ΜΕΤΑ-ΜΕΤΑΦΡΑΣΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΔΙΑΛΟΓΗ - ΣΤΟΧΕΥΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΠΟΛΙΚΟΤΗΤΑ

Transcript

1 Ιωάννης Π. Τρουγκάκος Τομέας Βιολογίας Κυττάρου & Βιοφυσικής Τμήμα Βιολογίας, Παν/μιο Αθηνών ΜΕΤΑ-ΜΕΤΑΦΡΑΣΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΔΙΑΛΟΓΗ - ΣΤΟΧΕΥΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΠΟΛΙΚΟΤΗΤΑ

2 ΚΥΤΤΟΣΟΛΙΟ ΠΥΡΗΝΑΣ ΥΠΕΡΟΞΕΙΣΩΜΑΤΑ ΜΙΤΟΧΟΝ ΡΙΑ ΠΛΑΣΤΙ ΙΑ ΕΝ ΟΠΛΑΣΜΑΤΙΚΟ ΙΚΤΥΟ GOLGI ΛΥΣΟΣΩΜΑ ΕΝ ΟΣΩΜΑ ΕΚΚΡΙΤΙΚΑ ΚΥΣΤΙ ΙΑ ΠΛΑΣΜΑΤΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ Οι κύριες οδοί μεταφοράς πρωτεϊνών στο κύτταρο περιλαμβάνουν τη φυλασσόμενη μεταφορά (κόκκινο βέλος) απότοκυττοσόλιοστοπυρήνα(και αντίστροφα), τη διαμεμβρανικη (γκρι βέλη) και την κυστιδιακή μεταφορά (μπλε βέλη). Τα σινιάλα που κατευθύνουν τη κίνηση και το πεπρωμένο μιας πρωτεΐνης βρίσκονται στην αμινοξική της αλληλουχία, ενώ σε κάθε ενδιάμεσο σταθμό (κουτιά) θα πρέπει να παρθεί μια απόφαση αν η πρωτεΐνηπρέπειναπαραμείνειήνα μετακινηθεί περαιτέρω.

3 ΕΚΚΡΙΤΙΚΑ ΜΟΝΟΠΑΤΙΑ: Ρυθμιζόμενη και συνεχής έκκριση πρωτεϊνών ΜΙΓΜΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΙΑΛΟΓΗ COPI ΣΥΝΕΧΗΣ ΡΟΗ ΠΡΟΣ ΤΗΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΕΠΙΦΑΝΕΙΑ ΣΥΝΕΧΗΣ ΕΚΚΡΙΣΗ πυρήνας κλαθρίνη υποδοχέας M6P ΛΥΣΟΣΩΜΑ πρωτεΐνη πλασματικής μεμβράνης σινιάλο (π.χ. ορμόνη) RER cis TGN ΡΥΘΜΙΖΟΜΕΝΗ ΕΚΚΡΙΣΗ medial trans GOLGI ΡΥΘΜΙΖΟΜΕΝΗ ΡΟΗ ΠΡΟΣ ΤΗΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΕΠΙΦΑΝΕΙΑ Πλασματική μεμβράνη Η διαλογή των πρωτεϊνών για το αν θα ακολουθήσουν το ένα ή το άλλο μονοπάτι λαμβάνει χώρα στο TGN. Οι πιο πολλές διαλυτές πρωτεΐνες εκκρίνονται μέσω του συνεχούς μονοπατιού ( ) που λειτουργεί σε όλα τα κύτταρα και μάλλον αποτελεί την φυσική ροή για μια εκκρινόμενη πρωτεΐνη εκτός αν αυτή διαθέτει σινιάλα που θα την κατευθύνουν στο ρυθμιζόμενο μονοπάτι έκκρισης. Μέσω του συνεχούς μονοπατιού έκκρισης τροφοδοτείται με λιπίδια και πρωτεΐνες η πλασματική μεμβράνη. Στο ρυθμιζόμενο μονοπάτι έκκρισης οι επιλεγμένες πρωτεΐνες κατευθύνονται σε εκκριτικά κυστίδια όπου και συγκεντρώνονται ( ). Στακυστίδιααυτάοιπρωτεΐνες αυτές παραμένουν μέχρι να υπάρξει ένα σήμα από τον εξωκυττάριο χώρο που θα πυροδοτήσει την έκκριση τους ( ). Τα δύο αυτά μονοπάτια έκκρισης μαζί με τη διαλογή των πρωτεϊνών προς το λυσόσωμα ( ) αποτελούν τα πιο καλά κατανοητά μονοπάτια διαλογής πρωτεϊνών στο κύτταρο. Τόσο στη ρυθμιζόμενη έκκριση πρωτεϊνών όσο και κατά τη διαλογή πρωτεϊνών προς το λυσόσωμα οι πρωτεΐνες πακετάρονται σε κυστίδια με κάλυμμα κλαθρίνης. Τα κυστίδια αυτά σύντομα χάνουν το κάλυμμα τους και είτε μετατρέπονται σε εκκριτικά κυστίδια (ή κοκκία) είτε συντήκονται με τα λυσοσώματα αναλόγως του μονοπατιού στο οποίο έχουν εισαχθεί.

4 ΚΥΣΤΙΔΙΑ ΡΥΘΜΙΖΟΜΕΝΗΣ ΕΚΚΡΙΣΗΣ Ηλεκτρονιογραφία τομής εκκριτικών κυττάρων από πάγκρεας όπου συντίθενται και εκκρίνονται ένζυμα πέψης. Διακρίνεται πολύ αναπτυγμένο ΕΔ, σύμπλεγμα Golgi και εκκριτικά κυστίδια σε διάφορες φάσεις συμπύκνωαης. Η διαλογή των πρωτεϊνών στο ρυθμιζόμενο μονοπάτι έκκρισης ελέγχεται από επιλεκτική πρωτεϊνική συσσωμάτωση λόγω αλλαγής στην ιονική ισχύ και στο ph (οξίνιση) που παρατηρείται στο TGN. Παράλληλα θα πρέπει να υπάρχει και ένα ειδικό πεπτιδικό σινιάλο που κατευθύνει τις πρωτεϊνες στο μονοπάτι αυτό, το οποίο πιστεύεται ότι είναι ένα σινιάλο επιφάνειας. Μετά την αποκοπή τους από το TGN τα κυστίδια κλαθρίνης του ρυθμιζόμενου μονοπατιού έκκρισης αποβάλλουν το κάλυμμα τους και το υλικό τους συμπηκνώνεται περαιτέρω (μέχρι και 200 φορές) συγκρινόμενο με τη συγκέντρωση του στον αυλό του TGN. Η συμπήκνωση αυτή λαμβάνει χώρα ξαφνικά πιθανότατα σαν αποτέλεσμα της περαιτέρω οξίνισης του αυλού του κυστιδίου μέσω μιας αντλίας Η +.

5 ΚΙΝΗΣΗ ΚΥΣΤΙΔΙΩΝ ΣΤΟΝ ΚΥΤΤΑΡΟΣΚΕΛΕΤΟ

6 ΕΝΔΟΚΥΤΤΩΣΗ LDL ΜΕΣΩ ΥΠΟΔΟΧΕΑ

7

8 β α βαριά αλυσίδα ελαφριά αλυσίδα Η δομή του καλύμματος κλαθρίνης. (α) Κάθε τρισκέλιο αποτελείται από τρειςβαριέςκαιτρειςελαφριές αλυσίδες κλαθρίνης. (β) Τρισδιάστατη απεικόνιση του καλύμματος της κλαθρίνης αποτελούμενου από 36 τρισκέλια οργανωμένων σε ένα δίκτυο 12 πενταγώνων και 6 εξαγώνων (συνήθως ο αριθμός τωνεξαγώνωνείναιαρκετά μεγαλύτερος). Στην επιφάνεια του καλαθιού διακρίνεται σχηματική απεικόνιση της κατανομής και διάταξης δύο τρισκελίων. Η αλληλεπικαλυπτόμενη διάταξη τους προσδίδει τόσο μηχανική αντοχή όσο και ευλυγισία. Το άκρο κάθε ποδιού του τρισκέλιου στρέφεται προς τα μέσα έτσι ώστε δημιουργείται ένα ενδιάμεσο κέλυφος.

9 ΠΡΩΪΜΑ ΕΝΔΟΣΩΜΑΤΑ

10 The seven cisternae of the Golgi Complex (named C1- C7 in the cis-to-trans direction) are colored light blue (C1), pink (C2), rose (C3), green (C4), dark blue (C5), amber (C6) and red (C7). 3-D πολυπλοκότητα του Golgi και σχετική τοποθέτηση του στο κυτταρόπλασμα σε σχέση με άλλα οργανίδια και τον κυτταροσκελετό Within the reconstructed volume, 2, 119 small (approximately 52 nm) transport vesicles are present near the Golgi stack. These vesicles appear in the model as white spheres. Most of the vesicles are tethered to each other or to a Golgi cisterna. Dense core granules, which contain insulin, are modeled in bright blue. Additional cytoplasmic components appear in the final frames of this movie. These include the endoplasmic reticulum (yellow), mitochondria (green) endocytic compartments (purple) and clathrin-bearing post-golgi compartments (red). Ribosomes are modeled in gold and microtubules are bright-green. Εκκριτικό Μονοπατι: Επανασύσταση από Τομογραφίες ΗΜ

11 Καλλυμένο κυστίδιο COPI To COPI αποτελείται από 7 πολυπεπτίδια Η αυτοσυγκρότηση και η αποδιαμόρφωση απαιτεί GTP Το κάλλυμα παραμένει μέχρι την μεμβράνη στόχο Καλλυμένο κυστίδιο COPIΙ To COPI αποτελείται από 5 πολυπεπτίδια Η αυτοσυγκρότηση και η αποδιαμόρφωση απαιτεί GTP Το κάλλυμα απομακρύνεται καθ οδόν για την μεμβράνη στόχο

12 ΜΟΡΙΑΚΟΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΣΤΟΧΕΥΣΗΣ ΚΥΣΤΙΔΙΩΝ

13 Μοριακοί μηχανισμοί σχηματισμού των κυστιδίων και ειδική σύντηξη τους με τη μεμβράνη-στόχο. Ειδικότητα στόχευσης, προσαρμοστές AP και πρωτεϊνες Rab Αν υποθέσουμε ότι η διαφορά, όσον αφορά τη σύσταση, μεταξύ δύο διαμερισμάτων του κυτταρου όπου υπάρχει συνεχής επικοινωνία είναι η ποσότητα μιας συγκεκριμένης πρωτεϊνης τότε αργά η γρήγορα η διαφορά θα τείνει να εξομαλυνθεί εκτός αν συντηρείται με παροχή ελεύθερης ενέργειας και τη μεταφορά μορίων ενάντια στην κλίση συγκέντρωσης. Πιο συγκεκριμένα η πρωτεϊνη αυτή θα πρέπει να ενσωματώνεται στα εκβλαστάνοντα κυστίδια του διαμερίσματος στο οποίο έχει χαμηλή συγκέντρωση αλλά όχι σε αυτά που ξεκινούν από το διαμέρισμα με τη μεγάλη συγκέντρωση. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω σημαντικών αλλαγών στη διαμόρφωση της οι οποίες προκαλούνται στο περιβάλλον του οργανιδίου με τη μεγάλη συγκέντρωση, είτε αυθόρμητα είτε υποβοηθούμενες από κατανάλωση ενέργειας μέσω υδρόλυσης ATP ή GTP. Με τον τρόπο αυτό η πρωτεϊνη αυτή δεν μπορεί πλέον να ενσωματωθεί στη μεμβράνη των κυστιδίων που εκβλαστάνουν από το οργανίδιο αυτό. Στο απλοποιημένο αυτό παράδειγμα φαίνεται πως μέσω παροχής ενέργειας μπορεί να συντηρηθεί η κατευθυνόμενη μεταφορά μορίων μεταξύ δύο μεμβρανών. Η επιλεκτική κατευθυνόμενη κυστιδιακή μεταφορά είναι βασικής σημασίας στην οργάνωση του ευκαρυωτικού κυττάρου. Από την άλλη βέβαια στα πλαίσια της έντονης ανταλλαγης κυστιδίων κάθε διαμέρισμα θα πρέπει να διατηρεί με κάποιο τρόπο τον ιδιαίτερο χαρακτήρα του. Το κυριάρχο χαρακτηριστικό για τη διατήρηση της ιδιαιτερότητας κάθε διαμερίσματος-οργανιδίου είναι η μεμβράνη του στην οποία ειδικοί υποδοχείς που εκτείνονται προς τη πλευρά του κυττοσολίου (πρωτεϊνες SNARE) καθορίζουν πια κυστίδια μπορούν να συντηχθούν εκεί. Με τον τρόπο αυτό καθορίζεται και το πρότυπο κυστιδιακής μετακινήσης από το ένα διαμέρισμα στο άλλο.

14 ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΚΑΙ ΣΥΝΤΗΡΗΣΗ ΤΗΣ ΔΙΑΜΕΡΙΣΜΑΤΟΠΟΙΗΣΗΣ ΙΑΜΕΡΙΣΜΑ Β (π.χ.λυσόσωμαi) ΚΥΣΤΙ ΙΟ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΙΑΜΕΡΙΣΜΑ Α (π.χ.golgi) Η + GTP GDP + Pi Η κατανάλωση ενέργειας χρησιμοποιείται για να προάγει την στόχευση των κυστιδίων προς μία μόνο κατεύθυνση. Σε αυτό το υποθετικό παράδειγμα η μπλε μεμβρανική πρωτεΐνη αποτελεί μια αντλία H+ που λειτουργεί με κατανάλωση ενέργειας, Η πρωτεΐνηαυτήείναι σε μικρή συγκέντρωση στο Golgi και σε μεγάλη στο λυσόσωμα οπότε ο αυλός του λυσοσώματος θα έχει όξινο περιβάλλον. Ανηπρωτεΐνηαυτή μπορεί να πακεταριστεί σε κυστίδια μόνο σε υψηλό ph τότε δεν μπορεί να διαφύγει από το λυσόσωμα και όσο η διαφορά ph μεταξύ των δύο οργανιδίων διατηρείται μέσω κατάλωσης ελεύθερης ενέργειας (υδρόλυση ATP) θα παρατηρείται συνεχής ροή μορίων από το Golgi προς το λυσόσωμα (ενάντια προς την κλίση συγκέντρωσης). Δεδομένου δε ότι οι πιο πολλές μεμβράνες δεν δημιουργούνται de novo αλλά προκύπτουν από επέκταση των υπαρχόντων το απλό αυτό παράδειγμα δίδει μια εξήγηση για τον τρόπο με τον οποίο τα κύτταρα χρησιμοποιούν ενέργεια για να διατηρήσουν το χαρακτήρα των διαφόρων διαμερισμάτων τους.

15 αυλός οργανιδίου κυττοσόλιο Απλοποιημένη σχηματική απεικόνιση των κύριων γεγονότων που προηγούνται της εκβλάστησης ενός κυστιδίου μεταφοράς πρωτεϊνών. πρόσδεση πρωτεϊνών καλύμματος στη μεμβράνη τοπική αποδιαμόρφωση της μεμβράνης οι πρωτεΐνες περιβάλλουν το εξόγκωμα της μεμβράνης εκβλάστηση του καλυμμένου κυστιδίου Σε μοριακό επίπεδο, κρίσιμο ρόλο για τη δημιουργία των κυστιδίων παίζει το κάλυμμα το οποίο προσελκύεται στο σημείο από όπου θα εκβλαστήσει το κυστίδιο. Η αυτοσυγκρότηση όλων των διαφορετικών τύπων καλύμματος είναι αυστηρά ρυθμιζόμενη και χρησιμεύει στο να επαχθεί τοπική αποδιαμόρφωση της μεμβράνης που θα οδηγήσει στην αποκοπή του κυστιδίου. Ειδικότερα το κάλυμμα δημιουργεί ένα διακριτό καλάθι μεταφοράς πρωτεϊνικής φύσης που περιβάλλει τα μεταφερόμενα μόρια. Πριν το κυστιδιο αυτό συντηχθεί με τη μεμβράνη-στόχο, το κάλλυμα πρέπει να αφαιρεθεί (τουλάχιστον μερικά) προκειμένου οι δύο μεμβράνες (δότης, στόχος) να μπορέσουν να αντιδράσουν απευθείας. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω της δυνατότητας αντιστροφής του πολυμερισμού του καλύμματος.

16 Kάποιες άλλες πρωτεϊνες προσδίδουν την μοριακή ταυτότητα αναγνώρισης του κυστιδίου. Οι πρωτεϊνες αυτές είναι η οικογένεια των πρωτεϊνών SNARE [v-snare, κυστιδιακή SNARE ή SNARE της μεμβράνης δότη (vesicle-snare) και t-snare, SNARE της μεμβράνης στόχου (target-snare)] που συμμετέχουν στην σωστή επιλογή της μεμβράνηςστόχου με την οποία θα συντηχθεί το κυστίδιο. Οι πρωτεϊνες τύπου v-snare πακετάρονται μαζί με το εκβλαστάνων κυστίδιο και συμμετέχουν τόσο στην εκλεκτική όσο και στηνμηεκλεκτικήκυστιδιακήμεταφοράμορίων.

17 Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ SNAREs ΣΤΗΝ ΜΕΤΑΦΟΡΑ (ΣΤΟΧΕΥΣΗ) ΚΥΣΤΙΔΙΩΝ μεμβράνη δότης ΕΚΒΛΑΣΤΗΣΗ ΚΥΣΤΙ ΙΟΥ κάλυμμαπροσαρμοστής κυστιδίου ΑΠΟΒΟΛΗ ΚΑΛΥΜΜΑΤΟΣ v-snare Rab-GDP Rab-GTP ΠΡΌΣ ΕΣΗ- ΣΥΝΤΗΞΗ t-snare μεμβράνη δέκτης οργανίδιο Α οργανίδιο Β Ησωστήστόχευσητων κυστιδίων βασίζεται σε μεγάλο βαθμό στη συμπληρωματικότητα των κυστιδιακών v-snares με τις t-snares της μεμβράνης (-οργανιδίου) στόχου. Η συμπληρωματικότητα αυτή καθορίζει την επιλογή για την αγκυροβόληση του κυστιδίου. Οι v-snares πακετάρονται μαζί με το κάλυμμα στο εκβλαστάνων κυστίδιο το οποίο φέρει και μια Rab πρωτεΐνη (που στη μεμβράνη-δότη είναι σε κατάσταση Rab-GDP). Η πρωτεΐνη αυτή εμπλέκεται σε μεγάλο βαθμό στην επιλογή της μεμβράνης-τόχου και μέχρι σήμερα έχουν απομονωθεί πολλές πρωτεΐνες Rab που χαρακτηρίζουν κάθε τμήμα των μονοπατιών μεταφοράς μορίων στο κύτταρο. Στο απελευθερωμένο κυστίδιο η Rab πρωτεΐνη είναι ενεργοποιημένη και βρίσκεται σε κατάσταση Rab-GTP.

18 Οι δύο πιο καλά χαρακτηρισμένοι τύποι καλλυμένων κυστιδίων είναι αυτά που φέρουν κάλυμμα καλυπτομερούς (COPI, COPII) και αυτά με κάλυμμα κλαθρίνης. Τα κυστίδια καλυπτομερούς μεσολαβούν στην (συνήθως μη επιλεκτική) μεταφορά πρωτεϊνών κατά μήκος των δεξαμενών του ER και του Golgi, ενώ τα κυστίδια κλαθρίνης αποτελούν τα οχήματα μεταφοράς κατά την επιλεκτική μεταφορρά πρωτεϊνών μέσω υποδοχεων από το TGN προς το λυσόσωμα ήτην πλασματική μεμβράνη και αντίστροφα. Θα πρέπει εδώ να σημειώσουμε ότι ένας άλλος τύπος κυστιδίων αφορά τα κυστίδια καβεολίνης τα οποία είναι αρκετά πιο σπάνια.

19 Κυστίδια με κάλυμμα COPI ή COPII Tα κυστίδια που φέρουν κάλυμα τύπου καλυπτομερούς (coatomer) μεσολαβούν στη μη επιλεκτική (κυρίως) μεταφορά μορίων από το ER προς στο Golgi και αντίστροφα, στην ανάστροφη κίνηση μορίων κατά μήκος των δεξαμενών Golgi και πιθανότατα κατά την συνεχη εξωκύττωση από το TGN προς τη πλασματική μεμβράνη. Το καλυπτομερές των κυστιδίων COPI είναι ένα μεγάλο πρωτεϊνικό σύμπλεγμα που αποτελείται από κυττοσολικά σύμπλοκα τύπου COP. Κάθε COP αποτελείται από 7 υπομονάδες. Σε αντίθεση με το κάλυμμα κλαθρίνης η αυτοσυγκρότηση του καλυπτομερούς δεν λαμβάνει χώρα αυθόρμητα αλλά απαιτεί ΑΤΡ. Τόσο ο πολυμερισμός οσο και ο αποπολυμερισμός του καλύμματος καλυπτομερούς εξαρτάται από μια GTPαση με το όνομα ARF (ο ARF πιθανως εμπλέκεται και στην συγκρότηση των κυστιδίων κλαθρίνης). Ο παράγων ARF είναι μια μονομερική GTPase που φέρει μια ουρά λιπαρού οξέος. Στο κυττοσόλιο βρίσκεται σε μεγάλη συγκέντρωση στην αφόρτιστη μορφή του με προσδεδεμένο GDP. Φαίνεται ότι η μεμβράνη δότης περιέχει μια ειδική GNRP που επάγει στον ARF την απελευθέρωση του GDP και την πρόσδεση του GTP. Η πρόσδεση του GTP στη συνέχεια προκαλεί την έκθεση της αλυσίδας του λιπαρού οξέος που εισχωρεί στη λιπιδική διπλοστοιβάδα της μεμβράνης-δότη. Ο ισχυρά προσδεμενος ARF προσελκύει τώρα τις διάφορες υπομονάδες του καλυπτομερούς COPI που προσδένονται σε αυτόν έχοντας σαν αποτέλεσμα την διόγκωση της μεμβράνης τοπικά και τελικά την εκβλάστηση του κυστιδίου που περιέχει τις υπομονάδες COPΙ, τον ARF και την ειδική για τη μεμβράνη-δότη v-snare καθώς και το προς μεταφορά φορτίο (φέρει επίσης και μια ειδική Rab-GTPase). Καθώς το κυστίδιο κινείται στο κυττοσόλιο μια πρωτεϊνη GAP πυροδοτεί την υδρόλυση του GTP στον ARF. Η αλλαγή αυτή προκαλεί μια σημαντική αλλαγή στη διαμόρφωση του ARF που έχει σαν αποτέλεσμα την αποδέσμευση του λιπαρού οξέος από τη μεμβράνη. Το γεγονός αυτό αποπολυμερίζει το κάλυμμα του καλυπτομερούς επιτρέποντας στο κυστίδιο να συντηχθεί με τη μεμβράνη-στόχο. Δεδομένης της τοπολογίας των GNRP και GAP ο ARF επάγει τη κίνηση των κυστιδίων COP- μόνο προς μία κατεύθυνση. Με παρόμοιο τρόπο σχηματίζονται και τα κυστίδια COPIΙ. Εδω τα κυττοσολικά σύμπλοκα είναι τύπου Sec καιηπρωτεΐνημεδράσηανάλογητουarf είναι η Sar1-GTPase.

20 ΜΕΜΒΡΑΝΗ ΟΤΗΣ α aνενεργός διαλυτός ARF-GDP GDP μεμβράνη Golgi δ GNRP γ Pi GAP GDP προσδεδεμενός στη μεμβράνη (ενεργοποιημένος) ARF-GTP GTP GTP GDP GTP ARF-GTP β ανενεργό ενεργό ΜΕΜΒΡΑΝΗ ΟΤΗΣ GNRP κυστίδιο καλυμμένο με COPI ARF-GDP GDP καλυπτομερές φορτίο v-snare Τρέχων μοντέλο που αφορά τον σχηματισμό των κυστιδίων καλυπτομερούς (COPI). (α) Ο ανενεργός ARF-GDP προσδένεται στον παράγοντα GRNP στη μεμβράνη-δότη προκαλώντας έτσι την αποδέσμευση του GDP και την πρόσδεση GTP. Η αλλαγή αυτή πυροδοτεί μια αλλαγή στην διαμόρφωση του ARF που τώρα εκθέτει την αλυσίδα λιπαρού οξέος που αγκυροβολεί εντός της μεμβράνης. (β) Στη συνέχεια στο συγκεκριμένο σημείο ο μεμβρανικά προσδεδεμένος ARF προσελκύει υπομονάδες καλυπτομερούς που προσδένονται σε αυτόν, οπότε τοπικά σχηματίζεται μια διόγκωση της μεμβράνης. Στη συνεχεια μέσω τοπικής σύσφιξης προκαλείται αποκοπή του κυστιδίου. Το κυστίδιο μέσω υδρόλυσης GTP χάνει το κάλυπτομερές αλλά και τον παράγοντα ARF (ο οποίος είναι τώρα σε κατάσταση ARF-GDP) (γ) ΟκύκλοςτουARF. Η ειδική GNRP της μεμβράνης-δότη επάγει στον ARF την απελευθέρωση του GDP και την πρόσδεση του GTP (ενεργοποίηση ARF). Όταν το κυστίδιο εκβλαστήσει μια πρωτεΐνη GAP πυροδοτεί την υδρόλυση του GTP στον ARF προκαλώντας αλλαγή στη διαμόρφωση του και τελικά αποδέσμευση του λιπαρού οξέος από τη μεμβράνη. Το γεγονός αυτό διαλύει το κάλυμμα και τελικά επιτρέπει στο κυστίδιο να συντηχθεί με τη μεμβράνηστόχο. Δεδομένης της τοπολογίας των GNRP και GAP ο ARF επάγει τη κίνηση μόνο προς μία κατεύθυνση.

21 ΙΑΦΟΡΕΤΙΚΟΙ ΤΥΠΟΙ ΚΑΛΛΥΜΕΝΩΝ ΚΥΣΤΙ ΙΩΝ ΚΛΑΘΡΙΝΗΣ

22 Κυστίδια με κάλυμμα κλαθρίνης Η αυτοσυγκρότηση του καλύμματος στα κυστίδια κλαθρίνης εκτός από το να προσφέρει την μηχανική δύναμη για να τραβηχτεί η μεμβράνη κατά την εκβλάστηση του κυστιδίου βοηθά στην σύλληψη ειδικών υποδοχέων και του προσδεδεμένου σε αυτούς μορίου-συνδέσμου (διαλογή). Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η ειδοποιός διαφορά των κυστιδίων κλαθρίνης που εμπλέκονται σε διακριτά μονοπάτια κυστιδιακής μεταφοράς είναι η ταυτότητα του προσαρμοστή η οποία είναι ειδική ανά μονοπάτι. Οι προσαρμοστές είναι πολυμερικές πρωτεϊνες που προσδένονται στο τμήμα του υποδοχεά που βλέπει προς το κυττοσόλιο. Η ποικιλότητα τους σχετίζεται με το γεγονός ότι κάθε προσαρμοστής αναγνωρίζει ειδικά πεπτιδικά σινιάλα στη κυττοσολική πλευρά κάθε υποδοχέα. Με τον τρόποαυτόπροωθεί(έμμεσα) το φορτίο σε διαφορετικά κυστίδια ανάλογα με τη φύση του. Για παράδειγμα ένα πεπτιδικό σινιάλο που φαίνεται να υπάρχει σε όλους τους υποδοχείς ενδοκύττωσης είναι η ακολουθία Phe-Arg-X-Tyr (σινιαλο ενδοκύττωσης) που αναγνωρίζεται ειδικά από τον προσαρμοστή AP-2. Θα πρέπει να σημειώσουμε επίσης ότι εκτός από τη διαλογή του φορτίου η πρόσδεση του προσαρμοστή στον υποδοχέα επάγει τον πολυμερισμό του καλαθιού της κλαθρίνης. Ειδικότερα αναφέρουμε ότι στην ενδοκύττωση σημαντικό ρόλο κατά την εκβλάστηση του κυστιδίου παίζει μια κυττοσολική πρωτεϊνη ~900 αμινοξέων η οποία προσδένεται στον λαιμό της καλλυμένης εσοχής και ρυθμίζει τη συστολή (σύσφιξη) στο σημείο αυτό μέχρι να αποκοπεί το κυστίδιο από τη μεμβράνη. Η πρωτεϊνηαυτήονομάζεταιδυναμίνη.

23 ΕΚΛΕΚΤΙΚΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΜΕΣΩ ΚΥΣΤΙ ΙΩΝ ΚΛΑΘΡΙΝΗΣ

24 ΚΑΛΛΥΜΕΝΟ ΚΥΣΤΙΔΙΟ ΚΛΑΘΡΙΝΗΣ

25 ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΟΣ ΧΩΡΟΣ φορτίο υποδοχέας ΠΛΑΣΜΑΤΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ ΚΥΤΤΟΣΟΛΙΟ Phe Tyr Arg X προσαρμοστής t-snare κλαθρίνη ΟΡΓΑΝΙ ΙΟ ΣΤΟΧΟΣ Rab-GDP/GNRP v-snare Rab-GTP v-snare Μοριακός μηχανισμός κατά την ενδοκύττωση πρωτεϊνών από την πλασματική μεμβράνη και την στόχευση στο οργανίδιο στόχο (όλατακυστίδιακλαθρίνης ανεξαρτήτως προέλευσης σχηματίζονται με αρκετά παρόμοιο τρόπο). Οι πρωτεΐνες υποδοχείς μέσω ενός πεπτιδικού σινιάλου (τα αμινοξέα που δείχνονται εδώ αποτελούν ένα σημαντικό τμήμα του σινιάλου αυτού ) προσδένονται στον προσαρμοστή που εκτός από το σύμπλοκο υποδοχέας-φορτίο συνδέεται και με την κλαθρίνη ( ). Δεδομένου ότι οι συμπληρωματικές ομάδες v- και t- SNAREs καθορίζουν την επιλογή του στόχου το καλυμμένο κυστίδιο περιέχει επίσης την αντίστοιχη για το οργανίδιο (εδώ πλασματική μεμβράνη) v-snare καθώς και την ειδική Rab- GTP ( ). Η πρωτεΐνηrab ενεργοποιείται στη μεμβράνη-δότη από τον παράγοντα GNRP που επάγει την ανταλλαγή του GDP με GTP (η ενεργοποίηση μπορεί να γίνει και από διαλυτό GNRP). Η αλλαγή αυτή ενεργοποιεί τη Rab εκθέτοντας την ομοιοπολικά προσδεδεμένη λιπιδική της αλυσίδα όποτε τώρα μπορεί να προσδεθεί (μέσω αυτής) στη μεμβράνη του κυστιδίου. Μετά την αποδέσμευση του καλλύματος της κλαθρίνης και την ανακύκλωση του στη μεμβράνη ( ) στημεμβράνητου κυστιδίου παραμένουν προσδεδεμένα η Rab-GTP αλλά και η v-snare. Όταν η v-snare προσδεθεί στην t-snare της μεμβράνης-στόχου ( ) το κυστίδιο αγκυροβολεί.

26 ΜΟΡΙΑΚΟΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ ΚΑΛΛΥΜΕΝΟΥ ΚΥΣΤΙΔΙΟΥ ΚΛΑΘΡΙΝΗΣ

27 ΜΟΡΙΑΚΟΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ ΚΑΛΛΥΜΕΝΟΥ ΚΥΣΤΙΔΙΟΥ ΚΛΑΘΡΙΝΗΣ

28 ΕΝΔΟΚΥΤΤΩΣΗ

29 Καθώς οι πρωτεϊνες του καλυματος πολυμερίζονται στη κυττοσολική επιφάνεια της μεμβράνης-δότη κάποιοι προσαρμοστές (adapters) (ή άλλες ειδικές πρωτεϊνες του καλύματος) επιλέγουν ποιες πρωτεϊνες θα φορτωθούν στο κυστίδιο (προσαρμοστές AP), Προσαρμοστές AP υπάρχουν μόνο στην επιλεκτική μεταφορά μέσω κυστιδίων κλαθρίνης. αυπομονάδα β 2 υπομονάδα γ υπομονάδα β 1 υπομονάδα ΠΡΟΣΑΡΜΟΣΤΕΣ μ 2 υπομονάδα σ 2 υπομονάδα Ν Ν Ν Ν AP-2 προσαρμοστής πλασματικής μεμβράνης AP-1 προσαρμοστής GOLGI μ 1 υπομονάδα σ 1 υπομονάδα

30 ΠΛΑΣΜΑΤΙΚΗ ΜΕΜΡΒΑΝΗ TGN GOLGI trans med cis RER ΠΡΟΣΑΡΜΟΣΤΕΣ ΒΙΟΣΥΝΘΕΤΙΚΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ AP-1/ κλαθρίνη AP-1/ κλαθρίνη AP-2/ κλαθρίνη AP-3/ κλαθρίνη ΜΟΝΟΠΑΤΙ ΕΝ ΟΚΥΤΤΩΣΗΣ ΠΡΩΙΜΑ ΕΝ ΟΣΩΜΑΤΑ ΩΨΙΜΑ ΕΝ ΟΣΩΜΑΤΑ ΛΥΣΟΣΩΜΑΤΑ Συγκριτική απεικόνιση των μονοπατιών βιοσύνθεσης (έκκρισης) και ενδοκύττωσης και των ειδικών προσαρμοστών που χρησιμοποιούνται ανά περίπτωση αφού η διαλογή του φορτίου και το τελικό του πακετάρισμα στα ειδικά κυστίδια εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τους διαφορετικούς κυστιδιακούς προσαρμοστές που χαρακτηρίζουν κάθε μονοπάτι κατά το σχηματισμό του κυστιδίου. Έτσι κατά την ενδοκύττωση το κυστίδιο περιέχει τον προσαρμοστή AP-2 ( ), ενώτακυστίδιακλαθρίνης που εκβλάστανουν από το TGN, αν κατευθύνονται πρός τον εξωκυττάριο χώρο φέρουν τον προσαρμοστή AP-1 ( ), ενώ αν κατευθύνονται προς το λυσόσωμα τον προσαρμοστή AP-3 ( ). Στο μονοπάτι συνεχούς έκκρισης ( ) δεν υπάρχουν προσαρμοστές.

31 Παράλληλα μια σειρά από GTP-προσδένουσες πρωτεϊνες παίζουν σημαντικό ρόλο στο ρυθμό σχηματισμού του κυστιδίου αλλά και στηστόχευσητου. Οι πρωτεϊνες αυτές δρούν σε πλήθος κυτταρικών δραστηριοτήτων σαν μοριακοί διακόπτες οι οποίοι διέρχονται δύο καταστάσεις διαμόρφωσης. Είτε μια ενεργή στην οποία έχουν προσδέσει GTP είτε μια ανενεργή με προσδεδεμένο GDP. Οι GTP-προσδένουσες πρωτεϊνες δρουν σε ένα κύκλο που ουσιαστικά εξαρτάται από δύο βοηθητικά συστατικά. Τον παράγοντα GNRP που καταλύει την ανταλλαγή του GDP για GTP και μια πρωτεϊνη GAP που πυροδοτεί την υδρόλυση του προσδεδεμένου GTP. Επίσης πολλές από τις GTP-προσδένουσες πρωτεϊνες φέρουν ομοιοπολικά προσδεδεμένα λιπίδια τα οποία τις βοηθούν να προσδένονται σε μεμβράνες. Δομικά αναγνωρίζονται δύο κύριες ομάδες. Οι μονομερικές GTP-προσδένουσες πρωτεϊνες (ονομάζονται και μονομερικές GTPases) που αποτελούνται από μία μόνο πολυπεπτιδική αλυσίδα και οι τριμερείς GTP-προσδένουσες πρωτεϊνες (ονομάζονται και G proteins) που αποτελούνται από 3 υπομονάδες. Ολες οι κατηγορίες φαίνεται να εμπλέκονται στους μοριακούς μηχανισμούς κυστιδιακής μεταφοράς. Ειδικότερα οι δύο κύριες οικογένειες πρωτεϊνών που απαιτούνται κατά την εξέλιξη της αλληλουχίας των μοριακών μηχανισμών της κυστιδιακής κίνησης είναι η οικογένεια των GTPασών (ARF, Sar1) που συμμετέχουν στο σχηματισμό του κυστιδίου και η οικογένεια των Rab-GTPασών που εμπλέκονται στο μηχανισμό στόχευσης των κυστιδίων.

32 Μοριακός μηχανισμός σύντηξης του κυστιδίου με τη μεμβράνη-στόχο Σε όλες τις περιπτώσεις η σύντηξη του κυστιδίου μεταφοράς με τη μεμβράνη-στόχο λαμβάνει χώρα αφού έχει αφαιρεθεί το κάλυμμα του κυστιδίου. Με τον τρόπο αυτό αποκαλύπτονται στην επιφάνεια του κυστιδίου οι πρωτεϊνες που μεσολαβούν τόσο στην στόχευση (Rabs) και στην ειδικότητα δέσμευσης (v-snares) μεταξύδότηκαιδέκτηκαιπου τελικά πυροδοτούν τη διαδικασία σύντηξης των δύο μεμβρανών. Η διαδικασία αγκυροβόλησης ρυθμίζεται πολύ αυστηρά και ένα κυστίδιο είναι δυνατόννα περάσει από πολλές μεμβράνες μέχρι να φτάσει στην σωστή όπου θα υπάρξει συμπληρωματικότητα των ειδικών v-snare και t-snares. Ολες οι μεμβράνες-στόχοι περιέχουν επίσης τη γενική πρωτεϊνη σύντηξης SNAP25 που δημιουργεί σύμπλοκο με την ειδικά ανά μεμβράνη t-snare. Το κρίσιμο βήμα αναγνώρισης μεταξύ της v-snare και του συμπλοκου t-snare/snap25) ελεγχεται από τα μέλη της οικογένειας των Rab- GTPασών.

33 ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ Rab geranylgaranyl λιπίδιο NH 2 ομόλογο τμήμα (πρόσδεση GTP, υδρόλυση GTP) πρόσδεση σε ειδικές μεμβράνες Οι Rab-GTPασες είναι μικρά μόρια μεγέθους ~200 αμινοξέων. Τα ευκαρωτικά κύτταρα περιέχουν πολλές διαφορετικές Rab πρωτεϊνες καθεμιά από τις οποίες συνδέεται ειδικά με την επιφάνεια κάποιου οργανίδιου. Οι Rab πρωτεϊνες προσδένονται στο εκβλαστάνων κυστίδιο της μεμβράνης-δότη. Αν το κυστίδιο συνδεθεί με τη σωστή t-snare και η πρόσδεση διατηρηθεί επί μακρόν (γιαταδεδομένατουκυττάρου) δίδεται ο χρόνος για να επαχθεί η υδρόλυση του προσδεδεμένου στη Rab πρωτεϊνη GTP σε GDP. Με τον τρόπο αυτό κλειδώνεται το κυστίδιο στη μεβράνη-στόχο και προετοιμάζεται για την επερχόμενη σύντηξη. Με άλλα λόγια η πρωτεϊνη Rab δρα σαν χρονομέτρης της διάρκειας πρόσδεσης.

34 ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΕΣ Rab ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΕΜΠΛΕΚΟΝΤΑΙ ΣΤΑ ΣΤΑΔΙΑ ΚΥΣΤΙΔΙΑΚΗΣ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ

35 Από τη στιγμή που το κυστίδιο έχει αναγνωρίσει τη μεμβράνη-στόχο και έχει προσδεθεί, θα πρέπει να αδειάσει το περιεχόμενο του με μεμβρανική σύντηξη. Η διαδικασία αυτή δεν είναι όμως πάντα άμεση, αφού για παράδειγμα στην ρυθμιζόμενη έκκριση πρέπει να προηγηθεί το κατάλληλο σινιάλο. Με άλλα λόγια η αγκυροβόληση και η σύντηξη του κυστιδίου είναι ανεξάρτητα γεγονότα και δεν συνδέονται αφού στην πρώτη περίπτωση οι δύο μεμβράνες απλά θα πρέπει να πλησιάσουν για να αντιδράσουν οι πρωτεΐνες της επιφάνειας, ενώ στη δεύτερη οι μεμβράνες θα πρέπει να πλησιάσουν σε απόσταση περίπου 1.5 nm έτσι ώστε να μπορούν να συντηχθούν. Για να επιτευχθεί η όμως η σύντηξη θα πρέπει να αποβληθεί νερό από την υδρόφιλη δι-επιφάνεια ανάμεσα στις δύο μεμβράνες (δότη-δέκτη) κάτι που ενεργειακά είναι μη επιθυμητό. Η σύντηξη πραγματοποιείται μέσω ειδικών πρωτεϊνών σύντηξης που επιτρέπουν να υπερπηδηθεί αυτός ο ενεργειακός φραγμός. Δυο απαραίτητα συστατικά της μηχανής σύντηξης είναι η πρωτεϊνη ΝSF και οι πρωτεϊνες SNAPs. Τα συστατικά αυτά οποία ανακυκλώνονται συνεχώς μεταξύ των μεμβρανών και του κυττοσολίου. Οι SNAPs προσδένονται τόσο στη v-snare όσο και στην t-snare και επάγουν την έναρξη της αυτοσυγκρότησης του μηχανισμού σύντηξης που θα προκαλέσει την ένωση των δύο λιπιδικών διπλοστοιβάδων. Η πρόσδεση των SNAPs στις SNAREs επιτρέπει και την πρόσδεση του NSF. O NSF είναι μια ATPase που υδρολύει ATP για να απελευθερωθεί το σύμπλοκο όταν η σύντηξη έχει τελειώσει. Μετά τη σύντηξη κυστίδια με v-snare επιστρέφουν στη μεμβράνη-δότη. Ειναι φανερό ότι η διαδικασία της σύντηξης των κυστιδίων μεταφοράς μορίων είναι μια αυστηρά ρυθμιζόμενη εκλεκτική διαδικασία αφού αλλιώς δεν θα μπορούσε να διατηρηθεί η ιδιαιτερότητα κάθε διαμερίσματος. Στην περίπτωση των κυστιδιων καλυπτομερούς η σύντηξη απαιτεί ATP, GTP, acylcoa και αρκετά πρωτεϊνικά συστατικά.

36 Rab-GTP t-snare v-snare ΟΡΓΑΝΙ ΙΟ ΟΤΗΣ αγκυροβολημένο κυστίδιο μεταφοράς ΜΕΜΒΡΑΝΗ ΣΤΟΧΟΣ GNRP Rab-GDP SNAPs NSF Tρέχων μοντέλο για τη σύντηξη του κυστιδίου με τη μεμβράνη-στόχο. Μετά την σύνδεση v-snare με t-snares και την αγκυροβόληση του κυστιδίου, η Rab υδρολύει το GTP κλειδώνοντας το κυστίδιο στη μεμβράνη και απελευθερώνεται σαν Rab-GDP στο κυττοσόλιο από όπου μπορεί να ξαναχρησιμοποιηθεί σε ένα νέο γύρο μεταφοράς μέσω αλληλεπίδρασης με τον GNRP. Το κυστίδιο στη συνέχεια μπορεί να συντηχθεί με τη μεμβράνηστόχο. Σημαντικά συστατικά της μηχανήςσύντηξηςαποτελούνοι πρωτεΐνες NSF και οι SNAPs. Το σύμπλοκο των πρωτεϊνών αυτών με τη βοήθεια του acyl CoA και άλλων πρωτεϊνών (π.χ. SNAP25) καταλύει τη σύντηξη των δύο λιπιδικών διπλοστοιβάδων. O NSF είναι μια ATPase που υδρολύει το ATP προκειμένου να απελευθερωθεί το σύμπλοκο.

37 Κατανομή των διαφόρων κυστιδιακών καλυμμάτων, των προσαρμοστών τους και των GTP πρωτεϊνών, που συμμετέχουν στο σχηματισμό του κυστιδίου στα διάφορα μονοπάτια κυστιδιακής μεταφοράς του κυττάρου.

38

39 Πλήρης ονοματολογία των συντμήσεων των βασικών πρωταγωνιστών της κυστιδιακής μεταφοράς στα ευκαρωτικά κύτταρα

40 Μαρκάρισμα και μεταφορά πρωτεϊνών για πρωτεόλυση στο πρωτεάσωμα (μονοπάτι 11) ΠΡΩΤΕΟΣΩΜΑ 11 ΚΥΤΤΟΣΟΛΙΟ

41 Το μονοπάτι αποικοδόμησης πρωτεϊνών στο πρωτεόσωμα Τα κύτταρα διαθέτουν τόσο εξωκυττάριους όσο και ενδοκυττάριους μηχανισμούς για την αποδόμηση πρωτεϊνών. Το κύριο εξωκυττάριο μονοπατι είναι το σύστημα των πρωτεασών πέψης που εντοπίζεται στο έντερο και διασπά τις πρωτεϊνες σε μικρά πολυπεπτίδια. Στο σύστημα αυτό περιλαμβάνονται διάφορες ενδοπρωτεάσες, οι εξωπεπτιδάσες και οι πεπτιδάσες. Δεδομένου ότι ο χρόνος ζωής των ενδοκυττάριων πρωτεϊνων μπορεί να ποικίλει από λίγα λεπτά (μιτωτικές κυκλίνες) έως πολλά χρόνια (πρωτεϊνες του φακού των ματιών) τα κύτταρα έχουν αναπτύξει διάφορους ενδοκυττάριους μηχανισμούς για την απομάκρυνση πρωτεΐνών που φέρουν λάθη στην αμινοξική τους ακολουθία (μη σωστή πρωτεϊνοσύνθεση), κατεστραμμένων πρωτεϊνών (π.χ. λόγω οξείδωσης), ή πρωτεΐνών που αφορούν ειδικότερα τον κυτταρικό κύκλο καθώς και μια σειρά από επιπλέον πρωτεϊνες (σταδιάφοραμονοπάτιαμεταγωγήςσήματος) που δεν είναι πλέον χρήσιμες στο κύτταρο. Επιπλέον τα ενδοκυττάρια συστήματα αποδόμησης πρωτεϊνών στοχεύουν και μια σειρά από πρωτεϊνες που αποροφήθηκαν από το κύτταρο. Ενα από τα κύρια ενδοκυττάρια μονοπάτιααποδομησηςπρωτεϊνώναφοράταλυσοσώματασταοποία(όπως ήδη αναφέρθηκε) εντοπίζονται μια σειρά από περίπου 50 διαφορετικά πρωτεολυτικά ένζυμα (πρωτεάσες, φωσφατάσες, νουκλεάσες, λιπάσες και γλυκοσιδάσες).

42 Παράλληλα όμως στο κύτταρο υπάρχει και ένας άλλος ενδοκυττάριος μηχανισμός αποδόμησης πρωτεϊνών που εντοπίζεται στο κυττοσόλιο. Ο μηχανισμός αυτός είναι το πρωτεάσωμα. Το πρωτεόσωμα είναι ένα πολύ μεγάλο πρωτεϊνικό σύμπλεγμα (αποτελούμενο από πολλές υπομονάδες) όπου η κύρια πρωτεολυτική του δράση αφορά ένα σύμπλοκο που ονομάζεται 20S. Το σύμπλοκο αυτό έχει δομή κυλίνδρου και αποτελείται από 28 υπομονάδες με συνολικό μοριακό βάρος περίπου 700 kda. Παράλληλα ένα σύμπλοκο με δράση ρυθμιστή (19S) φαίνεται ότι επιλέγει και αναγνωρίζει τις πρωτεϊνες που προορίζονται για αποδόμηση τις οποίες και προωθεί προς το εσωτερικό του κυλίνδρου. Η σήμανσηκαιηστόχευσητωνπρωτεϊνώνγιααποδόμησηστοπρωτεόσωμαπεριλαμβάνει ένα πολύπλοκο σύστημα αναγνώρισης που βασίζεται στο μαρκάρισμα των πρωτεϊνών με κατάλοιπα ουμπικιτίνης (ένα μικρό μόριο 76 αμινοξέων) καιπεριλαμβάνειδύοβήματα. Πρόσδεση μιας αλυσίδας μορίων ουμπικιτίνης σε πλευρικά αμινοξέα (κυρίως Lys) που πιθανότατα αποκαλύπτονται στην επιφάνεια της πρωτεϊνης λόγω αποδιάταξης της(τα κατάλοιπααυτάέχουνδράσησινιάλου). Πιο συγκεκριμένα αρχικά το ειδικό ενζυμικό σύμπλοκο ουμπικιτινίωσης καταλύει το σχηματισμό ενός πεπτιδικού δεσμού μεταξύ της ουμπικιτίνης και της εκτεθειμένης -NH2 στην πλευρική ομάδα ενός καταλοίπου λυσίνης στην πρωτεϊνη στόχο. Στη συνέχεια ακολουθεί πρόσθεση επιπλέον μορίων ουμπικιτίνης οπότε δημιουργείται μια αλυσίδα πολυουμπικιτίνης. Η αλυσίδα αυτή στη συνέχεια κατευθύνει την πρωτεϊνη στο πρωτεόσωμα όπου τελικά η πρωτεϊνη αποδομείται μέσω μιας διαδικασίας που εξαρτάται από ATP και που τελικά έχει σαν αποτέλεσμα τη δημιουργία πεπτιδίων και άθικτων μορίων ουμπικιτίνης.

43 Το πρωτεάσωμα

44 Γραμμική απεικόνιση της δομής Κατανομή πυκνότητας Ισο-επιφάνειες της εσωτερικής δομής 26S πρωτεάσωμα 26S ΠΡΩΤΕΑΣΩΜΑ

45

46 H 2 N- H 2 N- κανονική πρωτεΐνη ΠΡΟΣΘΗΚΗ ΟΥΜΠΙΚΙΤΙΝΗΣ -COOH -COOH 19S ρυθμιστής αποδιαταγμένη πρωτεΐνη (-NH 2 καταλοίπου Lys εκτίθεται) H 2 N- O C Ub Ub Ub Ub Ub n NH ATP 20S πρωτεόσωμα 26S πρωτεόσωμα NH 2 AMP + PPi (n φορές) ATP -COOH AMP + PPi H 2 N- Ub ενζυμικό σύμπλοκο ουμπικιτινίωσης O Ub Ub + Ub C Ub NH Ub Ub Ub Ub -COOH Σχηματική αναπαράσταση των κύριων γεγονότων που αφορούν στην στόχευση και την αποδόμηση αποδιαταγμένων πρωτεϊνών στο συμπλοκο του 26S πρωτεοσώματος. Τα βήματα της διαδικασίας περιλαμβάνουν αναγνώρισης του εκτεθειμένου (λόγω αποδιάταξης) καταλοίπου Lys, πολυ-ουμπικιτινίωση του μέσω του ενζυμικού συμπλόκου ουμπικιτινίωσης και της ουμπικιτίνης (με κατανάλωση ATP), αναγνώριση από το 19S ρυθμιστή και τελικά αποδόμηση από το 20S πρωτεολυτικό τμήμα του πρωτεοσώματος. Στο 20S σύμπλοκο αποδομούνται και οι οξειδωμένες πρωτεΐνες, οι οποίες δε φαίνεται όμως να μαρκάρονται με ουμπικιτίνη.

47 ΠΡΟΣΘΗΚΗ ΟΥΜΠΙΚΙΤΙΝΗΣ

48 ΠΡΟΣΘΗΚΗ ΟΥΜΠΙΚΙΤΙΝΗΣ

49 ΠΡΟΣΘΗΚΗ ΟΥΜΠΙΚΙΤΙΝΗΣ ΚΑΤΑ ΜΗΚΟΣ ΤΟΜΗ ΤΟΥ 20S ΠΡΩΤΕΟΣΩΜΑΤΟΣ Θάλαμος εισόδου Κεντρική κοιλότητα β- υπομονάδα α- υπομονάδα Löwe et al.

50

51 Nalepa et al. Nature Reviews Drug Discovery 5, (July 2006) doi: /nrd2056