"ΜΟΡΙΑΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΠΟΥ ΕΜΠΛΕΚΟΝΤΑΙ ΣΤΗΝ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ ΤΗΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ"

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ "ΜΟΡΙΑΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΠΟΥ ΕΜΠΛΕΚΟΝΤΑΙ ΣΤΗΝ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ ΤΗΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ" ΙΩΑΝΝΑ Ν. ΓΙΑΝΝΑΚΟΠΟΥΛΟΥ Ιατρός ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΠΑΤΡΑ 2007

2 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΙΩΑΝΝΗΣ ΒΑΡΑΚΗΣ Καθηγητής Ανατομικής-Ιστολογίας-Εμβρυολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών, Επιβλέπων καθηγητής ΒΑΣΙΛΙΚΗ Ε. ΓΚΡΕΚΑ ΣΠΗΛΙΩΤΗ Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Παιδιατρικής Ενδοκρινολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών. ΜΑΡΘΑ ΑΣΗΜΑΚΟΠΟΥΛΟΥ Επίκουρη Καθηγήτρια Ανατομικής-Ιστολογίας Εμβρυολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών. ii

3 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Ευχαριστώ θερμά την αναπληρώτρια καθηγήτρια κ. Βασιλική Ε. Γκρέκα Σπηλιώτη για την πολύτιμη επιστημονική της καθοδήγηση, τις γόνιμες συμβουλές της, και την αμέριστη ηθική υποστήριξη. Αποτελεί για μένα πρότυπο ανθρώπου, ιατρού και ερευνητή. Ευχαριστώ τον καθηγητή κ Βαράκη Ιωάννη για την υποστήριξη και τις πολύτιμες συμβουλές του. Έχει υπάρξει πολύτιμος διδάσκαλος από τα φοιτητικά μου χρόνια ως σήμερα. Ευχαριστώ την επίκουρη καθηγήτρια κ. Μάρθα Ασημακοπούλου για τη συμπαράσταση και ενθάρρυνση στη συγγραφή της διπλωματικής μου εργασίας. Ευχαριστώ την Δρ. Πάολα Ρόχας για την πολύτιμη συμβολή της στην κατανόηση μοριακών τεχνικών, απαραίτητη για την συγγραφή της διπλωματικής μου εργασίας. Ευχαριστώ την οικογένεια μου για την αγάπη και την ηθική στήριξη. iii

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΟΥ ΠΡΟΣΘΙΟΥ ΛΟΒΟΥ ΤΗΣ ΥΠΟΦΥΣΗΣ - ΣΩΜΑΤΟΤΡΟΠΑ ΚΥΤΤΑΡΑ Υποθαλαμική - Υποφυσιακή μονάδα Εμβρυολογική ανάπτυξη του αδένα της υπόφυσης Μεταγραφικοί παράγοντες απαραίτητοι για την φυσιολογική ανάπτυξη και λειτουργία των κυττάρων του πρόσθιου λοβού της υπόφυσης HESX LHX3/LHX Pit-1/POU1F PROP Σωματοτρόπα κύτταρα ΑΥΞΗΤΙΚΗ ΟΡΜΟΝΗ (GH) Δομή και ισομορφές της GH Oικογένεια γονιδίων της GH Δομή και ρύθμιση της έκφρασης του GH-1 γονιδίου ΝΕΥΡΟΕΝΔΟΚΡΙΝΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΕΚΚΡΙΣΗΣ ΤΗΣ GH Γενικά Φυσιολογία έκκρισης της GH Παλμική μορφή έκκρισης της GH Έκκριση της GH και ύπνος Έκκριση της GH βάσει ηλικίας Υποφυσιοτρόπες ορμόνες - Κύριοι ρυθμιστές έκκρισης της GH Εκλυτική ορμόνη της αυξητικής ορμόνης (GHRH)...23 Ιστική κατανομή της GHRH...23 Δομή της GHRH και του γονιδίου της...24 Ιστική κατανομή και δομή του υποδοχέα της GHRH (GHRHR)...26 Το γονίδιο του GHRHR και η ρύθμιση της έκφρασης του...27 Μετάδοση σήματος μετά την πρόσδεση της GHRH στον υποδοχέα της..28 Ρυθμιστικός ρόλος της GHRH στην έκκριση της GH Σωματοστατίνη (SST/SRIH)...31 Ιστική κατανομή των SST νευρώνων...31 Δομή της σωματοστατίνης (SST) και του γονιδίου της...31 Ρύθμιση της έκκρισης της SST και της έκφρασης του γονιδίου της...32 Δομή των υποτύπων του υποδοχέα της σωματοστατίνης (SST-R) και των γονιδίων τους και ενδοκυττάρια μετάδοση σήματος...33 Κατανομή των SST-R στον υποθάλαμο και στην υπόφυση...35 Βιολογικές δράσεις της SST...36 iv

5 Γκρελίνη...38 Ιστορική αναδρομή...38 Δομή της γκρελίνης, του γονιδίου της και ρύθμιση της έκκρισης της..39 Ο υποδοχέας των GHS/γκρελίνης και τα μονοπάτια ενδοκυττάριας μετάδοσης σήματος...42 To γονίδιο του GHS-R και η ρύθμιση της έκφρασης του...44 Ιστική κατανομή της γκρελίνης και του υποδοχέα της...46 Βιολογικές δράσεις γκρελίνης Νευροδιαβιβαστές που επηρεάζουν την έκκριση της GH Κατεχολαμίνες...51 α αδρενεργικά μονοπάτια...51 β αδρενεργικά μονοπάτια...51 Ντοπαμίνη Ακετυλοχολίνη Σεροτονίνη Ισταμίνη Αμινοξέα Νευροπεπτίδια που επηρεάζουν την έκκριση της GH Εκλυτικές ορμόνες του υποθαλάμου Nευροπεπτίδιο Υ Ενδογενή οπιοειδή Μονοξείδιο του αζώτου (NO) Άλλα νευροπεπτίδια Περιφερικές ορμόνες και μεταβολικά σήματα ή καταστάσεις που επηρεάζουν την έκκριση της GH Αρνητική παλίνδρομη ρύθμιση της έκκρισης της GH Εξωϋποθαλαμικές δομές του κεντρικού νευρικού συστήματος που ελέγχουν την έκκριση της GH GH-IGF ΑΞΟΝΑΣ Γενικά Υπόθεση της σωματομεδίνης Δεσμευτική πρωτεΐνη της αυξητικής ορμόνης (GHBP) Ο υποδοχέας της GH και η ενδοκυττάρια μετάδοση σήματος Δομή του υποδοχέα της GH και του γονιδίου της Ενδοκυττάρια μετάδοση σήματος της GH Σωματομεδίνες/Ινσουλινόμορφοι αυξητικοί παράγοντες (IGF) Δομική οργάνωση των IGF πεπτιδίων και των γονιδίων τους Δεσμευτικές πρωτεΐνες των IGF (IGFBP) IGF υποδοχείς (IGF-R)...80 v

6 4.6 Δράσεις της GH και των IGF Οστικός μεταβολισμός Μεταβολισμός υδατανθράκων και λίπους Μεταβολισμός πρωτεΐνών Γενετικές διαταραχές του GH-IGF άξονα IGF ανεπάρκεια που οφείλεται σε υποθαλαμική υποφυσιακή δυσλειτουργία (GHD) Αντίσταση στην αυξητική ορμόνη (GH resistance, GH insensitivity syndrome) Πρωτογενείς ανωμαλίες της σύνθεσης των IGF Πρωτογενείς ανωμαλίες της μεταφοράς/κάθαρσης των IGF IGF αντίσταση (IGF resistance) ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ (GHD) Επιδημιολογία και αιτιολογία Κλινική εικόνα Διαγνωστική προσέγγιση Κλινικά και σωματομετρικά κριτήρια Ακτινολογική εκτίμηση Βιοχημική αξιολόγηση ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΑΙΤΙΑ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑΣ GH Συνδυασμένη υποφυσιακή ορμονική ανεπάρκεια (CPHD) Μοντέλα μυών CPHD: φυσικά μεταλλαγμένοι μύες και γονιδιακή στόχευση Μεταλλαγές σε αναπτυξιακά γονίδια που συνδέονται με CPHD στον άνθρωπο Μεταλλαγές του HESX1 γονιδίου Μεταλλαγές του LHX3 γονιδίου Μεταλλαγές του LHX4 γονιδίου Μεταλλαγές του PIT-1 γονιδίου Μεταλλαγές του PROP1 γονιδίου Μεμονωμένη ανεπάρκεια GH (IGHD) Μοντέλα ζώων IGHD: Φυσικά μεταλλαγμένα ζώα και γονιδιακή στόχευση Τύποι οικογενούς IGHD Μεταλλαγές του GH1 γονιδίου Ελλείψεις GH1 γονιδίου Μονές αντικαταστάσεις ζεύγους βάσεων στην κωδικοποιούσα περιοχή του GH1 γονιδίου Μονές αντικαταστάσεις ζεύγους βάσεων που επιδρούν στο μάτισμα του mrna Πολυμορφισμοί στην περιοχή του υποκινητή του GH1 γονιδίου που μειώνουν την έκφραση του vi

7 Ετερόζυγες GH1 μεταλλαγές σε σποραδικές περιπτώσεις IGHD Μεταλλαγές του GH1 γονιδίου που οδηγούν σε βιοανενεργή GH Mεταλλαγές στο γονίδιο του υποδοχέα της GHRH (GHRH-R) Γενετικές διαταραχές άλλων παραγόντων που επηρεάζουν την έκκριση της GH ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY vii

8 1. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΟΥ ΠΡΟΣΘΙΟΥ ΛΟΒΟΥ ΤΗΣ ΥΠΟΦΥΣΗΣ - ΣΩΜΑΤΟΤΡΟΠΑ ΚΥΤΤΑΡΑ 1.1 Υποθαλαμική - Υποφυσιακή μονάδα Ο αδένας της υπόφυσης είναι ένας ενδοκρινής αδένας που τοποθετείται σε μια κοιλότητα σφηνοειδές οστού που καλείται τουρκικό εφίππιο. Αυτός ο αδένας απαρτίζεται από τρεις λοβούς: (i) τον πρόσθιο λοβό της υπόφυσης, που αποτελεί το κύριο μέρος του αδένα, (ii) τον διάμεσο λοβό, και (iii) τον οπίσθιο λοβό της υπόφυσης. Ο πρόσθιος λοβός της υπόφυσης καθορίζεται από πέντε κυτταρικούς τύπους που κατάγονται από κοινό προγονικό πληθυσμό: (i) τα λακτοτρόπα κύτταρα που εκκρίνουν προλακτίνη (PRL), (ii) τα γοναδοτρόπα κύτταρα που παράγουν την ωχρινοτρόπο ορμόνη (LH) και την θυλακιοτρόπο ορμόνη (FSH), (iii) τα θυρεοτρόπα κύτταρα που παράγουν την θυρεοτρόπο ορμόνη (TSH), (iv) τα κορτικοτρόπα κύτταρα που παράγουν την φλοιοεπινεφριδιοτρόπο ορμόνη (ACTH), και (v) τα σωματοτρόπα κύτταρα που παράγουν την αυξητική ορμόνη (GH). Ένας έκτος κυτταρικός τύπος συνιστάμενος από θυλακώδη αστεροειδή κύτταρα είναι παρόν στον πρόσθιο λοβό της υπόφυσης, αλλά η εμβρυολογική προέλευση και λειτουργία αυτών των κυττάρων απομένει να διευκρινισθεί. Ο πρόσθιος λοβός της υπόφυσης διαδραματίζει καίριο ρόλο στον έλεγχο της ομοιόστασης στα σπονδυλωτά. Χρησιμεύει ως κεντρικός μεσολαβητής της πληροφορίας που μεταδίδεται από τον εγκέφαλο δια μέσω του υποθαλάμου στα περιφερικά ενδοκρινή όργανα. Κατά συνέπεια ρυθμίζει κάποιες καίριες διαδικασίες, όπως τον μεταβολισμό, την ανάπτυξη, την αναπαραγωγή και την συμπεριφορά (Quentien et al. 2006). Οι τροφικές ορμόνες του πρόσθιου λοβού της υπόφυσης εκκρίνονται με παλμικό ή επεισοδιακό τρόπο, ο οποίος με την σειρά του ελέγχεται από ένα συγχρονισμένο πρότυπο έκκρισης των υποθαλαμικών ορμονών (Yeung et al. 2006). Ο υποθάλαμος βρίσκεται σε ανώτερη θέση από τον ώριμο αδένα της υπόφυσης και έχει νευρικές προβολές στον εγκεφαλικό φλοιό και στην μέση προεξοχή. Οι υποθαλαμικές ορμόνες μεταφέρονται στον διάμεσο και πρόσθιο 1

9 λοβό της υπόφυσης μέσω του πυλαίου αγγειακού συστήματος (Εικόνα 1-1). Τόσο οι νευρικές αξονικές προβολές στον αδένα της υπόφυσης όσο και η παροχή αίματος του πυλαίου αγγειακού συστήματος μεταφέρονται μέσω του μίσχου της υπόφυσης και κατά συνέπεια οποιαδήποτε βλάβη στον μίσχο της υπόφυσης μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα δυσλειτουργία του πρόσθιου και οπίσθιου λοβού της υπόφυσης (Kelberman and Dattani 2006). Εικόνα 1-1. Το υποθαλαμικό υποφυσιακό πυλαίο αγγειακό σύστημα που συνδέει τον υποθάλαμο με την υπόφυση (Yeung et al. 2006). Η υποθαλαμική-υποφυσιακή μονάδα ενσωματώνει διεγερτικά και ανασταλτικά κεντρικά και περιφερικά σήματα για σύνθεση και έκκριση αυτών των τροφικών ορμονών από τους ειδικούς κυτταρικούς τύπους (Melmed 2003). Καθένας από αυτούς τους κυτταρικούς τύπους εκφράζει μοναδικούς υποδοχείς που συνδέονται με G πρωτεΐνες, που είναι ειδικοί για τις εκλυτικές ή ανασταλτικές ορμόνες του υποθαλάμου (Yeung et al. 2006). 1.2 Εμβρυολογική ανάπτυξη του αδένα της υπόφυσης Η ανάπτυξη του αδένα της υπόφυσης είναι όμοια σε όλα τα σπονδυλωτά και έχει μελετηθεί εκτεταμένα στον μυ. Ο πρόσθιος και ο διάμεσος λοβός της υπόφυσης προέρχονται από το στοματικό εξώδερμα, ενώ ο οπίσθιος λοβός από το νευρικό εξώδερμα (Eικόνα 1-2). Η ανάπτυξη του πρόσθιου λοβού της υπόφυσης συμβαίνει σε τέσσερα διακριτά στάδια διαφοροποίησης που οδηγούν τελικά στον σχηματισμό ενός περίπλοκου εκκριτικού οργάνου που περιλαμβάνει τους πέντε προαναφερόμενους διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους που εκκρίνουν τις έξι διαφορετικές ορμόνες. Αρχικά πραγματοποιείται 2

10 πάχυνση του εξωδέρματος στην οροφή της πρωτογενής στοματικής κοιλότητας η οποία έρχεται σε επαφή με την οροφή του κοιλιακού διεγκεφάλου. Δεύτερον, το στοματικό εξώδερμα εγκολπώνεται και σχηματίζει έναν υποτυπώδες θύλακο του Rathke, ενώ ο κοιλιακός διεγκέφαλος εγκολπώνεται και σχηματίζει τον οπίσθιο λοβό της υπόφυσης. Τρίτον, ο οριστικός θύλακος του Rathke σχηματίζεται, και τέλος έπεται η διαφοροποίηση των ποικίλων κυτταρικών τύπων εντός του ώριμου πρόσθιου λοβού της υπόφυσης (Dattani 2005). Εικόνα 1-2. Ανάπτυξη της υπόφυσης (Yeung et al. 2006) Σηματοδοτικά μόρια συμβάλλουν στα πρώιμα γεγονότα ανάπτυξης του πρόσθιου λοβού της υπόφυσης. Επακόλουθα επάγονται μεταγραφικοί παράγοντες που ελέγχουν την έκφραση γονιδίων, από τα οποία εξαρτάται ο καθορισμός και η διαφοροποίηση του κυτταρικού τύπου. Λιγότερες είναι οι διαθέσιμες πληροφορίες για την ανάπτυξη του πρόσθιου λοβού της υπόφυσης του ανθρώπου, που δείχνει κάποιες διαφορές σε σύγκριση με το αναπτυξιακό πρότυπο που παρατηρείται στους μυς. Μοντέλα ζώων και έλεγχος για ανεύρεση μεταλλαγών στον άνθρωπο έχουν βοηθήσει στην αναγνώριση και/ή χαρακτηρισμό μεταγραφικών παραγόντων απαραίτητων για την φυσιολογική ανάπτυξη και λειτουργία του πρόσθιου λοβού της υπόφυσης (Quentien et al. 2006). 1.3 Μεταγραφικοί παράγοντες απαραίτητοι για την φυσιολογική ανάπτυξη και λειτουργία των κυττάρων του πρόσθιου λοβού της υπόφυσης Η στενή επαφή του στοματικού εξωδέρματος που σχηματίζει τον θύλακο του Rathke και του νευρικού εξωδέρματος του διεγκεφάλου διατηρείται κατά την διάρκεια των πρώιμων σταδίων της οργανογένεσης της υπόφυσης. Aυτή η 3

11 στενή σχέση μαζί με ποικίλους πειραματικούς χειρισμούς σε ζώα έχουν μακρά προτείνει ότι επαγωγικές αλληλεπιδράσεις ιστών ενέχονται στην διαδικασία, και ότι η στενή αλληλεπίδραση μεταξύ του στοματικού εξωδέρματος και του νευρικού εξωδέρματος είναι καίρια για την αρχική ανάπτυξη του λοβού της υπόφυσης (Dattani 2005). Εικόνα 1-3. Γενετικός έλεγχος της ανάπτυξης της υπόφυσης των θηλαστικών. Δείχνονται οι μεταγραφικοί παράγοντες που είναι απαραίτητοι για την ανάπτυξη των διαφορετικών κυτταρικών τύπων (Sloop et al. 2001). Εξωγενή μόρια εντός του κοιλιακού διεγκεφάλου και των περιβαλλουσών δομών, όπως BMP-2 και -4 (bone morphogenetic proteins), FGF-8 (fibroblast growth factor), SHH (Sonic hedgehog homologue), Wnt4 (wingless) και TTF-1 (thyroid transcription factor), που καλείται επίσης και Titf-1 ή Nkx2.1, διαδραματίζουν καίριους ρόλους στην πρώιμη οργανογένεση (Εικόνα 1-3). Φαίνεται ότι ο θύλακος του Rathke αναπτύσσεται με μια διαδικασία δύο βημάτων, που απαιτεί τουλάχιστον δύο αλληλοδιάδοχα επαγωγικά σήματα από 4

12 τον διεγκέφαλο. Πρώτον, η επαγωγή και ο σχηματισμός του υποτυπώδους θυλάκου εξαρτάται από το BMP4 που είναι παρών μόνο στον υποθάλαμο και όχι στον θύλακο του Rathke. Δεύτερον ο FGF8, που είναι επίσης παρών στον υποθάλαμο και όχι στον θύλακο του Rathke ενεργοποιεί τα ρυθμιστικά γονίδια Lhx3 και Lhx4 (βλέπε παρακάτω), που είναι απαραίτητα για επακόλουθη ανάπτυξη του υποτυπώδους θυλάκου σε έναν οριστικό θύλακο. Η τελική κυτταρική διαφοροποίηση της υπόφυσης είναι αποτέλεσμα σύνθετης αλληλεπίδρασης μεταξύ εξωγενών σηματοδοτικών μορίων, όπως FGF8, BMP-2, BMP-4, BMP-7 και Wnt5A, και μεταγραφικών παραγόντων, όπως Lhx3, Lhx4, GATA-2, Isl1, Prop-1 και Pit-1 (Εικόνα 1-3) (Dattani and Preece 2004) HESX1 Ο HESX1 είναι ένας από τους πρώιμους δείκτες του αρχέγονου οργάνου της υπόφυσης, προτείνοντας ότι έχει κριτικό ρόλο στον αρχικό καθορισμό και στην διαφοροποίηση του αδένα. Επίσης η έκφραση του είναι βασική για την ανάπτυξη του οπτικού νεύρου. Το όνομα του υποδηλώνει ομοιοακολουθίας (homeobox) γονίδιο που εκφράζεται στα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα. Το ίδιο γονίδιο αναφέρεται επίσης ως Rpx, που υποδηλώνει homeobox γονίδιο του θυλάκου του Rathke. Το γονίδιο του μυός χαρτογραφείται στο χρωμόσωμα 14, και το ανθρώπινο γονίδιο χαρτογραφείται στο χρωμόσωμα 3p21.2. Τα γονίδια του μυός και του ανθρώπου περιλαμβάνουν τέσσερα εξόνια, που καλύπτουν απόσταση 1.7 kb και κωδικοποιούν πρωτεΐνες των 185 αμινοξέων. Ο Hesx1/HESX1 είναι ένας μεταγραφικός καταστολέας, ωστόσο οι στόχοι του παραμένουν άγνωστοι. Μια υψηλά συντηρημένη περιοχή στο αμινοτελικό τμήμα του HESX1, είναι σημαντική για την κατασταλτική του λειτουργία. Η εξαφάνιση του Hesx1 είναι σημαντική για την ενεργοποίηση άλλων γονιδίων όπως Prop1 (βλέπε παρακάτω) (Parks et al. 1999; Dattani 2005) LHX3/LHX4 Οι LHX3 και LHX4 είναι LIM ομοιοπεριοχής (LIM-HD) μεταγραφικοί παράγοντες. Η LIM περιοχή, μια περιοχή πολυλειτουργικής αλληλεπίδρασης 5

13 πρωτεΐνης/πρωτεΐνης, αναγνωρίστηκε αρχικά σε αρκετά άλλα μέλη αυτής της κατηγορίας των μεταγραφικών παραγόντων. Στα θηλαστικά, υπάρχουν τουλάχιστον δώδεκα LIM-HD γονίδια που κωδικοποιούν ρυθμιστικές πρωτεΐνες ανάπτυξης, που χαρακτηρίζονται από δύο LIM περιοχές και μία DNAπροσδενόμενη ομοιοπεριοχή (DNA-binding HD). Από τις LIM-HD πρωτεΐνες των θηλαστικών, οι ISL-1, ISL-2, LHX2, LHX3, και LHX4 έχουν ενοχοποιηθεί για την ανάπτυξη της υπόφυσης. LHX3: Ανευρίσκεται στο αναπτυσσόμενο νευρικό σύστημα, καθώς επίσης και στον θύλακο του Rathke, και η έκφραση του εμμένει στην υπόφυση του ενήλικα, που σημαίνει ότι συμβάλλει στην διατήρηση της λειτουργίας ενός ή περισσοτέρων κυτταρικών τύπων του πρόσθιου λοβού της υπόφυσης. Ο LHX3 ενεργοποιεί τον α-gsu υποκινητή και, μαζί με τον POU1F1, δρουν συνεργικά για την ενεργοποίηση των TSH-β και PRL υποκινητών και του POU1F1 ενισχυτή. Ο LHX3 είναι ένας από τους πρώιμους δείκτες για τα κύτταρα που προορίζονται να σχηματίσουν τον πρόσθιο και τον διάμεσο λοβό και η συνεχής έκφραση του είναι βασική για τον σχηματισμό των γοναδοτρόπων, θυρεοειδοτρόπων, λακτοτρόπων και σωματοτρόπων κυττάρων. Το ανθρώπινο LHX3 γονίδιο χαρτογραφείται στο χρωμόσωμα 9 και συνίσταται από εφτά κωδικεύων εξόνια και έξι εσώνια, που εκτείνονται 8.5kb. Τα LHX3 γονίδια των θηλαστικών παράγουν δύο κύρια mrnas που είναι γνωστά ως LHX3a και LHX3b. LHX4: Ο LHX4 είναι στενά συγγενικό γονίδιο που εκφράζεται σε συγκεκριμένα πεδία του εγκεφάλου και της σπονδυλικής στήλης. Όπως ο LHX3, παρόμοια ο LHX4 εκφράζεται σε όλη την διάρκεια εγκολεασμού του θυλάκου, ωστόσο σε αντίθεση με τον LHX3, περιορίζεται η επακόλουθη έκφραση του στον μελλοντικό πρόσθιο λοβό της υπόφυσης. Το ανθρώπινο LHX4 γονίδιο στο χρωμόσωμα 1 έχει παρόμοια οργάνωση εξονίου/εσωνίου με το LHX3, αλλά τα μακρύτερα εσώνια συνεπάγονται μήκος γονιδίου περισσότερο από 45kb (Dattani 2005; Mullen et al. 2007) Pit-1/POU1F1 Ο Pit-1 είναι επίσης γνωστός ως GHF1 (GH factor-1) και έχει επίσημα ορισθεί ως POU1F1 (POU περιοχή, κατηγορία 1, μεταγραφικός παράγοντας 1). 6

14 Είναι μέλος της οικογένειας των μεταγραφικών παραγόντων, POU, υπεύθυνων για την ανάπτυξη των θηλαστικών. Το POU είναι ένα ακρωνύμιο για Pit-1, Oct- 1, που εκφράζεται ευρέως, Oct-2, που εκφράζεται στα Β λεμφοκύτταρα και σε ορισμένες περιοχές στον εγκέφαλο, και Unc-86, το οποίο λειτουργεί για την ανάπτυξη των νευρικών κυττάρων του C.elegans. Η έκφραση του Pit-1 περιορίζεται στον πρόσθιο λοβό της υπόφυσης και χαρακτηρίζεται από την ειδική του δέσμευση σε κύτταρο-ειδικά στοιχεία πλούσια σε AT στα γονίδια της GH και της PRL του επίμυ (Cohen and Radovick 2002). Ο Pit-1 συμμετέχει στην μεταγραφική ενεργοποίηση των γονιδίων της GH, προλακτίνης, TSH, και του υποδοχέα της GHRH (GHRHR), καθώς επίσης και στην διαφοροποίηση και πολλαπλασιασμό των σωματοτρόπων, λακτοτρόπων και θυρεοτρόπων κυττάρων (Amselem 2002). Το γονίδιο του Pit-1 (PIT-1) στον μυ χαρτογραφείται στο χρωμόσωμα 16, και στον άνθρωπο στο χρωμόσωμα 3p11. Συνίσταται από 6 εξόνια που κωδικοποιούν μια πρωτεΐνη 290 αμινοξέων. Ο Pit-1 έχει μια αμινοτελική περιοχή ενεργοποίησης της μεταγραφής (transactivation domain) που είναι πλούσια σε υδροξυλιωμένα αμινοξέα, που ακολουθείται από δύο περιοχές πρόσδεσης στο DNA (DNA binding domains). Αυτές είναι η POU-ομοιοπεριοχή (POU-H) και η POU-ειδική περιοχή (POU-S) (Εικόνα 1-4), οι οποίες είναι απαραίτητες για την υψηλής συγγένεια πρόσδεση στα γονίδια της GH και της PRL. Η POU-ομοιοπεριοχή μοιάζει με τις αντίστοιχες περιοχές που προσδένονται στο DNA (DNA-binding domains) μιας μεγάλης οικογένειας ομοιοακολουθίας (homeobox) πρωτεϊνών. Η POU-ομοιοπεριοχή συμβάλλει στην αναγνώριση περιοχών πλούσιων σε AT, και η POU-ειδική περιοχή ενισχύει την δέσμευση σε περιοχές που περιέχουν την TATNCAT συναινετική αλληλουχία (consensus sequence). Υπάρχουν δύο τέτοιες περιοχές στους υποκινητές της GH και της CS, τουλάχιστον τρεις στον υποκινητή της PRL, αρκετά περισσότερες σε μια απομακρυσμένη περιοχή ενισχυτή που προηγείται του γονιδίου της PRL, μία στον υποκινητή του γονιδίου που κωδικοποιεί την β υπομονάδα της TSH και μία στον υποκινητή του GHRH-R γονιδίου. Υπάρχουν επιπρόσθετα θέσεις δέσμευσης στον υποκινητή του PIT-1 και σύμπλεγμα Pit-1 7

15 και στοιχείου υποδοχέα ρετινοικού οξέος, 10kb ανάρρους του PIT-1 (Parks et al. 1999). Εικόνα 1-4. Α. Σχηματική απεικόνιση των συμπλεγμάτων Pit-1 και DNA. Οι POU περιοχές του Pit-1 δεσμεύονται στο DNA ως ομοδιμερή, και παρίστανται με ροδοκίτρινα και μπλε χρώματα. Τα βέλη δείχνουν τους σχετικούς προσανατολισμούς των POUειδικών και όμοιο υποπεριοχών. Β. Το Pit-1- DNA σύμπλεγμα απεικονίζεται κατά προσέγγιση διαμέσου μη κρυσταλλογραφικού διπλού άξονα. Οι διακεκομμένες γραμμές δείχνουν τους υποτιθέμενους ευέλικτους συνδέτες, που ενώνουν τις POUειδικές περιοχές (POU-S1και POU-S2) με τις όμοιο περιοχές (POU-H1 και POU-H2). (Jacobson et al. 1997). Στοιχεία από κρυσταλλογραφίες με ακτίνες Χ προτείνουν ότι υπάρχουν τέσσερις α έλικες παρούσες στην POU-S περιοχή και τρεις α έλικες παρούσες στην POU-H περιοχή. Ο Pit-1 συνήθως δεσμεύεται σε πολλαπλές θέσεις στα γονίδια-στόχους και διμερισμός του Pit-1 πάνω στο DNA εμφανίζεται να είναι σημαντικός για την υψηλής συγγένειας πρόσδεση στο DNA. Η τρίτη α-έλικα κάθε μιας από τις POU-S και POU-H δημιουργεί την πλειονότητα των επαφών με τις κύριες αύλακες του DNA. Ο Pit-1 σχηματίζει διμερή πάνω στο DNA μέσω αλληλεπιδράσεων μεταξύ της POU-S περιοχής του ενός μορίου και της καρβοξυτελικής περιοχής της POU-Η του άλλου μορίου (Εικόνα 1-4). Υψηλή ανάλυση μέσω ακτίνων Χ, αποκαλύπτει το διασυνδετικό στοιχείο στον διμερισμό του PIT-1, το οποίο, αναπάντεχα, αποδεικνύεται να είναι ευαίσθητο σημείο (hot spot) μεταλλαγών (Arg 58), σχετιζόμενο με συνδυασμένη υποφυσιακή ορμονική ανεπάρκεια (CPHD) στους ανθρώπους (βλέπε 6.1) (Jacobson et al. 1997). Όταν προσδένεται στο DNA, ο Pit-1 διεγείρει την έκφραση του γονιδίου της GH και της PRL, εν μέρει, μέσω της αμινοτελικής περιοχής του που ενεργοποιεί την μεταγραφή (transactivation domain) (Theill et al. 1989). 8

16 1.3.4 PROP1 O PROP1 (Prophet του Pit-1 γονιδίου) χαρτογραφείται στο χρωμόσωμα 5q και κωδικοποιεί μεταγραφικό παράγοντα που συμμετέχει στην πρώιμη εμβρυϊκή ανάπτυξη. Είναι απαραίτητος για την έκφραση του Pit-1, για την διαφοροποίηση των Pit-1-εξαρτώμενων κυτταρικών σειρών και για την διαφοροποίηση των γοναδοτρόπων κυττάρων (Bona et al. 2004). Το ανθρώπινο Prop1 γονίδιο, όπως και αυτό του μυός, συνίστανται από 3 εξόνια που εκτείνονται σε μια απόσταση περίπου 3 kb (Εικόνα 1-5). Αυτά τα γονίδια κωδικοποιούν πρωτεΐνες των 223 αμινοξέων. Εικόνα 1-5. Το γονίδιο και οι πρωτεινικές περιοχές του PROP-1 ( Στην πρωτεΐνη του Prop-1 υπάρχει μια κεντρική περιοχή πρόσδεσης στο DNA (DNA binding domain) με τρεις περιοχές α ελίκων που μοιάζουν με τις paired περιοχές της Drosophila. Μια περιοχή ενεργοποίησης της μεταγραφής (transcriptional activation domain) ακολουθεί την paired -όμοια περιοχή (Εικόνα 1-5). Υπάρχει απόκλιση της αμινοξικής αλληλουχίας στην αμινοτελική περιοχή της πρωτεΐνης, αλλά πολύ ισχυρή διατήρηση της αμινοξικής αλληλουχίας στο μέσο και στις καρβοξυτελικές περιοχές των πρωτεϊνών στον άνθρωπο και στον μυ. Ο Prop-1 προσδένεται ως διμερές σε στοιχεία του υποκινητή που περιέχουν παλινδρομικές TAAT ATTA αλληλουχίες, οι οποίες χωρίζονται από 2 ή 3 διαστήματα. Αυτός ο τύπος στοιχείου αναγνωρίζεται από άλλες paired -όμοιες ομοιοακολουθίας (homeobox) πρωτεΐνες, μεταξύ των οποίων ο HESX1 παράγοντας (Parks et al. 1999). 1.4 Σωματοτρόπα κύτταρα Τα σωματοτρόπα κύτταρα αντιπροσωπεύουν το 50% των κυττάρων του πρόσθιου λοβού της υπόφυσης. Βρίσκονται σε ομάδες κατά μήκος των 9

17 κολποειδών και τοποθετούνται κυρίως στις δύο πλάγιες πτέρυγες του πρόσθιου λοβού. Τα κύτταρα είναι συνήθως μεσαίου μεγέθους και περιλαμβάνουν πολυάριθμα σφαιρικά, ηλεκτρονικά πυκνά κοκκία, η πλειοψηφία των οποίων είναι 350 έως 500nm σε διάμετρο. Έχουν ένα καλά αναπτυσσόμενο ενδοπλασματικό δίκτυο και εκκρίνουν GH. Ανοσοϊστοχημικές παρατηρήσεις προτείνουν ισχυρά ότι τα σωματοτρόπα κύτταρα δεν είναι ομοιόμορφη μάζα κυττάρων. Έχουν αρκετούς υποπληθυσμούς, οι οποίοι εκφράζουν όλοι σωματοτροπίνη, ενώ είναι ικανοί σε ειδικές περιστάσεις να παράγουν άλλες ορμόνες, όπως προλακτίνη και TSH (Halasz 2004). Οι κυτταρικοί μηχανισμοί με τους οποίους οι εκλυτικές ορμόνες επιδρούν στην έκκριση της GH από τα σωματοτρόπα κύτταρα απαιτούν ειδικά συστήματα ενδοκυττάριας μετάδοσης (camp και/ή ροή ασβεστίου και/ή κινητοποίηση ενδοκυττάριου ασβεστίου και/ή κινάσες τυροσίνης και/ή μονοξείδιο του αζώτου (NO)/cGMP). Τα υποκυττάρια γεγονότα που οδηγούν στην απελευθέρωση της GH είναι η παροδική συγχώνευση των GH εκκριτικών κοκκίων με πόρους σύντηξης, που τοποθετούνται σε βοθρία στην επιφάνεια της κυτταρικής μεμβράνης (Anderson et al. 2004). 10

18 2. ΑΥΞΗΤΙΚΗ ΟΡΜΟΝΗ (GH) 2.1 Δομή και ισομορφές της GH Η GH του ανθρώπου συντίθεται από τα σωματοτρόπα κύτταρα του πρόσθιου λοβού της υπόφυσης. Είναι η πιο άφθονη ορμόνη στην υπόφυση και το περιεχόμενο της σε έναν μονό αδένα της υπόφυσης ποικίλει από 5 έως 15mg, που αντιστοιχεί στο 3% του βάρους του αδένα. Πρόκειται για μια σφαιρική πρωτεΐνη με μοριακό βάρος 22Kd. Αποτελείται από μια μονή πολυπεπτιδική αλυσίδα 191 αμινοξέων με δύο δισουλφιδικές γέφυρες και χωρίς τμήματα υδατανθράκων. Στην δευτεροταγή της δομή είναι κυρίως με την μορφή της α-έλικας (Εικόνα 2-1) (Cogan and Philips 2000). Εικόνα 2-1. α. Αλληλουχία αμινοξέων της 22kDa GH. Είναι σφαιρική πρωτεΐνη και συνίσταται από μονή πολυπεπτιδική αλυσίδα με 191 κατάλοιπα αμινοξέων, με δύο δισουλφιδικές γέφυρες (κίτρινο). β. Παρίστανται οι τέσσερις έλικες της GH. Οι πρώτες δύο έλικες είναι παράλληλες μεταξύ τους και αντιπαράλληλες στις δύο τελευταίες έλικες. Έλικα 1 (ανοιχτό πράσινο), έλικα 2 (σκούρο πράσινο), έλικα 3 (ανοιχτό μπλε), έλικα 4 (σκούρο μπλε). Αμινοτελικό (Ν-) άκρο μπλε, καρβοξυτελικό άκρο (C-) κόκκινο (Mullis et al. 2002). Η GH συνίσταται από αρκετές ισομορφές στα περισσότερα είδη που έχουν εξεταστεί. Η 22kDa GH θεωρείται η κλασσική μορφή της GH και είναι η πιο άφθονη ισομορφή στην κυκλοφορία. Αυτή η κυρίαρχη μορφή της GH προάγει την αύξηση και επηρεάζει την ενεργητική και αναβολική λιπόλυση και άλλες μεταβολικές διαδικασίες. H 20kDa GH, η οποία αντιπροσωπεύει το 5-10% της GH στην υπόφυση και περίπου το 15% στο πλάσμα, είναι η δεύτερη πιο 11

19 άφθονη ισομορφή. Μολονότι συντίθεται στην υπόφυση και εκκρίνεται μαζί με την 22kDa, προκύπτει από εναλλακτικό μάτισμα του εξονίου 3 με αποτέλεσμα να απουσιάζουν τα κατάλοιπα αμινοξέων από 32 έως 46. Μαζί οι δύο ισομορφές των 20 και 22kDa εκκρίνονται παλμικά και με μια σταθερή μοριακή αναλογία (De Palo et al. 2006). Επιπρόσθετα ασκούν παρόμοια μεταβολική δράση, ενώ είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι ο χρόνος ημίσειας ζωής της 20 kda GH είναι μεγαλύτερος από αυτόν της 22kDa μορφής (Leung et al. 2002). Έχουν αναγνωρισθεί και άλλες ισομορφές που βρίσκονται σε πολύ μικρότερο ποσό, όπως των 24kDa και των 17.5kDa. Η ισομορφή των 24kDa προέρχεται από πρωτεολυτική διάσπαση του μορίου των 22kDa μεταξύ των καταλοίπων 139 και 140. Λόγω αυτού το μόριο εμφανίζεται με την μορφή δύο αλυσίδων, με αποτέλεσμα αλλαγή της δευτεροταγής και τριτοταγής δομής και αύξηση του μοριακού βάρους. Βρίσκεται σε πολύ μικρές ποσότητες στον αδένα της υπόφυσης και δεν ανιχνεύεται στο πλάσμα, ενώ μπορεί να είναι υπεύθυνη για την λακτογόνο δραστικότητα της ανθρώπινης hgh. Η 17.5kDa μορφή είναι αποτέλεσμα ματίσματος που οδηγεί σε παράλειψη του εξονίου 3, το οποίο κωδικοποιεί τα αμινοξέα 32 έως 71 (Cogan and Phillips 2000). Αξίζει να σημειωθεί ότι από όλες τις μονομερείς μορφές που υπάρχουν σχηματίζονται ομο- και έτερο-ολιγομερή. Κατά προσέγγιση το ένα τρίτο των ολιγομερών είναι συνδεμένα με δισουλφιδικούς δεσμούς, ενώ τα δύο τρίτα είναι μη ομοιοπολικά συνδεδεμένα. Το διμερές κλάσμα είναι ιδιαίτερα αυξημένο στην 20kDa μορφή. Πρέπει να σημειωθεί ότι η ολιγομερής GH έχει μικρότερη βιοδραστικότητα από την μονομερή GH. Επιπλέον η αναλογία των ολιγομερών μορφών είναι γενικά υψηλότερη στο πλάσμα σε σχέση με τα εκχυλίσματα της υπόφυσης, ίσως επειδή η κάθαρση των ολιγομερών μορφών είναι βραδύτερη από αυτή των μονομερών μορφών (Baumann 1999). 2.2 Oικογένεια γονιδίων της GH Η συστάδα γονιδίων της GH αποτελείται από πέντε παρόμοια γονίδια που χαρτογραφούνται στο μακρύ σκέλος του χρωμοσώματος 17, στις q22-24 ζώνες του. Τα γονίδια που περιλαμβάνονται από το 5 προς το 3 άκρο είναι τα εξής: GH-1, CSHP (ψευδογονίδιο της χοριακής σωματοτοτροπίνης), CSH-1 (γονίδιο 12

20 της χοριακής σωματοτροπίνης), GH-2 και CSH-2 (Εικόνα 2-2). Αυτή η ομάδα γονιδίων των 66.5Kb έχει αλληλουχηθεί στο σύνολο της. Το GH-1 γονίδιο είναι το μοναδικό που εκφράζεται στην υπόφυση, το CSHP είναι ψευδογονίδιο και τα υπόλοιπα εκφράζονται σε κύτταρα συγκυτιοτροφοβλάστης του πλακούντα. Το GH-2 γονίδιο κωδικοποιεί την GH-V πρωτεΐνη που διαφέρει κατά 13 αμινοξέα από την πρωταρχική αλληλουχία του GH-N, το προϊόν του GH-1 γονιδίου. Αντικαθιστά την ορμόνη της υπόφυσης στην μητρική κυκλοφορία το δεύτερο μισό της εγκυμοσύνης. Εικόνα 2-2. Σχηματική απεικόνιση της ομάδας γονιδίων της GH και η χαρτογράφηση της στο χρωμόσωμα 17 του ανθρώπου. Εξόνια, ιντρόνια και μη μεταφραζόμενες αλληλουχίες απεικονίζονται με μαύρα, λευκά, και σκιαγραφημένα ορθογώνια παραλληλογράμματα αντίστοιχα (Phillips III and Cogan 2000) Τα CSH-1, CHS-2 γονίδια κωδικοποιούν πρωτεΐνες με όμοιες αλληλουχίες και έχουν 93% ομολογία με την αλληλουχία του GH1 σε επίπεδο DNA. Σε σύγκριση με τις αλληλουχίες των CSH γονιδίων, το CSHP1 ψευδογονίδιο περιλαμβάνει 25 αντικαταστάσεις νουκλεοτιδίων εντός των εξονίων καθώς και μια G A μετάπτωση στην +1 θέση της περιοχής δότη ματίσματος (donor splice site) του εσωνίου 2 που απενεργοποιεί μερικώς την έκφραση του. Υπάρχει ομοιότητα στην οργάνωση και των πέντε γονιδίων, καθένα από τα οποία αποτελείται από πέντε εξόνια που διακόπτεται σε πανομοιότυπες θέσεις από μικρού μεγέθους ιντρόνια. Η ευρεία ομολογία (92%-98%) μεταξύ της εγγύς πλευρικής, παρεμβαλλόμενης και κωδικοποιούσας αλληλουχίας αυτών 13

21 των πέντε γονιδίων δηλώνει ότι αυτή η οικογένεια των πολλαπλών γονιδίων προκύπτει από μια σειρά διαδικασιών διπλασιασμού. Με εξαίρεση το CSHP, κάθε γονίδιο κωδικοποιεί μια προορμόνη 217 αμινοξέων, η οποία διασπάται και δίνει γένεση σε μια ώριμη ορμόνη 191 αμινοξέων και μοριακού βάρους 22Kd (Procter et al. 1998; Mullis 2007). 2.3 Δομή και ρύθμιση της έκφρασης του GH-1 γονιδίου Το GH1 γονίδιο συνίσταται από 5 εξόνια με βραχείες παρεμβαλλόμενες αλληλουχίες και η πλήρη αλληλουχία του γονιδίου περιλαμβάνει 1.3kB (Eικόνα 2-2). Το εξόνιο 1 του GH-1 γονιδίου περιλαμβάνει 60 βάσεις της 5 αμετάφραστης περιοχής, τα κωδικόνια -26 έως -24 και το πρώτο νουκλεοτίδιο του κωδικόνιου -23 που αντιστοιχεί στην έναρξη της 26 αμινοξέων οδηγού αλληλουχίας (leader sequence). Το εξόνιο 2 κωδικοποιεί το υπόλοιπο του οδηγού πεπτιδίου και τα πρώτα 31 αμινοξέα της ώριμης GH. Τα εξόνια 3-5 κωδικοποιούν τα αμινοξέα 32 71, , και αντίστοιχα. Το εξόνιο 5 κωδικοποιεί επίσης 112 βάσεις της 3 αμετάφραστης περιοχής που καταλήγει στην θέση πολυαδενυλίωσης. Μια Alu επαναλαμβανόμενη αλληλουχία είναι παρούσα 100 βάσεις 3 της θέσης πολυαδενυλίωσης του GH1. Τα ιντρόνια Ι, ΙΙ, ΙΙΙ, ΙV είναι 256, 209, 93 και 253 βάσεις σε μήκος αντίστοιχα (Procter et al. 1998; Binder 2002). Το επίπεδο της έκφρασης του GH-1 γονιδίου στην υπόφυση είναι αρκετά υψηλό, όπως άλλωστε κρίνεται από την αναλογία (3%) των cdna κλώνων που προέχονται από την υπόφυση και αντιστοιχούν στο GH-1 γονίδιο. Υπάρχει, ωστόσο, ένδειξη για έκφραση του GH-1 γονιδίου σε ιστούς εκτός της υπόφυσης, όπως στον υποθάλαμο, θύμο καθώς και στα ουδετερόφιλα. Πειράματα με κυτταρικές καλλιέργειες, χρησιμοποιώντας είτε ανθρώπινα είτε κύτταρα επίμυος, παρείχαν ένδειξη ότι τα γλυκοκορτικοειδή, το ρετινοϊκό οξύ, και η GHRH ρυθμίζουν θετικά την έκφραση του GH-1 γονιδίου, ενώ η θυρεοειδής ορμόνη, ο IGF και η ινσουλίνη δρουν ως αρνητικοί ρυθμιστές. Τα γλυκοκορτικοειδή ασκούν τις δράσεις τους και μεταμεταγραφικά ενισχύοντας την σταθερότητα του GH-1 mrna (Procter et al. 1998). Η μεταγραφική μηχανή χρειάζεται cis-δραστικά στοιχεία, βραχείες περιοχές αλληλουχιών του DNA κυρίως 5 του γονιδίου που είναι υπεύθυνες 14

22 για τις προαναφερθείσες επαγώγιμες ή κατασταλτικές δράσεις στην έκφραση του GH1 γονιδίου, στα οποία δεσμεύονται οι μεταγραφικοί παράγοντες, που καλούνται επίσης trans-δραστικοί παράγοντες (Εικόνα 2-3). Αυτή η πρόσδεση αποτελεί προϋπόθεση για μια φυσιολογικά ρυθμιζόμενη μεταγραφή από την RNA πολυμεράση. Εικόνα περιοχή του υποκινητή του GH-1 γονιδίου και τα cis-δραστικά στοιχεία (Binder 2002). Η αλληλουχία του υποκινητή του GH-1 γονιδίου, που είναι επαρκής για έλεγχο της έκφρασης της GH σε καλλιέργεια κυττάρων, συνίσταται από 300 βάσεις περίπου της 5 πλευρικής περιοχής του GH-1 γονιδίου. Περιλαμβάνει δύο cis-δραστικά στοιχεία για τον ειδικό της υπόφυσης μεταγραφικό παράγοντα Pit-1 στο -65 έως -92 και -105 έως -130 και δύο μη κλασσικά camp στοιχεία απόκρισης στο -96 έως -99 και στο -183 έως Επιπρόσθετα, cis-δραστικά στοιχεία για την πρόσδεση των ευρισκόμενων παντού μεταγραφικών παραγόντων, όπως Zn-15, SP1, USF, NF-1, έχουν περιγραφεί, ωστόσο η λειτουργική σημασία αυτών των περιοχών για την έκφραση της GH στον άνθρωπο δεν έχει ακόμη εξεταστεί. Αλληλούχιση της περιοχής του υποκινητή της GH του ανθρώπου έχει αποκαλύψει μια εντυπωσιακά υψηλή μεταβλητότητα, η οποία μπορεί-τουλάχιστον κατά μέροςνα έχει δημιουργηθεί από διαγονιδιακή μετατροπή μεταξύ των πέντε γονιδίων που ανήκουν στην ομάδα γονιδίων της GH. Σε αντίθεση με τις καλλιέργειες κυττάρων, ο εγγύς υποκινητής του ανθρώπινου GH-1 γονιδίου δεν είναι επαρκής για να επιτευχθεί κατάλληλη έκφραση της GH στην υπόφυση των διαγονιδιακών μυών. Όταν το GH1 γονίδιο ενσωματώθηκε στο γονιδίωμα του μυός, εκφράστηκε μόνο σποραδικά και σε 15

23 χαμηλά επίπεδα στο όργανο-στόχο του διαγονιδιακού ζώου. Δύο περιοχές, περίπου 15 και 30kb ανάρρους του GH-1 γονιδίου, αναγνωρίστηκαν από πειράματα υπερευαισθησίας στην DNAse I, ως θέση ελέγχου για την ειδική της υπόφυσης και υψηλού επιπέδου έκφραση της GH, και για τον λόγο αυτό ονομάστηκε ως locus control region, LCR. Αυτή η περιοχή πιστεύεται ότι περιλαμβάνει cis-δραστικά στοιχεία που δεσμεύουν trans-δραστικούς παράγοντες, οι οποίοι επάγουν αλλαγή της δομής της χρωματίνης, με επακόλουθο ελευθέρωση του εγγύς υποκινητή για μεταγραφική ενεργοποίηση. Πρόσφατα, τρεις περιοχές πλούσιες σε A/T, που θα μπορούσαν να χρησιμεύουν ως cis-δραστικά στοιχεία για τον Pit-1 αναγνωρίσθηκαν στην LCR περιοχή, ανάρρους του GH-1 γονιδίου. Οι trans-δραστικοί παράγοντες μπορούν χρήσιμα να χωριστούν σε τρεις ευρείες κατηγορίες. Υπάρχουν αυτοί οι παράγοντες που χρησιμεύουν για τον έλεγχο του βασικού επιπέδου μεταγραφής του GH1 γονιδίου, όπως CTF/NF1, USF, C/EBPa, SP1 και οι πρωτεΐνες του κουτιού TATA. Υπάρχει ο ειδικός της υπόφυσης μεταγραφικός παράγοντας Pit-1 (POU1F1) που διεγείρει ισχυρά την μεταγραφή του GH1 γονιδίου τόσο in vivo όσο και in vitro. Η πρόσδεση του Pit-1 ως διμερές σε δύο cis-δραστικά στοιχεία του υποκινητή του GH1 γονιδίου είναι απαραίτητη για την έκφραση της GH. Οι μεταγραφικοί παράγοντες που είναι υπεύθυνοι για την GHRH-επαγόμενη θετική ρύθμιση της έκφρασης της GH δεν είναι γνωστοί, αλλά πιθανόν ο Pit-1 συμμετέχει σε αυτό το μονοπάτι. Τέλος, υπάρχουν μεταγραφικοί παράγοντες ενεργοποιούμενοι από ορμόνες, όπως ο AP-2, οι υποδοχείς των γλυκοκορτικοειδών και της θυρεοειδούς ορμόνης, μια επαγόμενη από την ινσουλίνη DNA-δεσμευτική πρωτεΐνη και μια πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά με το camp στοιχείο απόκρισης (Procter et al. 1998; Binder 2002). 16

24 3. ΝΕΥΡΟΕΝΔΟΚΡΙΝΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΕΚΚΡΙΣΗΣ ΤΗΣ GH 3.1 Γενικά Η έκκριση της GH από την υπόφυση βρίσκεται κάτω από τον νευρικό έλεγχο του υποθαλάμου κυρίως μέσω τριών υποφυσιοτρόπων παραγόντων: εκλυτική ορμόνη της GH (GHRH), σωματοστατίνη (SRIF) και γκρελίνη. Οι GHRH νευρώνες εντοπίζονται κυρίως στον τοξοειδή (ARC), αλλά και στον διάμεσο κοιλιακό και οι SRIF νευρώνες τοποθετούνται στον πρόσθιο περικοιλιακό πυρήνα (PeVN) (Εικόνα 3-1). Η απελευθέρωση της GH διεγείρεται από την GHRH και αναστέλλεται από την SRIH (Kato et al. 2002). Εικόνα 3-1. Ανατομία του άξονα υποθαλάμου-υπόφυσης που δείχνει τους κύριους υποθαλαμικούς πυρήνες και τον αδένα της υπόφυσης. Απεικονίζονται ο υποθάλαμος (hypothalamus), ο πρόσθιος (anterior) και ο οπίσθιος (posterior) λοβός της υπόφυσης (pituitary lobe), η μέση προεξοχή (median eminence), το οπτικό χίασμα (OC), oι πυρήνες του υποθαλάμου: παρακοιλιακός (paraventricular, PVN), μέσος ραχιαίος πυρήνας (dorsomedial, DMN), προ-οπτικός πυρήνας (preoptic, PO), υπεροπτικός πυρήνας (supraoptic, SO), τοξοειδής πυρήνας (arcuate, AR), και διάμεσος κοιλιακός πυρήνας (ventromedial, VMN). Πρόσφατα, ένα τρίτο ανεξάρτητο μονοπάτι, που ρυθμίζει την έκκριση της GH, αναγνωρίσθηκε από μελέτες σε ευοδωτικά πεπτίδια της έκκρισης της GH (GHS), συνθετικές ουσίες που είναι ισχυροί διεγέρτες της απελευθέρωσης της 17

25 GH. Ο Kojima και οι συνάδελφοι του αναγνώρισαν ότι το φυσικό συνδεόμενο μόριο του υποδοχέα των GHS (GHS-R) στα σωματοτρόπα κύτταρα είναι η γκρελίνη, που εκκρίνεται κυρίως από το στομάχι αλλά και από νευρώνες του υποθαλάμου (Kojima and Kangawa 2005). Η απελευθέρωση της GHRH και της SRIH από τον υποθάλαμο ρυθμίζεται από μια ποικιλία άλλων νευροπεπτιδίων, νευροδιαβιβαστών και νευροορμονών. Παρόμοια με άλλα ενδοκρινή συστήματα, το τελικό προϊόν της δράσης της GH, ο IGF-1, ασκεί αρνητική παλίνδρομη ρύθμιση στην έκκριση της GH. Τo ποσό της GH που εκκρίνεται και το πρότυπο απελευθέρωσης της GH είναι επίσης σύμφωνο με την θρεπτική κατάσταση, την μεταβολική κατάσταση, την άσκηση, το στρες και τον ύπνο (Fodor et al. 2006; Goldenberg and Barkan 2007). Αξίζει επίσης να σημειωθεί ότι σημαντικό ρόλο στην έκκριση της GH παίζουν και ανώτερα εγκεφαλικά κέντρα, ο ιππόκαμπος και η αμυγδαλή. Συνοπτικά, εκτός των υποφυσιοτρόπων ορμονών (GHRH, SRIH, γκρελίνη) που είναι οι κύριοι ρυθμιστές της έκκρισης της GH, άλλοι παράγοντες, καταστάσεις και δομές που επιδρούν στην έκκριση της GH είναι οι εξής (Εικόνα 3-2): νευροδιαβιβαστές: κατεχολαμίνες, ακετυλοχολίνη, ντοπαμίνη, σεροτονίνη, ισταμίνη, αμινοξέα (NMDA και GABA), νευροπεπτίδια: εκλυτική ορμόνη της θυρεοτροπίνης (TRH), εκλυτική ορμόνη των γοναδοτροπινών (GnRH), εκλυτική της φλοιοεπινεφριδιοτρόπου ορμόνης (CRH), οπιοειδή πεπτίδια (EOP), αργινίνη-βαζοπρεσίνη (AVP), οξυτοκίνη, νευροτενσίνη, αγγειοδραστικό εντερικό πεπτίδιο (VIP), PACAP, νευροπεπτίδιο Υ (NPY), γαλανίνη, κυττοκίνες, μονοξείδιο του αζώτου (NO), περιφερικές ορμόνες: γλυκοκορτικοειδή, στεροειδή των γονάδων, θυρεοειδικές ορμόνες, μεταβολικά σήματα: γλυκόζη, αμινοξέα, μη εστεροποιημένα λιπαρά οξέα, λεπτίνη, θρεπτική κατάσταση (παχυσαρκία, υποσιτισμός), παλίνδρομοι μηχανισμοί: αυξητική ορμόνη (GH), ινσουλινόμορφος αυξητικός παράγοντας (IGF-1), 18

26 εξωϋποθαλαμικές δομές του κεντρικού νευρικού συστήματος: ιππόκαμπος και αμυγδαλή (Muller et al. 1999). Εικόνα 3-2. Ρύθμιση της έκκρισης της GH. Τα πράσινα βέλη δείχνουν διεγερτικές επιρροές και τα κόκκινα βέλη ανασταλτικές επιρροές ( 3.2 Φυσιολογία έκκρισης της GH Παλμική μορφή έκκρισης της GH Η έκκριση της GH έχει παλμική μορφή σε όλα τα είδη, με νυχθημερή μεταβολή (κιρκαδικός ρυθμός και σχετιζόμενος με τον ύπνο). Η συχνότητα των GH παλμών κυμαίνεται από 10 έως 20 παλμούς το 24ωρο (Roelfsema et al. 2001). Η ανάπτυξη ευαίσθητων αναλύσεων χημειοφωταύγειας για μέτρηση της GH, με αυξημένη συχνότητα δειγματοληψίας, και με ανάλυση αποσυνέλιξης (deconvolution) επέτρεψε την λεπτομερή μελέτη της έκκρισης της GH. Αυτή έδειξε ότι υπάρχουν ανιχνεύσιμα επίπεδα βασικής έκκρισης GH μεταξύ των εκκριτικών αιχμών (Iranmanesh et al. 1994). Οι δύο χρονικά διακριτοί τρόποι έκκρισης της GH, o παλμικός και o βασικός, ασκούν διαφορετικές και ειδικές για τους ιστούς ρυθμιστικές επιδράσεις. Συγκεκριμένα, οι παλμοί GH τείνουν να προάγουν την βέλτιστη γραμμική (σκελετική) και μυϊκή ανάπτυξη, επάγοντας ειδικά την έκφραση του IGF-1 και άλλων γονιδίων στο οστό και στον γραμμωτό μυ. Από την άλλη, η 19

27 συνεχή GH διέγερση προνομιακά επάγει την ηπατική σύνθεση του IGF-1 και του υποδοχέα της GH και την έκφραση του υποδοχέα της χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνης (LDL), διαμεσολαβώντας με τον τρόπο αυτό στον μεταβολισμό των υδατανθράκων και του λίπους (Veldhuis et al. 2001). Οι υποκείμενοι μηχανισμοί γένεσης των παλμών είναι ακόμη αβέβαιοι, ειδικά στον άνθρωπο. Για παράδειγμα, η αλληλεπιδρούσα συμβολή των δύο κύριων υποθαλαμικών πεπτιδίων που ρυθμίζουν την παλμική έκκριση της GH, δηλαδή της GHRH και της σωματοστατίνης, δεν έχει καλά καθοριστεί. Αρκετές μελέτες σε ζώα, όπως επίμυς, πρόβατα, και χοίρους έχουν καταδείξει παλμική μορφή απελευθέρωσης αυτών των πεπτιδίων στην πυλαία κυκλοφορία της υπόφυσης, αλλά απέτυχαν να τεκμηριώσουν συσχέτιση των περιφερικών GH παλμών με τους GHRH παλμούς ή την άρση της σωματοστατίνης στο πυλαίο αίμα. Παράγοντες που μπλοκάρουν τον GHRH υποδοχέα στον άνθρωπο ελαττώνουν έντονα το εύρος (μέγιστο ρυθμό) της παλμικής έκκρισης της GH, δείχνοντας ότι η GHRH είναι βασικός παράγοντας για την ενίσχυση των GH παλμών, αλλά όχι για την επιλογή του χρόνου γένεσης των διακριτών GH παλμών. Ο ενισχυτικός ρόλος της GHRH είναι επίσης σύμφωνος με παρατηρήσεις στον άνθρωπο, όπου 24 ωρών εγχύσεις της GHRH σε φυσιολογικούς εθελοντές αυξάνει το εύρος, αλλά όχι τον αριθμό των GH παλμών. Επιπρόσθετα, ασθενείς με μεταλλαγή στον GHRH υποδοχέα (GHRH- R) εξακολουθούν να παρουσιάζουν παλμική έκκριση GH. Συμπερασματικά η σωματοστατίνη φαίνεται να εμπλέκεται στην επιλογή του χρόνου γένεσης του παλμού. Πράγματι, τόσο στους επίμυς όσο και στους ανθρώπους, οξεία άρση της σωματοστατίνης προκαλεί ανάδρασης-παρόμοιο παλμό έκκρισης GH, αν και το απόλυτο ποσό που παράγεται είναι γενικά μικρό σε σχέση με την μέγιστη απελευθέρωση της GH που επάγεται από την εξωγενή GHRH (Roelfsema et al. 2001). Γενικά, ο GH-IGF παλίνδρομος άξονας στηρίζει την έντονη εντός του αδένα παλμική μορφή σηματοδότησης. Η παλμικότητα διευθύνεται εξ αδιαιρέτου από την διεγερτική δράση της GH-εκλυτικής ορμόνης (GHRH) και της γκρελίνης/ghrp και ρυθμίζεται μέσω της σωματοστατινεργικής καταστολής και της ποικίλης παλίνδρομης καταστολής από την κυκλοφορούσα 20

28 GH και/ή από το πρωτογενές ιστικό προϊόν, IGF-1 (Εικόνα 3-3). Παραδόξως, περιοδικοί είσοδοι σωματοστατίνης διευκολύνουν επίσης τις αποκρίσεις των σωματοτρόπων κυττάρων σε επαναλαμβανόμενα εκλυτικά ερεθίσματα, ενισχύοντας με τον τρόπο αυτό την παλμική έκκριση της GH. Η παλμική δυναμική του GH-IGF άξονα προκύπτει από πολυδύναμες δοσοεξαρτώμενες και χρονοεξαρτώμενες αλληλεπιδράσεις, παρά από την μεμονωμένη δράση κάποιου πεπτιδίου (Veldhuis et al. 2001; Veldhuis and Bowers 2003). Εικόνα 3-3. Σχηματική απεικόνιση των κυριότερων ρυθμιστικών σημάτων (GHRH, GHRP/γκρελίνη, SST, GH, IGF-1) που οδηγούν σε παλμική έκκριση της GH (Veldhuis 2003) Έκκριση της GH και ύπνος Ένα από τα χαρακτηριστικά γνωρίσματα της παλμικής έκκρισης της GH στους ανθρώπους είναι η νυχτερινή αύξηση της έκκρισης της. Συμβαίνει συνήθως κοντά στα μεσάνυχτα και σε αυτό το χρονικό διάστημα τα επίπεδα της GH είναι κατά κανόνα τα υψηλότερα του 24 ώρου. Σχετίζεται με τον ύπνο βραδέων κυμάτων (SWS, στάδια III και ΙV), και εντός λεπτών από την έναρξη του παρατηρούνται τα μέγιστα επίπεδα GH. Οι νευροενδοκρινείς μηχανισμοί αύξησης της έκκρισης της GH την νύχτα δεν είναι γνωστοί. Μελέτες έδειξαν ότι δεν εξαρτάται από την ρυθμικότητα της κορτιζόλης (Goldenberg and Barkan 21

29 2007). Από την άλλη, η χορήγηση της GHRH ενισχύει την νυχτερινή απελευθέρωση της GH και προάγει τον SWS. Η σωματοστατίνη δεν αλλάζει την νυχτερινή απελευθέρωση της GH, δεν επηρεάζει την αναλογία του SWS, αλλά μπορεί να αυξήσει το στάδιο REM (ταχεία κίνηση των οφθαλμών) του ύπνου (Steiger et al. 1992). Έχει επίσης διαπιστωθεί ότι η γκρελίνη όταν χορηγείται εξωγενώς προάγει τον SWS εις βάρος του σταδίου REM, που συνοδεύεται από αύξηση της απελευθέρωσης της GH (Weikel et al. 2003) Έκκριση της GH βάσει ηλικίας Η δραστηριότητα του GH-IGF άξονα υφίσταται ποικίλες μεταβολές κατά την διάρκεια της ζωής. Η αυθόρμητη παλμική έκκριση της GH είναι παροδικά αυξημένη κατά την γέννηση αλλά μειώνεται σε σταθερά επίπεδα μέχρι την έναρξη της εφηβείας (Lanfranco et al. 2003). Η έκκριση της GH είναι μέγιστη κατά την διάρκεια της εφηβείας (Εικόνα 3-4). Η εφηβεία και οι στεροειδείς ορμόνες του φύλου ενισχύουν την έκκριση της GH με το να αυξάνουν τον μέγιστο ρυθμό της έκκρισης (μικρογραμμάρια/λίτρο/λεπτό) που πραγματώνεται εντός οποιουδήποτε εκλυτικού επεισοδίου, και όχι με το να επιμηκύνουν την διάρκεια του εκλυτικού επεισοδίου. Αρωματικά ανδρογόνα, όπως η τεστοστερόνη, ενισχύουν επίσης τον μέγιστο ρυθμό και την ποσότητα GH (μικρογραμμάρια/λίτρο) ανά εκλυτικό επεισόδιο (Veldhuis et al. 2001). Εικόνα 3-4. Πρότυπο της έκκρισης της GH κατά την διάρκεια της ζωής. Η ημερήσια μέση έκκριση είναι υψηλότερη στην παιδική ηλικία, φθάνοντας την κορυφή στην εφηβεία ενώ πέφτει σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις στην ενήλικο ζωή. Με την έναρξη της πρώιμης έως μέσης ενήλικου ζωής, η παραγωγή της GH υπολογίζεται ότι μειώνεται με έναν ρυθμό περίπου 14% κάθε δεκαετία. Έχει αποδειχθεί ότι το ποσό των κυμάτων του βαθέως ύπνου μειώνεται περίπου 80% από την πρώιμη (16-25 χρονών) έως την μέση ενήλικο ζωή (30-50 χρονών), με συνακόλουθη 75% μείωση της αυθόρμητης έκκρισης της GH. Έχει 22

30 επίσης δειχθεί ότι η 24 ωρών συνολική συγκέντρωση της GH στα ηλικιωμένα άτομα είναι χαμηλότερη σε σχέση με τους νεαρούς ενήλικες και όμοια με τους ασθενείς με οργανική ανεπάρκεια GH. Ο όρος σωματόπαυση υποδεικνύει τον σύνδεσμο μεταξύ της σχετιζόμενης με την ηλικία μείωσης των επιπέδων της GH και του IGF-1 και των αλλαγών στη σύνθεση του σώματος, στον μεταβολισμό και στις δομικές λειτουργίες κατά την γήρανση (Lanfranco et al. 2003). Μεταβολές στον νευροορμονικό και νευροδιαβιβαστικό έλεγχο της GH, σχετιζόμενες με την ηλικία, έχουν ευκρινώς διαπιστωθεί. Το καλά αναγνωριζόμενο φαινόμενο της σωματόπαυσης, μπορεί, κατά μεγάλο μέρος, να οφείλεται στην εξαρτώμενη από την ηλικία μείωση της έκκρισης της GHRH. Τα επίπεδα της GHRH είναι υψηλά στα νεογέννητα και σταδιακά μειώνονται μέχρι την εφηβεία. Η δραματική αύξηση των επιπέδων της GHRH στο πλάσμα κατά την διάρκεια της εφηβείας δηλώνει τον ρόλο αυτό του πεπτιδίου στην αναπτυξιακή δυναμική της εφηβείας. Με την πρόοδο της ηλικίας υπάρχει περαιτέρω μείωση των επιπέδων της GHRH. Βλάβη στον υποδοχέα της GHRH ή στην μετάδοση σήματος μετά την πρόσδεση στον υποδοχέα έχει επίσης αναφερθεί. Παράλληλα, έχει διαπιστωθεί απόλυτη ή σχετική υπερδραστηριότητα των νευρώνων σωματοστατίνης του υποθαλάμου κατά την διάρκεια της ζωής που μπορεί να οδηγεί και σε ενδοϋποθαλαμική καταστολή των GHRH-εκκριτικών νευρώνων (Russell-Aulet et al. 1999; Lanfranco et al. 2003). 3.3 Υποφυσιοτρόπες ορμόνες - Κύριοι ρυθμιστές έκκρισης της GH Εκλυτική ορμόνη της αυξητικής ορμόνης (GHRH) Ιστική κατανομή της GHRH Η GHRH εμφανίζεται στον υποθάλαμο του ανθρώπου μεταξύ της 18 ης και 22 ης εβδομάδας της κύησης. Στα μέσα της κύησης, τα εμβρυικά σωματοτρόπα κύτταρα αρχίζουν in vitro να αποκρίνονται στην GHRH αυξάνοντας την έκκριση της GH (Muller et al. 1999). Τα κυτταρικά σώματα που περιέχουν GHRH προέρχονται κυρίως από τον τοξοειδή πυρήνα (ARC). Άξονες από τους GHRH νευρώνες προβάλλουν στην μέση προεξοχή και καταλήγουν σε 23

31 τριχοειδή της πυλαίας κυκλοφορίας. Επίσης νευρώνες της GHRH έχουν βρεθεί στον διάμεσο κοιλιακό πυρήνα και σε εξωυποθαλαμικές δομές. Ωστόσο αυτοί οι νευρώνες δεν προβάλλουν στην μέση προεξοχή αλλά σε άλλες υποθαλαμικές και εξωυποθαλαμικές περιοχές (Petersenn and Schulte 2000). Η εκτεταμένη εξωυποθαλαμική κατανομή των GHRH νευρώνων στο κεντρικό νευρικό σύστημα προτείνει ότι, επιπρόσθετα της ρύθμισης της απελευθέρωσης της GH, η GHRH ίσως έχει και νευρορυθμιστικό ρόλο. Πράγματι κάποιες μελέτες έχουν δείξει ότι η GHRH προάγει τον ύπνο σε ζώα και σε ανθρώπους μάρτυρες. Άλλες μελέτες δείχνουν ότι η έγχυση της GHRH διεγείρει την πρόσληψη τροφής στους επίμυς και στα πρόβατα (Lin-Su and Wajnrajch 2002). Επιπρόσθετα GHRH mrna ή ανοσοαντιδραστικότητα μπορεί να βρεθεί σε ιστούς εκτός του κεντρικού νευρικού συστήματος. Έχει βρεθεί στον πλακούντα, όπου μπορεί να λαμβάνει μέρος στην ρύθμιση της έκκρισης της GH κατά την διάρκεια της εμβρυικής περιόδου (Gonzalez-Crespo and Boronat 1991), καθώς επίσης και σε άλλους ιστούς, όπως όρχεις (Berry et al. 1992), ωοθήκες (Binder et al. 1996), πάγκρεας και γαστρεντερική οδό. (Bosman et al. 1984). Δομή της GHRH και του γονιδίου της Η ταυτοποίηση της GHRH αποτελεί μια εξαίρεση στον κανόνα, λόγω του ότι απομονώθηκε αρχικά και αλληλουχήθηκε από ανθρώπινο και όχι ζωικό ιστό (Mayo et al. 1983). Επίσης δεν απομονώθηκε από τον υποθάλαμο αλλά από όγκους παγκρεατικών νησιδίων (Guillemin et al. 1982; Rivier et al. 1982), παρέχοντας πηγή mrna για την δημιουργία βιβλιοθηκών από τις οποίες μπορούσαν να απομονωθούν cdna που κωδικοποιούν την ανθρώπινη πρόδρομη GHRH πρωτεΐνη (Gubler et al. 1983). H ανθρώπινη πρόδρομη GHRH πρωτεΐνη περιλαμβάνει 108 αμινοξέα (Lin-Su and Wajnrajch 2002) και το γονίδιο της είναι ένα μοναδικό αντίγραφο στο ανθρώπινο γονιδίωμα, που έχει χαρτογραφηθεί στην p12 ζώνη στο χρωμόσωμα 20. To γονίδιο αυτό περιλαμβάνει πέντε εξόνια που εκτείνονται περίπου 10 έως 18 Κb στο ανθρώπινο γενωμικό DNA (Mayo et al. 1985) (Εικόνα 3-5). Στον μυ, το γονίδιο χαρτογραφείται στο χρωμόσωμα 2 (Godfrey et al. 1993). 24

32 Το GHRH γονίδιο υφίσταται εναλλακτικό μάτισμα που μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα εναλλακτικά-παραγόμενα πεπτίδια, ενώ μπορεί να χρησιμοποιεί και εναλλακτικούς υποκινητές. Τόσο το εναλλακτικό μάτισμα όσο και η προτίμηση υποκινητή πραγματοποιούνται με τρόπο εξαρτώμενο από τους ιστούς: η έκφραση στον υποθάλαμο διαφέρει από αυτή του πλακούντα και των ορχικών δομών. Ανεπαρκής χαρακτηρισμός έχει γίνει για την 5 πλευρική περιοχή του GHRH γονιδίου. Η έκφραση του GHRH γονιδίου στoν υποθάλαμο επηρεάζεται από ποικιλία ενδοκρινών και φυσιολογικών ερεθισμάτων, όπως στεροειδείς ορμόνες, ορμόνες του φύλου και του θυροειδούς, την μεταβολική κατάσταση, το στάδιο της ηλικίας και τον ύπνο (Burbach 2002). Εικόνα 3-5. Δομή και μετάφραση της GHRH (Lin-Su and Wajnrajch 2002). Τα GHRH πεπτίδια προέρχονται από πρωτεολυτική επεξεργασία της πρόδρομης GHRH πρωτεΐνης, όπως συμβαίνει με τα περισσότερα μικρά πεπτίδια. Αρχικά από όγκους παγκρεατικών νησιδίων του ανθρώπου απομονώθηκαν GHRH πεπτίδια των 37, 40, και 44 αμινοξέων (Guillemin et al. 1982; Rivier et al. 1982). In vivo μελέτες αποδεικνύουν ότι τα πεπτίδια των 37, 40, και 44 αμινοξέων είναι ισοδύναμα στην διέγερση της έκκρισης της GH (Vance 1990). Ωστόσο, το αμινοτελικό άκρο του GHRH πεπτιδίου, που περιλαμβάνει τα κατάλοιπα 1 έως 29, είναι σε υψηλό βαθμό συντηρημένο μεταξύ όλων των ειδών και έχει παρόμοια δραστικότητα με το πλήρες μόριο για δέσμευση στον υποδοχέα (Campbell et al. 1991) και διέγερση της απελευθέρωσης της GH (Wehrenberg and Ling 1983). Επίσης έχει βρεθεί ότι το καρβοξυτελικό άκρο είναι σημαντικό στην ρύθμιση της δραστικότητας της GHRH (Muller et al. 1999). Μετέπειτα μελέτες οδήγησαν στην απομόνωση απευθείας των πεπτιδίων των 40 και 44 αμινοξέων και από τον υποθάλαμο του ανθρώπου. Πρέπει να σημειωθεί ότι η ώριμη κύρια μορφή των 44 αμινοξέων 25

33 έχει προσθήκη αμιδίου στο καρβοξυτελικό της άκρο σε αρκετά είδη, εκτός από τα τρωκτικά (Bohlen et al. 1983; Ling et al. 1984). Βάσει της ομολογίας στην πρωτοταγή αλληλουχία αμινοξέων, η GHRH αποτελεί μέλος της οικογένειας των νευροεκκριτικών πεπτιδικών ορμονών εγκεφάλου εντέρου. Άλλα μέλη αυτής της οικογένειας είναι η σεκρετίνη, το αγγειοδραστικό εντερικό πεπτίδιο (VIP), το γαστρικό ανασταλτικό πεπτίδιο (GIP), το πολυπεπτίδιο της υπόφυσης ενεργοποιούμενο μέσω αδενυλικής κυκλάσης (PACAP), η γλυκαγόνη, το όμοιο με την γλυκαγόνη πεπτίδιο 1 (GLP- 1) και η πεπτιδική ορμόνη ισολευκίνης/πεπτιδική ορμόνη μεθειονίνης (PHUPHM) (Campbell and Scanes 1992; DeAlmeida and Mayo 2001). Ιστική κατανομή και δομή του υποδοχέα της GHRH (GHRHR) Όπως ακριβώς η GHRH ανήκει στην οικογένεια των πεπτιδίων εγκεφάλουεντέρου, ο GHRHR εμφανίζει επίσης ομοιότητα με την ανάλογη οικογένεια υποδοχέων, δηλαδή τους υποδοχείς που συνδέονται με τις G πρωτεΐνες (G protein coupled receptors) της οικογένειας Β, ομάδας III (B-III). Σε αυτή την οικογένεια περιλαμβάνονται επιπλέον οι υποδοχείς σεκρετίνης, VIP, GIP, GLP- 1, γλυκαγόνης και PACAP. Όλοι αυτοί οι υποδοχείς συνίσταται από μια αμινοτελική εξωκυττάρια περιοχή, εφτά υδρόφοβες διαμεμβρανικές έλικες και μια καρβοξυτελική ενδοκυττάρια περιοχή. Ο GHRHR αρχικά μεταφράζεται ως μια πρωτεΐνη 423 αμινοξέων κατά την επεξεργασία της οποίας το αμινοτελικό πεπτίδιο σήματος 22 αμινοξέων διασπάται. Η αμινοτελική εξωκυττάρια περιοχή 108 αμινοξέων περιλαμβάνει μια θέση γλυκοζυλίωσης. Η καρβοξυτελική ενδοκυττάρια ουρά 43 αμινοξέων περιλαμβάνει πολλαπλές πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης και θεωρείται ότι αλληλεπιδρά με την Gαs πρωτεΐνη (Gaylinn 1999). Παρά το γεγονός ότι η αμινοτελική εξωκυττάρια περιοχή είναι απαραίτητη για την δέσμευση του μορίου-προσδέτη, ωστόσο, μελέτες με χιμαιρικές πρωτεΐνες έδειξαν ότι η ειδικότητα της δέσμευσης παρέχεται από τις διαμεμβρανικές περιοχές και τις αντίστοιχες εξωκυττάριες συνδετικές αγκύλες (DeAlmeida and Mayo 1998). Εξάλειψη της εξωκυττάριας περιοχής βλάπτει όχι μόνο την δέσμευση με την ορμόνη αλλά και την μεταφορά του υποδοχέα στην κυτταρική επιφάνεια (Alba and Salvatori 2004a). 26