ΕΙΣΑΓΩΓΗ Γενικά Ανοσοποιητικό σύστηµα των σπονδυλωτών

Transcript

1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Γενικά Υπολογίζεται ότι υπάρχουν στη γη περίπου 13 εκατοµµύρια οργανισµοί εκ των οποίων τα έντοµα καλύπτουν ποσοστό που υπερβαίνει το 50% (Σχήµα 1α). Τα έντοµα διαθέτουν µεγάλη ικανότητα επιβίωσης σε ένα ευρύ φάσµα περιβαλλοντικών συνθηκών. Επιπλέον οι ευαίσθητοι µηχανισµοί αναγνώρισης παθογόνων που διαθέτουν, σε συνδυασµό µε αποτελεσµατικές στρατηγικές για άµυνα σε περίπτωση µικροβιακής προσβολής, ερµηνεύουν το λόγο που αποτελούν αναµφίβολα την πολυπληθέστερη οµοταξία οργανισµών του πλανήτη µας. Η σηµασία µελέτης τους είναι ανεκτίµητη αν αναλογιστούµε τον κίνδυνο που αποτελούν για τη δηµόσια υγεία ως φορείς ασθενειών ή την απειλή της γεωργίας εξαιτίας των καταστροφών σε καλλιέργειες. Στο εργαστήριο Βιολογίας Κυττάρου χρησιµοποιείται ως οργανισµός µελέτης το ολοµετά-βολο έντοµο Ceratitis capitata (µύγα της Μεσογείου ή φρουτό-µυγα). Ανήκει στην οικογένεια Tep-hritidae της τάξης των δίπτερων εντόµων. Είναι εξαιρετικά επιβλαβές για τη γεωργία αφού παρασιτεί σε περισσότερα από 250 είδη φρούτων και λαχανικών σε περιοχές της Μεσογείου, της Μέσης Ανατολής, της Λατινικής και Βορείου Αµερικής και της Αυστραλίας (Σχήµα 1β). Στο εργα-στήριο από τους διάφορους κυττα-ρικούς τύπους του εντόµου, έχουν χρησιµοποιηθεί για τη µελέτη των µηχανισµών µε-ταγωγής µηνυµά-των κυρίως τα αιµοκύτταρα. Ανοσοποιητικό σύστηµα των σπονδυλωτών Πριν αναφερθούµε στο ανοσοποιητικό σύστηµα των εντόµων θα κάνουµε µια µικρή αναφορά στο αντίστοιχο αλλά πιο εξελιγµένο σύστηµα των σπονδυλωτών. Στα σπονδυλωτά, η άµυνα έναντι των µικροβίων βασίζεται στις αποκρίσεις της εγγενούς ή µη ειδικής και της επίκτητης ή ειδικής ανοσίας. Η εγγενής ανοσία περιλαµβάνει κυτταρικούς και βιοχηµικούς αµυντικούς µηχανισµούς οι οποίοι προϋπάρχουν της µόλυνσης και βρίσκονται σε ετοιµότητα για άµεση απόκριση. Η εγγενής ανοσία δε χαρακτηρίζεται από εξειδίκευση και τα κύρια συστατικά της είναι: (α) οι φυσικοί και ορολογικοί 3

2 φραγµοί, όπως τα επιθήλια και η βλέννα που τα καλύπτει, η οποία περιέχει και αντιβακτηριακές ουσίες (ντεφενσίνες), (β) τα φαγοκύτταρα (ουδετερόφιλα, µονοκύτταρα και µακροφάγα) και τα κύτταρα-φυσικοί δολοφόνοι (natural killer cells), (γ) οι πρωτεΐνες του αίµατος, στις οποίες περιλαµβάνονται οι πρωτεΐνες του συµπληρώµατος και (δ) οι κυτταροκίνες που συντονίζουν πολλές από τις δραστηριότητες των κυττάρων που συµµετέχουν στην εγγενή ανοσία (Bodian et al., 2004; Ottavianni et al., 2004). Η επίκτητη ή ειδική ανοσία χαρακτηρίζεται από εξειδίκευση. Οι αποκρίσεις της πυροδοτούνται από έκθεση σε µολυσµατικούς παράγοντες και διαθέτουν ικανότητα µνήµης, αυξανόµενη ένταση και αποτελεσµατικότητα σε επαναλαµβανόµενες εκθέσεις στον ίδιο µικροοργανισµό. Τα συστατικά της επίκτητης ανοσίας είναι τα T και B λεµφοκύτταρα που είναι υπεύθυνα για την κυτταρική ανοσία και την παραγωγή αντισωµάτων, αντίστοιχα (Janeway and Medzhitov, 2002). Τα δύο είδη ανοσολογικών αποκρίσεων συνδέονται άµεσα. Αρχικά, η εγγενής ανοσολογική απόκριση διεγείρει και επηρεάζει τη φύση των επίκτητων ανοσολογικών αποκρίσεων και οι επίκτητες αποκρίσεις χρησιµοποιούν πολλούς από τους µηχανισµούς της εγγενούς ανοσίας για την εξουδετέρωση µικροβίων (Beutler, 2004). Η εγγενής ανοσία είναι φυλογενετικά το παλαιότερο σύστηµα άµυνας σε αντίθεση µε την επίκτητη ανοσία που εξελίχθηκε αργότερα. Στα ασπόνδυλα, η άµυνα έναντι ξένων εισβολέων πραγµατοποιείται µε τους µηχανισµούς της εγγενούς ανοσίας, όπου συµµετέχουν φαγοκύτταρα και µόρια που παρουσιάζουν οµοιότητες µε τις πρωτεΐνες του πλάσµατος των σπονδυλωτών. Ανοσοποιητικό σύστηµα των εντόµων Τα έντοµα διαθέτουν αποτελεσµατικούς µηχανισµούς για την αντιµετώπιση προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών µικροοργανισµών. Στην άµυνα πρώτης γραµµής ανήκουν το επιδερµίδιο, το έντερο και η τραχεία. Το επιδερµίδιο είναι ένας εξωτερικός άκαµπτος σχηµατισµός που αποτελείται από πρωτεΐνες και υδατάνθρακες που εκκρίνονται από τα υποκείµενα επιθηλιακά κύτταρα. Λόγω της στρατηγικής του θέσης µεταξύ περιβάλλοντος και υποκείµενων ιστών, προστατεύει το έντοµο από µικρόβια και ξηρασία. Όταν οι µικροοργανισµοί διαπεράσουν τους παραπάνω φραγµούς και εισβάλλουν στο αιµόκοιλο του ξενιστή, αντιµετωπίζουν αµυντικούς 4

3 µηχανισµούς που οδηγούν σε ορολογικές (humoral) και κυτταρικές (cellular) αποκρίσεις. Η ορολογική απόκριση συνίσταται στην παραγωγή αντιµικροβιακών πεπτιδίων από το λιπαρό σώµα (fat body) (Hoffmann, 2003), ενεργών παραγώγων οξυγόνου και αζώτου (Bogdan et al., 2000) και ενζύµων που ρυθµίζουν την πήξη της αιµολέµφου και τη µελανογένεση (Gillespie et al., 1997). Αντίθετα, η κυτταρική άµυνα συνίσταται σε αποκρίσεις των αιµοκυττάρων όπως κυτταροφαγία, σχηµατισµό οζιδίων και εγκύστωση (Schmidt et al., 2001, Nappi et al., 2004, Lamprou et al., 2005). Η διάκριση µεταξύ ορολογικών και κυτταρικών αποκρίσεων είναι ως ένα σηµείο αυθαίρετη καθώς πολλοί ορολογικοί παράγοντες επηρεάζουν τη λειτουργία των αιµοκυττάρων και τα αιµοκύτταρα αποτελούν σηµαντική πηγή αρκετών ορολογικών παραγόντων. Τα αιµοκύτταρα αναγνωρίζουν ένα ξένο σώµα είτε άµεσα, µέσω των υποδοχέων της επιφάνειας τους που αλληλεπιδρούν µε µόρια του ξένου οργανισµού, είτε έµµεσα, αναγνωρίζοντας ορολογικούς υποδοχείς που κυκλοφορούν διαλυτοί στην αιµολέµφο και έχουν προσδεθεί και οψωνινοποιήσει την επιφάνεια του εισβολέα (Lavine and Strand, 2002). Aιµοκύτταρα των εντόµων Τα έντοµα παράγουν διάφορους τύπους αιµοκυττάρων. Τα τελευταία χρόνια η χρήση αντισωµάτων και γενετικών µαρτύρων έδωσε ένα νέο, πιο αξιόπιστο τρόπο διαχωρισµού των διαφόρων κυτταρικών τύπων (Lebestky et al., 2000). Οι πιο κοινοί τύποι αιµοκυττάρων που αναφέρονται στη βιβλιογραφία είναι τα προαιµοκύτταρα, τα κοκκιοκύτταρα, τα πλασµατοκύτταρα, τα σφαιροκύτταρα και τα οινοκυτοειδή (Σχήµα 2). Όλοι οι τύποι των αιµοκυττάρων δεν απαντούν σε όλα τα είδη τω εντόµων. Στα λεπιδόπτερα για παράδειγµα απαντούν τα πλασµατοκύτταρα και τα κοκκιοκύτταρα και στα δίπτερα κυριαρχούν τα πλασµατοκύτταρα και υπάρχουν και λίγα οινοκυτοειδή. (Lavine and Strand, 2002). Από τους παραπάνω κυτταρικούς τύπους, τα πλασµατοκύτταρα αποτελούν την πολυπληθέστερη κατηγορία και είναι αυτά που συµµετέχουν στον εγκλωβισµό παθογόνων, στην κυτταροφαγία, στο σχηµατισµό θρόµβων και στην επούλωση πληγών. Η σηµασία των αιµοκυττάρων για την επιβίωση των εντόµων έχει αποδειχθεί από πειράµατα σε άτοµα του γένους Drosophila: Προνύµφες που 5

4 φέρουν τη µετάλλαξη domino (προκαλεί µειωµένο αριθµό αιµο-κυττάρων), είναι εξαιρετικά ευαί-σθητες σε µολύνσεις. Αναγνώριση εισβολέων από τα αιµοκύτταρα των εντόµων Τα σπονδυλωτά έχουν αναπτύξει υποδοχείς αναγνώρισης, (patternrecognition receptors, PRRs) οι οποίοι δεσµεύουν συντηρηµένες µοριακές δοµές παθογόνων µικροοργανισµών (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs) οι οποίες απουσιάζουν από τα κύτταρα των σπονδυλωτών. Ανάλογοι υποδοχείς υπάρχουν και στα έντοµα και διακρίνονται σε δύο κατηγορίες: (α) ορολογικοί υποδοχείς όπως οι λεκτίνες και η πρωτεΐνη δέσµευσης του LPS (λιποπολυσακχαρίτης της κυτταρικής µεµβράνης των Gram- αρνητικών βακτηρίων) (Lee et al., 2000), (β) κυτταρικοί υποδοχείς όπως οι Toll-like υποδοχείς (οικογένεια διαµεµβρανικών πρωτεϊνών) που ενεργοποιούν οδούς µεταγωγής µηνυµάτων µε αποτέλεσµα την παραγωγή κυτταροκινών (TNF-a, IL-1 και IL-12) (Akira et al., 2001), ενδοθηλιακών µορίων προσκόλλησης, όπως η Ε-σελεκτίνη, και πρωτεϊνών που εµπλέκονται σε µηχανισµούς εξουδετέρωσης µικροβίων, όπως η επαγόµενη συνθετάση οξειδίου του αζώτου (Medzhitov, 2001). Κυτταρικές αποκρίσεις των αιµοκυττάρων στα έντοµα Τα αιµοκύτταρα των εντόµων αναγνωρίζουν µια ποικιλία στόχων που περιλαµβάνουν πρωτόζωα, νηµατώδεις σκώληκες, παρασιτοειδή εντόµων κ.α. (Gillepsie et al., 1997). Επίσης είναι ικανά να αντιδρούν σε αβιοτικούς στόχους όπως είναι τα σφαιρίδια από λάτεξ. Οι κυτταρικές τους αποκρίσεις συνίστανται κυρίως στους ακόλουθους τύπους αντιδράσεων: Κυτταροφαγία: Απαντάται και σε κατώτερους οργανισµούς µε σκοπό την πρόσληψη τροφής. Χαρακτηριστικό παράδειγµα αποτελούν διάφορα πρωτόζωα (π.χ. αµοιβάδα) που προσλαµβάνουν την τροφή τους κατόπιν εγκόλπωσης, που πραγµατοποιείται µε τη βοήθεια κυτταροπλασµατικών προεκβολών που καλούνται ψευδοπόδια. Αυτά έπειτα µεταπίπτουν σε κυστίδια (φαγοσώµατα) τα οποία συντήκονται µε λυοσώµατα και ακολουθεί πέψη µε τη βοήθεια πρωτεολυτικών ενζύµων. Στους ανώτερους οργανισµούς (και στα έντοµα) η κυτταροφαγία αποτελεί µηχανισµό άµυνας. Πρόκειται για µια διαδικασία αναγνώρισης και εγκόλπωσης µικροοργανισµών ή καταλοίπων ιστών που συσσωρεύονται κατά τη µόλυνση, τη φλεγµονή ή την επούλωση πληγών. Χαρακτηριστικό παράδειγµα (Σχήµα 3) 6

5 αποτελούν τα µακροφάγα των θηλαστικών (Αderem and Underhill, 1999)και τα αιµοκύτταρα των εντόµων: Σε αυτά η κυτταροφαγία ξεκινά µε την αναγνώρισηπρόσδεση του στόχου σε υποδοχέα της κυτταρικής επιφάνειας. Ακολουθεί ενδοκυττάρωση του στόχου µε τη µεσολάβηση του κυτταροσκελετού της ακτίνης (Αderem and Underhill, 1999) και σχηµατισµός φαγοσώµατος. Η θανάτωση του στόχου επιτυγχάνεται µε τη δράση ελευθέρων ριζών που παράγονται στα φαγοσώµατα ή µε τη βοήθεια λυοσωµατικών ενζύµων (Ramet et al., 2002). Για όλα τα παραπάνω σηµαντική είναι η δράση της ενεργοποίησης των ΜΑΡ κινασών στα αιµοκύτταρα, που προκαλείται από τα βακτήρια (Lamprou et al., 2005). Στα θηλαστικά η δέσµευση των παθογόνων στα φαγοκύτταρα γίνεται µε δύο τουλάχιστον οµάδες υποδοχέων: (α) µε το σύστηµα του συµπληρώµατος, που περιλαµβάνει πρωτεΐνες που κυκλοφορούν στο αίµα και τα εξωκυτταρικά υγρά και έχουν την ικανότητα να δεσµεύουν µη ειδικά τα παθογόνα ενώ δεσµεύονται σε υποδοχείς της επιφάνειας των φαγοκυττάρων και (β) µε τα αντισώµατα που επίσης δεσµεύουν παθογόνα και δεσµεύονται στους Fc υποδοχείς της επιφάνειας των µακροφάγων και ουδετερόφιλων. Αξίζει σε αυτό το σηµείο να αναφερθεί εγκυκλοπαιδικά η παρατήρηση ότι κάποια βακτήρια (Salmonella enterica, Yersinia pseudotuberculosis) είναι ικανά να εισέρχονται κυτταροφαγικά σε κύτταρα που φυσιολογικά δεν φαγοκυτταρώνουν. Αυτό οφείλεται στην ικανότητα των βακτηρίων να εκφράζουν πρωτεΐνες (invasin) που δεσµεύονται στις β1 ιντεγκρίνες ή στη δυνατότητα να επάγουν πολυµερισµό ακτίνης λόγω ενεργοποίησης της οικογένειας των Rho- GTPασών (Dramsi et al., 1998, Galan 1996). Στα έντοµα έχει δειχθεί ότι (α) ανάλογο σύστηµα του συµπληρώµατος των θηλαστικών είναι το σύστηµα της προφαινολοξειδάσης (propo) που συµµετέχει στην κυτταροφαγία (Mavrouli et al., 2005) και (β) η κυτταροφαγία (Metheniti et al.,2001, Lamprou et al.,2005). Η κυτταροφαγία βακτηρίων (E. coli) απαιτεί τη συµµετοχή του κυτταροσκελετού της ακτίνης, του συµπλόκου FAK/Src και της β3 υποµονάδας ιντεγκρινών, καθώς η χρήση αναστολέων πολυµερισµού ακτίνης (cytochalasin D), η χρήση αντισωµάτων έναντι των FAK και Src και η χρήση του τριπεπτιδίου RGD (δεσµεύεται στις β υποµονάδες ιντεγκρινών), φαίνεται ότι αναστέλλουν την κυτταροφαγία του βακτηρίου. 7

6 Κυτταρική εγκύστωση: Πραγµατοποιείται όταν το µέγεθος του εισβολέα είναι µεγάλο, π.χ. παρασιτοειδή, νηµατώδεις σκώληκες. Εδώ τα αιµοκύτταρα συσσωµατώνονται γύρω από τον εισβολέα και στη συνέχεια λύονται και απελευθερώνουν στον ορό ουσίες που προσελκύουν άλλα αιµοκύτταρα και συµπληρώνουν το σχηµατισµό της κύστης. Κύριο σύστηµα που συµµετέχει στη διεργασία αυτή είναι το σύστηµα της propo (Nappi et al., 2004, Mavrouli et al., 2005). Η θανάτωση των παραπάνω πρέπει να προέρχεται από τη δράση των ενεργών ριζών οξυγόνου και αζώτου. Σχηµατισµός οζιδίων: Τα οζίδια σχηµατίζονται όταν ο αριθµός των µικροοργανισµών που εισβάλουν στο αιµόκοιλο είναι πολύ µεγάλος, ώστε να αποµακρυνθούν µε τη διαδικασία της κυτταροφαγίας. Πολλές φορές, η διάκριση ανάµεσα στα οζίδια και τις κύστεις είναι δύσκολη, ενώ είναι δυνατό οι δύο διαδικασίες να πραγµατοποιούνται ταυτόχρονα. Για το σχηµατισµό των οζιδίων έχει προταθεί ότι τα αιµοκύτταρα αποκοκκιώνονται και απελευθερώνουν παράγοντες που προκαλούν τη συσσωµάτωση των βακτηρίων. Ο σχηµατισµός οζιδίου ή κύστης προϋποθέτει ότι τα κυκλοφορούντα αιµοκύτταρα θα αλλάξουν συµπεριφορά και θα αποκτήσουν την ικανότητα προσκόλλησης τόσο µε τον στόχο τους όσο και µεταξύ τους. Τελικά τα αιµοκύτταρα σχηµατίζουν περίβληµα γύρω από τον εισβολέα ο οποίος σχεδόν πάντα πεθαίνει. Η ικανότητα των κυττάρων να πραγµατοποιούν τις παραπάνω ανοσολογικές αντιδράσεις αλλά και γενικότερα να αντιδρούν σε κάθε αλλαγή του περιβάλλοντος, δεν θα ήταν δυνατή αν δεν µπορούσαν να επικοινωνούν µεταξύ τους. Το κεφάλαιο της κυτταρικής επικοινωνίας είναι ουσιώδες προκειµένου να δούµε τους µηχανισµούς και τα συστήµατα που πρωταγωνιστούν σε όλα τα βιολογικά φαινόµενα, συµπεριλαµβανοµένων φυσικά και αυτών που θα αναπτύξουµε στο πειραµατικό µέρος. Θα ακολουθήσει µια σχετικά µικρή αναφορά στην περιγραφή της κυτταρικής µηχανής µε σκοπό να πάρουµε µια µικρή γεύση για το πώς λειτουργεί το κύτταρο. Κυτταρική Επικοινωνία 8

7 Βασικές αρχές της κυτταρικής επικοινωνίας Με τον όρο κυτταρική επικοινωνία αναφερόµαστε στο σύνολο των ερεθισµάτων (µηνυµατοφόρων µορίων πληροφοριών) που δέχεται ένα κύτταρο από το περιβάλλον και την κατάλληλη απόκρισή του στα εξωγενή µηνύµατα. Όλοι οι οργανισµοί είναι αναπόσπαστα συνδεδεµένοι µε το περιβάλλον και αποτελούν ένα ενιαίο σύνολο. Συνεπώς η επιβίωση των οργανισµών εξαρτάται άµεσα από το περιβάλλον. Οι µονοκύτταροι οργανισµοί, π.χ. οι ζύµες, οι µυξοµύκητες, διάφορα φύκη και πρωτόζωα, εκκρίνουν µόρια που επάγουν τη συνάθροιση άλλων κυττάρων οργανισµών για γονιµοποίηση ή διαφοροποίηση κάτω από ορισµένες συνθήκες. Ενώ για τους µονοκύτταρους οργανισµούς η κυτταρική επικοινωνία είναι σε µεγάλο βαθµό αυτόνοµη, δε συµβαίνει το ίδιο και µε τους πολυκύτταρους οργανισµούς. Η συµπεριφορά κάθε κυττάρου ενός πολυκύτταρου οργανισµού πρέπει να ρυθµίζεται ανά πάσα στιγµή µε τρόπο ειδικό, προκειµένου να εξυπηρετούνται οι ανάγκες του οργανισµού ως συνόλου. Εδώ η κυτταρική επικοινωνία αγγίζει τον ύψιστο βαθµό πολυπλοκότητας. Οι αλληλεπιδράσεις των κυττάρων αποτελούν απαραίτητη προϋπόθεση για τη διατήρηση, τη διαφοροποίηση και την ανάπτυξη και οδηγούν στη δηµιουργία ιστών και οργάνων. Τρόποι κυτταρικής επικοινωνίας Η κυτταρική επικοινωνία επιτυγχάνεται άµεσα (άµεση επαφή κυττάρου µε τα γειτονικά του) ή έµµεσα (µε τη συµµετοχή εκκρινόµενων µηνυµατοφόρων µορίων). Τα µηνυµατοφόρα µόρια µπορεί να είναι από απλά αέρια (π.χ. NO και CO) µέχρι πρωτεΐνες. Η επικοινωνία µέσω εκκρινόµενων µορίων περιλαµβάνει συνήθως έξι στάδια: (1) σύνθεση του µηνυµατοφόρου µορίου, (2) απελευθέρωσή του, (3) µεταφορά του στο κύτταρο στόχο, (4) αναγνώριση από υποδοχέα του κυττάρου-στόχου, (5) αλλαγή του κυτταρικού µεταβολισµού, της λειτουργίας ή της ανάπτυξης του κυττάρου-στόχου (επάγεται από το σύµπλοκο υποδοχέας-µηνυµατοφόρο µόριο) και (6) αποµάκρυνση του µηνυµατοφόρου µορίου (τερµατισµός κυτταρικής απόκρισης). Η κυτταρική επικοινωνία ανάλογα µε την απόσταση που διανύει το µηνυµατοφόρο µόριο για να συναντήσει το κύτταρο στόχο, διακρίνεται σε τρεις τρόπους: 9

8 Ενδοκρινής τρόπος µεταβίβασης: (Σχήµα 4). Τα µηνυµατοφόρα µόρια (ορµόνες) εκκρίνονται από εξειδικευµένα ενδοκρινή κύτταρα και διατρέχουν µέσω της κυκλοφορίας του αίµατος µεγάλες αποστάσεις (µέχρι και µέτρα, π.χ. οιστρογόνα). Παρακρινής τρόπος µεταβίβασης: (Σχήµα 4). Το µηνυµατοφόρο µόριο εκκρίνεται και δρα σε µικρή απόσταση στα γειτονικά κύτταρα. Χαρακτηριστικό παράδειγµα αποτελούν τα αέρια NO και CO, και οι νευροδιαβιβαστές, π.χ. ακετυλοχολίνη. Αυτοκρινής τρόπος µεταβίβασης: (Σχήµα 4). Το µηνυµατοφόρο µόριο δρα στο ίδιο το κύτταρο από το οποίο εκκρίθηκε. Παράδειγµα αποτελούν µερικά Τ λεµφοκύτταρα που εκκρίνουν αυξητικούς παράγοντες οι οποίοι επάγουν τον πολλαπλα-σιασµό τους προκειµένου να ενισχυθεί η ανοσοαπόκριση. Ο τρόπος δράσης των µηνυµατοφόρων µορί-ων ποικίλει. Τα περισσότερα ενώνονται µε υπο-δοχείς της κυτταρικής επιφάνειας του κυττάρου-στόχου ενώ κάποια (π.χ. στεροειδείς ορµόνες) δια-περνούν την κυτταρική µεµβράνη και ενώνονται µε κυτταροπλασµατικούς ή πυρηνικούς υποδοχείς (Σχήµα 5). Μηνυµατοφόρα µόρια (πρώτα µηνύµατα) Τα εξωκυτταρικά µηνυµατοφόρα µόρια µπορεί να είναι πρωτεΐνες, πεπτίδια, αµινοξέα, νουκλεοτίδια, στεροειδή, παράγωγα λιπαρών οξέων ή διαλυ- µένα αέρια και ανήκουν σε µία από τις παρακάτω κατηγορίες: Λιπόφιλα µόρια που συνδέονται µε ενδοκυτταρικούς υποδοχείς: Τα µόρια αυτά διαχέονται διαµέσου της πλασµατικής µεµβράνης. Το σύµπλοκο µηνυµατοφόρου µορίου-υποδοχέα συνδέεται σε περιοχές µεταγραφής του DNA, αυξάνοντας ή µειώνοντας την έκφραση ειδικών γονιδίων (Σχήµα 6). Τέτοια µόρια είναι οι στεροειδείς ορµόνες (π.χ. προγεστερόνη, εκδυσόνη, τεστοστερόνη) που µπορούν µάλιστα να δρουν για ώρες ή µέρες. Υδατοδιαλυτές ορµόνες που συν-δέονται µε υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας (Σχήµα 7): Εδώ ανήκουν δύο µικρότερες οµάδες. (1) Οι πεπτιδορµόνες (π.χ. ινσουλίνη, αυξητικοί παράγοντες, γλυκαγόνο) και (2) µικρά φορτισµένα µόρια που προέρχονται από αµινοξέα και λειτουργούν ως ορµόνες και νευρο-διαβιβαστές (π.χ. επινεφρίνη, ντοπα-µίνη). 10

9 Λιπόφιλα µόρια που συνδέονται µε υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας: Εδώ ανήκουν κυρίως οι προσταγλανδίνες (συµµετέχουν σε αντιδράσεις φλεγµονής επηρεάζοντας την επούλωση πληγών). Τύποι κυτταρικών υποδοχέων Υποδοχείς κυτταρικής επιφά-νειας: H πλειοψηφία των εκκρι-νόµενων µηνυµατοφόρων µορίων δεσµεύεται σε υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας. Με αυτό τον τρόπο ρυθµίζεται η ενεργότητα ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών, οι οποίες περνούν το µήνυµα από τον υποδοχέα σε άλλους ενδοκυτ-ταρικούς στόχους µεταξύ των οποίων περιλαµβάνονται και µεταγραφικοί παράγοντες. Οι υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας χωρίζονται στις παρακάτω κατηγορίες: Υποδοχείς που συνδέονται µε G πρωτεΐνες (GPCR - G Protein Coupled Receptors). Αποτελούν την πολύ-πληθέστερη κατηγορία επιφανειακών υποδοχέων και µέσω αυτών δρα ένα µεγάλο ποσοστό φαρµάκων. Τέτοιοι είναι οι υποδοχείς πολλών νευροδιαβιβαστών, νευροπεπτιδίων και πεπτιδορµονών, όπως επινεφρίνης, γλυκαγόνου σεροτονίνης κ.ά. Οι υποδοχείς αυτοί είναι διαµεµβρανικές πρωτεΐνες που διαπερνούν τη µεµβράνη επτά φορές (Σχήµα 8) και συµµετέχουν σε µια πληθώρα µονοπατιών µεταγωγής σήµατος (Σχήµα 9). Η δέσµευση του µηνυµατοφόρου µορίου αλλάζει τη στερεοδιάταξη του υποδοχέα µε από-τέλεσµα να µπορεί η κυτταροπλασµα-τική του περιοχή να συνδεθεί µε τη G πρωτεΐνη και να την ενεργοποιήσει, οπότε αποσυν-δέεται από τον υποδοχέα και µε-ταφέρει το µήνυµα σε ένα ενδοκυτ-ταρικό στόχο που είναι είτε µεµβρα-νικό ένζυµο είτε ιοντικός δίαυλος. Το αποτέλεσµα είναι η δηµιουργία ενός ειδικού δεύτερου µηνύµατος. Υποδοχείς ιοντικών διαύλων. Το µηνυµατοφόρο µόριο όταν δεσµευτεί στον υποδοχέα αλλάζει τη στερεοδιάταξή του ώστε να περάσουν µέσα από το δίαυλο ειδικά ιόντα (Σχήµα 10). Η κίνηση των ιόντων αλλάζει το ηλεκτρικό δυναµικό της πλασµατικής µεµβράνης (χαρακτηριστικό παρά-δειγµα τέτοιου υποδοχέα είναι ο υποδοχέας της ακετυλοχολίνης στις νευροµυϊκές συνάψεις). Υποδοχείς που συνδέονται µε κινάσες. Οι υποδοχείς αυτοί δεν έχουν ενδογενή ενεργότητα κινάσης αλλά µε τη δέσµευση του µηνυµατοφόρου µορίου διµερίζονται και συνδέονται άµεσα και ενεργοποιούν µία ή περισσότερες κυτταροπλασµατικές κινάσες τυροσίνης (Eικόνα 11). Υποδοχείς µε ενδογενή ενζυµική ενεργότητα στο κυτταροπλασµατικό τους τµήµα. Οι υποδοχείς αυτοί ενεργοποιούνται ως ένζυµα µε τη δέσµευση του µηνυµατοφόρου µορίου και µεταξύ των άλλων ευθύνονται για αλλαγές του 11

10 κυτταροσκελετού, της κυτταρικής κίνησης και του σχήµατος των κυτττάρων. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν οι υποδοχείς µε ενεργότητα γουανυλικής κυκλάσης που καταλύουν τη µετατροπή του GTP σε cgmp, οι υποδοχείς που αποµακρύνουν το Ρ από τις φωσφοτυροσίνες των πρωτεϊνών-υποστρωµάτων τροπο-ποιώντας έτσι την ενεργότητά τους και οι υποδοχείς µε ενεργότητα κινάσης είτε σερίνης/θρεονίνης είτε τυροσίνης. Στο πλείστο των περιπτώσεων το µηνυµατοφόρο µόριο όταν δεσµεύεται σε υποδοχέα µε ενεργότητα κινάσης οδηγεί στο διµερισµό (ετερο- ή οµοδιµερισµό) του υποδοχέα, στην ενεργοποίησή του ως κινάση και στην αυτοφωσφορυλίωσή του στο κυτταροπλασµατικό τµήµα του. Η αυτοφωσφορυλίωση των υποδοχέων µε ενεργότητα κινάσης τυροσίνης (Receptor Tyrosine Kinases, Σχήµα 12) που είναι οι πιο µελετηµένοι υποδοχείς της κατηγορίας αυτής, τους καθιστά ικανούς να φωσφορυλιώνουν διάφορες πρωτεΐνες-υπο-στρώµατα. Επιπλέον η αυτοφωσφορυλίωση των RTKs δηµιουργεί θέσεις δέσµευσης για διάφορα κυτταροπλασµατικά ένζυµα φέρνοντάς τα έτσι κοντά στα υποστρώµατά τους στην πλασµατική µεµβράνη. Σε µερικές περιπτώσεις τα ένζυµα αυτά δηµιουργούν δεύτερα µηνύµατα. Yποδοχείς που συνδέονται µε πεπτίδια µέλη της οικογένειας TNF (Tumour Necrosis Factor) που επάγουν την απόπτωση. Οι υποδοχείς αυτοί (Σχήµα 13), τριµερίζονται συνδεόµενοι µε τα µηνυµατοφόρα µόρια θανάτου και συνδέονται στο κυτταροπλασµατικό τµήµα τους µε τις κασπάσες (πρωτεάσες) που οδηγούν στον κυτταρικό θάνατο. Παράδειγµα ο υποδοχέας Fas που εκφράζεται κυρίως σε κύτταρα του λεµφικού συστήµατος. Παίζει σηµαντικό ρόλο στον έλεγχο της απόπτωσης στο ανοσοποιητικό σύστηµα των θηλαστικών, αφενός γιατί εξαλείφει τα καρκινικά και τα µολυσµένα µε ιούς κύτταρα και αφετέρου γιατί εξαλείφει τα λεµφοκύτταρα στο τέλος της ανοσοαπόκρισης. Υποδοχείς µεταβίβασης µηνυµάτων από σηµεία επαφής κυττάρουκυττάρου. Τα σηµεία επαφής κυττάρου-κυττάρου (σύνδεσµοι πρόσδεσης, στενοσύνδεσµοι, δεσµοσώµατα-eικόνα 14) φέρνουν σε στενή επαφή τις πλασµατικές µεµβράνες γειτονικών κυττάρων (µε τους στενοσυνδέσµους οι πλασµατικές µεµβράνες δε συντήκονται) και δεν αποτελούν απλώς δοµικές συνδέσεις αλλά και κέντρα µεταβίβασης µηνυµάτων από το εξωτερικό περιβάλλον. Πράγµατι στα σηµεία αυτά έχουν διαπιστωθεί πλήθος κυτταροσκελετικών πρωτεϊνών αλλά και πρωτεϊνών που είναι συστατικά 12

11 µεταβίβασης µηνυµάτων όπως κινάσες, φωσφατάσες και πρωτεΐνες συνδετήρες. Υποδοχείς τέτοιων σηµάτων είναι οι διαµεµβρανικές πρωτεΐνες ιντεγκρίνες και καντερίνες. Οι ενδοκυτταρικές οδοί που ξεκινούν από τους υποδοχείς αυτούς οδηγούν σε αλλαγές στην οργάνωση του κυτταροσκελετού και εποµένως σε αλλαγές του κυτταρικού σχήµατος, σε κίνηση, σε κυτταρική προσκόλληση κ.ά. Υποδοχείς µεταβίβασης µηνυµάτων από σηµεία επαφής κυττάρουεξωκυτταρικής ύλης. Τα σηµεία επαφής κυττάρου-εξωκυτταρικής ύλης είναι τα ηµιδεσµοσώµατα και οι εστίες προσκόλλησης. Τα ηµιδεσµοσώµατα είναι ισχυρές προσκολλήσεις µεταξύ επιθηλιακών κυττάρων και του υποκείµενου βασικού ελάσµατος. Κύριο στοιχείο των ηµιδεσµοσωµάτων είναι οι ιντεγκρίνες (διαµεµβρανικές πρωτεΐνες-υποδοχείς), για τις οποίες θα γίνει ιδιαίτερη αναφορά αργότερα. Οι εστίες προσκόλλησης (τα πιο µελετηµένα σηµεία κυτταρικών επαφών, για τα οποία θα γίνει αργότερα εκτενής αναφορά) δηµιουργούνται όταν ένα κύτταρο προσκολλάται in vitro σε µία επιφάνεια. Αποτελούν δυναµικές δοµές αφού δηµιουργούνται µόνο όταν το κύτταρο επιθυµεί να προσκολληθεί σε ένα υπόστρωµα και αποδιοργανώνονται όταν αυτό διεγείρεται να κινηθεί ή να διαιρεθεί. Η παρουσία εστιών προσκόλλησης είναι αντιστρόφως ανάλογη της κινητικότητας των κυττάρων. Επίσης χαρακτηρίζονται από την παρουσία ιντεγκρίνης και της κινάσης εστιών προσκόλλησης και αποτελούν σηµεία όπου (σε καλλιέργειες ινοβλαστών) το φυσιολογικό κενό 50nm µεταξύ της επιφάνειας του κυττάρου και του υποστρώµατος, µειώνεται σε 10-15nm. Μόρια που συµµετέχουν στην ενδοκυτταρική µεταβίβαση µηνυµάτων εύτερα µηνύµατα Η δέσµευση των µηνυµατοφόρων µορίων στους υποδοχείς τους συνεπάγεται αύξηση ή µείωση της συγκέντρωσης ενδοκυτταρικών µορίων γνωστών ως δεύτερα µηνύµατα. Τέτοια µόρια είναι τα camp, cgmp, Ca 2+, DAG, IP 3. PIP 3 κ.α. Η αλλαγή στη συγκέντρωση των παραπάνω µηνυµάτων οδηγεί σε αλλαγή της ενεργότητας πρωτεϊνών µε τελικό αποτέλεσµα αλλαγές π.χ. του µεταβολισµού, του πολλαπλασιασµού ή της διαφοροποίησης µέσω ρύθµισης της µεταγραφής ειδικών γονιδίων. 13

12 Ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες Οι οδοί µεταβίβασης των διάφορων εξωκυτταρικών µηνυµάτων εκτός από τους υποδοχείς και τα δεύτερα µηνύµατα περιλαµβάνουν πολλούς άλλους τύπους πρωτεϊνικών ή µη µορίων όπως αυτά που περιγράφονται παρακάτω. G πρωτεΐνες: Οι πρωτεΐνες αυτές ανάβουν και σβήνουν όταν ενώνονται µε το GTP και GDP αντίστοιχα (σχ. 15). Όταν απουσιάζει το µηνυµατοφόρο µόριο είναι δεσµευµένες µε το GDP. Η παρουσία του µορίου ενεργοποιεί την απελευθέρωση του GDP και τη δέσµευση του GTP. Η ενδογενής ενεργότητα GTPάσης των G πρωτεϊνών υδρολύει το GTP σε GDP και P µετατρέποντας την ενεργό µορφή σε ανενεργό. Υπάρχουν 2 κατηγορίες τέτοιων G πρωτεϊνών. Οι τριµερείς G πρωτεΐνες (συνδέονται µε την πλασµατική µεµβράνη οµοιοπολικά διαµέσου λιπιδικών αλυσίδων) που συνδέονται άµεσα µε υποδοχείς και οι µονοµερείς Ras και τύπου Ras (Rho, Rab, Ran) που συνδέονται µε τους υποδοχείς έµµεσα. Η ενεργοποίηση των δύο κατηγοριών G πρωτεϊνών ρυθµίζεται µε πολύ διαφορετικό τρόπο. Για τις τριµερείς G πρωτεΐνες η ενεργοποίηση γίνεται µε τη δέσµευση του µηνυµατοφόρου µορίου στον υποδοχέα η οποία οδηγεί σε αλλαγή της διαµόρφωσής του µε αποτέλεσµα το κυτταροπλασµατικό του τµήµα να αλληλεπιδράσει µε την α υποµονάδα της G πρωτεΐνης η οποία στην ανενεργό κατάσταση είχε δεσµευµένο το GDP και ήταν ενωµένη µε τις βγ υποµονάδες. Η αλλαγή όµως διαµόρφωσης του υποδοχέα επάγει την ανταλλαγή του GDP µε GTP και την ενεργοποίηση έτσι της α υποµονάδας που αποδεσµεύεται από τις βγ οι οποίες παραµένουν ενωµένες. Στη συνέχεια και οι α και οι βγ υποµονάδες αλληλεπιδρούν µε τις πρωτεΐνες στόχους. Η ενεργότητα της α υποµονάδας σταµατά µε την υδρόλυση του δεσµευµένου GTP οπότε η ανενεργή δεσµευµένη µε GDP τώρα υποµονάδα α ξαναενώνεται µε το σύµπλοκο βγ. Για τις µονοµερείς G πρωτεΐνες η ενεργοποίηση και απενεργοποίηση γίνεται από διάφορες ρυθµιστικές πρωτεΐνες τις GEFs και GAPs. Οι πρώτες δρουν ως παράγοντες ανταλλαγής των νουκλεοτιδίων (GEFs) που επάγουν την απελευθέρωση του GDP και την ένωση µε GTP και οι δεύτερες επάγουν την ενδογενή δράση GTPασης που έχουν οι G πρωτεΐνες. Κινάσες: Η ενεργοποίηση των υποδοχέων της κυτταρικής επιφάνειας οδηγεί σε αλλαγές στη φωσφορυλίωση διαφόρων κυτταροπλασµατικών πρωτεϊνών η οποία επιτυγχάνεται µε την ενεργοποίηση των κινασών. Σε µερικές 14

13 περιπτώσεις οι κινάσες αποτελούν τµήµα του ίδιου του υποδοχέα και σε άλλες είναι κυτταροπλασµατικές κινάσες ή κινάσες που συνδέονται µε την κυτταροπλασµατική µεµβράνη. Τα ζωικά κύτταρα έχουν 2 τύπους κινασών, τις κινάσες τυροσίνης και τις κινάσες σερίνης ή θρεονίνης µε πολύ παρόµοιες καταλυτικές περιοχές 250 αµινοξέων. Η ενεργότητά τους σταµατά µε τη δράση των φωσφατασών που αποµακρύνουν το P από ειδικές πρωτεΐνες. Πρωτεΐνες-συνδετήρες: Πολλοί οδοί µεταβίβασης σηµάτων περιλαµβάνουν µεγάλα πολυπρωτεϊνικά σύµπλοκα που συχνά συγκρατούνται µεταξύ τους µε πρωτεΐνες-συνδετήρες (adaptor proteins) που δεν έχουν καµία καταλυτική δράση αλλά περιέχουν περιοχές που λειτουργούν ως θέσεις σύνδεσης άλλων πρωτεϊνών αλλά και φωσφολιπιδίων. Oι πρωτεΐνες-συνδετήρες περιέχουν περιοχές SH2 (ανακαλύφθηκαν αρχικά στην κινάση Src) και PTB που ενώνονται µε κατάλοιπα φωσφοτυροσίνης, περιοχές SH3 (ανακαλύφθηκαν αρχικά στην κινάση Src) για δέσµευση µε αλληλουχίες πλούσιες σε προλίνη, περιοχές ΡΗ για δέσµευση µε ινοσιτίδια και περιοχές PDZ που ενώνονται µε αλληλουχίες καρβοξυτελικού άκρου που φέρουν υδρόφοβα κατάλοιπα. Σε µερικές περιπτώσεις οι πρωτεΐνες-συνδετήρες περιέχουν µια σειρά από περιοχές δέσµευσης ενός τύπου και σε άλλες περιέχουν συνδυασµούς πολλών τύπων, συγκεντρώνοντας έτσι περισσότερα στοιχεία του κυκλώµατος µεταβίβασης. Με αυτό τον τρόπο το κύτταρο πετυχαίνει πολύπλοκες αλληλεπιδράσεις µεταξύ των οδών µεταβίβασης σηµάτων χωρίς να απαιτείται η σύνθεση νέων πρωτεϊνών. Πρωτεΐνες-ικριώµατα (scaffold proteins): Συγκρατούν κοντά διάφορες πρωτεΐνες και εξασφαλίζουν ότι πολλά µόρια µεταβίβασης µηνυµάτων θα δράσουν σχεδόν συγχρόνως. Επιταχύνουν τη µεταγωγή των µηνυµάτων, αλλά και περιο-ρίζουν τα λάθη. Οι πρωτεΐνες-ικριώµατα φαίνεται να αποτελούν κοινή στρατηγική που χρησιµοποιούν τα κύτταρα για να εµποδίσουν να δράσουν σε ένα συγκεκριµένο στόχο λάθος κινάσες και φωσφατάσες. Το επιτυγχάνουν αυτό συγκρατώντας τις κατάλληλες κινάσες και φωσφατάσες κοντά στις πρωτεΐνες που ρυθµίζουν. Αρθρωτές πρωτεΐνες (modular proteins): Πρόκειται για πρωτεΐνες που συµµετέχουν στις οδούς µεταβίβασης µηνυµάτων και σχηµατίζονται από επιµέρους κοµµάτια που επιτελούν διαφορετικές λειτουργίες. Τα κοµµάτια αυτά δεν ανήκουν µόνιµα σε συγκεκριµένη πρωτεΐνη αλλά σε διαφορετικές 15

14 χρονικές στιγµές µπορεί να ανήκουν σε διαφορετικές πρωτεΐνες ώστε να διευκολύνουν µε τη λειτουργία τους τη µεταβίβαση του µηνύµατος. Αναµειγνύοντας δηλαδή το κύτταρο διάφορα πρωτεϊνικά κοµµάτια µπορεί να δηµιουργεί συνδυασµούς µορίων. Λιπίδια: Στην έναρξη της µεταβίβασης µηνυµάτων φαίνεται να συµµετέχουν και τα µεµβρανικά λιπίδια. Σφιγγολιπίδια και χοληστερόλη συγκεντρώνονται σε περιοχές της πλασµατικής µεµβράνης που καλούνται νησίδες (lipid rafts) και συγκεντρώνουν πρωτεΐνες προκειµένου να δράσουν µαζί. Ενδοκυτταρικοί οδοί µεταβίβασης µηνυµάτων H αλυσίδα ενδοκυτταρικών αντιδράσεων που ξεκινά από την επιφάνεια του κυττάρου, µπορεί να έχει ως τελικό στόχο είτε κυτταροπλασµατικές πρωτεΐνες, είτε µεταγραφικούς παράγοντες. Οι οδοί µεταβίβασης µηνυµάτων οδηγούν σε κυτταρικές αποκρίσεις όπως αλλαγή µεταβολισµού, σχήµατος, κίνηση, διαφοροποίηση, πολλαπλασιασµό, έκκριση, επιβίωση ή θάνατο. Αυτό το πετυχαίνουν προκαλώντας αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση. Οι πιο µελετηµένες οδοί µεταβίβασης µηνυµάτων που προέρχονται από υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας είναι οι παρακάτω. Η οδός cαμρ (κυκλικό ΑΜΡ): Το κυκλικό ΑΜΡ (σηµαντικό δεύτερο µήνυµα στα ζωϊκά κύτταρα) σχηµατίζεται από το ένζυµο αδενυλική κυκλάση, µόλις ενεργοποιηθεί από G πρωτεΐνες. Η δράση του (Σχήµα 16) επιτελείται µέσω της κινάσης Α (PKA) η οποία φωσφορυλιώνει ένζυµα στο κυτταρόπλασµα αλλά και στον πυρήνα (τον παράγοντα µεταγραφής CREB). Η απόκριση τερµατίζεται µε τη δράση φωσφατασών. Οδοί cgmp (κυκλικού GMP): To κυκλικό GMP σχηµατίζεται κατόπιν ενεργοποίησης της γουανυλικής κυκλάσης και η αποικοδόµησή του γίνεται από φωσφοδιεστεράση. Η ενεργοποίηση της γουανυλικής κυκλάσης µπορεί να γίνει από το µονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ, δρα ως µηνυµατοφόρο µόριο προκαλώντας αύξηση στα επίπεδα του cgmp). Η δράση του cgmp µπορεί να στοχεύει στη ρύθµιση ιοντικών διαύλων ή επιτυγχάνεται διαµέσου κινάσης. Οδοί φωσφολιπιδίων: Παράγωγα µεµβρανικών φωσφολιπιδίων (κυρίως της φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης) δηµιουργούν δεύτερα µηνύµατα που προκύπτουν από φωσφορυλίωση ινοσιτόλης σε διάφορες θέσεις. (α) Η οδός ΙΡ3 και Ca +2 (Σχήµα 17). Ορµόνες και αυξητικοί παράγοντες δεσµεύονται σε υποδοχείς 16

15 (τύπου RTK ή υποδοχείς που συνδέονται µε τριµερείς G πρωτεΐνες) προκαλώντας την παραγωγή δύο δεύτερων µηνυµάτων από τη δράση του ενζύµου φωσφολιπάση C στο φωσφολιπίδιο PIP 2. Η διακυλογλυκερόλη (DAG), το ένα από τα δύο δεύτερα µηνύµατα (λιπόφιλο µόριο που παραµένει συνδεδεµένο µε τη µεµβράνη), ενεργοποιεί την κινάση C, η οποία ενεργοποιεί τις πρωτεΐνες της οδού MAPK. Η τριφωσφορική ινοσιτόλη (IP 3 ), το άλλο δεύτερο µήνυµα, κινητοποιεί την έξοδο του Ca 2+ από τις αποθήκες του ενδοπλασµατικού δικτύου δεσµευόµενη σε υποδοχείς του που είναι δίαυλοι Ca 2+. Η αύξηση των επιπέδων Ca 2+ καταλήγει σε ενεργοποίηση πρωτεϊνών όπως η καλµοντουλίνη, µε τελικό αποτέλεσµα τη φωσφορυλίωση κυτταροπλασµατικών (π.χ. ένζυµα µεταβολισµού) και πυρηνικών πρωτεϊνών (µεταγραφικός παράγοντας CREB). Οδός PI3-K/Akt (Σχήµα 18): Η κινάση PI3-K (κινάση φωσφολιπιδίων ινοσιτόλης) φωσφορυλιώνει το PIP 2 παράγοντας ένα άλλο δεύτερο µήνυµα, το PIP 3. Το PIP 3 µπορεί να ενεργοποιηθεί και από G πρωτεΐνες και από υποδοχείς µε ενεργότητα κινάσης τυροσινών. Κατόπιν ενεργοποίησης ενώνεται µε την κινάση PDK και την κινάση σερίνης/θρεονίνης Αkt ή PKB (protein kinase Β) διαµέσου της PH περιοχής, οδηγώντας σε φωσφορυλίωση της Αkt. Η ενεργοποιηµένη τώρα Αkt ενεργοποιείται και φωσφορυλιώνει πλήθος πρωτεϊνών (µέλη της οικογένειας Bcl-2) που ρυθµίζουν τον κυτταρικό θάνατο ή την επιβίωση. Οι οδοί ΜΑΡΚ: Οι οδοί ΜΑΡΚ (Σχήµα 19) περιλαµβάνουν την ενεργοποίηση µιας σειράς κινασών των πρωτεϊνών σε απόκριση σε µια ποικιλία εξωκυτταρικών σηµάτων. Οι ευκαρυωτικοί οργανισµοί διαθέτουν πολλαπλές οδούς ενεργοποίησης ΜΑΡΚ (οδοί ERK, JNK, P38) οι οποίες καταλήγουν σε ποικίλες αποκρίσεις. Στις ΜΑΡΚ θα αναφερθούµε εκτενέστερα στη συνέχεια. H οδός JAK-STAT (Σχήµα 20): Οι οδοί ΜΑΡΚ συνδέουν έµµεσα την κυτταρική επιφάνεια µε τον πυρήνα µέσω των κινασών σερίνης/θρεονίνης που φωσφορυλιώνουν µεταγραφικούς παράγοντες. Μία άλλη οδός πολύ περισσότερο άµεση είναι η οδός JAK/STAT. Στην οδό αυτή η κινάση τυροσίνης JAK (που συνδέεται µε το κυτταροπλασµατικό τµήµα του υποδοχέα) φωσφορυλιώνει τους µεταγραφικούς παράγοντες STAT (περιέχουν περιοχές SH2 και βρίσκονται στο κυτταρόπλασµα) προκαλώντας το διµερισµό τους και τη µετανάστευσή τους στον πυρήνα όπου µεταγράφουν τα γονίδια-στόχους. Τα µηνυµατοφόρα µόρια σε αυτή την οδό είναι κυτταροκίνες αλλά και αυξητικοί παράγοντες. 17

16 Οδοί απόπτωσης και επιβίωσης: Η απόπτωση (προγραµµατισµένος κυτταρικός θάνατος) είναι αποτέλεσµα οδών που περιλαµβάνουν τρεις κατηγορίες µορίων: (α) τα ρυθµιστικά µόρια (πρωτεΐνες µέλη της οικογένειας Bcl-2 στα θηλαστικά), που είναι κλειδιά για τη ζωή ή το θάνατο των κυττάρων εφόσον επάγουν (προαποπτωτικές πρωτεΐνες) ή µπλοκάρουν (αντιαποπτωτικές πρωτεΐνες) τα µηνύµατα θανάτου, (β) πρωτεΐνες τελεστές. Η κατηγορία αυτή περιλαµβάνει τις πρωτε-άσες κυστεΐνης γνωστές ως κασπάσες, οι οποίες συνθέτονται ως ανενεργά πρόδροµα µόρια και (γ) πρωτεΐνες συνδέτες των κασπασών (CED-4, dark, Apaf-1). Υπάρχουν δύο κύριες οδοί απόπτωσης (Σχήµα 21). (α) Η εξω-γενής που επάγεται από τη δέσµευση υποδοχέων της κυτταρικής επιφά-νειας µε µόρια θανάτου π.χ. µέλη της οικογένειας του TNF και (β) η ενδογενής που επάγεται από στρεσογόνα σήµατα όπως π.χ. καταστροφή DNA, από έλλειψη τροφικών παραγόντων κ.ά. που επάγουν την απελευθέρωση από τα µιτοχόνδρια του κυτταροχρώµατος C και άλλων αποπτωτικών παραγόντων. Κάθε µια οδός ενεργοποιεί ειδικές εναρκτήριες κασπάσες, την κασπάση-8 και κασπάση-9 αντίστοιχα. Και οι δύο οδοί συγκλίνουν στην ενεργοποίηση του τελεστή κασπάση-3 (ενεργοποιείται και από την κασπάση 8 και από την κασπάση 9) η οποία µε τη σειρά της περνά το σήµα θανάτου σε άλλες κασπάσες. Έτσι ξεκινά µια αλυσίδα διαδοχικών πρωτεολύσεων µε τελικό αποτέλεσµα την πρωτεόλυση πρωτεϊνών-στόχων όπως FAK, λαµίνες, ένζυµα επιδιόρθωσης DNA κ.ά. και τελικά την απόπτωση. Κάτω από φυσιολογικές καταστάσεις (τα κύτταρα δέχονται τροφι-κούς παράγοντες) οι κασπάσες βρίσκονται στο κυτταρόπλασµα και το κυτταρόχρωµα C στα µιτοχόνδρια. Αν όµως το κύτταρο στερηθεί κάποιον από αυτούς τους τροφικούς παράγοντες οδηγείται σε απόπτωση. Ρύθµιση των κυτταρικών αποκρίσεων σε εκκρινόµενα µόρια. Ενίσχυση. Για την ενίσχυση των αποκρίσεων χρησιµοποιούνται από τα κύτταρα διάφοροι µηχανισµοί. Π.χ. η µεταβίβαση σηµάτων διαµέσου τριµερών G πρωτεϊνών προκαλεί ενίσχυση του αρχικού εξωκυτταρικού σήµατος κατά την ενδοκυτταρική του µεταβίβαση από µια αλυσίδα ενδιάµεσων µεσολαβητών. Ένα εξωκυτταρικό µόριο µπορεί να ενεργο-ποιήσει πολλά µόρια G πρωτεΐνης καθένα από τα οποία ενερ-γοποιεί ένα µόριο κυκλάσης. Καθώς δε κάθε µόριο G διατηρεί την ενερ-γότητά του για δευτερόλεπτα πριν υδρολυθεί διατηρεί και 18

17 το µόριο της κυκλάσης στο οποίο έχει δεσµευτεί ενεργό και έτσι η κυκλάση µπορεί να µετατρέψει ένα µεγάλο αριθµό µορίων ATP σε µόρια cαμρ. Τελικά ένα εξωκυτταρικό µόριο µπορεί να προκαλέσει την αλλαγή χιλιάδων µορίων του κυττάρου στόχου. Προσαρµογή. Τα κύτταρα υπόκεινται σε µια διαδικασία προσαρµογής ή ευαισθητοποίησης µε την οποία η απόκρισή τους ελαττώνεται όταν εκθέτονται για παρατεταµένο χρονικό διάστηµα στο ερέθισµα. Η προσαρµογή επιτυγχάνεται µε αρνητική ανάδραση που δρα µε καθυστέρηση. ηλαδή µια έντονη απόκριση τροποποιεί τη µηχανή που οδηγεί στην απόκριση και τη σταµατά. Η προσαρµογή συµβαίνει µε βαθµιαία ελάττωση του αριθµού των υποδοχέων της επιφάνειας (down regulation ενδοκυττάρωση και αποικοδό- µηση υποδοχέων), µε απενεργοποίηση των υποδοχέων (φωσφορυλίωση υποδοχέων - ταχεία προσαρµογή) ή µε αλλαγές των πρωτεϊνών που λαµβάνουν µέρος στην ενδοκυτταρική µεταβίβαση του σήµατος (G πρωτεΐνες και άλλες που βρίσκονται µετά τις G στις οδούς µεταβίβασης). Eστίες προσκόλλησης (Focal Adhesions) Στη συνέχεια θα µελετήσουµε αναλυτικότερα τη µεταγωγή σήµατος που σχετίζεται µε τα σύµπλοκα των εστιών προσκόλλησης, τα οποία αποτελούν και το ερευνητικό µέρος αυτής της µεταπτυχιακής διατριβής. Ξεκινώντας από τις ιντεγκρίνες θα καταλήξουµε στην κινάση εστιών προσκόλλησης και στα ενδοκυτταρικά µονοπάτια που εµπλέκεται αυτή. Ιντεγκρίνες (integrins) Είναι ετεροδιµερείς διαµεµβρανικοί υποδοχείς που αποτελούνται από δύο µη οµοιοπολικά συνδεδεµένες υποµονάδες, α και β (Σχήµα 22). Κάθε υποµονάδα είναι µία διαµεµβρανική γλυκοπρωτεΐνη µε µικρή κυτταροπλασµατική περιοχή. Η ικανότητά τους να συνδέονται µε πρωτεΐνες της εξωκυτταρικής ύλης (κολλαγόνο, λαµινίνες, βιτρονεκτίνη, φιµπρονεκτίνη) συνεπάγεται τη µεταγωγή σηµάτων στο εσωτερικό του κυττάρου (outside-in signaling). Tα σήµατα αυτά ρυθµίζουν την ενεργότητα κυτταροπλασµατικών κινασών και υποδοχέων αυξητικών παραγόντων επηρεάζοντας δραστηριότητες όπως η οργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης, η ρύθµιση του κυτταρικού κύκλου, η επιβίωση, η µετανάστευση, η κυτταροφαγία και η διαφοροποίηση 19

18 (Giancotti et al., 1999, Howe et al., 1998) (Σχήµα 23). Το κύτταρο µπορεί και ρυθµίζει από µόνο του την ικανότητα των ιντεγκρινών να δεσµεύουν πρωτεΐνες της εξωκυτταρικής ύλης (inside-out signaling) (Giancotti, 1999). Mέχρι σήµερα είναι γνωστές τουλάχιστον 9 β και 24 α υποµονάδες µε ικανότητα να προσδένουν πληθώρα πρωτεϊνών (Σχήµα 24). Η ικανότητα των ιντεγκρινών να δένουν προσδέµατα εξαρτάται από την εξωκυτταρική συγκέντρωση δισθενών ιόντων (Ca +2 ή Mg +2 ). Η παρουσία τους είναι αισθητή σε όλους τους ιστούς (Σχήµα 25) όπου συναντώνται ιντεγκρίνες µε διαφορετικούς συνδυασµούς α και β υποµονάδων που καθορίζουν και την ειδικότητα του προσδέµατος. Η δέσµευση των ιντεγκρινών µε πρωτεΐνες της εξωκυτταρικής ύλης συνεπάγεται συνάθροιση ιντεγκρινών στην κυτταρική µεµβράνη (clustering) και ακολουθεί σύνδεσή τους µε πρωτεϊνικά σύµπλοκα µεταβίβασης σήµατος. Η συγκέντρωση ινιδίων ακτίνης και η αναδιοργάνωσή τους σε µεγαλύτερα ινίδια (Σχήµα 26), είναι απαραίτητη προκειµένου να ακολουθήσει µεγαλύτερη συνάθροιση ιντεγκρινών ενισχύοντας έτσι την πρόσδεση στο εξωκυτ-ταρικό υλικό. Αυτό το σύστηµα θετικής επα-νατροφοδότησης κα-τάλήγει στο σχηµα-τισµό συσσωµατωµά-των στη µεµβράνη που αποτελούνται α-πό πρωτεΐνες της εξωκυτταρικής ύλης, ιντεγκρίνες και κυττα-ροπλασµατικές πρωτεΐνες. Τα σύµπλοκα που σχηµατίζονται µπορούν να ανιχνευθούν µε τεχνικές ανοσοφθορισµού και καλούνται εστίες προσκόλλησης (Giancotti, 1997). Oι ιντεγκρίνες µεταβιβάζουν σήµατα µέσω οδών στις οποίες συµµε-τέχουν η FAK και οι κινάσες Src κα-τάλήγοντας συνή-θως σε ενεργοποί-ηση των MAPK (Σχήµα 27). Κινάση Src Η κινάση Src και οι άλλες κινάσες της οικογένειας αυτής, αποτελούν ρυθµι-στικές πρωτεΐνες που συµµετέχουν σε µονοπάτια µεταγωγής σήµατος στα οποία εµπλέκεται η FAK. Έχουν σηµαντικό ρόλο στην κυτταρική διαφοροποίηση, στη ρύθµιση της κινητικότητας του κυττάρου, στον πολλαπλασιασµό, την κυτταροφαγία και την επιβίωση (Jones et al., 2000, Wozniak et al., 2004). Το µόριο µιας Src κινάσης (Σχήµα 28) αποτελείται (από το αµινοτελι-κό προς το καρβο-ξυτελικό άκρο) α-πό µία SH4 περιο-χή, µία µοναδική αλληλουχία, µία SH3 περιοχή, µία SH2 περιοχή, την περιοχή µε ενεργότητα κινάσης-τυροσίνης και το καρβοξυ-τελικό ρυθµιστικό άκρο. 20

19 Η ρύθµιση των κινασών Src γίνεται από ποικιλία µεµβρανικών υποδοχέων όπως ιντεγκρίνες, υποδοχείς µε ενεργότητα κινάσης-τυροσίνης, υποδοχείς κυτταροκινών κ.ά. (Τhomas, 1997). H µεταγωγή µηνυµάτων µέσω των κινασών Src περιλαµβάνει τη συµµετοχή πρωτεϊνών όπως η p85 (η ρυθµιστική υποµονάδα της PI-3K), η κινάση εστιών προσκόλλησης, η ταλίνη, η παξιλίνη κ.ά. (Βrown, 1996). Η κινάση Src απαντάται στο κύτταρο στα ενδοσώµατα, στα εκκριτικά κοκκία και στην κυτταροπλασµατική επιφάνεια της κυτταρικής µεµβράνης. Eκτός από το πρωτεϊνικό οµόλογο των ζώων (c- Src) υπάρχει και η οµόλογη πρωτεϊνη των ιών (v- Src). Η ενεργοποίηση της Src απαιτεί φωσφορυλίωση-αποφωσφορυλίωση σε συγκεκριµένα αµινοξέα (Σχήµα 29). Στα πιο κρίσιµα γεγονότα που σηµατοδοτούν την ενεργοποίηση ανήκουν η αυτοφωσφορυλίωση στην Tyr-416 και η αποφωσφορυλίωση στην Tyr-527 που πραγµατοποιείται από φωσφατάσες όπως οι ΡΤΡ1Β, Shp1 και Shp2. Η φωσφορυλίωση της Tyr-527 γίνεται από την κινάση Csk και έχει σαν αποτέλεσµα την αλληλεπίδραση αυτής της τυροσίνης µε την περιοχή SH2 αναστέλλοντας έτσι τις δράσεις της Src. Μείωση της ικανότητας της Src να δρα ως κινάση µπορεί να επιτευχθεί και µε αποφωσφορυλίωση στην Tyr-416. ILK (integrin linked kinase) pinch Η ILK ταυτοποιήθηκε και κλωνοποιήθηκε βάσει της ικανότητάς της να αλληλεπιδρά µε το κυτταροπλασµατικό τµήµα της β1 ιντεγκρίνης (Hannigan, 1996). Λαµβάνει µέρος σε πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις αλλά διαθέτει και ενεργότητα κινάσης σερίνης-θρεονίνης (Wu et al., 2001). Σχηµατίζει σύµπλοκο µέσω της ΑΝΚ (περιοχή αγκυ-ρίνης) περιοχής της µε την LIM1 περιοχή της pinch (Tu et al., 1999), (Eικόνα 30). Εντοπίζεται στις εστίες προσκόλλησης όπου ρυθµίζει την κυτταρική προσκόλληση και επέκταση (spreading). Για τον εντοπισµό στις εστίες προσκόλλησης σηµαντικές είναι οι αλληλεπιδράσεις της µε την παξιλίνη (περιοχή LD1) και την pinch (Nikolopoulos et al., 2001), αφού πειράµατα µε µεταλλάξεις στις θέσεις αλληλεπίδρασης µε αυτές τις πρωτεΐνες φανέρωσαν αδυναµία της ILK να µεταφερθεί στις εστίες προασκόλλησης. H ενεργοποιηµένη ILK µπορεί και φωσφορυλιώνει την κινάση Αkt συµβάλλοντας στην καταστολή της απόπτωσης (απενεργοποίηση της κασπάσης 3) ενώ συµµετέχει επίσης στη ρύθµιση της ενεργότητας της ΜΑΡΚ ERK (Eικόνα 31). 21

20 Η πρωτεΐνη pinch απαντάται σε δύο ισοµορφές (pinch1 και pinch2) που στον άνθρωπο έχουν οµολογία αµινοξικής αλληλουχίας 82% (Wu 2004). Η ικανότητα της pinch να δηµιουργεί σύµπλοκο µε την ILK έχει ιδιαίτερη βαρύτητα αφού οι περισσότερες από τις δράσεις της ILK (π.χ. συµµετοχή στην τροποποίηση της µορφής του κυττάρου, κυτταρική κίνηση) αναστέλλονται απουσία αυτού του συµπλόκου. H πα-ρουσία στο κύτταρο συµ-πλόκων ILKpinch είναι σηµαντική α-φού η ιδιό-τητα της ILK να συνδέεται µε τις ιντεγκρίνες αλλά και µε την παξιλίνη δί-νει στο κύτταρο άλλο ένα τρόπο να συνδέει τις ιντεγκρίνες µε τον κυτταροσκελετό της ακτίνης. Παξιλίνη (paxillin) Aρχικά χαρακτηρίστηκε σαν µια πρωτεΐνη 68 kda που εντοπίζεται στις εστίες προσκόλλησης και παρουσιάζει αυξηµένη φωσφορυλίωση σε τυροσίνες, µετά από έκφραση του ογκογονιδίου v-src (Glenney et al., 1989). Aποτελεί µέλος µιας υπεροικογένειας που περιλαµβάνει άλλα 2 µέλη (Hic-5 α, Leupaxin). Στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισµούς έχουν ταυτοποιηθεί τρεις ισοµορφές της παξιλίνης που προκύπτουν από εναλλακτικό µάτισµα του RNA (alternative RNA splicing). Η απουσία ενζυµικής δράσης και η παρουσία πολλών διαφορετικών περιοχών στο µόριο της παξιλίνης, ώθησαν από νωρίς στη σκέψη ότι αποτελεί µια πρωτεΐνη συνδετήρα. Το αµινοτελικό άκρο περιέχει πέντε περιοχές πλούσιες σε λευκίνη (LD περιοχές) ενώ το καρβοξυτελικό αποτελείται από τέσσερις LIM περιοχές (Σχήµα 33). Όλες οι πιο πάνω περιοχές του µορίου χρησιµεύουν για πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις. Η παρουσία SH3 περιοχών στο αµινοτελικό άκρο της παξιλίνης ίσως υποδηλώνει σύνδεση-φωσφορυλίωση από την Src. Κάθε LD περιοχή πραγµατοποιεί ειδικές αλληλεπιδράσεις. Στην LD1 περιοχή προσδένονται η ακτοπαξίνη, η βινκουλίνη και η ILK, στην LD2 περιοχή προσδένονται η βινκουλίνη και η FAK και στην LD4 περιοχή γίνεται πρόσδεση ακτοπαξίνης και FAK. Για τις LD3,5 περιοχές δεν έχουν βρεθεί ακόµα µόρια πρόσδεσης. Για τη σχέση της παξιλίνης µε τη FAK έχουν ειπωθεί πολλά. Πειράµατα µε µεταλλάξεις που συνεπάγονται αδυναµία της FAK να αλληλεπιδράσει µε την παξιλίνη, έχουν δείξει ότι το µόριο της FAK δεν εντοπίζεται τελικά στις εστίες προσκόλλησης (Ηildebrand et al., 1995). Παρόµοια πειράµατα όµως έχουν δείξει και το αντίστροφο αποτέλεσµα, δηλαδή ότι η FAK µπορεί να εντοπιστεί στις εστίες προσκόλλησης ακόµα και απουσία 22

21 σύνδεσης µε την παξιλίνη. Το µόνο σίγουρο για τις σχέσεις των δύο αυτών πρωτεϊνικών µορίων είναι ότι η αλληλεπίδρασή τους συνεπάγεται αύξηση της φωσφορυλίωσης της παξιλίνης σε τυροσίνες, είτε από την ίδια τη FAK, είτε έµµεσα (φωσφορυλίωση από την Src) (Weng et al., 1993). Oι περιοχές LIM ευθύνονται για τη σύνδεση της παξιλίνης µε τον κυτταροσκελετό, αλλά και για τον εντοπισµό στις εστίες προσκόλλησης. Με φωσφορυλίωση σε σερίνες-θρεονίνες στις LIM2,3 περιοχές πραγµατοποιείται εντοπισµός στις εστίες προσκόλλησης και σύνδεση µε τουµπουλίνη (Brown et al., 1998, Herreros et al., 2000). Με τις LIM3,4 περιοχές γίνεται σύνδεση µε την φωσφατάση PTP-PEST. H εκπληκτική ικανότητα της παξιλίνης να αλληλεπιδρά µε άλλα µόρια δε σταµατά εδώ αφού είναι γνωστή η σύνδεσή της και µε άλλα µόρια όπως η ταλίνη, η αντιαποπτωτική πρωτεΐνη bcl-2 (Sorenson, 2004) και η β1 ιντεγκρινική υποµονάδα (Tanaka et al., 1996) Οι περιοχές LD και LIM είναι ιδιαίτερα συντηρηµένες τόσο µέσα στην υπεροικογένεια της παξιλίνης όσο και µεταξύ των ειδών (π.χ. Drosophila, Xenopus, άνθρωπο) (Wheeler et al., 2001). Η παξιλίνη φωσφορυλιώνεται σε τυροσίνες αλλά και σερίνες-θρεονίνες (Σχήµα 34). Η FAK και η Src την φωσφορυλιώνουν στις θέσεις Tyr-31 και Tyr-118 (Bellis et al., 1995). Aκολουθεί φωσφορυλίωση στις θέσεις Tyr-40, Tyr-88 και Tyr-181. Φωσφορυλίωση σε τυροσίνες µπορεί να προκληθεί και από ΜΑΡΚs. Eνδιαφέρον παρουσιάζει η φωσφορυλίωση στην Tyr-178 από την JNK (Huang et al, 2003). Φωσφορυλίωση σερινών γίνεται στις θέσεις Ser-188/190. Mία ενδιαφέρουσα ιδιότητα της παξιλίνης είναι η ικανότητά της να συµµετέχει στην ενεργοποίηση της ERK. Η φωσφορυλίωση της παξιλίνης στην Tyr-118 από την Src δηµιουργεί στην παξιλίνη θέση πρόσδεσης για την ERK. Έτσι µεταφέρεται η ERK στις εστίες προσκόλλησης και ακολούθως η παξιλίνη δεσµεύεται µε Raf και ΜΕΚ ενεργοποιώντας την ERK. Στη συνέχεια η ERK φωσφορυλιώνει την παξιλίνη µε αποτέλεσµα να ισχυροποιείται η σύνδεση της FAK µε την παξιλίνη καταλήγοντας σε ρύθµιση της κυτταρικής επέκτασης (cell spreading) και κινητικότητας (Ηagel et al., 2002, Ishibe et al., 2003, Lin et al., 2002). Οι ιντεγκρίνες και οι υποδοχείς αυξητικών παραγόντων είναι λίγοι µόνο από τους διαµεµβρανικούς υποδοχείς που χρησιµοποιούν την παξιλίνη ως πρωτεΐνη συνδετήρα (Σχήµα 35). Η σύγκλιση διάφορων οδών µεταγωγής σηµάτων που πραγµατοποιείται µέσω της παξιλίνης, οδηγεί σε ενίσχυση των 23

22 σηµάτων µε τελικό αποτέλεσµα ταχείες αλλαγές του κυτταροσκελετού, του σχήµατος του κυττάρου, της προσκόλλησης και της γονιδιακής έκφρασης. Οι λειτουργίες της παξιλίνης δεν σταµατούν εδώ. Έχει βρεθεί να διαδραµατίζει ρόλο και στον καρκίνο. Ερευνητικά αποτελέσµατα φανερώνουν ότι µείωση των επιπέδων της παξιλίνης µε ταυτόχρονη αύξηση των επιπέδων της p130cas, σχετίζονται µε µεταστάσεις του καρκίνου του στήθους σε πειραµατόζωα (γάτες και σκύλους) (Scibelli et al., 2003). Κινάση Εστιών Προσκόλλησης F A K (Focal Adhesion Kinase) Στη συνέχεια θα γίνει µια προσπάθεια να ρίξουµε λίγο φως σε αυτό το µυστηριώδες µόριο µε τις απέραντες λειτουργίες. Στόχος είναι να φανεί η πολυδυναµικότητα της FAK και να καταλάβει ο αναγνώστης την κεντρική βαρύτητα που της δόθηκε στο πειραµατικό µέρος. Κινάση ή πρωτεΐνη-συνδετήρας; Η ανακάλυψη της FAK έγινε το 1992, όταν βρέθηκε στις εστίες προσκόλλησης µία πρωτεΐνη 125 kda που φωσφορυλιώνεται σε τυροσίνες και σχετίζεται µε το ογκογονίδιο v-src (Schaller et al., 1992). Η ικανότητά της να δρα ως κινάση ίσως περνά σε δεύτερη µοίρα αν αναλογιστεί κανείς πως µπορεί να συνδέεται µε πλειάδα µορίων (Σχήµα 36) δίνοντάς τους την ευκαιρία να έρθουν σε επαφή και να αλληλε-πιδράσουν, οδηγώντας το κύτταρο σε ποικίλες αποκρίσεις ικανές να ρυθµίζουν δραστηριότητες που σχετίζονται µε τη µετανάστευση, τον πολλαπλασιασµό, την απόπτωση κ.α. (Σχήµα 37). Εξίσου σηµαντική είναι η ιδιότητά της να ενεργοποιείται από διαφορετικούς δια- µεµβρανικούς υποδοχείς (Σχήµα 38). Με αυτό τον τρόπο µπορεί να επεξεργάζεται αφενός πολλά ερεθίσµατα και αφετέρου να συγχωνεύει ίδια ή διαφορετικά µηνύµατα από διάφορα µονοπάτια µε αποτέλεσµα να ενισχύει αποκρίσεις του κυττάρου ή να τις τροποποιεί κατάλληλα µε τελικό στόχο την επιβίωση. Η σηµασία της πρωτεΐνης αυτής για το κύτταρο φαίνεται από πειράµατα καταστολής της έκφρασής της που δείχνουν µειωµένη κινητικότητα και αύξηση κυτταρικού θανάτου (Hungerford et al., 1996). PYK2 και FRNK 24

23 Το 1995 διαφορετι-κές οµάδες ταυτοποίησαν την ίδια πρωτεϊνική κινάση τυροσίνης µε οµολογία προς τη FAK (Σχήµα 39) (Lev et al., 1995) στην οποία δόθηκαν διάφορες ονοµασίες: proline-rich tyrosine kinase (PYK2), cell adhesion kinase β (CAKβ), FAK2 κ.α. Η PYK2 προσδένεται σε πρωτεΐνες που προσδένεται και η FAK αλλά εντοπίζεται σε διαφορετικές θέσεις, συνήθως διάχυτη στο κυτταρόπλασµα. Πιθανώς ο ρόλος της είναι να ρυθµίζει τη FAK µέσω ανταγωνισµού για πρόσδεση σε κοινές θέσεις στις εστίες προσκόλλησης. Στα έντοµα οι µελέτες έχουν δείξει πως η πρωτεΐνη PYK2 απουσιάζει. Το µόριο FRNK (FAK related non kinase) είναι το καρβοξυτελικό άκρο του µορίου της FAK χωρίς την περιοχή µε ενεργότητα κινά-σης (Σχήµα 40). Περιέχει όµως την περιοχή στόχευσης των εστιών προσκόλλησης (FAT domain) και έτσι αποτελεί µάλλον ένα µηχανισµό αρνητικής ρύθµισης της ενεργότητας της FAK (Taylor et al., 2001), αφού µπορεί να εντοπίζεται στις εστίες προσκόλλησης και να αντικαθιστά τη FAK, χωρίς όµως να συµµετέχει στο σχηµατισµό πρωτεϊνικών συµπλόκων, ενώ παράλληλα αποτρέπεται η ενεργοποίηση της FAK από τις ιντεγκρίνες. Τα παραπάνω ισχυροποιούνται και από πειραµατικά δεδοµένα που αποδεικνύουν ότι η υπερέκφραση του µορίου FRNK συνεπάγεται αναστολή της κυτταρικής επέκτασης και της µετανάστευσης (Taylor et al., 2001). Θέσεις φωσφορυλίωσης του µορίου της FAK Το µόριο της FAK έχει την ικανότητα να φωσφορυλιώνεται σε τυροσίνες αλλά και σερίνες (Σχήµα 41). ιαθέτει 6 θέσεις φωσφορυλίωσης τυρο-σινών (Tyr-397, 576, 577, 861, 925, 950) και 4 θέσεις φωσφο-ρυλίωσης σερινών (Ser-722, 843, 846, 910). Για τη φωσφο-ρυλίωση σε σερίνες δεν είναι πολλά γνωστά αν και το πιθανότερο είναι να συµµετέχουν στην τροποποίηση της ικανότητας πρόσδεσης των πρωτεϊνών που βρίσκονται downstream της FAK στη µεταγωγή σήµατος. Περισσότερα όµως είναι γνωστά για τις θέσεις φωσφορυλίωσης τυροσινών. Η αυτοφωσφορυλίωση στην Tyr-397 (αποτέλεσµα ενεργοποίησης που προέρ-χεται από υποδοχείς της µεµβράνης, π.χ. ιντεγκρίνες) δηµιουργεί θέση πρόσδεσης για πρωτεΐνες µε SH2 περιοχές όπως είναι η κινάση Src. Η πρόσδεση της Src στη FAK (στην Tyr-397) συνεπάγεται ενεργοποίηση της ενεργότητας κινάσης της Src και φωσφορυλίωση στις Tyr-576,577 της FAK από 25

24 τη Src (Ruest et al., 2000). Στη συνέχεια ακολουθεί φωσφορυλίωση της FAK από τη Src στις Tyr-861,925. Η φωσφορυλίωση της Tyr-925 συνεπάγεται τη δηµουργία θέσης πρόσδεσης για την SH2 περιοχή της πρωτεΐνης-συνδετήρα Grb2 (Schlaepfer et al., 1999). To σύµπλοκο FAK-Src έχει την ικανότητα να φωσφορυλιώνει και άλλες πρωτεΐνες-συνδετήρες όπως είναι οι Shc, p130cas, και παξιλίνη (Izaguirre et al., 2001). Εξελικτική συντήρηση της αµινοξικής αλληλουχίας του µορίου της FAΚ Η οµόλογη πρωτεΐνη της FAK στη Drosophila (Dfak 56) (140kDa) έχει 33% οµολογία στην αµινοξική της αλληλουχία µε την αντίστοιχη ανθρώπινη (Palmer et al., 1999) (Σχήµα 42). Οι βιολογικές ιδιότητες της FAK στη Drosophila είναι κοι-νές µε αυτές του ανθρώπινου οµολόγου της, όπως είναι ο εντοπισµός στις εστίες προσκόλλησης και η εξαρτώµενη από κυτ-ταρική προσκόλληση φωσφορυλίωση τυρο-σινών (Palmer et al., 1999). Η κεντρική περιοχή µε ενεργότητα κινάσης-τυροσίνης διαθέτει το µεγαλύτερο ποσοστό συντήρησης που αγγίζει το 63%. Η περιοχή FAT χαρακτηρίζεται επίσης από µεγάλη συντήρηση αφού εδώ η οµοιότητα στην αµινοξική αλληλουχία φτάνει το ποσοστό του 47%. Το ποσοστό συντήρησης της αµινοτελικής περιοχής αγγίζει το 32%. Οργάνωση των περιοχών του µορίου της FAΚ To µόριο της FAK αποτελείται από τρεις διακριτές µεταξύ τους περιοχές (Σχήµα 41). Το αµινοτελικό άκρο παρουσιάζει οµοιότητες µε τα µέλη της οικογένειας των πρωτεϊνών που έχουν την περιοχή οµολογίας FERM (Girault et al., 1999) και επιτρέπει πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις. Επιτρέπει αλληλεπιδράσεις τόσο µε κυτταροπλασµατικές πρωτεΐνες όσο και µε υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας. Ανάµεσα στους υποδοχείς που πραγµατοποιούν τέτοιου είδους συνδέσεις µε τη FAK βρίσκονται ο επιδερµικός αυξητικός παράγοντας (EGF-epidermal growth factor) και η β1 ιντεγκρινική υποµονάδα, κάτι που έχει δειχθεί µε πειράµατα ανοσοκατακρήµνισης τα οποία απέδειξαν συγκατακρήµνιση µε τη FAK (Chen et al., 2000, Sieg et al.,2000). Η κεντρική περιοχή του µορίου της FAK είναι η περιοχή µε την ενεργότητα κινάσης-τυροσίνης. Η ενεργοποίηση όµως της FAK ως κινάσης 26