ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ. Δημητρόπουλος Βασίλης. ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΤΟΥ ΜΥΚΗΤΑ Pleurotus ostreatus

Transcript

1 ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Δημητρόπουλος Βασίλης ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΤΟΥ ΜΥΚΗΤΑ Pleurotus ostreatus ΣΕ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΕΔΑΦΟΥΣ - ΑΧΥΡΟΥ

2 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Πειραματική μελέτη της ανάπτυξης του μύκητα Pleurotus ostreatus σε υπόστρωμα εδάφους αχύρου Σκοπός είναι να διερευνηθούν παράγοντες, όπως το ποσοστό του αχύρου, η υγρασία, η θερμοκρασία και το θρεπτικό μέσο, που επηρεάζουν και πόσο την ανάπτυξη του συγκεκριμένου μύκητα Ο σχεδιασμός του πειράματος και η επεξεργασία των αποτελεσμάτων βασίζεται στις αρχές και τεχνικές του στατιστικού σχεδιασμού πειραμάτων Γίνεται χρήση του υπολογιστικού προγράμματος STATGRAPHICS για την επίλυση των στατιστικών μοντέλων

3 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

4 ΤΟ ΠΡΟΒΛΗΜΑ ΤΗΣ ΡΥΠΑΝΣΗΣ ΤΟΥ ΕΔΑΦΟΥΣ Ελλιπής εικόνα των πολιτών για το μείζον πρόβλημα της ρύπανσης των εδαφών Πρόβλημα που αφορά και την Ελλάδα: άρθρα στον ελληνικό Τύπο για κινδύνους από PCBs & εντομοκτόνα Η ΕΕ καθορίζει με Οδηγίες την ασφαλή διαχείριση επικίνδυνων αποβλήτων Και στην ελληνική νομοθεσία Υπουργικές Αποφάσεις διαχείρισης αποβλήτων. Π.χ. Υπουργική Απόφαση 14312/1302/2000 για τα PCBs Σε αυτήν καταγράφεται και η υφιστάμενη κατάσταση: Το 1991 υπήρχαν τόνοι PCBs σε πυκνωτές & μετασχηματιστές

5 ΟΙ ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΤΕΡΟΙ ΟΡΓΑΝΙΚΟΙ ΡΥΠΟΙ ΤΟΥ ΕΔΑΦΟΥΣ Πετρελαϊκοί Αρωματικοί Υδρογονάνθρακες: Ενώσεις BTEX Βενζόλιο, Τολουόλιο, Αιθυλοβενζόλιο, Ξυλόλιο Πολυκυκλικοί Αρωματικοί Υδρογονάνθρακες: Υδ/κες με 2 ή περισσότερους αρωματικούς δακτυλίους (ναφθαλένιο, ανθρακένιο, πυρένιο) Αλογονωμένες Αρωματικές Ενώσεις: π.χ. Χλωριωμένα Διφαινύλια (PCBs), Πενταχλωροφαινόλη (PCP) Αλογονωμένοι Αλειφατικοί Υδρογονάνθρακες: Χλωροφόρμιο, τετραχλωράναθρακας, διχλωρομεθάνιο, βινυλοχλωρίδιο, τριχλωροαιθυλένιο, τετραχλωροαιθυλένιο, κ.ά. Παρασιτοκτόνα: Lindane, DDT, Alachlor, Dieldrin, παραθείο, κ.ά.

6 ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΕΞΥΓΙΑΝΣΗΣ ΕΔΑΦΩΝ Στρατηγικές: Καταστροφή ή μεταβολή των ρύπων Εξαγωγή ή διαχωρισμός των ρύπων από το έδαφος Ακινητοποίηση των ρύπων Τεχνικές: Επί τόπου τεχνικές (in situ) Εκτός τόπου τεχνικές (ex situ) Τρόποι: Φυσική / χημική επεξεργασία Θερμική επεξεργασία Βιολογική επεξεργασία

7 ΒΙΟΕΞΥΓΙΑΝΣΗ Ορισμός: είναι η τεχνολογική διαδικασία κατά την οποία βιολογικά συστήματα χρησιμοποιούνται για την εξάλειψη χημικών ρύπων στο περιβάλλον Βιολογική εξάλειψη: βιοαποδόμηση Ανοργανοποίηση: μετατροπή οργ. ένωσης σε ανόργανα προϊόντα (CO 2, H 2 O) Μικροβιακά Συστήματα με εφαρμογή στη Βιοεξυγίανση: Βακτήρια (π.χ. γένος Pseudomonas) Μύκητες (μύκητες λευκής σήψης)

8 ΕΠΙ ΤΟΠΟΥ ΒΙΟΕΞΥΓΙΑΝΣΗ Στρατηγικές: Φυσική μείωση (natural attenuation) Βιοδιέγερση (biostimulation) Βιοαύξηση (bioaugmentation) Τεχνικές: Φυτοεξυγίανση Βιοαερισμός Ενισχυμένη βιοεξυγίανση

9 ΕΚΤΟΣ ΤΟΠΟΥ ΒΙΟΕΞΥΓΙΑΝΣΗ Τεχνικές: Κομποστοποίηση Βιοσωροί Άροση Βιοαντιδραστήρες

10 ΜΥΚΗΤΕΣ & ΒΙΟΕΞΥΓΙΑΝΣΗ Καταγεγραμμένα είδη: Εκτιμήσεις: είδη Ιδιαίτερη αξία για βιοεξυγίανση: Βασιδιομύκητες Μύκητες λευκής σήψης (white-rot fungi) Ικανότητα αποδόμησης της λιγνίνης του ξύλου με βάση ένα μη ειδικευμένο λιγνινολυτικό σύστημα ενζύμων

11 ΛΙΓΝΙΝΟΛΥΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΕΝΖΥΜΩΝ 1 Οι μύκητες λευκής σήψης διαθέτουν 2 τύπους εξωκυτταρικών ενζύμων: 1. Λακκάσες 2. Υπεροξειδάσες - Υπεροξειδάση της λιγνίνης - Υπεροξειδάση του μαγγανίου

12 ΛΙΓΝΙΝΟΛΥΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΕΝΖΥΜΩΝ 2 Καταλυτικοί Κύκλοι

13 ΒΙΟΑΠΟΔΟΜΗΣΗ ΟΡΓΑΝΙΚΩΝ ΡΥΠΩΝ ΑΠΟ ΜΥΚΗΤΕΣ Το λιγνινολυτικό σύστημα ενζύμων είναι μη ειδικευμένο - Αποδομεί τη λιγνίνη αλλά και πλήθος ξενοβιοτικών ενώσεων (οργανικοί ρύποι) όπως: πολυκυκλικούς αρωματικούς υδ/κες κες (PAHs) χλωριωμένες αρωματικές ενώσεις (PCBs, PCP) χρωστικές βαφές παρασιτοκτόνα Επιτυγχάνουν μεγάλες μειώσεις στις συγκεντρώσεις των ρύπων Οι περισσότερες έρευνες εστιάζονται σε υγρές καλλιέργειες ή σε PDA Λίγοι μύκητες λευκής σήψης έχουν διεξοδικά διερευνηθεί: Phanerochaete chrysosporium Lentinula edodes Pleurotus ostreatus Trametes versicolor

14 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

15 ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΤΟΥ ΜΥΚΗΤΑ Pleurotus ostreatus ΣΕ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΕΔΑΦΟΥΣ - ΑΧΥΡΟΥ Μίγμα εδάφους (άμμος) αχύρου σε δοκιμαστικούς σωλήνες Προσθήκη υγρασίας & θρεπτικού μέσου Εμβολιασμός του υποστρώματος με μύκητα Pleurotus ostreatus Εγκλιματισμός σε θάλαμο σταθερής & ελεγχόμενης θερμοκρασίας Καταγραφή του χρόνου εμφάνισης ανάπτυξης (χρόνος υστέρησης) του μυκηλίου Μέτρηση του μέγιστου βάθους ανάπτυξης του μύκητα στο υπόστρωμα μετά από 2 εβδομάδες

16 ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΥ 1 Εφαρμογή του Στατιστικού Σχεδιασμού Πειραμάτων: Central Composite Design πλαισίωση αστέρα & 2 ο βαθμιο μοντέλο Παράγοντες σχεδιασμού: - Ποσοστό αχύρου (%) επί του εδάφους (Χ 1 ) - Ποσοστό υγρασίας (%) επί του ξηρού μίγματος εδάφους-αχύρου (Χ 2 ) - Θερμοκρασία ( C) (Χ 3 ) - Ποσοστό θρεπτικού μέσου (%) επί του ξηρού μίγματος (Χ 4 ) Παράμετροι αριστοποίησης: - Χρόνος Υστέρησης (d) (Υ 1 ) - Βάθος Ανάπτυξης (mm) (Y 2 )

17 ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΥ 2 Κωδικοποιημένες & φυσικές τιμές των παραγόντων σχεδιασμού Παράγοντας -α α Χ 1 : Ποσοστό αχύρου (%) X 2 : Ποσοστό υγρασίας (%) X 3 : Θερμοκρασία ( C) X 4 : Ποσοστό θρεπτικού μέσου (%)

18 ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΥ 3 Συναρτήσεις απόκρισης των 2 παραμέτρων αριστοποίησης: χρόνος υστέρησης (d) : Y 1 = b 0 + b 1 X 1 + b 2 X b 11 X 12 + b b 12 X 1 X 2 + b 13 X 1 X 3 + b 14 X 1 X 4 + Βάθος ανάπτυξης (mm) : Y 2 = c 0 + c 1 X 1 + c 2 X c 11 X 12 + c c 12 X 1 X 2 + c 13 X 1 X 3 + c 14 X 1 X X X 2 2 Ο αριθμός των δοκιμών σωλήνων Ν είναι για k = 4 παράγοντες σχεδιασμού: Ν = = 26 Πραγματοποιείται 1 επανάληψη (repetition), άρα ο συνολικός αριθμός των δοκιμών είναι 52 Ομαδοποίηση των δοκιμών με βάση τη θερμοκρασία: 2x1 σωλήνες σε Τ = 9.6 C 2x8 σωλήνες σε Τ = 13 C 2x8 σωλήνες σε Τ = 20 C ΣΥΝΟΛΟ = 52 σωλήνες 2x8 σωλήνες σε Τ = 27 C 2x1 σωλήνες σε Τ = 30.4 C

19 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ : ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΤΟΥ ΜΥΚΗΤΑ - Σε κωνική φιάλη των 100 ml: 50 ml H 2 O + 1 gr Malt Extract Broth - Εμβολιασμός της φιάλης με δισκία μυκηλίου από καλλιέργεια σε Petri με PDA

20 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ : ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΠΡΩΤΩΝ ΥΛΩΝ Ξήρανση της άμμου στους 40 C για 24 h Ξήρανση του αχύρου στους 40 C για 24 h Παρασκευή θρεπτικού μέσου (PDA χωρίς άγαρ): - 1 lit απιονισμένο νερό gr πατάτες - 20 gr γλυκόζη

21 ΚΥΡΙΩΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ: ΦΑΣΗ 1 Η ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΜΙΓΜΑΤΟΣ & ΠΛΗΡΩΣΗ ΣΩΛΗΝΩΝ 5 διαφορετικά μίγματα: % άχυρο - 58 % άχυρο - 75 % άχυρο - 92 % άχυρο % άχυρο Παρασκευή μίγματος: - ζύγιση των καταλλήλων ποσοτήτων αχύρου & άμμου - ομοιογενοποίηση του μίγματος μέσω ανάδευσης Πλήρωση σωλήνων: 5 gr μίγματος σε κάθε σωλήνα

22 ΚΥΡΙΩΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ: ΦΑΣΗ 2 Η ΑΠΟΣΤΕΙΡΩΣΗ ΤΩΝ ΣΩΛΗΝΩΝ 3 διαδοχικές αποστειρώσεις των σωλήνων αποστείρωση σε αυτόκλειστο στους 120 C για 20 min

23 ΚΥΡΙΩΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ: ΦΑΣΗ 3 Η ΠΡΟΣΘΗΚΗ ΘΡΕΠΤΙΚΟΥ ΜΕΣΟΥ & ΥΓΡΑΣΙΑΣ Προσθήκη θρεπτικού μέσου: με πιπέτα & αποστειρωμένα tips 5 διαφορετικές συγκεντρώσεις θρεπτικού μέσου: % θρεπτικό μέσο % θρεπτικό μέσο % θρεπτικό μέσο % θρεπτικό μέσο % θρεπτικό μέσο Προσθήκη υγρασίας: με πιπέτα & αποστειρωμένα tips 5 διαφορετικές συγκεντρώσεις υγρασίας: - 40 % υγρασία - 45 % υγρασία - 55 % υγρασία - 65 % υγρασία - 70 % υγρασία

24 ΚΥΡΙΩΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ: ΦΑΣΗ 4 Η ΕΜΒΟΛΙΑΣΜΟΣ ΤΟΥ ΜΥΚΗΤΑ Με μίξερ: διάσπαση του μυκηλίου της κωνικής φιάλης & ομοιογενοποίηση του μίγματος Εμβολιασμός: με πιπέτα & αποστειρωμένα tips: - προσθήκη σε κάθε σωλήνα 2 ml εμβολίου

25 ΚΥΡΙΩΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ: ΦΑΣΗ 5 Η ΕΓΚΛΙΜΑΤΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ Εγκλιματισμός των σωλήνων σε θάλαμο ελεγχόμενης & σταθερής θερμοκρασίας 5 διαφορετικές θερμοκρασίες 5 διαφορετικές ημερομηνίες εκτέλεσης: - Θερμοκρασία 27 C : 24 Σεπτεμβρίου Οκτωβρίου Θερμοκρασία 13 C : 8 Οκτωβρίου Οκτωβρίου Θερμοκρασία 30.4 C : 3 Νοεμβρίου Νοεμβρίου Θερμοκρασία 9.6 C : 8 Δεκεμβρίου Δεκεμβρίου Θερμοκρασία 20 C : 12 Φεβρουαρίου Φεβρουαρ. 2004

26 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ: ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ Μέτρηση του χρόνου υστέρησης: Καταγραφή της ημέρας, μετά την εκτέλεση του πειράματος, εμφάνισης ανάπτυξης του μύκητα (εμφάνιση μυκηλίου) στην επιφάνεια του υποστρώματος Μέτρηση του βάθους ανάπτυξης: Το μέγιστο εμφανές βάθος ανάπτυξης σε mm του μύκητα εντός του υποστρώματος μετά από διάστημα 2 εβδομάδων Καταγραφή συνολικά 52 μετρήσεων: - του χρόνου υστέρησης - του βάθους ανάπτυξης

27 ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 1 Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων με το πρόγραμμα STATGRAPHICS v5.1: Πίνακας ANOVA Αποκλεισμός των ασήμαντων επιδράσεων στη συνάρτηση απόκρισης: : p-value p μεγαλύτερη από Χρόνος Υστέρησης (Υ 1 ): μόνο 6 από τις 14 επιδράσεις έχουν p-value < Βάθος ανάπτυξης (Υ 2 ): μόνο 5 από τις 14 επιδράσεις έχουν p-value < 0.05 Συντελεστές R 2 : - Για το χρόνο υστέρησης: : % - Για το βάθος ανάπτυξης: : %

28 Συναρτήσεις απόκρισης ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 2 Χρόνος υστέρησης: Y 1 = X X X X 1 X X X 2 4 Βάθος ανάπτυξης: Y 2 = X X X X X 2 4

29 ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 3 Επιφάνειες απόκρισης Χρόνος Υστέρησης Xronos ysterisis Estimated Response Surface Axyro=75.0,Threptiko meso= Ygrasia 28 Xronos ysteris thermokrasia

30 ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 4 Αριστοποίηση Χρόνος Υστέρησης (Υ 1 ): Ελαχιστοποίηση Βάθος Ανάπτυξης (Υ 2 ): Μεγιστοποίηση Y 1 (d) Y 2 (mm) Άριστη Τιμή Άχυρο X 1 (%) Υγρασία X 2 (%) Θερμοκρασία X 3 ( C) Θρεπτικό μέσο X 4 (%)

31 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Ο μύκητας αναπτύχθηκε πλήρως στο σύνολο των 52 σωλήνων και σε όλες τις συνθήκες ΚατάΚατά την εκτέλεση των πειραμάτων ήταν εμφανές πως κυρίαρχος παράγοντας που επηρεάζει την ανάπτυξη: θερμοκρασία Ο χρόνος υστέρησης ελαχιστοποιείται σε: - υψηλά επίπεδα αχύρου - χαμηλά επίπεδα υγρασίας - χαμηλά επίπεδα θρεπτικού μέσου - υψηλές θερμοκρασίες ΤοΤο βάθος ανάπτυξης μεγιστοποιείται σε: - υψηλά επίπεδα αχύρου - χαμηλά επίπεδα υγρασίας - υψηλά επίπεδα θρεπτικού μέσου - υψηλές θερμοκρασίες

32 ΠΡΟΟΠΤΙΚΕΣ Περαιτέρω διερεύνηση επίδρασης άλλων παραγόντων, όπως: - ph - ανόργανα άλατα - ποσότητα εμβολίου / βιομάζα μύκητα - συγκέντρωση ρύπου ξενοβιοτικής ένωσης - ύπαρξη αυτόχθονους μικροπανίδας Όμως με παραμετροποίηση επιπλέον παραγόντων (ph, βιομάζα, συγκέντρωση ρύπου) αυξάνει η πολυπλοκότητα του στατιστικού σχεδιασμού. Έτσι central composite design: - με 4 παράγοντες & 1 επανάληψη: : 52 δοκιμές - με 5 παράγοντες & 1 επανάληψη: : 88 δοκιμές Θερμοκρασία: σημαντικός παράγοντας ανάπτυξης η Ελλάδα με τις υψηλές θερμοκρασίες: δυνατότητα εφαρμογής της βιοεξυγίανσης με μύκητες