ΠΑΝΔΠΗΣΖΜΗΟ ΠΑΣΡΧΝ ΥΟΛΖ ΘΔΣΗΚΧΝ ΔΠΗΣΖΜΧΝ ΣΜΖΜΑ ΒΗΟΛΟΓΗΑ ΣΟΜΔΑ ΒΗΟΛΟΓΗΑ ΕΧΧΝ

Transcript

1 ΠΑΝΔΠΗΣΖΜΗΟ ΠΑΣΡΧΝ ΥΟΛΖ ΘΔΣΗΚΧΝ ΔΠΗΣΖΜΧΝ ΣΜΖΜΑ ΒΗΟΛΟΓΗΑ ΣΟΜΔΑ ΒΗΟΛΟΓΗΑ ΕΧΧΝ Ο ΠΡΟΣΑΣΔΤΣΗΚΟ ΡΟΛΟ ΣΟΤ ΔΛΖΝΗΟΤ ΔΝΑΝΣΗΑ ΣΖΝ ΔΠΑΓΧΓΖ ΟΞΔΗΓΧΣΗΚΟΤ STRESS Δ ΑΗΜΟΚΤΣΣΑΡΑ ΣΟΤ ΜΤΓΗΟΤ MYTILUS GALLOPROVINCIALIS (Lamarck, 1819) ΜΔΣΑ ΑΠΟ ΔΚΘΔΖ Δ ΤΓΡΑΡΓΤΡΟ. ΦΟΗΣΖΣΡΗΑ : ΒΗΚΣΧΡΗΑ ΥΑΣΕΖΑΡΓΤΡΗΟΤ Α.Μ. : 2685 ΔΠΗΒΛΔΠΧΝ ΚΑΘΖΓΖΣΖ: ΝΣΑΨΛΗΑΝΖ ΣΔΦΑΝΟ ΠΑΣΡΑ,

2 Επραξηζηίεο Θα ήζεια λα επραξηζηήζσ εηιηθξηλά ηνλ επηβιέπνληα θαζεγεηή κνπ θχξην ηέθαλν Νηατιηάλε γηα ηελ πνιχηηκε βνήζεηα θαη ηε ζηήξημή ηνπ ζε φιε ηε δηάξθεηα ηεο πεηξακαηηθήο δηαδηθαζίαο θαζψο θαη θαηά ηελ ζπγγξαθή απηήο ηεο εξγαζίαο. Δπίζεο, ζα ήζεια λα επραξηζηήζσ ηνπο γνλείο κνπ γηαηί ρσξίο ηε ζπκπαξάζηαζή ηνπο δε ζα κπνξνχζα λα είρα πξαγκαηνπνηήζεη ηηο ζπνπδέο κνπ θαη θαη επέθηαζε λα εθπνλήζσ απηήλ ηελ εξγαζία. Η εηθόλα ζην εμώθπιιν είλαη από ηελ ηζηνζειίδα 2

3 Πξόινγνο Ζ αηκφζθαηξα φζν θαη ην πδάηηλν πεξηβάιινλ δέρνληαη κία κεγάιε πνηθηιία ξππνγφλσλ νπζηψλ νη νπνίεο πξνέξρνληαη είηε απφ ηηο θπζηθέο δηαδηθαζίεο πνπ ιακβάλνπλ ρψξα ζην πεξηβάιινλ είηε απφ ηελ αλζξψπηλε δξαζηεξηφηεηα. Δηδηθφηεξα γηα ην πδάηηλν πεξηβάιινλ, ηα βαξέα κέηαιια ησλ νπνίσλ ε θπξηφηεξε πεγή πξνέιεπζεο είλαη ηα αζηηθά θαη βηνκεραληθά απφβιεηα, απνηεινχλ έλα ζεκαληηθφ πξφβιεκα. Tα ηειεπηαία ρξφληα έρνπλ γίλεη εθηεηακέλεο κειέηεο πνπ αθνξνχλ ηηο ηνμηθέο επηπηψζεηο ησλ βαξέσλ κεηάιισλ ηφζν ζε επίπεδν νξγαληζκψλ φζν θαη ζε επίπεδν θπηηάξσλ. Μεγάιν ελδηαθέξνλ παξνπζηάδεη ε δηεξεχλεζε ησλ ηνμηθψλ επηπηψζεσλ ηνπ πδξαξγχξνπ (Hg) ζε επίπεδν θπηηάξσλ, θαζψο θαίλεηαη λα ζπκβάιιεη ζηελ παξαγσγή ειεπζέξσλ ξηδψλ νη νπνίεο είλαη ππεχζπλεο γηα δηάθνξεο θπηηαξηθέο βιάβεο, φπσο ε επαγσγή νμεηδσηηθνχ stress θαη θπηηαξηθφ ζάλαην. Δηδηθφηεξα αλ ιάβνπκε ππφςε φηη πνιινί ζαιάζζηνη νξγαληζκνί πνπ δέρνληαη απηή ηελ επηβάξπλζε είλαη είδε κε ζεκαληηθή δηαηξνθηθή αμία γηα ηνλ άλζξσπν, νη κειέηεο ηεο ξχπαλζεο ηνπ ζαιάζζηνπ νηθνζπζηήκαηνο απνθηνχλ κεγαιχηεξε βαξχηεηα. Ζ παξνχζα δηπισκαηηθή εξγαζία πξαγκαηνπνηήζεθε ζην ηκήκα Βηνινγίαο ηεο ζρνιήο Θεηηθψλ Δπηζηεκψλ θαη πξαγκαηεχεηαη ηηο νμεηδσηηθέο επηπηψζεηο ηνπ πδξαξγχξνπ (Hg), ζε αηκνθχηηαξα ηνπ κπδηνχ Mytilus galloprovincialis. Σα αηκνθχηηαξα ησλ δίζπξσλ καιαθίσλ ρξεζηκνπνηνχληαη επξχηαηα γηα ηε κειέηε ησλ ηνμηθψλ επηπηψζεσλ ησλ βαξέσλ κεηάιισλ, ιφγσ ηεο επθνιίαο κε ηελ νπνία κπνξνχλ λα απνκνλσζνχλ. Παξαθάησ δίλνληαη πεξηιεπηηθά θάπνηεο πιεξνθνξίεο ζρεηηθά α) κε ην είδνο πνπ ρξεζηκνπνηήζεθε ζηε ζπγθεθξηκέλε κειέηε, β) ηηο θπξηφηεξεο θαηεγνξίεο ησλ βαξέσλ κεηάιισλ, κε έκθαζε ζηνλ πδξάξγπξν, γ) ηελ επαγσγή ησλ ηνμηθψλ επηπηψζεσλ ηνπ κεηάιινπ θαη δ) θαη ην ξφιν πνπ κπνξεί λα δηαδξακαηίζεη ην ζειήλην ζηελ πξνζηαζία ησλ θπηηάξσλ. 3

4 ΠΔΡΗΔΥΟΜΔΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ Ειςαγωγή Σν κεζνγεηαθφ κχδη (Μytilus galloprovincialis)-υαξαθηεξηζηηθά θαη εμάπισζε Σο είδοσ Μytilus galloprovincialis ωσ οργανιςμόσ βιοενδείκτησ τησ ρφπανςησ του περιβάλλοντοσ Ο ρόλοσ των αιμοκυττάρων ςε μελζτεσ των επιπτώςεων ρυπογόνων ουςιών Βαρζα μζταλλα και ρφπανςη Γενικά χαρακτθριςτικά των βαρζων μετάλλων Υδράργυροσ (Ηg) Σο ςελήνιο (Se) και η ςημαςία του ωσ ιχνοςτοιχείο Δραςτικζσ μορφζσ οξυγόνου (ROS) Σχθματιςμόσ ROS κατά τθ διαδικαςία τθσ φαγοκυττάρωςθσ Σουπεροξείδιο ι ανιόν του ςουπεροξειδίου (Ο 2 - ) Μονοξείδιο του αηώτου (ΝΟ ) κοπόσ τησ εργαςίασ ΤΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Χημικά και αντιδραςτήρια υλλογή και διατήρηςη μυδιϊν υλλογή αιμολζμφου Εφαρμογή τησ μεθόδου εκτίμηςησ τησ πρόςληψησ τησ χρωςτικήσ ουδζτερο ερυθρό (Neutral red uptake) ςε αιμοκφτταρα μυδιϊν, μετά από την ζκθεςή τουσ ςε διαφορετικζσ ςυγκεντρϊςεισ υδραργφρου, παρουςία ή απουςία ςεληνίου Προςδιοριςμόσ ςουπεροξειδικϊν ανιόντων (. O 2 - ) ςτα αιμοκφτταρα των μυδιϊν Παραγωγή ΝΟ ςτα αιμοκφτταρα των μυδιϊν Προςδιοριςμόσ πρωτεϊνϊν

5 2.8 τατιςτική ανάλυςη αποτελεςμάτων ΑΠΟΣΕΛΕΜΑΣΑ Εφαρμογή τησ Neutral red uptake ςε αιμοκφτταρα μυδιϊν, μετά από την ζκθεςή τουσ ςε διαφορετικζσ ςυγκεντρϊςεισ υδραργφρου, παρουςία ή απουςία ςεληνίου Προςδιοριςμόσ ςουπεροξειδικϊν ανιόντων (. O 2 - ) ςτα αιμοκφτταρα των μυδιϊν Παραγωγή ΝΟ ςτα αιμοκφτταρα των μυδιϊν μετά από ζκθεςή τουσ ςε Hg ΤΖΗΣΗΗ Πρόκληςη τοξικϊν φαινομζνων από τον υδράργυρο ςτα αιμοκφτταρα των μυδιϊν Μείωςη των τοξικϊν επιπτϊςεων του υδραργφρου ςτα αιμοκφτταρα παρουςία ςεληνίου Επίλογοσ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦIA... 40

6 ΠΔΡΗΛΖΦΖ Ζ ζπγθεθξηκέλε κειέηε δηεξεπλά ηνλ πξνζηαηεπηηθφ ξφιν πνπ κπνξεί λα δηαδξακαηίζεη ην ζειήλην (Se) απέλαληη ζηηο ηνμηθέο επηπηψζεηο ηνπ πδξαξγχξνπ (Hg) ζε αηκνθχηηαξα ηνπ κπδηνχ Mytilus galloprovincialis. χκθσλα κε ηα απνηειέζκαηα, ζε αηκνθχηηαξα πνπ εθηέζεθαλ γηα 1 h ζε δηαθνξεηηθέο ζπγθεληξψζεηο ρισξηνχρνπ πδξαξγχξνπ (HgCl 2 5, 10, 20, 50 θαη 100 κg/l) παξαηεξήζεθε ζεκαληηθή αχμεζε ηεο ζλεζηκφηεηάο ηνπο, κεηά απφ έθζεζε ζε ζπγθεληξψζεηο ηνπ κεηάιινπ κεγαιχηεξεο απφ 5 κg/l, ελψ ζεκαληηθή αχμεζε παξαηεξήζεθε ζηελ επαγσγή νμεηδσηηθνχ stress, φπσο πξνθχπηεη απφ ηε κέηξεζε ησλ παξαγφκελσλ αληφλησλ ζνππεξνμεηδίνπ (. O - 2 ) θαη ληηξηθψλ νμεηδίσλ (NO) πνπ κεηξήζεθαλ ζε αηκνθχηηαξα πνπ εθηέζεθαλ ζε ζπγθεληξψζεηο πνπ αληηπξνζσπεχνπλ ηελ έλαξμε ησλ ηνμηθψλ επηπηψζεσλ ηνπ κεηάιινπ (10 θαη 20 κg/l). Απφ ηελ άιιε πιεπξά, αηκνθχηηαξα πνπ πξν-επσάζηεθαλ κε 4 κg/l Se (κε ηε κνξθή Na 2 SeO 3 ) γηα 15 min, πξηλ ηελ έθζεζε ζηηο δηαθνξεηηθέο ζπγθεληξψζεηο ηνπ Hg, παξαηεξήζεθε ζεκαληηθή κείσζε ηφζν ηεο ζλεζηκφηεηαο, φζν θαη ηεο ζχλζεζεο. O - 2 θαη NO. Απφ ηα απνηειέζκαηα ηεο παξνχζαο κειέηεο κπνξνχκε λα ζπκπεξάλνπκε φηη ε βηνδηαζεζηκφηεηα ηνπ Se ζρεηίδεηαη κε ηελ ελίζρπζε ηεο αληηνμεηδσηηθήο άκπλαο ησλ θπηηάξσλ, πηζαλφ κέζσ ηεο ελεξγνπνίεζεο αληηνμεηδσηηθψλ ελδχκσλ, φπσο ε Se-εμαξηψκελε ππεξνμεηδάζε ηεο γινπηαζεηφλεο (Se-GPx), ζπκβάιινληαο νπζηαζηηθά ζηελ άκπλα ησλ θπηηάξσλ ελάληηα ζηελ Hg- εμαξηψκελε επαγσγή νμεηδσηηθνχ stress θαη θαη επέθηαζε ηελ πξφθιεζε θπηηαξηθψλ βιαβψλ.

7 Abstract This study investigated whether selenium (Se) could regulate mercury (Hg) ability to induce oxidative effects in haemocytes of mussel Mytilus galloprovincialis. Superoxide anions ( O - 2 ) and nitric oxide (NO) generation was measured in haemocytes of mussels exposed to different concentrations of mercury chloride (5-20 κg/l) either in the presence or in the absence of 4 κg/l of Se (as sodium selenite), (Se-free and Se-treated cells respectively). Hg at concentrations ranged within 10 or 20 κg/l, thus representing the onset of Hg toxic effects, as measured by neutral red retention assay, showed significantly high levels of both O - 2 and NO, while cells pretreated with Se (Se-treated cells) showed significant decrease Hg toxic effects in each case. The results of the present study showed that Se bioavailability within phagocytic cells, such as haemocytes, could promote a shift in the balance between oxidants and antioxidants in favor of antioxidants, possibly via activation of Se-dependent glutathione peroxidase (Se-GPx), thus reinforcing haemocytes immune system against toxic effects induced by pro-oxidants, such as Hg. 7

8 1. Δηζαγσγή 1.1 Σν κεζνγεηαθό κύδη (Μytilus galloprovincialis)-υαξαθηεξηζηηθά θαη εμάπισζε. Σν είδνο Μytilus galloprovincialis (κπιε κχδη ή κεζνγεηαθφ κχδη) έρεη επξεία εμάπισζε ζε φιε ηελ πδξφγεην, πξνζαξκνζκέλν ζε δηάθνξα πεξηβάιινληα θαη θπξίσο ζε πεξηνρέο κε κεγάια ιηκάληα. Σν γέλνο Μytilus πεξηιακβάλεη επηπιένλ ηα είδε M.edulis, M. trossulus, M. californianus (Δηθόλα 1). Δηθόλα 1. Δμάπισζε ηνπ είδνπο Mytilus galloprovincialis (πεγή: speciesidentification.org/images/obis_maps/m...). Σν είδνο απηφ (Βαζίιεην: Animalia, Φχιo: Mollusca, Kιάζε: Bivalvia, Τπφθιαζε: Pteriomorphia, Σάμε: Mytiloida, Οηθνγέλεηα: Mytilidae) αλήθεη ζηελ θαηεγνξία ησλ Γίζπξσλ Μαιαθίσλ, ηα νπνία είλαη εδξαίνη ζεξεπηέο, εμαξηψκελνη γηα ηελ πξφζιεςε ηξνθήο ηνπο απφ ξεχκαηα λεξνχ πνπ πξνθαινχλ νη βιεθαξίδεο ησλ βξαγρίσλ. Σα πεξηζζφηεξα Γίζπξα είλαη ζαιάζζηα αιιά πνιιά δνπλ ζε πθάικπξα θαη γιπθά λεξά. Όζνλ αθνξά ζηε κνξθνινγία ηνπο, είλαη πιεπξηθά πεπηεζκέλνη νξγαληζκνί θαη ηα δχν ηνπο φζηξαθα (ζπξίδεο) ζπγθξαηνχληαη κεηαμχ ηνπο κε έλαλ ειαζηηθφ ζχλδεζκν πνπ θάλεη ηηο ζπξίδεο λα αλνίγνπλ θνηιηαθά (Δηθόλα 2). 8

9 Δηθόλα 2. Σν είδνο Mytilus galloprovincialis κε ηηο ζπξίδεο ηνπ αλνηθηέο (εμσηεξηθή θαη εζσηεξηθή όςε (θσηνγξαθία Β. Χαηδεαξγπξίνπ). Σν είδνο Μytilus galloprovincialis ραξαθηεξίδεηαη απφ ζθνχξν κπιε ή θαθεηί, ζρεδφλ καχξν ρξψκα. Οη δχν ζχξεο είλαη ίζεο, κε ην κέξνο φπνπ ζπγθξαηνχληαη λα είλαη νμχιεθην, ελψ ην πάλσ κέξνο λα ζηξνγγπιεχεη, παξ φιν πνπ ην ζρήκα πνηθίιεη απφ πεξηνρή ζε πεξηνρή. Σξέθεηαη απφ έλα επξχ θάζκα πιαγθηνληθψλ νξγαληζκψλ, κέζσ ηεο δηήζεζεο ηνπ λεξνχ. Σα είδε ηνπ γέλνπο Μytilus κεηαθηλνχληαη ειάρηζηα, ζρεκαηίδνληαο κεγάινπο πιεζπζκνχο θαη δνπλ πξνζθνιιεκέλνη ζε ζηεξεφ ππφζηξσκα φπσο πέηξεο, βξάρηα θηι. Σα κχδηα είλαη ζεκαληηθά φρη κφλν γηα ηελ νηθνλνκηθή ηνπο αμία, αθνχ απνηεινχλ εδψδηκν είδνο, αιιά θαη απφ νηθνινγηθή ζθνπηά. Πην ζπγθεθξηκέλα νη πξνλχκθεο ησλ κπδηψλ απνηεινχλ ην θπξίαξρν θνκκάηη ηνπ δσνπιαγθηνχ θαη θηάλνπλ ηηο πξνλχκθεο αλά θπβηθφ κέηξν λεξνχ (Dailianis, 2010). Σα κχδηα είλαη νξγαληζκνί πξνζαξκνζκέλνη ζηνπο παιηξξνηαθνχο ξπζκνχο, κε δπλαηφηεηα ζπζζψξεπζεο ζηνπο ηζηνχο ηνπο πιεζψξαο ηνμηθψλ νπζηψλ, ζε ζπγθεληξψζεηο πςειφηεξεο απφ ηηο αληίζηνηρεο ηνπ ζαιαζζηλνχ λεξνχ. Ζ γλψζε ηεο θπζηνινγίαο θαη ηεο ζπκπεξηθνξάο ηνπο, ζε ζπλδπαζκφ κε θπηηαξνγελεηηθέο θαη βηνρεκηθέο κειέηεο, δίλεη ηε δπλαηφηεηα ζηνπο εξεπλεηέο λα πξνρσξήζνπλ ζε δηαπηζηψζεηο πνπ ζρεηίδνληαη κε ηελ θαηάζηαζε ηνπ ζαιάζζηνπ νηθνζπζηήκαηνο, θαζψο θαη ηηο επηπηψζεηο δηαθφξσλ νπζηψλ πνπ απνηεινχλ ξχπνπο ηνπ 9

10 πεξηβάιινληνο ζηνπο νξγαληζκνχο (Moore, 1985; Amiard θαη ζπλ., 1986; Cossa, 1989; Krishnakumar θαη ζπλ., 1994; Viarengo θαη ζπλ., 1997; Regoli, 1998; Lafontaine θαη ζπλ., 2000). 1.2 Σν είδνο Μytilus galloprovincialis σο νξγαληζκόο βηνελδείθηεο ηεο ξύπαλζεο ηνπ πεξηβάιινληνο. Σν είδνο απηφ ζεσξείηαη θαηάιιεινο νξγαληζκφο ζηε κειέηε δηαθφξσλ πεξηβαιινληηθψλ παξακέηξσλ θαζψο εκθαλίδεη παγθφζκηα εμάπισζε, πςειή αλαπαξαγσγηθή ηθαλφηεηα, είλαη αλζεθηηθφ ζε αζζέλεηεο, ελψ ην θφζηνο παξαγσγήο ηνπ είλαη κηθξφ. Έρεη ρξεζηκνπνηεζεί κε κεγάιε επηηπρία σο βηνινγηθφο δείθηεο ξχπαλζεο (bioindicator). Οη Βηνελδείθηεο είλαη νξγαληζκνί πνπ ρξεζηκνπνηνχληαη γηα ηελ παξαθνινχζεζε ηεο νηθνινγηθήο επηβάξπλζεο ζε ξππνγφλεο νπζίεο. Πξφθεηηαη γηα είδε ή νκάδεο εηδψλ, ησλ νπνίσλ ε δνκή, ε ιεηηνπξγία θαη ν πιεζπζκφο κπνξεί λα δηαηαξαρζνχλ ιφγσ πεξηβαιινληηθήο θαηαπφλεζεο (stress) πνπ κπνξεί λα πξνθιεζεί απφ αιιαγέο ηνπ πεξηβάιινληνο πνπ ζρεηίδνληαη κε ηε ξχπαλζε. Απηφ επηηπγράλεηαη κε ηελ κειέηε δηαθφξσλ ηζηνπαζνινγηθψλ θαη βηνρεκηθψλ παξακέηξσλ ηνπ νξγαληζκνχ πνπ κεηαβάιινληαη θάησ απφ ζπλζήθεο πίεζεο ή θαηαπφλεζεο (stress) πνπ αληηκεησπίδεη ν νξγαληζκφο ζην πεξηβάιινλ. Σα ραξαθηεξηζηηθά ησλ Γίζπξσλ Μαιαθίσλ θαη εηδηθφηεξα ησλ κπδηψλ πνπ ηα θαζηζηνχλ θαηάιιεινπο Βηνελδείθηεο ζπλνςίδνληαη ζηα παξαθάησ ζεκεία: Σα κχδηα απνηεινχλ θπξίαξρα θαη επξέσο εμαπισκέλα είδε ζε φιν ηνλ θφζκν. Λφγσ ηεο πξνζθφιιεζεο θαη παξακνλή ηνπο ζε ζπγθεθξηκέλα ζεκεία, απνηεινχλ αληηπξνζσπεπηηθνύο νξγαληζκνύο, πάλσ ζηνπο νπνίνπο έρνπλ αληίθηππν νη θπζηθνρεκηθέο θαη πεξηβαιινληηθέο παξάκεηξνη ηεο εθάζηνηε πεξηνρήο. Παξνπζηάδνπλ κεγάιε αληνρή ζε πνιινχο πεξηβαιινληηθνχο ξχπνπο. Ζ ηθαλφηεηά ηνπο λα θηιηξάξνπλ ηεξάζηηεο πνζφηεηεο λεξνχ ηα θαζηζηνχλ απνδέθηεο κεγάισλ πνζνηήησλ ξππνγόλσλ νπζηώλ. Ο πξνζδηνξηζκφο ηνπο κπνξεί λα δψζεη κηα ζαθή εηθφλα ηεο ξχπαλζεο ζηελ επξχηεξε πεξηνρή. πγθξηηηθά κε ηνπο ηρζχεο θαη ηα θαξθηλνεηδή, ηα δίζπξα καιάθηα έρνπλ ρακειό επίπεδν ελδπκηθήο δξαζηηθόηεηαο ησλ ζπζηεκάησλ πνπ κπνξνύλ λα κεηαβνιίδνπλ ξππνγόλεο νπζίεο (π.ρ., αξσκαηηθνί πδξνγνλάλζξαθεο, PCBs). Οη ζπγθεληξψζεηο ησλ ξππνγφλσλ νπζηψλ ζηνπο ηζηνχο αληηπξνζσπεχνπλ ζε κεγαιχηεξν βαζκφ ηελ ξχπαλζε ηνπ πεξηβάιινληνο. 10

11 Ζ κέηξεζε ησλ αλφξγαλσλ θαη νξγαληθψλ νπζηψλ ζηνπο ηζηνχο ησλ δίζπξσλ καιαθίσλ παξέρεη πιεξνθνξίεο ζρεηηθά κε ηελ βηνινγηθή δηαζεζηκφηεηά ηνπο, δεδνκέλα πνπ δελ είλαη πάληα πξνθαλή, φηαλ νη κεηξήζεηο γίλνληαη ζην λεξφ θαη εηδηθφηεξα ζηα αησξνχκελα ζσκαηίδηα ή ζηα ηδήκαηα. Οη πιεζπζκνί ησλ κπδηψλ είλαη ζηαζεξνί κε απνηέιεζκα λα ππάξρεη ε δπλαηόηεηα επαλαιακβαλόκελσλ δεηγκαηνιεςηώλ θαη καθξνρξόληαο παξαθνινύζεζεο ηνπ πδάηηλνπ πεξηβάιινληνο. Τπάξρεη ε δπλαηόηεηα κεηαθνξάο θαη δηαηήξεζεο πιεζπζκώλ ζε πεξηνρέο ειέγρνπ ηελ πδάηηλεο ξύπαλζεο. Απνηεινχλ δηαηξνθηθή πεγή ηνπ αλζξώπνπ, γεγνλφο πνπ θαζηζηά επηηαθηηθή ηελ αλάγθε ειέγρνπ, ηφζν ηνπ πδάηηλνπ ρψξνπ θαιιηέξγεηαο, φζν θαη ηεο καθξνρξφληαο θαηάζηαζεο ηεο πεξηνρήο θαιιηέξγεηαο. Σα κχδηα ζπληζηνχλ εδψδηκα είδε παγθνζκίσο θαη ππάξρνπλ ζηνηρεία ρεκηθήο ή κηθξνβηαθήο ξχπαλζεο απφ ηηο Γεκφζηεο ππεξεζίεο πνπ ιακβάλνληαη ππφςε θαη γηα ζέκαηα Γεκφζηαο πγείαο Ο ξόινο ησλ αηκνθπηηάξσλ ζε κειέηεο ησλ επηπηώζεσλ ξππνγόλσλ νπζηώλ. Σα αηκνθχηηαξα ησλ κπδηψλ Mytllus galloprovincialis δηαθξίλνληαη κνξθνινγηθά ζε δχν ηχπνπο, ηα θνθθψδε θαη ηα παιψδε θχηηαξα. Σα θνθθψδε ραξαθηεξίδνληαη απφ απμεκέλν αξηζκφ θπηηαξνπιαζκαηηθψλ θνθθίσλ κεξηθά απφ ηα νπνία πηζαλφηαηα είλαη ιπζνζψκαηα αθνχ αληηδξνχλ ζεηηθά ζηελ αλίρλεπζε ιπζνζσκηθψλ ελδχκσλ (Huffman θαη Tripp, 1982; Moore, 1985). Δπίζεο πεξηέρνπλ θαιπκκέλα θπζηίδηα κηθξφηεξεο ειεθηξνληθήο ππθλφηεηαο, ελδνθπηηθά θαη θαγνθπηηαξηθά θπζηίδηα, πνιπθηζηηδηαθά ζσκάηηα, πνιιά ππεξνμεηδηνζψκαηα θαη κηηνρφλδξηα. Σν ελδνπιαζκαηηθφ δίθηπν θαη ην ζχκπιεγκα Golgi δελ είλαη ηδηαίηεξα αλαπηπγκέλα. ηα ψξηκα θχηηαξα πνπ είλαη γεκάηα απφ θνθθία ν ππξήλαο είλαη ζθαηξηθφο, αιιά ζηα κηθξφηεξα αλψξηκα θχηηαξα ν ππξήλαο κπνξεί λα είλαη επηκήθεο. Σα παιψδε αηκνθχηηαξα ραξαθηεξίδνληαη απφ κεγάιν ππξήλα κε κάδεο ππθλήο ρξσκαηίλεο, πεξηνξηζκέλν θπηηαξφπιαζκα, θαιά ζρεκαηηζκέλν ζχκπιεγκα Golgi, ειάρηζηα ιπζνζψκαηα, αξθεηά κηηνρφλδξηα, ζεκαληηθή πνζφηεηα ιείνπ θαη αδξνχ ελδνπιαζκαηηθνχ δηθηχνπ θαη άθζνλα 11

12 ξηβνζψκαηα. Θεσξνχληαη είηε πξφδξνκεο κνξθέο θνθθσδψλ θπηηάξσλ είηε δηαθνξεηηθφο ηχπνο ψξηκσλ θπηηάξσλ πνπ αλήθνπλ ζε κηα μερσξηζηή θπηηαξηθή ζεηξά (Mix, 1986). Δηθόλα 3. Αηκνθύηηαξν κπδηώλ (θση. Νηατιηάλεο ). Σα αηκνθχηηαξα (Δηθόλα 3) ζπκκεηέρνπλ ζε πνιιέο θπζηνινγηθέο ιεηηνπξγίεο, φπσο ε επνχισζε ησλ ηξαπκάησλ, ν ζρεκαηηζκφο θαη επηδηφξζσζε ηνπ θειχθνπο, ε πέςε ζξεπηηθψλ ζπζηαηηθψλ, ε κεηαθνξά θαη ε απέθθξηζε ησλ ηειηθψλ πξντφλησλ ηεο πέςεο (Cheng θαη Sullivan, 1984). Ηδηαίηεξα ζεκαληηθφο φκσο είλαη ν ξφινο ηνπο ζηελ εζσηεξηθή άκπλα θαη πην ζπγθεθξηκέλα ηα θνθθψδε θχηηαξα. Σα αηκνθχηηαξα ησλ κπδηψλ αλήθνπλ ζηελ πξψηε γξακκή άκπλαο κέζσ ηεο θαγνθπηηάξσζεο θαη ηεο αλαπλεπζηηθήο έθξεμεο πνπ επηηειείηαη ζε απηά. Υξεζηκνπνηνχληαη επξέσο σο κνληέια ζηελ πεξηβαιινληηθή ηνμηθνινγία γηα ηε δηεξεχλεζε ησλ επηδξάζεσλ ησλ βαξέσλ κεηάιισλ (Borenfreund θαη Purner, 1985). H θαγνθπηηάξσζε απνηειεί κηα θχξηα ακπληηθή δηαδηθαζία ησλ αηκνθπηηάξσλ. Δπίζεο ξίδεο νμπγφλνπ θαη αδψηνπ φπσο ππεξνμείδηα θαη νμείδηα ηνπ αδψηνπ παξάγνληαη κέζσ κηαο δηαδηθαζίαο πνπ νλνκάδεηαη αλαπλεπζηηθή έθξεμε (respiratory burst), ε νπνία αληηπξνζσπεχεη ηνλ θχξην κεραληζκφ ηνπ ακπληηθνχ ζπζηήκαηνο έλαληη εμσγελψλ νπζηψλ (Pipe, 1992; Noel θαη ζπλ., 1993; Conte θαη Ottaviani, 1995; Franchini θαη ζπλ.,1995; Winston θαη ζπλ., 1996; Arumugam θαη ζπλ., 2000; Gourdon θαη ζπλ., 2001; Tafalla θαη ζπλ., 2002; Novas θαη ζπλ., 2004). Σα αηκνθχηηαξα δέρνληαη ηελ άκεζε επίδξαζε πεξηβαιινληηθψλ ξχπσλ ιφγσ ηνπ θπζηνινγηθνχ ξφινπ ηνπο ζηε κεηαθνξά ελδνγελψλ θαη εμσγελψλ παξαγφλησλ θαη ηεο ζπκκεηνρήο ηνπο ζηε δηαδηθαζία ηεο άκπλαο (Mersh θαη ζπλ., 1996). Πξφζθαηα δεδνκέλα 12

13 αλαθέξνπλ ηελ επαγσγή ηεο αλνζνινγηθήο δξαζηηθφηεηαο ησλ αηκνθπηηάξσλ, φπσο ε επαγσγή ηεο δηαδηθαζίαο ηεο αλαπλεπζηηθήο έθξεμεο, κεηά απφ έθζεζε ζε κηθξνκνξηαθέο ζπγθεληξψζεηο βαξέσλ κεηάιισλ, φπσο ην θάδκην (Dailianis, 2009). Παξαθάησ δίλνληαη πεξηιεπηηθά θάπνηεο πιεξνθνξίεο γηα ηα βαξέα κέηαιια θαη ηηο επηπηψζεηο ηνπο ζηνπο νξγαληζκνχο. 1.3 Βαξέα κέηαιια θαη ξύπαλζε Γεληθά ραξαθηεξηζηηθά ησλ βαξέσλ κεηάιισλ. Σα βαξέα κέηαιια είλαη θπζηθά ζπζηαηηθά ηνπ θινηνχ ηεο γεο. Δίλαη κέηαιια κε ζρεηηθή ππθλφηεηα > 5 ζε ζρέζε κε ην λεξφ. Γελ κπνξνχλ λα δηαζπαζηνχλ ζε απινχζηεξεο κνξθέο ή λα θαηαζηξαθνχλ. ε κηθξφ πνζνζηφ εηζάγνληαη ζηνλ αλζξψπηλν νξγαληζκφ κέζσ ησλ ηξνθίκσλ, ηνπ πφζηκνπ λεξνχ θαη ηνπ αέξα. Σα πεξηζζφηεξα βαξέα κέηαιια, ζεσξνχληαη κε απαξαίηεηα, εθ φζνλ δελ έρνπλ θάπνην γλσζηφ βηνινγηθφ ξφιν θαη εκθαλίδνπλ κεγάιε ηνμηθφηεηα, ηδηαίηεξα φηαλ ε ζπγθέληξσζή ηνπο ζηνπο ηζηνχο ππεξβεί κηα ζπγθεθξηκέλε νξηαθή ηηκή (Rainbow, 1993). ε πςειφηεξεο ζπγθεληξψζεηο κπνξνχλ λα είλαη ηνμηθά. Γηα παξάδεηγκα, δειεηεξίαζε απφ βαξέα κέηαιια κπνξεί λα πξνθχςεη κεηά απφ πφζε αθαηάιιεινπ λεξνχ (π.ρ. ζσιήλεο κνιχβδνπ). πγθεθξηκέλα, κπνξνχλ λα επηθέξνπλ ζεηξά δπζκελψλ επηδξάζεσλ ζηνπο δσληαλνχο νξγαληζκνχο, φπσο λεπξνθπζηνινγηθέο δηαηαξαρέο, γελεηηθέο αιινηψζεηο ησλ θπηηάξσλ (κεηαιιάμεηο), επηδξάζεηο ζηελ ελδπκηθή δξαζηηθφηεηα θαη νξκνληθή ιεηηνπξγία, πξνβιήκαηα ζηελ αλαπαξαγσγή, δηαηαξαρή ηεο κεκβξαληθήο δηαπεξαηφηεηαο ζε ηφληα Na +, K +, Cl -, θαζψο θαη νξγαληθψλ κνξίσλ, ηεξαηνγελέζεηο θαη θαξθηλνγελέζεηο. Μάιηζηα, ιφγσ αληαγσληζκνχ κε ηα απαξαίηεηα κέηαιια, κπνξνχλ λα θαηαιάβνπλ ηε ζέζε ζχλδεζεο ησλ ηειεπηαίσλ ζε εηδηθά κφξηα θαη δνκέο, κε ζπλέπεηα ηελ εκθάληζε αλσκαιηψλ ζην κεηαβνιηζκφ. Γεληθφηεξα ε ηνμηθφηεηα ησλ κεηάιισλ απνηειεί ζπλδπαζκφ πνηθίιισλ παξαγφλησλ φπσο ε ζπγθέληξσζή ηνπο, ην είδνο ηνπ κεηάιινπ, ε παξνπζία θαη ε ζπλεξγαηηθή δξάζε άιισλ κεηάιισλ, θαζψο θαη ην είδνο ηνπ νξγαληζκνχ Υδξάξγπξνο (Ηg). Ο πδξάξγπξνο αλήθεη ζηα βαξέα κέηαιια θαη είλαη κέηαιιν γλσζηφ απφ ηελ αξραηφηεηα. Απαληά θπξίσο σο κεηαιιηθφο Ζg (κε ηε κνξθή κνλνζζελνχο ή δηζζελνχο ηφληνο), σο HgS, Hg(OH)2 θαη HgCl2. ε ζεξκνθξαζία δσκαηίνπ απαληάηαη ζε πγξή κνξθή. Κπξηφηεξν νξπθηφ ηνπ πδξαξγχξνπ είλαη ην θηλλάβαξη, HgS, πνπ ρξεζηκνπνηήζεθε θαηά ην παξειζφλ θαη σο αθξηβφ εξπζξφ ρξψκα (vermilion). πάληα ζπλαληάηαη θαη σο ειεχζεξνο 13

14 πδξάξγπξνο ("απηνθπήο") ζε ζρηζκέο θαη θνηιψκαηα άιισλ νξπθηψλ. Οη δηαιπηέο ελψζεηο ηνπ είλαη ηνμηθφηαηεο. Γηα παξάδεηγκα, εμαηξεηηθά επηθίλδπλεο είλαη νη νξγαλνυδξαξγπξηθέο ελψζεηο, φπσο π.ρ. ν δηκεζπινυδξάξγπξνο, (CH3) 2 Hg, πνπ ζε ειάρηζηεο πνζφηεηεο κπνξνχλ λα απνξξνθεζνχλ απφ ην δέξκα θαη λα είλαη ζαλαηεθφξεο. Οη αηκνί ηνπ ίδηνπ ηνπ κεηάιινπ, πνπ παξάγνληαη αθφκε θαη ζε ζεξκνθξαζία δσκαηίνπ, είλαη επίζεο ηνμηθνί θαη απαηηείηαη ηδηαίηεξε πξνζνρή θαη θαιφο αεξηζκφο θαηά ηε ρξήζε ηνπ. Ζ ζπλερήο εξγαζία κε πδξάξγπξν ρσξίο ηα θαηάιιεια κέηξα πξνζηαζίαο πξνθαιεί πνλνθέθαιν, καχξηζκα ησλ δνληηψλ θαη δηαηαξαρέο ηνπ λεπξηθνχ ζπζηήκαηνο. Υξεζηκνπνηείηαη σο πιηθφ θαζφδνπ θαηά ηελ ειεθηξνιπηηθή παξαγσγή ρισξίνπ θαη NaOH ζε βηνκεραληθή θιίκαθα, παξαιαβή επγελψλ κεηάιισλ απφ νξπθηά θαη άκκν, κπθεηνθηφλα, ιπρλίεο πδξαξγχξνπ (ππεξηψδνπο αθηηλνβνιίαο), ειεθηξηθέο ζπζθεπέο, επηζηεκνληθά φξγαλα (π.ρ. ζεξκφκεηξα, βαξφκεηξα, αληιίεο δηάρπζεο), νδνληηαηξηθή (κε ηε κνξθή ακαιγακάησλ κε Sn θαη Zn σο πιηθφ ζθξαγηζκάησλ δνληηψλ), αλ θαη δηεζλψο θαηαβάιιεηαη πξνζπάζεηα πεξηνξηζκνχ ηεο ρξήζεο ηνπ (π.ρ. ηα πδξαξγπξηθά ζεξκφκεηξα έρνπλ πιένλ αληηθαηαζηαζεί απφ ςεθηαθά ζεξκφκεηξα). Ο πδξάξγπξνο, κπνξεί λα επηθέξεη ζεκαληηθή αιιαγή ζηνπο νκνηνζηαηηθνχο κεραληζκνχο ησλ νξγαληζκψλ (Auffret θαη Oubella, 1997), κέζσ ηεο επαγσγήο νμεηδσηηθνχ stress κε ηε δεκηνπξγία ελεξγψλ ξηδψλ νμπγφλνπ (ROS), ζπκβάιινληαο έηζη ζηε ιηπηδηθή ππεξνμείδσζε θαη ηελ θαηαζηξνθή ηνπ DNA (Lund θαη ζπλ., 1993; Ariza θαη ζπλ., 1994; Ben-Ozer θαη ζπλ., 2000). Δπίζεο κπνξεί λα πξνθαιέζεη αλσκαιία ηνπ λεπξηθνχ ζπζηήκαηνο, βιάβε ζηηο εγθεθαιηθέο ιεηηνπξγίεο, αιιεξγηθέο αληηδξάζεηο, κε ζπλέπεηα δεξκαηηθφ θλεζκφ, θνχξαζε θαη πνλνθέθαινπο, αξλεηηθέο επηδξάζεηο ζηελ αλαπαξαγσγή, φπσο βιάβε ηνπ ζπέξκαηνο, γελεηηθέο αλσκαιίεο θαη απνβνιέο ζηηο εγθχνπο. Βιάβε ζηηο εγθεθαιηθέο ιεηηνπξγίεο κπνξεί λα πξνθαιέζεη ηελ ππνβάζκηζε ησλ δπλαηνηήησλ εθκάζεζεο, αιιαγέο ζηελ πξνζσπηθφηεηα, ηξέκνπιν, αιιαγέο ζηελ φξαζε, θψθσζε, απψιεηα ζπληνληζκνχ ησλ κπψλ θαη απψιεηα κλήκεο. Ζ ηνμηθφηεηα ηνπ πδξαξγχξνπ απφ ηα ηξφθηκα είλαη πνιχ ζπάληα θαη ζρεδφλ πάληα πξνθαιείηαη απφ ηελ πεξηβαιινληηθή ξχπαλζε. πζζσξεχεηαη ζην ιηπψδε ηζηφ ησλ ςαξηψλ θαη άιισλ ζαιάζζησλ νξγαληζκψλ, ζηηο πξσηετλεο ησλ θπηηάξσλ ηνπο θαη κέζσ ηεο ηξνθηθήο αιπζίδαο κεηαθέξεηαη ζε αλψηεξνπο νξγαληζκνχο. 1.4 Σν ζειήλην (Se) θαη ε ζεκαζία ηνπ σο ηρλνζηνηρείν. Σν ζειήλην αλήθεη ζηελ θαηεγνξία ησλ ηρλνζηνηρείσλ, δειαδή νπζίεο πνπ είλαη απαξαίηεηεο ζηνλ νξγαληζκφ γηα δηάθνξεο θπζηνινγηθέο ιεηηνπξγίεο, αιιά βξίζθνληαη ζε πνιχ 14

15 κηθξέο πνζφηεηεο ζε απηφλ. Αλ μεπεξάζνπλ απηέο ηηο πνζφηεηεο ζεσξνχληαη ηνμηθέο κε δπζκελείο γηα ηνλ νξγαληζκφ επηπηψζεηο. Σν ζειήλην καδί κε ηελ γινπηαζεηφλε δεζκεχεη ηα ηνμηθά βαξέα κέηαιια φπσο πδξάξγπξν, κφιπβδν, θάδκην. Δπίζεο ην ζειήλην εκπνδίδεη ηελ ζπγθφιιεζε ησλ αηκνπεηαιίσλ κεηαμχ ηνπο, πεξηνξίδνληαο ηνπο θηλδχλνπο ζξφκβσλ ηνπ αίκαηνο, θαξδηαθήο πξνζβνιήο θαη εγθεθαιηθψλ. Δκπνδίδεη επίζεο ηελ νμείδσζε ηεο ρνιεζηεξίλεο (LDL) θαη εληζρχεη ηελ αλνζνπνηεηηθή ιεηηνπξγία ηνπ νξγαληζκνχ. Πεγή ζειελίνπ απνηεινχλ ηα ζαιαζζηλά, ην θξέαο, ην γάια, νη νιφθιεξνη ζπφξνη, ηα φζπξηα θαη ηα δεκεηξηαθά. Ζ έιιεηςε ζειελίνπ έρεη σο απνηέιεζκα ηελ κείσζε ηεο δξάζεο ηεο ππεξνμεηδάζεο ηεο γινπηαζεηφλεο θαη ηεο αληίζηνηρεο πξσηεΐλεο ζην αίκα θαη ηνπο ππφινηπνπο ηζηνχο. Μπνξεί λα νδεγήζεη ζε αλαηκία, θαζψο επίζεο θαη ζε κπνθαξδηνπάζεηα θαη αηθλίδην ζάλαην. Σν ζειήλην φηαλ ιακβάλεηαη ζε πνζφηεηεο κεγαιχηεξεο ησλ 750κg/εκέξα κπνξεί λα πξνθαιέζεη πεπηηθά πξνβιήκαηα. Έρεη επίζεο ζεκεησζεί φηη δφζεηο κεγαιχηεξεο απφ 900κg/εκέξα κπνξεί λα πξνθαιέζνπλ νλπρνδπζηξνθία θαη δεξκαηηθέο αιινηψζεηο. Λήςε άλσ ησλ 1000 κg κπνξεί λα έρεη ζαλ απνηέιεζκα απμεκέλα επίπεδα ρνιεζηεξίλεο ηνπ αίκαηνο. Σν ζειήλην είλαη ηζρπξφ αληηνμεηδσηηθφ πνπ βνεζάεη ζηελ απνηνμίλσζε ηνπ ζψκαηνο. Δλζσκαηψλεηαη ζε πξσηεΐλεο ηηο ζειεληνπξσηεΐλεο, νη νπνίεο είλαη ζεκαληηθά αληηνμεηδσηηθά έλδπκα. Οη αληηνμεηδσηηθέο ηδηφηεηεο ησλ πξσηετλψλ απηψλ βνεζνχλ ζην λα απνηξαπεί ε θαηαζηξνθή ησλ θπηηάξσλ απφ ηηο ειεχζεξεο ξίδεο. Οη ξίδεο είλαη θπζηθά παξαπξντφληα ηνπ κεηαβνιηζκνχ ηνπ νμπγφλνπ πνπ κπνξεί λα ζπκβάινπλ ζηε δεκηνπξγία ρξφλησλ παζήζεσλ. Δπίζεο νη πξσηεΐλεο απηέο βνεζνχλ ζηε ξχζκηζε ηεο ιεηηνπξγίαο ηνπ ζπξενεηδνχο θαη παίδνπλ ζεκαληηθφ ξφιν ζην αλνζνπνηεηηθφ ζχζηεκα. Σνπιάρηζηνλ έληεθα ζειελν-πξσηεΐλεο έρνπλ ραξαθηεξηζηεί, ελψ ππάξρνπλ ζηνηρεία φηη ππάξρνπλ αθφκα πεξηζζφηεξεο. ε απηέο αλήθνπλ νη ππεξνμεηδάζεο ηεο γινπηαζεηφλεο. Έρνπλ ηαπηνπνηεζεί ηέζζεξηο ππεξνμεηδάζεο ηεο γινπηαζεηφλεο νη νπνίεο πεξηέρνπλ ζειήλην (GPx): 1) θπηηαξηθή ή θιαζηθή GPx, 2) πιάζκα ή εμσθπηηαξηθή GPx, 3) θσζθνιηπηδηθή ππεξνμεηδάζε GPx, θαη 4) γαζηξνεληεξηθή GPx. Παξά ην γεγνλφο φηη θάζε GPx είλαη κηα ραξαθηεξηζηηθή ζειελν-πξσηεΐλε, είλαη φιεο αληηνμεηδσηηθά έλδπκα ηα νπνία δηαζπνχλ ην ππεξνμείδην ηνπ πδξνγφλνπ θαη ηηο ππεξνμεηδάζεο ησλ ιηπψλ, ζε αβιαβή πξντφληα φπσο ην λεξφ θαη ε αηζπιηθή αιθνφιε κέζσ ηεο νμείδσζεο ηεο γινπηαζεηφλεο. 15

16 Πξνεγνχκελεο κειέηεο έρνπλ αζρνιεζεί κε ηηο αληηδξάζεηο κεηαμχ πδξαξγχξνπ θαη ζειελίνπ, θαζψο θαη κε ηελ βηνδηαζεζηκφηεηά ηνπο, ηφζν ζε ζπνλδπισηά (Parizek θαη Ostadalova, 1967; Koeman θαη ζπλ, 1973), φζν θαη ζε αζπφλδπια (Micallef θαη Tyler, 1990). Δληνχηηο, ιίγα είλαη γλσζηά γηα ην ξφιν ηνπ ζειελίνπ ζηελ επαγσγή ηεο δξαζηηθφηεηαο ηεο GPx, έλαληη ησλ ηνμηθψλ θαηλνκέλσλ ηνπ πδξαξγχξνπ ζηα αηκνθχηηαξα ησλ κπδηψλ. Οη Patel θαη ζπλ. (1988) έδεημαλ πσο ην ζειήλην δελ έρεη πξνζηαηεπηηθφ ξφιν έλαληη ησλ ηνμηθψλ επηπηψζεσλ ηνπ πδξαξγχξνπ ζηα ζαιάζζηα καιάθηα, ελψ νη Tran θαη ζπλ. (2007) έδεημαλ πσο ηα πξνζηαηεπηηθά θαηλφκελα ηνπ ζειελίνπ έλαληη ηεο θαηαζηξνθήο ηνπ DNA πνπ πξνθαιείηαη απφ ηνλ πδξάξγπξν ζε αηκνθχηηαξα κπδηψλ Mytilus edulis ζρεηίδνληαη κε ηελ πξφιεςε ηεο νμεηδσηηθήο θαηαζηξνθήο κέζσ ηεο επαγσγήο ηεο δξαζηηθφηεηαο ηεο GPx. 16

17 1.5 Δπαγσγή νμεηδσηηθνύ stress Δξαζηηθέο κνξθέο νμπγόλνπ (ROS). Γξαζηηθέο κνξθέο νμπγφλνπ παξάγνληαη ζπλερψο κέζα ζηα θχηηαξα θαη εμνπδεηεξψλνληαη κε ηε κεζνιάβεζε θαηάιιεισλ αληηνμεηδσηηθψλ κεραληζκψλ, έηζη ψζηε λα δηαηεξείηαη κηα ηζνξξνπία. Ζ δηαηαξαρή ηεο ηζνξξνπίαο ζε βάξνο ησλ αληηνμεηδσηηθψλ κεραληζκψλ απνηειεί ην νμεηδσηηθφ stress θαη κπνξεί λα πξνθιεζεί: Α) κε ππέξκεηξε παξαγσγή ROS. Β) κε ηελ παξνπζία ηνμηθψλ νπζηψλ, φπσο νξγαληθψλ ξχπσλ θαη βαξέσλ κεηάιισλ. Γ) κε ππεξβνιηθή ελεξγνπνίεζε ησλ ζπζηεκάησλ παξαγσγήο ROS, φπσο ηεο θαγνθπηηαξηθήο δηαδηθαζίαο. Γ) κε αλεπάξθεηα αληηνμεηδσηηθψλ κεραληζκψλ. Οη ειεχζεξεο ξίδεο πνπ μεθεχγνπλ απφ ηελ αληηνμεηδσηηθή άκπλα ησλ θπηηάξσλ κπνξεί λα πξνθαιέζνπλ ζεκαληηθέο βιάβεο ζε φιεο ηηο ηάμεηο ησλ βηνκνξίσλ, φπσο πξσηετλεο, ιηπίδηα, πδαηάλζξαθεο θαη DNA (ρήκα 1). ΔΛΔΤΘΔΡΔ ΡΗΕΔ Σξνπνπνίεζε πδαηαλζξάθσλ Μεηνπζίσζε πξσηετλψλ Τπεξνμείδσζε ιηπηδίσλ Σξνπνπνίεζε DNA (κεηαιιάμεηο) ρήκα 1. Δπηδξάζεηο ειεύζεξσλ ξηδώλ ζε βηνκόξηα. Μεηαμχ ησλ ειεχζεξσλ ξηδψλ, κεγάιν ελδηαθέξνλ παξνπζηάδνπλ νη ειεχζεξεο ξίδεο νμπγφλνπ (Free oxygen radicals) θαη γεληθφηεξα νη δξαζηηθέο κνξθέο ηνπ (Γξαζηηθέο κνξθέο νμπγφλνπ/reactive oxygen species, ROS). Ωο ROS αλαθέξνληαη νη ελψζεηο πνπ παξάγνληαη απφ 17

18 ην κνξηαθφ νμπγφλν κε αλαγσγή ελφο, δχν, ή ηξηψλ ειεθηξνλίσλ, θαζψο θαη νη ξίδεο νμπγφλνπ ή νξγαληθψλ ελψζεσλ θαη ππεξνμεηδίσλ, νη νπνίεο παξάγνληαη απφ ελψζεηο πνπ έρνπλ αληηδξάζεη κε ξίδεο νμπγφλνπ (Halliwell θαη Gutteridge, 1999; Gutteridge, 1995). Γηα παξάδεηγκα, ε ξίδα ηνπ αληφληνο ηνπ ζνππεξνμεηδίνπ (Ο.- 2 ), ην ππεξνμείδην ηνπ πδξνγφλνπ (Ζ 2 Ο 2 ) θαη ε πδξνμπιηθή ξίδα κπνξεί λα ζεσξεζνχλ ROS, επεηδή παξάγνληαη κε αλαγσγή ηνπ κνξηαθνχ νμπγφλνπ κε έλα, δχν θαη ηξία ειεθηξφληα αληίζηνηρα (ρήκα 2). ρήκα 2. ρεκαηηζκόο δξαζηηθώλ κνξθώλ νμπγόλνπ, κεηά από αλαγσγή κε 1,2 3 θαη 4 ειεθηξόληα. Σν ππεξνμπληηξψδεο (ΝΟΟ - ) ζπγθαηαιέγεηαη ζηηο ROS, επεηδή πξνέξρεηαη απφ ηελ αληίδξαζε ηνπ νμεηδίνπ ηνπ αδψηνπ (ΝΟ. ) κε ηε ξίδα ηνπ ππεξνμεηδίνπ (Ο 2.- ). ΝΟ. + Ο 2 - ΟΝΟΟ - Οη ROS δελ είλαη ππνρξεσηηθά ειεχζεξεο ξίδεο. Γηα παξάδεηγκα, ζηηο δξαζηηθέο κνξθέο νμπγφλνπ ζπγθαηαιέγνληαη επίζεο ην κνλήξεο νμπγφλν ( 1 Ο 2 ) θαη ην φδνλ (Ο 3 ), επεηδή κπνξεί λα πξνθαιέζνπλ επαγσγή ειεχζεξσλ ξηδψλ (Παπαγεσξγίνπ, 1999, 2005). ηα βηνινγηθά ζπζηήκαηα κπνξεί λα ζρεκαηηζηνχλ θαη άιιεο ξίδεο, εθηφο απφ ηηο ξίδεο νμπγφλνπ. Γηα παξάδεηγκα, ελψζεηο πνπ πεξηέρνπλ ζεηνιηθέο νκάδεο (-SH) κπνξεί λα νμεηδσζνχλ κε ηελ παξνπζία κεηαβαηηθψλ κεηάιισλ θαη λα δψζνπλ ζεητιηθέο ξίδεο (R-S. ) πνπ έρνπλ ζην θέληξν ηνπο ζείν: R-SH + Cu +2 RS + Cu + +H + 18

19 Δπίζεο, νξηζκέλεο ελψζεηο ηνπ αδψηνπ, φπσο ην ΝΟ.. θαη ην ΝΟ 2 απνηεινχλ ειεχζεξεο ξίδεο θαη νλνκάδνληαη ειεχζεξεο ξίδεο ηνπ αδψηνπ (Reactive Nitrogen Species, RNS). ηνλ παξαθάησ πίλαθα 1 δίλνληαη ζπλνπηηθά νη δξαζηηθέο κνξθέο νμπγφλνπ (ROS) θαη αδψηνπ (RNS). Πίλαθαο 1. Γξαζηηθέο κνξθέο νμπγόλνπ (ROS) θαη αδώηνπ (RNS). Ρίδεο Ολνκαζία - Ο 2 HΟ 2 OH. ROO RO NO Με ξίδεο Ζ 2 Ο 2 Αληφλ ηνπ ζνππεξνμεηδίνπ (superoxide anion) Τδξνυπεξνμεηδηθή ξίδα (hydroperoxyl radical) Τδξνμπιηθή ξίδα ( hydroxyl radical) Τπεξνμεηδηθή ξίδα (peroxyl radical) Αιθνμεηδηθή ξίδα (alcoxyl radical) Ομείδην ηνπ αδψηνπ (nitric oxide) Τπεξνμείδην ηνπ πδξνγφλνπ (hydrogen peroxide) 1 Ο 2 Μνλήξεο νμπγφλν (singlet oxygen) Ο 3 HOCl ROOH ONOO - Όδνλ (ozon) Τπνρισξηψδεο νμχ (hypoclorus acid) Οξγαληθά πδξνυπεξνμείδηα (organic hydroxyperoxides) Τπεξνμπληηξψδεο (peroxynitrite) Σρεκαηηζκόο ROS θαηά ηε δηαδηθαζία ηεο θαγνθπηηάξσζεο. Σα θαγνθχηηαξα (νπδεηεξφθηια, εσζηλφθηια θαη καθξνθάγα) ελεξγνπνηνχληαη θαη θαηαλαιψλνπλ κεγάιεο πνζφηεηεο νμπγφλνπ, φηαλ έξρνληαη ζε επαθή κε μέλα ζσκαηίδηα θαη/ή βαθηήξηα. Ζ θαηαλάισζε νμπγφλνπ είλαη πνιχ κεγαιχηεξε απφ απηή πνπ πξαγκαηνπνηείηαη θαηά ηε δηαδηθαζία ηεο νμεηδσηηθήο θσζθνξπιίσζεο πνπ γίλεηαη ζηα κηηνρφλδξηα θαη νλνκάδεηαη αλαπλεπζηηθή έθξεμε (respiratory burst) ή νμεηδσηηθή έθξεμε (oxidative burst). Με απηή ηε δηαδηθαζία ηα θαγνθχηηαξα παξάγνπλ δξαζηηθέο κνξθέο νμπγφλνπ θαη αδψηνπ, απνζθνπψληαο ζηελ θαηαζηξνθή ησλ παζνγφλσλ βαθηεξίσλ, θαζψο θαη ζηελ εμνπδεηέξσζε μέλσλ ζσκαηηδίσλ πνπ κπνξεί λα πξνθαιέζνπλ θπηηαξηθέο βιάβεο (Clark, 1990). Οη δξαζηηθέο κνξθέο νμπγφλνπ θαη αδψηνπ παξάγνληαη κέζσ ηεο ελεξγνπνίεζεο ηεο NADPH νμεηδάζεο, ηεο 19

20 ζπλζεηάζεο ηνπ κνλνμεηδίνπ ηνπ αδψηνπ (NO ζπλζάζε), ηεο δηζκνπηάζεο ηνπ ζνππεξνμεηδίνπ (SOD) θαη ηεο κπεινυπεξνμεηδάζεο Σνππεξνμείδην ή αληόλ ηνπ ζνππεξνμεηδίνπ (Ο 2 - ). Σν ζνππεξνμείδην δεκηνπξγείηαη κεηά απφ αλαγσγή ηνπ κνξηαθνχ νμπγφλνπ κε έλα ειεθηξφλην, ζχκθσλα κε ηελ παξαθάησ αληίδξαζε: Ο 2 + e - Ο 2 - (αλαγσγή) Ο ζρεκαηηζκφο ηνπ πξαγκαηνπνηείηαη απζφξκεηα ζην πεξηβάιινλ ηεο εζσηεξηθήο κεκβξάλεο ησλ κηηνρνλδξίσλ, θαηά ηε δηάξθεηα ηεο ιεηηνπξγίαο ηεο αιπζίδαο κεηαθνξάο ειεθηξνλίσλ. Παξάγεηαη επίζεο απφ ηα θιαβηλν-έλδπκα, φπσο ηελ νμεηδάζε ηεο μαλζίλεο, ηελ ιηπννμπγελάζε, ηελ θπθιννμπγελάζε, θαζψο θαη ηελ NADPH νμεηδάζε ησλ θαγνθπηηάξσλ (Kuppusamy θαη Zweier, 1989; Zimmerman θαη Granger, 1994; Kontos θαη ζπλ., 1985; McIntyre θαη ζπλ., 1999). Σν αληφλ ηνπ ζνππεξνμεηδίνπ (Ο - 2 ) παίδεη ζεκαληηθφ ξφιν ζηε βηνρεκεία ησλ ειεχζεξσλ ξηδψλ, ιφγσ ηεο ζπκκεηνρήο ηνπ ζηελ παξαγσγή πνιιψλ δξαζηηθψλ κνξθψλ, κε ηε ζχδεπμε πνπ παξαηεξείηαη ζην αζχδεπθην ειεθηξφλην. Απνηέιεζκα ηεο ηάζεο ζχδεπμεο είλαη ε αληίδξαζε κεηαμχ 2 ξηδψλ (Ο - 2 ) ζε πδαηηθφ πεξηβάιινλ θαη ην ζρεκαηηζκφ ηνπ ππεξνμεηδίνπ ηνπ πδξνγφλνπ, ζχκθσλα κε ηελ παξαθάησ αληίδξαζε: e - + Ο H + H 2 O 2 Ζ παξαπάλσ αληίδξαζε είλαη απζφξκεηε θαη πξαγκαηνπνηείηαη πνιχ αξγά ζηνπο βηνινγηθνχο ηζηνχο, ελψ κε ηελ κεζνιάβεζε ηεο δηζκνπηάζεο ηνπ ζνππεξνμεηδίνπ (SOD) απμάλεηαη απνηειεζκαηηθά ε ηαρχηεηά ηεο. ε πδαηηθά δηαιχκαηα ην Ο - 2 κπνξεί λα πξσηνλησζεί θαη λα παξαρζεί ε ζνππεξνμεηδηθή ξίδα (ΖΟ - 2 ), ε νπνία παξνπζηάδεη κεγαιχηεξε δξαζηηθφηεηα απφ ην Ο 2 θαη κπνξεί λα πξνζβάιιεη βηνινγηθέο κεκβξάλεο θαη ιηπίδηα ρακειήο ππθλφηεηαο (LDL), ζπκβάιινληαο ζηελ έλαξμε ηεο ιηπηδηθήο ππεξνμείδσζεο (Bedwell θαη ζπλ. 1989). H ΖΟ 2 δηαπεξλά ηαρχηεξα ηηο βηνινγηθέο κεκβξάλεο ζπγθξηηηθά κε ην Ο - 2, ιφγσ ηνπ γεγνλφηνο φηη ην ηειεπηαίν δηαζέηεη 20

21 αξλεηηθφ θνξηίν, ην νπνίν πεξηνξίδεη ζεκαληηθά ηε δηαπεξαηφηεηά ηνπ δηακέζνπ ησλ κεκβξαλψλ Μνλνμείδην ηνπ αδώηνπ (ΝΟ ). Σν κνλνμείδην ηνπ αδψηνπ (ΝΟ ) είλαη άρξσκν αέξην, ιίγν δηαιπηφ ζην λεξφ θαη πεξηζζφηεξν δηαιπηφ ζε νξγαληθνχο δηαιχηεο. Γελ έρεη θνξηίν θαη κεηαθηλείηαη εχθνια κέζα ζηα θχηηαξα θαη κεηαμχ ησλ θπηηάξσλ. Θεσξείηαη ειεχζεξε ξίδα, ιφγσ ηεο χπαξμεο αζχδεπθηνπ ειεθηξνλίνπ ζην π*2p αληηδεζκηθφ ηξνρηαθφ. Δίλαη αξθεηά ζηαζεξφ θαη ζε δηαιχκαηα πνπ πεξηέρνπλ νμπγφλν αληηδξά κε απηφ θαη ζρεκαηίδεη ΝΟ - 2, ζχκθσλα κε ηελ παξαθάησ αληίδξαζε: 4ΝΟ + 2Ζ 2 Ο + Ο 2 4Ζ + + 4ΝΟ 2 - ηνλ αέξα ην κνλνμείδην ηνπ αδψηνπ νμεηδψλεηαη θαη ζρεκαηίδεηαη αέξην θαζηαλνχ ρξψκαηνο, δηνμείδην ηνπ αδψηνπ (ΝΟ 2 ): 2ΝΟ + Ο 2 2ΝΟ 2 Σν ΝΟ 2 είλαη ειεχζεξε ξίδα πνιχ πην δξαζηηθή απφ ην ΝΟ. Καη νη δχν ξίδεο κπνξεί λα απνβάιινπλ εχθνια ην κνλήξεο ειεθηξφλην, ζρεκαηίδνληαο ην ηφλ ληηξφλην ΝΟ +2 θαη ην ηφλ ληηξνζφλην ΝΟ + αληίζηνηρα (Μαλνπζάθεο, 1982). Σν ΝΟ παξάγεηαη ζε κηθξνκνξηαθέο ζπγθεληξψζεηο θαηά ηε δηάξθεηα θιεγκνλήο ή/θαη ηξαχκαηνο. ε κεγάιεο ζπγθεληξψζεηο κπνξεί λα αληηδξάζεη ην αληφλ ηνπ ζνππεξνμεηδίνπ (Ο - 2 ) θαη λα ζρεκαηηζηεί ην ππεξνμπληηξψδεο αληφλ (ΟΝΟΟ - ), ην νπνίν είλαη ηζρπξφ νμεηδσηηθφ (Beckman θαη Koppenol, 1996; Pryor θαη Squadrito, 1995). ΝΟ + Ο 2 - ΟΝΟΟ - Σν ΟΝΟΟ - είλαη αξθεηά ζηαζεξφ θαη ζρεκαηίδεη ην ππεξνμπληηξψδεο νμχ (ΖΝΟΟΖ), κεηά απφ πξσηνλίσζή ηνπ. Σν ΖΝΟΟΖ απνζπληίζεηαη γξήγνξα (t 1/2 1sec, 37 o C, ph 7.4) θαη κπνξεί λα ζρεκαηηζηνχλ ελδηάκεζα πξντφληα κε έληνλε θπηηαξνηνμηθή δξάζε, παξφκνηα ηεο δξάζεο 21

22 ηεο ξίδαο ΟΖ, ζχκθσλα κε ηελ παξαπάλσ αληίδξαζε (Beckman θαη Koppenol, 1996; Pryor θαη Squadrito, 1995): ΖΝΟΟΖ [ΟΖ + ΝΟ 2 ] Ζ + + ΝΟ 3 - Σν ΝΟ έρεη ηε δπλαηφηεηα δηάρπζεο κέζσ ησλ θπηηαξηθψλ κεκβξαλψλ ζην εζσηεξηθφ ηνπ θπηηάξνπ, κε ξπζκφ κεγαιχηεξν απφ ην νμπγφλν θαη ρσξίο λα θαηαλαιψλεηαη απφ ηα θχηηαξα (Gross θαη Wolin, 1995). Ζ βηνζχλζεζε ηνπ ΝΟ γίλεηαη κε ηελ αληίδξαζε κεηαηξνπήο ηεο L- αξγηλίλεο ζε L- θηηξνπιίλε κε ηελ θαηαιπηηθή ζπκκεηνρή κηαο νηθνγέλεηαο ελδχκσλ πνπ νλνκάδνληαη ζπλζεηάζεο ηνπ νμεηδίνπ ηνπ αδψηνπ (NOS). Ζ νηθνγέλεηα ησλ ζπλζεηαζψλ ηνπ νμεηδίνπ ηνπ αδψηνπ (NOS) απνηειείηαη απφ 3 ηζνέλδπκα, ηα νπνία εθθξάδνληαη απφ 3 μερσξηζηά γνλίδηα. Σα 2 ηζνέλδπκα πνπ παξνπζηάδνπλ ζπλερή βηνζχλζεζε ραξαθηεξίδνληαη σο nnos & enos, ελψ ην ηξίην ηζνέλδπκν, ην νπνίν παξνπζηάδεη επαγφκελε βηνζχλζεζε ραξαθηεξίδεηαη σο inos. Ζ δηαδηθαζία ηεο επαγφκελεο βηνζχλζεζεο πξαγκαηνπνηείηαη θπξίσο ζηα καθξνθάγα θχηηαξα (Mayer θαη Hemmens, 1997; Griffith θαη Stuehr, 1995). Σν ΝΟ ιακβάλεη κέξνο ζε πνιινχο κεραληζκνχο δσηηθήο ζεκαζίαο γηα ηελ ιεηηνπξγία ησλ θπηηάξσλ, φπσο ε λεπξνδηαβίβαζε, ε θιεγκνλή θαη ν θπηηαξηθφο ζάλαηνο (Lane θαη Gross, 1999). Ζ ζπκκεηνρή ηνπ ΝΟ ζηηο παξαπάλσ ιεηηνπξγίεο ζρεηίδνληαη κε ηελ πξφθιεζε κεηα-κεηαθξαζηηθψλ ηξνπνπνηήζεσλ ζε πξσηετλεο ηνπ θπηηάξνπ. Οη NOS ραξαθηεξίδνληαη απφ ηελ χπαξμε δχν πεξηνρψλ: α) κηα πεξηνρή πξνο ην θαξβνμπηειηθφ άθξν, κε δξάζε αλαγσγάζεο, ζηελ νπνία δεζκεχνληαη νη πξνζζεηηθέο νκάδεο FAD, FMN θαη ην ζπλέλδπκν NADPH θαη β) κηα πεξηνρή πξνο ην ακηλνηειηθφ άθξν, κε δξάζε νμπγνλάζεο, ζηελ νπνία ζπλδένληαη νη πξνζζεηηθέο νκάδεο αίκε θαη ηεηξαυδξνπηεξίλε (Ζ 4 - βηνπηεξίλε). Οη δχν πεξηνρέο ρσξίδνληαη απφ κία κηθξή πεξηνρή ζηελ νπνία ζπλδέεηαη ε θαικνδνπιίλε (CaΜ). Ζ ελεξγφηεηα ηεο CaM απνηειεί βαζηθή πξνυπφζεζε γηα ηελ δξαζηηθφηεηα ησλ ελδχκσλ, ιφγσ ηεο δηεπθφιπλζεο κεηαθνξάο ησλ ειεθηξνλίσλ πνπ παξέρνληαη απφ ην ζπλέλδπκν NADPH πξνο ην ακηλνηειηθφ άθξν (νμπγνλάζε) απφ ην θαξβνμπηειηθφ άθξν (αλαγσγάζε). ηα ηζνέλδπκα nnos θαη enos, ε ελεξγνπνίεζε ηεο CaM αληαπνθξίλεηαη ζηηο θπζηνινγηθέο κεηαβνιέο ησλ ηφλησλ αζβεζηίνπ (Ca +2 ), ελψ ζην ηζνέλδπκν inos παξαηεξείηαη ελεξγνπνίεζε ηεο CaM αθφκα θαη ζηελ χπαξμε κηθξψλ ζπγθεληξψζεσλ 22

23 αζβεζηίνπ (Griffith θαη Stuehr, 1995). Με άιια ιφγηα, ε δξαζηηθφηεηα ηεο ηζνκνξθήο inos δελ εμαξηάηαη απφ κεηαβνιέο ησλ επηπέδσλ ησλ ηφλησλ Ca θνπόο ηεο εξγαζίαο Ζ ζπγθεθξηκέλε κειέηε δηεξεπλά ηνλ πξνζηαηεπηηθφ ξφιν πνπ κπνξεί λα δηαδξακαηίζεη ην ζειήλην (Se) απέλαληη ζηηο ηνμηθέο επηπηψζεηο ηνπ πδξαξγχξνπ (Hg) ζε αηκνθχηηαξα ηνπ κπδηνχ Μytilus galloprovincialis. Αξρηθά, δηεξεπλήζεθε ην εχξνο ησλ ζπγθεληξψζεσλ ηνπ πδξαξγχξνπ, ζην νπνίν δελ επέξρεηαη θπηηαξηθφο ζάλαηνο (κέζνδνο νπδέηεξν εξπζξφ/neutral red uptake). ηε ζπλέρεηα, εθηηκήζεθε ε ηθαλφηεηα ηνπ πδξαξγχξνπ λα επάγεη ηε δεκηνπξγία ζνππεξνμεηδηθψλ αληφλησλ θαη ληηξηθψλ νμεηδίσλ, έηζη ψζηε λα δηεξεπλήζνπκε ηελ επαγσγή νμεηδσηηθνχ stress. Γηα ηε κειέηε ηνπ πξνζηαηεπηηθνχ ξφινπ ηνπ ζειελίνπ νη παξαπάλσ πεηξακαηηθέο δηαδηθαζίεο επαλαιήθζεθαλ ζε αηκνθχηηαξα, ηα νπνία πξνεγνπκέλσο είραλ εθηεζεί ζην ζπγθεθξηκέλν ηρλνζηνηρείν θαη ζε ζπγθεληξψζεηο κε ζαλαηνγφλεο γηα ηα θχηηαξα. 23

24 2. ΤΛΗΚΑ ΚΑΗ ΜΔΘΟΓΟΗ. 2.1 Υεκηθά θαη αληηδξαζηήξηα. Σα αληηδξαζηήξηα πνπ ρξεζηκνπνηήζεθαλ θαηά ηε δηάξθεηα ηνπ πεηξάκαηνο ήηαλ ηα εμήο: Sulfanilic acid, ρισξηνχρνο πδξάξγπξνο (HgCl 2 ), Nitroblue Tetrazolium ( NBT) απφ ηε Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), ληηξψδεο ζειήλην (Νa 2 SeO 3 ), neutral red (0.04 % θ.ν.), ληηξψδεο λάηξην, phorbol-myristate acetate (PMA), Oμηθφ νμχ,, Φσζθνξηθφ νμχ απφ ηελ Applichem (Darmstadt, Germany). Γηαιχκαηα: Alseve (ALS buffer): 20.8 g/l glucose, 8 g/l sodium citrate, 3.36 g/l EDTA θαη 22.5 g/l NaCl, ph 7 (1000 mosmol). Leibovitz L-15 medium ζην νπνίν έρνπλ πξνζηεζεί 350 mm NaCl, 7 mm KCl, 4 mm CaCl 2, 8 mm MgSO 4, 40 mm MgCl 2, 10% FCS, 100 U/ml πεληθηιίλε G, 100 κg/ml ζηξεπηνκπθίλε, 40 κg/ml gentamycin, 0.1 κg/ml amphotericin B, ζε ph 7 (1000 mosmol). Γηάιπκα νμηθνχ νμένο θαη αηζαλφιεο (1 % νμηθφ νμχ θαη 50 % αηζαλφιε). TBS (0.05Μ TRIS/HCl buffer, PH=7,6, πνπ πεξηέρεη 2% NaCl). Γηάιπκα 2M ΚΟΖ-DMSO. 2.2 πιινγή θαη δηαηήξεζε κπδηώλ. Μχδηα (5-6 cm ζε κήθνο) ζπιιέρζεθαλ απφ ηνλ θφιπν Κνληίλνβα (πεξηνρή Γαιαμεηδίνπ) θαη κεηαθέξζεθαλ ζην εξγαζηήξην φπνπ παξέκεηλαλ γηα 7 κέξεο, ρσξίο ηξνθή, ζε ελπδξεία εθνδηαζκέλα κε ιάκπα UV θαη θίιηξα θαζαξηζκνχ, ηα νπνία πεξηείραλ ηερλεηφ ζαιαζζηλφ λεξφ (35-40 αιαηφηεηα), ζηνπο 15 o C, ψζηε λα εγθιηκαηηζηνχλ ζηηο εξγαζηεξηαθέο ζπλζήθεο. Καηά ηε δηάξθεηα ηεο πεηξακαηηθήο πεξηφδνπ, ηα κχδηα ηξέθνληαλ θαζεκεξηλά κε εηδηθή ηξνθή (microencapsules Myspat, Inve Aquaculture NV, Belgium). Γελ παξαηεξήζεθε ζλεζηκφηεηα κπδηψλ θαηά ηε δηάξθεηα ηνπ εγθιηκαηηζκνχ θαη ηεο πεηξακαηηθήο πεξηφδνπ. 24

25 2.3 πιινγή αηκνιέκθνπ. Αηκφιεκθνο απφ 10 κχδηα ζπιιέρζεθε απφ ηνλ νπίζζην πξνζαγσγφ κπ κε απνζηεηξσκέλε ζχξηγγα 1 ml, 18G1/2 βειφλα, πνπ πεξηείρε 0.1 ml Alseve buffer (Δηθόλα 5). Σν θπηηαξηθφ ελαηψξεκα θπγνθεληξήζεθε ζηηο 1200 rpm, γηα 15 min, ζε ζεξκνθξαζία δσκαηίνπ. Σν ππεξθείκελν απνκαθξχλζεθε θαη ηα αηκνθχηηαξα επαλαησξήζεθαλ ζε ζξεπηηθφ δηάιπκα Leibovitz L-15 ζην νπνίν είραλ πξνζηεζεί 350 mm NaCl, 7 mm KCl, 4 mm CaCl 2, 8 mm MgSO 4, 40 mm MgCl 2, 10% FCS, 100 U/ml penicillin G, 100 κg/ml streptomycin, 40 κg/ml gedamycin, 0.1 κg/ml amphotericin B, ζε ph 7 (1000 mosmol). Σν λέν ελαηψξεκα πεξάζηεθε απφ θίιηξν 0.45 κm θαη δηαηεξήζεθε ζηνπο 15 o C ζε ζθνηεηλφ κέξνο γηα ηνπιάρηζηνλ 1 ψξα, ψζηε ηα δσληαλά αηκνθχηηαξα λα πξνζθνιιεζνχλ ζηα ηνηρψκαηα ηνπ δνθηκαζηηθνχ ζσιήλα, πξηλ ρξεζηκνπνηεζνχλ γηα ηα πεηξάκαηα. Γείγκα ηνπ αησξήκαηνο ηνπνζεηήζεθε ζε πιάθα Neubauer, φπνπ θαη κεηξήζεθαλ ηα αηκνθχηηαξα. Βξέζεθε φηη ε ζπγθέληξσζή ηνπο ήηαλ 10 6 θχηηαξα/ml κε ρξήζε Trypan blue. Δηθόλα 5. πιινγή αηκνιέκθνπ απφ ηνλ νπίζζην πξνζαγσγφ κπ ηνπ κπδηνχ κε ηε ρξήζε απνζηεηξσκέλεο ζχξηγγαο. 2.4 Δθαξκνγή ηεο κεζόδνπ εθηίκεζεο ηεο πξόζιεςεο ηεο ρξσζηηθήο νπδέηεξν εξπζξό (Neutral red uptake) ζε αηκνθύηηαξα κπδηώλ, κεηά από ηελ έθζεζή ηνπο ζε δηαθνξεηηθέο ζπγθεληξώζεηο πδξαξγύξνπ, παξνπζία ή απνπζία ζειελίνπ. Ζ κέζνδνο ησλ Gomez-Mendikute θαη ζπλ., (2002) πνπ ρξεζηκνπνηήζεθε ζηελ παξνχζα κειέηε, βαζίδεηαη ζηελ αλίρλεπζε ηεο ρξσζηηθήο νπδέηεξν εξπζξφ (neutral red) πνπ πξνζιακβάλεηαη απφ αηκνθχηηαξα κπδηνχ ηνπ είδνπο Μytilus galloprovincialis. Ζ πξφζιεςε ηεο 25

26 ρξσζηηθήο πξαγκαηνπνηείηαη απφ ηα δσληαλά θχηηαξα. Αλάινγα κε ηελ έληαζε ηεο ρξσζηηθήο πνπ έρεη πξνζιεθζεί εθηηκάηαη ε βησζηκφηεηα ησλ θπηηάξσλ κεηά απφ ηελ έθζεζή ηνπο ζε θάπνην ηνμηθφ παξάγνληα, άξα θαη επέθηαζε εθηηκάηαη θαη ε ηνμηθφηεηα ηνπ εθάζηνηε παξάγνληα (θσηνκεηξηθφο πξνζδηνξηζκφο ζε κήθνο θχκαηνο 550 nm). χκθσλα κε ηε κέζνδν, 500 κl θπηηαξηθνχ ελαησξήκαηνο εθηέζεθαλ ζε δηαθνξεηηθέο ζπγθεληξψζεηο ρισξηνχρνπ πδξαξγχξνπ (HgCl 2 5, 10, 20, 50 θαη 100 κg/l) γηα 1 ψξα. Σα αηκνθχηηαξα απηά είηε είραλ πξν-επσαζηεί κε 4 κg/l Se (ζηε κνξθή sodium selenite) γηα 15 ιεπηά (Se-treated cells), είηε φρη (Se-free cells). Μεηά ην ηέινο ηεο έθζεζεο, ην θπηηαξηθφ ελαηψξεκα θπγνθεληξήζεθε ζηηο 1200 rpm, ζηνπο 4 o C, γηα 10 min θαη απνκαθξχλζεθε πξνζερηηθά ην ππεξθείκελν. Σα θχηηαξα επαλαησξήζεθαλ ζε δηάιπκα ALS θαη παξέκεηλαλ γηα άιια 45 min ζε ζθνηεηλφ κέξνο ζηνπο 4 o C, ψζηε ηα δσληαλά θχηηαξα λα θνιιήζνπλ ζηα ηνηρψκαηα ηνπ δνθηκαζηηθνχ ζσιήλα. Μεηά ην ηέινο ηνπ ρξφλνπ, ηα κε πξνζθνιιεκέλα (λεθξά) θχηηαξα απνκαθξχλζεθαλ πξνζερηηθά κε ην άδεηαζκα ηνπ ππεξθεηκέλνπ θαη πξνζηέζεθαλ 500 κl ALS, πνπ πεξηείρε % ηεο ρξσζηηθήο neutral red. Σα δείγκαηα παξέκεηλαλ ζην ζθνηάδη ζηνπο 4 o C γηα 2 ψξεο ψζηε λα εηζρσξήζεη ε ρξσζηηθή ζηα δσληαλά θχηηαξα. Μεηά ην ηέινο ηεο έθζεζεο ην ελαηψξεκα θπγνθεληξήζεθε ζηηο 1200 rpm γηα 10 min θαη ηα θχηηαξα πιχζεθαλ 3 θνξέο κε δηάιπκα ALS ψζηε λα απνκαθξπλζνχλ ηα λεθξά θχηηαξα θαη φιε ε παξαπαλίζηα ρξσζηηθή πνπ δελ απνξξνθήζεθε. Ζ απειεπζέξσζε ηεο ρξσζηηθήο πξαγκαηνπνηήζεθε κε ηε ρξήζε δηαιχηε (1% νμηθφ νμχ θαη 50% αηζαλφιε) θαη αθνινχζεζε θσηνκέηξεζε ζηα 550 nm. Σα απνηειέζκαηα εθθξάδνληαη σο νη Μ.Ο. ± ηππηθέο απνθιίζεηο (SD) 6 δηαθνξεηηθψλ κεηξήζεσλ θαη εθθξάδνληαη σο OD 550nm /mg πξσηεΐλεο. 2.5 Πξνζδηνξηζκόο ζνππεξνμεηδηθώλ αληόλησλ (. O - 2 ) ζηα αηκνθύηηαξα ησλ κπδηώλ. Σν αληφλ ηνπ ζνππεξνμεηδίνπ ( O - 2 ) πξνζδηνξίζηεθε ζε αηκνθχηηαξα πνπ είηε είραλ εθηεζεί (Se-treated), είηε φρη (Se-free) ζε ζειήλην πξηλ ηελ έθζεζή ηνπο ζε δηαθνξεηηθέο ζπγθεληξψζεηο πδξαξγχξνπ, κηαο θαη απηά ηα αληφληα θαίλεηαη φηη παξάγνληαη θαηά ηε δηάξθεηα ηεο αλαπλεπζηηθήο έθξεμεο πνπ ιακβάλεη ρψξα ζηα αηκνθχηηαξα (Pipe, 1992) θαη εκπιέθεηαη ζηελ παξαγσγή ππεξνμεηδίνπ ηνπ πδξνγφλνπ (H 2 O 2 ), πδξνμπιηθψλ ξηδψλ (OH ) θαη ππεξνμπληηξψδνπο (ONOO - ) (Hermes-Lima θαη ζπλ., 2001; Dailianis, 2009). Ζ παξαγσγή. - O 2 κειεηήζεθε κε ηελ ηξνπνπνίεζε κηαο γλσζηήο κεζφδνπ (Pipe θαη ζπλ., 1995), κε ηε ρξήζε ηεο ρξσζηηθήο nitroblue tetrazolium (NBT). 26

27 χκθσλα κε ηε κέζνδν, 500 κl θπηηαξηθνχ αησξήκαηνο επσάζηεθαλ γηα 1 ψξα κε NBT (1mg/ml NBT ζε L-15 ζξεπηηθφ δηάιπκα) θαη δηαθνξεηηθέο ζπγθεληξψζεηο είηε ρισξηνχρνπ πδξαξγχξνπ (5, 10 θαη 20 κg/l), είηε 10 κg/ml θσξβνιεζηέξα (PMA) (δηαιπκέλν ζε DMSO). Γηα λα κπνξέζνπλ λα ζπγθξηζνχλ ηα απνηειέζκαηα κεηά ηελ επεμεξγαζία κε PMA, κεηξήζεθαλ ηα επίπεδα. - O 2 θαη ζηα θχηηαξα επεμεξγαζκέλα κε DMSO. Δπίζεο γηα λα εθηηκεζεί ε παξαγσγή. - O 2 πνπ πξνθαιείηαη απφ ηνλ Hg, κεηά ηελ επεμεξγαζία κε Se, ηα θχηηαξα πξνεπσάζηθαλ κε NBT/L-15 medium, ζην νπνίν έρνπλ πξνζηεζεί 4 κg/l Se γηα 15 min, πξηλ ηελ πξνζζήθε θαη έθζεζε ζε δηαθνξεηηθέο ζπγθεληξψζεηο πδξαξγχξνπ ζε θάζε πεξίπησζε. Μεηά ηελ έθζεζε, ηα θχηηαξα θπγνθεληξήζεθαλ ζηηο 1200 rpm γηα 10 min ζηνπο 4 o C θαη πιχζεθαλ κε 300 κl TBS (0.05M TRIS/HCl buffer, ph 7.6, πνπ πεξηείρε 2% NaCl), ψζηε λα απνκαθξπλζεί ην εμσθπηηαξηθφ NBT. Έπεηηα απφ ηελ πξνζζήθε κεζαλφιεο 70% θαη παξακνλή γηα 10 min, αθνινχζεζε θπγνθέληξεζε ησλ δεηγκάησλ ζηηο 1200 rpm (10 min, 4 o C). ην επφκελν ζηάδην ηα δείγκαηα αθέζεθαλ λα ζηεγλψζνπλ γηα 5 ιεπηά, ζε ζεξκνθξαζία δσκαηίνπ θαη ηέινο πξνζηέζεθε 1 ml δηαιχκαηνο εμαγσγήο (2M KOH-DMSO). Μεηά ηε πάξνδν 30 min, έγηλε θσηνκέηξεζε ησλ δεηγκάησλ ζηα 620 nm. Σα απνηειέζκαηα εθθξάδνληαη σο κέζνη φξνη ± ηππηθέο απνθιίζεηο (SD) 6 δηαθνξεηηθψλ κεηξήζεσλ θαη εθθξάδνληαη σο OD 620nm /mg πξσηεΐλεο. 2.6 Παξαγσγή ΝΟ ζηα αηκνθύηηαξα ησλ κπδηώλ. Ζ παξαγσγή ΝΟ κειεηήζεθε ζε αηκνθχηηαξα κπδηψλ κε ηε κέηξεζε ηεο ζπζζψξεπζεο ηνπο κε ηελ αληίδξαζε Griess (Green θαη ζπλ., 1982), κηα κέζνδν πνπ πνζνηηθνπνηεί ηα ληηξψδε αληφληα (NO - 2 ). χκθσλα κε ηε κέζνδν, 500 κl θπηηαξηθνχ αησξήκαηνο εθηέζεθαλ ζε δηαθνξεηηθέο ζπγθεληξψζεηο είηε ρισξηνχρνπ πδξαξγχξνπ (5, 10 θαη 20 κg/l), είηε 10 κg/ml PMA. Γηα λα κπνξέζνπλ λα ζπγθξηζνχλ ηα απνηειέζκαηα κεηά ηελ επεμεξγαζία κε PMA, κεηξήζεθαλ ηα - επίπεδα NO 2 θαη ζηα θχηηαξα επεμεξγαζκέλα κε DMSO. Δπίζεο γηα λα εθηηκεζνχλ ηα επίπεδα - NO 2 πνπ παξάγνληαη ιφγσ ηνπ Ζg, κεηά ηελ επεμεξγαζία ησλ θπηηάξσλ κε Se, ηα θχηηαξα πξνεπσάζηεθαλ κε 4 κg/l Se γηα 15 min (Se-treated cells) θαη κεηά εθηέζεθαλ ζε δηαθνξεηηθέο ζπγθεληξψζεηο ηνπ κεηάιινπ ζε θάζε πεξίπησζε. Σειηθά ηα δείγκαηα θπγνθεληξήζεθαλ ζηηο 1200 rpm (10 min, 4 o C) θαη ην ππεξθείκελν απνκαθξχλζεθε πξνζερηηθά. Έπεηηα, 500 κl κε 1% ζνπιθαληιηθφ νμχ ζε 5% θσζθνξηθφ νμχ πξνζηέζεθε ζε θάζε δείγκα θαη επσάζηεθαλ ζε 27

28 OD 548 nm ζεξκνθξαζία δσκαηίνπ γηα 10 min θαη ηέινο πξνζηέζεθε 500 κl 0.1% N-napthyl-ethylenediamine ζε 5 % θσζθνξηθφ νμχ. Μεηά απφ 15 min επψαζεο, κεηξήζεθε ε νπηηθή ππθλφηεηα ζηα 548 nm (Perkin Elmer 551). Ζ ζπγθέληξσζε ησλ ληηξσδψλ ζε θάζε δείγκα βξίζθεηαη κε ηε βνήζεηα πξφηππεο θακπχιεο ΝαΝΟ 3 ζπγθεληξψζεσλ πνπ θπκαίλνληαη απφ 1 έσο 100 κmol/l (Γηάγξακκα 1). Σα απνηειέζκαηα εθθξάδνληαη σο κέζνη φξνη ± ηππηθέο απνθιίζεηο (SD) 6 δηαθνξεηηθψλ κεηξήζεσλ θαη εθθξάδνληαη σο % ηεο δηαθνξάο ζε ζρέζε κε ηελ ηηκή αλαθνξάο ζε θχηηαξα ειέγρνπ (ην 100% αληηπξνζσπεχεη ηελ ηηκή αλαθνξάο πνπ αληηζηνηρεί ζε 8.135±1.31 κmol/l NO - 2 ). 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 y = 0,0165x R² = 0, NaNO 3 [μμ] ΓΗΑΓΡΑΜΜΑ 1. Πξφηππε θακπχιε ληηξηθνχ λαηξίνπ (ΝαΝΟ 3 ) γηα ηνλ ππνινγηζκφ ηεο ζπγθέληξσζεο ησλ ληηξσδψλ. 2.7 Πξνζδηνξηζκόο πξσηετλώλ. Ζ πεξηερφκελε πξσηεΐλε ζηα αηκνθχηηαξα ησλ κπδηψλ κεηξήζεθε ζχκθσλα κε ηε κέζνδν Bradford (1976) κε ηε ρξήζε Bovine Serum Albumin (BSA) σο πξφηππν (Γηάγξακκα 2). πγθεθξηκέλα 30 κl θπηηαξηθνχ αησξήκαηνο αλακηγλχνληαη κε 0,97 κl δηαιχκαηνο Bradford θαη κεηά απφ 10 ιεπηά επσάδνληαη. Αθνινπζεί κέηξεζε ζε κήθνο θχκαηνο 595 nm. 28

29 ΓΗΑΓΡΑΜΜΑ 2. Πξφηππε θακπχιε πξσηεΐλεο φπνπ δίλεηαη ε ζπγθέληξσζε ηεο πξσηεΐλεο ζην θπηηαξηθφ αηψξεκα ζε ζρέζε κε ηελ νπηηθή απνξξφθεζε ζηα 595 nm. 2.8 ηαηηζηηθή αλάιπζε απνηειεζκάησλ. Όια ηα απνηειέζκαηα εθθξάδνληαη σο κέζνη φξνη ± ηππηθέο απνθιίζεηο (SD) 6 αλεμάξηεησλ κεηξήζεσλ (θάζε πείξακα επαλαιήθζεθε έμη θνξέο, ρξεζηκνπνηψληαο αηκνθχηηαξα πνπ ζπιιέρζεθαλ απφ 10 κχδηα θάζε θνξά). Γηα ηνλ πξνζδηνξηζκφ ηεο neutral red uptake, ησλ ππεξνμεηδηθψλ αληφλησλ θαη ησλ ληηξηθψλ νμεηδίσλ, ε ζηαηηζηηθή αλάιπζε πξαγκαηνπνηήζεθε ρξεζηκνπνηψληαο ζηαηηζηηθή αλάιπζε Tukey test, p<0.05 (ANOVA), κέζσ ηνπ πξνγξάκκαηνο Graphpad Instat 3. 29

30 3. ΑΠΟΣΔΛΔΜΑΣΑ. 3.1 Δθαξκνγή ηεο Neutral red uptake ζε αηκνθύηηαξα κπδηώλ, κεηά από ηελ έθζεζή ηνπο ζε δηαθνξεηηθέο ζπγθεληξώζεηο πδξαξγύξνπ, παξνπζία ή απνπζία ζειελίνπ. Ζ κέζνδνο Neutral red uptake πνπ ρξεζηκνπνηήζεθε ζηε ζπγθεθξηκέλε κειέηε βαζίδεηαη ζηελ ελζσκάησζε ηεο ρξσζηηθήο ζηα ιπζνζψκαηα ησλ δσληαλψλ θπηηάξσλ δείρλνληαο έηζη ηνλ αξηζκφ ησλ δσληαλψλ θπηηάξσλ. χκθσλα κε ηα απνηειέζκαηα ηεο παξνχζαο κειέηεο, αηκνθχηηαξα πνπ είραλ πξν-επσαζηεί κε 4 κg/l Se δελ έδεημαλ ζηαηηζηηθψο ζεκαληηθή δηαθνξά φζνλ αθνξά ζηε βησζηκφηεηα, ζε ζρέζε κε ηα αηκνθχηηαξα πνπ δελ πξν-επσάζηεθαλ κε ζειήλην (Πίλαθαο 1). ΠΗΝΑΚΑ 1. Πξνζδηνξηζκφο ηεο πξφζιεςεο ηεο ρξσζηηθήο neutral red (NRU), ηεο παξαγσγήο ζνππεξνμεηδηθψλ αληφλησλ (. O 2 - ) θαη ληηξηθψλ νμεηδίσλ (NO 2 ) ζε αηκνθχηηαξα ειέγρνπ (Se-free cells) θαη ζε αηκνθχηηαξα πνπ εθηέζεθαλ ζε ζειήλην ηειηθήο ζπγθέληξσζεο 4 κg/l (Se-treated cells). Σα απνηειέζκαηα εθθξάδνπλ ην κέζν φξν (mean) ± ηελ ηππηθή απφθιηζε (SD), φπσο πξνθχπηεη κεηά απφ ηελ εθηέιεζε 6 αλεμάξηεησλ. ε θάζε πεηξακαηηθή δηαδηθαζία ρξεζηκνπνηήζεθαλ αηκνθχηηαξα, ηα νπνία ζπιιέρζεθαλ απφ ηελ αηκφιεκθν 10 αηφκσλ. Ζ ζηαηηζηηθή αλάιπζε ησλ ηηκψλ δελ έδσζε ζεκαληηθέο δηαθνξέο κεηαμχ ησλ θπηηάξσλ ειέγρνπ θαη ησλ θπηηάξσλ πνπ εθηέζεθαλ ζην ζειήλην (Tukey test, p<0.01). NRU *. O 2 - ** NO 2 - *** Se-free cells 2,688 ±0,60 10,551 ±3.39 8,135 ±1.31 Se-treated cells 2,554 ±0,49 10,144 ±3.19 8,434 ±1.24 * : OD 550 nm /mg πξσηετλεο ** : OD 620 nm /mg πξσηετλεο *** : κμ NO 2 - Σα θχηηαξα πνπ δελ πξν-επσάζηεθαλ κε ζειήλην θαη πνπ εθηέζεθαλ ζε 5 κg/l Hg έδεημαλ κηα κηθξή αιιά φρη ζεκαληηθή κείσζε βησζηκφηεηαο, ελψ ζεκαληηθή κείσζε ηεο βησζηκφηεηαο παξαηεξήζεθε κεηά απφ ηελ έθζεζε ησλ θπηηάξσλ ζε Hg 10 κg/l, πνπ αθνινπζήζεθε απφ 30

31 OD 540 nm/mg protein πεξεηαίξσ κείσζε ηεο βησζηκφηεηαο, πξνθαινχκελε απφ ηηο ηνμηθέο επηπηψζεηο πςειφηεξσλ ζπγθεληξψζεσλ Hg πνπ ρξεζηκνπνηήζεθαλ ζηε ζπγθεθξηκέλε κειέηε ( κg/l), (Γηάγξακκα 3). 3,5 3 2,5 2 1,5 1 Se-treated cells * * * 0,5 Se-free cells * Hg [μg/l] ΓΗΑΓΡΑΜΜΑ 3. Δθηίκεζε ηεο θπηηαξηθήο βησζηκφηεηαο κε ηε ρξήζε ηεο κεζφδνπ neutral red assay ζε αηκνθχηηαξα πνπ είηε έρνπλ πξν-επεμεξγαζηεί, είηε φρη κε ζειήλην θαη εθηεζεηκέλα ζε δηαθνξεηηθέο ζπγθεληξψζεηο πδξαξγχξνπ (5-100 κg/l). Σα απνηειέζκαηα εθθξάδνληαη σο κέζνη φξνη ± ηππηθέο απνθιίζεηο (SD) 6 δηαθνξεηηθψλ κεηξήζεσλ. ε θάζε πεηξακαηηθή δηαδηθαζία ρξεζηκνπνηήζεθαλ αηκνθχηηαξα, ηα νπνία ζπιιέρζεθαλ απφ ηελ αηκφιεκθν 10 αηφκσλ. Οη αζηεξίζθνη (*) ππνδειψλνπλ ζηαηηζηηθψο ζεκαληηθή δηαθνξά απφ ηελ ηηκή control, ππνδειψλνπλ ζηαηηζηηθψο ζεκαληηθή δηαθνξά κεηαμχ θπηηάξσλ εθηεζεηκέλσλ ζε δηαθνξεηηθέο ζπγθεληξψζεηο HgCl 2 (5, 10, 20, 50 and 100 κg/l) θαη θπηηάξσλ πξν-επεμεξγαζκέλσλ κε and 4 κg/l Se (Se-treated cells) πξηλ ηελ έθζεζή ηνπο ζηηο πξναλαθεξζείζεο ζπγθεληξψζεηο HgCl 2 (Tukey test, p<0.01). Απφ ηελ άιιε πιεπξά, θχηηαξα πνπ πξν-επσάζηεθαλ κε ζειήλην, έδεημαλ ζεκαληηθή αληίζηαζε ζηα ηνμηθά θαηλφκελα ηνπ κεηάιινπ. πγθεθξηκέλα παξαηεξήζεθε ζεκαληηθή δηαηήξεζε ηεο βησζηκφηεηαο ησλ θπηηάξσλ πνπ εθηέζεθαλ ζε θπηηαξνηνμηθέο ζπγθεληξψζεηο ηνπ κεηάιινπ ( κg/l), ζε επίπεδα παξφκνηα κε απηά θπηηάξσλ πνπ δελ είραλ εθηεζεί ζην κέηαιιν ζηελ θάζε πεξίπησζε (Γηάγξακκα 3). 31

32 Οη θπηηαξνηνμηθέο επηπηψζεηο ηνπ Hg θαίλεηαη λα μεθηλνχλ ζε ζπγθεληξψζεηο απφ κg/l, θαζψο 4 κg/l Se ζηα αηκνθχηηαξα αλαζηέιιεη ηηο θπηηαξνηνμηθέο επηπηψζεηο ηνπ κεηάιινπ, ρσξίο λα επεξεάδεη ηε βησζηκφηεηα ηνπο. Οπφηε ζην πείξακα ρξεζηκνπνηήζεθαλ νη ζπγθεθξηκέλεο ζπγθεληξψζεηο, γηα ηελ εθηίκεζε ηεο ηθαλφηεηαο ηνπ Hg λα επάγεη νμεηδσηηθά θαηλφκελα, φπσο ηελ παξαγσγή ππεξνμεηδηθψλ αληφλησλ ( O - 2 ) θαζψο θαη (NO). 3.2 Πξνζδηνξηζκόο ζνππεξνμεηδηθώλ αληόλησλ (. O - 2 ) ζηα αηκνθύηηαξα ησλ κπδηώλ. Αηκνθχηηαξα πνπ εθηέζεθαλ ζε ηνμηθέο ζπγθεληξψζεηο Hg, αιιά θαη θχηηαξα πνπ εθηέζεθαλ ζηνλ θσξβνιεζηέξα PMA (10 κg/ml) έδεημαλ απμεκέλα επίπεδα παξαγσγήο - O 2, ζπγθξηλφκελα κε ηα θχηηαξα control θαη κε ηα θχηηαξα πνπ επσάζηεθαλ κε DMSO, ελψ ηα ηειεπηαία δελ έδεημαλ ζεκαληηθέο δηαθνξέο ζε ζρέζε κε ηα Se-free θχηηαξα (Πίλαθαο 2 ). Πίλαθαο 2. Πξνζδηνξηζκφο ηεο παξαγσγήο ζνππεξνμεηδηθψλ αληφλησλ (. O - 2 ) θαη ληηξηθψλ νμεηδίσλ (NO - 2 ), ζε αηκνθχηηαξα κεηά ηελ έθζεζή ηνπο ζην θσξβνι-εζηέξα ΡΜΑ (10 κg/ml) γηα 1 h. Δπηπιένλ, ηα θχηηαξα εθηέζεθαλ γηα ηε ζπγθεθξηκέλε ρξνληθή πεξίνδν ζε DMSO, ν νπνίνο απνηειεί ην κέζν δηάιπζεο ηνπ θσξβνι-εζηέξα. Σα απνηειέζκαηα εθθξάδνπλ ην κέζν φξν (mean) ± ηελ ηππηθή απφθιηζε (SD), φπσο πξνθχπηεη κεηά απφ ηελ εθηέιεζε 6 αλεμάξηεησλ πεηξακάησλ γηα θάζε κέηξεζε. ε θάζε πεηξακαηηθή δηαδηθαζία ρξεζηκνπνηήζεθαλ αηκνθχηηαξα, ηα νπνία ζπιιέρζεθαλ απφ ηελ αηκφιεκθν 10 αηφκσλ. Οη ηηκέο πνπ θέξνπλ φκνην εθζέηε παξνπζηάδνπλ ζεκαληηθή ζηαηηζηηθή δηαθνξά κεηαμχ ηνπο, φπσο πξνέθπςε κεηά απφ ζηαηηζηηθή επεμεξγαζία ησλ απνηειεζκάησλ (Tukey test, p<0.01). NRU *. - ** - *** O 2 NO 2 control cells 2,688 ± ,551 ±3.39 e 8,135 ±1.31 c DMSO-treated cells 14,153 ±2.25 b 8,200 ±0.70 d 10 κg/ml PMA-treated cells 46,71 ±10.07 a,b 13,887 ±1.45 c,d * : OD 550 nm /mg πξσηετλεο ** : OD 620 nm /mg πξσηετλεο *** - : κμ NO 2 32

33 OD 620 nm/mg protein Se-free cells Se-treated cells * 40 * control Hg [μg/l] ΓΗΑΓΡΑΜΜΑ 4. Παξαγσγή ζνππεξνμεηδηθψλ αληφλησλ (. O 2 - ) ζε αηκνθχηηαξα πνπ είηε έρνπλ πξν-επεμεξγαζηεί, είηε φρη κε ζειήλην θαη εθηεζεηκέλα ζε δηαθνξεηηθέο ζπγθεληξψζεηο πδξαξγχξνπ (5-100 κg/l) γηα 1h. Σα απνηειέζκαηα εθθξάδνληαη σο κέζνη φξνη ± ηππηθέο απνθιίζεηο (SD) 6 δηαθνξεηηθψλ κεηξήζεσλ. ε θάζε πεηξακαηηθή δηαδηθαζία ρξεζηκνπνηήζεθαλ αηκνθχηηαξα, ηα νπνία ζπιιέρζεθαλ απφ ηελ αηκφιεκθν 10 αηφκσλ. Οη αζηεξίζθνη (*) ππνδειψλνπλ ζηαηηζηηθψο ζεκαληηθή δηαθνξά απφ ηελ ηηκή control, ππνδειψλνπλ ζηαηηζηηθψο ζεκαληηθή δηαθνξά κεηαμχ θπηηάξσλ εθηεζεηκέλσλ ζε δηαθνξεηηθέο ζπγθεληξψζεηο HgCl 2 (5, 10, 20 κg/l). Απφ ηελ άιιε πιεπξά, ην Se δε θάλεθε λα επάγεη ηελ παξαγσγή - O 2 ηνπιάρηζηνλ ζηε ζπγθέληξσζε πνπ ρξεζηκνπνηήζεθε ζηελ παξνχζα κειέηε (Πίλαθαο 1). εκαληηθά απμεκέλα επίπεδα -, O 2 παξαηεξήζεθαλ ζε θχηηαξα ηα νπνία εθηέζεθαλ ζε κg/l Hg, ελψ ζε θχηηαξα πνπ πξν-επσάζηεθαλ κε Se θάλεθε ζεκαληηθή κείσζε ηεο ηθαλφηεηαο ηνπ κεηάιινπ λα επάγεη ηελ παξαγσγή - O 2 ( Γηάγξακκα 4). 3.3 Παξαγσγή ΝΟ ζηα αηκνθύηηαξα ησλ κπδηώλ κεηά από έθζεζή ηνπο ζε Hg. χκθσλα κε ηα απνηειέζκαηα ηεο παξνχζαο κειέηεο, δελ παξαηεξήζεθε ζεκαληηθή δηαθνξά ζηελ παξαγσγή ληηξσδψλ (NO - 2 ), κεηαμχ αηκνθπηηάξσλ πνπ είηε είραλ, είηε φρη, πξνεπεμεξγαζηεί κε ζειήλην θαη δελ εθηέζεθαλ ζε Hg (Πίλαθαο 1). Απφ ηε άιιε πιεπξά, ηα κε πξν-επεμεξγαζκέλα κε ζειήλην θχηηαξα, πνπ εθηέζεθαλ ζε PMA (10 κg/l), έδεημαλ ζεκαληηθά 33