ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΙΙ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΧΗΜΕΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Π. ΜΑΡΚΑΚΗ ΚΑΙ Σ. ΜΑΣΤΡΟΝΙΚΟΛΗ ΑΘΗΝΑ

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΙΙ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΧΗΜΕΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Π. ΜΑΡΚΑΚΗ ΚΑΙ Σ. ΜΑΣΤΡΟΝΙΚΟΛΗ ΑΘΗΝΑ

3 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ: Μικροσκόπιο-Αποστείρωση- Θρεπτικό υλικό- Έλεγχος γάλακτος-έλεγχος νερού (Θεωρία).2-30 ΜΥΚΗΤΕΣ ΠΑΘΟΓΟΝΟ ΒΑΚΤΗΡΙΟ ΤΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΛΙΣΤΕΡΙΑ ΜΟΝΟΚΥΓΤΑΡΟΓΟΝΟΣ ΚΑΙ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΝΕΡΟΥ Σελ. 3

4 ΓΕΝΙΚΕΣ ΟΔΗΓΙΕΣ 1) Πριν αρχίσετε τις ασκήσεις διαβάστε με προσοχή το εργαστηριακό φυλλάδιο. Μη διστάσετε να ρωτήσετε τον διδάσκοντα εάν έχετε απορίες. Πρέπει να ξέρετε ακριβώς τι θα κάνετε, και ποιό είναι το θέμα της άσκησης πριν από τον οποιοδήποτε χειρισμό. 2) Σημειώνετε τις παρατηρήσεις σας τη στιγμή που τις παίρνετε. 3) Να χειρίζεστε τις καλλιέργειες με προσοχή σαν να πρόκειται για καλλιέργειες παθογόνων μικροοργανισμών επικίνδυνων για την υγεία του ανθρώπου. 4) Αν σπάσει δοκιμαστικός σωλήνας ή άλλο δοχείο που περιέχει καλλιέργειες, ή αν χυθεί υγρό καλλιέργειας πρέπει να το αναφέρετε αμέσως. 5) Κάθε τυχαίος τραυματισμός (κόψιμο, τρύπημα κλπ) όσο μικρός κι αν είναι, επίσης θα πρέπει να τον αναφέρετε. 6) Μην αγγίζετε με τα δάκτυλά σας τα χείλη των σωλήνων που έχουν καλλιέργειες, εάν προηγουμένως αυτά έχουν αποστειρωθεί στη φλόγα. Υπάρχει κίνδυνος εγκαυμάτων. 7) Μη ανοίξετε τα αποστειρωμένα τρυβλία και τα αποστειρωμένα σιφώνια, παρά μόνο τη στιγμή που θα τα χρησιμοποιήσετε. 8) Μην αφαιρείτε το βύσμα από βαμβάκι των αποστειρωμένων σιφωνίων: Σας προστατεύει από τους μικροοργανισμούς καθώς και το εσωτερικό του σιφωνίου από τις μολύνσεις. Αν εξέχουν ίνες κάψτε τις, περνώντας την άκρη του σιφωνίου από τη φλόγα. 9) Σβήνετε τη φλόγα του λύχνου, όταν δεν τη χρησιμοποιείτε. 10) Χειρίζεστε με προσοχή τα μικροσκόπια. Αναφέρατε αμέσως τυχούσα βλάβη. Στο τέλος κάθε άσκησης καθαρίστε τη θέση σας, κλείστε το φωτισμό και σκεπάστε το μικροσκόπιο. 11) Όλες οι καλλιέργειες πρέπει να σημειώνονται. Σημειώστε πάνω στο δοχείο καλλιέργειας ότι είναι απαραίτητο, δηλ. πηγή μικροοργανισμού, θρεπτικό υλικό, ημερομηνία, το όνομά σας κτλ. 4

5 ΑΠΟΣΤΕΙΡΩΣΗ Οι μικροοργανισμοί είναι ευρέως διαδεδομένοι στο περιβάλλον και βρίσκονται παντού οπουδήποτε μπορεί να μεταφερθούν και όπου οι συνθήκες επιτρέπουν τη διατήρηση της ζωής. Γι αυτό το λόγο σε όλα τα υλικά και τα σκεύη που χρησιμοποιούνται για τις καλλιέργειες βρίσκονται πολλοί ξένοι μικροοργανισμοί διαφόρων κατηγοριών. Οι εργαστηριακές μελέτες αφορούν κατά κανόνα μεμονωμένα είδη μικροοργανισμών και γι αυτά απαιτείται η καθαρή καλλιέργειά τους, χωρίς την παρουσία ξένων ανεπιθύμητων ειδών. Καθαρή η αξενική καλλιέργεια είναι η καλλιέργεια ενός μόνο είδους. Για να επιτευχθεί μια καθαρή καλλιέργεια Θα πρέπει πρώτα να αποστειρωθούν τα μέσα καλλιέργειας και τα διάφορα σκεύη. Η αποστείρωση είναι μια διαδικασία που απαλλάσσει τα υλικά ή τα αντικείμενα από κάθε μικροοργανισμό και πραγματοποιείται με φυσικά ή χημικά μέσα. Φυσικά μέσα αποστείρωσης Θερμότητα Το φυσικό μέσο που χρησιμοποιείται συνήθως είναι η θερμότητα σε ξερή ή υγρή μορφή (ατμοί). Η αποστείρωση με ξερή θερμότητα γίνεται σε ειδικούς αποστειρωτικούς κλιβάνους. Πλήρης αποστείρωση επιτυγχάνεται με έκθεση των αντικειμένων σε 180 C επί μία ώρα. Μ' αυτό το τρόπο αποστειρώνονται γυαλικά, μεταλλικά αντικείμενα και γενικά ότι είναι ανθεκτικό στις υψηλές Θερμοκρασίες. Με υγρή θερμότητα (υπέρθερμοι ατμοί) αποστειρώνονται νερά, διάφορα διαλύματα, θρεπτικά υλικά και γενικά υλικά υγρά αλλά και στερεά. Η αποστείρωση γίνεται μέσα σε ειδικό κλίβανο το αυτόκαυστο που είναι ένα δοχείο υδρατμών υψηλής πιέσεως. Το αυτόκαυστο είναι εφοδιασμένο με μανόμετρο και έχει μια βαλβίδα εξαγωγής ατμού και αέρα καθώς και μια βαλβίδα ασφαλείας. Για τη Θανάτωση των μικροοργανισμών χρειάζεται έκθεση των αντικειμένων σε ατμόσφαιρα ατμών πίεσης 1 at πάνω από την ατμοσφαιρική, επί min. Αυτή η ατμόσφαιρα αντιστοιχεί σε θερμοκρασία ατμών 120 ο C. Για να υπάρχει αυτή η αντιστοιχία πίεσης ατμών και θερμοκρασίας θα πρέπει να αντικατασταθεί όλος ο αέρας του αυτόκαυστου με ατμό. Τούτο φαίνεται από την έξοδο σταθερής στήλης ατμού από τη βαλβίδα εξαγωγής την οποία στη συνέχεια κλείνετε. Για να αποστειρωθούν θρεπτικά υλικά στα οποία ήδη έχουν αναπτυχθεί μικροοργανισμοί, απαιτείται αποστείρωση στους 140 C για min. Αποστείρωση γυαλικών Τα γυαλικά αποστειρώνονται στον κλίβανο στους 180 C επί μία ώρα. Τα τρυβλία τυλίγονται σε χαρτί ανά 4-5 ή τοποθετούνται σε ειδικές μεταλλικές θήκες για να προστατευθούν από μεταγενέστερες μολύνσεις μέχρις ότου χρησιμοποιηθούν. Τα σιφώνια επίσης είτε αποστειρώνονται σε μεταλλικές θήκες, είτε τυλιγμένα σε χαρτί (1 σιφώνιο σε κάθε στροφή του χαρτιού) όπου σημειώνετε με ένα + την ανώτερη άκρη τους. Προηγουμένως στην ανώτερη άκρη των σιφωνίων τοποθετείτε βύσμα από βαμβάκι. 5

6 ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ Για την παρατήρηση των βακτηρίων και γενικότερα μικροοργανισμών πολύ μικρού μεγέθους χρησιμοποιούνται απλοί φακοί ή συστήματα αυτών όπως είναι το μικροσκόπιο. Φακοί είναι σώματα διαφανή που καθορίζονται από δύο σφαιρικός επιφάνειες ή μια σφαιρική και μια επίπεδη. Κύριος άξων του φακού είναι η ευθεία η διερχόμενη δια των δύο κέντρων καμπυλότητας των σφαιρικών επιφανειών ταυ φακού. Ανάλογα με την κατεύθυνση των ακτινών μετά την πτώση τους επί των φακών, τους διακρίνουμε σε συγκλίνοντες ή και αποκλίνοντες. Το σημείο που ο κύριος άξων τέμνει το φακό καλείται οπτικά κέντρο. Κύρια εστία του φακού είναι: 1) Το κέντρο της σφαίρας στην οποία υποθετικά ανήκει η σφαιρική επιφάνεια του φακού. 2) Το σημείο στο οποίο συγκεντρώνεται μετά τη διάθλαση, δέσμη ακτινών που προσπίπτει παράλληλα προς τον κύριο άξονα. Στους φακούς υπάρχουν 2 κύριες εστίες: Εστιακή απόσταση είναι η ευθεία γραμμή που συνδέει το οπτικό κέντρο και η κύρια εστία του φακού. Για την παρατήρηση των μικροοργανισμών γενικά χρησιμοποιούνται οι αμφίκυρτοι ή συγκλίνοντες φακοί. Το σύνθετο μικροσκόπιο αποτελείται από τους εξής φακούς: 1) Το φακό του φωτιστικού συστήματος, 2) το φακό του συλλέκτη των φωτεινών ακτινών, 3) τον αντικειμενικό, 4) το προσοφθάλμιο. Επίσης διαθέτει: 1) Το διάφραγμα του φωτιστικού συστήματος, 2) το διάφραγμα του συλλέκτη των φωτεινών ακτινών, 3) το διάφραγμα του προσοφθάλμιου. Στο σύνθετο μικροσκόπιο η τελική μεγέθυνση καθορίζεται από τον αντικειμενικό και προσοφθάλμιο φακό και η τιμή της υπολογίζεται από τον τύπο: δl+f 2 Μ= f F όπου δ=απόσταση ευκρινούς οράσεως (25 cm), L=απόσταση μεταξύ των εστιών των δύο φακών αντικειμενικού και προσοφθάλμιου και F και f οι εστιακές αποστάσεις των δύο φακών που προαναφέρθηκαν αντιστοίχως. Εάν στον τύπο δεν υπολογίσουμε το F 2 τότε: δl Μ= f F Φαίνεται λοιπόν ότι θεωρητικά η μεγέθυνση μπορεί να αυξηθεί απείρως εάν αυξηθούν οι τιμές των εστιακών αποστάσεων, καθώς και της αποστάσεως L. Στην πραγματικότητα όμως τούτο δεν είναι δυνατόν λόγω διαφόρων ατελειών των φακών. Έτσι στα μικροσκόπια λαμβάνουμε υπόψη άλλο ένα παράγοντα τη διακριτική ικανότητα. Διακριτική ικανότητα ενός μικροσκοπίου είναι η ικανότητά 6

7 του να χαρακτηρίζεται από την ελάχιστη απόσταση 2 σημείων των οποίων οι εικόνες διακρίνονται σαφώς μεταξύ τους. Όσο μικρότερη (d) είναι αυτή η απόσταση τόσο τελειότερο είναι το μικροσκόπιο: Υπολογίζεται από τον τύπο: Η διακριτική ικανότητα των τελειότερων αντικειμενικών φακών είναι 0,22 μ. Το μέσο το οποίο μεσολαβεί μεταξύ αντικειμενικού φακού και παρασκευάσματος μπορεί να είναι αέρας (ν=1), νερό (ν=1,33), παραφινέλαιο (ν=1,47), κεδρέλαιο (ν=1,57). Όσο μεγαλύτερος είναι ο δείκτης διαθλάσεως (ν) του μέσου τόσο μεγαλύτερη διακριτική ικανότητα επιτυγχάνουμε, διότι το αριθ. άνοιγμα = ν ημθ και λ δ= ν ημθ όπου λ=μήκος κύματος, ν=δείκτης διαθλάσεως, θ=γωνία που σχηματίζουν οι οπτικές ακτίνες του παρασκευάσματος με τον οπτικά άξονα του αντικειμενικού φακού. Κάθε μικροσκόπιο έχει 3 φακούς: α) Τον αντικειμενικό χαμηλής δυνάμεως με εστιακή απόσταση 16 mm. Χρησιμοποιείται στεγνός χωρίς νερό ή κεδρέλαιο και δίνει μεγέθυνση 8-10 φορές. β) Τον αντικειμενικό υψηλής δυνάμεως με εστιακή απόσταση 4 mm. Δίνει μεγέθυνση φορές. γ) Τον καταδυτικό φακό με εστιακή απόσταση 2 mm. Χρησιμοποιείται πάντα εμβαπτισμένος σε σταγόνα κεδρελαίου. Εάν το παρασκεύασμα είναι μονιμοποιημένο και χρωσμένο ή σταγόνα τοποθετείται απευθείας στην αντικειμενοφόρο πλάκα. Αν όμως το παρασκεύασμα (ζυμομύκητες, βακτήρια) είναι διασπαρμένο σε σταγόνα νερού και όχι μονιμοποιημένο, τότε η σταγόνα κεδρελαίου τοποθετείται πάνω από την καλυπτρίδα. Η χρήση του καταδυτικού φακού απαιτεί χρόνο και δεξιοτεχνία και αυτό επειδή ο φακός που σχεδόν εφάπτεται με την πλάκα, είναι επικίνδυνο να σπάσει. Χειρισμός μικροσκοπίου Χαράζετε με μολύβι υαλογραφικό μια γραμμή στη μέση μιας αντικειμενοφόρου πλάκας. Τοποθετείτε την πλάκα στο μικροσκόπιο και χρησιμοποιείτε τον αντικειμενικό φακό μικράς μεγεθύνσεως, ανεβοκατεβάζοντας τον κοχλία μέχρις ότου διακρίνετε ευκρινώς τη γραμμή στην πλάκα. Ύστερα ρυθμίστε το φως, το διάφραγμα κτλ για να έχετε το μέγιστο της διακριτικότητας. Στη συνέχεια τοποθετείστε το παρασκεύασμα όπως προηγουμένως και με τον ίδιο φακό επιλέξτε ένα πεδίο όπου οι μικροοργανισμοί είναι εμφανείς (όχι στις λεπτομέρειες και αραιοί. Στο σημείο αυτά τοποθετείστε κεδρέλαιο (μια σταγόνα) και φέρτε στη θέση του αντικειμενικού μικράς μεγεθύνσεως τον καταδυτικό (χωρίς να μετακινήσετε το σωλήνα του μικροσκοπίου) δια απλής περιστροφής. Κατά την αντικατάσταση του φακού μικράς μεγεθύνσεως με τον καταδυτικό, προσέξτε κοιτάζοντας από τα πλάγια αν υπάρχει περιθώριο μεταξύ 7

8 παρασκευάσματος και σωλήνα μικροσκοπίου για να τοποθετηθεί ο καταδυτικός φακός. Αν όχι ανεβάστε το σωλήνα του μικροσκοπίου ελαφριά προς τα πάνω και στη συνέχεια φέρτε τον καταδυτικό φακό πάνω από τη σταγόνα του κεδρελαίου. Κατόπιν κοιτάζοντας από δίπλα (με γυμνό μάτι) εμβαπτίστε το καταδυτικό φακό εντός του κεδρελαίου έτσι ώστε να εφάπτεται ελαφριά με την αντικειμενοφόρο πλάκα. Γι αυτό χρησιμοποιείστε το μικρομετρικό κοχλία του μικροσκοπίου. Στη συνέχεια κοιτάξτε μέσα από το φακό και περιστρέψτε το μικρομετρικό κοχλία αντίθετα προς τη φορά των δεικτών του ωρολογίου (ο φακός ανέρχεται) μέχρις ότου δείτε ευκρινώς το παρασκεύασμα. Εδώ χρειάζεται προσοχή γιατί καθώς κοιτάζετε το παρασκεύασμα μέσα από το προσοφθάλμιο, ουδέποτε θα πρέπει να περιστρέψτε το μικρομετρικό κοχλία αντίθετα, γιατί ο καταδυτικός κατέρχεται. Και επειδή το περιθώριο μεταξύ πλάκας και φακού είναι μηδαμινό, υπάρχει σοβαρός κίνδυνος ο φακός να σπάσει. ΕΞΕΤΑΣΗ ΝΩΠΩΝ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΩΝ Ο σκοπός της άσκησης είναι: α) Ο έλεγχος της παρουσίας ή μη μικροοργανισμών, β) η μελέτη της μορφολογίας τους και κυρίως σε ποιές ομάδες κατατάσσονται και γ) η μελέτη της κινητικότητας των μικροβίων. Η εξέταση του νωπού παρασκευάσματος γίνεται σε καθαρές πλάκες, χωρίς χρώση απευθείας μεταξύ πλάκας και καλυπτρίδας. Εάν η καλλιέργεια που θα ξεκινήσετε είναι υγρή, τοποθετείστε μια σταγόνα απ' αυτή πάνω στην πλάκα. Εάν η καλλιέργεια είναι στερεή, παίρνετε με πιπέτα Pasteur ή κρίκο μια μικρή αποικία και φτιάξτε με φυσιολογικά ορό (αποστειρωμένο) ένα εναιώρημα. Στη συνέχεια βάζετε μια σταγόνα στην πλάκα και καλύπτετε με την καλυπτρίδα. Παρατηρείστε γρήγορα στο μικροσκόπιο. Τα μικρόβια που κινούνται διασχίζουν το οπτικό πεδίο γρήγορα προς όλες τις κατευθύνσεις. Εξέταση ύστερα από χρώση Για την παρατήρηση και μελέτη των λεπτομερειών ενός παρασκευάσματος, εκτός από τη μεγέθυνση και τη διά του μικροσκοπίου επίτευξη του maximum της διακριτικής ικανότητας, απαιτείται και ζωηρή χρωματική αντίθεση μεταξύ των μικροοργανισμών και του άμεσου περιβάλλοντάς τους. Το τελευταίο επιτυγχάνεται με τη χρήση των μονιμοποιημένων παρασκευασμάτων. Η μονιμοποίηση γίνεται για τους εξής λόγους: α) Καταστρέφει την εκλεκτική διαπερατότητα της κυτταρικής μεμβράνης και επιτρέπει την είσοδο των χρωστικών μέσα στο κύτταρο. β) Θρομβώνει τις πρωτεΐνες και διαφυλάσσει τη γενική μορφολογία του κυττάρου. Με τη θρόμβωση οε πρωτεΐνες δεν διαλύονται στο νερό και έτσι δεν εκπλύνονται κατά την πορεία της χρώσης. γ) Καθιστά ακίνδυνους τους μικροοργανισμούς. 8

9 Τρόπος εργασίας Καλύπτετε το παρασκεύασμα, που είχε ήδη μονιμοποιηθεί, με Η 2 Ο Στη συνέχεια προσθέτετε μερικές σταγόνες χρωστικής και αφήνετε να δράσουν 1-2 min. Απομακρύνετε τη χρωστική και ξεπλένετε με νερό. Αφήνετε να στεγνώσει και παρατηρείτε στο μικροσκόπιο βάζοντας μια σταγόνα κεδρελαίου πάνω στο παρασκεύασμα. ΧΡΩΣΗ GRAΜ Η χρώση Gram όταν χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά ήταν μια εμπειρική μέθοδος. Αργότερα όμως διαπιστώθηκε ότι συνδέεται με πολύ συγκεκριμένες διαφορές δομής των κυτταρικών τοιχωμάτων στις δύο κατηγορίες βακτηρίων που χαρακτηρίζονται ως Gram + και Gram -. Υπάρχουν όμως και μικροοργανισμοί Gram + που αν εκτεθούν στη δράση των ενζύμων RΝΑάση και λυσοζύμη καθίστανται Gram -. Στα Gram + βακτήρια το κυτταρικό τοίχωμα αποτελείται από μια παχιά στοιβάδα μουρεΐνης με την οποία είναι ενωμένα διάφορα οξέα του κυτταρικού τοιχώματος σε ποσοστό 50% του ξηρού βάρους των τοιχωμάτων και πολυσακχαρίτες σε μικρότερο όμως ποσοστό. Στα Gram - βακτήρια το τοίχωμα έχει δύο βασικές στοιβάδες: μια εξωτερική (80% του τοιχώματος) που αποτελείται από λιποπρωτεΐνες και λιποπολυσακχαρίτες και μια εσωτερική λεπτή στοιβάδα από μουρεΐνη. Σ' αυτές τις παραπάνω διαφορές οφείλεται και η διαφορική χρώση των βακτηρίων Gram + και Gram -. Στα Gram - ο οργανικός διαλύτης διαλύει τη στοιβάδα των λιποπολυσακχαριτών και έτσι η λεπτή στοιβάδα της μουρεΐνης καθίσταται περατή και δεν συγκρατεί το σύμπλοκο ιωδίου-ιωδιούχου καλίου που διαλύεται στην αλκοόλη και απομακρύνεται. Έτσι το κύτταρο αποχρωματίζεται. Αντίθετα στα Gram + η αλκοόλη απλώς αφυδατώνει την παχιά στοιβάδα μουρεΐνης μειώνοντας τη διαπερατότητά της. Έτσι δεν είναι δυνατή η έξοδος του συμπλόκου ενώ εμποδίζεται η είσοδος της χρωστικής, π.χ. σαφρανίνης ή φουξίνης και τα κύτταρα παραμένουν μπλε. Στα Gram - ωστόσο, η χρωστική εισέρχεται εύκολα και τα χρωματίζει κόκκινα. Στις παραπάνω διαφορές δομής των κυτταρικών τοιχωμάτων οφείλονται οι αντιγονικές ιδιότητες και ορισμένες άλλες ιδιότητες των Gram - βακτηρίων π.χ. τοξικότητα για τους ζώντες οργανισμούς, ανθεκτικότητα στη δράση της λυσοζύμης και ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά όπως η πενικιλίνη κτλ. 9

10 10

11 Χρώση Gram: 1) 1 σταγόνα δείγματος τροφίμου -> 5 ml Η 2 Ο απεσταγμένο 2) Απλώνεται μια σταγόνα από το (1) σε αντικειμενοφόρο πλάκα σε διαστάσεις 3x1cm 3) Αφήνετε για λίγο στον αέρα να στεγνώσει 4) Μονιμοποιείτε το παρασκεύασμα περνώντας 3 φορές πάνω από φλόγα (προσοχή να μην καεί) 5) Καλύπτεται με ΕtΟΗ για 60 sec 6) Ξεπλένετε με απεσταγμένο νερό 7) Καλύπτετε με methyl νiolet για 60 sec 8) Ξεπλένετε με απεσταγμένο νερό 9) Καλύπτετε με Lugol για 60 sec 10) Ξεπλένετε με ΕtΟΗ 95% η ακετόνη/αιθανόλη (1/4) μέχρις ότου οι σταγόνες να μην έχουν χρώμα (ΠΡΟΣΟΧΗ Σ' ΑΥΤΟ ΤΟ ΣΤΑΔΙΟ) 11) Καλύπτετε με φουξίνη ή σαφρανίνη για sec 12) Ξεπλένετε με απεσταγμένο Η 2 O και στεγνώνετε πάνω σε απορροφητικό χαρτί 13) Προσθέτετε μια σταγόνα κεδρελαίου και παρατηρείτε στο μικροσκόπιο: Gram + χρώμα μπλε Gram - χρώμα ροζ 11

12 12

13 Μικροσκοπική παρατήρηση Μόνιμα παρασκευάσματα του Εργαστηρίου Χημείας Τροφίμων: Βακτήρια 1) Κόκκοι Gram - 2) Σπορογόνοι βάκιλλοι 3) Βάκιλλοι Gram + 4) Βακτηριακές κάψες 5) Χρυσίζων σταφυλόκοκκος 6) Βακτήρια με μαστίγια 7) Σπειρήλια 8) Κλωστηρίδιο της αλλαντιάσεως 9) Γαλακτικά βακτήρια 10) Στρεπτόκοκκος 11) Escherichia coli 12) SaΙmοnella typhimurium 13) Αlcaligenes falcalis 14) Εrwinia amylofιora 15) Proteus νυlgaris 16) Acetobacter aceti Μύκητες-Ζυμομύκητες 1) Rhizopus (σπόρια, σποριάγγεια, σύζευξη) 2) Penicilium 3) Αspergillus 4) Αllomyces 5) Σακχαρομύκητες 6) Ζυμομύκητες 7) Schizosaccharomyces octasporus 8) Saprolegnia 9) Grape miιdew 10) Synthytrium 13

14 ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ Τα θρεπτικά υλικά χρησιμοποιούνται στη μικροβιολογία για τους εξής λόγους: α) Για την απομόνωση καθαρών καλλιεργειών. β) Για τη διατήρηση καλλιεργειών που έχουν απομονωθεί σε θρεπτικό υλικό, μέσα σε δοκιμαστικούς σωλήνες κεκλιμένης επιφάνειας ή όχι. γ) Για την προώθηση της ανάπτυξης μιας καθορισμένης κατηγορίας μικροοργανισμών σε βάρος άλλων. Αυτά τα θρεπτικά υλικά ονομάζονται εκλεκτικά. δ) Για την ανίχνευση μικροοργανισμών συγκεκριμένης κατηγορίας επιτυγχάνεται με την ενσωμάτωση κάποιου δείκτη μέσο στο θρεπτικό υλικό. Αυτός ο δείκτης Θα πρέπει να αντιδρά με τα προϊόντα μεταβολισμού του μικροοργανισμού που θέλουμε να προσδιορίσουμε και να δίδει χαρακτηριστική αντίδραση π.χ. eosinmethylene blue-agar για τα κολοβακτηρίδια. Στο εργαστήριο χρησιμοποιούνται θρεπτικά υλικά που ταξινομούνται ως εξής (ανάλογα με την προέλευσή τους): α) Φυσικά υποστρώματα π.χ. τεμάχια φυτικών και ζωικών ιστών, εκκρίματα φυτών και ζώων κτλ. β) Ημισυνθετικά υλικά, τα οποίο είναι συνήθως εκχυλίσματα διαφόρων φυσικών υποστρωμάτων που είτε χρησιμοποιούνται όπως είναι είτε ενισχυμένο με την προσθήκη κάποιας πηγής άνθρακα π.χ. εκχύλισμα πατάτας και γλυκόζη. γ) Συνθετικά ή τεχνητά θρεπτικά υλικά, τα οποία είναι διαλύματα διαφόρων χημικών ουσιών που είναι απαραίτητες για τη διατροφή συγκεκριμένων μικροοργανισμών. Έτσι η σύνθεση αυτών των Θρεπτικών υλικών είναι καθορισμένη τόσο ποιοτικά όσο και ποσοτικά σε αντίθεση με τις δύο προηγούμενες κατηγορίες. Τα θρεπτικά υλικά χωρίζονται επίσης σε στερεά και υγρά. Όλα όμως τα υγρά θρεπτικά υλικά μπορούν να γίνουν στερεά με την προσθήκη ενός στερεοποιητικού παράγοντα. Τέτοιοι παράγοντες είναι οι εξής: α) ζελατίνη, β) άγαρ, γ) κολλοειδές πυρίτιο (silica gel), που χρησιμοποιούνται μόνο στη μικροβιολογία εδάφους. Από αυτούς η ζελατίνη δεν χρησιμοποιείται πλέον α) γιατί δεν πήζει σε όξινο περιβάλλον, β) δεν πήζει πάνω από 35 C και τέλος γ) υδρολύεται από τα πρωτεϊνολυτικά ένζυμα των μικροοργανισμών. Το άγαρ είναι πολυσακχαρίτης που εκχυλίζεται από ορισμένα ροδοφύκη π.χ. Gelidium cartilagenum, Gracilaria confervoides. Είναι γαλακτάνη και εμφανίζει τα εξής πλεονεκτήματα: 14

15 α) Προστίθεται στο θρεπτικό υλικά σε μικρή αναλογία (1,5-2%). Εάν το ρη είναι χαμηλό, αυξάνεται ελάχιστα η αναλογία του (2,5%). β) Δεν προσβάλλεται από τα σακχαρολυτικά ένζυμα των μικροοργανισμών. γ) Λιώνει στους 100 C αλλά πήζει στους 44 C. Η ιδιότητα αυτή αποτελεί μεγάλο πλεονέκτημα γιατί το υλικά αφενός μεν παραμένει στερεό σε υψηλές σχετικά Θερμοκρασίες, αφετέρου η διαφορά μεταξύ σημείου τήξης και σημείου πήξης δίνει τη δυνατότητα χειρισμού του τηγμένου υλικού. Εκτός από το στερεοποιητικό παράγοντα τα θρεπτικά υλικά πρέπει να περιέχουν: α) Μια πηγή άνθρακα κυρίως γλυκόζη, αλλά χρησιμοποιούνται επίσης φρουκτόζη, μαννόζη, κ.α. δισακχαρίτες όπως σακχαρόζη, λακτόζη κλπ, πολυσακχαρίτες π.χ. άμυλο. Κάθε κατηγορία μικροοργανισμών είναι σε θέση να χρησιμοποιήσει ως πηγή άνθρακα συγκεκριμένη τάξη υδατανθράκων, ανάλογα με τα ένζυμα που διαθέτουν στο κύτταρό τους και με τα οποία τους διασπούν σε CO 2 και Η 2 O αποδεσμεύοντας ταυτόχρονα ενέργεια. β) Πηγή αζώτου. Το άζωτο είναι απαραίτητο για τον πολλαπλασιασμό των μικροοργανισμών. Πηγή αζώτου είναι τα αμινοξέα γενικής μορφής: ΝΗ 2 R- C- CΟΟΗ H Ορισμένοι μικροοργανισμοί συνθέτουν τα απαραίτητα για την ανάπτυξή τους αμινοξέα από απλά. Άλλοι πάλι έχουν ανάγκη από ορισμένα ουσιώδη αμινοξέα τα οποία σ' αυτή την περίπτωση προστίθενται στο θρεπτικό υλικό. Τέλος υπάρχουν άλλοι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούν ανόργανο άζωτο π.χ. ΚΝO 3, (ΝΗ 4 ) 2 SO 4. Γενικά όσο απλούστερη μορφή αζώτου χρησιμοποιεί ένας μικροοργανισμός, τόσο περισσότερες συνθετικές ικανότητες διαθέτει δηλαδή (περισσότερο ένζυμα). γ) Βιταμίνες: Απαραίτητες είναι μόνο οι υδατοδιαλυτές βιταμίνες. Όσο για τις λιποδιαλυτές δεν θεωρούνται αναγκαίες για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών. δ) Ανόργανα άλατα και ιχνοστοιχεία: Τα φωσφορικά χρησιμοποιούνται στη γλυκόλυση, χωρίς αυτό να αποτελεί απαραίτητη προϋπόθεση. Άλλα ιόντα ή άλατα σχετίζονται με την ρυθμιστική ικανότητα του υποστρώματος και άλλα πάλι σχετίζονται με φαινόμενα διαπερατότητας της κυτταρικής μεμβράνης. 15

16 Εκλεκτικά θρεπτικά υλικά Κάθε μικροοργανισμός έχει ιδιαίτερες θρεπτικές απαιτήσεις. Έτσι ένα θρεπτικά υλικά μπορεί να μην είναι κατάλληλο εξίσου, για την ανάπτυξη όλων των μικροοργανισμών. Γι αυτά το λόγο το θρεπτικό υλικό που Θα χρησιμοποιηθεί για την απομόνωση μιας κατηγορίας μικροοργανισμών θα πρέπει να ανταποκρίνεται στις απαιτήσεις τους. Αν μάλιστα η σύνθεση του υλικού είναι τέτοια, που να ικανοποιούνται οι απαιτήσεις μιας και μόνο κατηγορία μικροοργανισμών τότε διευκολύνεται η απομόνωσή τους μέσα από ένα μικτό πληθυσμό. Τούτο επιτυγχάνεται όχι μόνο με την επιλογή του κατάλληλου θρεπτικού υλικού αλλά και με την προσθήκη σ' αυτό ουσιών π.χ. αντιβιοτικών που παρεμποδίζουν την ανάπτυξη άλλων μικροοργανισμών. Ένα τέτοιο υλικό που ευνοεί εκλεκτικά την ανάπτυξη ενός μικροοργανισμού ενώ παρεμποδίζει άλλους, ονομάζεται εκλεκτικό θρεπτικό υλικό. Η εκλεκτική ανάπτυξη ενός μικροοργανισμού μέσα από ένα μικτό πληθυσμό διευκολύνεται επίσης με τη δημιουργία εκλεκτικών συνθηκών ανάπτυξης π.χ. χαμηλό pη (4,5-5) περιορίζει την ανάπτυξη των βακτηρίων, ενώ οι μύκητες δεν επηρεάζονται. Η επώαση σε χαμηλές θερμοκρασίες ευνοεί την ανάπτυξη των θερμόφιλων, η απουσία Ο 2 την ανάπτυξη αναερόβιων κ.ο.κ. (βλ. επίσης Τεχνολογία Τροφίμων σελ...). 16

17 ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ-ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ Η μελέτη των μικροοργανισμών στα εργαστήριο έχει σαν προϋπόθεση να είναι διαθέσιμοι κάθε στιγμή. Τούτο επιτυγχάνεται με την καλλιέργειά τους, δηλαδή με την ανάπτυξη και διατήρησή τους κάτω από τεχνητές συνθήκες περιβάλλοντος που δημιουργούμε στο εργαστήριο για να μπορούμε να τις ελέγχουμε. Για την καλλιέργεια των μικροοργανισμών πρέπει να εξασφαλιστούν οι κατάλληλες συνθήκες π.χ. θερμοκρασίας, pη, υγρασίας, αερισμού κτλ και το κατάλληλο υλικό ή μέσο καλλιέργειας ή θρεπτικά υλικό (βλ. θρεπτικά υλικά). Καθαρή καλλιέργεια είναι το σύνολο μικροοργανισμών απογόνων ενός και μόνο ενός κυττάρου. Η καθαρή καλλιέργεια είναι ανύπαρκτη στη φύση διότι ο μικροβιακός πληθυσμός είναι μικτός. Υπάρχουν μόνο τύποι μικροβίων που δεσπόζουν των άλλων γιατί βρίσκουν τις κατάλληλες συνθήκες και το κατάλληλο υπόστρωμα για την ανάπτυξή τους π.χ. κατά τη γαλακτική ζύμωση των πράσινων ελαιών επικρατεί το γένος Lactobacillus, σε ένα πληθυσμό που αποτελείται από πολλά είδη μυκήτων, ζυμών και βακτηρίων. Η καθαρή καλλιέργεια είναι απαραίτητη και χρήσιμη για τους εξής λόγους: 1) Για τη μελέτη ενός μικτού μικροβιολογικού πληθυσμού. 2) Για την εξακρίβωση της σχέσης μεταξύ ασθένειας και του μικροοργανισμού που την προκαλεί. 3) Για την εξακρίβωση αλλοιώσεων ή ζυμώσεων των προϊόντων και τη σχέση τους με την παρουσία μικροοργανισμών. 4) Για την κατευθυνόμενη ζύμωση. Αυτή επιτυγχάνεται είτε με εμβολιασμό του υποστρώματος με καθαρή καλλιέργεια είτε με την εξασφάλιση ενός περιβάλλοντος δυσμενούς για τους υπόλοιπους μικροοργανισμούς. Καλλιέργειες εμπλουτισμού Οι καλλιέργειες εμπλουτισμού είναι ένα προκαταρκτικά στάδιο των μεθόδων διασποράς ή μετασποράς που περιγράφονται πιo κάτω. Αποτελεί μια μέθοδο που είναι απαραίτητη, εάν ο μικροοργανισμός που πρέπει να απομονωθεί βρίσκεται σε πολύ μικρή αναλογία στον αρχικό μικτό πληθυσμό. Οι θρεπτικές απαιτήσεις των διαφόρων μικροοργανισμών ποικίλλουν κι έτσι σ' ένα θρεπτικό υλικό αναπτύσσεται γρηγορότερα ο μικροοργανισμός αυτός που ανταγωνίζεται καλύτερα τους άλλους στην εκμετάλλευση του υποστρώματος. Σ' ένα τέτοιο υλικό δεν εμποδίζεται η ανάπτυξη των άλλων μικροοργανισμών όπως στα εκλεκτικά θρεπτικά υλικά αλλά ανάλογα με τη σύνθετη του υλικού ευνοείται η 17

18 ανάπτυξη του επιθυμητού μικροοργανισμού. Αυτός ο εμπλουτισμός του μικτού πληθυσμού με μερικούς διαδοχικούς εμβολιασμούς στο ίδιο υλικό μπορεί να καταλήξει σε καθαρή καλλιέργεια του είδους που επικρατεί. Τούτο συμβαίνει γιατί από κάποιο εμβολιασμό και μετά δεν παραλαμβάνεται κανένα κύτταρο άλλου είδους εκτός από αυτά που επικρατεί. Η τεχνική της καλλιέργειας των μικροοργανισμών Για να επιτευχθεί μια καθαρή καλλιέργεια πρέπει α) να αποστειρωθεί το μέσο καλλιέργειας και να συνεχίσει να διατηρείται στείρο και β) να μπορεί να εμβολιαστεί αυτά το στείρο μέσο με ένα μόνο μικροοργανισμό χωρίς εξωτερικές μολύνσεις. Το σύνολο των μέτρων και των χειριστών με τους οποίους αποφεύγονται οι μολύνσεις αποστειρωμένων αντικειμένων και υλικών αποτελεί την ασηπτική τεχνική. Το θρεπτικό υλικό που χρησιμοποιείται στις καλλιέργειες αποστειρώνεται μέσα στα δοχεία καλλιέργειας εκτός από τις καλλιέργειες στα τρυβλία. Σ' αυτή την περίπτωση το υλικά αποστειρώνεται σε σωλήνες ή φιάλες και μεταγγίζεται υπό ασηπτικές συνθήκες σε αποστειρωμένα τρυβλία. Τα δοχεία καλλιέργειας πριν την αποστείρωση κλείνονται με πώματα από μη υδρόφιλο βαμβάκι, ελαστικά ή ειδικά μεταλλικά, που εμποδίζουν την είσοδο των μικροοργανισμών. Για την έναρξη της καλλιέργειας μια μικρή ποσότητα κυττάρων του μικροοργανισμού, το μόλυσμα (inoculum), μεταφέρεται στο θρεπτικό υλικό με ασηπτική τεχνική, ώστε να διατηρηθεί η καθαρότητα της καλλιέργειας. Η διαδικασία αυτή ονομάζεται εμβολιασμός (inoculation) ή μεταφύτευση και γίνεται με τη βοήθεια της μικροβιολογικής βελόνας ή του μικροβιολογικού κρίκου ή του μικροβιολογικού γάντζου για τους μύκητες. Η ασηπτική τεχνική περιλαμβάνει τα εξής στάδια (Σχ. 2): α) Αποστείρωση της βελόνας ή του κρίκου στη φλόγα ενός λύχνου. Τοποθετείτε τον κρίκο κατά την εφαπτομένη του εσωτερικού κώνου της φλόγας μέχρις ότου αυτός αποκτήσει. ένα έντονο ερυθρό χρώμα (ολόκληρο το σύρμα και δακτύλιος και στέλεχος). Αποστειρώνετε επίσης ελαφρά με περάσματα μέσα από τη φλόγα και το σημείο σύνδεσης του σύρματος με τη λαβή του κρίκου ή της βελόνας. β) Αποστείρωση των χειλιών του σωλήνα ή της φιάλης αμέσως μετά το άνοιγμά του. Το πώμα κρατιέται μεταξύ των δακτύλων του δεξιού χεριού και ποτέ δεν 18

19 πρέπει να το αφήσετε πάνω στον πάγκο. Οι σωλήνες διατηρούνται σε οριζόντια κατά το δυνατόν θέση. γ) Παραλαβή του μολύσματος με τη βελόνα ή με τον κρίκο και κλείσιμό του σωλήνα ή της φιάλης αφού προηγουμένως αποστειρωθούν πάλι τα χείλη του. δ) Ανοίγετε, όπως στο (β) ένα νέο σωλήνα με αποστειρωμένο θρεπτικό υλικό, μεταφέρετε το μόλυσμα στο καθαρά υλικό και κλείνετε τον εμβολιασμένο σωλήνα όπως στο (γ). Τα χείλη των σωλήνων και των φιαλών αποστειρώνονται στη φλόγα του λύχνου, όταν πρόκειται να γίνει μετάγγιση υλικού αλλά και κατά τον εμβολιασμό των τρυβλίων. Προσοχή χρειάζεται σε δύο περιπτώσεις: i. Το καπάκι του τρυβλίου του ανασηκώνετε με ήρεμη μαλακή κίνηση από τη μία μόνο πλευρά και ii. το καπάκι παραμένει πάνω από το τρυβλίο κ δεν πρέπει να το αφήσετε πάνω στο πάγκο. Ετοιμασία τρυβλίων για καλλιέργεια (Σχ. 3) Το αποστειρωμένο λιωμένο θρεπτικό υλικό το αφήνετε να κρυώσει στους 45 ο -50 ο C και υπό ασηπτικές συνθήκες (όπως έχει περιγραφεί) μεταγγίζετε ml σε κάθε αποστειρωμένο τρυβλίο. Το υλικό δεν πρέπει να μεταφερθεί καυτό στα τρυβλία γιατί σχηματίζονται υδρατμοί που συμπυκνώνονται στην εσωτερική επιφάνεια του καπακιού. Στη συνέχεια μετακινείστε το τρυβλίο μαλακό κάνοντας κυκλικές κινήσεις ώστε το υλικά να κατανεμηθεί ομοιόμορφα. Μην το σηκώσετε από τον πάγκο. Ετοιμασία δοκιμαστικών σωλήνων για καλλιέργεια Στο δοκιμαστικό σωλήνα μεταγγίζονται 5ml θρεπτικού υλικού. Οι σωλήνες πωματίζονται με μη υδρόφιλο βαμβάκι και αποστειρώνονται στο αυτόκαυστο. Μετά την αποστείρωση και την εξαγωγή τους από το αυτόκαυστο αφήνονται σε όσο το δυνατόc πιο οριζόντια θέση ώστε το υλικό πήζοντας να σχηματίσει μεγάλη επιφάνεια. Μέθοδοι απομόνωσης μικροοργανισμών Υπάρχουν κυρίως δύο τρόποι απομόνωσης: α) Η μέθοδος διασποράς (Σχ. 3), β) η μέθοδος διασποράς ή εξάπλωσης (Σχ. 4). Κατά τη μέθοδο της διασποράς μια σταγόνα από το υλικό που εξετάζετε το απλώνεται με τη βοήθεια μικροβιολογικού κρίκου στο στερεό θρεπτικό υλικό που βρίσκεται στο τρυβλίο Petri. 19

20 Εάν το δείγμα είναι στερεό π.χ. κρέας, τυρί κλπ μεταφέρετε ασηπτικώς ένα μικρό κομμάτι σε αποστειρωμένο νερό και αναταράσσετε ισχυρώς μέχρις ότου επιτευχθεί η ομοιόμορφη κατανομή του σε όλη την ποσότητα του αποστειρωμένου νερού. Απ' αυτό το εναιώρημα στη συνέχεια παραλαμβάνετε ασηπτικώς ενοφθάλμισμα και το απλώνετε στην επιφάνεια του θρεπτικού υλικού. Εάν το δείγμα είναι υγρό π.χ. οίνος, άλμη ελαιών, γάλα, χυμός τομάτας κτλ τότε παραλαμβάνετε κατ' ευθείαν ενοφθάλμισμα που στη συνέχεια το απλώνετε στο Θρεπτικά υλικό. Στην περίπτωση που υπάρχουν υπόνοιες ότι ο πληθυσμός των μικροβίων είναι αυξημένος (θόλωμα, ίζημα κτλ) τότε πριν την απομόνωση γίνεται γνωστή αραίωση του δείγματος π.χ. 1/10 κ.ο.κ υπό ασηπτικές συνθήκες μέσα σε αποστειρωμένο νερά. Τρόποι εξάπλωσης Για την απομόνωση και την καλλιέργεια των μικροοργανισμών χρησιμοποιούνταιτα τρυβλία Petri και οι δοκιμαστικοί σωλήνες (Σχ. 2, 4). 1) Η εξάπλωση στα τρυβλία Petri γίνεται με διάφορους τρόπους όπως: α) η σταγόνα από το εναιώρημα του μικτού πληθυσμού μεταφέρεται με το μικροβιολογικό κρίκο στην άκρη του τρυβλίου με στερεό θρεπτικό υλικό. Στη συνέχεια την απλώνετε με τη βοήθεια τον κρίκου σε μια συνεχή γραμμή ζικ-ζακ από το αρχικό σημείο εκκίνησης μέχρι το απέναντι. β) Η σταγόνα απλώνεται σε δέσμες παραλλήλων γραμμών και κάθε μια απ' αυτές τις δέσμες ξεκινάει τέμνοντας το τέλος της προηγούμενης. γ) Χωρίστε με το μαρκαδόρο σε 4 τμήματα το τρυβλίο και με τον κρίκο απλώνετε τη σταγόνα έτσι ώστε για κάθε τεταρτημόριο στρέφετε το τρυβλίο χωρίς να το ανασηκώσετε από το τραπέζι κατά 90 συνεχίζοντας να απλώνετε με τον κρίκο (αφήνετε ευκρινή διάδρομο μεταξύ των τεταρτημορίων). Στις παραπάνω περιπτώσεις, επιτυγχάνεται μια προοδευτική αραίωση δηλ. μια διασπορά των κυττάρων από την αρχή προς το τέλος των γραμμών. Έτσι οι αποικίες των μικροοργανισμών που εμφανίζονται μετά την επώαση ενώ στην αρχή είναι πυκνές και αλληλοκαλύπτονται στο τέλος είναι πιό αραιές και απομονωμένες. Απ' αυτές τις απομονωμένες αποικίες επιλέγεται ο μικροοργανισμός που θα απομονωθεί και που στη συνέχεια καλλιεργείται σε ειδικό θρεπτικό υλικό. δ) Σε περίπτωση που θα πρέπει να συγκρίνετε 3 ή 4 διαφορετικές κατηγορίες μικροβίων κάνετε σειρές από το κέντρο προς την περιφέρεια προσέχοντας να μην αγγίζουν η μία γραμμή την άλλη. Οι γραμμές Θα πρέπει να είναι το πολύ 3 ή 4. 20

21 ε) Σε ειδικές περιπτώσεις όπως π.χ. έλεγχος αιμόλυσης ή παραγωγή Η 2 S στο βάθος, τρυπάτε το θρεπτικό υλικό με τη βοήθεια της μικροβιολογικής βελόνας κ.α. 2) Οι δοκιμαστικοί σωλήνες προετοιμάζονται όπως έχει αναφερθεί με τη βοήθεια του κρίκου ή της βελόνας ανάλογα. α) Κάνετε σειρές ζικ-ζακ στην επάνω επιφάνεια του θρεπτικού υλικού, β) Kάνετε μια κεντρική ευθεία γ) Διαδοχικά αγγίγματα δ) Τρυπάτε μέχρι το βάθος, ε) Περιστρέφοντας τη βελόνα ή την πιπέτα Pasteur από το βάθος του σωλήνα μέχρι επάνω. Στις περιπτώσεις δ και ε το θρεπτικό υλικό είναι ομοιόμορφα κατανεμημένο στο σωλήνα και δεν έχει απλωμένη την ανώτερη επιφάνειά του. Γενικά το μειονέκτημα της μεθόδου της διασποράς, είναι ότι απομονώνονται οι μικροοργανισμοί που επικρατούν στη μικροχλωρίδα του υποστρώματος, και πολύ σπάνια αυτοί που είναι πιο λίγοι. Σ' αυτή την περίπτωση πριν από την απομόνωση μεταφέρετε μια μικρή ποσότητα από το δείγμα ασηπτικώς σε ένα πλούσιο θρεπτικό υλικό. Το υλικό αυτό εξασφαλίζει τη δυνατότητα σ' όλους τους μικροοργανισμούς να αυξηθούν και να πολλαπλασιαστούν. Η απομόνωση γίνεται 2-3 ημέρες μετά την επώαση του σωλήνα, αφού παραλάβετε ενοφθάλμισμα από το εμπλουτισμένο Θρεπτικό υλικό (βλ. καλλιέργειες εμπλουτισμού). Κατά τη μέθοδο της μετασποράς (Σχ. 3) αντί το ενοφθάλμισμα να το απλώσετε στη στερεή επιφάνεια του θρεπτικού υλικού το μεταφέρετε σε θρεπτικό υλικό ml θερμοκρασίας 45 C (λίγο πριν πήξει). Το υλικό αυτό και η ανάμειξή του με το ενοφθάλισμα γίνεται είτε κατ' ευθείαν σε τρυβλίο Petri είτε πρώτα σε δοκιμαστικούς σωλήνες και το μεταφέρετε στη συνέχεια με προσοχή και ασηπτικώς στα τρυβλία. Στη συνέχεια αφήνετε το υλικό να κρυώσει για να στερεοποιηθεί μέσα στα τρυβλία, τα οποία τοποθετείτε ανεστραμμένα μέσα στον επωαστικό θάλαμο σε θερμοκρασίες 30, 37 ή ανάλογα με την κατηγορία του μικροοργανισμού. Κατά τη στερεοποίησή του το θρεπτικό υλικό εγκλωβίζει τους μικροοργανισμούς του ενοφθαλμίσματος. Οι αποκίες που σχηματίζονται μετά τον πολλαπλασιασμό τους είναι ορατές μετά 2-3 ημέρες. Τα κυριότερα μειονεκτήματα αυτής της μεθόδου είναι ότι αναπτύσσονται πολλές αποικίες στον πυθμένα και τη μάζα του θρεπτικού υλικού. Έτσι δεν είναι εύκολη η παρατήρηση των μορφολογικών χαρακτηριστικών των αποικιών. 21

22 Είναι όμως δυνατόν να γίνουν αρχικές αραιώσεις 1/10, 1/000 κ.ο.κ. και έτσι οι αποικίες είναι πιο ευδιάκριτες όσο οι αραιώσεις είναι μεγαλύτερες. Ιδιαίτερη προσοχή χρειάζεται στη θερμοκρασία του θρεπτικού υλικού που Θα πρέπει να ρυθμίζεται με υδρόλουτρο στους 45 C. Σε χαμηλότερη θερμοκρασία το θρεπτικό υλικό πήζει, ενώ σε μεγαλύτερες θερμοκρασίες φονεύονται οι βλαστικές μορφές των μικροοργανισμών. Επίσης θα πρέπει να σκουπίζετε προσεκτικά τους σωλήνες που παίρνετε από το υδρόλουτρο γιατί υπάρχει περίπτωση σταγόνες νερού από το σωλήνα να πέσουν στο τρυβλίο. Αυτές οι σταγόνες συνήθως είναι σοβαρά μολυσμένες. 22

23 23

24 ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΣΕ ΓΑΛΑ ΚΑΙ ΝΕΡΟ 24

25 Συχνά είναι αναγκαίος ο υπολογισμός ενός μικροβιακού πληθυσμού. Υπάρχουν διάφορες τεχνικός από τις οποίες επιλέγεται και εφαρμόζεται εκείνη που κάθε φορά ανταποκρίνεται καλύτερα στην κάθε περίπτωση. Με τον όρο πληθυσμό εννοούμε το σύνολο των μικροοργανισμών δηλαδή βακτηρίων, ζυμών ή μυκήτων που μπορεί να υπάρχουν ή να αναπτυχθούν σε ένα υπόστρωμα. Για την εφαρμογή μιας οποιασδήποτε τεχνικής, είναι απαραίτητα ο μικροβιακός πληθυσμός να βρίσκεται υπό μορφή εναιωρήματος σε υγρό μέσον διασποράς (θρεπτικό υλικά ή νερό). ΑΜΕΣΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΜΕΤΡΗΣΗ Κατά τη μέθοδο αυτή μια μικρή ποσότητα εναιωρήματος μικροοργανισμών εξετάζεται στο μικροσκόπιο και μετρώνται τα κύτταρα που υπάρχουν σ' ορισμένο όγκο εναιωρήματος. Γι αυτό το σκοπό χρησιμοποιούνται ειδικός αντικειμενοφόροι πλάκες που ονομάζονται αιματοκυτόμετρα ή Ρetrοff-Hausser cοunting chambers. Σ' αυτές τις πλάκες η επιφάνεια όπου τοποθετείται το εναιώρημα είναι χαμηλότερη από την υπόλοιπη επιφάνεια της πλάκας έτσι ώστε όταν τοποθετείται η καλυπτρίδα να σχηματίζεται ένα λεπτό στρώμα εναιωρήματος ορισμένου πάχους. Στα σημεία όπου τοποθετείται η σταγόνα του εναιωρήματος υπάρχουν χαραγμένες πάνω στην πλάκα γραμμές παράλληλες και κάθετες μεταξύ τους, σε απόλυτα ακριβείς αποστάσεις, που σχηματίζουν τετραγωνίδια ορισμένης έκτασης. Κάθε αιματοκυτόμετρο έχει σημειωμένο από τον κατασκευαστή το βάθος και την έκταση κάθε τετραγωνιδίου. 'Οταν λοιπόν μετρηθεί ένας αριθμός α κυττάρων ανά τετραγωνίδιο μπορεί να υπολογιστεί ο τελικός αριθμός στην ποσότητα του εναιωρήματος και από εκεί στο αρχικό διάλυμα. Η τεχνική αυτή παρουσιάζει το μειονέκτημα ότι μετρώνται και νεκρά κύτταρα με αποτέλεσμα να γίνεται υπερεκτίμηση του πληθυσμού. Επίσης είναι δύσκολο να μετρηθούν πληθυσμοί βακτηρίων διότι α) πολλές φορές κινούνται και β) πολλές φορές η εστιακή απόσταση του ελαιοκαταδυτικού φακού είναι μικρή και δεν επιτρέπει την εστίαση και την ταυτόχρονη παρατήρηση c' όλο το βάθος του εναιωρήματος. ΜΕΘΟΔΟΣ ΑΡΙΘΜΗΣΗΣ ΑΠΟΙΚΙΩΝ Η μέθοδος αρίθμησης των αποικιών είναι μια προσαρμογή του τρόπου καλλιέργειας δια μετασποράς. Ξεκινάνε και οι δύο από την ίδια αρχή, ότι δηλαδή από ένα μικροβιακό κύτταρο αναπτύσσεται μία και μόνο αποικία και συνεπώς η μέτρηση των αποικιών δίνει τον αριθμό των μικροοργανισμών απ' όπου προήλθαν. 25

26 Από το αρχικό διάλυμα γίνονται διαδοχικές αραιώσεις 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 κ.λπ. Από την κάθε αραίωση 1 ml μεταφέρεται στο τρυβλίο σύμφωνα με τους τρόπους που έχουν περιγραφεί στις καλλιέργειες μετασποράς. Μετά την επώαση των τρυβλίων για 2-3 ημέρες--αναπτύσσονται αποικίες που στις μικρές αραιώσεις είναι πιο πυκνές και δυσδιάκριτες ενώ στις μεγαλύτερες αραιώνουν. Η μέτρηση των αποικιών γίνεται σε μια αραίωση τέτοια ώστε να υπάρχουν αποικίες ανά τρυβλίο (Ø 9 cm) και στη συνέχεια ανάγεται ο αριθμός των μικροοργανισμών στο αρχικό διάλυμα. π.χ. Αν οι αποικίες είναι α στην αραίωση 10-4, τότε στο αρχικό διάλυμα η συγκέντρωση των μικροοργανισμών είναι α 10 4 /ml Το πλεονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι ότι μετρώνται μόνο ζώντες μικροοργανισμοί και το μειονέκτημά της ότι όταν πρέπει να μετρηθεί μικτός πληθυσμός δεν υπάρχει θρεπτικό υλικό κατάλληλο για όλους τους μικροοργανισμούς. Έτσι μερικοί δεν αναπτύσσονται και δεν δίνουν αποικίες. Επίσης υπάρχουν μικροοργανισμοί που εμποδίζεται η ανάπτυξή τους από άλλους και δεν σχηματίζονται αποικίες τους. Υπάρχει λοιπόν η πιθανότητα το αποτέλεσμα της καταμέτρησης που πληθυσμού να είναι μικρότερο από το πραγματικό. ΤΕΧΝΙΚΗ ΤΟΥ ΠΙΘΑΝΟΤΕΡΟΥ ΑΡΙΘΜΟΥ Ή ΤΟΥ MC GRADY Αρχή της μεθόδου Αυτή η τεχνική συνίσταται στην προετοιμασία αραιώσεων 10-1, 10-2, 10-3 κ.λπ. από το διάλυμα του οποίου θέλουμε να γνωρίζουμε τον αριθμό των ζώντων μικροοργανισμών και στον εμβολιασμό ίδιου όγκου από αυτές τις αραιώσεις σε μια σειρά δοκιμαστικών σωλήνων. Ανάλογα με τον αριθμό των σωλήνων για κάθε περίπτωση, που θόλωσε, αφού πρώτα γίνει επώαση, μπορούμε τη μέθοδο των πιθανοτήτων να βρούμε τον αριθμό των μικροοργανισμών στο αρχικό διάλυμα. Ο υπολογισμός αυτός διευκολύνεται από τους Πίνακες του McGrady. Για κάθε αραίωση χρησιμοποιούνται 2 δοκιμαστικοί σωλήνες. Τεχνική των 2 δοκιμαστικών σωλήνων για κάθε αραίωση οι οποίοι εμβολιάζονται με 1 ml από το αρχικό διάλυμα. Παράδειγμα: Μετά την επώαση Αραιώσεις Αριθμός σωλήνων που θολώνουν

27 Θα πρέπει στη συνέχεια να καθορίσουμε το χαρακτηριστικό αριθμό των 3 ψηφίων ο οποίος με τη βοήθεια των πινάκων, θα μας δώσει το αποτέλεσμα. Η τελευταία αραίωση κατά την οποία όλοι οι δοκιμαστικοί σωλήνες θόλωσαν είναι η 10-1 : 2 θα είναι το πρώτο ψηφίο του αριθμού που ψάχνουμε, τα 2 επόμενα ψηφία θα είναι αυτά των 2 αραιώσεων που ακολουθούν την αραίωση 10-1 δηλαδή 1 και 1. 'Αρα ο χαρακτηριστικός αριθμός είναι 211. Ανατρέχουμε ύστερα στους πίνακες και βλέπουμε ότι στον αριθμό 211 αντιστοιχεί ο αριθμός 13. Αυτό σημαίνει ότι σε 1 ml της αραίωσης 10-1 ο πιθανότερος αριθμός μικροοργανισμών είναι 13. `Αρα το αρχικό διάλυμα περιέχει 13x10 = 130 μικροοργ./mι. 27

28 Περίπτωση 1 Μετά την τελευταία αραίωση όπου θόλωσαν και οι 2 δοκιμ. σωλήνες υπάρχουν 3 ψηφία ο αριθμός 211 δεν υπάρχει στους πίνακες. Για να έχουμε το χαρακτηριστικό αριθμό προσθέτουμε το τελευταίο ψηφίο του αριθμού σ' αυτόν που προηγείται οπότε ο χαρακτηριστικός αριθμός γίνεται 212. Στον πίνακα ο 212 αντιστοιχεί σε 20 άρα: Το αρχικό διάλυμα/εναιώρημα περιέχει 20 x10=200 μικροοργ./ml. Περίπτωση 2 Εάν μετά την επώαση θολώσει μόνο ο ένας σωλήνας από τους 2 του αρχικού διαλύματος Σ αυτή την περίπτωση ο χαρακτηριστικός αριθμός σχηματίζεται από τα 3 πρώτα ψηφία και αναφέρεται στο αρχικά διάλυμα οπότε: 110 αντιστοιχεί σε 2 μικροοργ./ml αρχικού διαλύματος. Αριθμός σωλ.+για κάθε 3 διαδοχικές αραιώσεις Αριθμός μικροβίων Παράδειγμα 1: Αν δύο σωλήνες είναι θολοί στην αραίωση 1/10, δύο σωλήνες θολοί στην αραίωση 1/100, κανένας σωλήνας Θολός στην 1/1000. Ω χαρακτηριστικός αριθμός είναι 220. Στον πίνακα το 220 αντιστοιχεί στο 25. 'Αρα 25 μικρόβια στην αραίωση 1/10. Το αρχικό διάλυμα 250 μικρ./ml Παράδειγμα 2: Αν όλοι οι σωλήνες είναι θετικοί, τότε χρησιμοποιείτε τις 3 τελευταίες αραιώσεις από τις οποίες θεωρείτε ότι η τρίτη είναι 0. 'Ετσι έχουμε: 2 σωλήνες + στην αραίωση σωλήνες + στην αραίωση σωλήνες + στην αραίωση 10-4 Ο χαρακτηριστικός αριθμός είναι 220 ο οποίος στον πίνακα αντιστοιχεί σε 25 μικροοργανισμούς για την αραίωση 10-2 έτσι το αρχικό προϊόν περιέχει το λιγότερο μικροοργ./mι. 28

29 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΣΥΝΟΛΙΚΟΥ ΑΡΙΘΜΟΥ Μ/Ο ΣΤΟ ΓΑΛΑ ΣΚΟΠΟΣ Πολύ μεγάλος αριθμός Μ/Ο σένα προϊόν δείχνει ότι το συγκεκριμένο προϊόν είναι υποβαθμισμένης ποιότητος. Εξαίρεση αποτελούν τρόφιμα που φτιάχνονται από Μ/Ο όπου σ αυτή τη περίπτωση είναι επιθυμητό να περιέχουν μεγάλο αριθμό Μ/Ο π.χ. ορισμένα τυριά, γιαούρτι, κρασί κτλ. Επομένως Γάλα αποστειρωμένο Γάλα παστεριωμένο Γάλα νωπό καλής ποιότητος 0 Μ/Ο πολύ μικρό αριθμό Μ/Ο μέχρι / ml ανάλογα με την ημερομηνία λήξης. ΠΩΣ ΕΠΙΤΥΓΧΑΝΕΤΑΙ Ο ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ Οι Μ/Ο δεν είναι ορατοί με γυμνό οφθαλμό επομένως εκτός από το ότι θα πρέπει να τους απομονώσουμε από το γάλα Θα πρέπει να τους κάνουμε να φαίνονται για να μπορούμε να τους καταμετρήσουμε. Χρησιμοποιούμε λοιπόν ένα στερεό θρεπτικό υλικό που περιέχει τα απαραίτητα συστατικά για την ανάπτυξη των Μ/Ο. Στη πραγματικότητα αναπαράγουμε στο εργαστήριο αυτό που από μόνο του γίνεται στη φύση. Βάζουμε λοιπόν μια μικρή ποσότητα ( 0.5 ml) από το γάλα πάνω στο θρεπτικό υλικό που περιέχεται στα τρυβλία Petri, επωάζουμε για 48 ώρες μέσα σε κλίβανο στους 37 ο C και παρατηρούμε την αύξηση που έχουν υποστεί οι Μ/Ο και τους μετράμε. Η αύξηση αυτή οφείλεται στον πολ/σμό του κάθε Μ/Ο ξεχωριστά που σχηματίζει έτσι μια αποικία μεγέθους φακής που είναι ορατή με γυμνό οφθαλμό. Άρα κάθε μία αποικία που σχηματίζεται αντιστοιχεί σε ένα μόνο Μ/Ο. ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΑ 1) Η παρουσία στο περιβάλλον Μ/Ο που μπορεί να δώσουν ψευδές αποτέλεσμα κατά τον μικροβιολογικό έλεγχο ΛΥΣΗ Εφαρμογή κανόνων ασηπτικής τεχνικής δηλαδή αποστείρωση όλων των υλικών στους 121 ο C για 15min και όλες οι εργασίες πρέπει να γίνονται μπροστά σε φλόγα οξειδωτική ώστε ούτε ο χειριστής να κινδυνεύει από τους Μ/Ο ούτε το δείγμα να επιμολύνεται από τον χειριστή. 29

30 2) Η ανομοιογενής κατανομή των Μ/Ο στο γάλα όπου βρίσκονται υπό μορφή εναιωρήματος και όχι διαλύματος. ΛΥΣΗ Πολύ καλή ανάδευση πριν την εφαρμογή της μεθόδου. 3) Πιθανόν το δείγμα να περιέχει μεγάλο αριθμό Μ/Ο οπότε εάν εμβολιάσουμε ποσότητα 0.5 ml από γάλα που περιέχει /ml έστω κι αν το γάλα είναι καλής ποιότητος οι αποικίες που θα σχηματιστούν θα είναι αδύνατον να καταμετρηθούν μιας και η διάμετρος του τρυβλίου που περιέχει το θρεπτικό υλικό είναι 9 cm (θα σχηματιστεί μία βλέννα) ΛΥΣΗ Διαδοχικές αραιώσεις( σύμφωνα με τη μέθοδο των αποικιών) και εμβολιασμός από κάθε αραίωση ξεχωριστά σε τρυβλία έτσι ώστε οι αποικίες να είναι διακριτές η μία από την άλλη. Επιλέγουμε τρυβλία που μετράμε από 20 έως 200 αποικίες (μετά την επώαση και ανεξάρτητα από ποια αραίωση προέκυψαν) και υπολογίζουμε τον αριθμό των Μ/Ο στο αρχικό δείγμα ως εξής (Αριθμός αποικιών στο τρυβλιο που προήλθαν από συγκεκριμένο όγκο εμβολίου) x (την αραίωση) Εάν το εμβόλιο είναι 0.5 ml τότε θα πρέπει να πολ/σουμε και επί 2 για να εκφράσουμε το αποτέλεσμα σε Μ/Ο /ml γάλακτος. 30

31 ΑΣΚΗΣΗ ΕΛΕΓΧΟΥ ΝΕΡΟΥ Το πόσιμο νερό προέρχεται κυρίως από επιφανειακές πηγές, όπως λίμνες, ποτάμια ή από βαθύτερα γήινα στρώματα, πηγάδια ή πηγές. Στην Ευρωπαϊκή και Αγγλική Φαρμακοποιία ο όρος νερό αναφέρεται στο καθαρό νερό. Το πόσιμο νερό και το νερό που τροφοδοτεί τις βιομηχανίες Τροφίμων πρέπει να μην περιέχει μικροοργανισμούς που μπορούν να προκαλέσουν αλλοιώσεις στα τρόφιμα ή ασθένειες και δηλητηριάσεις στην άνθρωπο. Ασθένειες όπως αμοιβαδώσεις, βακτηριακές ή ιογενείς δυσεντερείες, σαλμονέλλωση, συγγέλωση, τύφος, χολέρα, μολυσματική ηπατίτιδα μπορεί να μεταδοθούν στον άνθρωπο μέσω του νερού. Οι επικίνδυνοι μικροοργανισμοί στο νερό προέρχονται κυρίως από τον γαστρεντερικό σωλήνα του ανθρώπου και ορισμένων ζώων και μολύνουν το νερό όταν αυτό έρχεται σε παροδική ή μόνιμη επαφή με βοθρολύματα ή χώματα. Στον εντερικό σωλήνα εκτός από παθογόνοι μικροοργανισμοί υπάρχουν και μικροοργανισμοί πού συμβιώνουν με τον ξενιστή και αποτελούν την εντερική χλωρίδα. Επειδή η απομόνωση παθογόνων μικροοργανισμών από το νερό είναι αρκετά δύσκολη, οι έλεγχοι ρουτίνας στο νερό αφορούν στον έλεγχο εντερικών μικροοργανισμών που απομονώνονται πιο εύκολα. Αυτοί οι μικροοργανισμοί καλούνται δείκτες ΜΟ/Δ. Δείκτες μικροοργανισμοί για το νερό είναι τα κολοβακτηριοειδή και οι κοπρανώδεις στρεπτόκοκκοι. Ακόμη και ένα κολοβακτηριοειδές σε 100ml νερού μπορεί εύκολα να προσδιορισθεί. Ορισμένα γένη που ανήκουν στα κολοβακτηριοειδή Escherichia coli Enterobacter spp Hafnia spp Serratia spp Citrobacter spp Erwinia spp Ορισμένα είδη που ανήκουν στους κοπρανώδεις στρεπτόκοκκους Streptococcous faecalis Str. aνιum Str. bοvis Τα κολοβακτηριοειδή είναι μικροί Gram - βάκιλλοι μη σποριογόνοι πού ζυμώνουν την λακτόζη παράγοντας οξύ και αέριο σε 48 ώρες στον ς C. Το κολοβακτηρίδιο E.coli είναι ΜΟ/Δ για αναλύσεις νερού η δε παρουσία της κάνει πιθανή και την ύπαρξη άλλων παθογόνων μιικροοργανισμών εντερικής προέλευσης. Επειδή η Ε.cοli βρίσκεται και αλλού στη φύση μόνο όταν απομονώνεται από το νερό μιλάμε για κοπρανώδη επιμόλυνση και μόνο μερικά στελέχη της είναι παθογόνα προκαλώντας μολύνσεις του ουροποιητικού συστήματος ή γαστρεντερίτιδες. Το νερό των βιομηχανιών Τροφίμων πρέπει να ελέγχεται και για άλλους μικροοργανισμούς δείκτες όπως για Str. Faecalis, Clοstridium perfringers (μικροοργανισμός που τα ανθεκτικά του σπόρια στο νερό 31

32 αντέχουν ακόμη και σε κανονική χλωρίωση 0,2-1ppm) επειδή oι μικροοργανισμοί αυτοί αλλοιώνουν τα τρόφιμα σε κανονικές συνθήκες. Έλεγχοι στο νερό των βιομηχανιών Τροφίμων πρέπει να γίνονται και για την ύπαρξη Pseudomonas spp, Flavobacterium spp και Alcaligens μικροοργανισμοί ψυχρόφιλοι που επιβιώνουν σε συνθήκες ψύξης και μολύνουν κατεψυγμένα τρόφιμα κατά την απόψυξη. Σημαντικό κριτήριο για την υγιεινή κατάσταση του νερού είναι ο αριθμός κολοβακτηριοειδών σε συνάρτηση με τον τρόπο διανομής. Σε χωριά με λίγα σπίτια, η επαναλαμβανόμενη παρουσία 10 αποικιών Ε.cοli/100ml, είναι ένδειξη ακατάλληλου νερού. Αν το νερό προέρχεται από πηγές μέσω και δεν χλωριώνεται, η εύρεση 3 αποικιών E.coli/100ml δείγματος σε αραιά δ/ματα αναλύσεων είναι αποδεκτή. Σε χλωριωμένο όμως νερό η εμφάνιση έστω και μιας αποικίας Ε.cοli/100ml είναι απαγορευτική και μόνο στην περίπτωση που το 95% των δειγμάτων του ήταν αρνητικό σε Ε.cοli/100ml θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί. Στις πόλεις το νερό χλωριώνεται, σε μικρά όμως μέρη ύποπτο νερό θα πρέπει να βράζεται τουλάχιστον για 3 λεπτά και να ψύχεται. Κατά το πρώτο στάδιο ανάλυσης του νερού στο εργαστήριο με τη μέθοδο των πολλαπλών σωλήνων χρησιμοποιείται το εκλεκτικό θρεπτικό υλικό MacConkey Broth (ζωμός) το οποίο περιέχει πεπτόνη σαν πηγή αζώτου, χολικά άλατα που αποτρέπουν την ανάπτυξη των Gram + βακτηρίων και λακτόζη σαν υπόστρωμα για ζύμωση που οδηγεί στην παραγωγή οξέος και αερίου. Το αέριο συλλαμβάνεται στα σωληνάκια Durham και το οξύ φαίνεται με την αλλαγή χρώματος αφού περιέχεται δείκτης για pη. Τα θετικά δείγματα ή ύποπτα θετικά (ζύμωση λακτόζης ) δείχνουν μη πόσιμο νερό. Επειδή όμως και άλλοι μικροοργανισμοί που δεν είναι κοπρανώδους προέλευσης π.χ. το βακτήριο Αcrobacterium θα μπορούσαν να δώσουν θετικά δείγματα (ζύμωσης λακτόζης) η ανάλυση πρέπει να προχωρήσει και σε δεύτερο στάδιο πιστοποίησης της E.Coli. Με τη μέθοδο πολλαπλών σωλήνων εξάγουμε συμπεράσματα και για τον πιθανό αριθμό των κολοβακτηρίων/100ml νερού σύμφωνα με τον πίνακα (1). Βέβαια στον προσδιορισμό τον πιθανού αριθμού υπάρχει οπωσδήποτε σφάλμα γιατί οι πίνακες εξαγωγής στηρίζονται στην αποδοχή ότι οι μικροοργανισμοί κατανέμονται ομοιογενώς στο δείγμα. Έτσι η μέθοδος δεν είναι ακριβής για μεγάλες αραιώσεις. Στο νερό συγκεκριμένα, ο μικρός όγκος του εξεταζομένου δείγματος μπορεί να δώσει εσφαλμένα αποτελέσματα. Στο δεύτερο στάδιο ανάλυσης χρησιμοποιείται στερεό εκλεκτικό θρεπτικό υλικό το Eosine methylene blue για να αναπτυχθούν οι αποικίες του χαρακτηριστικού ΜΟ/Δ Ε.coli για κοπρανώδη μόλυνση του νερού. Αυτό το εκλεκτικό θρεπτικό υλικό χρησιμοποιείται γιατί: 32

33 α) Επιτρέπει μόνο την ανάπτυξη των Gram - βακτηρίων αναστέλλοντας την ανάπτυξη των Gram + β) Διαφοροποιεί την εμφάνιση των αποικιών μικροοργανισμών που ζυμώνουν την λακτόζη και αυτών που δεν είναι ζυμώτες. γ) Πιστοποιεί την εμφάνιση των αποικιών της Ε.coli: δίνοντάς τούς μία μπλέμαύρη χρώση με μεταλλική πράσινη λάμψη. Η χρώση αυτή οφείλεται στην καθίζηση των χρωστικών του εκλεκτικού θρεπτικού υλικό. Λόγω της παραγωγής οξέος από τούς μικροοργανισμούς στο σημείο ανάπτυξης και δημιουργίας συμπλόκου με τις χρωστικές. Άλλα κολοβακτηριοειδή όπως ο Enterobacter aerogens στο ίδιο εκλεκτικό θρεπτικό υλικό, αν υπάρχουν, εμφανίζονται με παχιές βλεννώδεις ροζ αποικίες (ο Enterobacter είναι βακτήριο που σχηματίζει εξωτερικά βλεννώδη κάψα). Αντίθετα εντεροβακτήρια που δεν ζυμώνουν την λακτόζη, αν υπάρχουν, εμφανίζονται με διαφανείς αποικίες που λόγω διαφάνειας παίρνουν το μωβ χρώμα του θρεπτικού μέσου. Στο τρίτο στάδιο της διαδικασίας ανάλυσης επιβεβαιώνεται για άλλη μια φορά η ανάπτυξη αποικιών Ε. coli από τις ήδη εμφανισμένες στο εκλεκτικό θρεπτικό υλικό Eosine methylene blue και στο τέλος γίνεται και μία χρώση κατά Gram. Βιβλιογραφία 1. Μicrobiology a Laboratory Μanual, by James G. Capuccino and Natalie Sherman 3d Ε Microbiology Methods, by Ch Collins and Patricia MLyne, 3d Ε Α Modern Introduction to Food Microbiology, by R.G. Board Μικροβιολογία τον Υδάτινου Περιβάλλοντος, των Μ. Παπαπετροπούλου, Α. Μαυρίκου. 33

34 Table 1. MPN determination from multiple-tube test Number of tubes giving positive reaction out of MPN index 95% confidence limits 3 of 10 ml each 3 of 1 ml each 3 of 0.1 ml each per 100ml Lower Upper < < < From: Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 14 th edition, American Public Health Association, American Water Works Association, Water Pollution Control Federation, Washington D.C

35 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. F.Forestier (1980). Τraνaux Pratiques de Μicrobiologie. Τechnique de Base. Faculte de Sciences Pharmaceutiqυes de Biologiques, Uniνersite Paris Sud (ΧI). 2. L.Beishir (1991). ΜicrobIοlogy in Ρracticee. Harper Collins Publishers (Fifth edition) 3. J.G.Cappucino and Ν.Sherman (1992). Μicrobiology A Labοratοry Μanual. Rochland Commurιity Cοllege, Suffern, Νew York. The Benjamin/Cummings Pubishing Company (Third edition). 4. FZ.Atlas (1988). Μicrobiology,Fυndamentals and Applications. ΜacΜillan Ρublishing Cοmpany, Νew York (2nd edition). 5. C.N.Cοllins, Ρ.Μ.Ryne, J.Μ.Οrange (1989). ΜicrοbiοlοgicαΙ Μethods. Butterworths (Sixth edition). 6. L.Βeuchat (1987). Food and Βeverage Μycology. Α.V.I Βοοk (2nd edition). 7. W.Frajier and D.C.Westhoff (1988). Food ΜicrοbiοΙοgy. ΜcGraw-ΗiΙΙ lnternational Editions (4th edition). 8. Cl.Μoreau (1974). Μoίsissures toxiques dans l Alimentation. Μasson et Cie Editeurs (Deuxieme editon). 9. G.J.Banwarf (1989). Basic Food Μicrobiology. Α.V.I..Βοοk (Second editiοn). 10. Εμμ.Βουδούρης (1980). Τεχνολογία Τροφίμων. Ιωάννινα (2η έκδοση). 35

36 ΑΝΑΓΝΩΡΙΣΗ ΜΥΚΗΤΩΝ ΑΦΛΑΤΟΞΙΝΟΓΟΝΟΙ ΜΥΚΗΤΕΣ Αρχικά η παρουσία των πιθανών τοξιγενών μυκήτων, δεν είναι εγγύηση και για την παραγωγή τοξινών. Οι φυσιολογικές-θρεπτικές απαιτήσεις για την παραγωγή τοξινών είναι γενικά πολύ ειδικές και συγκεκριμένες σε σχέση με τις απαιτήσεις ανάπτυξης των μυκήτων αυτών. Για πολλά πιθανά γένη τοξινογενών μυκήτων, δεν είναι όλα τα είδη τους ικανά προς παραγωγή τοξινών. Μεταξύ διαφόρων μυκοτοξίνων, οι αφλατοξίνες θεωρούνται σημαντικές εξ αιτίας των βλαβερών επιδράσεών τους στο ανθρώπινο είδος, τα πουλερικά και τα κατοικίδια. Για πρώτη φορά η αφλατοξίνη επισημάνθηκε και αναγνωρίστηκε το 1960, με το ξέσπασμα της ασθένειας "Turkey 'X' Disease", στην Βρετανία. Αιτία της ασθένειας αυτής, η οποία έπληξε χιλιάδες γαλοπούλες ήταν οι τοξίνες που παράχθηκαν από το μύκητα Aspergillus flavus και έτσι ονομάστηκαν αφλατοξίνες. Οι αφλατοξίνες είναι ισχυρά τοξικές, καρκινογόνες, κατασταλτικές του ανοσοποιητικού συστήματος, παραγόμενες ως δευτερογενείς μεταβολίτες από τους μύκητες Aspergillus flavus και A. parasiticus, σε ποικιλία τροφίμων. Μεταξύ των 18 διαφορετικών τύπων αφλατοξίνης, οι πιο σημαντικοί είναι οι αφλατοξίνες Β 1, Β 2, G 1 και G 2. Η αφλατοξίνη Β 1 (AFB 1 ) κυριαρχεί σε μεγάλο ποσό οργανισμών καθώς και σε τρόφιμα. Η καθαρή AFB 1 έχει μπεζ προς κίτρινη χρώση, είναι κρυσταλλική, άοσμη και στερεή. Οι αφλατοξίνες είναι διαλυτές στη μεθανόλη, στο χλωροφόρμιο, στην ακετόνη και στο ακετονιτρίλιο. Αφλατοξίνη Β 1, aflatoxin B 1 Οι κύριοι αφλατοξινογόνοι μύκητες είναι τα είδη A. flavus ο οποίος παράγει AFB 1 και AFB 2, ενώ ο A. parasiticus (A. nomius) παράγει AFG 1 και AFG 2 καθώς και AFB 1 και AFB 2. 36