ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ-ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΑΚΤΙΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΦΟΙΤΗΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ-ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΑΚΤΙΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΦΟΙΤΗΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΥΠΕΥΘΥΝΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Δρ. Κωνσταντίνος Ε. Βοργιάς ΑΘΗΝΑ 2010

2 Κανόνες ασφαλείας εργαστηρίου του Τµήµατος Βιολογίας Στο εργαστήριο πρέπει απαραιτήτως να φοράτε εργαστηριακή ποδιά η οποία να είναι καθαρή. Πλένετε πάντοτε τα χέρια σας µε σαπούνι και νερό πριν την εργαστηριακή σας δραστηριότητα και µετά το πέρας αυτής. Τα χέρια πρέπει επίσης να απολυµαίνονται µε αµέσως µετά την επαφή µε µικροβιακό υλικό. Απαγορεύεται να τρώτε, να πίνετε και να καπνίζετε στους εργαστηριακούς χώρους. Απαγορεύεται να µασάτε τσίχλες. Τέλος απαγορεύεται η φύλαξη τροφίµων στα ψυγεία που περιέχουν εργαστηριακό υλικό. Μή φοράτε φακούς επαφής και -αν είναι ανάγκη- φοράτε γυαλιά ασφαλείας. Απαγορεύεται η χρήση καλλυντικών εντός των εργαστηρίων. Φοράτε γάντια όταν αυτό είναι απαραίτητο. Ακόµα και µε τα γάντια πρέπει να προσέχετε ώστε ο χώρος και οι συσκευές να διατηρούνται καθαρές. Είναι απαραίτητο ο πάγκος εργασίας να είναι πάντοτε καθαρός και τακτικός. Όσοι ασχολείστε µε µικροβιολογία πρέπει πριν και µετά από κάθε πειραµατική εργασία να κάνετε απολύµανση. Εάν πέσει κάποιο τοξικό υλικό στο πάγκο σας τότε αυτός πρέπει άµεσα να καθαριστεί. Στο τέλος της εργασίας να πλένετε όλα τα υαλικά που χρησιµοποιήσατε κατά τη διάρκεια της ηµέρας. Όλη η πειραµατική εργασία πρέπει να είναι τόσο καλά οργανωµένη πριν από την έναρξή της ώστε να ελαχιστοποιεί πιθανούς κινδύνους ατυχήµατος. Διαβάζετε προσεκτικά τις ετικέτες των διαφόρων χηµικών αντιδραστηρίων και χειρίζεστε αυτά σύµφωνα µε τις υποδείξεις της εταιρείας παραγωγής τους ή τις οδηγίες του υπευθύνου του εργαστηρίου. Η χρήση εύφλεκτων, πτητικών, διαβρωτικών ή τοξικών οργανικών ουσιών (µεθανόλη, αιθανόλη, ισοπροπανόλη, ακρυλαµίδη, φαινόλη, χλωροφόρµιο, τολουόλιο, ξυλόλη κλπ.) ή διαλυµάτων που αναθυµιάζουν (πυκνά διαλύµατα οξέων ή βάσεων π.χ. υδροχλωρικό οξύ, θειικό οξύ, νιτρικό οξύ, οξικό οξύ, καυστικό νάτριο, καυστικό κάλιο) πρέπει να γίνεται πάντοτε στους απαγωγούς. Μη χρησιµοποιείται το στόµα σας για να αναρροφήσετε διαλύτες µε σιφώνιο. Χρησιµοποιείτε αυτόµατα σιφώνια ή πουάρ. Όταν κάνετε αραιώσεις οξέων πάντα να προσθέσετε το οξύ στο νερό. Ποτέ µη δοκιµάζετε ή µυρίζετε ένα αντιδραστήριο ή χηµική ουσία. Η χρήση του λύχνου BUNSEN πρέπει να γίνεται µε προσοχή και να επιβεβαιώνεται η διακοπή της παροχής του αερίου µετά το κλείσιµο του ii

3 λύχνου. Μη χρησιµοποιείτε φλόγα παρά µόνο όταν σας το πει ο υπεύθυνος του εργαστηρίου. Μη επιστρέφετε χηµικά αντιδραστήρια στις φιάλες τους. Προσπαθήστε να παίρνετε από τις φιάλες ακριβώς την ποσότητα που χρειάζεστε. Βάζετε πάντοτε ετικέτες που περιγράφουν το περιεχόµενο των δοκιµαστικών σωλήνων ή φιαλών που χρησιµοποιείτε κατά τον πειραµατισµό σας. Μη ρίχνετε στην αποχέτευση αντιδραστήρια και άχρηστα χηµικά, εκτός αν ρητά σας το έχει επιτρέψει ο υπεύθυνος του εργαστηρίου. Μη πετάτε ποτέ µικροβιακό υλικό χωρίς να το έχετε αποστειρώσει. Τα σιφώνια, µετά από τη χρήση τους, πρέπει να τοποθετούνται πρώτα στα ειδικά δοχεία µε το απολυµαντικό και µετά να προωθούνται στις ειδικές συσκευές πλυσίµατος. Να γνωρίζετε τη θέση του πυροσβεστήρα και να έχετε από πριν µάθει τη χρήση του. Πετάτε τα σπασµένα υαλικά σε ειδικά δοχεία απορριµάτων. Όλοι οι µεταλλικοί κύλινδροι που έχουν ύψος µεγαλύτερο από 1 µέτρο και περιέχουν αέριο υπό πίεση µεγαλύτερη από 100lbs/in2 πρέπει να µεταφέρονται µε ειδικά τρόλει. Οι κύλινδροι αυτοί, εφ όσον χρησιµοποιούνται µέσα σε εργαστήρια πρέπει να στηρίζονται µε µια ζώνη τοποθετηµένη στοπάνω 1/4 του κυλίνδρου. Κατά τη µεταφορά πρέπει να αφαιρούνται οι ρυθµιστές πίεσης και οι κύλινδροι να εξασφαλίζονται µε το κάλυµα ασφαλείας. Πάντοτε να ενηµερώνετε τον υπεύθυνο του εργαστηρίου όταν συµβεί να σπάσει κάποιο θερµόµετρο. Ποτέ µην προσπαθείτε να µαζέψετε τον υδράργυρο µόνοι σας. Να ειδοποιείτε τον υπεύθυνο του εργαστηρίου για οποιαδήποτε ατύχηµα. Όλα τα ατυχήµατα και τα περιστατικά που συµβαίνουν στο εργαστήριο πρέπει να καταγράφονται και να αποσαφηνίζονται τα αίτια που τα προκάλεσαν, ώστε να γίνεται στο µέλλον ευκολότερη η πρόληψή τους. iii

4 Κανονισµός λειτουργίας του Εργαστηρίου Βιοχηµείας 1. Το µάθηµα της Βιοχηµείας περιλαµβάνει εκτός των παραδόσεων και εργαστηριακές ασκήσεις που γίνονται συµφωνα µε το χρονοδιάγραµµα το οποίο αναρτάται έγκαιρα στον Πίνακα Ανακοινώσεων του Εργαστηρίου Βιοχηµείας. 2. Η παρουσία των φοιτητών στα εργαστήρια είναι υποχρεωτική για όλες τις ασκήσεις. Δεν υπάρχει δικαίωµα απουσίας σε καµµία άσκηση. 3. Σε εξαιρετική περίπτωση που κάποιος φοιτητής/τρια δεν ασκηθεί σε κάποια άσκηση για κάποιο πολύ σοβαρό λόγο είναι υποχρεωµένος/η να καταθέσει αµέσως στην Γραµµατεία του Τοµέα τα σχετικά δικαιολογητικά, προκειµένου να εξεταστεί η πιθανότητα αναπλήρωσης της άσκησης που χάθηκε. 4. Προτάσεις για αµοιβαίες αλλαγές τµηµάτων είναι δυνατόν να γίνουν µέσα σε ένα τριήµερο από την ανάρτηση των τµηµάτων µε τα ονόµατα των φοιτητών. Μετά την διαµόρφωση των οριστικών τµηµάτων δεν γίνονται σε καµµία περίπτωση αλλαγές στα τµήµατα. 5. Κατά την διάρκεια διεξαγωγής της άσκησης οι φοιτητές πρέπει υποχρεωτικά να φορούν την εργαστηριακή µπλούζα. Δεν επιτρέπεται επίσης να εξέρχονται από την αίθουσα για κανένα λόγο χωρίς την άδεια του υπευθύνου της άσκησης. 6. Η προσέλευση των φοιτητών στο εργαστήριο και η προετοιµασία της θέσης εργασίας κάθε οµάδας πρέπει να γίνεται κατά την διάρκεια του ακαδηµαικού τετάρτου και οπωσδήποτε πρίν από την έναρξη της παράδοσης. Όλα τα γυάλινα σκεύη που χρησιµοποιήθηκαν κατά την άσκηση πρέπει να ξεπλένονται καλά µε νερό της βρύσης και να τοποθετούνται στα ειδικά πλαστικά δοχεία που υπάρχουν στο εργαστήριο, έτσι ώστε η κάθε θέση εργασίας να παραδίδεται καθαρή και τακτοποιηµένη µετά το τέλος της άσκησης. 7. Οι φοιτητές είναι υποχρεωµένοι να έχουν µελετήσει προσεκτικά το εργαστηριακό φυλλάδιο και να ακολουθούν τις οδηγίες που δίδονται από τον υπεύθυνο του εργαστηρίου για την ορθή και ασφαλή διεξαγωγή των πειραµάτων της άσκησης. Πρέπει επίσης να έχουν µαζί τους υαλογραφικό µαρκαδόρο, αριθµοµηχανή, µιλιµετρέ χαρτί και ότι άλλο απαιτείται για την επεξεργασία των αποτελεσµάτων του κάθε πειράµατος. 8. Τα κινητά πρέπει επίσης να είναι απενεργοποιηµένα µέσα στο εργαστήριο. iv

5 Περιεχόµενα 1. Δείκτες, δείκτες, µέτρηση του ph, παρασκευή ρυθµιστικών διαλυµάτων, καµπύλες τιτλοδότησης 1.1 Σκοπός της άσκησης 1.2 Εισαγωγή-Θεωρητικό Μέρος Προσδιορισµός της περιεκτικότητας ενός διαλύµατος-τιτλοδότηση Δείκτες Μέτρηση του ph. Αρχή και λειτουργία του ηλεκτροδίου υάλου Διάσταση ασθενών οξέων και βάσεων, ορισµός pka Ρυθµιστικά συστήµατα - Εξίσωση Henderson-Hasselbach Όξινες και βασικές ιδιότητες των αµινοξέων pk τιµές των οµάδων που ιονόζονται σε πρωτείνες 1.3 Τιτλοδότηση διαλυµάτων µε χρήση δεικτών Σκοπός πειράµατος Εκτέλεση 1.4 Κατασκευή καµπύλης τιτλοδότησης Σκοπός πειράµατος Εκτέλεση 1.5 Παρασκευή Ρυθµιστικού Διαλύµατος-Μέτρηση ph Σκοπός πειράµατος - Θεωρητικό Μέρος Υπολογισµοί Εκτέλεση 2. Αµινοξέα 2.1 Σκοπός της άσκησης 2.2 Εισαγωγή-Θεωρητικό Μέρος Γενικά περί αµινοξέων Κατάταξη των αµινοξέων Χηµικές ιδιότητες-γενικές αντιδράσεις των αµινοξέων Αντιδράσεις καρβοξυλοµάδας Αντιδράσεις αµινοµάδας Αντιδράσεις πλευρικής αλυσίδας Διαχωρισµός αµινοξέων 2.3 Αύξηση της οξύτητας ενός αµινοξέος µετά από δέσµευση της αµινοµάδας Σκοπός πειράµατος Εκτέλεση 2.4 Χαρακτηριστικές αντιδράσεις ανίχνευσης αµινοξέων v

6 2.4.1 Αντίδραση Νινυδρίνης Σκοπός πειράµατος Εκτέλεση Αντίδραση Ξανθοπρωτείνης Σκοπός πειράµατος Εκτέλεση Αντίδραση Κυστείνης (Arnold) Σκοπός πειράµατος Εκτέλεση Αντίδραση Αργινίνης (Sakaguchi) Σκοπός πειράµατος Εκτέλεση Αντίδραση Τρυπτοφάνης (Hopkin-Cole) Σκοπός πειράµατος Εκτέλεση 2.5 Διαχωρσιµός µείγµατος αµινοξέων σε χρωµατογραφία στήλης Γενικά Προετοιµασία της ρητίνης και της στήλης Εκτέλεση χρωµατογραφίας Προσδιορισµός αµινοξέων 3. Πρωτείνες 3.1 Σκοπός της άσκησης 3.2 Εισαγωγή-Θεωρητικό Μέρος Γενικά περί πρωτεινών Ταξινόµηση των πρωτεινών Δοµή των πρωτεινών Ιδιότητες των πρωτεινών Αποδιάταξη και µετουσίωση των πρωτεινών Μηχανισµοί δράσης των διαφόρων αποδιατακτικών παραγόντων των πρωτεϊνών Αναγωγικοί παράγοντες Μηχανισµός χηµικής αποδιάταξης πρωτεϊνών σε ισχυρά όξινο περιβάλλον Μηχανισµός χηµικής αποδιάταξης πρωτεϊνών µε χαοτροπικούς παράγοντες Μηχανισµός αποδιάταξης πρωτεϊνών µε µηχανική κατεργασία Μηχανισµός αποδιάταξης πρωτεϊνών µε πίεση Μηχανισµός αποδιάταξης πρωτεϊνών µε θερµική κατεργασία vi

7 Μηχανισµός αποδιάταξης πρωτεϊνών σε µεσοαφάσεις διαλυµάτων Μηχανισµός αποδιάταξης πρωτεϊνών µε απορρυπαντικά Μηχανισµός αποδιάταξης πρωτεϊνών σε οργανικούς διαλύτες Καθαρισµός, αποµόνωση και χαρακτηρισµός πρωτεινών 3.3 Αντίδραση διουρίας Σκοπός πειράµατος Εκτέλεση 3.4 Αποδιάταξη πρωτεινών µε θέρµανση. Συσσωµάτωση αποδιατεταγµένης πρωτείνης Σκοπός πειράµατος Εκτέλεση 3.5 Σουλφυδρυλικές οµάδες στην φυσική και αποδιατεταγµένη ωαλβουµίνη Σκοπός πειράµατος Εκτέλεση 3.6 Καταβίθυση πρωτεινών µε τριχλωροξικό οξύ Σκοπός πειράµατος Εκτέλεση 3.7 Ποσοτικός προσδιορισµός πρωτεϊνών Μέθοδος Bradord Παραγωγή της πρότυπης καµπύλης αναφοράς Εκτέλεση Προσδιορισµός απορρόφησης πρωτείνης και ποσοτικός προσδιορισµός σε µήκος κύµατος 280 nm Παράδειγµα 3.8 Hλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωµα πολυακρυλαµίδης παρουσία SDS (αποδιατακτική ηλεκτροφόρηση) Κατασκευή πηκτώµατος Προετοιµασία των δειγµάτων για ηλεκτροφόρηση Χρώση των ηλεκτροφορηµάτων 4. Ένζυµα 4.1 Σκοπός της άσκησης 4.2 Εισαγωγή-Θεωρητικό Μέρος Γενικά περί ενζύµων Εξειδίκευση των ενζύµων Κατάταξη των ενζύµων Ενεργό κέντρο των ενζύµων Ρύθµιση της δράσης των ενζύµων vii

8 4.2.6 Ποσοτικός προσδιορισµός ενζύµων Δραστικότητα ενζύµων Κινητική ενζυµικών αντιδράσεων Μαθηµατική παραγωγή της εξίσωσης Michaelis-Menten Ποιές είναι οι υποθέσεις και παραδοχές που έγιναν για την παραγωγή της εξίσωσης των Michaelis-Menten Ποιά είναι η φυσική σηµασία των σταθερών K m και V max Μορφές γραφικής παράστασης της εξίσωσης των Michaelis- Menten Διάγραµµα Lineweaver-Burk Διάγραµµα Hanes Διάγραµµα Hofstee Γιατί χρησιµοποιούµε διαφορετικές µαθηµατικές µεθόδους υπολογισµού των V max και K m Τύποι ενζυµικής αναστολής Μη αντιστρεπτή Αντιστρεπτή Συναγωνιστική αναστολή (competitive) Μη συναγωνιστική αναστολή (no competitive) Ασυναγώνιστη αναστολή (un competitive) Επίδραση του ph στην ταχύτητα Επίδραση της θερµοκρασίας στην ταχύτητα Επίδραση της συγκέντρωσης του ενζύµου 4.3 Γενικά 4.4 Καµπύλη αναφοράς για τον προσδιορισµό της π-νιτροφαινόλης Σκοπός πειράµατος Εκτέλεση 4.5 Καταλυτική δράση της φωσφατάσης Εκτέλεση 4.6 Κινητική της δραστικότητας της φωσφατάσης συναρτήσει του χρόνου επώασης Σκοπός πειράµατος Εκτέλεση 4.7 Προσδιορισµός του αρίστου ph δράσης της φωσφατάσης Εκτέλεση 5. Υδατάνθρακες και σάκχαρα 5.1 Σκοπός της άσκησης 5. 2 Εισαγωγή-Θεωρητικό Μέρος Γενικά περί υδατανθράκων viii

9 Κατηγορίες υδατανθράκων Ονοµατολογία υδατανθράκων Μονοσακχαρίτες Τριόζες Τετραόζες Πεντόζες Εξόζες Αναγωγικά και µη αναγωγικά σάκχαρα α- και β- σάκχαρα Παράγωγα υδατανθράκων Γλυκοζίτες Μεθυλοσάκχαρα Αµινοσάκχαρα Φωσφοσάκχαρα Εναντιοµερή σάκχαρα Διαστερεοµερή σάκχαρα Επιµερή σάκχαρα Αντιδράσεις επιµερισµού και αντικατάστασης Oξείδωση του C 6 στο µόριο της γλυκόζης Δισακχαρίτες και ολιγοσακχαρίτες Πολυσακχαρίτες Aποθηκευτικοί πολυσακχαρίτες Άµυλο Γλυκογόνο Δοµικοί πολυσακχαρίτες Κυτταρίνη Χιτίνη Ετεροπολυσακχαρίτες Γλυκοπρωτείνες Σάκχαρα και οµάδες αίµατος 5.3 Αντίδραση Molish Σκοπός πειράµατος Εκτέλεση ix

10 5.4 Αντίδραση Benedict Σκοπός πειράµατος Εκτέλεση 5.5 Αντίδραση Barfoed (τροποποιηµένη κατά Tauber-Kleiner) Σκοπός πειράµατος Εκτέλεση 5.6 Αντίδραση Seliwanoff Σκοπός πειράµατος Εκτέλεση 5.7 Αντίδραση Bial Σκοπός πειράµατος Εκτέλεση 5.8 Υδρόλυση αµύλου µε HCl Σκοπός πειράµατος Εκτέλεση 5.9.Προσδιορισµός αγνώστου διαλυµάτος σακχάρων Σκοπός πειράµατος Εκτέλεση Τελικό αποτέλεσµα και αιτιολόγηση Περιγραφή µιας επιστηµονικής εργασίας x