ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «Πληροφορική Επιστημών Ζωής» Κατεύθυνση : Βιοπληροφορικής ΔΙΑΤΡΙΒΗ Για την απόκτηση ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ Μοριακή μοντελοποίηση και διαμορφωτική ανάλυση της δομής της πρωτεΐνης MuSK (Muscle specific kinase) ΧΑΙΝΤΙΝΗΣ ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ ΜΗΧΑΝΙΚΟΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΚΗΣ ΚΑΙ ΤΗΛΕΠΙΚΟΙΝΩΝΙΩΝ ΠΑΤΡΑ 2012

2

3 Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή 1. Αναπληρωτής Καθηγητής Γεώργιος Α. Σπυρούλιας (επιβλέπων) Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών. 2. Καθηγητής Αθανάσιος Τσακαλίδης Τμήμα Μηχανικών Ηλεκτρονικών Υπολογιστών και Πληροφορικής Πανεπιστήμιο Πατρών. 3. Επίκουρος Καθηγητής Κωνσταντίνος Πουλάς Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών. iii

4

5 Ευχαριστίες Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στα πλαίσια του διατμηματικού προγράμματος μεταπτυχιακών σπουδών πληροφορική επιστημών ζωής. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλέποντα, τον αναπληρωτή Καθηγητή κ. Γεώργιο Σπυρούλια για την αμέριστη υποστήριξη και βοήθεια που μου προσέφερε καθόλη τη διάρκεια της εκπόνησης της διπλωματικής μου εργασίας και για την διαρκή και σχολαστική παρακολούθηση της προόδου του ερευνητικού θέματος. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τα μέλη της τριμελής επιτροπής τον Καθηγητή κ. Αθανάσιο Τσακαλίδη και τον Επίκουρο Καθηγητή Κωνσταντίνο Πουλά για τις πολύτιμες συμβουλές τους, την καθοδήγηση τους σε ερευνητικά και μη θέματα και την συμπαράστασή τους στις όποιες δυσκολίες εμφανίστηκαν κατά την διάρκεια εκπόνησης της διπλωματικής εργασίας. Δεν θα μπορούσα να μην ευχαριστήσω τον μεταπτυχιακό φοιτητή Νικόλαο Δημητρόπουλο και τον υποψήφιο διδάκτορα Γεώργιο Δάλκα για την μετάδοση των γνώσεών τους και τις συμβουλές τους στην χρήση των τεχνολογιών που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διπλωματική εργασία. Τέλος ευχαριστώ θερμά την οικογένεια μου και τους φίλους μου για την ηθική συμπαράσταση που μου προσέφεραν όλο αυτό το διάστημα. v

6

7 Πίνακας περιεχομένων Περίληψη... x Abstract... x Θεωρητικό Μέρος... 1 Α.1. Η Νευρομυϊκή Σύναψη... 3 Α.1.1. Προσυναπτική περιοχή... 4 Α.1.2. Συναπτική σχισμή... 5 Α.1.3. Μετασυναπτική επιφάνεια... 6 Α.2. Ο υποδοχέας ακετυλοχολίνης (AchR)... 8 Α.3. Muscle Specific Kinase Α.3.1. Γενικά Α.3.2 Αγκρίνη Α.3.3 Lrp4 και Dok Α.3.4. Πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην λειτουργία και τα σηματοδοτικά μονοπάτια της MuSK Υπολογιστικές μέθοδοι και τεχνικές... 2 Β.1. Πρόβλεψη και Προσομοίωση Δομών Πρωτεϊνών Β.2 Προσομοίωση μέσω Ομολογίας Β.2.1. Πρόβλεψη δομής με το λογισμικό MODELLER Β.2.2. Πρόβλεψη δομής με τη χρήση του διακομιστή Swiss Model Β.3 Προσομοιώσεις Μοριακής Δυναμικής Βιομορίων Β.3.1. Γενικά Β.3.2. Αρχές Στατιστικής Μηχανικής Β.3.3 Κλασσική Μηχανική Β.3.4. Πεδίο δυνάμεων Β.3.5. Προσομοίωση παρουσία διαλύτη Β.3.6 Προετοιμασία και εκτέλεση προσομοιώσεων Μοριακής Δυναμικής vii

8 Γ. Σκοπός Εργασίας Ενότητα Δ - Πειραματικό μέρος Μοντελοποίηση μέσω ομολογίας Δ.1 Δημιουργία μοντέλου Δ.1.1. Γενικά Δ.1.2. Μεθοδολογίες συγκριτικής προσομοίωσης Δ.1.3 Μοντέλο περιοχής Ig1 Ig Δ Μοντέλο περιοχής Ig Δ Μοντέλο περιοχής CRD Δ Μοντέλο συνδετικής περιοχής (linker) Δ.1.4. Αποτίμηση ορθότητας αποτελεσμάτων Δ.1.5. Συναρμολόγηση τελικού μοντέλου Δ.1.6. Αποτελέσματα Procheck για Ig1-Ig2 περιοχές Δ Αποτελέσματα Procheck για την Ig3 περιοχή Δ Αποτελέσματα Procheck για την CRD περιοχή Δ Αποτελέσματα Procheck της τελικής δομής της MuSK Ενότητα Ε -Πειραματικό μέρος Προσομοιώσεις Μοριακής δυναμικής Ε.1 Προετοιμασία Μοντέλου για προσομοιώσεις Μοριακής Δυναμικής Ε.1.2. Προσομοιώσεις Μοριακής Δυναμικής Ενότητα ΣΤ Αποτελέσματα-Συζήτηση ΣΤ. Αποτελέσματα - συζήτηση ΣΤ1.1. Η περιοχή CRD ΣΤ.1.2 Περιοχές Ig Συμπεράσματα Ενότητα Ζ viii

9 Βιβλιογραφία Παράρτημα ix

10 Περίληψη Η πρωτείνη MuSK (Muscle Specific Kinase) αποτελεί μέρος ενός συμπλόκου υποδοχέων της αγκρίνης (agrin) οι οποίοι διεγείρουν την φωσφορυλίωση της τυροσίνης και οδηγούν στην ομαδοποίηση των υποδοχέων ακετυλοχολίνης (AChRs) στην μετασυναπτική μεμβράνη της νευρομυϊκής σύναψης των σπονδυλωτών οργανισμών. Μεταλλάξεις της MuSK είναι υπεύθυνες για ασθένειες και δυσλειτουργίες της νευρομυϊκής σύναψης, όπως το εκ γενετής μυασθενικό σύνδρομο. Τα τελευταία χρόνια το ενδιαφέρον για την πρωτεΐνη MuSK έχει αυξηθεί, αλλά παρόλα αυτά δεν έχουν αποδειχθεί πλήρως, ούτε ο ρόλος της, ούτε η λειτουργία της,ούτε η δομής της. Χρησιμοποιώντας τεχνικές μοντελοποίησης μέσω ομολογίας και χρησιμοποιώντας ως εκμαγεία γνωστές κρυσταλλογραφικές δομές, δημιουργήθηκε το υπολογιστικό μοντέλο της ανθρώπινης MuSK. Για την μελέτη της συμπεριφοράς της πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκαν προσομοιώσεις Μοριακής Δυναμικής σε υδατικό περιβάλλον όπου εξήχθησαν συμπεράσματα για τον προσανατολισμό της δομής, τις αλληλεπιδράσεις των τμημάτων της και την συνολική συμπεριφορά του μορίου. Abstract The protein MuSK (Muscle specific Kinase) is part of an agrin receptor complex which stimulates tyrosine phosphorylation and lead to the clustering of acetylcholine receptors (AChRs) in the postsynaptic membrane of the neuromuscular junction of vertebrate organisms. MuSK mutations are responsible for diseases and disorders of the neuromuscular junction, such as congenital myasthenic syndrome. In recent years interest over MuSK protein has increased, but till now neither the role nor function, nor the structure of the protein have been fully demonstrated. Using homology modeling techniques and based on templates of known crystallographic structures, we have generated in silico the model of human MuSK. To study the behavior of the protein we used molecular dynamics simulations carried out in an aqueous environment where conclusions were reached on the orientation of the structure, interactions between the domains of the protein and the overall behavior of the molecule. x

11 Ενότητα Α Θεωρητικό Μέρος

12

13 Α.1. Η Νευρομυϊκή Σύναψη Ο σκελετικός μυς των σπονδυλωτών αποτελείται από πολυπύρηνα κύτταρα τα οποία σχηματίζουν ίνες, οι οποίες νευρώνονται από κινητικούς νευρώνες. Το κυτταρικό σώμα κάθε κινητικού νευρώνα διαθέτει έναν επιμήκη άξονα, που εισέρχεται στο μυ και διακλαδίζεται νευρώνοντας πολλές ξεχωριστές μυϊκές ίνες. Ο κινητικός νευρώνας, με τις μυϊκές ίνες που νευρώνει, αποτελεί μια λειτουργική μονάδα, που καλείται κινητική μονάδα [1]. Η κάθε κινητική μονάδα μπορεί να αποτελείται από έναν αριθμό μυϊκών ινών που ποικίλει από 5 έως 10 ενώ αρκετές φορές φτάνει μέχρι και μερικές εκατοντάδες, ανάλογα με το πόσο λεπτές ή αδρές είναι οι κινήσεις που πρέπει να εκτελεσθούν από το μυ. Οι μυϊκές ίνες μίας μονάδας είναι διασκορπισμένες σε ολόκληρο το μυ και δεν αποτελούν ένα συμπαγές σύνολο, που βρίσκεται σε ένα συγκεκριμένο σημείο του. Καθώς κάθε αξονική διακλάδωση προσεγγίζει την ίνα-στόχο της, χάνει το μυελινικό της περίβλημα και είτε διακλαδίζεται περαιτέρω είτε δημιουργείται τελική διακλάδωση μέχρι το νεύρο να φτάσει στο μυ σχηματίζοντας τη νευρομυϊκή σύναψη. Η νευρομυϊκή σύναψη είναι μια εξειδικευμένη σύναψη σχεδιασμένη να μεταδίδει ηλεκτρικές ώσεις από τη νευρική απόληξη στο σκελετικό μυ μέσω του χημικού διαβιβαστή ακετυλοχολίνη (ACh) και αποτελείται από 3 κύρια δομικά στοιχεία: την προσυναπτική περιοχή, που περιλαμβάνει τη νευρική απόληξη και η οποία καλύπτεται από ένα τελικό κύτταρο Schwann τη συναπτική σχισμή και τη μετασυναπτική επιφάνεια [2] (Εικόνα Α.1). Το νευρικό σύστημα αποτελείται από νευρικό ιστό. Ο νευρικός ιστός περιλαμβάνει νευρικά και νευρογλοιακά κύτταρα. Τα νευρικά κύτταρα είναι υπεύθυνα για την μετάδοση των ενεργών ώσεων (ενεργά δυναμικά) που είναι και ο κύριος ρόλος του νευρικού ιστού, ενώ τα νευρογλοιακά κύτταρα υποβοηθούν τη λειτουργία αυτή αφενός με το να προστατεύουν και να θρέφουν τα νευρικά κύτταρα και αφετέρου με το να διευκολύνουν την μετάδοση των νευρικών ώσεων. Ο βασικός εκπρόσωπος των νευρογλοιακών κυττάρων στο περιφερειακό νευρικό σύστημα είναι τα κύτταρα Schwann τα οποία συμμετέχουν σε πολλές σημαντικές διαδικασίες όπως η μετάδοση νευρικών σημάτων κατά μήκος των νευρικών αξόνων, στην νευρική ανάπτυξη και αναγέννηση, στην τροφική υποστήριξη των νευρώνων, στην ρύθμιση 3

14 της νευρομυϊκής συναπτικής δραστηριότητας και στη δημιουργία της νευρικής εξωκυτταρικής θεμέλιας ουσίας. Α.1.1. Προσυναπτική περιοχή Στη νευρομυϊκή σύναψη, 3-5 κύτταρα Schwann δημιουργούν ένα κάλυμμα σε στενή παράθεση με τη νευρική απόληξη λειτουργώντας στεγανοποιητικά έτσι ώστε οι συνάψεις να είναι πλήρως απομονωμένες από τον υπόλοιπο εξωκυττάριο χώρο. Η σημασία των κυττάρων Schwann είναι μεγάλη καθώς πέραν της συμμετοχής τους στο σχηματισμό και τη λειτουργία της νευρομυϊκής σύναψης, τροποποιούν τη συναπτική μεταβίβαση, την ανάπτυξη και συντήρηση της νευρικής απόληξης με τροφικούς παράγοντες τους οποίους συνθέτουν και εκκρίνουν όπως επίσης και της αναγέννησης του νευρικού ιστού αφού σε περίπτωση βλάβης στη νευρική απόληξη, τα κύτταρα Schwann αποκτούν φαγοκυτταρικές ιδιότητες και απομακρύνουν τα άχρηστα υπολείμματα της νευρικής απόληξης. [3] Εικόνα Α.1 Σχηματική αναπαράσταση της δομής της νευρομυϊκής σύναψης. Ένα ιδιαίτερο δομικό χαρακτηριστικό στοιχείο της νευρικής απόληξης είναι τα συναπτικά κυστίδια τα οποία εσωκλείουν τον χημικό διαβιβαστή ακετυλοχολίνη (ACh), και 4

15 όλες οι πρωτεΐνες της νευρικής απόληξης λειτουργούν με τέτοιο τρόπο ώστε έμμεσα ή άμεσα να συνεισφέρουν στην λειτουργία των κυστιδίων αυτών. Τα συναπτικά κυστίδια είναι τοποθετημένα και ευθυγραμμισμένα σε θέσεις απελευθέρωσης που καλούνται ενεργές ζώνες, όπου οι δίαυλοι ασβεστίου διατάσσονται σε παράλληλες διπλές σειρές μαζί με μεγάλα μακρομοριακά σύμπλοκα σχεδιασμένα να επιτύχουν την απελευθέρωση των περιεχομένων των κυστιδίων [4]. Όταν ένα δυναμικό ενέργειας φτάσει στη νευρική απόληξη, οι δίαυλοι ασβεστίου ενεργοποιούνται, ασβέστιο εισέρχεται στην προσυναπτική απόληξη, με αποτέλεσμα η τοπική συγκέντρωση ασβεστίου να αυξάνεται σημαντικά προκαλώντας τη σύντηξη της μεμβράνης του συναπτικού κυστιδίου με τη μεμβράνη της νευρικής απόληξης. Α.1.2. Συναπτική σχισμή Ανάμεσα στην νευρική απόληξη και την μυϊκή κυτταροπλασματική μεμβράνη υπάρχει ένας χώρος περίπου 50 nm που ονομάζεται «συναπτική σχισμή» (Εικόνα Α.1). Η εξωκυττάρια ουσία της συναπτικής σχισμής είναι μία σύνθετη συλλογή από πρωτεΐνες οι οποίες ρυθμίζουν τη σύνθεση των μετασυναπτικών πρωτεϊνών και τη συγκέντρωση της ακετυλοχολινεστεράσης (AChE) η οποία είναι ένα ένζυμο, αποτελούμενο από ομοτετραμερή σφαιρικών καταλυτικών υπομονάδων, προσκολλημένων σε μια ουρά κολλαγόνου [4]. Είναι εμπλουτισμένη σε κολλαγόνο και περιέχει διάφορες μορφές λαμινίνης, οι οποίες συνδέονται όλες με την α-δυστρογλυκάνη στην μετασυναπτική μεμβράνη. Οι λαμινίνες σχηματίζουν ένα δίκτυο στο συναπτικό χώρο, το οποίο κατακρατεί άλλες πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας [5]. Μετά την απελευθέρωση από τα συναπτικά κυστίδια, η διάχυση της ακετυλοχολίνης κατά μήκος της σχισμής είναι ταχεία, λόγω της μικρής απόστασης που διανύει και του υψηλού ρυθμού διάχυσής της [6]. Η ακετυλοχολινεστεράση συγκεντρώνεται στη βασική στοιβάδα της μετασυναπτικής μεμβράνης και η υδρόλυση που προκαλεί στην ακετυλοχολίνη καθώς και η διάχυση της ακετυλοχολίνης έξω από την συναπτική σχισμή, οδηγεί σε ταχεία ελάττωση της συγκέντρωσης της [7]. Αυτό εμποδίζει την ενεργοποίηση του υποδοχέα ακετυλοχολίνης (AChR) περισσότερο από μία φορά, ως απάντηση στην ακετυλοχολίνη. Οι αναστολείς της ακετυλοχολινεστεράσης, όπως η πυριδοστιγμίνη και το εδροφώνιο, επιμηκύνουν τη διάρκεια της δράσης της ακετυλοχολίνης στην μετασυναπτική μεμβράνη. Σε διαταραχές της νευρομυϊκής διαβίβασης όπου η βλάβη βρίσκεται στη μετασυναπτική περιοχή, η αναστολή της ακετυλοχολινεστεράσης επαυξάνει τη δράση της ακετυλοχολίνης και επάγει την επίτευξη ενός τέτοιου δυναμικού τελικής κινητικής πλάκας, το οποίο θα οδηγήσει σε γενικευμένο 5

16 μυϊκό δυναμικό. Τα κύτταρα Schwann τα οποία περιβάλλουν την τελική νευρική απόληξη, έχει βρεθεί ότι εκκρίνουν μία πρωτεΐνη που δεσμεύει την ακετυλοχολίνη, γεγονός που μπορεί να μειώσει τη συγκέντρωση της στη συναπτική σχισμή και να διαδραματίσει ρόλο στην τροποποίηση της νευρομυϊκής διαβίβασης [8]. Α.1.3. Μετασυναπτική επιφάνεια Όταν το δυναμικό ενέργειας εισέλθει στη νευρική απόληξη, η εκπόλωση επιφέρει τη διάνοιξη των εξαρτώμενων από το δυναμικό διαύλων Ca 2+ στην προσυναπτική μεμβράνη, επιτρέποντας την εισροή ιόντων Ca 2+ (Εικόνα Α.2). Το γεγονός αυτό προκαλεί τη σύντηξη των συναπτικών κυστιδίων με την προσυναπτική μεμβράνη, ελευθερώνοντας ακετυλοχολίνη (ACh) στη συναπτική σχισμή. Τα μόρια ακετυλοχολίνης που περιέχονται σε ένα μονήρες κυστίδιο αναφέρονται ως κβάντα και ο αριθμός των κβάντων που ελευθερώνονται από μια μονήρη νευρική ώση είναι γνωστός ως κβαντικό περιεχόμενο. Αφού η ακετυλοχολίνη διασχίσει τη συναπτική σχισμή, δεσμεύεται στους υποδοχείς ακετυλοχολίνης που συγκεντρώνονται απέναντι από τις «ενεργές ζώνες» της νευρικής απόληξης. (Εικόνα Α.2) [4]. Η δέσμευση αυτή έχει ως αποτέλεσμα τη διάνοιξη του ιοντικού καναλιού των υποδοχέων ακετυλοχολίνης και την είσοδο κατιόντων, κυρίως νατρίου, μέσα στον μυ, γεγονός που έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή του δυναμικού της τελικής κινητικής πλάκας. Όταν επιτυγχάνεται μια καθορισμένη ουδός εκπόλωσης, δίαυλοι νατρίου, στον πυθμένα των μετασυναπτικών πτυχών ανοίγουν, επιτρέποντας την είσοδο περισσότερων ιόντων νατρίου με αποτέλεσμα να προκαλείται μυϊκό δυναμικό ενεργείας το οποίο εξαπλώνεται σε όλη τη μυϊκή ίνα [9]. Η μετασυναπτική επιφάνεια των σκελετικών μυών χαρακτηρίζεται από εγκολπώσεις της κυτταροπλασματικής μεμβράνης οι οποίες καλούνται δευτερογενείς συναπτικές πτυχές [10]. Αυτές οι πτυχές αυξάνουν το εμβαδόν επιφανείας της μετασυναπτικής μεμβράνης και η αρχιτεκτονική τους επιτρέπει στην εκπόλωση της τελικής κινητικής πλάκας να εστιάζει στο βάθος αυτών [11]. Οι υποδοχείς ακετυλοχολίνης συγκεντρώνεται στα ανώτερα μέρη των δευτερογενών συναπτικών πτυχών, και «αγκυροβολούν» στο σύμπλεγμα πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη δυστροφίνη, διαμέσου της ραψίνης, μίας πρωτεΐνης που συμμετέχει στην συσσώρευση των υποδοχέων ακετυλοχολίνης στην νευρομυϊκή σύναψη κατά τη διάρκεια ανάπτυξης της σύναψης [10]. Οι ομάδες των υποδοχέων ακετυλοχολίνης συνδέονται με στοιχεία του κυτταροσκελετού μέσω των συμπλεγμάτων πρωτεϊνών δυστρογλυκάνης, 6

17 σαρκογλυκάνης και της ουτροφίνης [12]. Στη συσσώρευση των υποδοχέων ακετυλοχολίνης στην περιοχή, συμβάλλει και το γεγονός ότι οι πυρήνες της μυϊκής ίνας που βρίσκονται κοντά στην νευρομυϊκή σύναψη εκφράζουν κατά προτίμηση γονίδια που κωδικοποιούν τις υπομονάδες του υποδοχέα ακετυλοχολίνης [13]. Οι δίαυλοι νατρίου εμφανίζουν υψηλή συγκέντρωση στη βάση των συναπτικών πτυχών της μετασυναπτικής μεμβράνης, αντιδρώντας με αγκυρίνη, το σύμπλεγμα σαρκογλυκάνης, το σύμπλεγμα δυστρογλυκάνης, τις δυστρομπρεβίνες (dystrobrevins) και την δυστροφίνη/ουτροφίνη [4]. Εικόνα Α.2 Δυναμικό ενέργειας εισέρχεται στην νευρική απόληξη προκαλώντας εκπόλωση και διάνοιξη των εξαρτώμενων από το δυναμικό διαύλων Ca 2+ στην προσυναπτική μεμβράνη. Ιόντα Ca 2+ εισέρχονται στο εσωτερικό της νευρικής απόληξης και προκαλούν σύντηξη των συναπτικών κυστιδίων με την προσυναπτική μεμβράνη, ελευθερώνοντας ακετυλοχολίνη (ACh) στη συναπτική σχισμή. Αφού η ακετυλοχολίνη διασχίσει τη συναπτική σχισμή, δεσμεύεται στους υποδοχείς ακετυλοχολίνης που συγκεντρώνονται απέναντι από τις «ενεργές ζώνες» της νευρικής απόληξης. Η δέσμευση προκαλεί τη διάνοιξη του ιοντικού καναλιού των 7

18 υποδοχέων ακετυλοχολίνης και την είσοδο κατιόντων, κυρίως νατρίου, μέσα στον μυ, γεγονός που έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή του δυναμικού της τελικής κινητικής πλάκας. Α.2. Ο υποδοχέας ακετυλοχολίνης (AchR) Ο υποδοχέας της ακετυλοχολίνης είναι μια διαμεμβρανική γλυκοπρωτείνη η οποία ανταποκρίνεται στην πρόσδεση της ακετυλοχολίνης, η οποία συντίθεται, αποθηκεύεται και εκκρίνεται από τους χολινεργικούς νευρώνες. Ανήκουν στην υπερ-οικογένεια των ιοντικών καναλιών που ενεργοποιούνται από την δέσμευση ενός προσδέτη (LGICs: Ligand gated ion channels). Τα ιοντικά αυτά κανάλια συγκροτούνται από πέντε ομόλογες υπομονάδες διευθετημένες περιμετρικά ενός κεντρικού πόρου, καθεμία από τις οποίες αποτελείται από μία αμινοτελική εξωκυττάρια περιοχή, από τέσσερεις διαμεμβρανικές α έλικες (M1 M4) και από μία κυτταροπλασματική περιοχή μεταξύ της M3 και M4 έλικας (Εικόνα Α.3). Ανάλογα με την τοπολογία και τα φαρμακολογικά τους χαρακτηριστικά, οι AChRs διακρίνονται σε δύο μεγάλες κατηγορίες, στους μυϊκού τύπου και στους νευρικού τύπου. Εικόνα Α.3 Απεικόνιση του υποδοχέα ακετυλοχολίνης, των υπομονάδων που τον αποτελούν και των διαμεμβρανικών ελίκων (Μ1-Μ4) που συγκροτούν κάθε υπομονάδα. Οι μυϊκού τύπου υποδοχείς ακετυλοχολίνης απαντώνται στις μετασυναπτικές μεμβράνες των νευρομυϊκών συνάψεων των σκελετικών μυών των σπονδυλωτών, καθώς και στα ηλεκτρικά όργανα ιχθύων του γένους Torpedo και Electrophorus. Αποτελείται από 5 υπομονάδες και απαντάται σε 2 ισομορφές [14] [15] [16]. Ο υποδοχέας ακετυλοχολίνης στον ενήλικα αποτελείται από δύο α-υπομονάδες και ένα αντίγραφο από κάθε μία από τις β, δ, και ε-υπομονάδες, ενώ ο εμβρυϊκός υποδοχέας ακετυλοχολίνης περιέχει μια γ αντί της ε- 8

19 υπομονάδας (Εικόνα Α.4). Μεταξύ των υπομονάδων του υποδοχέα ακετυλοχολίνης υπάρχει υψηλή ομολογία στην αλληλουχία των αμινοξέων, με κάθε μία υπομονάδα να περιέχει τέσσερις α-έλικες (M1 έως M4) οι οποίες εκτείνονται στην κυτταροπλασματική μεμβράνη. Τα εξωκυττάρια τμήματα των υπομονάδων, που αποτελούνται από τα αμινοτελικά και καρβοξυτελικά άκρα και την περιοχή μεταξύ M2 και M3, δημιουργούν ένα μεγάλο εξωκυττάριο προθάλαμο ο οποίος περιβάλλει το εξωκυττάριο στόμιο του διαύλου. Οι περιοχές μεταξύ M1 και M2 και μεταξύ M3 και M4 σχηματίζουν ένα μικρότερο προθάλαμο γύρω από το ενδοκυττάριο στόμιο του ιοντικού διαύλου [17] [18]. Ο νικοτινικός υποδοχέας ακετυλοχολίνης του σκελετικού μυός έχει μία μεγάλη εξωκυττάρια επιφάνεια που του δίνει τη δυνατότητα να σχηματίζει πολλές θέσεις πρόσδεσης για σύνδεση με αυτοαντισώματα και να διευκολύνει την ταυτόχρονη δέσμευση διαφορετικών αντισωμάτων [4]. Το σημείο σύνδεσης της ακετυλοχολίνης είναι στην εξωτερική επιφάνεια του εξωκυττάριου τμήματος του υποδοχέα ακετυλοχολίνης. Το κανάλι του υποδοχέα για να ανοίξει συνήθως απαιτεί σύνδεση με δύο μόρια ακετυλοχολίνης. Η κύρια ανοσογόνος περιοχή (ΚΑΠ) βρίσκεται στην ανώτερη εξωτερική θέση της εξωκυττάριας μοίρας του υποδοχέα ακετυλοχολίνης [19]. Κάθε υποδοχέας ακετυλοχολίνης έχει δυο κύριες ανοσογόνες περιοχές πού ευρίσκονται στην αμινοτελική απόληξη της α-υπομονάδας μεταξύ των αμινοξικών καταλοίπων 67 και 76 της α-υπομονάδας [20] [21]. Η ενδοκυττάρια περιοχή του είναι μικρή και αρνητικά φορτισμένη, έχει δε σημεία σύνδεσης για κυτταροσκελετικές και ρυθμιστικές πρωτεΐνες όπως είναι οι πρωτεϊνοκινάσες [22]. Ο υποδοχέας ακετυλοχολίνης του ενήλικα μπορεί να διαχωρισθεί από τον εμβρυϊκό υποδοχέα ακετυλοχολίνης με βάση ηλεκτροφυσιολογικά χαρακτηριστικά. Οι δίαυλοι στον ενήλικα έχουν βραχύτερους μέσους χρόνους διάνοιξης και η αγωγιμότητά τους είναι 50% μεγαλύτερη σε σχέση με τους διαύλους του εμβρύου. Οι διαφορές μεταξύ των διαύλων του υποδοχέα ακετυλοχολίνης στον ενήλικα και το έμβρυο οφείλονται στην αντικατάσταση της γ με την ε-υπομονάδα. Η φωσφορυλίωση αλλά και άλλες μορφές μεταμεταφραστικής τροποποίησης, μπορούν να μεταβάλλουν τις ιδιότητες του υποδοχέα ακετυλοχολίνης, και ιδιαίτερα η φωσφορυλίωση υπομονάδων του φαίνεται ότι ρυθμίζει την απευαισθητοποίηση η οποία επάγεται από αγωνιστές [4] [14]. Ο μυϊκού τύπου υποδοχέας ενέχεται σε πολλά κληρονομικά και επίκτητα νοσήματα, η πλειονότητα των οποίων έχει ως επακόλουθο την εξασθένηση της νευρομυϊκής διαβίβασης και κατά συνέπεια μυϊκή αδυναμία. Το επίκτητο αυτοάνοσο νόσημα βαριά μυασθένεια είναι 9

20 το πιο κοινό και καλύτερα μελετημένο, το οποίο προκαλείται από αυτοαντισώματα έναντι του υποδοχέα [20]. Εικόνα A.4 Διάταξη των υπομονάδων των υποτύπων του μυϊκού τύπου υποδοχέα ακετυλοχολίνης. Η διαφοροποίηση μεταξύ του υποδοχέα εμβρυικού τύπου με τον υποδοχέα ενήλικου τύπου είναι η αντικατάσταση της υπομονάδας γ από την υπομονάδα ε. Η δέσμευση της ακετυλοχολίνης στης θέσης πρόσδεσης του υποδοχέα προκαλεί άνοιγμα του καναλιού του υποδοχέα και εισροή ιόντων στο εσωτερικό του κυττάρου. Η περιοχή ΚΑΠ είναι το σημείο όπου κατευθύνονται τα περισσότερα αντισώματα στην κλινική και πειραματική αυτοάνοση μυασθένεια [20] [21]. Υπάρχουν επίσης μερικές σπάνιες κληρονομικές ασθένειες, γνωστές ως συγγενή μυασθενικά σύνδρομα, οι οποίες επηρεάζουν την έκκριση της ακετυλοχολίνης, τη λειτουργία της ακετυλοχολινεστεράσης, καθώς επίσης και τη λειτουργία ή τον αριθμό των υποδοχέων μυϊκού τύπου στη νευρομυϊκή σύναψη. Α.3. Muscle Specific Kinase Η ανάπτυξη της πλήρως διαφοροποιημένης νευρομυϊκής σύναψης προχωρεί με μια πολύπλοκη αλληλουχία γεγονότων, η οποία δεν είναι ακόμα πλήρως κατανοητή. Η 10

21 αλληλουχία αυτή των γεγονότων εξαρτάται από αμοιβαίες αλληλεπιδράσεις μεταξύ του κινητικού νευρώνα και του μυϊκού κυττάρου. Η διεργασία λαμβάνει χώρα σε περίοδο αρκετών εβδομάδων στα τρωκτικά και περιλαμβάνει σήματα με κατεύθυνση τόσο από το νεύρο προς το μυ, όσο και παλίνδρομα (από το μυ προς το νεύρο). Σαν υποδοχέας με δράση κινάσης της τυροσίνης, η MuSK αλληλεπιδρά με μια πληθώρα πρωτεϊνών, οι οποίες ρυθμίζουν την δράσης της και ενεργοποιούν προς τα κάτω μονοπάτια (downstream pathways). Ωστόσο η MuSK σχετίζεται και με πρωτεΐνες που έχουν δομικό ρόλο και συμμετέχουν σε διαδικασίες όπως ο σχηματισμός της νευρομυϊκής σύναψης, η ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων και η πυρηνική θέση. Όλες οι παραπάνω παρατηρήσεις οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η MuSK μπορεί να δημιουργεί ένα σηματοδοτικό μόριο (signalosome) με κρίσιμο ρόλο στην δημιουργία της νευρομυϊκής σύναψης. Για να μπορέσει κανείς να κατανοήσει τον τρόπο με τον οποίο λειτουργεί η πρωτεΐνη MuSK και να προσδιορίσει τους λόγους για τους οποίους διατηρεί συγκεκριμένες στερεοδιαμορφώσεις δεν αρκεί μόνο η μελέτη της ίδια της πρωτεΐνης αλλά κρίνεται αναγκαία και η μελέτη των πρωτεϊνών με τις οποίες αλληλεπιδρά. Παρακάτω θα αναλύσουμε την λειτουργία της MuSK μέσω των αλληλεπιδράσεων της με πρωτεΐνες της νευρομυϊκής σύναψης όπως και τα σηματοδοτικά μονοπάτια στα οποία εμπλέκεται. Α.3.1. Γενικά Η MuSK πρωτεΐνη είναι ένα διαμεμβρανικό πολυπεπτίδιο, με μια ενδοκυτταρική περιοχή, που χαρακτηρίζεται από δράση κινάσης τυροσίνης (Tyr) και μια μεγάλη εξωκυτταρική περιοχή, με πρωτεϊνικά μοτίβα ανοσοσφαιρινών (Ig-like). H πρωτεΐνη φαίνεται να είναι ειδική για τη σειρά των σκελετικών μυών. Εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα στους μυοβλάστες. Στον ώριμο μυ, ελαττώνεται η έκφρασή της, ενώ τα επίπεδά της είναι πιο αυξημένα στη νευρομυϊκή σύναψη. Η έκφραση της MuSK ρυθμίζεται, επίσης, από την ηλεκτρική δραστηριότητα, καθώς επάγεται δραματικά μετά από απονεύρωση ή αναστολή της ηλεκτρικής δραστηριότητας [23]. Τα ποντίκια, στα οποία έχει εξαλειφθεί το γονίδιο που κωδικοποιεί τη MuSK, αναπτύσσονται φυσιολογικά στη μήτρα, αλλά πεθαίνουν περιγεννητικά, εξαιτίας ανικανότητας να αναπνεύσουν. Παρά το γεγονός ότι ο σκελετικός μυς αναπτύσσεται φυσιολογικά σ αυτά τα ζώα, η μετασυναπτική διαφοροποίηση είναι σχεδόν απούσα, με τον υποδοχέα ακετυλοχολίνης να μη συγκεντρώνεται υπό τη νευρική απόληξη [24]. Το γεγονός ότι η MuSK είναι απαραίτητη για τη δράση της αγκρίνης υποδηλώνει ότι η MuSK μπορεί να 11

22 είναι ο υποδοχέας της αγκρίνης. Επακόλουθα πειράματα υποστήριξαν αυτήν την υπόθεση. Καλλιεργημένα μυϊκά κύτταρα από ανεπαρκή σε MuSK ποντίκια δεν αποκρίθηκαν στην αγκρίνη, ενώ η εισαγωγή του γονιδίου της MuSK σε αυτά τα κύτταρα αποκατέστησε την απόκριση στην αγκρίνη [25]. Η αγκρίνη είχε ως αποτέλεσμα την επαγωγή ταχείας φωσφορυλίωσης της MuSK. Μια μετάλλαξη της MuSK, χαρακτηριζόμενη από ανενεργή περιοχή κινάσης, ανέστειλε την επαγόμενη από αγκρίνη συνάθροιση. Α.3.2 Αγκρίνη Έχει δειχθεί ότι το μονοπάτι αγκρίνης / MuSK παίζει ρόλο-κλειδί στην έναρξη και διατήρηση πολλών από τις δομικές εξειδικεύσεις της μετασυναπτικής συσκευής. Η αγκρίνη είναι μια παραγόμενη από τα νεύρα πρωτεΐνη, η οποία απομονώθηκε, αρχικά, εξαιτίας της ικανότητάς της να επάγει τη συνάθροιση των υποδοχέων ακετυλοχολίνης στην επιφάνεια των μυϊκών κυττάρων. Η αγκρίνη συντίθεται και ελευθερώνεται από τους αναπτυσσόμενους νευρίτες των κινητικών νευρώνων [26]. Επιπλέον, αντισώματα έναντι της αγκρίνης ανέστειλαν το σχηματισμό των επαγόμενων από τους κινητικούς νευρώνες συναθροίσεων [27]. Η παρατήρηση αυτή οδήγησε στην υπόθεση ότι η αγκρίνη ήταν το παραγόμενο από τα νεύρα σήμα, που διαμεσολαβούσε τη συσσωμάτωση του υποδοχέα ακετυλοχολίνης in vivo. Μικρές συναθροίσεις υποδοχέων ακετυλοχολίνης είναι ορατές με ανοσοφθορισμό στην επιφάνεια των μυϊκών κυττάρων, ακόμα και επί απουσίας του νεύρου ή της αγκρίνης. Ωστόσο, μέσα σε 2h από τη νεύρωση ή την προσθήκη αγκρίνης, ο αριθμός αυτών των μικροσυναθροίσεων υποδοχέων ακετυλοχολίνης αρχίζει να αυξάνει. Μέσα σε 14h, ένας αριθμός μεγάλων συναθροίσεων υποδοχέων ακετυλοχολίνης φαίνεται και η μέγιστη συνάθροιση παρατηρείται μέσα στις 24 ώρες. Ο σχηματισμός των συναθροίσεων δεν συνοδεύεται από αύξηση στα επίπεδα των υποδοχέων ακετυλοχολίνης. Φαίνεται ότι οι προϋπάρχοντες υποδοχείς ακετυλοχολίνης ανακατανέμονται στην κυτταρική μεμβράνη. Πολλές από τις πρωτεΐνες που σχετίζονται με τους υποδοχείς ακετυλοχολίνης στις ώριμες συνάψεις έχει παρατηρηθεί ότι συσσωματώνονται με αυτούς στα πρώιμα στάδια. Η ραψίνη, η α-δυστρογλυκάνη και η ακετυλοχολινεστεράση, όλες συνδέονται με τις αυθόρμητες και τις επαγόμενες από αγκρίνη AChR συναθροίσεις [28][29]. Μετά 15-20h από την κατεργασία με αγκρίνη, μια δεύτερη ομάδα μορίων συγκεντρώνεται στις συναθροίσεις υποδοχέων ακετυλοχολίνης, η οποία περιλαμβάνει τα κυτταροσκελετικά συστατικά α- ακτινίνη, φιλαμίνη και βινκουλίνη. 12

23 Η σημασία της αγκρίνης επιβεβαιώθηκε οριστικά με τη δημιουργία ενός ποντικού, στον οποίο είχε εξαλειφθεί το γονίδιο για την αγκρίνη και ο οποίος έδειξε μικρή ή καθόλου μετασυναπτική διαφοροποίηση, με πολύ λίγες συναθροίσεις υποδοχέων ακετυλοχολίνης και καμία από τις φυσιολογικές δομικές εξειδικεύσεις [30]. Το γονίδιο που είναι υπεύθυνο για την αγκρίνη κωδικοποιεί έναν πρωτεϊνικό πυρήνα 220kDa, αλλά η αγκρίνη που απομονώνεται από εγκέφαλο μεταναστεύει ως μια διάχυτη μπάντα kda. Κατεργασία της τελευταίας με ηπαρινάση προκαλεί μια μετατόπιση στην καθορισμένη 220kDa μπάντα, επισημαίνοντας ότι η αγκρίνη είναι ένα μέλος μιας οικογένειας αρνητικά φορτισμένων, έντονα γλυκοζυλιωμένων πρωτεϊνών, των πρωτεογλυκανών θειϊκής ηπαράνης. Πολλά άλλα μέλη αυτής της οικογένειας έχουν εμπλακεί σ έναν αριθμό κρίσιμων αναπτυξιακών διεργασιών, όπως έλεγχος κυτταρικής αύξησης και διαφοροποίησης και ρύθμιση γονιδιακής μεταγραφής. Η αγκρίνη διαθέτει περιοχές ομολογίας με αρκετές γνωστές πρωτεΐνες και υφίσταται σε πολλές διαφορετικές ισομορφές. Οι δομικές περιοχές της αγκρίνης που απαιτούνται για την συνάθροιση υποδοχέων ακετυλοχολίνης έχουν προσδιοριστεί. Απαλοιφή ολόκληρης της αμινοτελικής περιοχής και της κεντρικής περιοχής δεν έχει επίδραση στην ικανότητα συνάθροισης. Φαίνεται ότι αυτές οι 2 περιοχές απαιτούνται μόνο για τους προτεινόμενους ρόλους της αγκρίνης στη σύνδεση με αυξητικούς παράγοντες και στην αναστολή πρωτεασών. Παρά το ότι η αγκρίνη αναγνωρίστηκε αρχικά, ως ένας παράγοντας εκκρινόμενος από τους κινητικούς νευρώνες, στη συνέχεια, δείχθηκε ότι η αγκρίνη είναι ευρύτερα κατανεμημένη. Η αγκρίνη είναι παρούσα στον εγκέφαλο, στο νωτιαίο μυελό, στο μυ, στο ήπαρ, στο νεφρό, στον πνεύμονα και σε ποικιλία άλλων ιστών. Στα πρωιμότερα στάδια της ανάπτυξης, τα ολικά επίπεδα της αγκρίνης είναι χαμηλά. Τα επίπεδα του mrna της αγκρίνης αυξάνονται στη συνέχεια, στη διάρκεια της ανάπτυξης και ελαττώνονται εκ νέου στην ενήλικη ζωή. Η αγκρίνη χαρακτηρίζεται για την ικανότητά της να επάγει συσσωμάτωση και συνάθροιση των υποδοχέων ακετυλοχολίνης στην επιφάνεια καλλιεργημένων μυϊκών κυττάρων και αυτό το γεγονός την εμπλέκει σε παρόμοιες πρώιμες διεργασίες, στη διάρκεια του σχηματισμού νευρομυϊκής σύναψης in vivo. Ο μηχανισμός δράσης της αγκρίνης έχει παραμείνει για πολύ καιρό υποθετικός, παρά το γεγονός ότι η κατεργασία με αγκρίνη οδηγεί σε φωσφορυλίωση Tyr των υπομονάδων του υποδοχέα ακετυλοχολίνης και αναστολείς φωσφορυλίωσης Tyr μπλοκάρουν την επαγόμενη από αγκρίνη συνάθροιση. 13

24 Αφότου πρωτοαπομονώθηκε η αγκρίνη από το Torpedo, έχει λάβει χώρα εκτεταμένη έρευνα σχετικά με την ταυτότητα του υποδοχέα που ενέχεται στη μεταγωγή της επαγόμενης από αγκρίνη συνάθροισης των υποδοχέων ακετυλοχολίνης. Παρά το γεγονός ότι η έρευνα βρίσκεται υπό εξέλιξη, πιστεύεται ότι ο υποδοχέας με δράση κινάσης Tyr, η MuSK, αντιπροσωπεύει μέρος αυτού του υποδοχέα. Α.3.3 Lrp4 και Dok7 Όπως προαναφέρθηκε παρατηρήσεις δηλώνουν ότι η MuSK μπορεί να μην είναι ο πλήρης υποδοχέας της αγκρίνης. Παρά το γεγονός ότι η αγκρίνη διεγείρει τη φωσφορυλίωση της MuSK σε μυϊκά κύτταρα, δεν υπάρχει άμεση δέσμευση της αγκρίνης στην εξωκυττάρια περιοχή της MuSK [31]. Αυτό που συμβαίνει, στην πραγματικότητα, είναι ότι η αγκρίνη δεν μπορεί να δεσμευτεί άμεσα σε απομονωμένη MuSK, αλλά μπορεί να δεσμευτεί στη MuSK που βρίσκεται στην επιφάνεια μυϊκών κυττάρων. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι η MuSK μπορεί να αντιπροσωπεύει μία υπομονάδα σε ένα σύμπλεγμα υποδοχέα από πολλά συστατικά για την αγκρίνη και ότι χρειάζεται επιπρόσθετο(-α) βοηθητικό(-ά) συστατικό(-ά) υποδοχέα, ώστε να συνδεθεί και στη συνέχεια, να ενεργοποιηθεί από την αγκρίνη. Αυτό το συστατικό αρχικά ονομάστηκε MASC (MuSK-Accessory Specificity Component), έχει απομονωθεί από μυϊκά κύτταρα και έχει δειχθεί ότι απαιτείται, ώστε η αγκρίνη να δεσμευτεί στην εξωκυττάρια περιοχή της απομονωθείσας MuSK. Επιπλέον, πειράματα έδειξαν ότι μόνο 13 αμινοξέα, εντοπιζόμενα κοντά στη διαμεμβρανική περιοχή της MuSK, είναι απαραίτητα για τη συνάθροιση των υποδοχέων ακετυλοχολίνης [25]. Μελέτες γενετικής έδειξαν ότι μια μονής διέλευσης διαμεμβρανική πρωτεΐνη η Lrp4 (low-density lipoprotein receptor-related protein 4) είναι απαραίτητη για την δημιουργία της νευρομυϊκής σύναψης, όπως επίσης και για την ανάπτυξη των άκρων, των πνευμόνων, των νεφρών και των εξωδερμικών οργάνων [32][33][34]. Πρόσφατα δυο ανεξάρτητες μελέτες αναφέρουν ότι η Lrp4 αποτελεί συν υποδοχέα της αγκρίνης [35][36]. Η Lrp4 προσδένεται επιλεκτικά στην νευρική αγκρίνη [35][36]. Η Lrp4 είναι απαραίτητη για την επαγόμενη από την αγκρίνη ενεργοποίηση της MuSK και για την συνάθροιση των υποδοχέων ακετυλοχολίνης σε καλλιεργημένα μυϊκά κύτταρα, ενώ είναι ικανή να επαναφέρει την σηματοδοσία της MuSK σε μη μυϊκά κύτταρα. [35][36]. Τα παραπάνω ευρήματα υποδεικνύουν ότι η Lrp4 πιθανώς να αποτελεί τον σύνδεσμο που συνδέει την αγκρίνη με την ενεργοποίηση της MuSK. Η Lrp4 είναι μέλος της οικογένειας πρωτεϊνών (low-density lipoprotein receptor) (LDLR). Αποτελείται από μια μεγάλη εξωκυτταρική αμινοτελική περιοχή, μια διαμεμβρανική 14

25 και μια μικρή καρβοξυτελική περιοχή χωρίς κάποια αναγνωρίσιμη καταλυτική περιοχή [32][37][38][39]. Ο τρόπος με τον οποίο η Lrp4 ρυθμίζει την δραστηριότητα της MuSK παραμένει ακόμη άγνωστος. Η Lrp4 αυτοσυσχετίζεται και μπορεί να αλληλεπιδρά με την MuSK μέσω των εξωκυτταρικών περιοχών των δυο πρωτεϊνών [35][36] σε συμφωνία με προγενέστερα ευρήματα δραστηριότητας πρόσδεσης στην επιφάνεια προμυοβλαστών της εξωκυτταρικής περιοχής της MuSK σαν συμμετοχή στην συνάθροιση των υποδοχέων ακετυλοχολίνης [40]. Έτσι η Lrp4 θα μπορούσε να λειτουργήσει στην ενεργοποίηση της MuSK απουσία αγκρίνης, όπως επίσης και στην περίπτωση της επαγόμενης από την αγκρίνη ενεργοποίηση της MuSK. Παρατηρήσεις ότι η συν έκφραση της Lrp4 είναι ικανή από μόνη της να αυξήσει την δραστηριότητα της MuSK υποστηρίζει την παραπάνω γνώμη [35][36]. Πρόσφατες έρευνες υποδεικνύουν ότι η αγκρίνη διεγείρει την συσχέτιση μεταξύ της Lrp4 και της MuSK και προτείνουν ένα μοντέλο για την ενεργοποίηση της MuSK που προκαλείται από την δέσμευση της αγκρίνης στην Lrp4. Σε αυτό το μοντέλο η Lrp4 βρίσκεται σε μια κατάσταση δυναμικής ισορροπίας μεταξύ μιας «κλειστής» διαμόρφωσης, η οποία δεν είναι ικανή να προσδεθεί και να ενεργοποιήσει την MuSK και μιας ανοικτής διαμόρφωσης, η οποία δεσμεύει την MuSK. Απουσία αγκρίνης, η Lrp4 έχει μικρή πιθανότητα να υιοθετήσει την ανοικτή διαμόρφωση. Ωστόσο αυτή η ανοικτή διαμόρφωση δεν εξαρτάται αυστηρά από την αγκρίνη αλλά η αγκρίνη μετατοπίζει την ισορροπία ώστε να ευνοεί την ανοικτή διαμόρφωση, προάγοντας την δέσμευση της Lrp4 και της πρώτης lg περιοχής της MuSK η οποία μπορεί να αναδιατάξει την MuSK και να προσανατολίσει τις υδροφοβικές περιοχές της Lg1 περιοχής σε μια ευνοϊκή διευθέτηση ώστε να προκληθεί διμερισμός της MuSK και να διευκολυνθεί η τρανς φωσφορυλίωση των περιοχών με δράση κινάσης (Εικόνα Α.5). Επιπλέον οι τυροσίνες της ενδοκυτταρικής περιοχής της Lrp4 φωσφορυλιώνονται στους μυοβλάστες που έχουν διεγερθεί από την αγκρίνη και περιέχει το τυπικό NPxY μοτίβο και πέντε επιπλέον κατάλοιπα τυροσίνης τα οποία μπορεί να αλληλεπιδρούν με τις PTB (phospho-tyrosine binding) ή SH2 (Src homology 2) περιοχές. Στις συσχετιζόμενες πρωτεΐνες Ldlr, Lrp1 και Lrp2, το NPxY μοτίβο λειτουργεί σαν σημείο πρόσδεσης για προσαρμοστικές ( adapter) πρωτεΐνες. H παραμεμβρανική περιοχή της MuSK περιέχει ένα παρόμοιο μοτίβο (Υ553) το οποίο φωσφορυλιώνεται στις τυροσίνες σαν ανταπόκριση στην διέγερση από την αγκρίνη και είναι 15

26 απαραίτητο για την επαγόμενη από την αγκρίνη συνάθροιση υποδοχέων ακετυλοχολίνης [25][41][42]. Η αλληλεπίδραση του με την PTB περιοχή της πρωτεΐνης Dok7 (downstream-oftyrosine-kinase-7) απαιτείται για την ενεργοποίηση της MuSK και για τον σηματοδοτικό καταρράκτη. Ποντίκια στα οποία υφίσταται μετάλλαξη στην πρωτεΐνη Dok7 στερούνται νευρομυϊκών συνάψεων και τα μεταλλαγμένα μυϊκά κύτταρα δεν σχηματίζουν συσσωματώματα υποδοχέων ακετυλοχολίνης ως ανταπόκριση στην αγκρίνη ενώ αναγκαστική έκφραση της Dok7 ενεργοποιεί την MuSK και επάγει συνάθροιση υποδοχέων ακετυλοχολίνης υποδεικνύοντας ότι η Dok7 είναι ικανή να ενεργοποιήσει την MuSK απουσία αγκρίνης. Εικόνα Α.5 Η αγκρίνη δεσμεύεται στο προσχηματισμένο σύμπλοκο και πυροδοτεί μια αναδιοργάνωση ή αναπροσανατολισμό της MuSK, προωθώντας τρανς φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση της κινάσης. Μόλις φωσφορυλιωθεί η MuSK ενεργοποιεί ένα σηματοδοτικό μονοπάτι το οποίο οδηγεί σε συναπτική διαφοροποίηση Λαμβάνοντας υπόψη τα παραπάνω η Lrp4 θα μπορούσε να μεσολαβήσει ή να ρυθμίσει την σηματοδοτική δραστηριότητα της MuSK με τρείς τρόπους, Διατηρώντας την βασική δραστηριότητα με άμεση αλληλεπίδραση, λειτουργώντας σαν υποδοχέας αγκρίνης ή σαν μεταγωγέας σημάτων μέσω της ενδοκυττάριας περιοχής της. Α.3.4. Πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην λειτουργία και τα σηματοδοτικά μονοπάτια της MuSK Παρά το γεγονός ότι ο πραγματικός υποδοχέας της αγκρίνης δεν έχει αναγνωριστεί ακόμα, η πρωτεΐνη ραψίνη είναι γνωστό ότι παίζει κεντρικό ρόλο στη φυσική διεργασία της 16

27 συνάθροισης. Η ραψίνη (Receptor-associated protein at the synapse, Rapsyn) είναι μια 43kDa πρωτεΐνη, η οποία εντοπίζεται μαζί με τους υποδοχείς ακετυλοχολίνης στις νευρομυϊκές συνάψεις από τα πρωιμότερα στάδια του σχηματισμού συνάψεων [43][44]. Η ραψίνη φαίνεται να προσδένει τους υποδοχείς ακετυλοχολίνης σε ένα υποσυναπτικό δίκτυο κυτταροσκελετού (Εικόνα Α.6-Α.7). Η χαρτογράφηση περιοχών στη MuSK, οι οποίες είναι απαραίτητες για την αλληλεπίδρασή της με τη ραψίνη, δείχνει ότι αλληλουχίες μέσα και κοντά στην τέταρτη Iglike περιοχή απαιτούνται για τη σύνδεση με τη ραψίνη μέσω της πρωτεΐνης RATL (Rapsyn Associated Transmembrane Linker), ώστε να μεσολαβηθεί η συνάθροιση των υποδοχέων ακετυλοχολίνης [45]. Η φωσφορυλίωση τους εξαρτάται από τη ραψίνη. Η Src κινάση, η κύρια κινάση που φωσφορυλιώνει τον υποδοχέα ακετυλοχολίνης, έχει δειχθεί ότι συνδέεται με τη ραψίνη [46] (Εικόνα Α.6-Α.7). Φαίνεται ότι η αγκρίνη δεσμεύεται, αρχικά, στο σύμπλεγμα του υποδοχέα της MuSK, ενεργοποιώντας τη MuSK και επάγοντας τη μετασυναπτική συνάθροισή της και το σχηματισμό ενός πρωτοπαθούς βασισμένου στη MuSK δικτύου. Αυτό το πρωτοπαθές, το βασισμένο στη MuSK δίκτυο, απαιτεί, εν συνεχεία, ραψίνη, ώστε να συγκεντρωθούν επιπρόσθετα μετασυναπτικά συστατικά, όπως οι υποδοχείς ακετυλοχολίνης, η δυστρογλυκάνη, κ.ά. Αναλυτικότερα, η αγκρίνη διεγείρει το διμερισμό [47] και τη δραστηριότητα κινάσης της MuSK. Το σήμα που προκαλείται από την ενεργοποίηση της MuSK εξαρτάται από τη φωσφορυλίωση ενός καταλοίπου Tyr (Tyr553) στην παραμεμβρανική ομόφωνη θέση αναγνώρισης (NPxY) για τις πρωτεΐνες που περιέχουν περιοχή δέσμευσης φωσφοτυροσίνης [25]. Αυτή η φωσφοτυροσίνη απαιτείται, για να συγκεντρωθούν σηματοδοτικά συστατικά [25]. Επιπρόσθετα, η αγκρίνη προκαλεί ταχεία ενεργοποίηση των Src κινασών και φωσφορυλίωση Tyr στις β και δ υπομονάδες του υποδοχέα ακετυλοχολίνης [48], με τη φωσφορυλίωση της β να απαιτείται για την αποτελεσματική συνάθροιση του υποδοχέα [49]. Η φωσφορυλίωση Tyr, καθώς και οι Src και Fyn κινάσες, είναι απαραίτητες για τη σταθεροποίηση των συναθροίσεων [8]. Όπως και οι υποδοχείς ακετυλοχολίνης, και η ραψίνη σχηματίζει συσσωματώματα, αυτόματα ή μετά από επαγωγή από την αγκρίνη. Η ραψίνη και ο υποδοχέας ακετυλοχολίνης βρίσκονται σε ισομοριακές συγκεντρώσεις στη νευρομυϊκή σύναψη [50]. Όταν ο υποδοχέας ακετυλοχολίνης εκφράζεται σε ωοκύτταρα Xenopus, οι υποδοχείς κατανέμονται διάχυτα στην κυτταρική επιφάνεια. Ταυτόχρονη έκφραση της ραψίνης και του υποδοχέα ακετυλοχολίνης έχει ως αποτέλεσμα αυξημένο χρόνο ημιζωής του τελευταίου, δηλώνοντας ότι αυτή η σύνδεση μπορεί να είναι μερικώς υπεύθυνη για την αυξημένη σταθερότητα των υποδοχέων 17

28 ακετυλοχολίνης μετά τη συναπτογένεση [51][52]. Η ραψίνη είναι σε θέση να προκαλέσει συνάθροιση αρκετών πρωτεϊνών της νευρομυϊκής σύναψης, άλλων, εκτός του υποδοχέα ακετυλοχολίνης. Η ικανότητα της ραψίνης να προκαλεί συνάθροιση πρωτεϊνών της νευρομυϊκής σύναψης οδήγησε στην υπόθεση ότι αποτελεί μια πρωτεΐνη-οδηγό, η οποία συγκεντρώνει τις άλλες συναπτικές πρωτεΐνες στα σημεία επαφής νεύρου/μυός. Τα ποντίκια, στα οποία απουσιάζει το γονίδιο για τη ραψίνη, παρέχουν μια in vivo υποστήριξη σ αυτήν την πρόταση. Οι υποδοχείς ακετυλοχολίνης, η δυστρογλυκάνη και άλλες πρωτεΐνες δε συναθροίζονται στις νευρομυϊκές συνάψεις αυτών των ποντικιών. Η MuSK δεν παίζει απλά έναν δομικό ρόλο, στη διάρκεια του σχηματισμού της νευρομυϊκής σύναψης, καθώς μελέτες με τη δημιουργία μεταλλάξεων αποκαλύπτουν ότι η δραστηριότητα κινάσης της MuSK απαιτείται για την επαγωγή συνάθροισης των υποδοχέων ακετυλοχολίνης. Επιπλέον, η ενεργοποίηση της MuSK είναι απαραίτητη συνθήκη, ώστε να διαμεσολαβηθεί ένα πρώιμο γεγονός-κλειδί στο σχηματισμό της νευρομυϊκής σύναψης, τη φωσφορυλίωση του υποδοχέα ακετυλοχολίνης. Ωστόσο, ούτε η ενεργοποίηση της MuSK ούτε η φωσφορυλίωση του υποδοχέα ακετυλοχολίνης αρκούν για την συνάθροιση των υποδοχέων ακετυλοχολίνης, δηλώνοντας ότι η φωσφορυλίωση του AChR δεν είναι το γεγονός-κλειδί που θα προκαλέσει την συνάθροιση των υποδοχέων ακετυλοχολίνης και το σχηματισμό της νευρομυϊκής σύναψης. Μελέτες επικεντρώνονται στη συμμετοχή της ακτίνης στη διεργασία της συσσωμάτωσης των υποδοχέων ακετυλοχολίνης. Η διέγερση της αγκρίνης οδηγεί σε πολυμερισμό της ακτίνης και μετατόπιση της ρυθμιστικής της ακτίνης πρωτεΐνης, της κορτακτίνης (cortactin), σε μετασυναπτικές θέσεις [53]. Επιπλέον, η λατρουνκουλίνη Α (latrunculin A), ένας αναστολέας του πολυμερισμού ακτίνης, μπλοκάρει την επαγόμενη από αγκρίνη συνάθροιση των υποδοχέων ακετυλοχολίνης σε μυϊκά κύτταρα [53]. Οι GTPάσες Rac/Cdc42, δύο μικρές GTPάσες, που ρυθμίζουν την οργάνωση της ακτίνης, απαιτούνται για την επαγόμενη από αγκρίνη συνάθροιση των υποδοχέων ακετυλοχολίνης σε μυϊκά κύτταρα [54]. Η πρόσφατη ανακάλυψη αρκετών αγωνιστών της MuSK έχει φωτίσει τα μοριακά γεγονότα στον καταρράκτη της ενεργοποίησης της MuSK από την αγκρίνη. Αρκετοί από αυτούς τους αγωνιστές ενέχονται στην οργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης. Επιπροσθέτως της δραστηριότητας κινάσης της MuSK, μια δραστηριότητα διαφορετική από αυτήν ενός υποδοχέα κινάσης Tyr (nonreceptor tyrosine kinase, NRTK), στον καταρράκτη της MuSK, είναι απαραίτητη για την συνάθροιση των 18

29 υποδοχέων ακετυλοχολίνης. Ο Pendergast και συνεργατες [55] υπέθεσαν ότι οι Abelson κινάσες Tyr (Abl) (Εικόνα Α.6-Α.7) έχουν ρόλο στο σχηματισμό της σύναψης και ανέφεραν την απαίτηση αυτών των πρωτεϊνών στην επαγόμενη από αγκρίνη AChR συνάθροιση in vitro. Οι Abl κινάσες ρυθμίζουν την οργάνωση της ακτίνης [56] και εντοπίζονται στη μετασυναπτική μεμβράνη της αναπτυσσόμενης νευρομυϊκής σύναψης. Οι συγγραφείς πρότειναν ότι οι Abl κινάσες ενισχύουν το αρχικό σήμα και τη συνάθροιση των υποδοχέων ακετυλοχολίνης μέσω φωσφορυλιώσεων Tyr και σταθεροποιούν τις συναθροίσεις [55]. Η Dvl δεσμεύεται τόσο στην παραμεμβρανική περιοχή, όσο και στην περιοχή κινάσης της MuSK. Η Dvl αλληλεπιδρά, επίσης, με την κινάση Ser/Thr PAK1, η οποία ενεργοποιείται σε μυϊκά κύτταρα σε απόκριση στην αγκρίνη. Η PAK1 είναι αγωνιστής των Rac/Cdc42 στην αναδιοργάνωση της ακτίνης (Εικόνα Α.6-Α.7). Άλλο ένα σημαντικό σηματοδοτικό συστατικό στο μονοπάτι αγκρίνη/musk είναι η γερανυλο-γεράνυλο-τρανσφεράση 1 (geranylgeranyltransferase 1, GGT) (Εικόνα Α.6-Α.7). Πειράματα έδειξαν ότι η α υπομονάδα της GGT αλληλεπιδρά με την περιοχή κινάσης της MuSK [57]. Η αγκρίνη προκαλεί ταχεία αύξηση στη φωσφορυλίωση Tyr της GGT και η αναστολή είτε της έκφρασης της GGT είτε της δραστηριότητας της GGT εμποδίζει τα μυϊκά κύτταρα από το να σχηματίσουν συναθροίσεις υποδοχέων ακετυλοχολίνης σε απόκριση στην αγκρίνη. Υπάρχουν ενδείξεις για ρύθμιση της συνάθροισης των υποδοχέων ακετυλοχολίνης από την ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη APC (Adenomatous Polyposis Coli), μια πρωτεΐνη που δεσμεύει ακτίνη [58]. Η APC πρωτεΐνη έχει βρεθεί σε αρκετά υποκυτταρικά διαμερίσματα, όπως το κυτταρόπλασμα και ο πυρήνας. Η APC εντοπίζεται μαζί με τους υποδοχείς ακετυλοχολίνης στη μετασυναπτική μεμβράνη της νευρομυϊκής σύναψης και αλληλεπιδρά άμεσα με τη β-υπομονάδα των υποδοχέων ακετυλοχολίνης, βοηθώντας τους να βρεθούν στον κυτταροσκελετό ακτίνης. Η πρωτεΐνη-οδηγός, MAGI-1c (Εικόνα Α.6), έχει αναγνωριστεί ως σύντροφος της MuSK στη μετασυναπτική μεμβράνη των ηλεκτρικών κυττάρων του Torpedo [59]. Η MAGI-1c είναι ένα μέλος της οικογένειας των πρωτεϊνών-οδηγών MAGUK, οι οποίες ενέχονται στην οργάνωση της μεταγωγής σήματος στις κυτταρικές συνάψεις. Όπως συμβαίνει και με άλλες MAGUKs που σχετίζονται με συνάψεις, έτσι και η MAGI-1c αποτελείται από αρκετές περιοχές αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, μεταξύ των οποίων και μία περιοχή γουανυλικής κινάσης. Καθεμιά από τις περιοχές αυτές συμβάλλει στην ειδική σύνδεση με μια μεγάλη ομάδα σηματοδοτικών, δομικών και κυτταροσκελετικών στοιχείων. 19

30 Η MAGI-1c εντοπίζεται στις χολινεργικές συνάψεις του ηλεκτρικού κυττάρου του Torpedo και στις νευρομυϊκές συνάψεις ενήλικων αρουραίων. Η NRG, δρώντας μέσω των ErbB υποδοχέων με δράση κινάσης Tyr στη μετασυναπτική μεμβράνη, ενεργοποιεί τη συναπτική γονιδιακή μεταγραφή διαμέσου των μονοπατιών μεταγωγής σήματος της πρωτεϊνικής κινάσης που ενεργοποιείται από μιτογόνα (Mitogen Activated Protein Kinase, MAPK), της c-jun NH2-terminal kinase (JNK) και της κινάσης της φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης (Phosphatidyl Inositol-3 Kinase, PI3K) (Εικόνα Α.8). Η ερμπίνη συνδέεται με την καρβοξυτελική περιοχή της ErbB2 και ελαττώνει το σηματοδοτικό καταρράκτη της MAPK, ο οποίος διεγείρεται από τη NRG, μέσω απενεργοποίησης του Ras [60]. Εικόνα Α.6 Η MuSK εμφανίζεται σαν κύριος οργανωτής της μετασυναπτικής ανάπτυξης της νευρομυϊκής σύναψης. Ποντίκια με μεταλλάξεις στο γονίδιο που κωδικοποιεί την MuSK παρουσιάζουν ανεπάρκειες στην δημιουργία πρωτογενών συναθροίσεων υποδοχέων ακετυλοχολίνης ή προτυποποιημένων μυϊκών ινών και δεν σχηματίζουν νευρικά επαγόμενες συναθροίσεις υποδοχέων ακετυλοχολίνης ή νευρομυϊκές συνάψεις. Ενδείξεις υποδεικνύουν ότι η MuSK όχι μόνο λειτουργεί σαν υποδοχέας για την αγκρίνη αλλά αρχικοποιεί μονοπάτια που οδηγούν στην μετασυναπτική διαφοροποίηση. Αλληλεπιδρώντας με επιπρόσθετες πρωτεΐνες πολλές από τις 20

31 οποίες έχουν ήδη αναγνωρισθεί, η MuSK ενδέχεται να λειτουργεί και σαν βασικός οργανωτής διαμερισματοποιημένης σηματοδοσίας. Με βάση την λειτουργία τους οι πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με την MuSK μπορούν να κατηγοριοποιηθούν σε τέσσερις κατηγορίες. Η πρώτη ομάδα (πορτοκαλί)είναι απαραίτητη για την δραστηριότητα της MuSK και για τον καταρράκτη σηματοδοσίας, Η δεύτερη (μωβ) ελέγχει την σηματοδοσία αγκρίνης/musk. Η Τρίτη ομάδα (μπλε) αποτελείται από scaffold πρωτεΐνες συμπεριλαμβανομένου της ραψίνης [45][61], της ColQ μια πρωτεΐνη για την εμπλούτιση της ακετυλοχολιστερινασης στην συναπτική σχισμή (AChE) [62], την πρωτεΐνη MAGUK MAGI-1c [59] και από υποδοχείς της ακετυλοχολίνης [63]. Η τέταρτη ομάδα (ροζ) επάγει πρωτεΐνες οι οποίες ενδέχεται να ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση, επάγοντας την γ, μια πρωτεΐνη που θεωρείται ότι ρυθμίζει την συναπτική γονιδιακή έκφραση στην νευρομυϊκή σύναψη [64] και στη ρύθμιση της Sine1 (synaptic nuclear envelope 1) [65]. Αυτή η αλληλεπίδραση θεωρείται ότι βοηθά στην πρόσδεση του συναπτικού πυρήνα στην συναπτική περιοχή των νευρομυϊκών συνάψεων. Εκτός του μονοπατιού NRG/ErbB, αρκετές μελέτες έδειξαν έναν ρόλο για την αγκρίνη και τη MuSK στη ρύθμιση της συναπτικής γονιδιακής μεταγραφής. Η αγκρίνη των νεύρων ή η MuSK διεγείρουν τη μεταγραφή των γονιδίων του υποδοχέα ακετυλοχολίνης. Εικόνα Α.7 Ενδοκυτταρικά μονοπάτια που ενεργοποιούνται από την αγκρίνη για τον σχηματισμό συναθροίσεων υποδοχέων ακετυλοχολίνης. Η αγκρίνη αλληλεπιδρά με την Lrp4 για να αυξήσει την αλληλεπίδρασή της με την MuSK και κατά συνέπεια τον διμερισμό της MuSK και την ενεργοποίηση της. Διαδοχικά, αλληλεπιδράσεις μεταξύ της κινάσης και συγκεκριμένων πρωτεϊνών όπως η Dok7, οι οποίες είναι ζωτικής σημασίας για την καταλυτική της δραστηριότητα και τον σηματοδοτικό καταρράκτη, αυξάνονται. Η κινάση τυροσίνης Abl και το μέταλλο ένζυμο γερανυλο-γεράνυλο-τρανσφεράση GGΤ ενεργοποιούνται. Η GGT 21

32 διευκολύνει την ενεργοποίηση της Rho GTPase, η οποία μέσω πολλαπλών μονοπατιών ρυθμίζει την δυναμική με την οποία η ακτίνη συμμετέχει στην μετακίνηση και στην παρεμβολή των υποδοχέων ακετυλοχολίνης στην μεμβράνη. Η αγκρίνη επίσης διεγείρει την συσχέτιση των υποδοχέων ακετυλοχολίνης με την ραψίνη και την Apc οι οποίες ενώνουν των υποδοχέα άμεσα ή έμμεσα με τον κυτταροσκελετό. Η σταθερότητα της ραψίνης αυξάνεται στην σύναψη από την chaperone Hsp90b, και αλληλεπιδρά και δεσμεύει την calpain με αποτέλεσμα να ανταγωνίζεται το φαινόμενο διασποράς των υποδοχέων ακετυλοχολίνης που προκαλεί η ακετυλοχολίνη. Η σηματοδοσία της αγκρίνης ρυθμίζεται από την ενδοκύτταρωση της MuSK, την Ε3 λιγάση ουιβικουιτίνης Pdzrn3, λιπιδικές μικροδομές [66][67][68][69] και το ενδοκυτταρικό ασβέστιο [70]. Τα αστέρια υποδεικνύουν αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης με πρωτεΐνη που αυξάνονται από την αγκρίνη. Πρόσφατα, ο Brenner και συνεργάτες έδειξαν ότι η επαγόμενη από την αγκρίνη μεταγραφή του γονιδίου της MuSK ελέγχεται εν μέρει από το μονοπάτι NRG/ErbB και από έναν νέο παράπλευρο δρόμο, στον οποίο η MuSK διεγείρει την ενεργοποίηση των Rac και JNK. Με αυτά τα δεδομένα, η MuSK φαίνεται να ενέχεται όχι μόνο στη συνάθροιση των υποδοχέων ακετυλοχολίνης, αλλά και στη ρύθμιση της έκφρασης των συναπτικών γονιδίων (Εικόνα Α.8). Εικόνα Α.8 Μεταγραφική ρύθμιση γονιδίων στη νευρομυϊκή σύναψη. Οι υποδοχείς με δράση κινάσης Tyr ErbB 2/4 και η MuSK διεγείρουν αρκετούς σηματοδοτικούς καταρράκτες, οι οποίοι συνεργάζονται, ώστε να ξεκινήσει η μεταγραφική ενεργοποίηση των συναπτικών γονιδίων στους υποσυναπτικούς πυρήνες. Η ενεργοποίηση των ErbB υποδοχέων από τη NRG διεγείρει τα μονοπάτια MAPK και JNK μέσω του Ras. Το γεγονός αυτό οδηγεί στην έκφραση του c-jun και στη φωσφορυλίωση του μεταγραφικού παράγοντα GABP, ο 22

33 οποίος θα ενεργοποιήσει τη μεταγραφή ειδικών της σύναψης γονιδίων. Επίσης, η MuSK επάγει ενεργοποίηση της JNK μέσω του Rac/Cdc42, δηλώνοντας ότι τα 2 μονοπάτια συνδέονται. Ανασταλτικοί παράγοντες, όπως η ερμπίνη και η SHP2, καθώς και η γ, που αλληλεπιδρά με τη MuSK, απενεργοποιούν το σηματοδοτικό μονοπάτι του ErbB. Το ερωτηματικό επισημαίνει μια πιθανή ρύθμιση της αλληλεπίδρασης μεταξύ γ και MuSK από ένα ακόμα άγνωστο σήμα, το οποίο είτε δρα στη MuSK είτε σε άλλο σηματοδοτικό μόριο. Σε μια συστηματική έρευνα για συντρόφους της MuSK, ο Cartaud και συνεργάτες αναγνώρισαν την πρωτεΐνη γ σε μετασυναπτική μεμβράνη από τα ηλεκτρικά κύτταρα του Torpedo. Η πρωτεΐνη γ εντοπίζεται μαζί με τον υποδοχέα ακετυλοχολίνης στη νευρομυϊκή σύναψη από μύες αρουραίων. Οι πρωτεΐνες συνιστούν μια αναδυόμενη οικογένεια σηματοδοτικών μορίων, που βρίσκονται στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς και ενέχονται στο ενδοκυττάριο σήμα [71]. Μεταξύ των πολλών λειτουργιών στην κυτταρική σηματοδότηση, οι πρωτεΐνες είναι μείζονες ρυθμιστές των σηματοδοτικών μονοπατιών της MAPK και της PI3K. Υπερέκφραση της γ σε μυϊκά κύτταρα καταστέλλει ειδικά τη μεταγραφή αρκετών συναπτικών γονιδίων, όπως αυτών που κωδικοποιούν τις α, δ, ε-υπομονάδες του υποδοχέα ακετυλοχολίνης, τη ραψίνη και τη MuSK. Υπάρχουν ενδείξεις ότι η MuSK μπορεί να χρησιμεύει ως οδηγός, ώστε να συγκεντρωθεί η γ κοντά στη μετασυναπτική μεμβράνη. Σε πολλές περιπτώσεις, η αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών με άλλες πρωτεΐνες ρυθμίζεται από τη φωσφορυλίωση καταλοίπων Ser σε ομόφωνες αλληλουχίες στις πρωτεΐνες-στόχους [72]. Έχει δειχθεί ότι η αγκρίνη αλληλεπιδρά με μια ποικιλία εξωκυττάριων πρωτεϊνών, όπως α-δυστρογλυκάνη, ιντεγκρίνες, Neural Cell Adhesion Molecule (NCAM), αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών τύπου 2 (Fibroblast Growth Factor-2, FGF-2), ηπαρίνη και γλυκοσυμπλέγματα. Οι 2 πιο εκτεταμένα μελετημένες πρωτεΐνες που δεσμεύουν αγκρίνη είναι η λαμινίνη και η α-δυστρογλυκάνη. Έχει δειχθεί ότι η λαμινίνη προκαλεί συνάθροιση υποδοχέων ακετυλοχολίνης [73]. Η λαμινίνη δεν επάγει φωσφορυλίωση της MuSK, ούτε της β- υπομονάδας του υποδοχέα ακετυλοχολίνης και, αντίθετα από την αγκρίνη, μπορεί να επάγει συνάθροιση σε μυϊκά κύτταρα, που στερούνται MuSK. Τα επαγόμενα από λαμινίνη συσσωματώματα υποδοχέων ακετυλοχολίνης σχηματίζονται πιο αργά σε σχέση με τα αντίστοιχα που επάγονται από αγκρίνη και η συνάθροιση έχει παρατηρηθεί μόνο σε υψηλές συγκεντρώσεις λαμινίνης, περίπου nmoles/lt, σε σχέση με τα 100 pmoles/lt με 1 nmole/lt, για την αγκρίνη [74]. Η α-δυστρογλυκάνη είναι η πιο άφθονη δεσμευτική της αγκρίνης πρωτεΐνη στη νευρομυϊκή σύναψη και συναθροίζεται μαζί με τον υποδοχέα ακετυλοχολίνης. Πρόσφατα 23