(Στάδια τεχνολογίας rdna)

Transcript

1 (Στάδια τεχνολογίας rdna) Έτσιτακοσµίδια (σανπλασµίδια): Αφ ενόςµενπεριέχουνµιαθέσηγιατηδράση περιοριστικής ενδονουκλεάσης και συνεπώς εισαγωγής ξένου DNA (και µάλιστα µεγάλου µεγέθους), Αφ ετέρου δε, περιέχουν ένα γονιδιακό δείκτη αντοχής σ ένα αντιβιοτικό που κάνει εύκολη τη συλλογή βακτηριακών ξενιστών που περιέχουν τοανασυνδυα-σµένοκοσµίδιο. Μπορούν ακόµα να πακεταριστούν σε πρωτεϊνικές κάψεςτωνιών, καιναµεταφέρουνεύκολατοξένο DNA στοβακτηριακόξενιστή. Παρ όλααυτάόµωςδελύνουντοπρόβληµατης αστάθειας των πλασµιδίων.

2 Εισαγωγή ανασυνδυασµένου DNA στο κύτταρο του ξενιστή. 1 ος )Τρόπος: Πολλά βακτήρια και ευκαρυωτικά κύτταρα έχουν την ικανότητα να προσλαµβάνουν από το περιβάλλον (από το θρεπτικόµέσο) γυµνάµόρια DNA. Ηπρόσληψηαυτήείναιβέβαιαπολύµικρή (1 µόριο DNA από 10 6 µόρια DNA), αλλάσεκατάλληλεςπειραµατικές συνθήκεςγίνεταισεικανοποιητικόβαθµό. Τααποτελέσµαταείναικαλύτεραότανχρησιµοποιηθούν, όπως συνήθως συµβαίνει, κύτταρα µεταλλαγµένων βακτηρίωνπουδεναποικοδοµούνγρήγορατοξένο DNA. Πρόσληψη rdna µπορεί να γίνει και από ζωϊκά κύτταρα, τα οποία έχουν την ικανότητα να προσλαµβάνουν ξένα µόρια DNAπουέχουνκαταβυθισθείµεφωσφορικόκάλιο. Ανκαιηπρόσληψηκαιστησυνέχειαηενσωµάτωσητου ξένου DNA στοχρωµοσωµικό DNA τουκυττάρουείναιµικρή, εντούτοις η µέθοδος χρησιµοποιείται γιατί είναι πολύ απλή

3 (Εισαγωγή ανασυνδυασµένου DNA στο κύτταρο του ξενιστή.) 2 ος )Τρόπος: Μέθοδος µε καλύτερα αποτελέσµατα που χρησιµοποιείται στα ζωϊκά κύτταρα, είναι η εισαγωγή ξένου DNA µεγυάλινηµικροσύριγγα (διαµέτρου 0,1 µm) στονπυρήνατουκυττάρου. Ένα εκπαιδευµένο άτοµο µπορεί να κάνει τέτοια ένεση σε εκατοντάδες κύτταρα την ώρα και ένα ποσοστό αυτών των κυττάρων να είναι βιώσιµα και να περιέχουντοξένο DNA (νέαγονίδια). 3 ος )Τρόπος: Πρόσληψη ξένου DNA µπορεί να γίνει και από φυτικά κύτταρα στα οποία έχει αποµακρυνθεί το κυτταρικό περίβληµα, µετά από κατεργασία µε κυτταρινάση, όταν το ξένο DNA περιέχεται στο θρεπτικό υλικό µαζί µε ασβέστιο και πολυαιθυλενογλυκόλη.

4 (Εισαγωγήανασυνδυασµένου DNA στοκύτταροτουξενιστή). 4 ος ) Τρόπος: Σε µερικά είδη φυτικών κυττάρων, όπως τα δικοτυλήδονακαιµερικάείδηαπόταµονοκοτυλήδονα (όχιόµωςτα σηµαντικά από εµπορική άποψη µονοκοτυλήδονα δηµητριακά) το ξένο DNA µπορεί να εισαχθεί µε τη βοήθειατωνπαραγώγωντουτi-πλασµιδίου. Συγκεκριµένα, µερικάείδηβακτηρίωντουεδάφους (π.χ. Agrobacterium tumefaciens) µολύνουν τα φυτά και εισάγουνξέναγονίδιασ αυτά. Στοσηµείοτηςµόλυνσηςαναπτύσσεται ένας όγκος (κάλλος) από φυτικά κύτταρα, αντίστοιχα των ζωϊκών καρκινικών κυττάρων, που συνθέτουν παράγωγα αµινοξέων που είναι απαραίτητα για τα βακτήρια αυτά.

5 (Εισαγωγή ανασυνδυασµένου DNA στο κύτταρο του ξενιστή.) 4ος ) Τρόπος: Η αλλαγή του µεταβολισµού των µολυσµένων φυτικών κυττάρων για να παράγουν τα απαραίτητα συστατικά για τα βακτήρια γίνεται από την εισαγωγή του Ti-πλασµιδίου από τα βακτήρια στα φυτικά κύτταρα, οπότε ένα µικρό ποσοστό από τα Tiπλασµίδια ενσωµατώνεται στο DNA των φυτικών κυττάρων.

6 (Εισαγωγή ανασυνδυασµένου DNA στο κύτταρο του ξενιστή.) 5ος ) Τρόπος: Έναςπιοπολύπλοκοςτρόπος (electroporation) βασίζεται στο γεγονός ότι οι πλασµατικές µεµβράνες των φυτικών κυττάρων, όταν βρεθούν σε υψηλό ηλεκτρικό πεδίο, γίνονται παροδικά διαπερατές από µεγάλα µόρια. Όταν λοιπόν εφαρµοσθεί ηλεκτρικό πεδίο σε κύτταρα στα οποία έχει αποµακρυνθεί το κυτταρικό περίβληµα παρουσία ξένου DNA, το DNA αυτό µπαίνει µέσα στο κύτταρο. Στη συνέχεια αφήνονται τα κύτταρα να ξαναφτιάξουν το κυτταρικό τους περίβληµα και γίνονται πια βιώσιµα κύτταρα που περιέχουν ξένο DNA, ενσωµατωµένο στο δικό τους DNA. Η µέθοδος αυτή έχει εφαρµοστεί στα δηµητριακά.

7 (Εισαγωγήανασυνδυασµένου DNA στοκύτταροτουξενιστή). 6 ος ) Τρόπος: Άλλοςτρόποςεισαγωγήςτουξένου DNA στα κύτταραγίνεταιµετουςιούς. Ο τρόπος αυτός είναι περισσότερο αποδοτικός και παρουσιάζει πολλά πλεονεκτήµατα σε σχέση µε τις άλλεςµεθόδουςπουαναφέρθηκαν. Στα µεν βακτήρια π.χ. E.coli οι περισσότεροι γνωστοίιοίείναιολφάγοςκαιο M13. ΟΜ 13έχειτοπλεονέκτηµαναµησκοτώνειτο βακτηριακόξενιστή. Σταζωϊκάκύτταραοιπιοαποδοτικοίιοίείναι οι ρετροϊοί (συνήθως δε σκοτώνουν τον ξενιστή) οιός SV40πουείναιοπερισσότερο συνηθισµένος ιός που χρησιµοποιείται σα φορέας.

8 Κλωνοποίηση: Στα στάδια της τεχνολογίας rdna ακoλoυθεί τo στάδιo της κλωvoπoίησης, δηλαδή της απoµόvωσης εvός καθαρoύ κλώvoυ κυττάρωv τoυ ξεvιστή πoυ vα περιέχoυv τo rdna. Η κλωvoπoίηση αρχίζει µε τηv εφαρµoγή τoυ φαιvoµέvoυ τoυ µετασχηµατισµoύ τoυ ξεvιστή χρησιµoπoιώvτας τoµίγµατωvµoρίωv rdnaπoυπαρασκευάστηκε. Ταµόριαόµωςαυτά είναι λίγα, για να µπορέσουν να χρησιµοποιηθούν για οποιαδήποτε εργασία, συνυπάρχουν δε µ ένα µεγάλο αριθµό άλλων µορίων DNA πουδενέχουνανασυνδυασθεί. Ακόµη λιγότερα είναι εκείνα που έχουν εισαχθεί στον ξενιστή, ώστε τελικά να υπάρχουν στη διάθεσή µας πολύ λίγα µετασχηµατισµένα κύτταρα που να περιέχουν το rdnaκαιµάλιστασεµιαγονιδιακήβιβλιοθήκη.

9 (Κλωνοποίηση) Ένααπόταπιοδύσκολαπροβλήµαταείναιναξεχωρίσει κανείς τα κύτταρα που θέλει και να τα καλλιεργήσει. Η έκταση του προβλήµατος φαίνεται από το ακόλουθο παράδειγµα: Έστω ότι µελετάται το γονίδιο της αυξητικής ορµόνης τουανθρώπου. Ξεκινώντας, κατά τα γνωστά, από το DNA του ανθρώπουκόβεταισεκοµµάτιαµετοένζυµο EcoRI, εισάγονται όλα τα κοµµάτια σε πλασµίδια και αυτά σε κύτταρα E.coli. Αν το γονίδιο που µελετάται έχει συµπεριληφθεί σ ένατέτοιοκοµµάτικαιαφούτο DNA απότοένζυµο EcoRI έχει κοπεί σε περίπου κοµµάτια, στην πραγµατικότητα γίνεται προσπάθεια να εντοπισθεί ένα είδος κυττάρου δουλεύοντας στη γονιδιακή βιβλιοθήκη µεαναλογίακυττάρων προς 1.

10 (Κλωνοποίηση) Το πρόβληµα της πιστοποίησης των κυττάρων αυτών αντιµετωπίζεται µε διάφορους τρόπους: 1 ος ) Τρόποςπιστοποίησης Βασίζεται στις ιδιότητες του φορέα, δηλαδή την ικανότητα µερικών πλασµιδίων να κάνουν ανθεκτικό τον ξενιστή σ ένα ή δύο αντιβιοτικά, µε αποτέλεσµα η καλλιέργεια του συνόλου των κλώνων του ξενιστή παρουσία των αντιβιοτικώναυτών, παρεµποδίζει την ανάπτυξη των ανεπιθύµητων κλώνων

11 (Κλωνοποίηση) 2 ος ) Τρόπος πιστοποίησης: Βασίζεταισ αυτότο ίδιοτοξένογονίδιοκαι συνίσταται στο να ψαρέψει κανείς το ζητούµενοκλώνο, δηλαδή το επιθυµητό εκείνο κύτταρο του ξενιστή µε κάποιο ειδικό αγκίστρι, που δενείναιάλλοαπότο συµπληρωµατικό DNA (cdna) ή το αντίστοιχο mrna που έχει ιχνοθετηθείµε 32 Ρ.

12 (Κλωνοποίηση: 2ος ) Τρόπος πιστοποίησης) Ηόληπορείαέχειωςεξής: Οιαποικίεςτωνκλώνωντου ξενιστή αν έχουν χρησιµοποιηθείπλασµίδια (ήοιπλάκεςαν έχουνχρησιµοποιηθείφάγοι) αποτυπώνονται σ ένα φίλτρο νιτροκυτταρίνης. Μεαυτότοντρόπο µεταφέρονται στο φίλτρο µερικά βακτήρια από τις αποικίες, αλλά στις ακριβώς αντίστοιχες θέσεις που είχανοιαποικίες. Το φίλτρο κατεργάζεται µε NaOH για τη λύση των κυττάρωνκαιτηµετουσίωσητου DNA (ηδιπλήαλυσίδαςγίνεταιµονή).

13 (Κλωνοποίηση: 2ος ) Τρόπος πιστοποίησης) Σταθεροποιείται το DNA στο φίλτρο µε ξήρανση σε φούρνοκενού. Tοφίλτροεπωάζεταισε διάλυµα επίσης µετουσιωµένου σε θέρµανση ραδιενεργού cdna, ώστε να σχηµατισθούν οι διπλές αλυσίδες από τα DNA του ξενιστή και τα cdna. Aποµακρύνεται το αδέσµευτο cdna µε ξέπλυµα.

14 (Κλωνοποίηση: 2ος ) Τρόπος πιστοποίησης) Τοφίλτρο υποβάλλεται σε αυτοραδιογράφηση, οπότε εντοπίζεται η αποικία που περιέχει το δεσµευµένο cdna και συνεπώς περιέχει καιτογονίδιοπου αναζητάται.

15 (Κλωνοποίηση) 3 ος ) Τρόπος πιστοποίησης: Στις περιπτώσεις όµως (καιείναιοι περισσότερες) που δεν υπάρχει διαθέσιµο τοκατάλληλο cdna, χρησιµοποιούνται άλλοι τρόποι που βασίζονται στις πρωτεΐνες που παράγονται από το ξένο αυτό γονίδιο του ξενιστή. Γιαπαράδειγµα, γίνεται µεταφορά των αποικιώνσεφίλτρα.

16 (Κλωνοποίηση:3ος ) Τρόπος πιστοποίησης) Προστίθεται πλήρες mrna από τον οργανισµό κάτω από συνθήκες που ευνοούν τον υβριδισµό του DNA-mRNA. Τα µη δεσµευµένα mrna αποµακρύνονται µε πλύσιµο. Τα δεσµευµένα mrna παραλαµβάνονται µε αραιό διάλυµα αλάτων και προστίθενται σε κατάλληλο in vitro σύστηµα για πρωτεϊνοσύνθεση. Παραλαµβάνονται οι αντίστοιχες πρωτεΐνες, που πιστοποιούνται µε χηµικές ή βιολογικές ή ανοσολογικές µεθόδους.

17 (Κλωνοποίηση: 3ος ) Τρόπος πιστοποίησης) Ανµιααποικίαφέρειτο ζητούµενο rdna, αυτόθαδεσµεύσειτο αντίστοιχο mrna, µε την πρωτεϊνοσύνθεση θα συντεθεί η αντίστοιχη πρωτεΐνη και µετηνπιστοποίησητης πρωτεΐνης αυτής θαβρεθείηαποικίαµετο ξένοαυτό DNA.

18 (Κλωνοποίηση) Το cdnaµπορείνασυντεθείχηµικά, ότανείναιγνωστήησειράτωναµινοξέωνστην πρωτεΐνη ήσεµέροςτηςπρωτεΐνηςπουπαράγεταιαπό τονξενιστήµετοξένο DNA. Τοπρόβληµασ αυτήτηνπερίπτωσηείναιότιθα πρέπει να συντεθεί µίγµα νουκλεοτιδίων για µια δεδοµένησειράαµινοξέων, αφού κάθε αµινοξύ µπορεί να κωδικοποιείται µε περισσότερους του ενός τρόπους.

19 (Κλωνοποίηση) Όταv η κλωvoπoίηση γίvεται µε στόχo τηv παραγωγή µεγάλωv πoσoτήτωv ενός εvζύµoυ ή πεπτιδικής oρµόvης κ.λπ. πoυ κωδικoπoιείται από τoαvασυvδυασµέvoγovίδιo, τότεπρoκύπτoυv πρόσθετα πρoβλήµατα, επειδή κάθε κύτταρo διαθέτει ειδικoύς µηχαvισµoύς, πoυ ρυθµίζoυv πότε και αv θα αρχίσει και πότε θα σταµατήσει η έκφραση κάπoιας γεvετικής πληρoφoρίας τoυ γεvετικoύ υλικoύτoυ.

20 (Κλωνοποίηση) Έτσι, έvας από τoυς πιo σηµαvτικoύς στόχoυς της τεχvoλoγίας rdna είvαι vα δηµιoυργήσει vέoυς φoρείς, πoυ vα περιέχoυv τoυς ρυθµιστικoύς µηχαvισµoύς έκφρασης γovιδίωv τoυ ξεvιστή σε γειτovικές θέσεις µε τo σηµείo, όπoυ θα πρoστεθεί τo ξέvo DNA, ώστε vα βελτιστoπoιείται η έκφραση της επιθυµητής γεvετικής πληρoφoρίας στις συvθήκες της βιoµηχαvικής βιoδιεργασίας.

21 (Κλωνοποίηση) Επίσης, o φoρέας µπoρεί vα εξoπλισθεί µε τις ρυθµιστικές αλληλoυχίες βάσεωv πoυ vα κωδικoπoιoύvτιςπρωτεΐvεςπoυδίvoυvτoσήµα γιααπέκκρισητωvεπιθυµητώvπρωτεϊvικώv µoρίωv από τo κύτταρo-ξεvιστή, πράγµα πoυ απλoπoιεί σηµαvτικά τo στάδιo καθαρισµoύ τoυ πρoϊόvτoς στη βιoµηχαvική κλίµακα.

22 Οι τελευταίες εξελίξεις στov τoµέα της αυτoµατoπoιηµέvης αvάλυσης της αλληλoυχίας αµιvoξέωv και της χωρoταξικής δoµής τωv πρωτεϊvικώvµoρίωvµεηλεκτρovικoύςυπoλoγιστές και µε κρυσταλλoγραφικές µελέτες σκέδασης ακτίvωv Χ, δίvoυv αvεκτίµητες πληρoφoρίες για τις αλλαγές στηv αλληλoυχία αµιvoξέωv, πoυ µπoρoύv vαπρoικίσoυvέvαέvζυµoµεεπιθυµητέςιδιότητες, όπωςηθερµoαvθεκτικότητα. Η επίσης αυτoµατoπoιηµέvη σήµερα παρασκευή τωvαvτίστoιχωvσυvθετικώvµoρίωv DNAδίvoυv ακόµα πιo συvταρακτικές δυvατότητες στηv τεχvoλoγία rdna.