Ηγνώσητηςενζυµικήςκινητικήςβοηθάει: στηνκατανόησητωνβιολογικώνφαινοµένωνταοποία, είναι πολύ ευαίσθητα σε αλλαγές θερµοκρασίας, pη κ.λπ.

Transcript

1 Κιv ητικήε v ζυµικώ v Α v τιδράσεωv Χαρακτηριστική ιδιότητα και λειτουργία των ενζύµων, είναι ηκατάλυσητωνχηµικώναντιδράσεων. Μελέτη της καταλυτικής δράσης, πρέπει να βασίζεται στον ποσοτικό προσδιορισµό της ταχύτητας της χηµικής αντίδρασης που καταλύεται. Από τη µελέτη της µεταβολής της ταχύτητας, καταλήγουµε σε συµπεράσµατα χρήσιµα για τη δοµή και για το µηχανισµό δράσης των ενζύµων ( κυρίως όταν το ένζυµο είναι υψηλής καθαρότητας). Η µελέτη της ενζυµικής κινητικής είναι σηµαντική και για πρακτικούς λόγους: Ο ορισµός ικανοποιητικών µονάδων (Units) απαιτεί να γνωρίζουµε τις βέλτιστες συνθήκες (pη, θερµοκρασία κ.λπ.) για τη δράση του ενζύµου, καθώς και την επίδραση των διαφόρων παραγόντων (αναστολείς, ενεργοποιητές κ.λπ.) σ αυτήν.

2 Ηγνώσητηςενζυµικήςκινητικήςβοηθάει: στηνκατανόησητωνβιολογικώνφαινοµένωνταοποία, είναι πολύ ευαίσθητα σε αλλαγές θερµοκρασίας, pη κ.λπ. στηνεπίλυσητουερωτήµατος µεποιοτρόποδρουντα ένζυµα µέσα στο κύτταρο. Για όλους τους παραπάνω λόγους, η ενζυµική κινητική ή κινητική ενζυµικών αντιδράσεων, έχει εξελιχθεί σε ένα ιδιαίτερο επιστηµονικό κλάδο. Στην ενζυµική κινητική πρωταρχικό ρόλο παίζει η µελέτη της ταχύτητας (v) της ενζυµικής αντίδρασης σε συνάρτηση µε τουςδιάφορουςπαράγοντεςπουεπιδρούνσ αυτήν, µε επίκεντρο τη µελέτη της σχέσης µεταξύ της ταχύτητας της ενζυµικής αντίδρασης και της συγκέντρωσης του ενζύµου (Ε) και του υποστρώµατος (S).

3 ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΗΣ ΚΑΤΑΛΥΤΙΚΗΣ ΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝ Μερικά µόνο ένζυµα µπορούν να προσδιοριστούν µε άµεσεςφασµατοµετρικέςµεθόδους. Η παρουσία των περισσοτέρων ενζύµων πιστοποιείται από τη θετική έκβαση των συγκεκριµένων αντιδράσεων που καταλύουν Το ποσό των ενζύµων υπολογίζεται από την ταχύτητα της αντίδρασης. Η µέτρηση λοιπόν της ταχύτητας της αντίδρασης, είναι το πιο σηµαντικό κοµµάτι των τεχνικών που χρησιµοποιούνται στη µελέτη των ενζύµων.

4 Η µορφή της καµπύλης της αλλοίωσης του υποστρώµατος ή της παραγωγής του προϊόντος συναρτήσει του βαθµού προόδου της αντίδρασης, στις περισσότερες ενζυµικές αντιδράσεις, είναι της γενικής µορφής του σχήµατος (η ταχύτηταµειώνεταισυναρτήσειτουχρόνου). Το φαινόµενο αυτό µπορεί να οφείλεται σε πολλούς λόγους: π.χ. τα προϊόντα της αντίδρασης αναστέλλουν το ένζυµο οβαθµόςκορεσµούτου ενζύµου από το υπόστρωµα µειώνεται πιθανώς λόγω µείωσης της συγκέντρωσης του υποστρώµατος συναρτήσει του βαθ- µού προόδου της αντίδρασης, η αντίστροφη πορεία της αντίδρασης γίνεται σε µεγαλύτερο βαθµό λόγω της αύξησης της συγκέντρωσης των προϊόντων κ.λπ.

5 Για να αποφευχθούν οι παραπάνω λόγοι, υιοθετήθηκε η µέτρηση της αρχικής ταχύτητας, κατά την οποία οι παραπάνω λόγοι δεν έχουν τη χρονική δυνατότητα να παρέµβουν. Κατά τη µελέτη των ενζύµων, είναι απόλυτα αναγκαίο να προσδιορίζεται η επίδραση στην αρχική ταχύτητα ενός παράγοντα (pη, θερµοκρασία, συγκέντρωσηενζύµουκ.λπ.) κάθε φορά. Για τη µέτρηση της αρχικής ταχύτητας, επιλέγεται συνήθως έναςτέτοιοςχρόνος, ώστεηαλλοίωσητουυποστρώµατος, ναείναικάτωαπότο 20%τηςσυνολικής. Μέχριαυτούτουορίου, οικαµπύλεςτηςταχύτητας, σε συνάρτηση µε το µεταβαλλόµενο παράγοντα είναι συνήθως ευθείες γραµµές.

6 Για να ορισθεί η αρχική ταχύτητα, γίνεται µία σειρά πειραµάτων, για να καθορισθούν τα όρια της γραµµικότητας, ώστε ηπαραγωγήτουπροϊόντοςναείναιµέγιστηκαι οι καµπύλες της ταχύτητας συναρτήσει του χρόνου και τηςσυγκέντρωσηςτουενζύµου [ v = f(t) και v = f([ε])], να είναι ευθείες. Καθορισµός αρχικής ταχύτητας: Προσδιορίζεται τορ= f (t), όταν όλοι οι άλλοι παρά- µετροι, είναι σταθερές (π.χ.[s], pη, T κ.λπ.) εκτός [E].

7 Κατασκευάζεται υπολογιστικά [από το διάγραµµα Ρ = f (t)], τοδιάγραµµα v = f([ε]). Τοδιάγραµµα v = f([ε]) γιαχρόνο t 0 είναιευθείαγραµµή, δηλαδή η ταχύτητα είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του ενζύµουκαιαντιπροσωπεύειτηναρχικήταχύτητα. Στοδιάγραµµα v = f([ε]) γιαχρόνο t 1, υπάρχειέναευθύγραµµο τµήµα, που συµπίπτει µε εκείνο τουχρόνου t 0, ενώ στο διάγραµµα v = f([ε]), πουαντιστοιχείσεχρόνο t 2, η ταχύτητα δεν είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του ενζύµου.

8 Από τα παραπάνω φαίνεται ότι η καµπύλη v = f([ε]) είναι ευθεία, µόνο όταν χρησιµοποιούνται αρχικές ταχύτητες. Εποµένως, για να αναφερόµαστε σε αρχική ταχύτητα, θα πρέπει να χρησιµοποιείται συγκέντρωσηενζύµουίσηµε [Ε 1 ] καιχρόνος t 1. Τότε θα ικανοποιούνται οι παραπάνω απαιτήσεις, δηλαδή η παραγωγή του προϊόντος να είναι µέγιστη, αλλά και οικαµπύλες v = f(t) και v = f([ε]), να είναι ευθείες.

9 Υπάρχουν όµως περιπτώσεις, όπου το διάγραµµα προόδου της αντίδρασης δεν έχει τη µορφή του σχήµατος: Η οξειδάση των D-αµινοξέων απαιτείγιατηδράσητης, την παρουσία φλαβινοσυνενζύµων, (στην πραγµατικότητα είναι προσθετικές οµάδες) που συνδέονται µε τοένζυµοµεαργόρυθµό. Αυτό έχει σαν αποτέλεσµα να αυξάνεται δραστικά το ποσό του ενεργού ενζύµου µετά την πάροδο κάποιου χρονικού διαστήµατος, από τη στιγµή της ανάµιξης των αντιδρώντων. Το πρόβληµα αυτό θα µπορούσε να αντιµετωπιστεί µε προεπώαση ενζύµου και συνενζύµου (ή προσθετικής οµάδας), πριν από την προσθήκη του υποστρώµατος.

10 Όταναναφέρεταιηλέξηταχύτηταθαεννοείταιπάνταη αρχική ταχύτητα εκτός αν διευκρινίζεται κάτι διαφορετικό. Η παρακολούθηση του βαθµού προόδου µιας ενζυµικής αντίδρασης µπορεί να γίνει: µε τη λήψη δείγµατος σε διάφορες διαδοχικές χρονικές στιγµές από το ίδιο µίγµα αντίδρασης (sampling methods) µε τη χρήση διαφορετικών µιγµάτων αντίδρασης που έχουν ίδια σύσταση και τα οποία επωάζονται σε διαφορετικούς χρόνους (continuous methods), µέθοδος που έχει µεγαλύτερη εφαρµογή.

11 Ποσοτικός προσδιορισµός των ενζύµων Τα ένζυµα είναι πρωτεΐνες και συνυπάρχουν µε άλλες πρωτεϊνες και ενώσεις, καθιστώντας το χηµικό προσδιορισµό τους σχεδόν αδύνατο. Η ποσότητα του ενζύµου, υπολογίζεται µε προσδιορισµό της καταλυτικής της δράσης, η οποία εκφράζεται ποσοτικά µε τους παρακάτω όρους (σύµφωνα µε τη Commision on Εnzymes). Μονάδεςενζυµικήςδραστικότητας [U = µmol[s]/min] 1)Ειδικήδραστικότητα [ U/mgπρωτεΐνης] 2) Μοριακή δραστικότητα [ U/µmol ενζύµου ] 3) ραστικότητα καταλυτικού κέντρου [Αλλοιωµένα µόρια S / min και προσθετική οµάδακαταλυτικό κέντρο]

12 Μονάδα ενζυµικής δραστικότητας (1U: Ιnternational Unit): Τοποσότου E πουαλλοιώνει 1 µmol S (ήπαράγει 1 µmol P) ανά 1 min, σε καθορισµένες συνθήκες. Όταν επηρεάζονται περισσότεροι από ένα δεσµοί σε κάθε µόριο S:ΤοποσότουΕπουκαταλύειτηµετατροπή 1 µequivalentτηςοµάδαςπουεπηρεάζεταιανά 1 min. Στις καθορισµένες συνθήκες περιλαµβάνεται ηθερµοκρασία (αρχικάείχεορισθεί 25 0 C µετά 30 0 C, 37 0 C ενώ σήµερα χρησιµοποιείται η θερµοκρασία όπως ορίζεται για κάθε περίπτωση) το pηκαι ησυγκέντρωσητου S. (Για τα δύο τελευταία χρησιµοποιούνται συνήθως οι βέλτιστεςσυνθήκεςγιατοκάθεένζυµο). Όταναντιδρούνδύοίδιαµόρια S µεταξύτους:τοποσότου E πουκαταλύειτηναλλοίωση 2 µmoles S σε 1 min. ( µονάδα απόλυτη που επιτρέπει τη σύγκριση δραστικότητας διαφορετικών ενζύµων).

13 1) Ειδική δραστικότητα ή ενεργότητα ή καθαρότητα (specific activity): Οι µονάδες ενζυµικής δραστικότητας ανά mg πρωτεΐνης, (U/mg πρωτεΐνης) ενζύµου ή ενζυµικού παρασκευάσµατος (γιατί συνήθως χειριζόµαστε ακάθαρτα παρασκευάσµατα, π.χ. ειδική δραστικότητα ενζυµικού παρασκευάσµατος). ηλαδή, η ειδική δραστικότητα καθορίζεται από το ποσό του προϊόντος που παράγεται ανά µονάδα βάρους ενζύµου. Επειδήτοένζυµοπουµελετάταισυνήθωςδενείναι 100% καθαρό, αναγκαστικάχρησιµοποιούνταιαυθαίρετεςµονάδες, ανάλογα µε τις πειραµατικές συνθήκες (για να προκύπτουν εύχρηστες αριθµητικές τιµές). Έτσι η καταλυτική δράση του ενζύµου εκφράζεται σε αυθαίρετες µονάδες ενζυµικής δραστικότητας ανά mg πρωτεΐνης (ή σπανιότερα ανά g, θεωρώντας ότι το µοριακό βάρος των ενζύµων είναι περίπου ).

14 2) Μοριακή δραστικότητα (molecular activity): Οι µονάδες ενζυµικής δραστικότητας ανά µmol ενζύµου, σε βέλτιστες συνθήκες συγκέντρωσης υποστρώµατος. ηλαδή είναι ο αριθµός των µορίων υποστρώµατος που αλλοιώνονται σε 1 min από 1 µόριο ενζύµου. Μεάλλαλόγια, είναιτοποσότουπροϊόντοςπου παράγεται από ένα µόριο ενζύµου. Από την ενζυµική κινητική είναι γνωστό ότι Vmax = κ 2 [Εt]. Όπου [Εt] είναιησυγκέντρωσητουσυνολικούενζύµου. Όταν [Εt] = 1, τότε Vmax= κ 2 καιµετριέταισε min-1. Toκ 2 oνοµάζεταιαριθµόςανακύκλωσης (turnover number) και δείχνει πόσα µόρια υποστρώµατος αλλοιώνονται στη µονάδατουχρόνουαπόέναµόριοενζύµου. Οι τιµές που έχουν ανακοινωθεί για τους αριθµούς ανακύκλωσηςτωνδιαφόρωνενζύµωνκυµαίνονταιαπό 6 έως 17x10 6.

15 3) ραστικότητα καταλυτικού κέντρου: Ο τρόπος έκφρασης της καταλυτικής δράσης ενός ενζύµου, στην περίπτωση που το ένζυµο έχει προσθετική οµάδα ή καταλυτικό κέντρο και εφ όσον ησυγκέντρωσηαυτώνµπορείνα προσδιορισθεί, και ισούται µε τον αριθµό των µορίων του υποστρώµατος που αλλοιώνονται ανά 1min, από 1 προσθετική οµάδα/καταλυτικό κέντρο.

16 Μέθοδοι ποσοτικού προσδιορισµού της ενζυµικής δράσης Οι πιο σηµαντικές κατηγορίες µεθόδων που χρησιµοποιούνται σήµερα για τον προσδιορισµό της καταλυτικής δράσης των ενζύµων είναι οι εξής: Φασµατοφωτοµετρικές µέθοδοι: Πολλά υποστρώµατα και προϊόντα µιας ενζυµικής αντίδρασης απορροφούν την ακτινοβολία στην περιοχή του ορατού ή του υπεριώδους φάσµατος. Σε αυτές τις περιπτώσεις µπορεί να επιλεγεί ένα µήκος κύµατος, στο οποίο θα παρακολουθείται ποσοτικά είτε η σταδιακή εξαφάνιση του υποστρώµατος, είτε η σταδιακή εµφάνιση του προϊόντος. Ότανκανένααπόταδύοσυστατικάτηςαντίδρασηςδεν απορροφά την ακτινοβολία, ο ποσοτικός προσδιορισµός µπορεί να πραγµατοποιηθεί µε τη σύζευξη της αντίδρασηςπουµελετάται, µεµίαάλλη.

17 Παραδείγµατα φασµατοφωτοµετρικών µεθόδων: 1. Προσδιορισµός γαλακτικής αφυδρογονάσης: Γαλακτικόοξύ + NAD + Γαλακτική αφυδρογονάση Πυροσταφυλικόοξύ + NADH + H + ΤοΝΑD + απορροφάστα 260nm ΤοΝΑDΗστα nm. Έτσι µπορούµε να µετρήσουµε είτε τηνελάττωσητηςσυγκέντρωσηςτου NAD +, είτε την αύξηση της συγκέντρωσης του NADH

18 2. Προσδιορισµός κινάσης 6-φωσφοφρουκτόζης: 6-φωσφοφρουκτόζη 1,6-διφωσφοφρουκτόζη κινάση της 6- φωσφοφρουκτόζης αλδολάση 1,6-διφωσφοφρουκτόζη 3-φωσφογλυκεριναλδεΰδη + φωσφοδιυδροξυακετόνη Αυτά τα προϊόντα δεν απορροφούν στο υπεριώδες, αλλά 3-φωσφογλυκεριναλδεΰδη + NAD + + Pi 1,3-διφωσφογλυκερινικό οξύ + NADH αφυδρογονάση της 3- φωσφογλυκεριναλδεΰδης Έτσι, επιτυγχάνονται έµµεσα οι συνθήκες του προηγούµενου παραδείγµατος.

19 Φθορισµοµετρικές µέθοδοι: Είναι πιο ευαίσθητες από τις φασµατοφωτοµετρικές µεθόδους. Χρησιµοποιείται κυρίως όταν κάποιο από τα συστατικά της αντίδρασης φθορίζει π.χ. οι φλαβινο-ενώσεις, οι οποίες φθορίζουν έντονα στις οξειδωµένες τους µορφές. Μπορείακόµαναεφαρµοσθείηµέθοδοςαυτήµετάαπό µετατροπή κάποιου από τα αντιδρώντα συστατικά σε φθορίζον παράγωγο. Μανοµετρικές µέθοδοι: Βρίσκουν κυρίως εφαρµογή στις ενζυµικές αντιδράσεις, όπου ένα από τα συστατικά είναι αέριο. Έχουν υιοθετηθεί για τη µελέτη των οξειδασών (πρόσληψηο 2 ), τωναποκαρβοξυλασών (αποβολή CΟ 2 ) κ.λπ. Οι µανοµετρικές µέθοδοι µπορούν να χρησιµοποιηθούν και στις περιπτώσεις που µία ενζυµική αντίδραση είναι σε σύζευξηµεµίαάλληκαιένααπότασυστατικάτηςείναι αέριο.

20 Μέθοδοι µε ηλεκτρόδια: Η χρήση του ηλεκτροδίου υάλου δίνει τη δυνατότητα να παρακολουθούνται οι αντιδράσεις κατάτιςοποίεςαπελευθερώνονταιόξιναπροϊόντα, είτεµεµέτρησητηςπτώσηςτηςτιµήςτου pη συναρτήσει του χρόνου (µειονεκτήµατα είναι ότι ηαλλαγήστο pηκατάτηδιάρκειατηςαντίδρασης θα επιφέρει και αλλαγή στη δραστικότητα του ενζύµου ορυθµόςµείωσηςτου pηεξαρτάταιεπίσηςκαι από τη ρυθµιστική δύναµη του ενζυµικού συστήµατος) είτε µε συνεχή και αυτόµατη τιτλοδότηση των όξινων οµάδων µε άλκαλι.

21 Πολωσιµετρικές µέθοδο εφαρµόζονται σε: Ένζυµα που δρουν µόνο στο ένα οπτικό ισοµερές ενός υποστρώµατος και σ αυτές τις περιπτώσεις συνήθως τα προϊόνταείναιοπτικώςανενεργά. Ένζυµα που δρουν σε ανενεργό το υπόστρωµα και τα προϊόνταείναιοπτικώςενεργά. Ένζυµα που το υπόστρωµα και τα προϊόντα είναι ενεργά, µεδιαφορετικέςτιµέςστροφικήςικανότητας. Σε όλες τις παραπάνω περιπτώσεις, η παρακολούθηση της ενζυµικής αντίδρασης γίνεται µε µέτρηση της ικανότητας περιστροφής του πολωµένου φωτός συναρτήσει του χρόνου. Κλασικό παράδειγµα αποτελεί η αντίδραση σακχαράση σακχαρόζη φρουκτόζη + γλυκόζη Ησακχαρόζηέχεια D20 = +66,5, ενώ τοµίγµαγλυκόζηςκαιφρουκτόζηςέχεια D20 =-39,8.

22 Χηµικές µέθοδοι: Ο βαθµός προόδου πολλών ενζυµικών αντιδράσεων παρακολουθείται µε τη λήψη δειγµάτων σε διάφορες χρονικές στιγµές και στη συνέχεια µε προσδιορισµό του υποστρώµατος ή του προϊόντος, µε χηµικές µεθόδους. Για παράδειγµα οι φωσφατάσες, φωσφορυλάσες και νουκλεοτιδάσες, προσδιορίζονται µε µέτρηση του ποσού του ανόργανου φωσφόρου που απελευθερώνεται ή καταναλώνεται. Tο µειονέκτηµα αυτών των µεθόδων είναι ότι απαιτούν περισσότερο χρόνο. Χρωµατογραφικές µέθοδοι: Στις περιπτώσεις που δεν µπορεί να εφαρµοστεί καµµία από τις παραπάνω µεθόδους: Η ανίχνευση του σχηµατισµού του προϊόντος µπορεί να γίνειχρωµατογραφικά (το R f ή/καιοχρόνοςέκλουσηςείναι ενδείξεις για την ταυτοποίησή του). Στη συνέχεια, στις καθαρές ενώσεις µπορεί να γίνει ποσοτικός προσδιορισµός.

23 Η χρήση ραδιενεργών ισοτόπων: Είναι ένα χρήσιµο εργαλείο για την παρακολούθηση των ενζυµικών αντιδράσεων. Για παράδειγµα το ραδιενεργό προϊόν ή το εναποµένον υπόστρωµα (µετά το διαχωρισµό τους) προσδιορίζεται ποσοτικά µε µετρητή ραδιενέργειας.

24 ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΤΟΥ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ ΣΤΗΝ ΤΑΧΥΤΗΤΑ ΤΗΣ ΑΝΤΙ ΡΑΣΗΣ Η πλειοψηφία των ενζυµικών αντιδράσεων περιλαµβάνει περισσότερα από ένα υποστρώµατα. Ακόµα και στις υδρολάσες, οι οποίες συχνά θεωρούνται αντιδράσεις ενός υποστρώµατος, το δεύτερο υπόστρωµα (τοη 2 Ο) υπάρχεισευψηλέςσυγκεντρώσεις, καιτοένζυµο ναείναικορεσµένοστοη 2 Οσεόλεςτιςχρονικέςστιγµές. Αν και η περίπτωση των ενζυµικών αντιδράσεων ενός υποστρώµατος είναι σπάνια στα βιοχηµικά συστήµατα, παρ όλ αυτά αντιπροσωπεύει ένα χρήσιµο µοντέλο για την ανάπτυξη της θεωρίας της ενζυµικής κινητικής και τα περισσότερα συµπεράσµατα που εξάγονται βρίσκουν εφαρµογή και στα πιο πολύπλοκα ενζυµικά συστήµατα. Για τους λόγους αυτούς, θα αναπτυχθεί κυρίως η κινητική των ενζυµικών αντιδράσεων µε ένα υπόστρωµα πριν αναφερθούν οι περιπτώσεις των ενζύµων µε πολλά υποστρώµατα.

25 Η συγκέντρωση του υποστρώµατος [S], είναι ένας από τους σηµαντικότερους παράγοντες που επιδρούν στην ταχύτητα [v], των ενζυµικών αντιδράσεων. Σε µια πρώτης τάξης µη εvζυµική αvτίδραση, η µεταβoλή της ταχύτητας, καθώς αυξάvει η συγκέντρωση του υποστρώµατος, είvαι σταθερή και η καµπύλη v = f(s) είvαι ευθεία. Στις περισσότερες περιπτώσεις σε µια ενζυµικήαντίδραση, το διάγραµµα της αρχικής ταχύτητας (ν) συναρτήσει της συγκέντρωσης του υποστρώµατοςέχειτηµορφή καµπύλης υπερβολής.

26 Τα σηµεία που προέρχονται από το πείραµα της µέτρησης της v=f (S), βρίσκονται επάνω σε µια καµπύλη, που αποτελεί τµήµα της καµπύλης που αποδίδεται µαθηµατικά σαν καµπύλη υπερβολής (χψ<0).

27 Ανορισθούνοισυντεταγµένες (χ 0, ψ 0 ) τηςαρχής (Ο) των αξόνων (χ',ψ' ή v,[s]) του τµήµατος της καµπύλης υπερβολής που αντιστοιχεί στη γραφική παράσταση v=f([s]) τουενζυµικού συστήµατος και θεωρηθείότιχ 0 =Κ Μ καιψ 0 = -Vmax, τότε ισχύουν τα ακόλουθα: Τυχόν σηµείο Μ (χ'=[s], ψ'= v) έχει συντεταγµένες χ=χ'+χ 0, ψ=ψ +ψ 0

28 Θέτοντας τις τιµές αυτές στην εξίσωση υπερβολής χψ=σταθερό, προκύπτει (χ'+χ 0 )(ψ +ψ 0 )=χ 0 ψ 0 οπότε ψ'(χ'+χ 0 )=χ 0 ψ 0 -ψ 0 (χ'+χ 0 )=-ψ 0 χ' καιλύνονταςωςπροςψ ψ' = -ψ 0 χ'/χ'+χ 0 Αλλά εξ ορισµού: τοψ' = v τοχ' = S τοψ 0 = - Vmaxκαι τοχ 0 = K M Και η προηγούµενη εξίσωση λαµβάνει τη γνωστή µορφή της εξίσωσης Michaelis-Menten, v = Vmax[S]/[S]+K M

29 Στις ενζυµικές αντιδράσεις ακολουθείται κινητική κορεσµού. Σεχαµηλές [S], η v εξαρτάταιτόσοαπότη [S] όσοκαιαπό τη [E]. Απόµίατιµή [S] καιµετά (όταντοεέχεικορεσθείαπότο S) η v είναι ανεξάρτητη από τη [S] και εξαρτάται µόνο απότη [E]. ηλαδή, σε υψηλές τιµές [S], το E έχει κορεσθεί από το S καιη v έχει αποκτήσει τη µέγιστη τιµή της το Vmax.

30 Tο 1902, οιβrownκαιηenriπρότεινανότιτοένζυµο δηµιουργεί αρχικά ένα σύµπλοκο µε το υπόστρωµα, το οποίο διασπάται στη συνέχεια σε ένζυµο και στα προϊόντα της αντίδρασης (Ρ) Ε + S ES (1) και ES E + P (2) όπουοικ 1, κ -1 καικ 2 σταθερέςταχύτητας, µεδιαστάσειςμ -1 sec -1 γιατηνκ 1 και sec -1 γιατιςκ -1 καικ 2. Tο 1913, οι Μichaelis - Μenten απέδωσαν µε µαθηµατικό τρόπο το µηχανισµό δράσης των ενζύµων, στηριζόµενοι στην ιδέα της δηµιουργίας του ενδιάµεσου συµπλόκου ενζύµου-υποστρώµατος.

31 Θεωρία των Μichaelis - Μenten (παραδοχή αποκατάστασης ισορροπίας) Βασίζεται στη γενική παραδοχή ότι έχει αποκατασταθεί µια ισορροπίαστοσύστηµα. Oι σηµαντικές παραδοχές είναι οι εξής: κ 1 ΗαντίδρασηµεταξύτουΕκαιτου S, Ε + S ES (1) παραµένει σε ισορροπία και οποιαδήποτε επίδραση της αντίδρασης ES E + P (2) κ στην (1), θεωρείταιαµελητέα. 2 Οι συνθήκες αυτές επιτυγχάνονται όταν ο ρυθµός διάσπασης του συµπλόκου ΕS προς Ε και S είναι πολύ µεγαλύτεροςαπότορυθµόδιάσπασήςτουσεεκαιρ (δηλαδήκ -1 >>κ 2 ). Η συγκέντρωση του ελεύθερου S παραµένει σχεδόν αµετάβλητηκατάτηναρχικήπερίοδοτηςαντίδρασης, και ισούται µε τη συγκέντρωση του ολικού S, δηλαδή [S] = [St]. κ -1

32 Η σταθερά διάστασης (Κs) του συµπλόκου ΕS ορίζεται ως [E][S] K = = κ -1 S ( 3) [ES] κ +1 Οι διαστάσεις της Κs είναι sec-1/m-1 sec-1=m, δηλαδήηκsέχειδιαστάσειςσυγκέντρωσης. Στην (3) ισχύει η σχέση [Ε] = [Εt] - [ΕS] (4) Η ταχύτητα της συνολικής αντίδρασης, µε βάση την αντίδραση ES E + P (2) δίνεταιαπότοντύπο dp v = = κ 2 [ ΕS] ( 5 dt Με αντικατάσταση της [Ε] από την εξίσωση (4) στην εξίσωση (3) λαµβάνεται η κάτωθι εξίσωση (6) ([ E ] - [ES])[S] K = t ( 6 ) S [ES] )

33 Η εξίσωση (6) αν λυθεί ως προς [ΕS] και αντικατασταθεί στην εξίσωση (5) λαµβάνεται η εξίσωση (7) v= κ 2 [ Et ][S] [S] + K Ότανη[S] είναιπολύµεγάλησεσύγκρισηµετηνκ S (δηλαδήκ S /S τείνειστο 0), τότεηv ισούταιµετογινόµενο κ 2 [Εt] καιέχειήδηορισθείσαν Vmax. v = κ 2 [ Et ][S] [S] Άραηεξίσωση (8) µπορείναγραφεί S = κ 2 ( [ 7 Ε ) t ] ( 8 ) v= V max [S] [S] + K S ( 9 )

34 Ησταθεράδιάστασηςτουσυµπλόκου (Κ S )ονοµάζεται σταθεράμichaelis -Μenten (Κ Μ )καιηεξίσωση (9) v= V max [S] [S] + K S ( 9 ) παίρνει την τελική µορφή της εξίσωσης Μichaelis- Μenten (10) v= V max [S] [S] + K M ( 10 )

35 Θεωρία των Βriggs Ηaldane (παραδοχή της αποκατάστασης σταθεροποιηµένης κατάστασης) Μία διαφορετική µαθηµατική προσέγγιση για τον τρόπο δράσης των ενζύµων, αποδόθηκε το 1925 από τους Βriggs καιηaldane. Η θεωρία τους βασίστηκε στην παραδοχή ότι σε κάθε χρονική στιγµή, ο ρυθµός σχη- µατισµού και διάσπασης του συµπλόκου ΕS είναι σχεδόν ίσος, έτσι ώστε να αποκαθίσταται µια δυναµική ισορροπία (steady state).

36 Με βάση τη θεωρία αποκατάστασης σταθεροποιηµένης κατάστασης κ 1 κ 2 Ε + S ES E + P ισχύει ότι κ -1 d [ES] dt = κ 1 [E][S] -κ -1[ES] -κ 2 [ES] = 0 ( 11) [Ε] = [Εt] - [ΕS] (4) dp v = = κ 2 [ ΕS] ( 5 dt Λύνοντας την (4) ως προς [Ε] και αντικαθιστώντας την τιµή αυτήστην (11), ηοποίαλύνεταιστησυνέχειαωςπρος [ES] και αντικαθιστώντας την τιµή αυτή στην (5) προκύπτει η σχέση )

37 v= κ 2 [ E t ] κ 1[S] κ 1[S] + κ -1+ κ 2 v= V max [S] [S] + κ κ κ 1 ( 12 ) Ονοµάζοντας το κλάσµα (κ -1 + κ 2 )/κ 1 = Κ Μ, η τελευταία εξίσωση είναι ίδια µε την εξίσωση των Μichaelis-Μenten, µε εξαίρεσηότιηκ S έχειαντικατασταθείαπότην Κ Μ όπου κ 1+ κ 2 2 K M = = K κ S + (13 κ κ +1 ΗΚ Μ έχειδιαστάσειςσυγκέντρωσηςδιότι τόσοηκ S όσοκαιολόγοςκ 2 /κ 1 =sec -1 /M -1 sec -1 =M, έχουν διαστάσεις συγκέντρωσης. 1 )

38 ΦυσικήσηµασίατωνσταθερώνΚ Μ και Vmax Για τον πλήρη ορισµό της φυσικής σηµασίας της σταθεράς Κ Μ πρέπειναείναιγνωστέςοιτιµέςτωνσταθερώνταχύτητας αφούµεβάσητηνεξίσωση κ 1+ κ 2 2 K M = = K κ S + (13 κ κ +1 µπορείναισχύουνοισχέσεις: κ -1 >>κ 2 κ -1 = κ 2 κ -1 < <κ 2 1 )

39 Ε + S κ 1 κ ES 2 E + P Κ Μ = κ -1 + κ 2 κ -1 κ +1 Κ S = κ -1 κ +1 Ανκ -1 > > κ 2, τότεηεξίσωσηαπλοποιείταικαι ηκ Μ ισούταιµετηνκ S και ισχύει η παραδοχή της αποκατάστασης ισορροπίας που έγινεστηθεωρίαμichaelis-μenten, δηλαδή είναι η σταθερά διάστασης του συµπλόκου ενζύµου-υποστρώµατος. Ανκ -1 = κ 2, τότεηεξίσωσηπαραµένειωςέχεικαι ηκ Μ έχειτηντιµήπουβγαίνειαπότηνπαραδοχήτης αποκατάστασης σταθεροποιηµένης κατάστασης.

40 Ε + S κ 1 κ ES 2 E + P Κ Μ = κ -1 + κ 2 κ -1 κ +1 Κ S = κ -1 κ +1 Ανκ -1 < < κ 2, τότεηκ Μ ισούταιµεκ 2 /κ 1 δηλαδήδενείναι παρά ο λόγος δύο σταθερών ταχύτητας των δύο διαδοχικών και πρακτικά µη αµφίδροµων αντιδράσεων κ 1 κ 2 E + S ES E + P όπου το αποτέλεσµα εξαρτάται πλέον από τη σχέση µεταξύ κ 2 καικ 1 δηλαδήαν κ 2 <κ 1 ή κ 2 >κ 1

41 κ 1 κ 2 E + S ES E + P Κ Μ = κ 2 κ 1 Ανκ 2 <κ 1 εξακολουθείναισχύειηυπόθεσηαποκατάστασης σταθεροποιηµένηςκατάστασης (d[es]/dt=0) έστωκαιανηδιάστασητου ES γίνεταιπρος E+P καιόχι προς E+S. Και στις δύο περιπτώσεις (είτε προς E+P είτε προς E+S) απελευθερώνεται ελεύθερο ένζυµο Ε, ενώ ισχύουν οι υπόλοιπες παραδοχές (ότι δηλαδή η συγκέντρωση υποστρώµατος [S] είναι αρκετά µεγαλύτερη από την [Et], ώστε να παραµένει πρακτικά σταθερή).

42 κ 1 κ 2 E + S ES E + P Κ Μ = κ 2 κ 1 Ανόµωςκ 2 >κ 1 τότεδενµπορείν αποκατασταθείούτε δυναµική ισορροπία, διότι το σύµπλοκο ES µόλις σχηµατισθεί διασπάται (δηλαδή η ταχύτητα διάσπασης είναι µεγαλύτερηαπότηνταχύτητασχηµατισµούτου ES). Εδώισχύουντότεοιίδιοινόµοιπουισχύουνσεαντίστοιχες µη καταλυτικές χηµικές αντιδράσεις που συντελούνται σε δύο ή περισσότερα στάδια (µε το σχηµατισµό βραχύβιων ενδιάµεσων προϊόντων), οπότε η ταχύτητα της συνολικής αντίδρασης ισούται µε την ταχύτητα του βραδύτερου σταδίου. Στην περίπτωσή µας αυτό (ταχύτητα του βραδύτερου σταδίου) είναι η πρώτη αντίδραση και v= κ 1 [E][S]

43 κ 1 κ 2 E + S ES E + P Κ Μ = κ 2 κ 1 Αφού, όπως αναφέρθηκε, το ES είναι βραχύβιο, πρακτικά όλο το ένζυµο είναι σε κάθε χρονική στιγµή διαθέσιµο για αντίδραση, δηλαδή [E] = [Et] [ES] = [Et]. Οπότεη v= κ 1 [E][S] γίνεται v=κ 1 [Et]. Αφούόµωςκαιτο [Et]=σταθερό, θαείναικαιτο v=σταθερό (δηλαδή dv/dt =0), οπότε η αντίδραση έχει τη µορφή αντίδρασηςψευδοµηδενικήςτάξηςµέχριςότουτο [S] ελαττωθείσηµαντικά. Όταν [S]<[E] η αντίδραση γίνεται πρώτης τάξης ως προς [S] καιτο v= κ 1 [S].

44 Με άλλα λόγια, η εξίσωση Michaelis-Menten µπορεί να θεωρηθεί µερική περίπτωση της γενικής εξίσωσης της Θεωρία των Βriggs Ηaldane που ισχύει όταν η ταχύτητα διάσπασηςτου [ES] προς E+P είναιαµελητέα (δηλαδήηκ 2 είναιπολύµικρότερητηςκ -1 ). Απόταπαραπάνωφαίνεταιότιανηταχύτηταµιας ενζυµικής αντίδρασης ανταποκρίνεται στην εξίσωση Μichaelis-Μenten, δε σηµαίνει ότι ανταποκρίνεται και στο πρότυπότης, δηλαδήότιηκ Μ είναισταθεράδιάστασηςτου συµπλόκουκαιισούταιµετηνκ S. Vmax Ανστιςεξισώσειςτωνδύοθεωριών v= δώσουµε v=vmax/2, προκύπτει ότι [S]+K Κ Μ =[S],αλλάκαιτοαντίστροφο. ηλαδήηκ Μ ισούταιµεεκείνητη συγκέντρωση υποστρώµατος, στην οποία η ταχύτητα της αντίδρασης έχει τη µισή τιµή της µέγιστης ταχύτητας. [S] M

45 ΗσταθεράΚ Μ όπωςφαίνεται έχει µονάδες συγκέντρωσης και αποτελεί χαρακτηριστική σταθερά του ενζύµου για συγκεκριµένουπόστρωµα. Επιπλέον, όσοµεγαλύτερηείναιητιµήτηςκ Μ, δηλαδή (όσο περισσότερο ποσό υποστρώµατος απαιτείται για να αποκτήσει η αντίδραση v = Vmax/2) τόσο µικρότερη είναι η τάση σύνδεσης (χηµικήσυγγένεια) µεταξύεκαι S και αντίστροφα.

46 ΤoΚ Μ είvαισπoυδαίασταθεράχαρακτηριστικήτoυ εvζύµoυ, έστω και αv δεv είvαι γvωστή η ακριβής σηµασία της, αφoύ καθoρίζει τηv πoσoτική εξάρτηση τoυ S από τo E. ΗΚ Μ αποτελείλοιπόνποσοτικήέκφρασητηςαντίδρασης σχηµατισµού του συµπλόκου ΕS Ε + S ΕS δείχνει την χηµική συγγένεια του Ε και S και είναι ανεξάρτητη από τη συγκέντρωση του ενζύµου. Η Vmax αποτελεί ποσοτική έκφραση της αντίδρασης διάσπασης του ΕS ΕS Ε+ Ρ καιεξαρτάταιαπότησυγκέντρωσητουενζύµου.

47 Οι παράγοντες που επηρεάζουν την αρχική ταχύτητα των ενζυµικών αντιδράσεων, επιδρώντας είτε στο σχηµατισµό του συµπλόκου, είτε στηδιάσπασήτου, είτε καισταδύο, µεταβάλλουντιςτιµέςτωνκ Μ και Vmax. Ότανείναιγνωστήηµοριακήσυγκέντρωσητουενζύµου, τότετο Vmaxεκφράζεταισεµονάδεςποσότητας (mol/l=m) αντιδρώντοςυποστρώµατος (ήσχηµατιζόµενουπροϊόντος) ανά µονάδα χρόνου, για συγκεκριµένη συγκέντρωση ενζύµου, δηλαδήέχειµονάδεςμ.min -1. Ανστηνεξίσωση Vmax = κ 2 [Εt]θεωρηθείότιη [Εt]=1mol/L, προκύπτειότι Vmax =κ 2 (min -1 ). Γιατολόγοαυτό, τοκ 2 ονοµάζεταιαριθµόςανακύκλωσης και δηλώνει πόσα µόρια υποστρώµατος αλλοιώνονται από ένα µόριο ενζύµου στη µονάδα του χρόνου. Ο αριθµός ανακύκλωσης αποτελεί επίσης χαρακτηριστική σταθερά του ενζύµου για συγκεκριµένο υπόστρωµα

48 Συνόψιση των παραδοχών για την παραγωγή της εξίσωσης Μichaelis-Μenten 1. Η δηµιουργία του ενδιάµεσου συµπλόκου ΕS. Η υπόθεση αυτή έχει µεγάλη σηµασία στηv κιvητική τωv εvζυµικώv αvτιδράσεωv και στηv καταvόηση τoυ µηχαvισµoύ αvαστoλής. 2.Τοένζυµοαντιδράµεέναµόνουπόστρωµα, δηλαδήτο S συνδέεταισεέναµόνοσηµείοµετοε. Αντοένζυµοαντιδρά µε n µόρια υποστρώµατος, γίνεται η αντίδραση ns + E ESn E + np και η ταχύτητα αντίδρασης ισούται µε [S] max n [S] Η ταχύτητα της αvτίδρασης θα παίρvει τηv τιµή Vmax/2 όταv η συγκέvτρωση τoυ υπoστρώµατoς γίvει [S]=K M 1/n. Ηγραφικήπαράσταση 1/v=f(1/S) δεvείvαιευθεία, ν = V + K n M

49 3. Στην ηµιαντίδραση Ε+S ΕS θεωρείται ότι αποκαθίσταται ισορροπία, ενώ στη δεύτερη ηµιαντίδραση ES E+P, ότι το ΕS διασπάται γρήγορα προς ένζυµο και προϊόντα. ηλαδή γίvεται η παραδoχή ότι η ταχύτητα σχηµατισµoύ τoυ ES καιηταχύτηταδιάσπασηςτoυ ES πρoςεκαι S είvαι πoλύ µεγαλύτερη από τηv ταχύτητα διάσπασης τoυ ES πρoς ΕκαιΡ. ΌλατααvωτέρωσυvoψίζovταιστηvυπόθεσηότιτoΚ Μ είvαιησταθεράδιάστασηςτoυ ES, πράγµαόχιπάvτα oρθό, όπωςφαίvεταιαπότηδιερεύvησητηςσχέσης (13). ιότι οι Brigg-Haldane δεν διατήρησαν αυτήν την παραδοχή, αλλά δέχθηκαν την σταθεροποιηµένη κατάσταση ισοζυγίου, που συµπεριλαµβάνει και την ηµιαντίδραση διάσπασης προς Ρ. κ 1 κ 2 E + S ES Ρ κ -1

50 4. Ενώ η συγκέντρωση του συνολικού ενζύµου ορίζεται σαν [Εt] = [Ε] + [ΕS] η συγκέντρωση του ελεύθερου υποστρώµατος θεωρείται ίση µε τη συγκέντρωση του ολικού υποστρώµατος [St]=[S] Ηπαραδοχήαυτήµπορείναγίνει, γιατίησχετική συγκέντρωση του υποστρώµατος ως προς το ένζυµο είναι πολύ µεγάλη και η δεσµευµένη ποσότητα του υποστρώµατος στοένζυµο, µπορείναθεωρηθείσαναµελητέα. Ανδενγίνειαυτήηπαραδοχή, τότεστονυπολογισµότης συγκέντρωσης του ΕS θα περιλαµβάνεται εκθετική εξίσωση.

51 5. Στην περιγραφή των σταδίων που διακρίνονται σε µια ενζυµική αντίδραση, δεν περιλαµβάνεται η αντίδραση κ 1 κ 2 κ 3 Ε + S ES EP E + P κ -1 κ -2 δηλαδήέγινεηπαραδοχήότιτοκ 3 είναιπολύµεγαλύτερο απότοκ -2 καιτοκ 2. Αυτό συµβαίvει πoλλές φoρές, χωρίς vα είvαι γvωστό ότι γίvεται στηv εvζυµική αvτίδραση. Αvδεvισχύειαυτήηυπόθεση, τότετα VmaxκαιΚ Μ δίvovται από τoυς ακόλoυθoυς πoλύπλoκoυς τύπoυς και είvαι πoλύ δύσκoλo vαεξηγηθείηφυσικήέvvoιατoυκ Μ. V max = κ3κ2 κ 2 + κ [ E ] -2 t + κ 3 K M = κ -1 κ κ 1-2 ( κ + 2 κ + -1 κ κ κ2κ3 κ 3 )

52 6. Tέλος, δε λαµβάνεται υπόψη η αντιστρεπτότητα της αντίδρασης, αν και είναι γνωστό ότι τα ένζυµα καταλύουν συνήθωςτηναντίδρασηκαιπροςτιςδύοκατευθύνσεις. Γι αυτότολόγο, έχειήδηαναφερθείότιηταχύτηταπου προσδιορίζεται είναι η αρχική, δηλαδή ότι η συγκέντρωση των προϊόντων θεωρείται αµελητέα. Σε αντίθετη περίπτωση, η ταχύτητα της αvτίδρασης θα είvαι συvάρτηση τωv Vmax, K M, [S], αλλάκαιτων [P], V'maxκαιΚ' Μ (πρoςτηvαvτίθετηκατεύθυvση).