ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΩΝ ΜΕΛΕΤΩΝ 2013

Transcript

1 ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΩΝ ΜΕΛΕΤΩΝ 2013 Ανάπτυξη και αξιοποίηση ενός νέου in vitro συστήματος μόλυνσης με τον ιό της Ηπατίτιδας C (HCV), που προσομοιάζει την in vivo κατάσταση, για τον χαρακτηρισμό νέων αντι-hcv φαρμάκων Επιστημονικά Υπεύθυνος: Νίκη Βασιλάκη, PhD, Ερευνήτρια Δ, Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ, Εργαστήριο Μοριακής Ιολογίας Μέλη Ομάδας: - Πηνελόπη Μαυρομαρά, Καθηγήτρια Βιοχημείας, Δημοκρίτειο Πανεπιστήμιο Θράκης, συνεργαζόμενη ερευνήτρια Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ - Ιωάννης Κοσκίνας, Αναπληρωτής Καθηγητής Πανεπιστημίου Αθηνών, Β' Πανεπιστημιακή Παθολογική Κλινική, Γενικό Νοσοκομείο Αθηνών «Ιπποκράτειο» - Ευσεβεία Φρακολάκη, MSc, μεταπτυχιακή φοιτήτρια, Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ, Εργαστήριο Μοριακής Ιολογίας - Βασιλική Σαρδέλη, MSc, μεταπτυχιακή φοιτήτρια, Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ, Εργαστήριο Μοριακής Ιολογίας - Γρηγόρης Ζωίδης, Λέκτορας, Τμήμα Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Αθηνών, Τομέας Φαρμακευτικής Χημείας - Αλέξιος-Λέανδρος Σκαλτσούνης, Καθηγητής, Πρόεδρος Τμήματος Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Αθηνών, Τομέας Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων - Νεκτάριος Αληγιάννης, Επίκουρος Καθηγητής, Τμήμα Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Αθηνών, Τομέας Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων - Αικατερίνη Αργυροπούλου, Μεταδιδάκτορας, Τμήμα Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Αθηνών, Τομέας Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων - Μαργαρίτα Χατζοπούλου-Κλαδαρά, Καθηγήτρια, Τμήμα Βιολογίας του ΑΠΘ, Τομέας Γενετικής, Ανάπτυξης και Μοριακής Βιολογίας, Εργαστήριο Βιολογίας Ανάπτυξης - Ιωάννα Βαλλιάνου, Μεταδιδάκτορας, Τμήμα Βιολογίας του ΑΠΘ, Τομέας Γενετικής, Ανάπτυξης και Μοριακής Βιολογίας, Εργαστήριο Βιολογίας Ανάπτυξης - Ralf Bartenschlager, Καθηγητής, Πανεπιστήμιο Χαϊδελβέργης (Γερμανία), Εργαστήριο Μοριακής Ιολογίας. Δεκέμβριος

2 ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Πρόσφατα αναπτύξαμε ένα νέο σύστημα πολλαπλασιασμού του HCV σε ανθρώπινα ηπατοκαρκινικά κύτταρα που προσομοιάζει την κατάσταση φυσικής μόλυνσης, καθώς βασίζεται σε οξυγόνο 3% (v/v), τη μέση τάση οξυγόνου στο ήπαρ. Η συγκεκριμένη συνθήκη ενισχύει την αντιγραφή του HCV RNA συγκριτικά με την ατμοσφαιρική. Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν ο χαρακτηρισμός του νέου in vitro συστήματος μόλυνσης με HCV και η αξιοποίησή του για τον προσδιορισμό νέων αποτελεσματικών ασφαλών και φθηνών αντι HCV φαρμάκων. Συγκεκριμένα, η αύξηση της HCV αντιγραφής παρουσία 3% οξυγόνου επιβεβαιώθηκε σε διαφοροποιημένα ανθρώπινα ηπατοκαρκινικά κύτταρα που προσομοιάζουν τα πρωτογενή. Επιπλέον, χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες DNA και qrt PCR, δείχθηκε στο 3% οξυγόνο η θετική ρύθμιση μιας σειράς γονιδίων σχετιζόμενων με υποξικό στρες, γλυκολυτικό μεταβολισμό και κυτταρική αύξηση. Έπειτα, ελέγχθηκαν για την αντι HCV τους δράση διάφορα συνθετικά ανάλογα και φυτικά προϊόντα Ελληνικής και Μεσογειακής βιοποικοιλότητας και βρέθηκε ότι: τροποποιημένα ανάλογα του flutimide, ενός χηλικού παράγοντα από μύκητα, η ουσία Κ που επιδρά στο λιπιδικό μεταβολισμό με μικρότερη κυτταροτοξικότητα από τις στατίνες, καθώς και φυτικά εκχυλίσματα των οικογενειών Compositae, Lamiaceae, Leguminosae και Pinaceae, έχουν ανασταλτική δράση στην αντιγραφή του HCV RNA, με μηχανισμό υπό διερεύνηση. Η παρούσα μελέτη οδήγησε στην ανακάλυψη μερικών πολλά υποσχόμενων αναστολέων έναντι του HCV με επιστημονικό και εμπορικό ενδιαφέρον. SUMMARY OF THE STUDY We recently developed a new HCV proliferation system in human hepatoma cells that mimics the natural infection condition, as it is based on 3% oxygen (v/v), the medium oxygen tension in the liver. This condition enhances the HCV RNA replication comparatively to the atmospheric one. Aim of the current study was to characterize the novel in vitro HCV infection system and to apply it for identifying new potent, safe and affordable anti HCV drugs. Specifically, the increase of HCV replication at 3% oxygen was confirmed in differentiated human hepatoma cells that simulate primary cells. Furthermore, using DNA microarrays and qrt PCR, the upregulation of certain genes related to hypoxic stress, glycolytic metabolism and cell increase was shown in 3% oxygen. Subsequently, a variety of synthetic analogues and natural products of Greek and Mediterranean biodiversity were tested for their anti HCV activity, with these findings: modified analogues of flutimide, a fungal chelating factor, component Κ that effects lipid metabolism with less cytotoxicity than statins, and plant extracts from Compositae, Lamiaceae, Leguminosae and Pinaceae families, inhibit HCV RNA replication, with their mechanism of action under investigation. The current study led to the discovery of some highly promising HCV inhibitors with scientific and commercial interest. 2

3 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η ηπατίτιδα C είναι ένα μείζον παγκόσμιο πρόβλημα υγείας με έναν εκτιμώμενο αριθμό προσβληθέντων ατόμων άνω των 170 εκατομμυρίων παγκοσμίως (Π.Ο.Υ.), προκαλώντας ένα ευρύ φάσμα κλινικών εκδηλώσεων, από υγιείς φορείς ως οξεία και χρόνια ηπατίτιδα που μπορεί να οδηγήσει σε ίνωση, κίρρωση και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα. Η τυπική θεραπεία, συνδυασμός ιντερφερόνης α και rivabirin, δεν είναι ευρέως αποτελεσματική και έχει συχνά παρενέργειες (64). Ο ιός της ηπατίτιδας C (Hepatitis C Virus HCV) είναι ένας RNA ιός θετικής αλυσίδας με γονιδίωμα 9,6 kb που περιστοιχίζεται και στα δυο άκρα από συντηρημένες, μη μεταφραζόμενες περιοχές (non translated regions NTRs), απαραίτητες για τη μετάφραση και την αντιγραφή του RNA. Η 5 NTR αποτελεί ένα εσωτερικό σημείο εισόδου για το ριβόσωμα (internal ribosome entry site IRES) που καθοδηγεί την έκφραση μιας πρόδρομης πολυπρωτεΐνης (49, 67). Η πολυπρωτεΐνη διασπάται σε δομικές (core, E1, E2) και μη δομικές πρωτεΐνες (p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) που σε συνδυασμό με κυτταρικούς παράγοντες σχηματίζουν ένα μεμβρανο σχετιζόμενο σύμπλεγμα ρεπλικάσης (αντιγραφάσης). Αυτό αντιγράφει το ιικό RNA θετικής αλυσίδας σε μια ενδιάμεση αρνητική αλυσίδα, η οποία χρησιμεύει ως μήτρα για τη σύνθεση απόγονων γονιδιωμάτων (48). Η μελέτη του κύκλου αντιγραφής του HCV έγινε αρχικά δυνατή το 1999 με την ανάπτυξη του συστήματος ρεπλικονίου (αυτοαντιγραφόμενο σύστημα) (41). Με τον προσδιορισμό ενός συγκεκριμένου απομονωθέντος στελέχους γονοτύπου 2α του HCV (JFH1) το οποίο αντιγράφεται πολύ αποδοτικά σε κυτταροκαλλιέργειες και συγκεκριμένα στην ανθρώπινη ηπατοκαρκινική κυτταρική σειρά Huh7.5, το 2005 καθιερώθηκε ένα αποδοτικό σύστημα πολλαπλασιασμού του HCV (75). Αυτό το σύστημα βελτιώθηκε με την ανάπτυξη ενός διαγονοτυπικά χιμαιρικού ιού που αποτελείται από τη ρεπλικάση του JFH1 (NS3 ως NS5B) συζευγμένη με την περιοχή core ως NS2 του J6 (Jc1) (40, 52). Μέχρι σήμερα, ο πολλαπλασιασμός του HCV έχει μελετηθεί αποκλειστικά υπό ατμοσφαιρική τάση οξυγόνου (20% v/v O 2 ) (7). Ωστόσο, οι φυσιολογικές ηπατικές συνθήκες οξυγόνου εκτείνονται από 12% O 2 γύρω από την πυλαία φλέβα ως 1% O 2 κοντά στην κεντρική φλέβα (19), με μια μέση τιμή 3% O 2 (24). Αυτή η διαβάθμιση οξυγόνου είναι σημαντική για τη ζώνωση της μεταβολικής δραστηριότητας (31, 70) που αντικατοπτρίζεται σε μια ασύμμετρη κατανομή βασικών ενζύμων. Η ικανότητα για οξειδωτικό μεταβολισμό ενέργειας, απελευθέρωση γλυκόζης και προστασία από την οξείδωση είναι μεγαλύτερη στην περιπυλαία περιοχή, ενώ για πρόσληψη γλυκόζης, σχηματισμό γλουταμίνης και σύνθεση λιπαρών οξέων είναι μεγαλύτερη περιφλεβικά. Σε ιστοκαλλιέργειες, το χαμηλό οξυγόνο ενεργοποιεί έναν προσαρμοστικό αναπρογραμματισμό της κυτταρικής ομοιόστασης και του ενεργειακού μεταβολισμού (61). Όσον αφορά τα ηπατοκύτταρα, το χαμηλό οξυγόνο είναι απαραίτητο για τη διατήρηση της δομής και του μεταβολισμού τους (45). Επιπλέον, η υποξία επηρεάζει την αντιγραφή πολλών ιών (2, 18, 30, 53, 55, 59, 62). Βασιζόμενοι σε αυτές τις παρατηρήσεις, έχουμε μελετήσει την επίπτωση της τάσης οξυγόνου στην αντιγραφή του γονιδιώματος και την παραγωγή ιικών σωματιδίων του HCV σε ανθρώπινα κύτταρα ηπατώματος (human hepatoma Huh7). Έχουμε δείξει ότι το χαμηλό οξυγόνο ενισχύει επιλεκτικά την αντιγραφή του RNA του HCV, σε αρχικό στάδιο και με τρόπο ανεξάρτητο του επαγόμενου από την υποξία παράγοντα α (hypoxia inducible factor α HIFα), αλλά άμεσα εξαρτώμενο από τον αυξημένο αναερόβιο μεταβολισμό ενέργειας (γλυκόλυση και παραγωγή ενέργειας μέσω κρεατινικής κινάσης Β (CKB)) (72). Η ανακάλυψη του in vitro συστήματος πολλαπλασιασμού του HCV (75) έχει προωθήσει την κατανόηση του κύκλου ζωής του ιού και κατ επέκταση την ανακάλυψη υποσχόμενων 3

4 αντιικών έναντι ειδικών στόχων, τα οποία αναστέλλουν την αντιγραφή του HCV (51, 56, 77, 78). Η πρόσφατη προσθήκη των αναστολέων της πρωτεάσης NS3/4Α telaprevir και boceprevir στην καθιερωμένη θεραπεία έχει οδηγήσει σε βελτιωμένα ποσοστά παρατεταμένης ιολογικής ανταπόκρισης σε ασθενείς μολυσμένους με HCV γονοτύπου 1. Νέα φάρμακα που στοχεύουν άλλες πρωτεΐνες του ιού (νουκλεοσιδικά/νουκλεοτιδικά ανάλογα και μη νουκλεοσιδικούς αναστολείς της πολυμεράσης NS5b και αναστολείς της NS5Α) καθώς επίσης και παράγοντες του κυττάρου ξενιστή που εμπλέκονται στην αντιγραφή του ιού (κυκλοφιλίνη ή πρωτεΐνες που σχετίζονται με το λιπιδικό μεταβολισμό) βρίσκονται σε κλινικές δοκιμές (51, 56, 77, 78). Ωστόσο, οι τρέχουσες θεραπείες είναι εξαιρετικά ακριβές, συνοδευόμενες από σοβαρές παρενέργειες, ακόμη περιορισμένες σε επιλεγμένους γονοτύπους και οδηγούν σε εμφάνιση ανθεκτικών στα φάρμακα ιικών στελεχών (λόγω της υψηλής συχνότητας μεταλλαγών). Επειδή η τιμή της θεραπευτικής αγωγής αρχίζει από τουλάχιστον $ ανά άτομο, ο HCV είναι μια παραμελημένη ασθένεια στην Αφρική και την Ασία με σχεδόν 100 εκατομμύρια ασθενείς σε αυτές τις περιοχές και είναι απίθανο η τιμή των θεραπειών να γίνει πιο προσιτή στο άμεσο μέλλον. ΓΕΝΙΚΟΣ ΣΤΟΧΟΣ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Με βάση τα παραπάνω, θεωρήσαμε αναγκαίο να χαρακτηρίσουμε περαιτέρω σε γονιδιακό και πρωτεϊνικό επίπεδο το νέο in vitro σύστημα μόλυνσης ηπατοκυττάρων με τον ιό HCV σε χαμηλή τάση οξυγόνου (3% Ο 2 ), που προσομοιάζει καλύτερα τη φυσική μόλυνση στο ήπαρ, και στη συνέχεια να το αξιοποιήσουμε σε δοκιμές για το χαρακτηρισμό νέων αντι HCV φαρμάκων, καθώς αναμένεται να δώσει πιο αξιόπιστα αποτελέσματα. ΑΙΤΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΕΠΙΛΟΓΗΣ ΓΙΑ ΕΛΕΓΧΟ ΝΕΩΝ ΠΙΘΑΝΩΝ ΑΝΑΣΤΟΛΕΩΝ ΕΝΑΝΤΙ ΤΟΥ HCV Με βάση τις δυσκολίες στις τρέχουσες θεραπείες για την ηπατίτιδα C, οδηγηθήκαμε στην αναζήτηση νέων πιθανών αναστολέων έναντι του HCV μέσω συνεργασιών. Συγκεκριμένα, αναζητήσαμε δύο κατηγορίες πιθανών φαρμάκων, τροποποιημένες μορφές χημικών (adamantane, flutimide) που είναι γνωστό ότι έχουν βελτιωμένη δράση έναντι άλλων ιών καθώς επίσης και φυσικά προϊόντα (φυτικά εκχυλίσματα) με γνωστή αντιική δράση. Χημικά ανάλογα Όσον αφορά την adamantine (κυκλοαλκάνιο), ένα παράγωγο αυτής, η amantadine, έχει αναφερθεί πως αναστέλλει τη δράση της πορίνης Μ2 του ιού της γρίπης Α και ενώ αναστέλλει τη δράση της πορίνης p7 του HCV in vitro (σε λιπιδικές διπλοστιβάδες), υπάρχουν αντικρουόμενες ενδείξεις για την επίδρασή της στην αναπαραγωγή του ιού (66), κυρίως λόγω της γονοτυπικής του ποικιλομορφίας (27). Άλλα παράγωγα της adamantane έχει βρεθεί πως έχουν βελτιωμένη δράση έναντι του ιού της γρίπης Α (26, 35, 73, 84), επομένως η δοκιμή τροποποιημένων αναλόγων του adamantane θα μπορούσε πιθανά να αναδείξει κάποιο με αποτελεσματικότερη δράση έναντι του HCV. Χημικά παράγωγα του flutimide, το οποίο είναι ένας χηλικός παράγοντας που προέρχεται από εκχυλίσματα του μύκητα Delitschia confertaspora, έχει παρατηρηθεί πως 4

5 αναστέλλουν τη δράση ενδονουκλεάσης στην πολυμεράση του ιού της γρίπης Η1Ν1 και της RNάσης Η στον HIV, οι οποίες για τη δράση τους απαιτούν δισθενή μεταλλικά ιόντα Mn 2+ ή/και Mg 2+ (34, 36, 69). Στον HCV, η πολυμεράση NS5B έχει δύο θέσεις δέσμευσης για δισθενή ιόντα Mn 2+ ή/και Mg 2+, όπως ακριβώς και στην περίπτωση της RNάσης Η του HIV (74). Επιπλέον, η NS2 3 πρωτεάση δρα ως διμερές και καταλύει την πρωτεόλυση στο σημείο σύζευξης NS2 και NS3 στην πολυπρωτεΐνη του HCV. Στη δράση αυτή είναι απαραίτητο το αμινοτελικό άκρο της NS3, η δομή της οποίας σταθεροποιείται από ένα ιόν Zn 2+ (43). Η πρωτεΐνη NS5A είναι και αυτή μια μεταλλοπρωτεάση και φέρει κοντά στο αμινοτελικό άκρο της ένα ιόν Zn 2+, απαραίτητο για την αντιγραφή του ιού (68). Επομένως, θα είχε ενδιαφέρον να ελεγχθεί αν αυτές οι μεταλλοπρωτεΐνες αναστέλλονται από το συγκεκριμένο χηλικό παράγοντα. Φυσικά προϊόντα Όσον αφορά τη δεύτερη κατηγορία πιθανών αναστολέων για τον HCV, τα φυσικά προϊόντα, τα τελευταία χρόνια, νέες, υποσχόμενες ενώσεις που στοχεύουν σε διαφορετικά στάδια του κύκλου ζωής του ιού, έχουν απομονωθεί από ποικιλία φυτικών ειδών και θαλάσσιων οργανισμών (φλαβονοειδή όπως αυτά που προέρχονται από εκχυλίσματα γαϊδουράγκαθου και πράσινου τσαγιού, λιγνάνες, πολυφαινόλες, ακόμα και ακατέργαστα φυτικά εκχυλίσματα) και μερικά έχουν ήδη εγκριθεί ως θεραπευτικά (συμπεριλαμβανομένου του silibinin) και χορηγούνται σε ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα C (15, 63). Καθώς η χρήση φυτικών ουσιών και εκχυλισμάτων έναντι του HCV κερδίζει έδαφος (15), στόχος είναι να μελετηθεί η δράση φυτικών ειδών της ελληνικής και μεσογειακής χλωρίδας. Χρησιμοποιήθηκαν εκχυλίσματα από είδη των οικογενειών compositae, lamiaceae, και leguminosae, καθώς φυτικά εκχυλίσματα και στη συνέχεια απομονωμένες ουσίες από είδη των οικογενειών αυτών (όπως το Glycirrhiza glabra) έχουν ήδη δοκιμαστεί έναντι του HCV κι έχει δειχθεί ότι εμποδίζουν την είσοδο (11, 29) ή τον πολλαπλασιασμό του ιού (8), ενώ έχουν και δράση έναντι άλλων ιών, όπως ο HIV (10, 14, 50, 82) και ο HSV (4, 9, 58). Χρησιμοποιήθηκαν επίσης είδη των οικογενειών anacardiaceae, iridaceae, lilaceae, pinaceae, plantaginaceae και polygonaceae, οι οποίες εμποδίζουν την είσοδο και τον πολλαπλασιασμό ιών όπως ο HIV (22, 76, 83), ο HSV (17, 57), ο ιός της γρίπης Α (20, 38, 80), ο ιός Epstein Barr (21, 81) και ο ιός του SARS (42). Ουσία Κ φυτικής προέλευσης. Η ουσία Κ έχει δειχθεί πως μειώνει τα ενδοκυτταρικά επίπεδα χοληστερόλης και εστέρων της χοληστερόλης στην ηπατική κυτταρική σειρά HepG2 μέσω διαφορετικής μεταβολικής διαδικασίας από ότι η αναστολή της αναγωγάσης HMG CoA που πραγματοποιείται από τις στατίνες και επιπλέον είναι πολύ λιγότερο κυτταροτοξικό από τις στατίνες. Υπάρχει στενή σχέση μεταξύ των λιπιδίων του κυττάρου ξενιστή και του HCV σε κάθε στάδιο του κύκλου αντιγραφής του ιού. Η είσοδος του HCV ξεκινά με τη χρονικά συντονισμένη αλληλεπίδραση των ιικών σωματιδίων με υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας, συμπεριλαμβανομένου του υποδοχέα LDL (low density lipoprotein receptor). Η αντιγραφή του ιικού RNA στηρίζεται απαραίτητα στη βιοσύνθεση λιπαρών οξέων και χοληστερόλης (5). Επιπλέον, για τη συγκρότηση των ιικών σωματιδίων είναι απαραίτητη η μεταφορά της πρωτεΐνης core στην επιφάνεια λιπιδικών σταγόνων, οι οποίες είναι κυτταρικές αποθήκες λιπιδίων που περιέχουν ουδέτερα λιπίδια και εστέρες της χοληστερόλης μέσα σε μια λιπιδική μονοστιβάδα (39). Με βάση τα παραπάνω, η ουσία Κ θα μπορούσε πιθανά να αποτελέσει αναστολέα του HCV. 5

6 ΣΤΟΧΟΙ Επετεύχθησαν οι παρακάτω επιμέρους στόχοι: 1. Χαρακτηρισμός σε γονιδιακό επίπεδο του νέου in vitro συστήματος μόλυνσης ανθρώπινων ηπατοκυττάρων Huh7.5 με τον ιό HCV σε χαμηλή τάση οξυγόνου (3% Ο 2 ), που αποτελεί τη μέση τάση οξυγόνου στο ανθρώπινο ήπαρ και επομένως μια πλησιέστερη συνθήκη στη φυσική μόλυνση από τον ιό, προκειμένου να προσδιοριστούν οι κυτταρικοί παράγοντες που ευθύνονται για την επαγωγή της αντιγραφής του γονιδιώματος του ιού στο 3% Ο 2 συγκριτικά με το ατμοσφαιρικό. 2. Ανάπτυξη του συστήματος των διαφοροποιημένων με DMSO κυττάρων Huh7.5 σε χαμηλή τάση οξυγόνου (3% Ο 2 ), που προσομοιάζουν τα πρωτογενή ηπατοκύτταρα ως προς το ότι έχουν υψηλή διαφοροποίηση, έχει διακοπεί η αύξησή τους και αντιδρούν σε ενδοκυττάριο δίκλωνο RNA. Χαρακτηρισμός της κινητικής του πολλαπλασιασμού HCV στο συγκεκριμένο κυτταρικό μοντέλο. 3. Προσδιορισμός της κυτταροτοξικότητας 13ων συνθετικών χημικών ουσιών, 7 αναλόγων της adamantane (amantadine, memantine, Z8, Z9, Ζ10, Ζ11, Ζ13) και 6 αναλόγων του flutimide (Z3, Ζ4, Z5, Ζ6, Ζ7, Z14), στην κυτταρική σειρά Huh 1b σε 3% Ο 2, με σκοπό τον προσδιορισμό των ασφαλών για το κύτταρο συγκεντρώσεων. Έλεγχος της δραστικότητάς τους έναντι του πολλαπλασιασμού του HCV σε κύτταρα που υποστηρίζουν σταθερά την αντιγραφή του ιικού RNA γονοτύπου 1b ή 2a (Huh 1b και Huh 2a) σε 20% και 3% Ο 2, καθώς και έναντι του πλήρους κύκλου ζωής του ιού κατόπιν μόλυνσης Huh7.5 και Huh7.25 κυττάρων με ιικά σωματίδια. Οι χημικές ουσίες μας έχουν ευγενώς παραχωρηθεί στα πλαίσια συνεργασίας από τον Δρ Γρηγόρη Ζωίδη (Τομέας Φαρμακευτικής Χημείας, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Αθηνών). Προσδιορισμός της δράσης των 14άρων συνθετικών χημικών ουσιών 4. Ανίχνευση του ρόλου της ουσίας Κ (φυτικής προέλευσης) ως καταστολέα της αντιγραφής του HCV στα Huh 1b κύτταρα σε συγκεντρώσεις ασφαλείς για τη βιωσιμότητα των κυττάρων σε 20% Ο 2 (πειράματα στο 3% βρίσκονται σε εξέλιξη). Η ουσία Κ μας έχει ευγενώς παραχωρηθεί στα πλαίσια συνεργασίας από τους Καθ. Μαργαρίτα Χατζοπούλου Κλαδαρά και Δρ Ιωάννα Βαλλιάνου (Εργαστήριο Βιολογίας Ανάπτυξης, Τομέας Γενετικής, Ανάπτυξης και Μοριακής Βιολογίας, Τμήμα Βιολογίας, ΑΠΘ). Προσδιορισμός της επίδρασης της ουσίας Κ στην κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων Huh7.5 σε 3% Ο 2. Σκοπός ήταν να προσδιοριστούν οι ασφαλείς για το κύτταρο συγκεντρώσεις, ώστε στη συνέχεια να ελεγχθεί η δραστικότητά τους έναντι του πλήρους κύκλου ζωής του ιού κατόπιν μόλυνσης των κυττάρων με ιικά σωματίδια. 5. Προσδιορισμός της κυτταροτοξικότητας 50 εκχυλισμάτων από φυτά της ελληνικής και μεσογειακής χλωρίδας των οικογενειών Anacardiaceae, Compositae, Iridaceae, Lamiaceae, Leguminosae, Liliaceae, Morinaceae, Pinaceae, Plantaginaceae, Platanaceae, Polygonaceae, στις κυτταρικές σειρές Huh7.5 και Huh 1b σε 3% Ο 2. Σκοπός ήταν να προσδιοριστούν οι ασφαλείς για το κύτταρο συγκεντρώσεις. Έλεγχος της δραστικότητάς τους έναντι του πολλαπλασιασμού του HCV σε κύτταρα που υποστηρίζουν σταθερά την αντιγραφή του ιικού RNA γονοτύπου 1b (Huh 1b) σε 3% Ο 2. Τα φυτικά εκχυλίσματα μας έχουν ευγενώς παραχωρηθεί στα πλαίσια 6

7 συνεργασίας από τους Καθ. Αλέξιο Λέανδρο Σκαλτσούνη, Καθ. Νεκτάριο Αληγιάννη και Δρ Αικατερίνη Αργυροπούλου (Τομέας Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Αθηνών). ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Επίτευξη στόχου 1: Έχουμε δείξει ότι η χαμηλή τάση οξυγόνου (3% Ο 2 ), που αποτελεί τη μέση τάση οξυγόνου στο ανθρώπινο ήπαρ και επομένως μια πλησιέστερη συνθήκη στη φυσική μόλυνση από τον ιό, ενισχύει επιλεκτικά την αντιγραφή του RNA του HCV στην ανθρώπινη ηπατοκαρκινική κυτταρική σειρά Huh7.5, σε αρχικό στάδιο και με τρόπο ανεξάρτητο του επαγόμενου από την υποξία παράγοντα α (hypoxia inducible factor α HIFα), αλλά άμεσα εξαρτώμενο από τον αυξημένο αναερόβιο μεταβολισμό ενέργειας (γλυκόλυση και παραγωγή ενέργειας μέσω κρεατινικής κινάσης Β (CKB)) (72). Τα παραπάνω αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με τη χρήση του ιού JcR2a (Εικόνα 1Α), που είναι ένας ιός που προέρχεται από τη χίμαιρα Jc1 και εκφράζει το γονίδιο αναφοράς Renilla λουσιφεράση, γεγονός που μας επιτρέπει εύκολη και ακριβή ποσοτικοποίηση της ιικής αντιγραφής στις μελέτες ελέγχου της δράσης των πιθανών αναστολέων έναντι του ιού. Χαρακτηρίστηκε η κινητική της ιικής αντιγραφής σε κύτταρα που καλλιεργήθηκαν σε 3% και 20% Ο 2 σε διάφορα χρονικά διαστήματα. Παρατηρήθηκε σταδιακή αύξηση των τιμών ενεργότητας λουσιφεράσης στο 3% Ο 2 σε σχέση με το 20% Ο 2, με μέγιστη αύξηση στις 24 ώρες (κατά 4,5 φορές) (Εικόνα 1Β). Α JcR2a Β Επαγωγή ενεργότητας Luc (φορές ως προς 20% Ο2) Εικόνα 1. Η τάση οξυγόνου 3% ρυθμίζει θετικά την αντιγραφή του γονιδιώματος του HCV. Α) Σχηματική αναπαράσταση του ιού JcR2a. Β) Υπερκείμενα κυττάρων Huh7 Lunet που έχουν υποστεί ηλεκτροδιάτρηση με RNA του JcR2a (10 μg/4x10 6 κύτταρα αντίστοιχα) και επωασμένα σε 20% O 2, συλλέχθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για μόλυνση κυττάρων Huh7.5 (1 TCID 50 /κύτταρο) που στρώθηκαν σε 30% κάλυψη και προεπωάστηκαν για 18 ώρες σε 20% ή 3% Ο 2, αντίστοιχα. Κύτταρα προεπωασμένα σε 20% Ο 2 καλλιεργήθηκαν είτε σε 20% ή 3% Ο 2 μέχρι τη συλλογή (20 20 ή 20 3, αντίστοιχα). Κύτταρα προεπωασμένα σε 3% Ο 2 επωάστηκαν σε 3% Ο 2 (3 3) μέχρι τη συλλογή. Οι ενεργότητες λουσιφεράσης στο 20 3 και 3 3 % Ο 2 εκφράζονται ως πολλαπλάσιο αυτών που μετρήθηκαν στο % Ο 2 (σχετικές μονάδες φωτός relative light units ή RLU). 7

8 Έχουμε δείξει ότι η επαγωγή της αντιγραφής του ιού μέσω της υποξίας συνδέεται με επαναπρογραμματισμό της κυτταρικής ενεργητικής που επάγεται από την υποξία. Από την στιγμή που παρατηρήθηκε ότι ο HIF δεν ευθύνεται για τη θετική ρύθμιση της αντιγραφής του HCV στο 3% O 2, προχωρήσαμε στο να εξετάσουμε συνολικά τις αλλαγές της γονιδιακής έκφρασης του κυττάρου σε μολυσμένα Huh7.5 κύτταρα χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες DNA εστιασμένες σε σηματοδοτικά μονοπάτια. Κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες σε 3% O 2 και έδειξαν θετική ρύθμιση κατά 2 φορές συγκεκριμένων γονιδίων σχετιζόμενων με την υποξία, όπως τους άμεσους μεταγραφικούς στόχους του HIF (VEGFA, EPO) (Πίνακας 1), γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες σχετιζόμενες με το στρες, γονίδια που εμπλέκονται στο οξειδωτικό στρες και παραγωγή δραστικών ριζών οξυγόνου (ROS), μεταφορά (GLUT1, 8) και μεταβολισμό (HK2, ENO1) γλυκόζης, κυτταρική ανάπτυξη, πολλαπλασιασμό και ρύθμιση κυτταρικού κύκλου (ογκογονίδια FOS, MYCN και ΚΙΤ). Επιπλέον, ανάλυση επιλεγμένων γονιδίων με qrt PCR επιβεβαίωσε τον κυτταρικό μεταγραφικό προγραμματισμό ως απόκριση στην υποξία και έδειξε μια μεταβολική μετατόπιση προς υψηλότερο ρυθμό αναερόβιας γλυκόλυσης (VEGFA, GLUT1, HK2, ENO1, LDH A). Ακόμα, συγκεκριμένα ογκογονίδια που ευθύνονται για τον επαναπρογραμματισμό του ενεργειακού μεταβολισμού κατά τη διάρκεια της υποξίας, όπως τα FOS, MYC και SRC επιβεβαιώθηκε ότι ρυθμίζονται θετικά στο 3% O 2. Τέλος, παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση των επιπέδων φωσφορυλίωσης του AKT στα μολυσμένα από HCV Huh7.5 κύτταρα που καλλιεργήθηκαν σε 3% O 2 συγκριτικά με τα κύτταρα που καλλιεργήθηκαν σε 20% O 2 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). 8

9 Πίνακας 1. Γονίδια επαγμένα τουλάχιστον κατά 2 φορές στο 3% O 2 σε σχέση με το 20% Ο 2 σε μολυσμένα Ηuh7.5 κύτταρα Επίτευξη στόχου 2: Λόγω των τεχνικών δυσκολιών που υπάρχουν στα πρωτογενή ηπατοκύτταρα, δηλαδή περιορισμένη διαθεσιμότητα ανθρώπινου ηπατικού ιστού, καλή ποιότητα προετοιμασίας ηπατοκυττάρων και μεγάλη δυσκολία στη διατήρηση τους σε καλλιέργεια λόγω της μείωσης της βιωσιμότητας και της αλλαγής του φαινοτύπου τους (54), δε μπορέσαμε να μελετήσουμε τον πολλαπλασιασμό του HCV σε αυτά. Ως εναλλακτική προσέγγιση, προτείνουμε τα διαφοροποιημένα με DMSO Huh7.5 κύτταρα, ένα σύστημα καλλιέργειας ηπατοκαρκινικών κυττάρων, το οποίο μιμείται τα γεγονότα που συμβαίνουν κατά τη φυσιολογική μόλυνση με τον HCV in vivo (37, 47) καθώς έχουν υψηλή διαφοροποίηση, έχει διακοπεί η αύξησή τους και αντιδρούν σε ενδοκυττάριο δίκλωνο RNA (13, 23, 44, 46). Όντως, στα κύτταρα αυτά παρατηρήσαμε υψηλότερα επίπεδα των ηπατοειδικών γονιδίων 9

10 Α1ΑΤ και HNF4 α (Εικόνα 2Α). Σε συνέπεια με τα μη διαφοροποιημένα Huh7.5 κύτταρα, παρατηρήθηκε πως η αντιγραφή του HCV ρυθμιζόταν θετικά υπό χαμηλή τάση οξυγόνου στα DMSO διαφοροποιημένα Huh7.5 (Εικόνα 2Β). A Γονίδια ηπατοκυττάρου B Επαγωγή ενεργότητας Luc Επίπεδα mrna (φορές ως προς μάρτυρα) (φορές ως προς 20% Ο2) Εικόνα 2. Το 3% (v/v) O 2 ενισχύει την αντιγραφή του HCV σε κύτταρα Huh7.5 dif. A) Επαγωγή ηπατοειδικών κυτταρικών γονιδίων λόγω επώασης με DMSO. Ανάλυση με qrt PCR της έκφρασης των mrna των A1AT και HNF4 α τη 14 η ημέρα επώασης. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως επαγωγή της γονιδιακής έκφρασης σε κύτταρα επωασμένα με DMSO σε σχέση με αυτή των κυττάρων που δεν έχουν επωαστεί με DMSO (ημέρα 0 μάρτυρας). Β) Επίδραση της χαμηλής τάσης οξυγόνου σε κύτταρα Huh7.5 dif μολυσμένα με τον JcR2a τα οποία επωάστηκαν όπως προσδιορίστηκε στην κορυφή και συλλέχθηκαν σε διάφορες χρονικές στιγμές. Οι μέσες τιμές εκφράζονται σε σχέση με αυτές που λήφθηκαν από κύτταρα τα οποία καλλιεργήθηκαν σε 20 20% Ο 2. Επίτευξη στόχου 3: 7 ανάλογα της adamantane (amantadine, memantine, Z8, Z9, Ζ10, Ζ11, Ζ13) και 6 ανάλογα του flutimide (Z3, Ζ4, Z5, Ζ6, Ζ7, Z14) ελέγχθηκαν όσον αφορά την τοξικότητά τους στην κυτταρική σειρά Huh 1b στο 3% Ο 2 με τη μέθοδο alamar Blue και προσδιορίστηκε η μέση θανατηφόρος συγκέντρωση (LC50), δηλαδή η συγκέντρωση των χημικών η οποία προκαλεί θάνατο στο 50% των κυττάρων (Πίνακας 2). Σκοπός ήταν να προσδιοριστούν οι ασφαλείς για το κύτταρο συγκεντρώσεις, ώστε στη συνέχεια να ελεγχθεί η δραστικότητά τους έναντι του πολλαπλασιασμού του HCV. Ουσία LC50 μμ EC50 Huh 1b Huh 2a HCV (JcR2a) Amantadine 188,7 ND + Memantine 52,96 ND + Z8 4,228 ND + Z9 >200 56,99 + Z10 52,43 ND + Z11 >200 ND + Z13 >200 >200 ND + Z3 > ,9 ND Z4 >200 9,914 Z5 >200 >200 + ND Z6 >200 + ND Z7 >200 80,98 Z14 >200 ND ND: Δεν έχει προσδιοριστεί Πίνακας 2. Μέση θανατηφόρος συγκέντρωση (LC50) και μέση αποτελεσματική συγκέντρωση (EC50) 13ων συνθετικών χημικών ουσιών (ανάλογα amantadane και flutimide). 7 ανάλογα της adamantane (amantadine, memantine, Z8, Z9, Z10, Z11, Z13) και 6 ανάλογα του flutimide (Z3, Z4, Z5, Z6, Z7, Z14) ελέγχθηκαν όσον αφορά την τοξικότητά τους στην κυτταρική σειρά Huh 1b σε 3% Ο 2 και ως προς τη δράση τους έναντι της αντιγραφής του HCV RNA στις κυτταρικές σειρές Huh 1b και Huh 2a που φέρουν το αυτόνομα αντιγραφόμενο υπογονιδιωματικό RNA των στελεχών 1b Con1 και 2a JFH αντίστοιχα, και στην κυτταρική σειρά Huh 7.25 CD81 μολυσμένη με τον ιό JcR2a, σε 20% Ο 2. 10

11 Σε μια σειρά ασφαλών για το κύτταρο συγκεντρώσεων ελέγξαμε τα επίπεδα της HCV αντιγραφής στην κυτταρική σειρά Huh 1b και προσδιορίσαμε τη μέση αποτελεσματική συγκέντρωση (EC50) των αναλόγων (Πίνακας 2). Διαπιστώθηκαν τα εξής: Α) Ανάλογα της adamantine: Με βάση τη βιβλιογραφία, στόχος της amantadine και των υπόλοιπων αναλόγων της adamantine, είναι η p7 πορίνη του ιού και δεν έχουν επίδραση στην αντιγραφή του HCV γονιδιώματος (65). Η πορίνη p7 δεν εκφράζεται από το υπογονιδιωματικό RNA που περιέχει η κυτταροσειρά Huh 1b. Ως αναμενόταν, τα περισσότερα ανάλογα της adamantane που ελέγξαμε δε φάνηκε να επηρεάζουν την αντιγραφή του HCV RNA (Εικόνα 3). Ωστόσο, για δύο από αυτά παρατηρείται επίδραση στην HCV αντιγραφή, μεγαλύτερη για το Ζ9 (EC50 56,99 μμ) (Εικόνα 4) και μικρότερη για το Ζ13 (EC50 >200 μμ). Πιθανόν τα ανάλογα αυτά να δρουν μέσω ενός άλλου στόχου εκτός της p7, που θα είχε ενδιαφέρον να μελετηθεί μελλοντικά. A B Γ Εικόνα 3. Επίδραση αναλόγων adamantane στην αντιγραφή του υπογονιδιωματικού RNA του HCV στα κύτταρα Huh 1b και στην κυτταρική βιωσιμότητα. Η σταθερή κυτταρική σειρά Huh 1b, που φέρει το αυτόνομα αντιγραφόμενο υπογονιδιωματικό RNA του 1b Con1 στελέχους του HCV (Ι389luc ubineo/ns3 3/5.1) (Α), με αρχική πυκνότητα κυττάρων 30%, καλλιεργήθηκε για 72 ώρες παρουσία των χημικών Ζ9, Ζ11 και Ζ13 σε συγκέντρωση 100 μμ, της memantine και του Ζ10 σε συγκέντρωση 20 μμ και του Ζ8 σε συγκέντρωση 2 μμ, με την amantadine ως θετικό μάρτυρα, σε συγκέντρωση 100 μμ. Κατόπιν λύσης των κυττάρων μετρήθηκε η ενεργότητα της firefly λουσιφεράσης, που εκφράζεται από την κυτταροσειρά ως δείκτης της αντιγραφής του HCV RNA (Β), ή τα ενδοκυττάρια επίπεδα ΑΤP (Γ) και αυτά εκφράστηκαν ως ποσοστό των αντίστοιχων επιπέδων που αποδόθηκαν από τα μη επωασμένα με φάρμακο κύτταρα (Μ: παρουσία του διαλύτη των ουσιών, DMSO). 11

12 Στη συνέχεια, τα ανάλογα της adamantane ελέγχθηκαν στον πλήρη κύκλο ζωής του ιού, σε μολυσμένα με τον ιό JcR2a κύτταρα Huh 7.25, και μετρήθηκε η ενεργότητα της Renilla λουσιφεράσης στα λυμένα κύτταρα, αρχικά τρεις μέρες μετά την πρώτη μόλυνση (Εικόνα 5Α) και έπειτα σε δεύτερο κύκλο μόλυνσης μετά από μεταφορά των υπερκειμένων σε μη μολυσμένα κύτταρα (Εικόνα 5Γ). Τα ανάλογα memantine, Z8, Z9, Ζ10, Ζ11 και Ζ13 δε φάνηκαν να έχουν μεγαλύτερη επίδραση από την amantadine που είναι ο θετικός μάρτυρας. Όλα τα ανάλογα είχαν μεγαλύτερη επίδραση στον πολλαπλασιασμό του ιού στο δεύτερο κύκλο μόλυνσης, καθώς επηρεάζουν την απελευθέρωση και τη συγκρότηση των ιικών σωματιδίων (65). A Β Εικόνα 4. Επίδραση αναλόγων flutimide και adamantane στην αντιγραφή του υπογονιδιωματικού RNA του HCV στα κύτταρα Huh 1b και στην κυτταρική βιωσιμότητα. Η σταθερή κυτταρική σειρά Huh 1b, που φέρει το αυτόνομα αντιγραφόμενο υπογονιδιωματικό RNA του 1b Con1 στελέχους του HCV (Ι389luc ubi neo/ns3 3/5.1), με αρχική πυκνότητα κυττάρων 30%, καλλιεργήθηκε για 72 ώρες παρουσία του χημικού Ζ9 σε διάφορες συγκεντρώσεις. Κατόπιν λύσης των κυττάρων μετρήθηκε η ενεργότητα της firefly λουσιφεράσης, που εκφράζεται από την κυτταροσειρά ως δείκτης της αντιγραφής του HCV RNA (A), ή τα ενδοκυττάρια επίπεδα ΑΤP στις δύο μεγαλύτερες συγκεντρώσεις (B) και αυτά εκφράστηκαν ως ποσοστό των αντίστοιχων επιπέδων που αποδόθηκαν από τα μη επωασμένα με φάρμακο κύτταρα (Μ: παρουσία του διαλύτη των ουσιών, DMSO). 12

13 A Β Γ Εικόνα 5. Επίδραση αναλόγων adamantane στον πολλαπλασιασμό του HCV στα κύτταρα Huh 7.25 CD81 και στην κυτταρική βιωσιμότητα. Η κυτταρική σειρά Huh 7.25 CD81, με αρχική πυκνότητα κυττάρων 30%, 13

14 μολύνθηκε με τον ιό JcR2a και καλλιεργήθηκε για 72 ώρες παρουσία των χημικών Ζ9, Ζ11 και Ζ13 σε συγκέντρωση 100 μμ, της memantine και του Ζ10 σε συγκέντρωση 20 μμ και του Ζ8 σε συγκέντρωση 2 μμ, με την amantadine ως θετικό μάρτυρα, σε συγκέντρωση 100 μμ. Κατόπιν λύσης των κυττάρων μετρήθηκε η ενεργότητα της Renilla λουσιφεράσης, που εκφράζεται από τo ιικό στέλεχος ως δείκτης της αντιγραφής του HCV RNA (A), ή τα ενδοκυττάρια επίπεδα ΑΤP (B) και αυτά εκφράστηκαν ως ποσοστό των αντίστοιχων επιπέδων που αποδόθηκαν από τα μη επωασμένα με φάρμακο κύτταρα. Τα υπερκείμενα των κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν για τη μόλυνση νέων Huh 7.25 κυττάρων, τα οποία καλλιεργήθηκαν για 72 ώρες σε θρεπτικό υλικό πλήρες DMEM. Κατόπιν λύσης των κυττάρων μετρήθηκε η ενεργότητα της Renilla λουσιφεράσης (Γ) (Μ: παρουσία του διαλύτη των ουσιών, DMSO). Β) Ανάλογα του flutimide: 6 ανάλογα του flutimide (Z3, Ζ4, Z5, Ζ6, Ζ7, Z14) ελέγχθηκαν αρχικά σε μια συγκέντρωση για τη δράση τους έναντι της αντιγραφής του HCV RNA στην κυτταρική σειρά Huh 1b (Εικόνα 6). Τα δραστικότερα από αυτά, Ζ3, Ζ4 και Ζ7 ελέγχθηκαν σε περισσότερες συγκεντρώσεις (Εικόνα 7) και προσδιορίστηκαν τα EC50 τους (Πίνακας 2). Επιλέξαμε τα πιο δραστικά (Ζ4 και Ζ7) ανάλογα του flutimide και κάναμε συγκριτική τιτλοποίηση στο 20% και 3% οξυγόνο (Εικόνα 8). Όπως αναμενόταν, στη χαμηλή τάση οξυγόνου αυξάνεται η ιική αντιγραφή κι έχουν μικρότερη επίδραση τα φάρμακα. A Β Εικόνα 6. Επίδραση αναλόγων flutimide στην αντιγραφή του υπογονιδιωματικού RNA του HCV στα κύτταρα Huh 1b και στην κυτταρική βιωσιμότητα. Η σταθερή κυτταρική σειρά Huh 1b, που φέρει το αυτόνομα αντιγραφόμενο υπογονιδιωματικό RNA του 1b Con1 στελέχους του HCV (Ι389luc ubineo/ns3 3/5.1), με αρχική πυκνότητα κυττάρων 30%, καλλιεργήθηκε για 72 ώρες παρουσία των χημικών Ζ3, Ζ4, Ζ5, Ζ6, Ζ7 και Ζ14 σε συγκέντρωση 100 μμ. Κατόπιν λύσης των κυττάρων μετρήθηκε η ενεργότητα της firefly λουσιφεράσης, που εκφράζεται από την κυτταροσειρά ως δείκτης της αντιγραφής του HCV RNA (A), ή τα ενδοκυττάρια επίπεδα ΑΤP (B) και αυτά εκφράστηκαν ως ποσοστό των αντίστοιχων επιπέδων που αποδόθηκαν από τα μη επωασμένα με φάρμακο κύτταρα (Μ: παρουσία του διαλύτη των ουσιών, DMSO). 14