(ή πώς να αποµονώσετε όποιο γονίδιο θέλετε από οποιονδήποτε οργανισµό)

Transcript

1 (ή πώς να αποµονώσετε όποιο γονίδιο θέλετε από οποιονδήποτε οργανισµό) [ΣYMBAΣEIΣ KAI ΣYNTMHΣEIΣ: Oταν γράφουµε µια αλληλουχία νουκλεϊκού οξέος, την γράφουµε πάντα από το 5' προς το 3' άκρο, αλλιώς σηµαδεύουµε τα άκρα µε τα αντίστοιχα σύµβολα. Oταν πρόκειται για DNA αρκεί να γράψουµε την µία αλυσίδα, αφού η άλλη είναι αναγκαστικά η συµπληρωµατική της. Aν γράψουµε και τις δύο, παρουσιάζουµε την πάνω µε την συµβατική κατεύθυνση (5' προς 3') και την κάτω αντίστροφα. bp = base pair (µέτρο µήκους DNA) / nt = nucleotide (µέτρο µήκους µονόκλωνου νουκλ. οξέος) kb = kilobase = 1000 bp ή 1000 nt, ανάλογα µε το νουκλ. οξύ ss = single stranded = µονόκλωνο / ds = double stranded = δίκλωνο] Oι µέθοδοι που θα αναφέρουµε αναπτύχθηκαν κατά την δεκαετία του 1970 σαν αποτέλεσµα της µελέτης της ενζυµολογίας των λειτουργιών του DNA στα βακτήρια. O όρος ανασυνδυασµένο DNA υποδηλώνει ένα µόριο DNA αποτελούµενο από δύο (ή περισσότερα) ξένα µεταξύ τους τµήµατα ενωµένα σε µια συνεχή αλυσίδα µε in vitro διεργασίες. H τεχνολογία αυτή µας επιτρέπει την αποµόνωση, ταυτοποίηση και πολλαπλασιασµό οποιουδήποτε τµήµατος DNA ενός οργανισµού. MEPIKEΣ ΦYΣIKOXHMIKEΣ I IOTHTEΣ TOY DNA H τεχνολογία ανασυνδυασµένου DNA βασίζεται σε µεγάλο βαθµό στο γεγονός ότι τα νουκλεϊκά οξέα δηµιουργούν δίκλωνα µόρια όπου οι δύο συµπληρωµατικές αντιπαράλληλες αλυσίδες κρατούνται συστοιχισµένες µέσω υδρογονοδεσµών µεταξύ των αντιστοίχων βάσεων της κάθε αλυσίδας. Tα συµπληρωµατικά ζεύγη βάσεων είναι: A-T (2 υδρογονοδεσµοί ανά ζεύγος) G-C (3 υδρογονοδεσµοί ανά ζεύγος) Θερµική τήξη του DNA συµβαίνει όταν οι υδρογονοδεσµοί αυτοί διασπώνται και το δίκλωνο (ds) µόριο µετατρέπεται σε δύο µονόκλωνα (ss). H θερµοκρασία στην οποία το µισό ενός δείγµατος DNA βρίσκεται σε µονόκλωνη και το άλλο µισό σε δίκλωνη µορφή λέγεται θερµοκρασία τήξης. Oσο αυξάνεται το ποσοστό GC ενός µορίου DNA, τόσο αυξάνεται και η θερµοκρασία τήξης του, επειδή οι περισσότεροι υδρογονοδεσµοί απαιτούν µεγαλύτερη ενέργεια για την διάσπασή τους. Συµπληρωµατικές µονόκλωνες αλυσίδες νουκλεϊκών οξέων µπορούν να ανασυστοιχισθούν και να σχηµατίσουν δίκλωνο νουκλεϊκό οξύ όταν η θερµοκρασία 1

2 µειωθεί κάτω από την θερµοκρασία τήξης. Aυτή η υβριδοποίηση µπορεί να λάβει χώρα ανάµεσα σε δύο ss µόρια DNA, δύο ss µόρια RNA ή και µεταξύ ενός ssdna και του συµπληρωµατικού του ssrna (όπου συµµετέχει RNA, η ουρακίλη παίζει τον ρόλο της αντίστοιχης θυµίνης του DNA). Πρώτα δυό λόγια για το πώς αποµόνωναν ορισµένες αλληλουχίες DNA πριν από την άφιξη των µεθόδων κλωνοποίησης (εναλλακτικός όρος για την δηµιουργία ανασυνδυασµένου DNA): AΠOMONΩΣH EI IKΩN AΛΛHΛOYXIΩN NOYKΛEΪKΩN OΞEΩN 1. Mόρια µε διαφορετική πυκνότητα (buoyant density) από το υπόλοιπο του γονιδιώµατος αποµονώνονται σε κλίσεις χλωριούχου καισίου (σχηµατίζουν ζώνη σε διαφορετικό σηµείο από το µεγαλύτερο µέρος του DNA). Eτσι αποµονώθηκε το δορυφορικό DNA ανωτέρων οργανισµών = γενωµικά τµήµατα αποτελούµενα από πολλές επαναλήψεις µικρής αλληλουχίας. Oταν η συγκεκριµµένη µονάδα επανάληψης έχει ποσοστό GC διαφορετικό από τον µέσο όρο του γονιδιώµατος, η πυκνότητα του δορυφόρου απέχει σηµαντικά από την µέση πυκνότητα. Mία παραλλαγή αυτής της µεθόδου χρησιµοποιεί κλίσεις CsCl στην παρουσία βρωµιούχου αιθιδίου, ενός µορίου που δένεται µε το DNA διεισδύοντας ανάµεσα από συνεχόµενες βάσεις, κάτι που έχει σαν αποτέλεσµα την µείωση της πυκνότητας του συµπλόκου. Για να εισχωρήσει το αιθίδιο σε µία διπλή έλικα, πρέπει να υπάρχει ευχέρεια για µερικό ξετύλιγµα της έλικας, κάτι που είναι πιο εφικτό για ευθύγραµµα DNA παρά για κύκλους. Eτσι µε την προσθήκη βρωµιούχου αιθιδίου, τυχόντα κυκλικά DNA διαχωρίζονται από ευθύγραµµα, ως πιο πυκνά. Mεγάλοι κύκλοι,όπως το βακτηριακό χρωµόσωµα, τεµαχίζονται στην διαδικασία της αποµόνωσης δείγµατος και έτσι συµπεριφέρονται σαν ευθύγραµµο DNA. Mε αυτή την µέθοδο αποµονώθηκαν βακτηριακά πλασµίδια, όπως και το γονιδίωµα µιτοχονδρίων και χλωροπλαστών. 2. Eπαναλαµβανόµενο DNA, π.χ. το προαναφερµένο δορυφορικό DNA. Oταν συνολικό γενωµικό DNA τηχθεί και µετά του επιτραπεί να ανασυστοιχισθεί, οι επαναλαµβανόµενες αλληλουχίες ανασυστοιχίζονται µε πολύ ταχύτερη κινητική από τις µοναδικές (επειδή η συγκέντρωσή τους είναι ψηλότερη). Tο δίκλωνο DNA (επαναλαµβανόµενο) διαχωρίζεται από το µονόκλωνο (µοναδικό), βάσει της ιδιότητας του δεύτερου να προσδένεται σε ρητίνη υδροξυαπατίτη ή νιτροκυτταρίνης. 3. DNA που συνδέεται εξειδικευµένα µε αποµονωµένη πρωτεΐνη, όπως ρυθµιστικές (για την µεταγραφή) περιοχές, που περιέχουν θέσεις σύνδεσης για κάποιον αποµονωµένο µεταγραφικό παράγοντα. Tο σύµπλοκο πρωτεΐνης - DNA επωάζεται 2

3 µε δεοξυριβονουκλεάση (DNase)και το µόνο DNA που δεν καταστρέφεται είναι η θέση σύνδεσης της πρωτεΐνης - η πρωτεΐνη εµποδίζει την DNase να προσδεθέι στο DNA. Tα παραπάνω παραδείγµατα καθιστούν εµφανές το πόσο περιορισµένες είναι οι καθαρά βιοχηµικές µέθοδοι για την αποµόνωση αλληλουχιών DNA ή RNA. Tα διάφορα ένζυµα που θα περιγράψουµε παρακάτω επέτρεψαν την µεταχείριση του DNA και του RNA στο εργαστήριο και, σε συνδυασµό µε την ικανότητα των βακτηρίων να µετασχηµατίζονται µε DNA, έδωσαν διέξοδο στο γενικό πρόβληµα της αποµόνωσης συγκεκριµµένων αλληλουχιών. ENZYMA ΠEPIOPIΣMOY Eνδονουκλεάσες που κόβουν dsdna σε συγκεκριµµένες αλληλουχίες. Oνοµάζονται από το είδος του βακτηρίου από το οποίο αποµονώθηκαν (π.χ. EcoRI από την Escherichia coli, Sau3A από τον Staphylococcus aureus) Θέσεις αναγνώρισης: συνήθως 4 ή 6 bp σε µήκος και παλινδροµικές (π.χ. CTGCAG ή GGCC). Σηµείο κοπής: για ορισµένα ένζυµα περιορισµού είναι στο µέσο της θέσης αναγνώρισης, οπότε δηµιουργούνται λεία άκρα (blunt ends). Aλλα ένζυµα κόβουν τις δύο αλυσίδες του DNA σε συµµετρικά έκκεντρα σηµεία (staggered cuts) µία ή δύο βάσεις από το µέσο, οπότε δηµιουργούνται προεξέχοντα άκρα 2 ή 4 βάσεων αντίστοιχα. Tα προεξέχοντα άκρα είναι προς την 5' ή την 3' κατεύθυνση, ανάλογα µε το ένζυµο. Eπειδή οι αλληλουχία της µονόκλωνης προέκτασης είναι παλινδροµική, µπορεί να συστοιχίζεται µε τον εαυτό της και έτσι αυτά τα άκρα αποκαλούνται κολλώδη άκρα (sticky ends). Mία ενδονουκλεάση περιορισµού κόβει την εξειδικευµένη θέση αναγνώρισής της (την θέση περιορισµού της) οπουδήποτε αυτή συναντάται µέσα σε ένα δείγµα DNA, εκτός αν η θέση αυτή είναι προστατευµένη µε µεθυλίωση σε µία ή περισσότερες από τις βάσεις που την αποτελούν (η µεθυλίωση κατά τα άλλα δεν επηρεάζει τις λειτουργίες του DNA). Σε ένα τυχαίο δείγµα DNA µία θέση περιορισµού των 6bp συναντάται κατά µέσο όρο µία φορά στις 4 6 bp = 4096 bp, ενώ µία των 4bp συναντάται πιο συχνά, µία στις 4 4 bp = 256 bp. XAPTEΣ ΠEPIOPIΣMOY: Tα ένζυµα περιορισµού είναι ιδανικά αντιδραστήρια για χαρτογράφηση του DNA, αφού κάθε αναγνωριζόµενη αλληλουχία (θέση περιορισµού) παίζει τον ρόλο οροσήµου πάνω στο DNA. Στην πράξη, επωάζουµε ένα δείγµα DNA 3

4 µε κάποιο περιοριστικό ένζυµο και µετράµε το µέγεθος των θραυσµάτων µετά από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης (η ταχύτητα µετακίνησης µέσα στο πήκτωµα είναι ανάλογη µε το αρνητικό του λογαρίθµου του µήκους του θραύσµατος). Mε συνδυασµό απλών και διπλών (χρησιµοποιώντας συγχρόνως δύο περιοριστικά ένζυµα) πέψεων πετυχαίνουµε χαρτογράφηση των περιοριστικών θέσεων στο δείγµα µας. Tεχνικές που βοηθούν στην ανάλυση των αποτελεσµάτων περιοριστικών πέψεων είναι: - υβριδοποίηση DNA (Southern blots): δείχνει ποιά θραύσµατα της πέψης µε το ένζυµο A αλληλεπικαλύπτονται µε κάποια της πέψης µε το ένζυµο B. - ραδιοσήµανση των άκρων ενός ευθυγράµµου τµήµατος DNA δείχνει ποιά θραύσµατα αντιστοιχούν στα άκρα (µε αυτοραδιογραφία του πηκτώµατος που αναλύσαµε τις περιοριστικές πέψεις). - ραδιοσήµανση του ενός άκρου και µερική πέψη µε περιοριστικό ένζυµο - η αυτοραδιογραφία του πηκτώµατος δείχνει την απόσταση κάθε περιοριστικής θέσης από το σηµασµένο άκρο. Φυσικά, χαρτογράφηση περιορισµού δεν είναι δυνατό να γίνει σε δείγµατα συνολικού γενωµικού DNA (εκτός από τα µικρά ιικά γονιδιώµατα, 5-50 x 10 3 bp), γιατί ο αριθµός περιοριστικών θραυσµάτων είναι πολύ µεγάλος για να αναλυθεί. H µέθοδος της κλωνοποίησης (παρακάτω) παράγει µικρά τεµάχια ενός γονιδιώµατος που προσφέρονται για περιοριστική χαρτογράφηση. Eνώ η γενετική χαρτογράφηση έχει διακριτικότητα 200 (σπανίως) bp, ανάλογα µε τον οργανισµό (ανασυνδυασµός πολύ πιο συχνός στους προκαρυώτες), η συχνότητα των περιοριστικών θέσεων επιτρέπει χαρτογράφηση µε διακριτικότητα περίπου 50 bp. Eπιπλέον εργαζόµαστε in vitro και έτσι αποφεύγουµε τον φόρτο δουλειάς που απαιτεί η αποµόνωση, ταυτοποίηση και χαρτογράφηση µεταλλαγών. O περιοριστικός χάρτης απεικονίζει πιστά την φυσική απόσταση πάνω στο DNA, ενώ µε την γενετική χαρτογράφηση αντιµετωπίζουµε την αβεβαιότητα του ποικίλου ρυθµού ανασυνδυασµού σε διάφορες περιοχες του DNA. KΛΩNOΠOIHΣH DNA ύο άσχετα µεταξύ τους τεµάχια DNA, προϊόντα πέψης δύο διαφορετικών δειγµάτων µέ το ίδιο περιοριστικό ένζυµο, µπορούν να συνδεθούν προσωρινά βάσει της ικανότητας των κολλώδων τους άκρων να υβριδοποιούνται. Tο παραγόµενο µόριο είναι δύο συνεχή τµήµατα dsdna µε µόνο δύο εγκοπές (nicks), µία σε κάθε αλυσίδα. H σύνδεση αυτή είναι προσωρινή γιατί στηρίζεται σε µόνο 4 υδρογονικά δεσµευµένα ζεύγη βάσεων, αλλά µπορεί να µονιµοποιηθεί µε το κλείσιµο των εγκοπών, δηλ. τον σχηµατισµό φωσφοδιεστερικών (οµοιοπολικών) δεσµών. Aυτό επιτυγχάνεται µε το ένζυµο DNA λιγάση, ο φυσιολογικός ρόλος της οποίας είναι να κλείνει τέτοιες εγκοπές στην ασυνεχή (lagging) αλυσίδα κατά την αντιγραφή του DNA. Tο προϊόν µιας τέτοιας 4

5 σύνδεσης είναι ένα συνεχές dsdna αποτελούµενο από τα ξένα µεταξύ τους αρχικά τµήµατα µε µία περιοριστική θέση A µεταξύ τους. Για την αποµόνωση συγκεκριµµένων τεµαχίων DNA επωφελούµαστε της ύπαρξης µικρών (και συνεπώς ευχρήστων) µορίων προκαρυωτικού DNA µε ικανότητα αυτόνοµου πολλαπλασιασµού σε βακτήρια: συγκεκριµένα χρησιµοποιούµε DNAs πλασµιδίων ή βακτηριοφάγων ως φορείς κλωνοποίησης (cloning vectors). Aν ένας π.χ. κυκλικός φορέας κοπεί µε το ένζυµο περιορισµού A, θα µετατραπεί σε ευθύγραµµο DNA µε κολλώδη άκρα τύπου A. Xρησιµοποιώντας την DNA λιγάση συνδέουµε έναν τέτοιο κοµµένο φορέα µε οποιοδήποτε τµήµα DNA µε συµβατά κολλώδη άκρα (εικ. 1). Eνα τέτοιο µόριο εισάγεται σε βακτήρια µέσω µετασχηµατισµού. Στο κύτταρο, η ικανότητα του φορέα να πολλαπλασιάζεται έχει ως αποτέλεσµα τον πολλαπλασιασµό 5

6 και του οποιουδήποτε ενθέτου (insert) DNA που έχει εισαχθεί σε κάποια θέση περιορισµού του. Eνα τµήµα DNA µπορεί µ'αυτό τον τρόπο να παραχθεί σε µεγάλες ποσότητες. Kόβοντας ένα σύνθετο γονιδίωµα µε το ένζυµο A και κλωνοποιώντας µαζικά τα θραύσµατά του σε ένα φορέα δηµιουργούµε µία γονιδιακή βιβλιοθήκη αυτού του οργανισµού (π.χ. του καρότου). Tο µίγµα της αντίδρασης σύνδεσης χρησιµοποιείται για µετασχηµατισµό E. coli, ώστε κάθε κύτταρο να εισάγει το πολύ ένα ανασυνδυασµένο µόριο DNA. Eτσι κάθε βακτηριακή αποικία περιέχει ένα κλώνο καρότου, δηλαδή ένα τµήµα του γονιδιώµατος του καρότου ανασυνδυασµένο µε τον βακτηριακό φορέα. H κατασκευή µιάς τέτοιας γενωµικής βιβλιοθήκης είναι το πρώτο βήµα για την αποµόνωση και χαρακτηρισµό συγκεκριµµένων γονιδίων οποιουδήποτε οργανισµού. Eνα άλλο είδος βιβλιοθήκης είναι αυτή που αντιστοιχεί στο συνολικό mrna ενός ιστού. Aυτή λέγεται βιβλιοθήκη cdna (copy DNA), γιατί αποτελείται από DNA κλώνους αντίγραφα των διαφόρων mrna του υπό µελέτη ιστού. Tο αρχικό cdna συντίθεται επωάζοντας το δείγµα του mrna µε δεοξυνουκλεοτίδια και το ένζυµο αντίστροφη µεταγραφάση (reverse transcriptase), που συνθέτει συµπληρωµατικό DNA πάνω σε µήτρα RNA. Eπειδή το παραγόµενο cdna δεν έχει κολλώδη άκρα, χρησιµοποιούµε φορείς κλωνοποίησης κοµµένους µε περιοριστικό ένζυµο που παράγει λεία άκρα. Για πιο αποτελεσµατική σύνδεση προσθέτουµε 3' οµοπολυµερικές προεκτάσεις (π.χ. CCC...CC) στον φορέα και αντίστοιχα στο cdna (στο συγκεκριµένο παράδειγµα θα βάζαµε GGG...GG). Aυτό επιτυγχάνεται µέσω του ενζύµου τελική τρανσφεράση (terminal transferase). H µετέπειτα σύνδεση και µετασχηµατισµός είναι ακριβώς όπως στην κατασκευή γενωµικής βιβλιοθήκης. ΦOPEIΣ KΛΩNOΠOIHΣHΣ: Tρία χαρακτηριστικά κάνουν ένα DNA καλό φορέα: 1. Iκανότητα για αυτόνοµη DNA αντιγραφή (ύπαρξη αρχής αντιγραφής - origin of replication) στην E. coli. 2. Eυκολία ανίχνευσής του (π.χ. αν φέρει γονίδιο µάρτυρα, όπως ανθεκτικότητα σε κάποιο αντιβιοτικό). 3. Eυκολία στην παρασκευή του ανασυνδυασµένου µορίου. Eπιπλέον πρέπει να έχει καλά χαρακτηρισµένη αλληλουχία και αρκετές βολικές θέσεις περιορισµού για ένθεση ξένων τεµαχίων DNA. Tα πλασµίδια έχουν την ικανότητα να πολλαπλασιάζονται σε πολλά (µέχρι 50) αντίγραφα ανα κύτταρο. Περιέχουν ένα (τουλάχιστον) γονίδιο ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικό (αµπικιλλίνη, τετρακυκλίνη, καναµυκίνη και χλωραµφαινικόλη είναι τα πιο κοινά), που είναι απαραίτητο για την φαινοτυπική διαφοροποίηση των 6

7 µετασχηµατισµένων βακτηρίων ξενιστών. H παρασκευή των πλασµιδίων (ανασυνδυασµένων και µη) βασίζεται στην διαφορική συσσώρευση µικρών κυκλικών DNA σε κλίσεις πυκνότητας CsCl στην παρουσία βρωµιούχου αιθιδίου. Oι πιο ευρέως χρησιµοποιούµενοι βακτηριοφάγοι φορείς είναι ο λ και ο M13. Kαι οι δύο πολλαπλασιάζουν το DNA τους σε ψηλά επίπεδα κατά την µόλυνση του ξενιστή και παράγουν ιοσώµατα, τα οποία ελευθερώνονται στο θρεπτικό µέσο και έτσι η συλλογή τους για την παρασκευή DNA είναι ιδιαίτερα εύκολη. H παρουσία τους είναι από µόνη της εµφανής (πλάκα σε βακτηριακή χλόη) και έτσι δεν χρειάζονται γενετικοί δείκτες όπως στην περίπτωση των πλασµιδίων. O λ έχει γονιδίωµα ~50 kb, 20 kb από τις οποίες είναι περιττές για την αύξησή του στην E. coli και µπορούν να αντικατασταθούν µε ξένο DNA. H ικανότητά του να δέχεται µεγάλα ένθετα τον κάνει τον προτιµητέο φορέα για κατασκευή γενωµικών βιβλιοθηκών. Tο γονιδίωµα του M13 είναι µονόκλωνο DNA και έτσι παράγει και το ένθετο DNA σε µονόκλωνη µορφή, ιδανική για προσδιορισµό της αλληλουχίας του (βλ. παρακάτω). Mε την διάδοση της κλωνοποίησης για πληθώρα εφαρµογών τα τελευταία χρόνια έχουν αναπτυχθεί φορείς µε διάφορες ευκολίες και λειτουργικότητες. Π.χ.: - Φορείς µε µοναδικές θέσεις για πολλά ένζυµα περιορισµού. - Φορείς πού επιτρέπουν την έκφραση του κλωνοποιηµένου γονιδίου στην E. coli. - Πλασµίδια που πολλαπλασιάζονται και στην E. coli και σε άλλο ξενιστή, π.χ. σακχαροµύκητα ή κύτταρα ποντικού σε καλλιέργεια. - ίκλωνα πλασµίδια που µπορούν να παράγουν µονόκλωνο αντίγραφο του εαυτού τους πακεταρισµένο σε ψευδο-ιοσώµατα. ΣTPATHΓIKEΣ KΛΩNOΠOIHΣHΣ έχουµε πληθώρα µε µόνο κοινό σηµείο την αναδροµή της κάθε διαδικασίας σε κάποια γενωµική ή cdna βιβλιοθήκη. Παίρνοντας την ύπαρξη µιας βιβλιοθήκης σαν δεδοµένο, το πρόβληµα είναι να ταυτοποιήσουµε τον σωστό κλώνο που περιέχει την αλληλουχία που µας ενδιαφέρει. H συχνότητα αντιπροσώπευσης µιάς αλληλουχίας 17 kb (µέσο µέγεθος ενθέτου βακτηριοφάγου λ) σε βιβλιοθήκη λ του γονιδιώµατος της (π.χ.) ροσόφιλας είναι 17 / = 10-4 (το απλοειδές γονιδίωµα της ροσόφιλας είναι kb). Eπιπλέον, για να έχουµε 99% στατιστική βεβαιότητα ανεύρεσης µιάς αλληλουχίας πρέπει να ερευνήσουµε περίπου το ισοδύναµο 10 γονιδιωµάτων, δηλ. κάπου πλάκες. H εξεύρεση του καλύτερου τρόπου για την ταυτοποίηση της αλληλουχίας µας από µία βιβλιοθήκη απαιτεί να χρησιµοποιήσουµε ό,τι γνώσεις έχουµε για την ζητούµενη αλληλουχία, µε άλλα λόγια θέλει φαντασία. Mερικές συνηθισµένες προσεγγίσεις θα αναφερθούν επιγραµµατικά παρακάτω: (1) Yβριδοποίηση πλακών ή αποικιών µετά από δηµιουργία αντιγράφων σε φίλτρα νιτροκυτταρίνης των τρυβλίων που περιέχουν την βιβλιοθήκη. Ως 7

8 ανιχνευτής χρησιµοποιείται κατά περίπτωση: κλώνος οµολόγου γονιδίου (π.χ. το ζητούµενο γονίδιο από εξελικτικά συγγενή οργανισµό) - cdna κλώνος, όταν ζητάµε κλωνοποίηση του γενωµικού κοµµατιού που τον περιέχει (ή το αντίστροφο, δηλ. γενωµικό κοµµάτι για ανίχνευση cdna βιβλιοθήκης)- συνθετικό ολιγονουκλεοτίδιο κατασκευασµένο (βάσει του γενετικού κώδικα) να κωδικοποιεί ένα τµήµα της πρωτεϊνικής αλληλουχίας (όταν έχουµε αποµονώσει την πρωτεΐνη και ζητάµε το γονίδιο) - συνολικό RNA (σαν ραδιοσηµασµένο cdna) από κάποιον ιστό - κ.λπ. κ.λπ. (2) Tο χρωµοσωµικό περπάτηµα εφαρµόζεται για την αποµόνωση εκτενών χρωµοσωµικών περιοχών, που δεν χωράνε σε έναν λ κλώνο. Aπό τον πρώτο κλώνο αποµονώνουµε ένα ακριανό περιοριστικό θραύσµα και το χρησιµοποιούµε σαν ανιχνευτή για εκ νέου υβριδοποίηση της (γενωµικής) βιβλιοθήκης - θα σηµανθούν κλώνοι που επικαλύπτονται µε τον αρχικό και εκτείνονται προς την κατεύθυνση του άκρου ανιχνευτή. Eπαναλαµβάνοντας τέτοια "βήµατα" περπατάµε κατά µήκος του χρωµοσώµατος αποµακρυνόµενοι από τον αρχικό µας κλώνο. (3) Eρευνα βιβλιοθήκης βακτηριακής έκφρασης, δηλ. βιβλιοθήκης που εκφράζει το ξένο ένθετο στο κύτταρο ξενιστή (E. coli). Oταν έχουµε ανοσοδιαγνωστική ή ενζυµική µέθοδο µέτρησης της πρωτεΐνης που µας ενδιαφέρει µπορούµε να την εφαρµόσουµε σε in situ πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα της (cdna) βιβλιοθήκης µας (δηλ. πάνω σε φίλτρα νιτροκυτταρίνης). Eλπίζουµε να σηµανθεί µία πλάκα/αποικία (ή περισσότερες). ΠPOΣ IOPIΣMOΣ AΛΛHΛOYXIAΣ TOY DNA (SEQUENCING) ύο διαφορετικές µέθοδοι αναπτύχθηκαν σχεδόν συγχρόνως για τον προσδιρισµό της αλληλουχίας ενός κλωνοποιηµένου τµήµατος DNA. H χηµική µέθοδος (Maxam and Gilbert) σήµερα σπάνια χρησιµοποιείται. H ενζυµική µέθοδος (Sanger) απαιτεί µονόκλωνο DNA, που χρησιµοποιείται σαν µήτρα για την σύνθεση ραδιοσηµασµένης συµπληρωµατικής αλυσίδας in vitro. H αντίδραση αυτή επιτυγχάνεται µε την DNA πολυµεράση της E. coli στην παρουσία των τεσσάρων δεοξυνουκλεοτιδίων (datp, dttp, dgtp, dctp, ένα από τα οποία είναι ραδιοσηµασµένο) και ενός συνθετικού ολιγονουκλεοτιδίου που είναι συµπληρωµατικό στο DNA µήτρα και χρησιµεύει ως εκκινητής. Tέσσερες κατά τ' άλλα όµοιες αντιδράσεις σύνθεσης αναµειγνύονται µε προσθήκη στην κάθε µία µικρής ποσότητας ενός διαφορετικού 2',3'-διδεοξυνουκλεοτιδίου (ddatp, ddgtp κλπ.). H ενσωµάτωση ενός ddnmp στο 3' άκρο µιάς αντιγραφόµενης αλυσίδας σταµατάει την περαιτέρω 8

9 σύνθεση, γιατί δεν υπάρχει πια 3' -OH για προέκταση της αλυσίδας. O λόγος της π.χ. ddatp προς την datp είναι ρυθµισµένος έτσι ώστε να µην γίνεται περάτωση της σύνθεσης σε κάθε σηµείο που συναντάται A. Eτσι κάθε αντίδραση καταλήγει να περιέχει µίγµα περατωµένων αλυσίδων, όλες σε διαφορετική περίσταση που συναντάται A, G, C ή T, ανάλογα µε το ddntp που συµπεριλήφθηκε. Mετά από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα πολυακρυλαµίδης και αυτοραδιογραφία µπορούµε να διαβάσουµε την αλληλουχία του DNA. 9

10 ΓONI IAKH OMH H τεχνολογία του ανασυνδυασµένου DNA µας δίνει την ευκαιρία να τεµαχίσουµε ένα πολύπλοκο γονιδίωµα σε µικρά εύχρηστα τµήµατα (κλώνους) και να χαρτογραφήσουµε τα γονίδια πάνω σ' αυτά τα τµήµατα. ιακριτική ικανότητα ενός νουκλεοτιδίου επιτυγχάνεται µε τις µεθόδους προσδιορισµού της αλληλουχίας ενός τµήµατος DNA. Σαν αποτέλεσµα της εφαρµογής αυτής της τεχνολογίας στις τελευταίες δύο δεκαετίες, έχει συλλεχθεί πλήθος πληροφοριών για την δοµή των γονιδίων διαφόρων οργανισµών. Θα αναφέρουµε τα βασικά χαρακτηριστικά των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες στους προκαρυώτες και ευκαρυώτες. ΠPOKAPYΩTIKA ΓONI IA H αλληλουχία του DNA που µεταγράφεται σε mrna είναι συνεχής. Tο mrna είναι πολυκιστρονικό, δηλ. µπορεί να περιέχει περισσότερα από ένα γονίδια σε µη αλληλεπικαλυπτόµενη σειρά. Σπανίως (ιδίως σε ιικά mrna) τα γονίδια ενός RNA µπορεί και να αλληλεπικαλύπτονται. Συναντάται, δηλαδή, το φαινόµενο η ίδια κωδική περιοχή να διαβάζεται σε ένα πλαίσιο (reading frame) για µία πρωτεΐνη και σε άλλο πλαίσιο για µία άλλη. H 3' µη µεταφραζόµενη περιοχή του mrna (3' untranslated region or 3'UTR) περιέχει cis-ρυθµιστικά στοιχεία για την περάτωση της µεταγραφής. H 5' flanking region (5' µη µεταγραφόµενη περιοχή) περιέχει τα cis-ενεργά στοιχεία για την ρύθµιση της µεταγραφής. 10

11 EYKAPYΩTIKA ΓONI IA Tα mrna τους είναι µονοκιστρονικά και έχουν εξειδικευµένες προσθήκες στα άκρα: το cap στο 5' (παραλλαγµένο νουκλεοτίδιο) και µία ουρά πολυαδενίνης στο 3'. Tο DNA που αντιστοιχεί στο mrna δεν είναι συνεχές. Tο γονίδιο αποτελείται από περιοχές που αντιστοιχούν στο mrna και λέγονται εξόνια, τις οποίες διαχωρίζουν ιντρόνια, περιοχές που µεταγράφονται µεν, αλλά αφαιρούνται από το RNA πριν από την εξαγωγή του στο κυτταρόπλασµα. H αφαίρεση των ιντρονίων και συγκόλληση των συνεχοµένων εξονίων (splicing) καθιστά απαραίτητη την σύγκριση µεταξύ γενωµικών και cdna κλώνων για την ακριβή χαρτογράφηση ενός γονιδίου. Eκτός από τις περιοχές ρύθµισης συγκόλλησης, µερικά ιντρόνια περιέχουν και περιοχές µεταγραφικής ρύθµισης. Tέτοιες µεταγραφικές ρυθµιστικές περιοχές βρίσκονται και στις 5' και 3' flanking περιοχές. Οι 5' UTR και 3 UTR ελέγχουν την µετάφραση και την σταθερότητα του µηνύµατος, ενώ η 3' UTR περιέχει και το σήµα για πολυαδενυλίωση του RNA. H παρακάτω εικόνα παριστάνει σχηµατικά τις χαρακτηριστικές δοµές προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών γονιδίων: ΠΡΟΚΑΡΥΩΤΙΚΑ ΓΟΝΙ ΙΑ GENE 1 5 FLANKING GENE 2 GENE 3 5 UTR 3 UTR ΠΡΟΚΑΡΥΩΤΙΚΟ mrna ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟ ΓΟΝΙ ΙΟ EXON 1 5 FLANKING EXON 2 EXON 3 5 UTR 3 UTR INTRON 1 INTRON 2 mg-ppp ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚO mrna AAAAAAAAAAAAAAAAAA 11