Το δόγμα της Μοριακής Βιολογίας

Transcript

1 Το δόγμα της Μοριακής Βιολογίας To DNA είναι το βασικό μόριο φορέας και διατηρησης της γενετικής πληροφορίας. Με τη διαδικασία της αντιγραφής του DNA το μητρικό μόριο διπλασιάζετα σε δυο θυγατρικά και έτσι η γενετική πληροφορία μεταβιβάζεται από γενια σε γενιά. Η γενετική πληροφορία εκφράζεται σε λειτουργικά μόρια-πρωτεϊνες.αυτό πραγματοποιείται σε δύο βήματα: Aρχικά με τη διαδικασία της μεταγραφής η πληροφορία του DNA μεταβιβάζεται τμηματικά σε RNA- το RNA μεταφέρει την πληροφορία σε θέσεις παραγωγής πολυπεπτιδίων-τα ριβοσώματα. Έκει σε δευτερο χρόνο αποκωδικοποιείται η γενετική πληροφορία των νουκλεοτιδίων σε κώδικα αμινοξέων (γενετικός κώδικας). Αποκλίσεις από το κλασικό μοντέλο παρατηρούμε κατά το κύκλο ζωής των ιών. Εδώ, συναντάμαι δίκλωνο RNA που μπορεί να διπλασιαστει με αντιγραφή RNA (RNA ιοι) ενώ σε ρετροιούς το RNA αναπαράγεται χρησιμοποιώντας ως ενδιάμεσο μόριο DNA (ανάστροφη μεταγραφή)

2

3 ΣΤΕΡΕΟΔΙΑΤΑΞΗ ΤΟΥ DNA (B-DNA) Κυλινδρόμορφη δομή με 10.5 bp ανά στροφή και διάμετρο 23.7 Å. Παρουσιάζονται μεγάλη και μικρή αύλακα Εξωτερικά ραχοκοκαλία δεοξυριβόζης- φωσφορικού με φωσφοδιεστερικούς δεσμους- συμβατικά 5>3 κατευθυνση. Οι δύο άλυσοι αλληλεπιδρούν με Η-δεσμους πουρίνης-πυριμιδίνης [ Α-Τ (2) και G- C(3) ]

4 Τήξη του DNA Αποδιάταξη των δύο κλώνων με προσφορά θερμότητας. Tm: θερμοκρασία όπου το 50% των δεσμών αλληλεπίδρασης έχουν λυθεί. Το Τm εξαρτάται από το ποσοστό GC, από την αλατότητα, το μεγεθος του μορίου και την παρουσία αποδιατακτικών παραγόντων.

5 Οι καμπύλες Cot περιγράφουν την κινητική επαναδιάταξης του πλήρως αποδιατεταγμένου DNA. Όταν η κατανομή GC-AT είναι ομοιόμορφη σε όλο το γένωμα -όπως συμβαίνει σε εξελικτικά απλούς οργανισμούς (άνω τμήμα)- η καμπύλη είναι σιγμοειδής. Σε εξελικτικά πολύπλοκους οργανισμούςπολυκύτταρους ευκαρυωτικούς- η κατανομή GC-AT ποικίλει ανάλογα με την περιοχή του γονιδιώματος και η καμπύλη που προκύπτει είναι πολυσιγμοειδής.

6 Οργάνωση του γενώματος στα ευκαρυωτικά Το γενετικό υλικό στα ευκαρυωτικά οργανώνεται σε: 1. Περιοχές που περιλαμβάνουν γονίδια και εκτείνονται στο 25% του γενώματος. Από αυτές το 1/10 περίπου είναι κωδικές περιοχές και το υπόλοιπο αποτελεί ρυθμιστικές περιοχές. 2. Περιοχές που περιλαμβάνουν πολλαπλά αντίγραφα γονιδίων (rrna) ή οικογένειες γονιδίων 3. Περιοχές που περιλαμβάνουν επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες: i) περιοχές δορυφορικού/μικροδορυφορικού DNA ii) μεταθετά στοιχεία: τρανσποζόνια, ρετροτρανσποζόνια-ltrs,lines,sines 4. Δομικές περιοχές των χρωμοσωμάτων: περιοχές έναρξης αντιγραφής, κεντρομερίδια, τελομερή, περιοχές πρόσδεσης στον πυρηνοσκελετό.

7 Το πείραμα των Meselson -Stahl Ημισυντηρητικός τρόπος αντιγραφής DNA

8 DNA πολυμεράσες Προκαρυωτικά- DNA εξαρτώμενες DNA πολυμεράσες (Pol I,II, III, IV, V) Pol I: εμπλέκεται στην επιδιόρθωση βλαβών- έχει 5'->3' δράση (πολυμερισμός) αλλά και δράση εξωνουκλεάσης: 3'->5' (επιδιόρθωση) και 5'->3' (απομάκρυνση των RNA εκκινητών). Pol III: η κύρια πολυμεράση του διπλασιασμού του DNA - έχει 5'->3' δράση (πολυμερισμός) αλλά και δράση εξωνουκλεάσης: 3'->5' (επιδιόρθωση) Ευκαρυωτικά- DNA εξαρτώμενες DNA πολυμεράσες (Pol α, β, γ, δ, ε, ζ, η, ι, κ) Pol α (ονομάζεται κι RNA πριμάση): είναι υπεύθυνη για τη σύνθεση του εκκινητή RNA και στη συνέχεια επέκταση με τμήμα δεοξυριβονουκλεϊκού οξέος. Pol δ: είναι η κύρια πολυμεράση που λειτουργεί στον καθυστερημένο- ακολουθό κλώνο- έχει 5'- >3' δράση (πολυμερισμός) αλλά και δράση εξωνουκλεάσης: 3'->5' (επιδιόρθωση) Pol ε: είναι η κύρια πολυμεράση που λειτουργεί στον οδηγό κλώνο- έχει 5'->3' δράση (πολυμερισμός) αλλά και δράση εξωνουκλεάσης: 3'->5' (επιδιόρθωση) Pol β: εμπλέκεται σε μηχανισμούς επιδιόρθωσης και στην συμπλήρωση κενών τμημάτων κατά το διπλασιασμό Pol γ: είναι η κύρια πολυμεράση που λειτουργεί στο διπλασιασμό και την επιδιόρθωση του DNA στα μιτοχόνδρια Ρετροιοί- RNA εξαρτώμενες DNA πολυμεράσες (ανάστροφες μεταγραφάσες) HIV-1, M-MLV, AMV

9 Shevelev IV, Hübscher U. The 3' 5' exonucleases. Nat Rev Mol Cell Biol May;3(5):364-76

10 Η DNA εξαρτώμενη DNA πολυμεράση και η αντίδραση πολυμερισμού

11 Η ψαλίδα(διχάλα) διπλασιασμού. Στον οδηγό κλώνο το νεο μόριο είναι ένα ενιαίο προϊόν πολυμερισμού. Στον ακόλουθο κλώνο ο πολυμερισμός είναι τμηματικός και ξεκινάει από εναρκτήρια μόρια RNA- κομματια Okazaki Ακολουθόν κλώνος Τμήματα Οkazaki Διχάλα διπλασιασμού Οδηγός κλώνος

12 Μάτι- θηλεία διπλασιασμού Οριοθετείται από διχάλες διπλασιασμού Ξεκινάει από ένα σημείο έναρξης διχάλα διπλασιασμού

13

14 Σημεία έναρξης διπλασιασμού Περιοχές πλούσιες σε A/T Μοναδικό σε χρωμόσωμα ευβακτήριων, σε πλασμίδια σε μιτοχονδριακό& χλωροπλαστικό DNA Ενα μέχρι 3 σε αρχαιοβακτήρια και πολλαπλά σε ευκαρυωτικά (τουλάχιστον 1 ανα χρωμόσωμα) Χαρακτηρίζουν μια περιοχή διπλασιασμού- replicon

15 Εναρξη αντιγραφής σε προκαρυωτικά Η περιοχή έναρξης της αντιγραφής αναγνωρίζεται από την DnaA (A). Ξεκινάει η αποδιάταξη του DNA (Β) και στην περιοχή η DnaC μεταφέρει την ελικάση DnaB (C). Το μονόκλωνο DNA προστατεύεται με τις πρωτεϊνες σύνδεσης σε μονόκλωνο DNA- SSB. Στην περιοχή μεταφέρονται οι: πριμάση DnaG και η DNA Polymerase III (D, E). Βοηθητικές πρωτεϊνες είναι (E): οι πρωτεϊνες συγκράτησης της Pol III στο DNA- clamp Proteins, η τοποισομεράση που χαλαρώνει το συνεστραμένο DNA και η λιγάση (ligase) που συνδέει τα κομμάτια αναδιπλασιασμένου DNA.

16 Εναρξη αντιγραφής σε ευκκαρυωτικά Η περιοχή έναρξης της αντιγραφής αναγνωρίζεται από τις πρωτεϊνες ORC1-6, στο σύμπλοκο προσδένεται η Cdc6. Αυτή με τη σειρά της αλληλεπιδρά με τη Cdt1. Η τελευταία βοηθά στο να φορτωθεί το σύμπλοκό της ελικάσης MCM2-7. Η κυκλινοεξαρτώμενες κινάσες φωσφορυλιώνουν το MCM2-7 με αποτέλεσμα να αντικατασταθεί η Cdt1 από τη MCM10. Το νέο σύμπλοκο προσδένει τη CDC45 που με τη σειρά του φέρνει στην περιοχή την DNA Polα/ πριμάση, τις DNA Polδ,ε. Βοηθητικές πρωτεϊνες είναι: η πρωτεϊνη συγκράτησης της Pol δ, ε στο DNA- PCNA, η πρωτεϊνη σύνδεσης σε μονόκλωνο DNA- RPA, η τοποισομεράση που χαλαρώνει το συνεστραμένο DNA και η λιγάση (ligase) που συνδέει τα κομμάτια αναδιπλασιασμένου DNA. Bryant J A, and Aves S J Ann Bot 2011;107:

17 Ο SV40 χρησιμοποιεί τη μηχανή διπλασιασμού DNA του κυττάρου ξενιστή. Το εναρκτήριο σύμπλοκο διπλασιασμού βασίζεται στο LTAg που έχει το ρόλο ελικάσης.

18

19 ΟΙ ΠΡΩΤΕΙΝΕΣ TOY ΔΙΠΛΑΣΙΑΣΜΟY ΤΟΥ DNA ΣΤΑ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΑ DNA πολυμεράση δ DNA λιγάση RNA εκκινητής DNA πριμάση KOMMATI OKASAKI Τοποϊσομεράση DNA πολυμεράση ε Ελικάση Πρωτεϊνες σύνδεσης σε μονόκλωνο DNA

20 Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΠΟΥ ΣΥΜΜΕΤΕΧΟΥΝ ΣΤΟ ΔΙΠΛΑΣΙΑΣΜΟ DNA Helicase- Eλικάση: Πρωτεϊνη αποδιάταξης δίκλωνου DNA. DNA Polymerase- DNA πολυμεράση: Ενζυμο πολυμερισμού DNA. Επίσης έχει και επιδιορθωτική ικανότητα. DNA clamp: πρωτεϊνη σταθεροποίησης του DNA- Πολυμεράση συμπλόκου. Single-Strand Binding (SSB) Proteins: Πρωτεϊνη προσδεσης σε μονόκλωνο DNAδιατήρηση και προστασία του μονόκλωνου DNA. Topoisomerase- Τοποϊσομεράση: χαλαρώνει την υπόλοιπη δίκλωνη δομή από τάση υπερελίκωσης λόγω κίνησης της διχάλας διπλασιασμού- προηγείται της διχάλας. DNA Gyrase- DNA γυράση: συστρέφει το DNA- στο σύνολο του μορίου αντιρροπεί τη δράση της τοποϊσομεράσης μετά το διπλασιαμό. DNA Ligase- Λιγάση: συνδέει τα κενά με φωσφοδιεστερικούς δεσμούς. Primase- Πριμάση: Κατασκευάζει το εναρκτήριο μόριο RNA για προαγωγή του πολυμερισμού. Telomerase- Τελομεράση: Επεκτείνει τα τελομερή στα άκρα των χρωμοσωμάτων.

21 Η ΒΑΣΙΚΗ ΜΟΝΑΔΑ ΔΙΠΛΑΣΙΑΣΜΟ ΤΟΥ DNA- ΤΟ REPLISOME Cell Cycle September 1;8(17):

22 ΒΛΑΒΗ ΤΟΥ DNA ΒΛΑΠΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ: Μεταβολικές ρίζες οξυγόνου, αζώτου Λαθη κατά την αντιγραφή Υπεριώδης ακτινοβολία Ιονίζουσα ακτινοβολία Μεταλλαξογόνες ουσίες: που προκαλούν αλκυλίωση, υδρόλυση βάσεων, υποκατάσταση βάσεων, αλλαγή στερεοδιάταξης Ιοί ΕΠΙΔΙΟΡΘΩΣΗ ΤΟΥ DNA Βλάβες στο DNA μπορεί να συμβούν σε οποιαδήποτε φάση του κυτταρικού κύκλου: πριν την αντιγραφή (G1), κατά την αντιγραφή (S), μετά την αντιγραφή και πριν τη διαίρεση του κυτταρου (G2),, κατά τη διαίρεση του κυτταρου (Μ). Το κύτταρο έχει μηχανισμούς ελέγχου της ακεραιότητας του γενετικού υλικού στο μεταίχμιο των παραπάνω φάσεων: G1/S, S, G2/M, M. Η επιδιόρθωση μπορεί να γίνει κατά ή ανεξάρτητα του διπλασιασμού. Υπάρχούν πολυμεράσες που επιτρέπουν τη συνέχιση της αντιγραφής παρακάμπτωντας τη βλάβη. Τα συστήματα επιδιόρθωσης ταξινομούνται ανάλογα με τον αν η βλάβη είναι στον ένα ή και στους δύο κλώνους του DNA.

23 Microbiol Mol Biol Rev March; 73(1):

24 ΑΝΤΙΚΑΤΆΣΤΑΣΗ ΒΑΣΗΣ DNA γλυκοζυλαση: αφαιρεί τη λάθος βάση ΑΡ ενδονουκλεάση: αναγνωρίζει και κόβει στη θέση έλλειψης βάσης ΑΡ λυάση: υδρολύει και απομακρύνει τη φωσφορική δεοξυριβόζη DNA πολυμεραση β: συμπληρώνει το κενό DNA λιγάση: συμπληρώνει το φωσφοδιεστερικό δεσμό

25 ΕΠΙΔΙΟΡΘΩΣΗ ΒΛΑΒΗΣ ΛΑΘΟΥΣ ΖΕΥΓΑΡΩΜΑΤΟΣ ΒΑΣΕΩΝ Σύμπλοκο MSH2/MSH6: αναγνωρίζει το λάθος Προσθήκη συμπλόκου MLH/PMS: δράση ενδονουκλεάσης Προσθήκη ελικάσης και εξωνουκλεάσης: αφαίρεση του νουκλεοτιδικού τμήματος DNA πολυμεραση: συμπληρώνει το κενό DNA λιγάση: συμπληρώνει το φωσφοδιεστερικό δεσμό

26 ΕΠΙΔΙΟΡΘΩΣΗ ΜΕ ΑΦΑΙΡΕΣΗ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΩΝ ΣύμπλοκοXPC/Rad23B: αναγνωρίζει το λάθος Προσθήκη συμπλόκου TFIIH/XPG/RPA: ξεδιπλώνει την περιοχή της βλάβης Προσθήκη XPF: αφαίρεση του νουκλεοτιδικού τμήματος DNA πολυμεραση: συμπληρώνει το κενό DNA λιγάση: συμπληρώνει το φωσφοδιεστερικό δεσμό

27 ΕΠΙΔΙΟΡΘΩΣΗ ΣΠΑΣΙΜΑΤΟΣ ΔΙΠΛΗΣ ΕΛΙΚΑΣ ΜΕ ΜΗ ΟΜΟΛΟΓΟ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΟ Σύμπλοκο DNA-PK/Ku70/Ku80: προσδένεται στη βλάβη ως διμερές, συμπλησιάζει το κενό και προσελκύει μόρια της μηχανής της αντιγραφής που διορθώνουν το κενόη σύνδεση των κλωνων γίνεται με τη δραση της λιγάσης.

28 ΕΠΙΔΙΟΡΘΩΣΗ ΣΠΑΣΙΜΑΤΟΣ ΔΙΠΛΗΣ ΕΛΙΚΑΣ ΜΕ ΟΜΟΛΟΓΟ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΟ Όταν συμβαίνει κώλυμα στη διχάλα διπλασιασμού λόγω σπασίματος της μιας αλυσίδας τότε συπληρώνεται ο πατρικός χρωμοσωμικός κλώνος ενώ ο άλλος θα υποστεί 5 εξωνουκλεοτιδική κατάλυση. Στο χώρο που δημιουργείται με τη δράση των RecA/Rad51 θα γίνει αποδιάταξη των χρωμοσωμικών κλώνων και ανασυνδυασμός με τους κλώνους της διχάλας διπλασιασμού (δομή Holiday). Με αυτό τον τρόπο παρακάπτεται η περιοχή βλάβης αφού συμπληρώνεται με τη βοήθεια των χωρίς βλαβών δομών και συνεχίζεται η διαδικασία της αντιγραφής.

29 Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης έγινε εφικτή στην πράξη μετά τη χρήση των θερμοάντοχων πολυμερασών. Αρχικά γίνεται αποδίαταξη του δίκλωνου μορίου στους 95C, ακολουθεί πρόσδεση των εκκινητών και τελικά γίνεται ο πολυμερισμός. Σε ένα επόμενο κύκλο επαναλαμβάνεται η διαδικασία σε κάθε κύκλο έχουμε διπλασιασμό του υποστρώματος. Συστατικά της αντίδρασης είναι: πολυμεράση, υπόστρωμα DNA, dntps, ιόντα Mg, DNA εκκινητές, ρυθμιστικό δ/μα ιόντων και ph. ΑΠΟΔΙΑΤΑΞΗ ΔΙΚΛΩΝΟΥ DNA ΥΒΡΙΔΙΣΜΟΣ ΕΚΚΙΝΗΤΩΝ ΠΟΛΥΜΕΡΙΣΜΟΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΩΝ ΚΛΩΝΩΝ DNA

30 Πέψη του DNA με περιοριστικές ενδονουκλεάσες Τα ένζυμα περιορισμού- περιοριστικές ενδονουκλεάσες αναγνωρίζουν αλληλουχίες DNA με συμμετρία- παλίνδρομα, και κόβουν το δίκλωνο μόριο σε αυτή την αλληγλουχία. Συστατικά της αντίδρασης είναι: ένζυμο, υπόστρωμα DNA, ιόντα Mg, ρυθμιστικό δ/μα ιόντων και ph.

31 Εκλεκτική καταστροφή γονιδίων (knockout gene) Ενισχύουμε με PCR ένα τμήμα DNA που φέρει το γονίδιο ανθεκτικότητας σε καναμυκίνη και στα άκρα του φέρει ομολογία με το γονίδιο που θέλουμε να αδρανοποιήσουμε. Κάνουμε μεταμόλυνση με αυτό το τμήμα DNA και αν κατά τη μίτωση συμβεί ομόλογος ανασυνδυασμός με το γονίδιο, τα κύτταρα που φέρουν το κατεστραμμένο γονίδιο θα παρουσιάσουν ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό

32 Εκλεκτική καταστροφή γονιδίων (knockout gene) Με την τεχνική αυτή αδρανοποιούμε ιστοειδικά συγκεκριμένα γονίδια. Χρησιμοποιούμε την ιστοειδική έκφραση της πρωτεϊνης ανασυνδυασμού Cre και καταστρέφουμε- με τμηματική έλλειψη της περιοχής που περιορίζεται από τις loxp θέσεις- το γονίδιο στόχο. Το τμήμα του γονιδίου που αποκόπτεται είναι αυτό που περιορίζεται από τις θέσεις loxp. Μαζί με το τμήμα αυτό αφαιρείται και η μία περιοχή loxp (δύο μισά τμήματα).