ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ Μελέτη γονιδίων που εµπλέκονται σε µηχανισµούς νευροεκφύλισης στο γενετικό µοντέλο ντοπαµινεργικής απονεύρωσης µυός weaver και σε λεµφοκύτταρα παρκινσονικών ασθενών ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ. ΣΠΑΘΗΣ Μάρτιος 2007

2 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΤΗΣ ΙΑΤΡΙΒΗΣ...1 THESIS ABSTRACT...5 ΜΕΡΟΣ Α : ΕΙΣΑΓΩΓΗ Κεφάλαιο 1 ο : ΝΟΣΟΣ ΤΟΥ ΠΑΡΚΙΝΣΟΝ Α1.1) Εισαγωγή Επιδηµιολογία...10 Α1.2) Παθοφυσιολογία της ΝΠ στα βασικά γάγγλια Α1.2.1) Οι κύριοι νευροδιαβιβαστές των βασικών γαγγλίων Α Ντοπαµίνη Α ) γ-αµινοβουτυρικό οξύ (GABA)...13 Α ) Γλουταµικό οξύ...15 Α1.2.2 Τα Βασικά Γάγγλια...17 Α Ανατοµική οργάνωση των βασικών γαγγλίων Α Νεοραβδωτό σώµα...17 Α Ωχρά σφαίρα...17 Α Υποθαλάµιος πυρήνας...19 Α Μέλαινα ουσία και οργάνωση του ντοπαµινεργικού συστήµατος του µεσεγκεφάλου...19 Α Λειτουργική οργάνωση του κυκλώµατος των βασικών Γαγγλίων...21 Α1.2.3 Παθολογία της ΝΠ Α Παθολογία της µελαινοραβδωτής οδού στη ΝΠ...22 Α Παθοφυσιολογία των βασικών γαγγλίων στη ΝΠ Α Σωµάτια / ενδρίτες Lewy..23 Α Μη ντοπαµινεργική παθολογία της ΝΠ...24 Α Στάδια της ΝΠ...25 Α1.3 Συµπτωµατολογία της ΝΠ Α1.3.1 Πρωτογενή Συµπτώµατα...27 Α1.3.2 Μη κινητικά Συµπτώµατα...28 Α Όσφρηση..28 Α Όραση..28 Α ιαταραχές του ύπνου 29

3 Α Κατάθλιψη.29 Α Ψύχωση.29 Α1.3.3 Πρώιµα Συµπτώµατα Προκλινική περίοδος...30 Α1.4 ιάγνωση της ΝΠ.31 Α1.5 Παθογένεια της ΝΠ Α1.5.1 Αιτιολογία της ΝΠ...34 Α Ιδιοπαθής ΝΠ...34 Α Κληρονοµική ΝΠ.35 Α α-συνουκλεΐνη.35 Α Parkin...36 Α UCH-L1 (Ubiquitin C-terminal Hydrolase-L1)...36 Α PINK1 (PTEN- induced putative kinase-1)...36 Α DJ Α1.5.2 Μοντελοποίηση της ΝΠ 37 Α Γενετικά µοντέλα της ΝΠ...38 Α Τοξικά µοντέλα της ΝΠ...39 Α OHDA..39 Α MPTP..39 Α1.5.3 Μοριακή Παθογένεια της ΝΠ..41 Α Οξειδωτικό stress.41 Α Μιτοχονδριακή δυσλειτουργία...42 Α Ανώµαλη διαµόρφωση και συσσώρευση πρωτεϊνών..42 Κεφάλαιο 2 ο : ΜΟΝΤΕΛΟ WEAVER.45 Α2.1 Ιστοανατοµικές αλλαγές στο ΚΝΣ του µοντέλου weaver Α2.1.1 Μεσεγκέφαλος.45 Α2.1.2 Ραβδωτό σώµα.48 Α2.2 Νευροχηµικές µεταβολές στο ΚΝΣ των weaver µυών...50 Α2.3 Η µετάλλαξη weaver 52 Κεφάλαιο 3 ο : ΤΑ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΑ ΩΣ ΙΧΝΗΘΕΤΗΣ ΤΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΤΗΣ ΝΠ Α3.1 Η ανάγκη εύρεσης βιοδεικτών της ΝΠ...59 Α3.2 Η νευρωνική απεικόνιση ως βιοµάρτυρας της ΝΠ...60 Α3.3 Τα λεµφοκύτταρα ως ιχνηθέτης της παθολογίας του ΚΝΣ 61 Α3.3.1 Νόσος του Alzheimer...62

4 Α3.3.2 Σχιζοφρένεια 64 Α3.3.3 Νόσος του Πάρκινσον..66 Κεφάλαιο 4 0 : ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΟΙΧΙΕΣ DNA Α4.1 Η βιολογία στη µετα-γονιδιωµατική εποχή..71 Α4.2 Τεχνολογία Μικροσυστοιχιών (Microarrays)...73 Α4.2.1 Μικροσυστοιχίες cdna (cdna arrays). 74 Α4.2.2 Ολιγονουκλεοτιδικές µικροσυστοιχίες (Affymetrix) Α4.3 Data Analysis Α4.3.1 Κανονικοποίηση 76 Α4.3.2 Πολυπαραµετρική Στατιστική Ανάλυση...77 Α Ιεραρχική Οµαδοποίηση 78 Α Permutation t-test...79 Α Significant Analysis of Microarrays (SAM).80 Α ) Principal Component Analysis (PCA Ανάλυση κυρίων συνιστωσών).81 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΙΑΤΡΒΗΣ...84 ΜΕΡΟΣ Β : ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Β1) Βιολογικά είγµατα Β1.1) Μύες...89 Β1.1.1) Αποµόνωση εγκεφαλικών περιοχών µυών...89 Β1.2) Ανθρώπινα δείγµατα...89 Β1.2.1) Προετοιµασία δειγµάτων αίµατος...90 Β2) Προσδιορισµός γενοτύπου µυών ως προς τη µετάλλαξη weaver...91 Β2.1) Αποµόνωση DNA από ιστό µυός...91 Β2.2) Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR)...92 Β2.3) Ηλεκτροφόρηση DNA σε πήκτωµα αγαρόζης...93 Β3) Προσδιορισµός του φύλου σε νεογέννητους weaver µύς...93 Β4) Αποµόνωση RNA...95 Β4.1) Καθαρισµός του RNA...95 Β4.2) Ποιοτικός έλεγχος του RNA Β4.2.1) Καθαρότητα και ποσοτικοποίηση...96 Β4.2.2) Ποιοτικός έλεγχος του ολικού RNA µε Bioanalyzer...96 Β4.2.3) Ποσοτικοποίηση του ολικού RNA µε τη µέθοδο Ribogreen...98 Β5) Προετοιµασία των δειγµάτων του ολικού RNA για την υβριδοποίηση στις

5 Μικροσυστοιχίες...99 Β5.1) Σύνθεση c DNA...99 Β5.2) Καθαρισµός του δίκλωνου cdna Β5.3) Σύνθεση crna Β5.4) Καθαρισµός του crna Β5.5) Test 3 Arrays Β6) Υβριδοποίηση στις µικροσυστοιχές και σάρωση Β7) Πολυπαραµετρική Ανάλυση των Αποτελεσµάτων των Μικροσυστοιχιών Β8) Real-Time PCR (QPCR) ΜΕΡΟΣ Γ : ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γ1) Προσδιορισµός γονιδίων που ενέχονται στην έναρξη της µελαινοραβδωτής εκφύλισης στους weaver µύες Γ1.1) Ανάλυση του µεταγραφικού προφίλ του µεσεγκεφάλου των µυών weaver µε µικροσυστοιχίες DNA πλήρους γονιδιώµατος Γ1.2) Μελέτη του προτύπου έκφρασης γονιδίων που προσδιορίστηκαν στις µικροσυστοιχίες να διαφοροποιούνται στο µεσεγκέφαλο των µυών weaver µε Real-Time PCR Γ1.3) Σύνοψη των αποτελεσµάτων ανάλυσης του µεταγραφικού προφίλ του µεσεγκεφάλου των µυών weaver και αξιολόγηση της πειραµατικής προσέγγισης Γ2) Ανίχνευση µοριακών δεικτών σε λεµφοκύτταρα στη ΝΠ Γ2.1) Ανάλυση του µεταγραφικού προφίλ των λεµφοκυττάρων ασθενών της ΝΠ µε µικροσυστοιχίες DNA πλήρους γονιδιώµατος Γ2.2) Σύνοψη των αποτελεσµάτων ανάλυσης του µεταγραφικού προφίλ των λεµφοκυττάρων παρκινσονικών ασθενών ΜΕΡΟΣ : ΣΥΖΗΤΗΣΗ 1) Προσδιορισµός γονιδίων που χαρακτηρίζουν το µεσγκέφαλο των µυών weaver κατά την έναρξη της µελαινοραβδωτής νευροεκφύλισης ) Προσδιορισµός γονιδίων που µεταβάλλουν το µεταγραφικό τους προφίλ στα λεµφοκύτταρα ασθενών της ΝΠ ΜΕΡΟΣ ΣΤ : ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...164

6 ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΤΗΣ ΙΑΤΡΙΒΗΣ Η νόσος του Πάρκινσον (ΝΠ) είναι η δεύτερη πιο συχνά εµφανιζόµενη νευροεκφυλιστική νόσος του ΚΝΣ και επηρεάζει το 1%-2% του γηράσκοντα πληθυσµού. Η κύρια ιστοπαθολογία της νόσου χαρακτηρίζεται από την προοδευτική εκφύλιση των ντοπαµινεργικών κυττάρων της µέλαινας ουσίας, γεγονός που οδηγεί στην εµφάνιση των πρωτογενών συµπτωµάτων της νόσου τα οποία σχετίζονται µε κινητικές δυσλειτουργίες. Τα συµπτώµατα της νόσου, στα οποία στηρίζεται η διάγνωσή της, εµφανίζονται αφού ένας σηµαντικός αριθµός ντοπαµινεργικών νευρώνων έχει ήδη εκφυλιστεί. Επιπρόσθετα, τα συµπτώµατα αυτά δεν είναι ειδικά για τη ΝΠ, θέτοντας τη διάγνωσή της ειδικά στα πρώτα στάδια εκδήλωσής της σχετικά επισφαλή. Η αιτιολογία της νόσου παραµένει άγνωστη έως σήµερα. Η ΝΠ θεωρείται ένα πολυπαραγοντικό σύνδροµο, οι µηχανισµοί παθογένειας της οποίας είναι ακόµα αδιευκρίνιστοι, καθώς τα πρώτα στάδια εξέλιξής της, στα οποία η όποια θεραπεία αναµένεται να είναι πιο αποτελεσµατική, δε γίνονται αντιληπτά και κατά συνέπεια δεν µπορούν να µελετηθούν άµεσα στον άνθρωπο. Η παρούσα ερευνητική εργασία είχε 2 σκοπούς: 1) τη µελέτη της παθογένειας της εκφύλισης της µελαινοραβδωτής οδού και 2) την ανίχνευση του παθολογικού φαινοτύπου της ΝΠ σε περιφερειακό ιστό. 1) Στα πλαίσια της πρώτης κατεύθυνσης µελετήθηκε ο µεταλλαγµένος µυς weaver, που αντιπροσωπεύει ένα µοναδικό γενετικό µοντέλο προοδευτικής εκφύλισης της µελαινοραβδωτής οδού. Ο ιστοπαθολογικός του φαινότυπος στηρίζεται σε µια σηµειακή µετάλλαξη στο γονίδιο girk2 που κωδικοποιεί µια υποµονάδα των GIRK καναλιών. Αν και η µετάλλαξη αυτή βρέθηκε να µη συσχετίζεται µε την εµφάνιση της ΝΠ στον άνθρωπο, ανάλογοι υποπληθυσµοί ντοπαµινεργικών κυττάρων εκφυλίζονται και χαρακτηρίζουν την παθολογία του µοντέλου όσο και της νόσου. Σηµαντικό πλεονέκτηµα του µοντέλου weaver επίσης είναι ότι η έναρξη της νευροεκφυλιστικής διαδικασίας είναι γνωστή και άρα µπορεί να µελετηθεί. Έχοντας ως βάση τα προηγούµενα, κύριος στόχος της ερευνητικής αυτής προσέγγισης ήταν ο προσδιορισµός υποψήφιων γονιδίων που ενέχονται στην έναρξη της ντοπαµινεργικής εκφύλισης στο µοντέλο weaver. Για το σκοπό αυτό εξετάστηκε το µεταγραφικό 1

7 προφίλ ολόκληρου του γονιδιώµατος της ευρύτερης θιγόµενης περιοχής του µεσεγκεφάλου weaver και φυσιολογικών µυών χρησιµοποιώντας µικροσυστοιχίες DNA πλήρους γονιδιώµατος µυός. Επιλέχτηκαν µύες 7 ηµερών, ηλικίας που βρίσκεται ακριβώς πριν την έναρξη της εκφυλιστικής διαδικασίας. Τα αποτελέσµατα που παρήχθησαν περιλαµβάνουν ένα σχετικά µικρό αριθµό γονιδίων που σηµειώνουν περιορισµένη αλλά σηµαντική αλλαγή των επιπέδων έκφρασης τους στους weaver µύες. Τα γονίδια αυτά διακρίνονται µε βάση την λειτουργία τους σε 4 κατηγορίες που αφορούν στη φυσιολογία της σύναψης ή τη νευροδιαβίβαση, τη µεταγωγή σήµατος, την ενεργοποίηση της µεταγραφής και τη µεταφορά. Αν και εξετάστηκε η ευρύτερη περιοχή του µεσεγκεφάλου που παράλληλα µε τη µέλαινα ουσία περιλαµβάνει και µη θιγόµενες ντοπαµινεργικές ή µη περιοχές και επιφέρει σηµαντική αραίωση στα αποτελέσµατα των γονιδίων που εµπλέκονται στην εκφύλιση της µελαινοραβδωτής οδού, οι λειτουργίες αυτές έχουν βρεθεί ότι επηρεάζονται στη ΝΠ και στο νευροτοξικό µοντέλο MPTP σε µύες, ακόµα και σε πρώιµα στάδια νευροεκφύλισης. Μάλιστα, είναι η πρώτη φορά που µία τέτοια προσπάθεια προσδιορισµού των µοριακών µηχανισµών παθογένειας του ντοπαµινεργικού θανάτου πραγµατοποιείται σε τόσο πρώιµο στάδιο, πριν ουσιαστικά η εκφύλιση αρχίσει να παρατηρείται. Μεταξύ των γονιδίων των οποίων το µεταγραφικό προφίλ βρέθηκε να χαρακτηρίζει ειδικά τη µεσεγκεφαλική περιοχή των µυών weaver, επιλεχτήκαν να πιστοποιηθούν περαιτέρω µε QPCR σε µια νέα οµάδα ζώων της ίδιας ηλικίας συγκεκριµένα γονίδια µε γνώµονα τη λειτουργία τους και το ποσοστό της αλλαγής των επιπέδων έκφρασής τους στα µεταλλαγµένα ζώα. Τα γονίδια που πιστοποιήθηκαν ότι αλλάζουν το προφίλ της έκφρασής τους στο µεσεγκέφαλο των weaver µυών περιλαµβάνουν το supt16h, το lasp1, το dlgh4 και ένα καινούργιο µετάγραφο του nurr1. Το supt16h κωδικοποιεί τη µεγάλη υποµονάδα του συµπλόκου FACT, το οποίο είναι σύµπλοκο αναδιαµόρφωσης της χρωµατίνης και παίζει σηµαντικό ρόλο στη διεκπεραίωση της µεταγραφικής διαδικασίας. Η µείωση της έκφρασης του supt16h στο µεσεγκέγαλο των µυών weaver είναι πιθανό να σηµατοδοτεί ένα γενικότερο µηχανισµό µείωσης της µεταγραφικής δραστηριότητας στην περιοχή. Το nurr1 είναι ένα πρώιµο γονίδιο µε καλά χαρακτηρισµένη λειτουργία στην ανάπτυξη και διατήρηση των ντοπαµινεργικών νευρώνων, ενώ µεταλλάξεις του έχουν εµπλακεί στην παθογένεια της ΝΠ. Αλλαγές στο προφίλ έκφρασης του ίσως σηµατοδοτούν ένα αντισταθµιστικό µηχανισµό που ενεργοποιείται στη θιγόµενη περιοχή στα πρώιµα 2

8 στάδια εκφύλισης ή εµπλέκονται στους µοριακούς µηχανισµούς παθογένειας της νευροεκφύλισης. Το lasp1 και το dlgh4 παρατηρήθηκαν να µειώνουν τα επίπεδα της έκφρασής τους στο µοντέλο weaver. Πρόκειται για 2 γονίδια που κωδικοποιούν 2 συναπτικές πρωτεΐνες µε πολύ σηµαντικό ρόλο στη νευροδιαβίβαση και την απόκριση του µετασυναπτικού νευρώνα. Η µείωση των επιπέδων των πρωτεϊνών αυτών στο µοντέλο weaver µπορεί να οδηγήσει σε δυσλειτουργία της σηµατοδότησης στη σύναψη ή της απόκρισης του µετασυναπτικού κυττάρου σε µηχανισµούς που τροποποιούν τη συναπτική φυσιολογία. Επιπρόσθετα, η µείωση των επιπέδων των συναπτικών αυτών πρωτεϊνών θα µπορούσε να επιφέρει αλλαγές στην αρχιτεκτονική της σύναψης, οι οποίες είναι αναµενόµενο να έχουν αντίκτυπο και στο προσυναπτικό άκρο. Συνοψίζοντας, τόσο η µεταβολή της µεταγραφικής δραστηριότητας όσο και η απώλεια ή η διαταραχή της συναπτικής λειτουργίας όπως ανιχνεύονται από τον προσδιορισµό των γονιδίων που διαφοροποιούν το µεταφραφικό τους προφίλ ειδικά στο µεσεγκέφαλο των weaver µυών, υπαινίσσονται διαδικασίες που ενεργοποιούνται στην ευρύτερη περιοχή πριν η εκφύλιση των ντοπαµινεργικών νευρώνων αρχίσει να παρατηρείται. Η περαιτέρω ιστολογική ανάλυση της έκφρασης των γονιδίων αυτών στο µεσεγκέφαλο των weaver µυών, ίσως σηµατοδοτεί µια νέα µοριακή κατεύθυνση στη διερεύνηση της έναρξης της εκφυλιστικής διαδικασίας στα ντοπαµινεργικά κύτταρα. 2) Ο δεύτερος σκοπός αυτής της διατριβής ήταν η προσπάθεια ανίχνευσης του µοριακού αποτυπώµατος της ΝΠ σε περιφερειακό ιστό. Προς την κατεύθυνση αυτή χρησιµοποιήθηκαν περιφερειακά λεµφοκύτταρα αίµατος επειδή είναι ένας εύκολα προσβάσιµος ιστός, στον οποίο η έκφραση υποδοχέων νευροδιαβιβαστών έχει προταθεί ότι µπορεί να αντικατοπτρίζει την κατάσταση των οµόλογων υποδοχέων του εγκεφάλου, ενώ ειδικά σε σχέση µε τη ΝΠ, έχει δειχθεί ότι εκφράζουν φυσιολογικά υποδοχείς ντοπαµίνης οι οποίοι υπερεκφράζονται στη νόσο, ενώ το περιεχόµενο της ντοπαµίνης και η ανοσοαπόκριση της υδροξυλάσης της τυροσίνης µειώνονται στα πρώιµα στάδια της νόσου. Τα στοιχεία αυτά ενισχύουν το ρόλο των λεµφοκυττάρων ως περιφερικό δείκτη της δυσλειτουργίας του ΚΝΣ στη ΝΠ. Για τη µελέτη του µεταγραφικού προφίλ των λεµφοκυττάρων ασθενών της ΝΠ χρησιµοποιήθηκαν πρωτοδιαγνωσµένοι ασθενείς που δεν είχαν λάβει καµία θεραπεία. Πραγµατοποιήθηκε υψηλής κλίµακας ανάλυση της γονιδιακής τους έκφρασης µε 3

9 µικροσυστοιχίες DNA πλήρους γονιδιώµατος ανθρώπου. Από τη σύγκριση των παρκινσονικών ασθενών µε φυσιολογικά άτοµα ιδίου φύλου και κατά το δυνατόν αντίστοιχης ηλικίας, η κατηγοριοποίηση όλων των δειγµάτων της έρευνας µε βάση το µεταγραφικό προφίλ όλων των γονιδίων τους έδειξε ότι τα παρκινσονικά άτοµα διαχωρίζονται µεν, δε διαφέρουν όµως πάρα πολύ από τα φυσιολογικά. Επιπρόσθετα, από την ανάλυση των αποτελεσµάτων της γονιδιακής έκφρασης σε όλα τα δείγµατα προέκυψε ότι η ηλικία, τουλάχιστον οι µεγάλες διακυµάνσεις της, παίζει πιο δραστικό ρόλο στον καθορισµό του µεταγραφικού προφίλ των λεµφοκυττάρων από ότι η νόσος ή το φύλο. Η οµαδοποίηση των δειγµάτων µε βάση το πρότυπο της γονιδιακής τους έκφρασης έδειξε ότι τα φυσιολογικά άτοµα κατηγοριοποιούνται µαζί σε µία οµάδα παρότι είναι διαφορετικού φύλου. Αντίθετα, το σύνολο των παρκινσονικών ασθενών που χρησιµοποιήθηκαν είναι πιο ετερογενές, γεγονός που υποδεικνύει ότι πέρα από τον κλινικό φαινότυπο των ασθενών και το στάδιο της νόσου, υπάρχουν άλλοι παράγοντες της νόσου που ρυθµίζουν το µεταγραφικό προφίλ των λεµφοκυττάρων. Λαµβάνοντας υπόψη αυτήν την ποικιλοµορφία των παρκινσονικών ασθενών καθώς και το ρόλο της ηλικίας στην εξαγωγή των αποτελεσµάτων, παράλληλα µε την κύρια σύγκριση µεταξύ όλων των φυσιολογικών και όλων των παρκινσονικών ατόµων, δοκιµάστηκε µία ακόµη σύγκριση µεταξύ µόνο των παρκινσονικών και υγιών εκείνων ατόµων που πέρα από το χαρακτηρισµό τους διαχωρίζονται µεταξύ τους και από το προφίλ της γονιδιακής τους έκφρασης µε βάση τα αποτελέσµατα της κατηγοριοποίησης. Τα γονίδια που προέκυψαν από τις συγκρίσεις αυτές να µεταβάλλουν τα επίπεδα έκφρασης τους στα λεµφοκύτταρα των παρκινσονικών ασθενών αφορούν σε λειτουργίες που αντιστοιχούν στη βιοσύνθεση των πρωτεϊνών και τη µεταγραφή, τη µεταφορά, τη µεταγωγή σήµατος και το µεταβολισµό. Οι λειτουργίες αυτές είτε αφορούν σε µηχανισµούς που έχουν βρεθεί να διαταράσσονται στη µέλαινα ουσία της ΝΠ, ή αντιπροσωπεύουν µια περιφερική απόκριση στη νόσο, η παθολογία της οποίας επεκτείνεται έξω από τον εγκέφαλο. Ο προσδιορισµός συγκεκριµένων γονιδίων µεταξύ των αποτελεσµάτων που έχουν ήδη εµπλακεί στη ΝΠ ή παίζουν ρόλο στη φυσιολογία του εγκεφάλου, προσφέρει ένα βιολογικό υπόβαθρο στην προσπάθεια διερεύνησης του µοριακού αποτυπώµατος της ΝΠ στα λεµφοκύτταρα. 4

10 THESIS ABSTRACT Parkinson s disease (PD) is the second most common neurodegenerative disease of the CNS, affecting 1%-2% of the aging population. The main histopathology of the disease is characterized by the progressive degeneration of the dopaminergic neurons of the substantia nigra leading to primary symptoms that are correlated to motor abnormalities. The diagnosis of PD is possible only after its primary symptoms appear, when a severe degree of neurodegeneration has already occurred. Moreover, the symptoms are not specific for the disease, weakening the accuracy of its diagnosis, especially in its early stages. The etiology of the disease remains unknown. PD is considered to be a rather multifactorial syndrome, the pathogenic mechanisms of which have not yet been clarified, as the onset of the disease cannot be identified presymptomatically. The present thesis had two primary targets: 1) The study of the pathogenesis of the degeneration of the nigrostriatal pathway and 2) the detection of the pathological phenotype of PD in blood. 1) Towards the first direction, the mutant mouse weaver was studied, which represents a unique genetic model of progressive nigrostriatal neurodegeneration. Its pathophysiological phenotype lies on an autosomal missense mutation identified in the girk2 gene, which codes for a subunit of a G-protein-activated inwardly rectifying K + channel. Although this mutation was not correlated to PD in humans, similar subpopulations of dopaminergic neurons are affected and characterize the pathology of both PD and the weaver mouse model. In addition, a crucial advantage in weaver mice is that the onset of the progressive dopaminergic degeneration is known and thus, can be studied. Based on these facts, the first aim of this thesis was the identification of candidate genes involved in the initiation of the dopaminergic degeneration in weaver mice. In this context, the complete transcriptional profile of the affected midbrain area of weaver mice was investigated using mouse full-genome DNA microarrays. Seven days-old mice were selected for this study, a time point that is currently the last reported at which no neurodegeneration has yet occured in the weaver midbrain. 5

11 The results that were obtained include a relatively small number of genes that exhibit a limited but significant change in their expression levels. These genes are separated based on their function in four categories that concern the physiology of the synapse or neurotransmission, signal transduction, the regulation of transcription and transport. In the current experimental approach, the broader midbrain area of weaver mice was examined that besides the substantia nigra it includes other non affected dopaminergic or non dopaminergic areas, thus inducing quite a dilution to the genes identified to alter their expression significantly during the initiation of dopaminergic degeneration in weaver mice. However, the gene functions detected to be affected in this study have also been reported in PD and in the MPTP neurotoxical mouse model, even in the early stages of neurodegeneration. Notably, this is the first time such a study of the molecular pathogenic mechanisms of dopaminergic death is conducted so early in the neurodegenerative process, even before cell death begins to be observed. Among the genes whose transcriptional profile was found to specifically characterize the midbrain area of weaver mice, certain genes were selected to be validated by QPCR in a new group of weaver mice, based on their function and their ratio of differential gene expression in the mutant mice. The genes validated to alter their expression profile in the midbrain of weaver mice include supt16h, lasp1, dlgh4 and a predicted transcript variant of nurr1. Supt16h codes for the large subunit of the FACT complex, a chromatin remodeling complex playing an important role in transcription processing. The down regulation of Supt16h in the midbrain of weaver mice could imply a more generalized reduction of the transcriptional activity in the area. Nurr1 is an early gene playing an established role in the development and maintenance of dopaminergic neurons, whereas several mutations of the gene have been associated with PD. Changes in the expression level of Nurr1 might be observed either because of a compensative mechanism taking place in the early stages of dopaminergic degeneration, or alternatively due to the involvement of Nurr1 in the pathogenesis of the nigrostriatal neurodegeneration. Lasp1 and Dlgh4 were found to be downregulated in the midbrain of weaver mice. They code for two synaptic proteins that play a very important role in neurotransmission and post-synaptic response. The decrease of the expression levels of both genes in weaver mice could lead to signaling impairment in the synapse or to abnormalities in the post-synaptic response to stimuli affecting synaptic physiology. 6

12 Furthermore, the down-regulation of those two synaptic proteins could induce alterations in the architecture of the synapse that would be expected to affect the presynaptic neuron as well. In summary, both transcriptional activity change and synaptic function loss or impairment as they are detected through the identification of genes that specifically differentiate their transcriptional profile in the midbrain of weaver mice are potentially processes that are observed to take place in the midbrain before the initiation of the dopaminergic degeneration. Further histological analysis of the expression pattern of those genes in the midbrain of weaver mice could possibly indicate a new molecular direction towards understanding the triggering of dopaminergic cell death. 2) The second goal of the current thesis was the detection of the molecular fingerprint of PD in a peripheral tissue. In this direction, the peripheral blood lymphocytes (PBLs) were chosen to be used. PBLs are an easily accessible tissue, expressing several neurotransmitter receptors that are believed to reflect the function of their brain homologues. Especially in relation to PD, PBLs have been found to normally express dopamine receptors that are upregulated in the disease, while both their dopamine content and the immunoreactivity of tyrosine hydroxylase are reduced in the early stages of PD. Those findings enhance the consideration of PBLs as a putative peripheral marker of CNS impairment in PD. To investigate the transcriptional profile of the lymphocytes from PD patients, a high-throughput analysis of gene expression was carried out using whole genome human DNA microarrays. The PD patients that were used for this survey were all recently diagnosed to suffer from the disease and had received no treatment. The comparison of the transcriptome in lymphocytes between PD patients and age- and sex-matched healthy subjects identified that PD patients, in terms of their transcriptional profile in PBLs, are categorized separately from the healthy subjects, without however differing dramatically. Moreover, the analysis of gene expression among all samples pointed that age, at least its large variations, affects the transcriptional profile of lymphocytes more actively than sex or the disease itself. The clustering of samples according to their gene expression grouped all healthy subjects of advanced age together, regardless of their sex. On the contrary, the group of PD patients is more heterogeneous, a fact indicating that there might be other disease 7

13 factors that regulate the transcriptional profile of lymphocytes besides the general clinical phenotype of the disease. Taking into consideration the variability of PD patients, as well as the effect of age on the results obtained, besides the main general comparison between all PD patients and all healthy subjects, another comparison was tried between only those PD patients and healthy subjects that are grouped separately between them based on the clustering outcome. The genes identified to specifically change their expression levels in the lymphocytes of PD patients have functions regarding protein biosynthesis transcription, transport, signal transduction and metabolism. Those functions either reflect the mechanisms underlying the pathology of SN in PD, or represent a peripheral response to the disease, the pathology of which extends beyond the brain to the periphery. The correlation of some of the genes identified in this study to previous studies of PD or brain physiology offers a biological background towards understanding the putative molecular fingerprint of PD in lymphocytes. 8

14 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 9

15 ΜΕΡΟΣ Α : ΕΙΣΑΓΩΓΗ Κεφάλαιο 1 ο : ΝΟΣΟΣ ΤΟΥ ΠΑΡΚΙΝΣΟΝ Α1.1) Εισαγωγή Επιδηµιολογία Η νόσος του Πάρκινσον (ΝΠ) αποτελεί µία χρόνια και προοδευτική νευροεκφυλιστική νόσο του Κεντρικού Νευρικού Συστήµατος (ΚΝΣ) που αφορά κυρίως σε δυσλειτουργίες των κινήσεων του σώµατος. Περιγράφτηκε για πρώτη φορά το 1817 απο το James Parkinson [Parkinson, 1817]. Μετά τη νόσο του Alzheimer, είναι η δεύτερη πιο συχνά εµφανιζόµενη νευροεκφυλιστική ασθένεια. Συνήθως εµφανίζεται µετά την ηλικία των 55 ετών και απαντάται µε µεγάλες συχνότητες στο γηράσκοντα πληθυσµό: άνω του 1% σε ηλικίες άνω των 60 ετών, 2% σε ηλικίες άνω των 70 και 6% σε ηλικίες άνω των 90 ετών. Ωστόσο, στο 10-15% των περιπτώσεων, οι ασθενείς βρίσκονται σε ηλικία µικρότερη των 40 ετών και η νόσος χαρακτηρίζεται ως νόσος του Πάρκινσον πρώιµης έναρξης. Σήµερα στις ΗΠΑ, περισσότεροι από άνθρωποι πάσχουν, ενώ κάθε χρόνο διαγνώσκονται νέες περιπτώσεις. Συνολικά παγκοσµίως, οι ασθενείς της ΝΠ ξεπερνούν τα Τέλος, η νόσος φαίνεται να απαντάται µε µεγαλύτερη συχνότητα στους άντρες από ότι στις γυναίκες, ιδιαίτερα στις πιο προχωρηµένες ηλικίες [Van Den Eeden et al., 2003; Tanner and Aston, 2000]. Η ΝΠ χαρακτηρίζεται από τέσσερα πρωτογενή συµπτώµατα, τα οποία είναι τρόµος, βραδυκινησία, ακαµψία των άκρων και αστάθεια θέσης. Α1.2) Παθοφυσιολογία της ΝΠ στα βασικά γάγγλια Η χαρακτηριστική παθολογία της ΝΠ, στην οποία οφείλεται η εκδήλωση των πρωτογενών κινητικών συµπτωµάτων και πάνω στην οποία στηρίζεται η οριστική διάγνωση της νόσου, συνίσταται: α) Στην εκφύλιση των ντοπαµινεργικών νευρώνων που εντοπίζονται στη µέλαινα ουσία και 10

16 β) Στην παρουσία ενδονευρωνικών πρωτεϊνικών κυτταροπλασµατικών συσσωµάτων που καλούνται σωµάτια Lewy. Η µέλαινα ουσία αποτελεί έναν πυρήνα του κυκλώµατος των βασικών γαγγλίων το οποίο παίζει σηµαντικό ρόλο στη ρύθµιση της κινητικής δραστηριότητας του οργανισµού, καθώς επίσης και στη φυσιολογία διάφορων γνωστικών λειτουργιών. Η εκφύλιση της ντοπαµινεργικής µελαινοραβδωτής οδού στη ΝΠ έχει ως αποτέλεσµα τη διαταραχή της ισορροπίας στη λειτουργία του κυκλώµατος των βασικών γαγγλίων, γεγονός που οδηγεί στην εµφάνιση των κινητικών συµπτωµάτων της νόσου. Τα σωµατία Lewy, που αποτελούν κύριο ιστοπαθολογικό γνώρισµα της ΝΠ, δεν παρατηρούνται µόνο στα ντοπαµινεργικά κύτταρα της µέλαινας ουσίας, αλλά και σε διάφορες άλλες περιοχές του εγκεφάλου. Μάλιστα σε κάποιες από τις εγκεφαλικές αυτές περιοχές, η εµφάνισή τους προηγείται της µέλαινας ουσίας. Σύµφωνα µε τα προηγούµενα, στο υποκεφάλαιο αυτό (1.2) περιγράφονται τα χαρακτηριστικά της νευροδιαβίβασης των κύριων νευροδιαβιβαστών που συναντιούνται στα βασικά γάγγλια, η ανατοµική και λειτουργική οργάνωση των πυρήνων των βασικών γαγγλίων, η παθοφυσιολογία της µέλαινας ουσίας και του κυκλώµατος των βασικών γαγγλίων στη ΝΠ, καθώς και το ιστολογικό και χρονικό πρότυπο εµφάνισης των σωµατίων Lewy στη νόσο µε βάση το οποίο προτείνεται η διάκριση της παθολογίας της νόσου σε στάδια. Α1.2.1 Οι κύριοι νευροδιαβιβαστές των βασικών γαγγλίων Α Ντοπαµίνη Η ντοπαµίνη αναγνωρίστηκε ως νευροδιαβιβαστής για πρώτη φορά από τον Carlsson (1959). Μαζί µε την αδρεναλίνη και τη νοραδρεναλίνη, ανήκει στην οικογένεια των κατεχολαµινών, οι οποίες περιέχουν ένα βενζολικό δακτύλιο µε 2 υδροξυλικές υποκαταστάσεις και µια αµινοµάδα. Συντίθεται από το αµινοξύ τυροσίνη, το οποίο µετατρέπεται µε την βοήθεια του ενζύµου υδροξυλάσης της τυροσίνης σε L-δινδροξυφαινυλαλαµίνη (L-DOPA), το οποίο εν συνεχεία αποκαρβοξυλιώνεται από την αποκαρβοξυλάση της L-DOPA σε ντοπαµίνη. Η κυτταροπλασµατική ντοπαµίνη συσκευάζεται σε κυστίδια από το µεταφορέα µονοαµινών των κυστιδίων (vesicle monoamine transporter ) και έτσι αποτρέπεται ο καταβολισµός της. Μόλις ο ντοπαµινεργικός νευρώνας ενεργοποιηθεί, 11

17 πραγµατοποιείται εξωκύττωση κατά την οποία τα κυστίδια, που έχουν τη ντοπαµίνη, συγχωνεύονται µε την πλασµατική µεµβράνη και την απελευθερώνουν έτσι στη συναπτική περιοχή για να εκδηλώσει τη δράση της. Η αποµάκρυνση της ντοπαµίνης από τη σύναψη προκειµένου να τερµατιστεί η δράση της επιτελείται από το µεταφορέα της ντοπαµίνης (DAT). Πρόκειται για µια διαµεµβρανική πρωτεΐνη 12 διαµεµβρανικών περιοχών που φέρει το αµινοτελικό του άκρο εξωκυτταρικά και το καρβοξυτελικό του άκρο ενδοκυτταρικά και εδράζεται στο προσυναπτικό τµήµα των ντοπαµινεργικών νευρώνων. Η επαναπρόσληψη της ντοπαµίνης από το DAT προϋποθέτει την παράλληλη είσοδο ιόντων Να + και έξοδο ιόντων Cl - σε αναλογία 1:2 για κάθε µόριο ντοπαµίνης που µεταφέρεται [Chen and Reith, 2000]. Η λειτουργία του DAT είναι ιδιαίτερα σηµαντική για τη ρύθµιση της δράσης της ντοπαµίνης (βλ. υποδοχείς ντοπαµίνης). Τα επίπεδα του DAT ρυθµίζονται ανάλογα µε τα επίπεδα της εξωκυττάριας συγκέντρωσης της ντοπαµίνης [Zanisher and Doolen, 2001]. Ο καταβολισµός της ντοπαµίνης γίνεται ενζυµικά από 2 ένζυµα, τη µονοάµινο-οξειδάση (MAO) και την Ο-µεθυλοτρανσφεράση των κατεχολαµινών (COMT). Η COMT εντοπίζεται τόσο ενδό όσο και εξωκυτταρικά και µεθυλιώνει µια υδροξυλοµάδα του βενζολικού δακτυλίου. Η MAO βρίσκεται στην εξωτερική µεµβράνη του µιτοχονδρίου και απαµινώνει το υπόστρωµα οδηγώντας σε αλδεϋδικά παράγωγα, τα οποία εν συνεχεία καταβολίζονται σε οξέα και αλκοόλες. Από τις δύο µορφές της MAO Α και Β η ΜΑΟ Β είναι αυτή που έχει τη µεγαλύτερη συγγένεια για τη ντοπαµίνη [Reiner, 1994] Η ντοπαµίνη ασκεί τη δράση της στους µετασυναπτικούς νευρώνες µέσω της δέσµευσής της στους µεµβρανικούς υποδοχείς της που βρίσκονται σε αυτούς. Οι υποδοχείς της ντοπαµίνης ανήκουν στην κατηγορία των µεταβοτροπικών υποδοχέων νευροδιαβιβαστών, η ενεργοποίηση των οποίων σχετίζεται µε την επαγωγή σήµατος που θα καθορίσουν τελικά τη φυσιολογική απόκριση του µετασυναπτικού νευρώνα. Η φύση των υποδοχέων αυτών καθορίζει και την αργή δράση της ντοπαµίνης, το αποτέλεσµα της οποίας εµφανίζεται αρκετά αργότερα και για µεγαλύτερο διάστηµα από το χρόνο δράσης της [Lee et al., 2005]. Οι υποδοχείς της ντοπαµίνης διακρίνονται λειτουργικά σε 2 µεγάλες κατηγορίες, τους υποδοχείς της οµάδας D1 και τους υποδοχείς της οµάδας D2. Οι υποδοχείς της οµάδας D1 περιλαµβάνει τους υποδοχείς D1 και D5 και εντοπίζονται, κατά κανόνα, µετασυναπτικά σε διάφορες περιοχές του εγκεφάλου, όπως το ραβδωτό σώµα, τον επικλινή πυρήνα, τη µέλαινα ουσία, την κοιλιακή καλύπτρα και τον εγκεφαλικό 12

18 φλοιό. Στις αξονικές απολήξεις των προβολών του ραβδωτού σώµατος στη µέλαινα ουσία, οι D1 υποδοχείς εντοπίζονται προσυναπτικά [Khan et al., 1998]. Οι υποδοχείς της οµάδας D2 εντοπίζονται µετασυναπτικά ή προσυναπτικά σε ντοπαµινεργικές συνάψεις στο ραβδωτό σώµα, τον επικλινή πυρήνα, τη µέλαινα ουσία, την κοιλιακή καλύπτρα και το φλοιό. Η ντοπαµίνη είναι γνωστό ότι έχει την ικανότητα να προκαλεί τόσο διεργετική όσο και ανασταλτική νευροδιαβίβαση. Η ιδιότητά της αυτή στηρίζεται στους διαφορετικούς µηχανισµούς µεταγωγής σήµατος µεταξύ των αποκρίσεων των 2 οµάδων υποδοχέων της ντοπαµίνης µετά από ενεργοποίησή τους. Συγκεκριµένα, οι D1 υποδοχείς συζεύγνυνται µε Gs πρωτεΐνες και κατά συνέπεια όταν ενεργοποιηθούν διεγείρουν την ενεργότητα της αδενυλίκης κυκλάσης, και αυξάνουν τα επίπεδα του κυκλικού AMP (camp) στο κύτταρο. Αντίθετα, οι D2 υποδοχείς συζεύγνυνται µε τις Gi πρωτεΐνες, αναστέλλουν την ενεργότητα της αδενυλικής κυκλάσης και µειώνουν τα επίπεδα του camp στο κύτταρο. Λαµβάνοντας υπόψη τις αντίθετες αυτές δράσεις, η ντοπαµίνη δεν µπορεί να χαρακτηριστεί ως ένα αµιγώς διεγερτικός ή ανασταλτικός νευροδιαβιβαστής, αλλά ως ένα ρυθµιστικό µόριο, η συµπεριφορά του οποίου εξαρτάται από το περιβάλλον στο οποίο δρά. Α γ-αµινοβουτυρικό οξύ (GABA) Το γ-αµινοβουτυρικό οξύ (GABA) αποτελεί τον κύριο ανασταλτικό νευροδιαβιβαστή του ΚΝΣ. Συντίθεται προσυναπτικά από το γλουταµικό οξύ µε την βοήθεια του ενζύµου αποκαρβοξυλάση του γλουταµικού οξέος (glutamic and decarboxylase-gap) που απαντά σε 2 ισοµορφές, τη GAD 65 nm και τη GAD67. Οι δύο αυτές ισοµορφές είναι προΐόντα διαφορετικών γονιδίων και ανάλογα µε τον ιστό επικρατεί η µια ή η άλλη µορφή. Εναλλακτική πηγή σύνθεσης του GABA µπορεί να είναι η L-γλουταµίνη µέσω απαµίνωσής της, καθώς και η σπερµίνη, η σπερµιδίνη και η ρυιθίνη που παράγουν GABA µέσω αντιδράσεων απαµίνωσης και αποκαρβοξυλίωσης [Tillakavatne et al., 1995]. To GABA καταβολίζεται ενδοκυτταρικά ή στη συναπτική σχισµή από το ένζυµο GABA transaminase (GABA- T) προς το προϊόν sussinic semi-aldehyde, το οποίο στη συνέχεια µετατρέπεται ή σε succinic acid µε τη βοήθεια του ενζύµου succinic semialdehyde dehydrogenase ή σε γ-υδροξυβουτυρικό οξύ µε τη βοήθεια του ενζύµου succinic semialaldehyde reductase [Wong et al., 2003]. 13

19 Η λειτουργικότητα των GABAεργικών συνάψεων καθορίζεται από τη δράση του GABA στους µετασυναπτικούς υποδοχείς του. Οι υποδοχείς του GABA διακρίνονται σε 2 κύριες κατηγορίες, τους GABA A και GABA B, ενώ µια τρίτη οµάδα υποδοχέων GABA C έχει αναγνωριστεί κυρίως στον αµφιβληστροειδή χιτώνα, που εµφανίζουν όµως µεγάλη οµοιότητα δοµικά και φαρµακολογικά µε τους GABA A υποδοχείς. Ο υποδοχέας GABA A ανήκει στους ιονοτροπικούς υποδοχείς και είναι ένα κανάλι χλωρίου η λειτουργία του οποίου καθορίζεται από τη δέσµευση προσδετών στις ειδικές θέσεις που περιλαµβάνει. Είναι υπεύθυνος για την άµεση ανασταλτική νευροδιαβίβαση που επιτελείται από το GABA. Εκτός από το GABA, ο υποδοχέας GABA A περιέχει και άλλες θέσεις δέσµευσης για αγωνιστές και διάφορους αλλοστερικούς νευροτροποποιητές, όπως βενζοδιαζεπίνες και βαρβιτουρικά, καθένας από τους οποίους επηρεάζει διαφορετικά την κινητική του υποδοχέα [Sieghart, 1992]. Ο GABA A υποδοχέας είναι ένα ετεροπενταµερές σύµπλοκο διαφορετικών πρωτεΐνικών υποµονάδων, οι οποίες κατηγοριοποιούνται σε 7 οικογένειες καθεµία από τις οποίες περιλαµβάνει 1 ή περισσότερα µέλη (α1-β, β1-4, γ1-3,δ,ε,π,ρ1-2). Ο συνδυασµός των υποµονάδων αυτών σε µια πενταµερή δοµή οδηγεί σε διαφορετικούς τύπους του υποδοχέα. Ο πλήρως λειτουργικός ωστόσο υποδοχέας προϋποθέτει την παρουσία της α, της β, και της γ υποµονάδας. Η διαφορετική σύσταση του υποδοχέα καθορίζει όχι µόνο τη λειτουργία του, αλλά και την ικανότητα τροποποίησής του από φαρµακολογικές ουσίες [Smith et al., 2001]. Η ενεργοποίηση του υποδοχέα GABA A στους νευρώνες του ενήλικα εγκεφάλου οδηγεί σε µια αλλαγή της διαµόρφωσης του υποδοχέα που επιτρέπει την εισροή στο κύτταρο ιόντων Cl -. Υπό αυτήν την έννοια, η µεµβράνη του κυττάρου υπερπολώνεται, γεγονός που αναστέλλει την εκφόρτιση του νευρώνα. Οι GABA B υποδοχείς είναι µεταβοτροπικοί υποδοχείς και η λειτουργεία του επιτελείται µέσω της σύζευξής τους µε G πρωτεΐνες. Πρόκειται για ετεροδιµερή 2 πρωτεϊνικών υποµονάδων, των GABA B1 και GABA B2. Οι υποµονάδες αυτές είναι προϊόντα 2 γονιδίων που παρουσιάζουν 35% οµολογία µεταξύ τους και έχουν το καθένα εναλλακτικά µετάγραφα, οδηγώντας στην ύπαρξη ισοµορφών GABA B1a-f και GABA B2a-c αντίστοιχα [Billintan et al., 2001]. Κάθε υποµονάδα είναι µια διαµεµβρανική πρωτεΐνη 7 διαµεµβρανικών περιοχών, το αµινοτελικό άκρο της οποίας βρίσκεται στον εξωκυττάριο χώρο και το καρβοξυτελικό στο κυτταρόπλασµα. Η δέσµευση του GABA στους GABA B υποδοχείς οδηγεί στην ενεργοποίηση G πρωτεϊνών (α,β,γ) οι οποίες ενεργοποιούν µε τη σειρά τους δευτερογενώς κάποιο 14

20 ενδοκυττάριο σύστηµα απόκρισης [Bowery and Enna, 2000]. Οι GABA B υποδοχείς εντοπίζονται τόσο µετασυναπτικά, όσο και προσυναπτικά. Στο µετασυναπτικό νευρώνα, οι GABA B υποδοχείς είναι υπέυθυνοι για το αργό και µακροχρόνιο ανασταλτικό δυναµικό, ενώ στο προσυναπτικό άκρο η ενεργοποίηση των υποδοχέων αυτών αναστέλλει τα κανάλια ασβεστίου και κατά συνέπεια την απελευθέρωση του νευροδιαβιβαστή [Lanthorn and Gotman, 1981]. Α Γλουταµικό οξύ Το γλουταµικό οξύ αποτελεί τον κύριο διεγερτικό νευροδιαβιβαστή του εγκεφάλου. Η ποικίλη δράση του οφείλεται στη δέσµευσή του µε τους διαφόρους υποδοχείς του, οι οποίοι παίζουν σηµαντικό ρόλο στην πλαστικότητα των συνάψεων, τη µνήµη και τη µάθηση, ενώ εµπλέκονται επίσης στη νευροτοξικότητα και τη νευροεκφύλιση. ιακρίνονται σε 2 µεγάλες οµάδες: τους ιονοτροπικούς και τους µεταβοτροπικούς υποδοχείς. Οι ιονοτροπικοί υποδοχείς, µε βάση τη διαφορετική σύσταση µιας συγγένειας που παρουσιάζουν για ειδικούς αγωνιστές και ανταγωνιστές, διακρίνονται στους NMDA υποδοχείς, τους AMPA υποδοχείς και τους υποδοχείς του καϊνικού οξέος. Επειδή οι NMDA υποδοχείς είναι και οι πιο καλά µελετηµένοι, συχνή είναι και η διάρκεια των ιονοτροπικών υποδοχέων του γλουταµικού οξέος σε NMDA και µη NMDA. Οι µεταβοτροπικοί υποδοχείς, µε βάση τις φαρµακολογικές τους ιδιότητες και τους µηχανισµούς µεταγωγής σήµατος µε τους οποίους συνδέονται, διακρίνονται σε 3 οµάδες, τους m GluRs της οµάδας Ι, της οµάδας ΙΙ και της οµάδας ΙΙΙ. Οι NMDA (N-methyl-D-aspartate) υποδοχείς συγκροτούνται από 8 εναλλακτικά µετάγραφα (α-h) της υποµονάδας NMDAR1 και 4 διαφοερτικές υποµονάδες, της NR2A, NR2B, NR2C, NR2D. Οι υποδοχείς είναι πενταµερείς και προκειµένου να διασφαλιστεί η λειτουργικότητα του χρειάζεται τις υποµονάδες NRI και NR2A, η στοιχειοµετρία του ωστόσο παραµένει µη διευκρυνίσµενη. Οι NMDA υποδοχείς περιλαµβάνουν µια θέση δέσµευσης του γλουταµικού οξέος, µια θέση συνενεργοποιητή που δεσµεύει γλυκίνη, και µια θέση δέσµευσης ιόντων Mg 2+, η δέσµευση του οποίου εξαρτάται από το δυναµικό της µεµβράνης. Σε δυναµικά πιο αρνητικά από -20 ή -30 mv, το Mg 2+ δεσµεύονται στον υποδοχέα και µπλοκάρουν την είσοδο του Ca 2+ µέσω του οποίου επιτελείται η απόκριση του υποδοχέα στο νευροδιαβιβαστή. Κατά συνέπεια, η ενεργοποίηση του υποδοχέα 15

21 προϋποθέτει τη µερική εκπόλωση της µεµβράνης έτσι ώστε να αποµακρυνθεί το Mg 2+ από τη θέση δέσµευσής του στον υποδοχέα. Η γλουταµίνη ενισχύει σηµαντικά τη δράση των αγωνιστών των NMDA υποδοχέων [Palmada and Centelles, 1998]. Οι AMPA (alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4 isoxazole propionate) υποδοχείς αποτελούνται από τις υποµονάδες GluR5-7 και KA1-2. Η ενεργοποίηση των υποδοχέων αυτών είναι µη-εξαρτώµενη από το δυναµικό της µεµβράνης και οδηγούν στην αύξηση της ροής Ca 2+ στο κύτταρο. Οι µη NMDA υποδοχείς αυτοί του γλουταµικού οξέος θεωρούνται υπεύθυνοι για την άµεση γλουταµινεργική νευροδιαβίβαση [Smith et al., 2001]. Οι µεταβοτροπικοί υποδοχείς της οµάδας Ι αποτελούνται από τις υποµονάδες mglur1 που περιλαµβάνει 4 εναλλακτικά µετάγραφα και τις mglur5 που περιλαµβάνει 2 ισοµορφές. Εντοπίζονται κυρίως µετασυναπτικά, η απόκρισή τους σχετίζεται µε το µονοπάτι της φωσφορικής ινοσιτόλης και οδηγεί σε ενεργή πόλωση των νευρώνων. Ωστόσο, οι υποδοχείς αυτοί έχει βρεθεί ότι εντοπίζονται και προσυναπτικά [Conn and Pin, 1997]. Οι µεταβοτροπικοί υποδοχείς της οµάδας ΙΙ και ΙΙΙ αποτελούνται από τις υποµονάδες mglur2, mglur3 και mglur4, mglur6, mglur8 αντίστοιχα και αναστέλλουν την αδενυλική κυκλάση και την παραγωγή του κυκλικού AMP. Εντοπίζονται κυρίως προσυναπτικά και δρουν ως αυτό- ή έτερο-υποδοχείς τροποποιώντας την απελευθέρωση του γλουταµικού οξέος ή άλλων νευροδιαβιβαστών [Lartmell and Schoepp, 2000]. Τόσο οι ιονοτροπικοί όσο και οι µεταβοτροπικοί υποδοχείς του γλουταµικού οξέος εκφράζονται σε όλους τους πυρήνες των βασικών γαγγλίων [Smith et al., 2001]. Το γλουταµικό οξύ συντίθεται από τη γλουταµίνη στα νευρικά κύτταρα µε τη βοήθεια της γλουταµινάσης. Μετά την απελευθέρωσή του στη σύναψη, προκειµένου να τερµατιστεί η δράση του, µεταφέρεται στα αστρογλοιακά κύτταρα µε µεγαλύτερη συγγένεια από ότι στα νευρικά, όπου µε τη βοήθεια της συνθετάσης της γλουταµίνης (glutamine synthase) το γλουταµικό οξύ µεταβολίζεται σε γλουταµίνη που δεν έχει ενεργότητα νευροδιαβιβαστή και µπορεί να ξαναχρησιµοποιηθεί από τους νευρώνες για την επανασύνθεση του γλουταµικού οξέος [Polnada και Centelles, 1998]. 16

22 Α1.2.2 Τα Βασικά Γάγγλια Τα βασικά γάγγλια συνιστούν ένα σύνολο ετερόκλητων εγκεφαλικών δοµών οργανωµένων σε ένα λειτουργικό κύκλωµα, το οποίο παίζει σηµαντικό ρόλο στη ρύθµιση της εκτέλεσης της κίνησης. Η ρύθµιση της εκούσιας κίνησης επιτυγχάνεται µέσω της σωστής επεξεργασίας των σωµατοαισθητικών πληροφοριών στον εγκέφαλο, διαδικασία που επιτελείται απο τον εγκεφαλικό φλοιό, τον κινητικό θάλαµο και τα βασικά γάγγλια. Τα βασικά γάγγλια παρεµβάλλονται λειτουργικά µεταξύ του φλοιού και του θαλάµου, όπου επεξεργάζονται την πληροφορία που δέχονται απο το φλοιό και την επαναδιοχετεύουν στο φλοιό µέσω του θαλάµου. Με τον τρόπο αυτό, ασκούν σηµαντική ρυθµιστική δράση στην έναρξη της κίνησης, ενώ συµµετέχουν και σε µηχανισµούς επιδιόρθωσης των κινήσεων, ενισχύοντας την επιθυµητή και καταστέλλοντας την ανεπιθύµητη συµπεριφορά [Lawrence, 2000]. Ο ρόλος των βασικών γαγγλίων δεν περιορίζεται µόνο στη ρύθµιση της κινητικής συµπεριφοράς, αλλά εµπλέκεται και στη φυσιολογία συναισθηµατικών και γνωστικών λειτουργιών όπως η µνήµη και η µάθηση [Rolls, 1994]. Α Ανατοµική οργάνωση των βασικών γαγγλίων Τα βασικά γάγγλια εντοπίζονται στο βασικό τελεγκέφαλο και αποτελούνται από 4 υποφλοιϊκούς πυρήνες µε εκτεταµένες συνδέσεις µεταξύ τους. Πρόκειται για το νεοραβδωτό σώµα (neostriatum Str), την ωχρά σφαίρα που υποδιαιρείται στην έξω µοίρα (Globus Pallidus external Gpe) και την έσω µοίρα (Globus Pallidus internal), τον υποθαλάµιο πυρήνα (Subthalamic nucleus STN) και τη µέλαινα ουσία (SN) που περιλαµβάνει 2 κύριες υποδιαιρέσεις: τη συµπαγή µοίρα (Substantia Nigra pars compacta - SNpc) και τη δικτυωτή µοίρα (Substantia Nigra pars rericulata SNpr) που βρίκεται κοιλιακά της συµπαγούς µοίρας. Α Νεοραβδωτό σώµα Το νεοραβδωτό σώµα περιλαµβάνει τον κερκοφόρο πυρήνα (caudate nucleus) και το κέλυφος (putamen), που στα τρωκτικά εµφανίζεται ως µία ανατοµικά οµοιογενής δοµή. Το κέλυφος συνδέεται στο κοιλιακό του τµήµα µε το έσω τµήµα της κεφαλής του κερκοφόρου πυρήνα στο επίπεδο του επικλινούς πυρήνα. 17

23 Ο κύριος πληθυσµός νευρώνων του ραβδωτού σώµατος αποτελείται σε ποσοστό 95% από ακανθώδεις GABAεργικούς νευρώνες εξόδου (GABA: γ-αµινοβουτυρικό οξύ). Οι δενδρίτες των νευρώνων αυτών εµφανίζουν µεγάλη πυκνότητα τοπικών διογκώσεων / ακάνθων (spines) και δέχονται νεύρωση από παράπλευρους άξονες νευρώνων του ίδιου τύπου. Οι ακανθώδεις νευρώνες προβολής του ραβδωτού σώµατος δέχονται ντοπαµινεργική νεύρωση (βλ. Μέλαινα ουσία) και γλουταµινεργική νεύρωση από το φλοιό. ιακρίνονται σε 2 κατηγορίες: σε αυτούς που περιέχουν το νευροπεπτίδιο εγκεφαλίνη, εκφράζουν περισσότερο τους D2 υποδοχείς της ντοπαµίνης και προβάλλουν στη GPe, και σε αυτούς που περιέχουν τα νευροπεπτίδια δινορφίνη και ουσία P, εκφράζουν περισσότερο τους D1 υποδοχείς της ντοπαµίνης και προβάλλουν στη GPi και SNr. Εκτός από τους ακανθώδεις νευρώνες εξόδου, το ραβδωτό σώµα περιλαµβάνει και µη ακανθωτούς ενδονευρώνες. Αυτοί είναι GABAεργικοί, χολινεργικοί ή σωµατοστατινεργικοί. Οι GABAεργικοί ενδονευρώνες δέχονται νεύρωση απο το φλοιό, τη SNpc και το θάλαµο, ενώ συνάπτονται µε τους νευρώνες εξόδου και τους άλλους ενδονευρώνες του ραβδωτού σώµατος. Οι χολινεργικοί ενδονευρώνες συνάπτονται στους ακανθώδεις νευρώνες µε πρότυπο παρόµοιο εκείνου των ντοπαµινεργικών απολήξεων και δέχονται γλουταµινεργική είσοδο από το φλοιό. Οι σωµατοστατινεργικοί ενδονευρώνες δέχονται επίσης διεγερτική είσοδο από το φλοιό. Τέλος, έχει παρατηρηθεί ότι το ραβδωτό σώµα περιέχει και ντοπαµινεργικούς νευρώνες [Betarbet et al., 1997]. Το ραβδωτό σώµα µε βάση τη λειτουργική εξειδίκευση των υποπεριοχών του διακρίνεται στο κινητικό (motor) ραβδωτό στην πλευρική περιοχή του πυρήνα, στο συνειρµικό (associative) ραβδωτό στη µέση περιοχή του πυρήνα και το µεταιχµιακό (limbic) ραβδωτό, που αποτελείται από το κοιλιακό ραβδωτό και τον επικλινή πυρήνα. Επιπρόσθετα, µε βάση τη χρώση της ακετυλοχολινεστεράσης, το ραβδωτό σώµα διακρίνεται περαιτέρω σε ελαφρώς χρωσµένες περιοχές που ονοµάζονται ραβδοσώµατα (striosomes) και εντοπίζονται στο µέσο ισχυρότερα χρωσµένων περιοχών που αποτελούν το στρώµα (matrix). Το στρώµα του ραβδωτού σώµατος, που είναι περιοχή πλούσια σε καλβινδίνη, προβάλλει στη GPi και στη SNpr και δέχεται νεύρωση από το φλοιό, ενώ τα ραβδοσώµατα, που είναι περιοχές φτωχές σε καλβινδίνη, προβάλλουν στη SNpc και δέχονται νεύρωση από τον πρόσθιο µετωπιαίο φλοιό. 18

24 Α Ωχρά σφαίρα Η έσω µοίρα της ωχράς σφαίρας, που αντιστοιχεί στον ενδοσχινοειδή πυρήνα στα τρωκτικά, αποτελεί µαζί µε τη SNpr τις κύριες εξόδους του κυκλώµατος των βασικών γαγγλίων προς το θάλαµο. Αποτελείται από GABAεργικά κύτταρα, οι ίνες των οποίων προβάλλουν στον πρόσθιο κοιλιακό και τον πλευροκοιλιακό πυρήνα του θαλάµου. Οι νευρώνες της έσω µοίρας της ωχράς σφαίρας δέχονται τόσο GABAεργική νεύρωση από το ραβδωτό σώµα και την έξω µοίρα της ωχράς σφαίρας [Parent and Hazrati, 1995a], όσο και γλουταµινεργική νεύρωση κυρίως από τον υποθαλάµιο πυρήνα [Parent and Hazrati, 1995b]. Η ισορροπία µεταξύ αυτών των 2 νευροδιαβιβαστικών συστηµάτων µε αντίθετη δράση καθορίζει τη λειτουργική δραστηριότητα αυτού του πυρήνα. Τα κύτταρα της έξω µοίρας της ωχράς σφαίρας είναι κυρίως GABAεργικά και προβάλλουν στον υποθαλάµιο πυρήνα, στη SNpc, στη GPi, ενώ έχουν παρατηρηθεί GABAεργικές προβολές της έξω µοίρας της ωχράς σφαίρας και στη δικτυωτή µοίρα της µέλαινας ουσίας. Η GPe δέχεται GABAεργική νεύρωση από το ραβδωτό και γλουταµινεργική απο τον υποθαλάµιο πυρήνα [Parent and Hazrati, 1995b]. Επίσης φαίνεται ότι δέχεται ντοπαµινεργική νεύρωση από παράπλευρες ίνες της µελαινοραβδωτής οδού [Lindvall and Bjorklund, 1979; Cossette et al., 2000]. Α Υποθαλάµιος πυρήνας Ο υποθαλάµιος πυρήνας αποτελεί το µόνο γλουταµινεργικό πυρήνα του κυκλώµατος των βασικών γαγγλίων. Νευρώνει τις εξόδους των βασικών γαγγλίων τη SNpr και τη GPiκαθώς και τη GPe. Επιπρόσθετοι στόχοι των προβολών του υποθαλάµιου πυρήνα είναι το ραβδωτό σώµα και η SNpc. Οι νευρώνες του υποθαλάµιου πυρήνα δέχονται ανασταλτική GABAεργική νεύρωση από τη GPe. Επίσης λαµβάνει διεγερτική γλουταµινεργική είσοδο από περιοχές του κινητικού φλοιού [Fujimoto and Kita, 1993]. Τέλος, έχει περιγραφεί ότι ο υποθαλάµιος πυρήνας δέχεται και ντοπαµινεργική νεύρωση από τη SNpc [Hassani et al., 1997; Hedreen, 1999]. Α Μέλαινα ουσία και οργάνωση του ντοπαµινεργικού συστήµατος του µεσεγκεφάλου Η SNpc περιλαµβάνει τα σώµατα των ντοπαµινεργικών νευρώνων, που προβάλλουν στο ραβδωτό σώµα και σχηµατίζουν τη µελαινοραβδωτή οδό. Τα ντοπαµινεργικά κύτταρα της 19

25 SNpc εκτείνουν τους δενδρίτες τους στη SNpr. Η οργάνωση της SN περιλαµβάνει τη διάκρισή της σε κοιλιακό και ραχιαίο κέρας [Joel και Weiner, 2000], ενώ τµηµατοποιείται επίσης µε βάση το βαθµό παρουσίας της καλβινδίνης. Πιο συγκεκριµένα, οι πλούσιες σε καλβινδίνη περιοχές συνιστούν το στρώµα (matrix), µέσα στο οποίο εγκλείονται περιοχές φτωχές σε καλβινδίνη που καλούνται µελαινοσώµατα (nigrosomes) [Damier et al., 1999]. Η διάταξη αυτή είναι οµόλογη µε το πρότυπο οργάνωσης του ραβδωτού σώµατος σε στρώµα και ραβδοσώµατα [Holt et al., 1997]. Η µελαινοραβδωτή οδός αποτελεί τµήµα του γενικότερου ντοπαµινεργικού συστήµατος του µεσοτελεγκεφάλου, το οποίο περιλαµβάνει επίσης τη µεσοµεταιχµιακή και τη µεσοφλοιϊκή οδό. Εκτός από τη SNpc (A9 κατά Fuxe και Dahlstrome), τα σώµατα των ντοπαµινεργικών κυττάρων εντοπίζονται επίσης στην κοιλιακή καλύπτρα (Ventral Tegmental Area VTA / A10) και στον ερυθροειδή πυρήνα (Α8). Οι προβολές του ντοπαµινεργικού συστήµατος στις περιοχές που νευρώνει υπόκεινται σε µία υψηλού επιπέδου τοπογραφική οργάνωση. Πιο συγκεκριµένα, το πλευρικό τµήµα της SNpc νευρώνει το κινητικό ραβδωτό, τα πιο µεσαία τµήµατα της SNpc προβάλλουν στο συνειρµικό ραβδωτό σώµα σε συνδυασµό µε ντοπαµινεργικές ίνες από τη VTA, ενώ το µεταιχµιακό ραβδωτό νευρώνεται κυρίως από τη VTA και σε µικρό βαθµό από τη SNpc. Ο ερυθροειδής πυρήνας προβάλλει και στις 3 λειτουργικές υποδιαιρέσεις του ραβδωτού σώµατος. Τέλος, προβολές τόσο από το κοιλιακό όσο και από το ραχιαίο κέρας της SN καταλήγουν και στις 2 µοίρες της ωχράς σφαίρας [Prensa et al., 2000]. H SNpc δέχεται ανασταλτική GABAεργική νεύρωση από το ραβδωτό σώµα και την ωχρά σφαίρα. Μάλιστα, η νεύρωση της περιοχής από το ραβδωτό σώµα ακολουθεί επίσης ένα πρότυπο τοπογραφικής οργάνωσης. Συγκεκριµένα, το µεταιχµιακό ραβδωτό προβάλλει στη VTA και στο ραχιαίο τµήµα της SNpc, ενώ το κινητικό και συνειρµικό ραβδωτό προβάλλουν στο κοιλιακό τµήµα της SNpc, στα πλευρικά και µεσαία τµήµατά του αντίστοιχα. Η SNpc δέχεται επίσης γλουταµινεργική νεύρωση απο το µέσο προκινητικό φλοιό και τον υποθαλάµιο πυρήνα. Οι ντοπαµινεργικοί νευρώνες της µέλαινας ουσίας δέχονται επίσης σεροτονινεργικές προβολές από τους µεσαίους και ραχιαίους πυρήνες της ραφής [Hauber, 1998]. Η SNpr, που περιλαµβάνει GABAεργικούς νευρώνες, αποτελεί µαζί µε τη GPi την έξοδο του κυκλώµατος των βασικών γαγγλίων προς το θάλαµο, νευρώνοντας τον πλευροκοιλιακό και τον πρόσθιο κοιλιακό πυρήνα του. Οι νευρώνες της SNpr δέχονται ανασταλτική GABAεργική νεύρωση κυρίως από το ραβδωτό σώµα [Chevalier and Deniau, 1990], αλλά και απο την ωχρά σφαίρα [Smith et al., 1989] και από τον επικλινή πυρήνα 20

26 [Denieau et al., 1994]. Η SNpr δέχεται επίσης και γλουταµινεργική νεύρωση από τον υποθαλάµιο πυρήνα, η οποία µάλιστα είναι αποφασιστικής σηµασίας για τη ρύθµιση της δραστηριότητας της µέλαινας ουσίας, αφού έχει παρατηρηθεί ότι καταστροφή του υποθαλάµιου πυρήνα προκαλεί µείωση της ενεργότητας των συµπλόκων Ι, ΙΙ και ΙV της αναπνευστικής αλυσίδας των µιτοχονδρίων της SNpr και οδηγεί σε επακόλουθη µείωση της δραστηριότητας των κυττάρων της [Blandini και Greenamyre, 1995α; Blandini et al., 1995]. Α Λειτουργική οργάνωση του κυκλώµατος των βασικών γαγγλίων Ο ρόλος των βασικών γαγγλίων στη ρύθµιση της κίνησης καθορίζεται από την επικοινωνία τους µε τον εγκεφαλικό φλοιό. Συγκεκριµένα, τα βασικά γάγγλια επεξεργάζονται και τροποποιούν την πληροφορία που δέχονται από το φλοιό, για να την επαναδιοχετεύσουν και πάλι µέσω του θαλάµου στο φλοιό παίζοντας έτσι το ρυθµιστικό τους ρόλο στην εκτέλεση της κίνησης. Το ραβδωτό σώµα αποτελεί τη δοµή εισόδου στο κύκλωµα των βασικών γαγγλίων και δέχεται γλουταµινεργική διεγερτική νεύρωση από το φλοιό [Kemp και Powell, 1971]. Η GPi και η SNpr αποτελούν τις δοµές εξόδου των βασικών γαγγλίων προβάλλοντας ανασταλτικές GABAεργικές ίνες στο θάλαµο, από όπου γλουταµινεργικές διεγερτικές ίνες καταλήγουν τελικά στον κινητικό φλοιό. Σύµφωνα µε το µοντέλο λειτουργικής οργάνωσης των βασικών γαγγλίων, στο εσωτερικό του κυκλώµατος σχηµατίζονται 2 νευρωνικές οδοί µετάδοσης της πληροφορίας από το ραβδωτό σώµα προς τους πυρήνες εξόδου: η άµεση και η έµµεση. Οι 2 οδοί ξεκινούν από διαφορετικούς υποπληθυσµούς νευρώνων του ραβδωτού σώµατος και είναι λειτουργικά διαφορετικές. Συγκεκριµένα, στην άµεση οδό οι GABAεργικοί νευρώνες του ραβδωτού, που φέρουν D1 υποδοχείς ντοπαµίνης και περιέχουν τα νευροπεπτίδια δινορφίνη και ουσία P, προβάλλουν απευθείας στη GPi και στη SNpr. Στην έµµεση οδό, οι άλλοι GABAεργικοί νευρώνες του ραβδωτού που φέρουν D2 υποδοχείς ντοπαµίνης και περιέχουν το νευροπεπτίδιο εγκεφαλίνη προβάλλουν στη GPe, η οποία στέλνει ανασταλτικές GABAεργικές ίνες στον υποθαλάµιο πυρήνα. Ο υποθαλάµιος πυρήνας τέλος προβάλλει γλουταµινεργικές διεγερτικές ίνες στους πυρήνες εξόδου των βασικών γαγγλίων GPi και SNpr. Η ροή της πληροφορίας δια µέσω του κυκλώµατος των βασικών γαγγλίων ξεκινάει από την ενεργοποίηση των γλουταµινεργικών κυττάρων του φλοιού που προβάλλουν στο ραβδωτό σώµα και ενεργοποιούν τόσο την άµεση όσο και την έµµεση οδό. Η ενεργοποίηση 21