Διδακτορική Διατριβή

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ-ΡΕΥΜΑΤΟΛΟΓΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΝΔΡΕΑΣ Π. ΑΝΤΩΝΟΠΟΥΛΟΣ Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών «Κλινικές και Κλινικοεργαστηριακές Ειδικότητες» Διδακτορική Διατριβή «Μελέτη μηχανισμών επαγωγής αυτοανοσίας σε ασθενείς με συστηματικά ρευματικά νοσήματα που λαμβάνουν θεραπεία με αντι-tnfα βιολογικούς παράγοντες» Μαρία Π. Καραμπέτσου Ιατρός Πάτρα,

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ-ΡΕΥΜΑΤΟΛΟΓΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΝΔΡΕΑΣ Π. ΑΝΤΩΝΟΠΟΥΛΟΣ Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών «Κλινικές και Κλινικοεργαστηριακές Ειδικότητες» Διδακτορική Διατριβή «Μελέτη μηχανισμών επαγωγής αυτοανοσίας σε ασθενείς με συστηματικά ρευματικά νοσήματα που λαμβάνουν θεραπεία με αντι-tnfα βιολογικούς παράγοντες» Μαρία Π. Καραμπέτσου Ιατρός Πάτρα,

3 Τριμελής Συμβουλευτική Επιτροπή Ανδρέας Π. Αντωνόπουλος (επιβλέπων): Καθηγητής Σταμάτης-Νικόλαος Λιόσης: Αναπληρωτής Καθηγητής Δημήτριος Δαούσης: Λέκτορας Επταμελής Εξεταστική Επιτροπή Ανδρέας Π. Αντωνόπουλος: Kαθηγητής Φωτεινή Παληογιάννη: Καθηγήτρια Σταμάτης-Νικόλαος Λιόσης: Αναπληρωτής Καθηγητής Ζωή Λυγερού: Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Aθανάσιος Τσαμαντάς: Επίκουρος Καθηγητής Δημήτριος Δαούσης: Λέκτορας Έλενα Σολωμού: Λέκτορας 3

4 ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ Γεννήθηκα στην Καλαμάτα Μεσσηνίας το 1983 και μεγάλωσα στην Πάτρα μαζί με τους γονείς και τα δύο αδέρφια μου. Αποφοίτησα από το 6 ο Γενικό Λύκειο Πατρών το 2000 και το ίδιο έτος, μετά από Πανελλαδικές Εξετάσεις, εισήχθην στην Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου της Πάτρας. Έλαβα το πτυχίο μου το 2006 και την ίδια χρονιά έγινα δεκτή στο μεταπτυχιακό πρόγραμμα σπουδών «Κλινικές και Κλινικοεργαστηριακές Ειδικότητες» της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών για την απόκτηση διδακτορικού διπλώματος στον τομέα της ρευματολογίας. Από τον Ιούνιο του 2010 μεχρι τον Δεκέμβρη του 2012 εργάστηκα στο Περιφερειακό Γενικό Νοσοκομείο Αιγίου ως ειδικευόμενη Παθολογίας με στόχο την απόκτηση τίτλου ειδικότητας στην Ρευματολογία. Η διατριβή μου, το πειραματικό μέρος της οποίας ολοκληρώθηκε τον Μάιο του 2010, εκπονήθηκε εξ ολοκλήρου στο νεοσύστατο τότε εργαστήριο Ρευματολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών. Διαφορετικά τμήματα της μελέτης παρουσιάστηκαν στα εξής επιστημονικά συνέδρια: Ευρωπαϊκό Συνέδριο Ρευματολογίας (European League Against Rheumatism) για το έτος 2009 (Ιούνιος 10-13, Κοπεγχάγη), Maria P. Karampetsou, Andrew P. Andonopoulos, Stamatis-Nick C. Liossis: Anti-TNFα treatment-induced changes in the expression of B cell surface CD20 and B cell Lyn content. ACR (Αmerican College of Rheumatology) 2009 (Oκτώβριος 16-21, Φιλαδέλφεια, ΗΠΑ): Maria Karampetsou, Fotini Paliogianni, Andrew P. Andonopoulos and Stamatis-Nick C. Liossis: Phenotypical and functional aberrations of B cells in patients treated with anti-τνfα agents. Arthritis and Rheum. 2009; 60 (10): S

5 22 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ρευματολογίας 2010 (Δεκέμβριος 01-04, Αθήνα): Μαρία Καραμπέτσου, Ανδρέας Αντωνόπουλος, Σταμάτης-Νίκος Λιόσης: Φαινοτυπικές και λειτουργικές διαταραχές των Β λεμφοκυττάρων ασθενών που λαμβάνουν θεραπεία με αντι-tnfα βιολογικούς παράγοντες Η μελέτη έχει δημοσιευτεί σε έγκυρο ξενόγλωσσο περιοδικό που λειτουργεί με κριτές: Karampetsou MP, Andonopoulos AP, Liossis SN. Treatment with ΤΝFα blockers induces phenotypical and functional aberrations in peripheral B cells. Clin Immunol Jul;140(1):8-17 5

6 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Θα ήθελα να ευχαριστήσω όσους συνέβαλαν στην ολοκλήρωση της παρούσας διατριβής: Τον επιβλέποντα καθηγητή κ. Ανδρέα Αντωνόπουλο, ο οποίος πίστεψε σε μένα και τις δυνατότητές μου. Μου έδωσε τη μοναδική ευκαιρία να ασχοληθώ με τη βασική έρευνα και να φέρω σε πέρας αυτήν τη μελέτη. Θα είναι πάντα για εμένα σημείο αναφοράς, καθώς μέσα από τη διδασκαλία του ήρθα για πρώτη φορά σε επαφή με το αντικείμενο της ρευματολογίας, ενώ κατά τη διάρκεια εκπόνησης της διατριβής με καθοδήγησε με σταθερότητα και με βοήθησε να κατανοήσω τα πολύπλοκα μονοπάτια των παθογενετικών μηχανισμών των ρευματικών νοσημάτων. Τον αναπλ.καθηγητή κ.σταμάτιο-νικόλαο Λιόση, στον οποίο οφείλω πάρα πολλά, καθώς με μύησε στις αρχές της βασικής έρευνας και συγκρότησε την επιστημονική μου σκέψη, με εκπαίδευσε ο ίδιος βήμα προς βήμα στις τεχνικές της μοριακής βιολογίας και μου μετέδωσε αφειδώς τις γνώσεις του στην ανοσολογία. Μου συμπαραστάθηκε σε όλη μου την προσπάθεια από την αρχή και υπό την καθοδήγησή του κατάφερα να πραγματοποιήσω τη συγγραφή των πρώτων επιστημονικών εργασιών μου. Όλους τους ιατρούς του Ρευματολογικού Τμήματος του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών, ειδικούς και ειδικευόμενους, των οποίων η συμβολή στην ανεύρεση ασθενών και στη συλλογή των δειγμάτων υπήρξε καθοριστική, καθώς και τους ασθενείς και τους υγιείς εθελοντές που συμμετείχαν στη μελέτη. Την κα Μαρίνα Καρακάντζα (αναπλ. Καθηγήτρια Αιματολογίας) και το προσωπικό του εργαστηρίου κυτταρομετρίας ροής του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών 6

7 για την παραχώρηση κυτταρομετρητή ροής για τη διενέργεια μεγάλου τμήματος των πειραμάτων. Την κα Έλενα Σολωμού (λέκτορας Παθολογίας/Αιματολογίας) καθώς και την κα Ευσταθία Γιαννοπούλου (χημικός, ΜSc, PhD) για τις πολύτιμες συμβουλές τους στα πρώτα μου βήματα στο εργαστήριο Την οικογένειά μου, γιατί χωρίς την υποστήριξη και την αμέριστη συμπαράστασή τους σε κάθε μου απόφαση τίποτε δεν θα είχε γίνει πραγματικότητα. 7

8 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ 10 Από την ανακάλυψη του TNFα στους αντι-tnfα βιολογικούς παράγοντες 10 Αντι-TNFα βιολογικοί παράγοντες και προφίλ ασφαλείας: κλινικοεργαστηριακά στοιχεία επαγωγής αυτοανοσίας μετά από θεραπεία με ανταγωνιστές του TNFα 15 Ο ρόλος του ΤΝFα στα πειραματικά μοντέλα λύκου 18 Δεδομένα από τον άνθρωπο για το ρόλο του ΤΝFα στον ΣΕΛ 21 Πιθανοί μηχανισμοί αυτοανοσίας από την χρήση των αντι-tnfα βιολογικών παραγόντων 23 Απόπτωση 24 H μείωση των επιπέδων της CRP ως πιθανός μηχανισμός επαγωγής αυτοανοσίας 26 Ο πιθανός ρόλος των Τ-λεμφοκυττάρων στην αντι-tnfα επαγόμενη αυτοανοσία 27 Πολυκλωνική ενεργοποίηση των Β λεμφοκυττάρων 29 Το Β λεμφοκύτταρο 31 Η φυσιολογία της διέγερσης του ώριμου Β λεμφοκυττάρου 31 Ο διπλός ρυθμιστικός ρόλος της Lyn στο Β λεμφοκύτταρο 36 Φαινοτυπικές και λειτουργικές διαταραχές του Β λεμφοκυττάρου στον ΣΕΛ 37 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΜΕΛΕΤΗΣ 40 ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 42 Ασθενείς και υγιείς μάρτυρες 42 Κύτταρα 43 Απομόνωση μονοπυρήνων κυττάρων περιφερικού αίματος 43 Απομόνωση Β λεμφοκυττάρων από ΜΚΠΑ 44 Κυτταρομετρία ροής 46 Ανοσοαποτύπωμα κατά Western 50 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 54 Τα επίπεδα της Lyn αυξάνονται στα Β λεμφοκύτταρα ασθενών που λαμβάνουν θεραπεία με αντι-tnfα βιολογικό παράγοντα. 54 Η αύξηση των επιπέδων της κινάσης Lyn σχετίζεται με αύξηση της ενζυματικής της δραστηριότητας σε ασθενείς που λαμβάνουν θεραπεία με αντι-tnfα βιολογικούς παράγοντες 58 8

9 Αύξηση των επιπέδων των φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών σε θέσεις τυροσίνης σε μηδιεγερμένα Β λεμφοκύτταρα ασθενών υπό θεραπεία με ανταγωνιστές του TNFα. 60 H θεραπεία με αντι-τνfα επάγει την έκφραση του CD20, αλλά όχι του CD21 στην επιφάνεια των περιφερικών Β λεμφοκυττάρων 62 Σε ασθενείς υπό θεραπεία με αντι-tnfα βιολογικούς παράγοντες αυξάνεται το ποσοστό των κυκλοφορούντων CD5 + B λεμφοκυττάρων 65 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 67 ΧΡΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗ 73 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 74 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 85 ABSTRACT 87 ΑΡΘΡΟ 89 9

10 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Από την ανακάλυψη του TNFα στους αντι-tnfα βιολογικούς παράγοντες Ο παράγοντας νέκρωσης των όγκων (tumor necrosis factor-alpha, ΤΝFα) είναι μια μικρού μεγέθους διαμεμβρανική πρωτεΐνη τύπου ΙΙ, της οποίας η ύπαρξη διαπιστώθηκε για πρώτη φορά στις αρχές τις δεκαετίας του 1970, και η οποία οφείλει το όνομά της στην ικανότητά της να προκαλεί τη λύση ορισμένων καρκινικών κυττάρων (Granger GA, 1969) (Helson L, 1975). Το 1984 επετεύχθη η κλωνοποίηση του cdna που κωδικοποιεί τον ανθρώπινο TNFα σε κύτταρα Ε.Coli και σύντομα διαπιστώθηκε ότι ο TNFα και η καχεκτίνη, μία πρωτεΐνη που εθεωρείτο υπεύθυνη για πρόκληση καχεξίας και πυρετού, ήταν τελικά το ίδιο μόριο. Μαζί με τον ΤΝFβ (λεμφοτοξίνη) ο ΤΝFα αποτελεί πρότυπο μέλος μιας ευρύτερης ομάδας χημικών μορίων με δομική και λειτουργική ομολογία, η οποία πλέον είναι γνωστή ως υπεροικογένεια του TNF και η οποία σήμερα αριθμεί πάνω από 40 μέλη (Hehlgans T, 2005). Ο TNFα, όπως και οι υπόλοιποι προσδέτες που ανήκουν στην υπεροικογένεια του TNF, είναι βιολογικά δραστικός υπό μορφή τριμερούς (Σχήμα 1). Η κάθε πρωτεϊνική αλυσίδα τουtnfα λαμβάνει δευτεροταγή διαμόρφωση «β-πτυχωτού φύλλου» και οι πρωτεϊνικές αλυσίδες συγκρατώνται μεταξύ τους με μη-ομοιπολικούς και υδρόφοβους δεσμούς που αναπτύσσονται μεταξύ αμινοξέων με αρωματικούς δακτυλίους, σχηματίζοντας ομοτριμερείς δομές. O ΤNFα αρχικά εκφράζεται ως διαμεμβρανική πρωτεΐνη. Mε τη μεσολάβηση ειδικών πρωτεολυτικών ενζύμων (ΤΝFa converting enzyme, TACE ή ADAM17) ο TNFα αποκόπτεται και απελευθερώνεται από την επιφάνεια του κυττάρου που τον εκφράζει, ώστε να ασκήσει τη δράση του σε γειτονικά κύτταρα. Τόσο η διαμεμβρανική (μεγέθους 10

11 25kDa) όσο και η διαλυτή μορφή του TNFα (μεγέθους 17kDa) είναι βιολογικά δραστικές ουσίες. Σχήμα 1: Η κρυσταλλική τριτοταγής δομή του TNFα (Α) και του εξωκυτταρίου τμήματος του p55τnfr υποδοχέα (Β) Σήμερα ο ΤΝFα θεωρείται ως ένας από τους κύριους ενορχηστρωτές της φλεγμονώδους απάντησης του οργανισμού με βασικό στόχο την προστασία του ξενιστή από λοιμώξεις (Σχήμα 2). Παράγεται κυρίως από ενεργοποιημένα μονοπύρηνα / μακροφάγα, φυσικούς φονείς (natural killer cells) και λεμφοκύτταρα (Kornbluth RS, 1986) (Paya CV, 1988) (Caron G, 1999) (Kinkhabwala M, 1990) (Boussiotis VA, 1994). Ο ΤΝFα ασκεί τη δράση του μέσω των δύο μεμβρανικών υποδοχέων του (p55tnfr και p75tnfr) και συμμετέχει στη ρύθμιση ενός ευρέος φάσματος δραστηριοτήτων σε επίπεδο κυττάρου όπως είναι ο πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση, η επιβίωση και η απόπτωση (Vandenabeele P, 1995). Μεταξύ άλλων, λειτουργεί ως αυξητικός παράγοντας για τα Τ και Β λεμφοκύτταρα, επάγει την παραγωγή κυτοκινών και την παραγωγή πρωτεϊνών οξείας φάσης, ρυθμίζει την 11

12 έκφραση προσκολλητικών μορίων και μορίων του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας και προάγει τον σχηματισμό ανοσοσφαιρινών (Boussiotis VA, 1994) (Hackett RJ, 1988) (Kehrl JH, 1987) (Jelinek DF, 139) (Yokota S, 1988) (Parry SL, 1997) (Lou J, 1996) (Wedgwood JF, 1988) (Vidovic M, 1990) (Aversa G, 1993). Επιπλέον συμμετέχει στη διαδικασία της οργανογένεσης και στη μετέπειτα διατήρηση της αρχιτεκτονικής δομής των περιφερικών λεμφικών οργάνων (Hehlgans T, 2005) (Pfeffer, 2003). Παρόλ αυτά, ο ΤΝFα έχει συσχετιστεί και με καταστάσεις λιγότερο ευνοϊκές για τον ξενιστή, όπως είναι η καχεξία, η σήψη, τα πυρετικά σύνδρομα και τα αυτοάνοσα φλεγμονώδη νοσήματα. Σχήμα 2: οι κύριες βιολογικές δράσεις του TNFα. Ο ΤNFα παράγεται από ενεργοποιημένα μονοκύτταρα/μακροφάγα (MACRO), φυσικούς φονείς (ΝΚ) και λεμφοκύτταρα (LYMPH) και ασκεί τις δράσεις του σε κύτταρα και ιστούς-στόχους, προάγοντας τη φλεγμονώδη απάντηση. Η δημιουργία διαγονιδιακών μοντέλων ποντικών που υπερεκφράζουν τον TNFα αποτέλεσαν ένα πολύ χρήσιμο εργαλείο στην προσπάθεια κατανόησης του ρόλου που 12

13 διαδραματίζει ο TNFα στην παθογένεια αυτοάνοσων φλεγμονωδών νοσημάτων όπως είναι η ρευματοειδής αρθρίτιδα (ΡΑ), η αγκυλοποιητική σπονδυλίτιδα (ΑΣ) και τα φλεγμονώδη νοσήματα του εντέρου (ΦΝΕ) (Keffer J, 1991) (Kontoyiannis D, 1999) (Crew MD, 1998) (Li P, 2003). Επιπλέον, έχουν βρεθεί αυξημένα επίπεδα TNFα τόσο στον ορό όσο και στους φλεγμαίνοντες ιστούς ασθενών με ΡΑ, ΑΣ ή ΦΝΕ, καθιστώντας έτσι τον TNFα κύριο θεραπευτικό στόχο (Feldmann M, 1996) (Petrovic- Rackov L, 2006) (Gratacós J, 1994) (Braun J, 1995) (McCormack G, 2001). Σήμερα οι αντι-τνfα βιολογικοί παράγοντες (infliximab, adalimumab και etanercept) έχουν εγκριθεί και χρησιμοποιούνται ευρέως για την αντιμετώπιση της ΡΑ, της ΑΣ, της νόσου του Crohn, της ψωρίασης, της ψωριασικής αρθρίτιδας και της Νεανικής Ιδιοπαθούς Αρθρίτιδας (ΝΙΑ) (Lin J, 2008) (Sfikakis, 2010) (Πίνακας 1). Προσφάτως, δύο νέοι αντι-τνfα βιολογικοί παράγοντες εγκρίθηκαν και έκαναν την εμφάνισή τους στην κλινική πράξη, το certolizumab pegol και το golimumab. Το certolizumab pegol απαρτίζεται από το F(ab) τμήμα ενός ανθρώπινου αντισώματος συζευγμένου με γλυκόλη του πολυαιθυλενίου (PEG) και έχει λάβει ένδειξη για τη θεραπεία της ΡΑ και της νόσου του Crohn. Το golimumab είναι ένα πλήρως ανθρώπινο IgG1κ μονοκλωνικό αντίσωμα και ενδείκνυται για την αντιμετώπιση της ΡΑ, της ΑΣ και της ψωριασικής αρθρίτιδας (Πίνακας 1). 13

14 Πίνακας 1: Εγκεκριμένοι αντι-tnfα βιολογικοί παράγοντες, δομή φαρμακευτικού μορίου, οδός χορήγησης, δοσολογία και επίσημες ενδείξεις χορήγησης Αντι-ΤΝFα βιολογικός παράγοντας Εμπορική ονομασία Infliximab Remicade Adalimumab Humira Etarnercept Enbrel Certolizumab pegol Cimzia Δομή μορίου Χιμαιρικό μονοκλωνικό IgG1 αντίσωμα Πλήρως ανθρώπινο ΙgG1 μονοκλωνικό αντίσωμα Σύζευξη Fc τμήματος IgG1 αντισώματος με το εξωκυττάριο τμήμα του p75tnfr Σύζευξη F(ab) τμήματος ανθρώπινου αντισώματος με δύο μόρια PEG Οδός χορήγησης (για ενήλικες) Ι.V 3-10mg/kg ΣΒ Αρχικά: 0, 2 η και 6 η εβδομάδα Δόση συντήρησης: κάθε 6-8 εβδομάδες s.c 40-80mg Ανα 1-2 εβδομάδες s.c 50mg Άπαξ εβδομαδιαίως s.c mg Αρχικά: 400mg 0, 2 η και 4 η εβδομάδα Δόση συντήρησης: 200mg κάθε 15 ημέρες ή 400mg άπαξ μηνιαίως Eπίσημες ενδείξεις χορήγησης ΡΑ, ΑΣ, ΨΑ, ψωρίαση, νόσος Crohn, ελκώδης κολίτιδα ΡΑ, ΑΣ, ΨΑ, ψωρίαση, νόσος Crohn ΡΑ, νεανική ρευματοειδής πολυαρθρίτιδα, ΨΑ, ΑΣ, ψωρίαση ΡΑ, νόσος Crohn Golimumab Simponi Πλήρως ανθρώπινο IgG1κ μονοκλωνικό αντίσωμα s.c 50mg Άπαξ μηνιαίως ΡΑ, ΑΣ, ΨΑ 14

15 Αντι-TNFα βιολογικοί παράγοντες και προφίλ ασφαλείας: κλινικοεργαστηριακά στοιχεία επαγωγής αυτοανοσίας μετά από θεραπεία με ανταγωνιστές του TNFα Οι αντι-τνfα βιολογικοί παραγόντες έχουν αποδειχθεί ιδιαιτέρως αποτελεσματικοί όταν χορηγούνται σε συνδυασμό με τροποποιητικά της νόσου αντιρευματικά φάρμακα (disease modifying anti-rheumatic drugs, DMARDs) ή ακόμα και ως μονοθεραπεία. Μέχρι σήμερα, πάνω από ασθενείς παγκοσμίως έχουν λάβει θεραπεία με κάποιον από τους τρεις πρώτους αντι-tnfα βιολογικούς παράγοντες και σε αρκετές περιπτώσεις όχι για τις παθήσεις για τις οποίες έχουν λάβει επίσημη έγκριση (Sfikakis, 2010). Επιπλέον, οι αντι-τνfα παράγοντες έχουν επιδείξει ένα αρκετά ικανοποιητικό προφίλ ασφαλείας, με τα κυριότερα προβλήματα να είναι μια κάπως αυξημένη προδιάθεση σε ευκαιριακές λοιμώξεις, ενεργοποίηση λανθάνουσας φυματίωσης και αντιδράσεις υπερευαισθησίας κατά την έγχυση (Lin J, 2008). Ωστόσο σύντομα έγινε αντιληπτό ότι οι ασθενείς που λαμβάνουν θεραπεία με αντι-tnfα βιολογικούς παράγοντες εμφανίζουν συχνά στον ορό τους αντιπυρηνικά αντισώματα (ΑΝΑ) de novo (De Rycke L, 2003) (Vermeire S, 2003) (Ferraro-Peyret C, 2004) (Eriksson C, 2005) (Caramaschi P, 2006) (Alessandri C, 2007). Σύμφωνα με μερικές μελέτες, οι ασθενείς με ΡΑ ή ΑΣ υπό αγωγή με infliximab που αναπτύσσουν ΑΝΑ ξεπερνούν το 80% (De Rycke L, 2003) (Ferraro-Peyret C, 2004) (Caramaschi P, 2006). Το ποσοστό αυτό φαίνεται να είναι σχετικά χαμηλότερο όσον αφορά το etanercept, ενώ οι ασθενείς υπό adalimumab μπορεί να εμφανίσουν αυτοαντισώματα μεν, αλλά αρκετά σπανιότερα σε σχέση με τους άλλους δύο αντι- TNFα βιολογικούς παράγοντες σύμφωνα με τα μέχρι τώρα δεδομένα. (Atzeni F, 15

16 2005) (De Rycke L B. D., 2005) (Bacquet-Deschryver H, 2008) (Atzeni F S.-P. P., 2006) (Weinblatt ME, 2003). Βιβλιογραφικές αναφορές, αν και αριθμητικά λίγες, για την επαγωγή ΑΝΑ υπάρχουν και για τους νεότερους αντι-tnfα παράγοντες (certolizumab pegol και golimumab) (Inman RD, 2008) (Schreiber S & Investigators., 2007). Λιγότερο συχνή, αλλά πιο σημαντική, είναι η εμφάνιση αντισωμάτων έναντι της διπλής έλικας του DNA (αντι-dsdna), τα οποία είναι χαρακτηριστικά του συστηματικού ερυθηματώδους λύκου (ΣΕΛ) (De Rycke L K. E., 2003) (Vermeire S, 2003) (Ferraro-Peyret C, 2004) (Eriksson C, 2005) (Caramaschi P, 2006) (Alessandri C, 2007) (Atzeni F T. M.-P., 2005). Το ποσοστό των ασθενών που τελικά αναπτύσσουν αντι-dsdna αντισώματα ποικίλει στις διάφορες μελέτες από 0% μέχρι 78% (Fusconi M, 2007), ενώ κατά καιρούς έχει αναφερθεί και η εμφάνιση άλλων αυτοαντισωμάτων, όπως έναντι καρδιολιπίνης (Ferraro-Peyret C, 2004) (Ferraccioli GF, 2002) (De Bandt M & Inflammation., 2005) (Chadha T, 2006), ΕΝΑ (De Rycke L K. E., 2003) (De Bandt M & Inflammation., 2005), ιστονών (De Rycke L K. E., 2003) (Vermeire S, 2003) (Chadha T, 2006) (Ali Y, 2002) (Carlson E, 2003) (Klapman JB, 2003), ακόμα δε και ουδετεροφιλικών κυτταροπλασματικών ή περιπυρηνικών αυτοαντισωμάτων (Jarrett SJ, Anti-tumor necrosis factor-alpha therapy-induced vasculitis: case series., 2003) (Ashok D, C-ANCA positive systemic vasculitis in a patient with rheumatoid arthritis treated with infliximab., 2008) (Simms R, ANCA-associated renal vasculitis following anti-tumor necrosis factor alpha therapy., 2008). Εκτός από την de novo εμφάνιση ή αύξηση του προϋπάρχοντος τίτλου των αυτοαντισωμάτων, ένα μικρό ποσοστό των ασθενών αναπτύσσουν ένα κλινικό σύνδρομο που προσομοιάζει με ΣΕΛ. Σύμφωνα με τη μελέτη των DeBandt και συν, 16

17 η επίπτωση του συνδρόμου δεν ξεπερνάει το 1% (De Bandt M & Inflammation., 2005). Το σύνδρομο είναι συνήθως ήπιας βαρύτητας και περιλαμβάνει κυρίως δερματικές εκδηλώσεις (Εικόνα 1). A B Εικόνα 1: (Α )έκθυση εκτεταμένου ερυθηματώδους εξανθήματος σε κορμό και άνω άκρα σε ασθενή με νόσο Still των ενηλίκων που έλαβε θεραπεία με etanercept και (Β) φωτοευαίσθητο εξάνθημα τύπου δισκοειδούς λύκου σε ασθενή με νόσο Crohn μετά από αγωγή με infliximab. (Costa MF, 2008) Ωστόσο, έχουν περιγραφεί και περιπτώσεις ασθενών οι οποίοι ανέπτυξαν συστηματική νόσο με επιδείνωση της αρθρίτιδας, μυαλγίες, πυρετό,κακουχία, κυτταροπενίες και πτώση των επιπέδων του συμπληρώματος (Klapman JB, 2003), ενώ ακόμα σπανιότερα έχουν αναφερθεί περιπτώσεις νεφρίτιδας με τυπική παθολογοανατομική εικόνα νεφρίτιδας λύκου (Stokes MB, 2005), περικαρδίτιδας (Burke JP, 2008), πλευρίτιδας και εν τω βάθει φλεβοθρόμβωσης (De Bandt M & Inflammation., 2005). Τόσο η αύξηση του τίτλου των αυτοαντισωμάτων όσο και το σύνδρομο του λύκου είναι παροδικά φαινόμενα και συνήθως υφίονται μέσα σε διάστημα μερικών εβδομάδων από τη διακοπή της θεραπείας με αντι-tnfα (De Bandt M & Inflammation., 2005) (Debandt M, 2003), αλλά μπορεί σε κάποιες 17

18 περιπτώσεις να χρειαστεί πρόσκαιρη αντιμετώπιση με κορτικοστεροειδή ή άλλη ανοσοκατασταλτική αγωγή (De Bandt M & Inflammation., 2005) (Klapman JB, 2003) (Stokes MB, 2005) (Costa MF, 2008). Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι επαναχορήγηση της θεραπείας με αντι-tnfα μπορεί να οδηγήσει σε περαιτέρω αύξηση του τίτλου των αυτοαντισωμάτων και σε επανεμφάνιση των κλινικών εκδηλώσεων υποδηλώνοντας την πιθανή ύπαρξη μιας αιτιολογικής συσχέτισης ανάμεσα στη χορήγηση ανταγωνιστών του TNFα και την εκδήλωση του συνδρόμου λύκου (Costa MF, 2008). Η αυτοανοσία που επάγεται από τη χρήση των αντι-tnfα βιολογικών παραγόντων θα μπορούσε να θεωρηθεί περίπτωση τυπικού φαρμακογενούς ερυθηματώδους λύκου. Ωστόσο, η συχνότερη παρουσία αντιdsdna αντισωμάτων και υποσυμπληρωματιναιμίας καθώς και η περιγραφή τυπικής νεφρίτιδας λύκου αποτελούν εκδηλώσεις ιδιοπαθούς ΣΕΛ και όχι φαρμακογενούς λύκου, ο οποίος χαρακτηρίζεται κυρίως από την παρουσία αυτοαντισωμάτων έναντι ιστονών και σπανιότατα από αντι-dsdna αντισώματα ή /και χαμηλό συμπλήρωμα (Costa MF, 2008). Ο ρόλος του ΤΝFα στα πειραματικά μοντέλα λύκου Ο ρόλος του TNFα στην αυτοανοσία δεν είναι απόλυτα ξεκαθαρισμένος. Φαίνεται, όμως, κυρίως από μελέτες σε ορισμένα πειραματικά μοντέλα λύκου, αλλά όχι σε όλα, ότι υπάρχει κάποια συσχέτιση ανάμεσα σε μειωμένα επίπεδα TNFα και την εμφάνιση λύκου και για το λόγο αυτό έχει προταθεί ότι ο TNFα ενδεχομένως να έχει προστατευτικό ρόλο στον ΣΕΛ. Οι ισχυρότερες ενδείξεις που διαθέτουμε σχετικά με τον πιθανό προστατευτικό ρόλο του TNFα στον ΣΕΛ προέρχονται από μελέτες στα F1 υβρίδια των NZB/NZW 18

19 ποντικών. Τα ποντίκια αυτά εμφανίζουν κατά τη διάρκεια της ζωής τους σύνδρομο λύκου χαρακτηριζόμενο από παραγωγή αυτοαντισωμάτων και σοβαρή σπειραματονεφρίτιδα που οδηγεί σε πρόωρο θάνατο. Τα επίπεδα του TNFα είναι χαμηλά στα (NZB/NZW)F1 ποντίκια, εξαιτίας ενός ελαττωματικού γονιδίου που κληρονομούν από τον NZW γονέα. Η χορήγηση υψηλών δόσεων TNFα υπό μορφή ενέσεων σε ενήλικα (NZB/NZW)F1 ποντίκια καταφέρνει να καθυστερήσει, χωρίς όμως να αποτρέψει πλήρως, τη νεφρική νόσο, ενώ ο τίτλος των αντι-dsdna αντισωμάτων δεν αλλάζει από την αγωγή αυτή (Jacob CO, 1988) (Gordon C, 1989). Εξίσου προστατευτική αποδείχθηκε να είναι και η χορήγηση αντισώματος έναντι της IL-10, το οποίο μέσω αναστολής της IL-10 επάγει την παραγωγή TNFα, μόνο που στην περίπτωση αυτή παρατηρήθηκε παράλληλα και μείωση του τίτλου των IgG και IgM αντισωμάτων (Ishida H, 1994). Σε μια προσπάθεια να αποσαφηνιστεί εάν η μειωμένη παραγωγή TNFα μπορεί να ευθύνεται για την ανάπτυξη αυτοανοσίας στα (NZB/NZW)F1 per se ή εάν ταυτόχρονα παίζουν ρόλο και άλλοι γενετικοί παράγοντες, η ομάδα του Κόλλια και συν, κατάφερε να δημιουργήσει ένα υβρίδιο από τη διασταύρωση NZW ποντικών με ποντίκια που ήταν γενετικώς τροποποιημένα ώστε να μην παράγουν TNFα. Το αποτέλεσμα ήταν ένα υβρίδιο με φαινότυπο παρόμοιο με αυτόν που παρουσιάζεται στα (NZB/NZW)F1. Εμφανίζουν, δηλαδή, σοβαρή σπειραματονεφρίτιδα, αυξημένο πολλαπλασιασμό των Β κυττάρων μετά από πολυκλωνική διέγερση και αυξημένα επίπεδα IgG τύπου αντι-dsdna αντισωμάτων, σε αντίθεση με την ήπια αυτοάνοση συνδρομή και τα μη-παθογόνα αυτοαντισώματα τύπου IgM που απαντώνται στα NZB ποντίκια (Kontoyiannis D K. G., 2000). Λαμβάνοντας, επομένως, υπ όψιν τα παραπάνω φαίνεται ότι η μειωμένη έκφραση του TNFα, μέσα στα πλαίσια ενός προδιαθεσιακού γενετικού περιβάλλοντος, αρκεί για να πυροδοτήσει συστηματική αυτοανοσία. 19

20 Παρόλ αυτά, δεν συμπεριφέρονται όλα τα πειραματικά μοντέλα λύκου όπως τα (NZB/NZW)F1 ποντίκια. Ένα τέτοιο παράδειγμα είναι τα MRL/lpr ποντίκια, στα οποία όχι μόνο δεν είναι μειωμένα τα επίπεδα του TNFα στον ορό, αλλά αντίθετα τα επίπεδα αυξάνονται προοδευτικά και η μέγιστη τιμή τους συμπίπτει χρονικά με την έναρξη νεφρίτιδας, πράγμα που θα μπορούσε να σημαίνει ότι ο ΤΝFα έχει παθογενετικό ρόλο στην ανάπτυξη νεφρικής νόσου (Yokoyama H, 1995). Ένα επιπλέον στοιχείο που συνηγορεί υπέρ συμμετοχής του TNFα στην παθογένεια της νεφρίτιδας είναι η αυξημένη έκφραση του mrna του TNFα στους νεφρούς των MRL/lpr ποντικών, ακόμα και στους νεφρούς των (NZB/NZW)F1 ποντικών, καθώς και το γεγονός ότι τα επίπεδα του TNFα mrna συσχετίζονται με την ενεργότητα της νόσου (Boswell JM, 1988) (Brennan DC, 1989). Η θεραπεία με αντι-tnfα δεν υπήρξε αποτελεσματική στην αντιμετώπιση της νεφρίτιδας στα MRL/lpr ποντίκια ούτε επηρέασε τους τίτλους των αυτοαντισωμάτων. Υπήρξε, όμως, ωφέλιμη στην αντιμετώπιση άλλων φλεγμονωδών εκδηλώσεων, όπως για παράδειγμα στην αρθρίτιδα και την πνευμονική νόσο (Kim N, 2002). Παραδόξως, η νεφρίτιδα στα ποντίκια αυτά ανταποκρίθηκε στη χορήγηση υψηλών δόσεων TNFα, καθώς και στη θεραπεία με ισχυρούς επαγωγείς του TNFα όπως είναι ο παράγοντας ΟΚ-432. (Jacob CO H. F., 1991) (Mihara M, 1989). Ενώ φαίνεται, σύμφωνα με τα παραπάνω, ότι ο ΤΝFα ασκεί προστατευτική δράση στα (NZB/NZW)F1 ποντίκια, και σε κάποιο βαθμό και στα MRL/lpr στελέχη, το ζήτημα αυτό περιπλέχθηκε όταν διαπιστώθηκε ότι η κλινική έκβαση συσχετιζόταν με τη δοσολογία των χορηγουμένων ενέσεων και από την ηλικία των ποντικών. Χαμηλές δόσεις ΤΝFα ή χορήγηση TNFα σε νεογέννητα (NZB/NZW)F1 ποντίκια είχαν ως αποτέλεσμα να επιταχυνθεί η εμφάνιση σπειραματονεφρίτιδας (Brennan DC, 1989). Αντίθετα, κάποια πειραματικά μοντέλα λύκου σαφώς επωφελούνται από 20

21 την αναστολή του TNFα. Ένα τέτοιο παράδειγμα είναι τα ποντίκια με έλλειψη τριστετραπρολίνης. Η τριστετραπρολίνη είναι μια πρωτεΐνη η οποία προσδένεται στον υποκινητή του mrna του TNFα προκαλώντας την αποσταθεροποίησή του, με συνέπεια η έλλειψη τριστετραπρολίνης να οδηγεί σε υπερπαραγωγή TNFα (Carballo E, 1998) (Lai WS, 1999). Τα ποντίκια αυτά, αν και φαίνονται υγιή κατά τη γέννηση, σύντομα αναπτύσσουν διαβρωτική αρθρίτιδα, δερματίτιδα και υψηλούς τίτλους αυτοαντισωμάτων. Οι εκδηλώσεις αυτές, όμως, είναι δυνατόν να προληφθούν όταν τους χορηγηθεί σε νεαρή ηλικία μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι του TNFα (Taylor GA, 1996). Ένα άλλο παράδειγμα πειραματικού μοντέλου λύκου που επωφελείται από τους αντι-tnfα βιολογικούς παράγοντες είναι τα BXSB ποντίκια. Τα BXSB ποντίκια χαρακτηρίζονται από υψηλά επίπεδα TNFα στον ορό και η χορήγηση TNFα δεν μετέβαλλε με κανέναν τρόπο τον φαινότυπό τους, ενώ η αναστολή του ΤΝFα οδήγησε σε βελτίωση των νεφρικών βλαβών και πτώση των αντι-dsdna αντισωμάτων στον ορό (Li WD, 2006) (Dong YJ, 2003). Δεδομένα από τον άνθρωπο για το ρόλο του ΤΝFα στον ΣΕΛ Η ετερογένεια των επιπέδων του TNFα που παρατηρείται στον ορό των πειραματικών μοντέλων παρατηρείται και στους ασθενείς που πάσχουν από ΣΕΛ. Αρχικές μελέτες είχαν δείξει ότι οι ασθενείς με ΣΕΛ που φέρουν τους απλότυπους HLA-DR2 και HLA-DQw1 παρουσιάζουν μειωμένη παραγωγή TNFα και αυξημένες πιθανότητες ανάπτυξης νεφρικής νόσου, σε αντίθεση με τους ασθενείς φέρουν τον HLA-DR3 και HLA-DR4 απλότυπο και οι οποίοι παράγουν υψηλότερα επίπεδα TNFα και δεν είναι επιρρεπείς στην εμφάνιση νεφρίτιδας λύκου (Fronek Z, 1990) (Jacob CO F. Z., 1990). Επίσης έχει βρεθεί ότι σε ασθενείς με ενεργό ΣΕΛ, εκτός από τα επίπεδα του TNFα, 21

22 είναι αυξημένα και τα επίπεδα των διαλυτών μορφών των υποδοχέων του TNFα, των οποίων η φυσιολογική δράση είναι να δεσμεύουν τον TNFα ώστε να μην του επιτρέπουν να αλληλεπιδρά με τους μεμβρανικούς υποδοχείς του. Δηλαδή, οι διαλυτοί υποδοχείς αποτελούν έναν φυσιολογικό ανασταλτικό/ρυθμιστικό μηχανισμό της δράσης του TNFα. Φαίνεται όμως, ότι τα επίπεδα των διαλυτών υποδοχέων του TNFα στον ενεργό ΣΕΛ σχετίζονται με την ενεργότητα της νόσου και υπερτερούν των επιπέδων του TNFα (Davas EM, 1999). Σε άλλη πρόσφατη έρευνα που έγινε σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (ΜΚΠΑ) ασθενών με ενεργό ΣΕΛ περιγράφτηκαν διαταραχές στην οδό μεταγωγής του σήματος του TNFα. Πιο συγκεκριμένα, είναι μειωμένη η έκφραση των TRADD και FADD, τα οποία φυσιολογικά προσκολλώνται στο κυτταροπλασματικό τμήμα του p55tnfr μετά την πρόσδεση του TNFα στον υποδοχέα και λειτουργούν ως πλατφόρμες για την προσκόλληση άλλων μορίων (πχ πρωτεΐνες RIP-1 και TRAF-2) που συμμετέχουν στο μεταγωγικό μονοπάτι του TNFα. Τα επίπεδα RNA των πρωτεϊνών αυτών έχουν επίσης βρεθεί να είναι μειωμένα στον ενεργό ΣΕΛ (Zhu L, 2007). Λαμβάνοντας υπ οψιν τα παραπάνω δεδομένα φαίνεται ότι τα ελαττωμένα επίπεδα του TNFα, η μειωμένη βιοδιαθεσιμότητα ή/και οι διαταραχές στη σηματοδότηση του TNFα μπορεί να συμμετέχουν στην παθογένεια του ΣΕΛ. Αν και η αναστολή του ΤΝFα θα μπορούσε να είναι αποτελεσματική στην αντιμετώπιση κάποιων φλεγμονωδών εκδηλώσεων του ΣΕΛ, όπως είναι η αρθρίτιδα, υπάρχει πάντα ο φόβος ότι η χρήση των αντι-tnfα βιολογικών παραγόντων σε ασθενείς με ΣΕΛ θα μπορούσε να οδηγήσει σε έξαρση της νόσου. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα αποτελέσματα μελετών που αφορούσαν ασθενείς με ΣΕΛ στους οποίους χορηγήθηκαν 4 εγχύσεις infliximab σε διάστημα 10 εβδομάδων. Η σύντομη αυτή θεραπεία επέφερε σημαντική βελτίωση στην αρθρίτιδα και την 22

23 πρωτεϊνουρία για αρκετούς μήνες, ωστόσο οι ήδη υπάρχοντες τίτλοι ΑΝΑ, αντιdsdna ή/και αcl αυξήθηκαν επιβεβαιώνοντας τη συσχέτιση ανάμεσα στην αναστολή του TNFα και την επαγωγή αυτοανοσίας (Aringer M, 2004) (Aringer M S. G., 2007). Σε πρόσφατη δημοσίευση που αφορούσε την μακροχρόνια παρακολούθηση ασθενών με ΣΕΛ που έλαβαν αντι-tnfα, μεταξύ των οποίων και οι ασθενείς των παραπάνω δύο μελετών, αναφέρεται ότι δεν παρατηρήθηκε έξαρση της νόσου μετά από τη χορήγηση αντι-tnfα, ωστόσο σημειώθηκε ένα επεισόδιο εν τω βάθει φλεβοθρόμβωσης σε ασθενή ο οποίος παρουσίασε αύξηση του τίτλου αυτοαντισωμάτων έναντι καρδιολιπίνης (αcl), καθώς και μια περίπτωση λεμφώματος σε ασθενή με ΣΕΛ που έλαβε συνολικά 16 εγχύσεις με infliximab (Aringer M H. F., 2009). Πιθανοί μηχανισμοί αυτοανοσίας από την χρήση των αντι-tnfα βιολογικών παραγόντων Με βάση την ήδη υπάρχουσα γνώση που διαθέτουμε σχετικά με την αιτιοπαθογένεια του ΣΕΛ, έχουν διατυπωθεί κάποιες υποθέσεις για τους μηχανισμούς που πιθανώς εμπλέκονται στην επαγωγή αυτοανοσίας από τη χρήση των αντι-tnfα βιολογικών παραγόντων. O ΣΕΛ είναι μία χρόνια αγνώστου αιτιολογίας αυτοάνοση πολυσυστηματική ασθένεια, κύριο χαρακτηριστικό της οποίας αποτελεί η παρουσία πολλαπλών αυτοαντισωμάτων. Κάποια από τα αυτοαντισώματα, όπως είναι τα αντι-dsdna, διαδραματίζουν παθογενετικό ρόλο μέσω σχηματισμού ανοσοσυμπλεγμάτων. Η εναπόθεση ανοσοσυμπλεγμάτων στους ιστούς οδηγεί στην ενεργοποίηση και 23

24 κατανάλωση του συμπληρώματος και έχει τελικά ως αποτέλεσμα την πρόκληση ιστικής βλάβης. Καθώς ο ΣΕΛ προσβάλλει κατά κύριο λόγο γυναίκες αναπαραγωγικής ηλικίας θεωρείται ότι το ορμονικό υπόστρωμα έχει κάποια σημασία για την πρόκληση της νόσου. Διαταραχές στον ρυθμό απόπτωσης και αδυναμία επαρκούς κάθαρσης των αποπτωτικών σωματιδίων, υπερδραστηριότητα Τ- και Β λεμφοκυττάρων και διαταραχές στην έκφραση κυτταροκινών συμβάλλουν στην παθογένεια της νόσου, ενώ παράλληλα έχουν ενοχοποιηθεί γενετικοί καθώς και περιβαλλοντικοί παράγοντες για την εκδήλωση ΣΕΛ. Απόπτωση Ο αυξημένος ρυθμός απόπτωσης και η μειωμένη ικανότητα κάθαρσης των αποπτωτικών σωματίων είναι δύο μηχανισμοί που μπορεί να συμμετέχουν στην παθογένεια του ΣΕΛ (Munoz LE, 2008) (Gaipl US, 2007). Στο τελικό στάδιο της απόπτωσης τα κύτταρα διασπώνται στα λεγόμενα αποπτωτικά σωμάτια, μέσα στα οποία περικλείεται υλικό από την αποδόμηση του πυρήνα και του κυτταροπλάσματος. Τα αποπτωτικά σωμάτια είναι ανοσογόνα και εάν δεν απομακρυνθούν καταλλήλως μπορεί να οδηγήσουν στον σχηματισμό αυτοαντισωμάτων (Rovere P, 2000) (Rodenburg RJ, 2000). Ένα από τα κύρια αυτοαντιγόνα που απελευθερώνονται κατά την απόπτωση είναι τα νουκλεοσώματα, τα οποία αποτελούνται από DNA και ιστόνες (Bruns A, 2000). Τα νουκλεοσώματα είναι ισχυροί επαγωγείς σχηματισμού αντι-dsdna αντισωμάτων και αντισωμάτων έναντι ιστονών και η παρουσία τους έχει ανιχνευθεί στο ορό ασθενών με ΣΕΛ αλλά και σε πειραματικά μοντέλα λύκου (Amoura Z P. J., 1997) (Amoura Z, 2000) (Licht R, 2001). 24

25 Σύμφωνα με αρκετές in vivo και in vitro μελέτες οι αντι-tnfα είναι ικανοί να προκαλέσουν απόπτωση. Σε ασθενείς με ΡΑ τόσο το infliximab όσο και το etanercept φαίνεται ότι μπορούν να επάγουν την απόπτωση μονοπυρήνων/μακροφάγων στο αρθρικό υγρό όσο και στο περιφερικό αίμα (Catrina AI, 2005). Παρομοίως το infliximab επάγει την απόπτωση στα ΜΚΠΑ και τα T- λεμφοκύτταρα της lamina propria στη νόσο του Crohn (ten Hove T, 2002) (Van den Brande JM, 2003). Mεταγενέστερα in vitro πειράματα σε T-λεμφοκύτταρα Jurkat, που ήταν τροποποιημένα κατά τέτοιο τρόπο ώστε να εκφράζουν συνεχώς στην επιφάνειά τους μια μη-αποκοπτόμενη μορφή μεμβρανικού TNFα, έδειξαν ότι το infliximab, αλλά όχι το etanercept, μπορούσε να κινητοποιήσει διαδικασίες αναστολής του κυτταρικού κύκλου και απόπτωσης μέσω μονοπατιών εξαρτώμενων από τις κασπάσες και από την JNK (Mitoma H, 2005). Σε άλλη μελέτη, η θεραπεία των ασθενών με ΡΑ με infliximab οδήγησε σε αυξημένη συγκέντρωση νουκλεοσωμάτων στον ορό και η αύξηση αυτή συνοδευόταν από μετέπειτα εμφάνιση ΑΝΑ (D'Auria F, 2004). Αύξηση στα επίπεδα των νουκλεοσωμάτων διαπιστώθηκε και σε ασθενείς με ΣπΑ μετά από θεραπεία με infliximab, αλλά όχι με etanercept, ωστόσο στη συγκεκριμένη μελέτη αυτή η αύξηση αποδόθηκε περισσότερο σε μείωση των επιπέδων του συμπληρώματος στον ορό παρά σε αυξημένο ρυθμό απόπτωσης. Από την άλλη πλευρά, το etanercept οδήγησε σε αύξηση της δραστηριότητας του συστήματος της ιντερφερόνης τύπου Ι, κάτι που δεν διαπιστώθηκε με το infliximab (Cantaert T, 2009). Σήμερα πιστεύεται ότι η ιντερφερόνη-α (IFNα) παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη αυτοανοσίας όχι μόνο στα πειραματικά μοντέλα, αλλά και στον άνθρωπο (Rönnblom L, 2003) (Rönnblom L P. V., 2008). Η IFNα ανήκει στην οικογένεια του συστήματος της ιντερφερόνης τύπου Ι και παράγεται κατά κύριο λόγο από ανώριμα 25

26 πλασματοκυτταροειδή δενδριτικά κύτταρα. Μια μελέτη από τους Palucka και συν. έδειξε ότι η χορήγηση ΤΝFα μπορεί να ρυθμίζει την παραγωγή IFNα με δύο τρόπους: i) ο TNFα παρεμποδίζει τη δημιουργία των πλασματοκυττροειδών κυττάρων από τα προγονικά τους κύτταρα και ii) οδηγεί τα ανώριμα πλασματοκυτταροειδή δενδριτικά κύτταρα στο να αποκτήσουν φαινότυπο ωριμότερων κυττάρων, τα οποία όμως δεν έχουν τη δυνατότητα να παράγουν IFNα (Palucka AK, 2005). Στην ίδια αυτή μελέτη η χορήγηση αντι-tnfα βιολογικών παραγόντων σε παιδιατρικούς ασθενείς που έπασχαν από νεανική ρευματοειδή αρθρίτιδα οδήγησε σε ένα προφίλ γονιδιακής έκφρασης παρόμοιο με αυτό που παρατηρείται στα ΜΚΠΑ ασθενών με ΣΕΛ, το οποίο χαρακτηρίζεται από αυξημένη έκφραση γονιδίων που ρυθμίζονται από την IFNα (Crow MK, 2003) (Bennett L, 2003). H μείωση των επιπέδων της CRP ως πιθανός μηχανισμός επαγωγής αυτοανοσίας Όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως, εκτός από τον αυξημένο ρυθμό απόπτωσης, η ελαττωματική κάθαρση των αποπτωτικών σωματίων εμπλέκεται στην παθογένεια του ΣΕΛ (Vogt B, 2007) (Gaipl US, 2007). Η CRP είναι μια πρωτεΐνη οξείας φάσης, που επάγεται ταχέως από τον TNFα, την IL-1, IL-6 και την IFNγ κατά την οξεία φάση της φλεγμονώδους απάντησης και συμμετέχει στην κάθαρση των αποπτωτικών σωματίων (Steel DM, 1994). Η CRP μαζί με το συμπλήρωμα έχει την ικανότητα να προσδένεται στη μεμβράνη των αποπτωτικών κυττάρων και στα πυρηνικά προϊόντα της αποπτωτικής διαδικασίας με απώτερο στόχο την απομάκρυνσή τους από τα μακροφάγα (Gershov D, 2000) (Kim SJ, 2003). Στα ποντίκια, η εξάλειψη της SAP, η οποία είναι αντίστοιχη πρωτεΐνη οξείας φάσης με την ανθρώπινη CRP, ή η εξάλειψη 26

27 του C1q κλάσματος του συμπληρώματος οδηγούν σε ένα κλινικό σύνδρομο με εκδηλώσεις λύκου και παραγωγή αντι-dsdna αυτοαντισωμάτων (Bickerstaff MC, 1999) (Botto M, 1998). Επιπροσθέτως, ενέσεις CRP ή η έκφραση ανθρώπινης CRP σε γενετικώς τροποποιημένα (NZB/NZW)F1 ποντίκια φαίνεται ότι μπορεί να καθυστερήσει την έναρξη λύκου. Παρομοίως, μία και μόνη ένεση CRP σε MRL/lpr ποντίκια μπορούσε να αναστρέψει τη νεφρίτιδα (Szalai AJ, 2003) (Rodriguez W, 2005). Ανεπάρκειες κλασμάτων του συμπληρώματος αλλά και μειωμένα επίπεδα CRP έχουν κατ επανάληψιν περιγραφεί σε ασθενείς με ΣΕΛ, ανεξάρτητα από την ενεργότητα της νόσου (Russell AI, 2004) (Vogt B, 2007) (Truedsson L, 2007). Σύμφωνα με πρόσφατη μελέτη, αν και τα επίπεδα της CRP μειώνονται ταχέως μετά από θεραπεία με αντι-tnfα, δεν διαπιστώθηκε συσχέτιση ανάμεσα στην πτώση των επιπέδων της CRP και την εμφάνιση ΑΝΑ ή εκδηλώσεων λύκου (Caramaschi P, 2006) Ο πιθανός ρόλος των Τ-λεμφοκυττάρων στην αντι-tnfα επαγόμενη αυτοανοσία Όταν τα βοηθητικά Τ-λεμφοκύτταρα εκτεθούν επί μακρόν σε TNFα επηρεάζεται η λειτουργικότητά τους. Μειώνεται η ικανότητα πολλαπλασιασμού τους, καταστέλλεται η παραγωγή κυτταροκινών και ελαττώνεται η ικανότητα κινητοποίησης ασβεστίου από τις ενδοκυττάριες αποθήκες μετά από διέγερση τους μέσω του Τ αντιγονικού υποδοχέα (TCR) (Cope AP, 1997) (Cope AP L. M., 1994). Ωστόσο, η κατασταλτική αυτή δράση του TNFα δεν είναι μόνιμη, αφού η απομάκρυνση του TNFα από το περιβάλλον των Τ-κυττάρων επαναφέρει τις παραπάνω λειτουργίες. Από μεταγενέστερες μελέτες προέκυψαν δύο πιθανοί μηχανισμοί που θα μπορούσαν να είναι υπεύθυνοι για αυτή τη συμπεριφορά των Τ- 27

28 κυττάρων απέναντι στον TNFα. Ο πρώτος μηχανισμός αφορά μία αναστρέψιμη μείωση των επιπέδων έκφρασης της αλυσίδας ζ του TCR (ΤCRζ) και μείωση της φωσφορυλίωσης της τυροσινικής κινάσης ZAP-70, η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στην ενδοκυττάρια μετάδοση του σήματος από τον TCR (Isomäki P, 2001). Ο δεύτερος μηχανισμός είναι λιγότερο άμεσος. Γνωρίζουμε ότι για την ενεργοποίηση των naïve Τ-λεμφοκυττάρων απαιτείται η σωστή παρουσίαση του αντιγόνου από μόρια MHC II τα οποία εκφράζονται στην επιφάνεια των αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων. Στη μελέτη από τους Μueller και συν. φάνηκε ότι η έκφραση των MHC II μορίων είναι μειωμένη στα μακροφάγα ασθενών με ΡΑ, ενώ η θεραπεία με αντι- TNFα επανέφερε τα επίπεδα έκφρασης των MHC II μορίων σε φυσιολογικά επίπεδα (Mueller RB, 2005). Στην ίδια αυτή μελέτη όταν τα μακροφάγα υγιών μαρτύρων εκτέθηκαν ex vivo σε TNFα διαπιστώθηκε ότι i) εξέφραζαν μειωμένα επίπεδα MHC II στην επιφάνειά τους και ii) εξαιτίας της μειωμένης έκφρασης MHC II δεν ήταν αποτελεσματική η ενεργοποίηση των βοηθητικών CD4 + T κυττάρων. Λαμβάνοντας υπ οψιν τα παραπάνω φαίνεται ότι η εξουδετέρωση του TNFα μπορεί τελικά να βελτιώσει τόσο την ικανότητα των αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων να παρουσιάζουν αποτελεσματικότερα αντιγόνα στα βοηθητικά T κύτταρα, όσο και την ικανότητα των ίδιων αυτών T κυττάρων να απαντούν κατάλληλα στην αντιγονική διέγερση. Τα αποτελέσματα της αναστολής του TNFα ελέγχθηκαν και στο πειραματικό μοντέλο της νόσου μοσχεύματος κατά ξενιστή (graft vs host disease, GVHD) καθώς, τόσο η οξεία όσο και η χρόνια μορφή GVHD χαρακτηρίζονται από την παρουσία υπερδραστήριων Β λεμφοκυττάρων και παραγωγή αυτοαντισωμάτων. Στην οξεία GVHD τα αυτοαντιδραστικά κύτταρα εξουδετερώνονται από τα CD8 + κυτταροτοξικά T λεμφοκύτταρα μέσω των οδών Fas-FasL και περφορίνης. Αντίθετα, στη χρόνια GVHD αυτά τα κυτταροτοξικά κύτταρα δεν επάγονται, με αποτέλεσμα τα 28

29 αυτοαντιδραστικά κύτταρα να επιβιώνουν, να συνεχίζουν να παράγουν αυτοαντισώματα και τελικά να εκδηλώνεται σπειραματονεφρίτιδα που θυμίζει αυτήν στον ΣΕΛ. Η χορήγηση αντι-tnfα στα ποντίκια με οξεία GVHD είχε ως επακόλουθο να μην επάγονται κυτταροτοξικά CD8 + T λεμφοκύτταρα και να παρεμποδίζεται η παραγωγή IFNγ, ενώ η έκφραση των λεγόμενων τύπου Th2 κυτταροκινών (IL-4, IL-6, IL-10) δεν επηρεάστηκε. Θεωρήθηκε, επομένως, ότι οι ασθενείς που θεραπεύονται με αντι-tnfα δεν έχουν αποτελεσματική δραστηριοποίηση κυτταροτοξικών απαντήσεων, ενώ ταυτόχρονα αλλάζει η ισορροπία στο προφίλ κυτταροκινών, ευνοώντας την έκφραση κυτταροκινών τύπου Th2, όπως συμβαίνει και στον ΣΕΛ (Via CS, 2001). Πολυκλωνική ενεργοποίηση των Β λεμφοκυττάρων Σήμερα, θεωρείται ότι τα Β λεμφοκύτταρα κατέχουν κεντρικό ρόλο στην παθογένεια της νόσου. Η παρουσία υπεραντιδραστικών/αυτοαντιδραστικών Β λεμφοκυττάρων αποτελεί κύριο χαρακτηριστικό του ΣΕΛ. Σήμερα γνωρίζουμε ότι αυτοαντιδραστικά Β λεμφοκύτταρα υπάρχουν και σε φυσιολογικά άτομα. Ένας ιδιαίτερος υποπληθυσμός Β λεμφοκυττάρων είναι εκείνα που φέρουν στην επιφάνειά τους τον Τ-λεμφοκυτταρικό δείκτη CD5 (Wardemann H, 2003) (Tsuiji M, 2006). Αυτά τα CD5 + B λεμφοκύτταρα παράγουν IgM τύπου «φυσικά» αυτοαντισώματα για μικρό χρονικό διάστημα ως απάντηση σε κακοήθεια ή λοίμωξη. Τα αυτοαντισώματα αυτά δεν προκαλούν ιστικές βλάβες ή αυτοάνοσες εκδηλώσεις (Coutinho A, 1995). Δεδομένου ότι τα αυτοαντισώματα που ανιχνεύονται στους ασθενείς που λαμβάνουν αντι-tnfα είναι τύπου IgM και λαμβάνοντας ταυτόχρονα υπ όψιν την παροδική φύση του αυτοάνοσου συνδρόμου που μπορεί να αναπτύξουν κατά τη διάρκεια της 29

30 αγωγής τους, θα μπορούσαμε να υποθέσουμε ότι η ενεργοποίηση των Β λεμφοκυττάρων, συμπεριλαμβανομένου και αυτού του φυσιολογικού αυτοαντιδραστικού πληθυσμού, ευθύνονται τελικά για την αυτοανοσία που επάγεται από τους αντι-tnfα. Η εμφάνιση αυτοανοσίας εξαρτάται από γενετικούς, φυλετικούς, ορμονικούς και περιβαλλοντικούς παράγοντες. Υπάρχουν αρκετές αναφορές στη διεθνή βιβλιογραφία σύμφωνα με τις οποίες μια λοίμωξη ή εμβολιασμός προκάλεσε εμφάνιση ή υποτροπή του ΣΕΛ (Tomita H, 2003) (Kasapcopur O, 2006) (O'Neill SG, 2006). Καθώς ο ΤΝFα είναι σημαντικός για την προστασία του ξενιστή από λοιμώδη νοσήματα και λαμβάνοντας υπ όψιν τον αυξημένο κίνδυνο για λοιμώξεις που διατρέχουν οι ασθενείς που θεραπεύονται με ανταγωνιστές του TNFα (Lin J, 2008), θεωρήθηκε πιθανό η εμφάνιση των αυτοαντισωμάτων κατά την αγωγή με αντι-tnfα να οφείλεται σε πολυκλωνική ενεργοποίηση των Β λεμφοκυττάρων από λοιμώδεις παράγοντες. Σύμφωνα με εργασία των Ferraccioli και συν., ασθενείς με ΡΑ που έλαβαν etanercept ανέπτυξαν αcl και αντι-dsdna αντισώματα κατά τη διάρκεια της αγωγής και διαπιστώθηκε ότι η εμφάνιση των αυτοαντισωμάτων συνέπεσε χρονικά με κλινική διάγνωση και εργαστηριακή επιβεβαίωση λοίμωξης από S.aureus ή/και E.coli (Ferraccioli G, 2002). Η χορήγηση αντιβιοτικής θεραπείας οδήγησε σε μείωση του τίτλου των αυτοαντισωμάτων. Τα δεδομένα αυτά συνηγορούν για το ότι πιθανόν λοιμώδεις παράγοντες να επάγουν χυμική αυτοανοσία στους ασθενείς αυτούς (Ferraccioli G, 2002), χωρίς όμως να μπορούν να εξηγήσουν για ποιο λόγο συχνά ανιχνεύουμε ΑΝΑ και αντι-dsdna στους υπό αγωγή ασθενείς, ενώ οι τίτλοι άλλων αυτοαντισωμάτων, όπως είναι τα αντι-ccp και ο ρευματοειδής παράγοντας μειώνονται (Atzeni F T. M.-P., 2005) (Atzeni F S.-P. P., 2006). 30

31 Το Β λεμφοκύτταρο Η φυσιολογία της διέγερσης του ώριμου Β λεμφοκυττάρου Τα Β λεμφοκύτταρα αποτελούν κύτταρα της ειδικής ανοσίας και είναι τα μοναδικά κύτταρα του οργανισμού που διαθέτουν τη δυνατότητα παραγωγής (αυτο)αντισωμάτων. Τα ώριμα Β λεμφοκύτταρα εδράζονται στα περιφερικά λεμφικά όργανα και το ποσοστό των κυκλοφορούντων Β κυττάρων κυμαίνεται περίπου στο 7-10% των λευκών αιμοσφαιρίων. Στα θηλαστικά η παραγωγή των Β λεμφοκυττάρων ξεκινά από το εμβρυικό ήπαρ, ωστόσο μετά τη γέννηση ο ρόλος αυτός αναλαμβάνεται εξ ολοκλήρου από τον μυελό των οστών. Στον μυελό των οστών το έναυσμα για την παραγωγή Β λεμφοκυττάρων δίδεται όταν το πολυδύναμο προγονικό κύτταρο (pluripotent stem cell) δεσμευτεί προς την κατεύθυνση εξέλιξης της Β κυτταρικής σειράς. Η διαδικασία ωρίμανσης του Β λεμφοκυττάρου γίνεται απουσία εξωγενούς αντιγονικού ερεθισμού. Περιλαμβάνει μια σειρά χρονικώς αυστηρά καθορισμένων γεγονότων επαναδιάταξης των γονιδίων που αφορούν τους γενετικούς τόπους των βαρειών και κατόπιν των ελαφριών αλυσίδων των ανοσοσφαιρινών, καθώς και διαδικασίες αρνητικής επιλογής, ώστε τελικά να οδηγηθούν σε πλήρη ωρίμανση μόνο τα κύτταρα εκείνα που θα εκφράζουν στην επιφάνειά τους το πλήρες λειτουργικό μόριο του Β αντιγονικού υποδοχέα (B-cell receptor ή ΒCR) και τα οποία θα ενεργοποιούνται έντονα μόνο μετά από αναγνώριση ξένων αντιγόνων. Ο BCR του ώριμου «παρθένου» (naïve) Β λεμφοκυττάρου αποτελείται από μια ανοσοσφαιρίνη επιφανείας τύπου IgM ή IgD και από δύο μη-πολυμορφικές αλυσίδες Igα και Igβ (Σχήμα 3). Η ανοσοσφαιρίνη είναι εκείνη που αναγνωρίζει και αλληλεπιδρά με το αντιγόνο, ωστόσο δεν έχει την δυνατότητα ενδοκυττάριας μετάδοσης του σήματος που προκύπτει από την αλληλεπίδραση αυτή, καθώς το 31

32 ενδοκυττάριο τμήμα της έχει μήκος μόλις τριών αμινοξέων. Η μετάδοση του σήματος εξυπηρετείται από τις αλυσίδες Igα και β. Οι αλυσίδες Ιgα και Igβ είναι ενωμένες μεταξύ τους με δισουλφιδικούς δεσμούς και στο ενδοκυττάριο τμήμα τους φέρουν αλληλουχίες αμινοξέων πλούσιες σε τυροσίνη (immunoreceptor-based tyrosine activation motif ή ITAM). Οι αλληλουχίες αυτές είναι απαραίτητες για την ενδοκυττάρια μετάδοση του σήματος που προκύπτει από την αλληλεπίδραση αντιγόνου-ανοσοσφαιρίνης. Η μετάδοση του σήματος περιλαμβάνει έναν καταρράκτη φωσφορυλιώσεων κυρίως σε θέσεις τυροσίνης. Οι φωσφορυλιώσεις αυτές εξυπηρετούνται από ειδικά ένζυμα (κινάσες της οικογένειας Src), τα οποία εδράζονται εγγύς των Igα και β αλυσίδων και τελικά οδηγούν σε μια αλληλουχία γεγονότων που θα καταλήξει στην πλήρη ενεργοποίηση του Β λεμφοκυττάρου. Πιο συγκεκριμένα, όταν το αντιγόνο αναγνωριστεί και συνδεθεί στους ειδικούς για αυτό υποδοχείς στην επιφάνεια του Β λεμφοκυττάρου αυτό έχει ως αποτέλεσμα την προσέγγιση των υποδοχέων μεταξύ τους (cross-linking) και ως εκ τούτου την προσέγγιση και την ενεργοποίηση μέσω της μεταξύ τους φυσικής επαφής των κινασών της οικογένειας Src. Πρόκειται για μια οικογένεια ενζύμων με δράση κινάσης τυροσίνης που αριθμεί 9 μέλη συνολικά. Μεταξύ αυτών των ενζύμων συγκαταλέγεται και η κινάση Lyn η οποία διαδραματίζει σημαντικό διπλό ρόλο, ευοδωτικό και ανασταλτικό, στην οδό ενεργοποίησης του Β λεμφοκυττάρου. Όταν ενεργοποιηθούν οι κινάσες Src φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν την περιοχή ΙΤΑΜ των Igα και β αλυσίδων του υποδοχέα. Η φωσφορυλιωμένη ΙΤΑΜ περιοχή λειτουργεί ως θέση σύνδεσης για την κινάση Syk. Η αλληλεπίδραση της Syk με την περιοχή ΙΤΑΜ καθώς και η φωσφορυλίωσή της από τις Src κινάσες έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της Syk. Με τη σειρά της η Syk λειτουργεί επίσης ως κινάση τυροσίνης ενεργοποιώντας επόμενα στη σειρά μόρια σηματοδότησης, όπως 32

33 είναι η πρωτεΐνη BLNK η οποία λειτουργεί ως θέση πρόσδεσης και ενεργοποιήσης διαφόρων ενζύμων. Μεταξύ των ενζύμων-στόχων της BLNK είναι η φωσφολιπάση Cγ2 (PLCγ2). Η πλήρης ενεργοποίηση της PLCγ2 επιτυγχάνεται τόσο με την πρόσδεσή της στην BLNK όσο και με την ταυτόχρονη φωσφορυλίωσή της από τις κινάσες Syk και Btk. H ενεργός PLCγ2 διασπά την τριφωσφορική φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη (ΡΙΡ3), που εδράζεται στην πλασματική μεμβράνη, σε τριφωσφορική ινοσιτόλη (ΙΡ3) και σε διακυλογλυκερόλη (DAG). H DAG παραμένει στην πλασματική μεμβράνη, ενώ η IP3 απελευθερώνεται προς το κυτταρόπλασμα και προσδένεται στον υποδοχέα της στο ενδοπλασματικό δίκτυο, κινητοποιώντας με τον τρόπο αυτό την έκλυση ελεύθερων ιόντων ασβεστίου στο εσωτερικό του κυττάρου και οδηγώντας τελικά στην ενεργοποίηση μεταγραφικών παραγόντων που ελέγχουν γονίδια πολλαπλασιασμού, διέγερσης και διαφοροποίησης του κυττάρου. Η αύξηση των ενδοκυτταρίων επιπέδων ασβεστίου δεν διαμεσολαβείται μόνο μέσω απελευθέρωσης ιόντων ασβεστίου από το ενδοπλασματικό δίκτυο, αλλά διατηρείται και μέσω ροής εξωκυτταρίου ασβεστίου προς το εσωτερικό του κυττάρου. Η διαδικασία αυτή εξυπηρετείται σύμφωνα με πρόσφατες μελέτες από ένα μόριο επιφανείας του Β λεμφοκυττάρου, το CD20. Το CD20 είναι ένα από τα πρώτα αντιγόνα που αναγνωρίστηκαν στην επιφάνεια του Β λεμφοκυττάρο. Πρόκειται για μια μη-γλυκοζυλιωμένη φωσφοπρωτεΐνη της πλασματικής μεβράνης μεγέθους 33-37kDa, η οποία ανήκει στην οικογένεια των tetraspanins και η οποία εκφράζεται αποκλειστικά στην επιφάνεια του Β λεμφοκυττάρου συνδεδεμένη με τον BCR (Polyak MJ, 2008). Έχει την δυνατότητα να σχηματίζει ομοτετραμερή και να συμπεριφέρεται ως δίαυλος ιόντων ασβεστίου, ενώ υπάρχουν και στοιχεία που καταδεικνύουν ότι το CD20 έχει τη δυνατότητα να κινητοποιεί ασβέστιο και από τις 33

34 ενδοκυττάριες αποθήκες ενεργοποιώντας την PLCγ2, παίζοντας σημαντικό ρόλο στην διατήρηση της διέγερσης του Β λεμφοκυττάρου. H πλήρης ενεργοποίηση του Β λεμφοκυττάρου δεν εξαρτάται αποκλειστικά και μόνο από την αλληλεπιδραση του αντιγόνου με τον ΒCR, αλλά και από την δράση άλλων μορίων επιφανείας που λειτουργούν ως συνυποδοχείς του Β λεμφοκυττάρου. Συγκεκριμένα πρόκειται για το CD21-CD19-CD81 σύμπλοκο. Το CD21 είναι ο υποδοχέας του συμπληρώματος τύπου 2 και εκφράζεται στην επιφάνεια του Β λεμφοκυττάρου πάντα σε συνδυασμό με άλλα δύο μόρια επιφανείας, το CD19 και το CD81. O ρόλος του CD21 είναι να αναγνωρίζει το C3d κλάσμα του ενεργοποιημένου συμπληρώματος είτε αυτό έχει ενεργοποιηθεί με την κλασική είτε με την εναλλακτική οδό. Το C3d προκύπτει από την πρωτεολυτική διάσπαση του C3b κλάσματος του συμπληρώματος και παραμένει συνδεδεμένο επάνω στην δομή την οποία έχει αναγνωρίσει. Το σύμπλοκο C3d-αντιγόνου, αναγνωρίζεται από το Β λεμφοκύτταρο μέσω του CD21 που δεσμεύει το C3d και ταυτόχρονα μέσω του BCR που αναγνωρίζει το αντιγόνο. Με τον τρόπο αυτό το CD21-CD19-CD81 σύμπλοκο και ο BCR αλληλοπροσεγγίζονται και το ενδοκυττάριο τμήμα του CD19 φωσφορυλιώνεται από την κινάση Lyn διεγείροντας ενδοκυττάρια μονοπάτια ενεργοποίησης του Β λεμφοκυττάρου. 34

35 Σχήμα 3: Τα πρώιμα βιοχημικά γεγονότα που ακολουθούν τη διέγερση του BCR. O BCR είναι ένα ετεροτριμερές αποτελούμενο από μια ανοσοσφαιρίνη επιφανείας (IgM) και δύο αλυσίδες Igα και Igβ, οι οποίες φέρουν στο ενδοκυττάριο τμήμα τους τις ITAM αλληλουχίες (γαλάζια περιοχή). Με την αλληλεπίδραση αντιγόνου-bcr ενεργοποιούνται οι Src κινάσες και φωσφορυλιώνουν τις ΙΤΑΜ περιοχές (κίτρινοι κύκλοι) δίνοντας το έναυσμα για την έναρξη καταρράκτη φωσφορυλιώσεων σε κινάσες τυροσίνης, μιας διαδικασίας που θα καταλήξει στην αύξηση των ενδοκυτταρίων επιπέδων Ca ++ και τελικά στην διέγερση του Β λεμφοκυττάρου. Ως συνυποδοχέας του BCR λειτουργεί το σύμπλοκο CD21-CD19-CD81. Το CD21 συνδέεται με το αντιγόνο μέσω του C3d κλάσματος του συμπληρώματος. Το CD19 φωσφορυλιώνεται από την Lyn και με τη σειρά του ενισχύει την ένταση του σήματος που δημιουργείται από τη διέγερση του BCR. Για την διατήρηση της διέγερσης του Β λεμφοκυττάρου, η οποία εξαρτάται από την ενδοκυττάρια συγκέντρωση ιόντων Ca ++, επιστρατεύεται το CD20. Το CD20 λειτουργεί ως δίαυλος ιόντων επιτρέποντας την είσοδο εξωκυττάριου Ca ++ στο εσωτερικό του κυττάρου. 35

36 Ο διπλός ρυθμιστικός ρόλος της Lyn στο Β λεμφοκύτταρο Η Lyn είναι η κύρια και σημαντικότερη κινάση της οικογένειας των Src κινασών που εκφράζονται στο Β λεμφοκύτταρο. Ανιχνεύονται δύο ισομορφές της Lyn, η p53 και η p56, χωρίς ωστόσο μέχρι σήμερα να έχει αναγνωριστεί κάποια λειτουργική διαφοροποίηση μεταξύ αυτών (Yi TL, 1991) (Stanley E, 1991). Αρχικά ο ρόλος της Lyn στη φυσιολογία του ώριμου Β λεμφοκυττάρου είχε θεωρηθεί αμιγώς διεγερτικός, όπως και των υπολοίπων κινασών της ιδίας οικογενείας. Είναι η κύρια κινάση που δραστηριοποιείται όταν το αντιγόνο δεσμευτεί στον BCR για να ξεκινήσει ο καταρράκτης των φωσφορυλιώσεων που θα καταλήξουν στην διέγερση του Β λεμφοκυττάρου (Tolar P, 2005) (Sohn HW, 2006). Οι ΙΤΑΜ αλληλουχίες των Igα και β αλυσίδων του BCR, το ενδοκυττάριο τμήμα του CD19, οι κινάσες Syk και Btk και η PLCγ2 αποτελούν μόρια-στόχους της Lyn οδηγώντας σε διέγερση του Β λεμφοκυττάρου. O ανασταλτικός ρόλος της Lyn έγινε αντιληπτός όταν δημιουργήθηκαν πειραματικά μοντέλα ποντικών γενετικώς τροποποιημένων ώστε να μην εκφράζουν το γονίδιο της Lyn (lyn -/- ποντίκια) και τα οποία χαρακτηρίζονται από υπερδιεγερσιμότητα του BCR, παρουσία αυτοαντισωμάτων και εμφάνιση βαρειάς θανατηφόρου σπειραματονεφρίτιδας οφειλόμενης στην παρουσία ανοσοσυμπλεγμάτων (Hibbs ML, 1995). Φαίνεται όμως από μεταγενέστερες μελέτες ότι και η υπερδραστηριότητα της Lyn μπορεί να οδηγήσει σε φαινόμενα αυτοανοσίας. Πιο συγκεκριμένα, δημιουργήθηκαν ποντίκια φέροντα μια gain-offunction μετάλλαξη του γονιδίου της Lyn (lyn up/up ποντίκια) η οποία έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή ενός ενζύμου έως και τρεις φορές δραστικότερο από την φυσιολογική Lyn. Kατά τη μελέτη μη-διεγερμένων Β λεμφοκυττάρων των ποντικών αυτών προέκυψε ότι τόσο τα ανασταλτικά (CD22, FcγRIIb1, SHP-1, SHIP-1), όσο και τα διεγερτικά μόρια-στόχοι της Lyn (Syk και PLCγ2) ήταν φωσφορυλιωμένα. Η 36

37 in vitro δυνατότητα πολλαπλασιασμού των Β λεμφοκυττάρων ήταν μειωμένη, όπως επίσης μειωμένη βρέθηκε να είναι η έκφραση της επιφανειακής IgM ανοσοσφαιρίνης καθώς και άλλων συνδιεγερτικών μορίων. Παράλληλα, διαπιστώθηκε αύξηση του ποσοστού των κυκλοφορούντων CD5 + B λεμφοκυττάρων, ενώ διέγερση των Β λεμφοκυττάρων των lyn up/up ποντικών χαρακτηριζόταν από εντονότερη αύξηση των επιπέδων των ελεύθερων ενδοκυτταρίων ιόντων ασβεστίου σε σχέση με τα Β λεμφοκύτταρα ποντικών με φυσιολογική Lyn. Σε κλινικό επίπεδο, τα lyn up/up ποντίκια αναπτύσσουν αυτοαντισώματα τύπου IgM, σοβαρή αυτοάνοση σπειραματονεφρίτιδα και μειωμένο προσδόκιμο επιβίωσης, κάτι που παρατηρείται και στα lyn -/- ποντίκια. Φαινοτυπικές και λειτουργικές διαταραχές του Β λεμφοκυττάρου στον ΣΕΛ Η παραγωγή αυτοαντισωμάτων αποτελεί εκδήλωση υπερδραστηριότητας και πολυκλωνικής ενεργοποίησης αυτοαντιδραστικών Β λεμφοκυττάρων. Αν και ο ακριβής ρόλος του Β λεμφοκυττάρου στον ΣΕΛ δεν είναι απόλυτα κατανοητός, σήμερα πιστεύεται ότι το Β λεμφοκύτταρο κατέχει κεντρικό ρόλο στην παθογένεια της νόσου και δεν περιορίζεται μόνο στην παραγωγή παθογόνων αυτοαντισωμάτων. Αρχικά είχε θεωρηθεί ότι η υπερδραστηριότητα του Β λεμφοκυττάρου που οδηγεί στην παραγωγή αυτοαντισωμάτων είναι αποτέλεσμα: 1) της διαταραχής στην ισορροπία των κυτταροκινών που παρατηρείται στον ΣΕΛ με επικράτηση των κυτταροκινών τύπου Th2, 2) της αυξημένης επίδρασης των βοηθητικών Τ- λεμφοκυττάρων σε αυτοαντιδραστικά Β λεμφοκύτταρα και 3) πιθανής αδυναμίας καταστολής των αυτοαντιδραστικών λεμφοκυττάρων από τα ρυθμιστικά Τ- λεμφοκύτταρα. Πλέον όμως, είναι γνωστό ότι το Β λεμφοκύτταρα παρουσιάζει 37

38 εγγενώς φαινοτυπικές και λειτουργικές διαταραχές, οι οποίες θα μπορούσαν να έχουν παθογενετικές προεκτάσεις. Χαρακτηριστική είναι η επίταση που παρατηρείται στα πρώιμα γεγονότα του καταρράκτη σηματοδότησης που ακολουθεί τη διέγερση του BCR. Ανεξάρτητα από την ενεργότητα της υποκείμενης νόσου ή τη θεραπεία που ακολουθείται, τα Β λεμφοκύτταρα ασθενών με ΣΕΛ εμφανίζουν σημαντικά αυξημένα επίπεδα φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών σε θέσεις τυροσίνης μετά από διέγερση του BCR καθώς επίσης και αυξημένη κινητοποίηση ασβεστίου από τις ενδοκυττάριες αποθήκες σε σχέση με τα Β λεμφοκύτταρα υγιών μαρτύρων ή ασθενών με άλλο ρευματικό νόσημα, πράγμα που υποδηλώνει ότι η υπερδραστηριότητα του Β λεμφοκυττάρου δεν είναι αποτέλεσμα μόνο των πιθανών εξωγενών επιρροών που μπορεί να δέχεται (Liossis SN, 1996). Παράλληλα με την επίταση των πρώιμων γεγονότων που αφορούν την ενεργοποίηση του BCR, λειτουργικές διαταραχές έχουν περιγραφεί και στη σηματοδότηση που συντελείται από τον FcγRIIB, του οποίου η δράση είναι ανασταλτική και o οποίος αποτελεί μεταξύ άλλων στόχο της κινάσης Lyn. Όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως, ο ρόλος της Lyn είναι διττός και διαδραματίζει σημαντική ευοδωτική και ανασταλτική δράση στη οδό σηματοδότησης του BCR. Σε ασθενείς με ΣΕΛ τα επίπεδα της Lyn είναι μειωμένα, γεγονός που συσχετίστηκε με την υπερδιεγερσιμότητα που παρατηρείται στα Β λεμφοκύτταρα στον ΣΕΛ, η δε μείωση των επιπέδων έχει αποδοθεί σε διαταραχές στο μεταγραφικό επίπεδο καθώς και σε αυξημένο ρυθμό αποδόμησης του μορίου (Liossis SN S. E., 2001) (Flores- Borja F, 2005). Οι φαινοτυπικές αλλαγές που έχουν αναφερθεί στα Β λεμφοκύτταρα ασθενών με ενεργό ΣΕΛ αφορούν κατά κύριο λόγο διαφοροποιήσεις στα ποσοστά των πληθυσμών των κυκλοφορούντων Β λεμφοκυττάρων. Χαρακτηριστική είναι η μείωση του ποσοστού των Β λεμφοκυττάρων του περιφερικού αίματος σε ασθενείς με ενεργό νόσο, η οποία κατά κύριο λόγο αφορά μείωση του ποσοστού των 38

39 «παρθένων»/naïve Β λεμφοκυττάρων και επικράτηση των Β κυττάρων μνήμης. Παράλληλα, έχει περιγραφεί αύξηση του ποσοστού των CD5 + B λεμφοκυττάρων σε ασθενείς με ΣΕΛ χωρίς ωστόσο να τους αποδίδεται σαφώς παθογενετικός ρόλος παρόμοιος με εκείνον που έχουν στα πειραματικά μοντέλα της νόσου, καθώς η παραγωγή παθογόνων αυτοαντισωμάτων όπως είναι τα αντι-dsdna συντελείται τόσο από τα CD5 + B λεμφοκύτταρα όσο και τα «συμβατικά» CD5 - B λεμφοκύτταρα (Suzuki N, 1990). Τέλος, στον ενεργό ΣΕΛ έχουν περιγραφεί μείωση των επιπέδων του CD21 (Wilson JG, 1986) (Marquart HV, 1995), ενώ υπάρχουν και αναφορές για αύξηση της έκφρασης του CD20 στην επιφάνεια των Β λεμφοκυττάρων (Oooto Y, 1995) (Hu S, 2001). 39

40 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Ο κύριος στόχος της παρούσας μελέτης είναι η ανάδειξη πιθανών μηχανισμών επαγωγής αυτοανοσίας σε ασθενείς που λαμβάνουν αντι-tnfα βιολογικούς παράγοντες. Καθώς σήμερα το Β λεμφοκύτταρο θεωρείται ότι κατέχει κεντρικό ρόλο στην παθογένεια του ΣΕΛ επικεντρώσαμε την προσοχή μας στα Β λεμφοκύτταρα ασθενών υπό αντι-tnfα αγωγή και μελετήσαμε εάν με την επίδραση των αντι-tnfα παραγόντων αποκτούν φαινοτυπικά ή/και λειτουργικά χαρακτηριστικά που να προσομοιάζουν με τα αντίστοιχα των Β λεμφοκυττάρων του ΣΕΛ. Επομένως, λαμβάνοντας υπ όψιν τα παραπάνω δεδομένα, μελετήσαμε την ύπαρξη πιθανών αλλαγών στα Β λεμφοκύτταρα ασθενών πριν και μετά την έναρξη αντι- TNFα θεραπείας όσον αφορά: Ι) την έκφραση της κινάσης Lyn ΙΙ) τα πρώιμα γεγονότα (φωσφορυλιώσεις ενδοκυτταρίων πρωτεϊνών σε υπολείμματα τυροσίνης) του καταρράκτη μετάδοσης του ενδοκυτταρίου σήματος III) την έκφραση του CD20 στην επιφάνεια του Β λεμφοκυττάρου IV) την έκφραση του CD21 (υποδοχέας του συμπληρώματος τύπου 2) στην επιφάνεια του Β λεμφοκυττάρου V) το ποσοστό των κυκλοφορούντων CD5 + Β λεμφοκυττάρων Από τα παραπάνω, βασικός στόχος είναι να αντλήσουμε πληροφορίες σχετικά με τη βιολογική συμπεριφορά των Β λεμφοκυττάρων υπό την επίδραση των αντι-tnfα βιολογικών παραγόντων που πιθανώς να οδηγήσουν σε καλύτερη κατανόηση των 40

41 μηχανισμών πρόκλησης αυτοανοσίας σε αυτές τις περιπτώσεις, αλλά πιθανώς και σε καλύτερη κατανόηση, κατ επεκτασιν, της παθογένειας του ΣΕΛ. 41

42 ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Ασθενείς και υγιείς μάρτυρες Για τις ανάγκες της μελέτης αναλύσαμε συνολικά 29 ασθενείς. Από τους ασθενείς αυτούς, 11 είχαν ρευματοειδή αρθρίτιδα (ΡΑ), 16 έπασχαν από οροαρνητική σπονδυλοαρθροπάθεια (ΣπΑ), 1 με νόσο Αδαμαντιάδη-Behçet και 1 με σύνδρομο SAPHO. Aπό τους ασθενείς με ΣπΑ, οι 8 είχαν αγκυλοποιητική σπονδυλίτιδα (ΑΣ), 5 είχαν αδιαφοροποίητη σπονδολυαρθροπάθεια και 3 έπασχαν από ψωριασική αρθρίτιδα (ΨΑ). Από τους 29 ασθενείς οι 16 ήταν άνδρες και 13 γυναίκες, με ηλικιακό εύρος 24 έως 75 έτη (μέσος όρος 50 ± 14 έτη). Πέντε από τους ασθενείς ελάμβαναν μεθοτρεξάτη (7.5-10mg εβδομαδιαίως), 6 ελάμβαναν λεφλουνομίδη, 2 υδροξυχλωροκίνη, 11 κορτικοστεροειδή (λιγότερο από 8mg ημερησίως), 5 ελάμβαναν μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη και 7 δεν ελάμβαναν καμμία αγωγή. 14 από τους ασθενείς έλαβαν infliximab, 13 έλαβαν adalimumab και 2 etanercept. Οι ασθενείς που ελάμβαναν παράλληλα θεραπεία με κορτικοστεροειδή μελετήθηκαν 24 ώρες τουλάχιστον μετά τη λήψη της τελευταίας δόσης. Η ενεργότητας της νόσου αξιολογήθηκε με την κλίμακα Disease Activity Score 28 (DAS28) για τους ασθενείς με ΡΑ και με την κλίμακα Bath Ankylosing Spondylitis Disease Activity Index (BASDAI) για τους ασθενείς με ΑΣ. Παράλληλα με τους ασθενείς περιελήφθησαν στη μελέτη και 10 υγιείς εθελοντές. 42

43 Κύτταρα Απομόνωση μονοπυρήνων κυττάρων περιφερικού αίματος Η ανάλυση των ασθενών έγινε στα εξής χρονικά σημεία: χρόνος 0 (ημέρα έναρξης της αντι-tnfα θεραπείας), 6 η, 14 η και 30 η εβδομάδα θεραπείας. Στα χρονικά αυτά σημεία, μετά από ενυπόγραφη συγκατάθεση του ασθενούς για τη συμμετοχή του στη μελέτη, γινόταν αιμοληψία 40ml περιφερικού αίματος σε ηπαρινισμένη σύριγγα. Από το αίμα αυτό γινόταν απομόνωση Μονοπυρήνων Κυττάρων Περιφερικού Αίματος (ΜΚΠΑ) με κλασική μεθοδολογία επίστρωσης σε ειδικό διαχωριστικό υλικό Ficoll-Hypaque. Η μέθοδος περιλαμβάνει πιο συγκεκριμένα: 1. Αραίωση ολικού αίματος με θρεπτικό υλικό RPMI-1640 σε αναλογία 1:1 2. Αργή επίστρωση του μείγματος επάνω σε όγκο διαχωριστικού υλικού Ficoll- Hypaque ίσο με το 1/3 του όγκου του μείγματος 3. Φυγοκέντρηση στις 2000 στροφές/λεπτό για 40 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, χωρίς φρένα 4. Προσεκτική συλλογή της στοιβάδας των ΜΚΠΑ από την επιφάνεια της φικόλης 5. Δύο πλύσεις των κυττάρων με θρεπτικό υλικό RPMI-1640 σε στις 1500 στροφές/λεπτό για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου 6. Καταμέτρηση κυττάρων με τη χρήση αιμοκυτταρόμετρου Neubauer 7. Φύλαξη δειγμάτων σε υγρό άζωτο (θ= -135 C), σε ειδικό θρεπτικό υλικό για κατάψυξη των κυττάρων αποτελούμενο από 50% FBS, 40% RPMI-1640 και 10% DMSO 43

44 Απομόνωση Β λεμφοκυττάρων από ΜΚΠΑ H περαιτέρω απομόνωση των Β λεμφοκυττάρων από τα ΜΚΠΑ έγινε με στρατηγική «αρνητικής επιλογής» με τη βοήθεια μαγνητικών σφαιριδίων που διατίθενται στο εμπόριο. Η διαδικασία περιλαμβάνει αναλυτικά: 1. Απόψυξη των ΜΚΠΑ σε υδατόλουτρο θερμοκρασίας 37 C 2. Πλύση κυττάρων με θρεπτικό υλικό RPMI-1640 στις 1500 στροφές/λεπτό για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου 3. Απόχυση υπερκειμένου και επαναραίωση κυτταρικού καθιζήματος σε 5ml RPMI Eπώαση κυτταρικών διαλυμάτων με DNAse (τελική συγκέντρωση 0.05mg/ml από αρχικό διάλυμα DNAse 1mg/ml) για 10 λεπτά 5. Διακοπή της ανωτέρω αντίδρασης με προσθήκη PBS 1X έως τελικού όγκου 10ml 6. Πλύση κυττάρων σε 1500στροφές/λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου 7. Καταμέτρηση κυττάρων με χρήση αιμοκυτταρόμετρου και προσθήκη διαλύματος MACS buffer MACS buffer PBS 1X (500ml) BSA 2.5gr EDTA 2mM (από αρχικό διάλυμα 0.5M ph=8.0) 8. Πλύση κυττάρων στις 1500 στροφές/λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου 9. Απόχυση υπερκειμένου 10. Επαναιώρηση κυττάρων σε MACS buffer σε τελικό όγκο 100μl 44

45 11. Eπώαση κυττάρων με κοκτέιλ αντισωμάτων συζευγμένων με βιοτίνη έναντι των CD2, CD14, CD16, CD36, CD43 και CD235a για 10 λεπτά σε θερμοκρασία 4 C. Tα αντισώματα αυτά δεσμεύονται στην επιφάνεια των Τ-λεμφοκυττάρων, των μονοκυττάρων, των δενδριτικών κυττάρων, των φυσικών φονέων και των ερυθρών κυττάρων, αφήνοντας ελεύθερα μόνο τα Β λεμφοκύτταρα. 12. Επώαση των σημασμένων κυττάρων με μαγνητικά σφαιρίδια (magnetic beads), τα οποία είναι συζευγμένα με μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της βιοτίνης για 15 λεπτά στους 4 C 13. Προσθήκη ΜΑCS buffer σε τελικό όγκο 5ml 14. Πλύση σημασμένων κυττάρων στις 1500 στροφές/λεπτό σε θερμοκρασία 4 C 15. Διέλευση των σημασμένων κυττάρων μέσα από ειδική λεπτή στήλη διαχωρισμού η οποία ήταν κατάλληλα προσαρμοσμένη σε ισχυρό μαγνητικό πεδίο Με την παραπάνω διαδικασία τα Β λεμφοκύτταρα διήλθαν μέσω της στήλης παραμένοντας άθικτα, ενώ τα υπόλοιπα κύτταρα που ήταν συζευγμένα με τα μαγνητικά σφαιρίδια κατακρατήθηκαν στο εσωτερικό της στήλης υπό την επίδραση του μαγνητικού πεδίου. Με τον τρόπο αυτό μας δόθηκε η δυνατότητα να λάβουμε δείγμα κυττάρων εμπλουτισμένο σε Β λεμφοκύτταρα, σε υψηλό ποσοστό, το οποίο σε κάθε περίπτωση ελέγχθηκε με κυτταρομετρία ροής και βρέθηκε να είναι πάνω από 95%. 45

46 Κυτταρομετρία ροής Μετά από την απομόνωση των Β λεμφοκυττάρων με μαγνητικό διαχωρισμό ακολούθησε η καταμέτρησή τους σε αιμοκυτταρόμετρο. 1. πλύση 0.5 x 10 6 Β λεμφοκυττάρων με PBS 1X σε ειδικά φιαλίδια κυτταρομετρίας στις 1700 στροφές για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου 2. Επώαση Β λεμφοκυττάρων με τα κατάλληλα μονοκλωνικά αντισώματα τα οποία είναι σημασμένα με φθοριόχρωμα, ή με τα αντίστοιχα ισοτυπικά αντισώματα (Πίνακας 2) σε πάγο για 1 ώρα στο σκοτάδι 3. Δύο πλύσεις των σημασμένων Β λεμφοκυττάρων με PBS 1X εμπλουτισμένο με 3% FBS και 0.1% NaN3, στις 1700 στροφές/λεπτό για 10 λεπτα σε θερμοκρασία 4 C. 4. Μονιμοποίηση των δειγμάτων με διάλυμα παραφορμαλδεΰδης 2% Η ανάλυση έγινε με κυτταρομετρία 3 χρωμάτων σε κυτταρομετρητή ροής Beckman Coulter Epics XL MCL. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση ένταση φθορισμού (mean fluorescence intensity, MFI) ± τιμή τυπικής απόκλισης (Standard deviation, SD) ή ως % έκφραση ± SD. Αντίσωμα Ισότυπος Σύζευξη με φθοριόχρωμα Αντι-CD20 Mouse ΙgG2a anti-human, PE clone B9E0 Aντι-CD21 Mouse ΙgG2a anti-human, FITC clone B-E5 Αντι-CD5 Mouse IgG1κ anti-human, clone UCHT2 PE-Cy5 Πίνακας 2: μονοκλωνικά αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για κυτταρομετρία ροής 46

47 Διέγερση Β λεμφοκυττάρων και απομόνωση πρωτεϊνών Τα Β λεμφοκύτταρα που απομονώθηκαν με την διαδικασία μαγνητικού εμπλουτισμού, όπως αυτή περιγράφηκε παραπάνω, διαχωρίστηκαν μετά από καταμέτρηση, σε δύο ίσα μέρη το καθένα εκ των οποίων περιείχε περίπου 2-3x10 6 Β λεμφοκύτταρα σε όγκο 0.5ml σε ειδικά φιαλίδια (eppendorfs). Το ένα μέρος διατηρήθηκε χωρίς καμμία διέγερση για 60 δευτερόλεπτα σε θρεπτικό υλικό αποτελούμενο από RPMI-1640 εμπλουτισμένο με FBS 15% σε θερμοκρασία 37 C. Tο δεύτερο μέρος επωάστηκε για 60 δευτερόλεπτα με 10μg ανά εκατομμύριο κύτταρα με το F(ab) τμήμα ενός ανθρώπινου ΙgM αντισώματος, επίσης σε θερμοκρασία 37 C, δοσολογία που θεωρήθηκε βέλτιστη μετά από σειρά πειραμάτων «δόσης-αποτελέσματος» (dose-response) σε Β λεμφοκύτταρα υγιών μαρτύρων (Εικόνα 2) Η αντίδραση διεκόπη με την προσθήκη 1ml ειδικού ρυθμιστικού διαλύματος (4 C) (stop buffer) αποτελούμενο από αναστολείς πρωτεασών και φωσφατασών (Πίνακας 3) 47

48 Unstim 10μg 20μg 40μg Εικόνα 2: Β λεμφοκύτταρα από υγιείς μάρτυρες είτε διατηρήθηκαν σε κατάσταση ηρεμίας είτε διεγέρθηκαν με το F(ab) τμήμα ενός ανθρώπινου IgM αντισώματος για 1 λεπτό σε θερμοκρασία 37 C,και σε δοσολογία 10μg, 20μg ή 40μg ανά εκατομμύριο κύτταρα. Απομονώθηκαν ολικές πρωτεΐνες από τα Β λεμφοκύτταρα και με μεθοδολογία ανοσοαποτυπώματος κατά Western ελέγξαμε τα επίπεδα φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών σε θέσεις τυροσίνης. Με βάση τα αποτελέσματα του πειράματος επιλέχθηκε η δοσολογία των 10μg ανά εκατομμύριο κύτταρα, καθώς η έκφραση των φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών σε θέσεις τυροσίνης ήταν εντονότερη σε σχέση με αυτή που προέκυψε από διέγερση των Β λεμφοκυττάρων με 20μg ή με 40μg. Για την απομόνωση πρωτεϊνών ακολουθήθηκε η εξής διαδικασία: 1. Μετά την προσθήκη stop buffer 1ml στα δείγματα, ακολούθησε φυγοκέντρηση στις στροφές/λεπτό για 60 δευτερόλεπτα, σε θερμοκρασία 4 C 2. Αναρρόφηση του υπερκειμένου με την βοήθεια αυτόματης πιπέτας 48

49 3. Eπώαση των κυττάρων με 50μl ανά δείγμα με ειδικό διάλυμα λύσης κυττάρων (lysis buffer) (Πίνακας 3). Η επώαση των δειγμάτων γινόταν σε πάγο και διαρκούσε συνολικά 45 λεπτά, με παράλληλη ανατάραξη των δειγμάτων διάρκειας 1 λεπτού σε μηχάνημα vortex ανά 15 λεπτά, ώστε να επιτευχθεί λύση του καθιζήματος 4. Φυγοκέντρηση των δειγμάτων στις στροφές ανά λεπτό για 15 λεπτά σε θερμοκρασία 4 C, ώστε να απαλλαχθούν από το μη-διαλυτό τους περιεχόμενο (κυτταροσκελετός) και φύλαξη ολικής πρωτεΐνης σε βαθιά κατάψυξη (-80 C) Stop Buffer Αρχικό διάλυμα Tris base 1Μ EDTA (ph = 8.0) 0.5Μ NaCl 0.5Μ NaF 1Μ Na 3VO 4 100mM Νa 4P 2O 7 0.3Μ PMSF 50mM Aprotinin 10μg/ml Leupeptin 5μg/ml Tελική συγκέντρωση 10mM 5mM 50mM 50mM 1mM 30mM 1mM 2mg/ml 2mg/ml Lysis Buffer Προσθήκη στο stop buffer Triton X-100 σε τελική συγκέντρωση 0.02% Πινακας 3: Διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση ολικής πρωτεΐνης από τα Β λεμφοκύτταρα 49

50 Ανοσοαποτύπωμα κατά Western 1. Προσδιορισμός συγκέντρωσης της ολικής πρωτεΐνης στα κυτταρικά διαλύματα με φωτομέτρηση στα 595nm με τη βοήθεια συνήθους μεθοδολογίας ( Bio-Rad protein assay) 2. Προετοιμασία δειγμάτων με προσθήκη loading buffer (αρχικό διάλυμα 2X) και reducing agent (αρχικό διάλυμα 10X) σε τελική συγκέντρωση 1Χ 3. Γρήγορη φυγοκέντρηση ( στροφές για 15 δευτερόλεπτα) 4. Βρασμός δειγμάτων στους 95 C για 5 λεπτά 5. Γρήγορη φυγοκέντρηση ( στροφές για 15 δευτερόλεπτα) 6. Ανάλυση πρωτεϊνών (ποσότητα 10μg ανά δείγμα) σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 10% (SDS-PAGE) σε Running Buffer 1X στα 125V για περίπου 1.5 ώρα 7. Πλύση του πηκτώματος σε Transfer Buffer για περίπου 10 λεπτά 8. Διαπότιση μεμβράνης νιτροκυτταρίνης με Transfer buffer 1X 9. Hλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (semi-dry transfer), σε συνθήκες 15V για 20 λεπτά 10. Επώαση μεμβράνης μετά το πέρας της ηλεκτρομεταφοράς σε διάλυμα TBS 1X εμπλουτισμένου με 0.25% Tween-20 (TBS-T) και 2% ΒSA για 1 ώρα περίπου σε θερμοκρασία δωματίου, ώστε να καλυφθούν οι μη-ειδικές θέσεις δέσμευσης 11. Υβριδοποίηση μεμβράνης με το κατάλληλο πρώτο αντίσωμα, σε TBS-T 0.25% εμπλουτισμένου με 5% BSA (ολονύκτια επώαση) σε θερμοκρασία 4 C και σε συνθήκες ήπιας ανάδευσης 12. Τρεις πλύσεις της μεμβράνης με ΤΒS-T 0.05% διάρκειας 10 λεπτών 50

51 13. Επώαση μεμβράνης με το κατάλληλο δεύτερο αντίσωμα (συζευγμένο με υπεροξειδάση) σε ΤΒS-T 0.25% εμπλουτισμένου με 5% BSA, για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου Προετοιμασία μεμβράνης για εμφάνιση (τα ανωτέρω βήματα παραλείπονται στην περίπτωση που το πρώτο αντίσωμα ήταν συζευγμένο με υπεροξειδάδη): 1. Πέντε πλύσεις της μεμβράνης με TBS-T 0.05% διάρκειας 5 λεπτών 2. Πλύση της μεμβράνης με TBS για 20 λεπτά 3. Ανίχνευση σήματος με χρήση του ECL plus συστήματος (Amersham) 4. Έκθεση μεμβράνης σε φιλμ αυτορραδιογραφίας Kodak X-Omat LS Τα διαλύματα και τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για την διενέργεια ανοσοαποτυπωμάτων κατά Western συνοψίζονται στους πίνακες 4 και 5 αντιστοίχως. Ο ποσοτικός προσδιορισμός (densitometry) των αποτελεσμάτων μετά από κάθε ανοσοαποτύπωμα κατά Western έγινε από τα φιλμ αυτορραδιογραφίας με τη βοήθεια ειδικού υπολογιστικού προγράμματος (ScnImage). Τα αποτελέσματα όλων των πειραμάτων διορθώθηκαν ως προς την έκφραση της πρωτεΐνης GAPDH (αφυδρογονάση της 3 φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης), μιας πρωτεΐνης η οποία εκφράζεται σταθερά και σε υψηλά επίπεδα στα περισσότερα κύτταρα του οργανισμού ως «house-keeping» πρωτεΐνη, και εκφράστηκαν ως ο λόγος της έκφρασης της εκάστοτε πρωτεΐνης προς την έκφραση της GAPDH πρωτεΐνης ± SD 51

52 Loading Buffer 2X 10ml Tris-base 0.5M 10ml Glycerol 1gr SDS 0.5ml Bromophenol Blue 2% Διάλυση σε 50ml απιονισμένου ύδατος 29 gr/lt Tris-base Running Buffer 10X 144gr/lt Glykine 10gr/lt SDS Διάλυση σε απιονισμένο ύδωρ 48.5gr/lt Tris-base Transfer Buffer 25X 180gr/lt Glykine Διάλυση σε απιονισμένο ύδωρ 2.42gr/lt Tris-base TBS 1X 8gr NaCl 3.8ml HCl 1N για τελικό διάλυμα όγκου 1lt Διάλυση σε απιονισμένο ύδωρ TBS-T 0.25% Προσθήκη Τween-20 (250μl σε 100ml TBS 1X) TBS-T 0.05% Προσθήκη Tween-20 (50μl σε 100ml TBS 1X) Πίνακας 4: Διαλύματα που παρασκευάστηκαν για την διενέργεια ανοσοαποτυπώματος κατά Western 52

53 1 ο αντίσωμα Τύπος αντισώματος Τίτλος Έναντι φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών- recombinant 4G10 (συζευγμένο με υπεροξειδάση) Lyn Syk Anti-human Chinese Hamster Ovary Anti-human rabbit polyclonal Anti-human mouse monoclonal 1:1000 1:500 1:500 SHP-1 (συζευγμένο με υπεροξειδάση) Anti-human goat polyclonal 1:500 Έναντι φωσφορυλιωμένης Syk στη θέση τυροσίνης 348 (PY348-Syk) Anti-human mouse monoclonal 1:500 GAPDH (συζευγμένο με υπεροξειδάση) Αnti-human rabbit polyclonal 1:500 2 ο αντίσωμα (Συζευγμένο με υπεροξειδάση) Τύπος αντισώματος Τίτλος Goat anti-rabbit polyclonal 1:2000 Goat anti-mouse polyclonal 1:2000 Πίνακας 5: Αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για τα ανοσοαποτυπώματα κατά Western 53

54 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Τα επίπεδα της Lyn αυξάνονται στα Β λεμφοκύτταρα ασθενών που λαμβάνουν θεραπεία με αντι-tnfα βιολογικό παράγοντα. Τόσο η μειωμένη έκφραση των επιπέδων της Lyn όσο και η αυξημένη ενζυματική της δραστηριότητα έχουν συσχετισθεί με ορολογικές και κλινικές εκδηλώσεις αυτοανοσίας σε πειραματικά μοντέλα λύκου αλλά και στον ανθρώπινο ΣΕΛ. Για να ερευνήσουμε αν και κατά πόσο επιδρά η θεραπεία με αντι-tnfα βιολογικό παράγοντα στην έκφραση της κινάσης Lyn, μελετήσαμε τα επίπεδα της Lyn σε εκχύλισμα ολικής πρωτεΐνης που απομονώθηκε από τα Β λεμφοκύτταρα 17 ασθενών πριν (ημέρα 0) και μετά την έναρξη θεραπείας με ανταγωνιστή του TNFα (30 η εβδομάδα), με μεθοδολογία ανοσοαποτυπώματος κατά Western. Παράλληλα με την Lyn εξετάσαμε την έκφραση και άλλων μορίων-κλειδιών που ενεργοποιούνται κατά την διέγερση του BCR όπως είναι η κινάση Syk, η οποία προωθεί τη διέγερση του Β λεμφοκυττάρου, και η φωσφατάση SHP-1 που ασκεί ρυθμιστικό/ανασταλτικό ρόλο. Τα αποτελέσματα όλων των πειραμάτων διορθώθηκαν ως προς την έκφραση της πρωτεΐνης GAPDH, μιας «house-keeping» πρωτεΐνης με σταθερή έκφραση στα κύτταρα. Για τη διόρθωση αυτή χρησιμοποιήσαμε τον λόγο της εκάστοτε πρωτεΐνης (Lyn, Syk, SHP-1) προς την έκφραση της GADPH. Βρήκαμε ότι σε ασθενείς που υποβάλλονται σε θεραπεία με αντι-tnfα βιολογικό παράγοντα τα επίπεδα της Lyn αυξάνονται σημαντικά (μέση έκφραση της Lyn/GAPDH ± SD: ± vs ± την ημέρα 0 και 30 εβδομάδες μετά την έναρξη της αντι-tnfα αγωγής αντιστοίχως, p = 0.003) (Εικόνα 3). Η αύξηση των επιπέδων της Lyn διαπιστώθηκε στους 13 από τους 17 ασθενείς που αναλύθηκαν και αφορούσε και τις δύο ισομορφές της Lyn. Σε μερικούς ασθενείς (ν = 3) μελετήθηκε η έκφραση των επιπέδων της Lyn 54

55 σε ενδιάμεσες χρονικές περιόδους και συγκεκριμένα, την 6 η και 14 η εβδομάδα από την ημέρα έναρξης της αντι-tnfα θεραπείας και ήταν εμφανές ότι η αύξηση των επιπέδων της Lyn ήταν προοδευτική και σχεδόν γραμμική (Εικόνα 3Α και Ε). Εικόνα 3: Η έκφραση της κινάσης Lyn σε ασθενείς με φλεγμονώδεις αρθρίτιδες πριν και μετά την έναρξη θεραπείας με αντι-tnfα βιολογικό παράγοντα. Τα επίπεδα της Lyn αυξήθηκαν σε μη-διεγερμένα Β λεμφοκύτταρα μετά από θεραπεία με αντι-tnfα βιολογικό παράγοντα (Α) σε ασθενή με ΣπΑ και (Β) σε ασθενή με ΡΑ (αντιπροσωπευτικά πειράματα). (Γ) Απεικόνιση συγκεντρωτικών αποτελεσμάτων των επιπέδων της Lyn πριν και μετά την έναρξη αγωγής με ανταγωνιστή του TNFα. Τα αποτελέσματα έχουν διορθωθεί ως προς την έκφραση της πρωτεΐνης GAPDH και αποτελούν τον λόγο έκφρασης της Lyn προς την έκφραση της GAPDH. (Δ) H αυξημένη έκφραση της Lyn αφορούσε κατά κύριο λόγο ασθενείς με ΣπΑ, αλλά δεν αποτελούσε χαρακτηριστικό των ασθενών με ΡΑ. Επίσης, δεν παρατηρήθηκε διαφορά στα επίπεδα της Lyn μεταξύ υγιών μαρτύρων και ασθενών με ΡΑ ή ΣπΑ πριν την έναρξη της θεραπείας με αντι-tnfα. (Ε) Τα επίπεδα της Lyn αυξήθηκαν προοδευτικά στο διάστημα των 30 εβδομάδων της μελέτης (δεδομένα από 3 ασθενείς πριν από την έναρξη της αγωγής με αντι- TNFα και κατά την 6 η, 14 η και 30 η εβδομάδα χορήγησης αντι-tnfα θεραπείας). 55

56 Από την μελέτη των επιπέδων της κινάσης Syk και της φωσφατάσης SHP-1 δεν προέκυψαν στατιστικά σημαντικές αλλάγες πριν και μετά την έναρξη θεραπείας με αντι-tnfα βιολογικό παράγοντα (μέση έκφραση Syk/GAPDH ± SD: ± vs ± 0.135, σε χρόνο 0 και την 30 η εβδομάδα αντίστοιχα, p= NS, και μέση έκφραση SHP-1/GAPDH± SD: ± vs ± την ημέρα 0 και 30 εβδομάδες μετά την έναρξη της αντι-τνfα θεραπείας, p=ns) (Εικόνα 4). Η αύξηση των επιπέδων της Lyn χαρακτήριζε κατά κύριο λόγο τους ασθενείς με ΣπΑ. Συγκεκριμένα, η Lyn αυξήθηκε σε 11 ασθενείς με ΣπΑ από τους 12 συνολικά που αναλύθηκαν (μέση έκφραση Lyn/GAPDH± SD: ± vs ± 0.186, σε χρόνο 0 και την 30 η εβδομάδα της θεραπείας με αντι-tnfα παράγοντα, p= ). Στους ασθενείς με ΡΑ (ν = 5) τα επίπεδα της Lyn φάνηκε να έχουν αυξητική τάση χωρίς οι διαφορές να είναι στατιστικά σημαντικές (μέση έκφραση Lyn/GAPDH ± SD: ± vs ± πριν και μετά την έναρξη αντι-tnfα αγωγής αντιστοίχως, p=ns). Tα επίπεδα της Lyn μεταξύ υγιών μαρτύρων (Lyn/GAPDH ± SD: ± 0.231), ασθενών με ΡΑ (Lyn/GAPDH ± SD: ± 0.136) ή με ΣπΑ (Lyn/GAPDH± SD: ± 0.153) πριν την έναρξη αγωγής με αντι-tnfα παράγοντες δεν παρουσίασαν διαφορές. 56

57 Εικόνα 4: Έκφραση των επιπέδων της κυτταροπλασματικής κινάσης Syk και της φωσφατάσης SHP-1 σε μη-διεγερμένα περιφερικά Β λεμφοκύτταρα ασθενών πριν και μετά την έναρξη αγωγής με αντι-tnfα βιολογικό παράγοντα. Τα επίπεδα της Syk και της SHP-1 παρέμειναν αμετάβλητα πριν και μετά την θεραπεία με ανταγωνιστή του TNFα. Αντίθετα παρατηρείται αύξηση των επιπέδων της Lyn σε (Α) ασθενή με σύνδρομο SAPHO και (Β) σε ασθενή με ΡΑ. Οι αλλαγές των επιπέδων της Lyn ήταν ανεξάρτητες από την ενεργότητα της νόσου, όπως αυτή υπολογίστηκε σύμφωνα με τους δείκτες ενεργότητας της νόσου BASDAΙ για τους ασθενείς με ΑΣ (r = , p= NS) και DAS-28 για τους ασθενείς με ΡΑ (r = , p = NS) και παρατηρήθηκαν τόσο στους ασθενείς που ανταποκρίθηκαν κλινικά στην θεραπεία με αντι-τνfα παράγοντες όσο και σε εκείνους που δεν ανταποκρίθηκαν. 57

58 Η αύξηση των επιπέδων της κινάσης Lyn σχετίζεται με αύξηση της ενζυματικής της δραστηριότητας σε ασθενείς που λαμβάνουν θεραπεία με αντι-tnfα βιολογικούς παράγοντες Η αύξηση των ενδοκυτταρίων επιπέδων της κινάσης Lyn θα μπορούσε να σχετίζεται με αύξηση της ενζυματικής της δραστηριότητας, αλλά με τα προηγούμενα πειράματά μας δεν απαντούμε ευθέως στο ερώτημα αυτό. Για να διερευνήσουμε κατά πόσο η κινάση Lyn διατηρεί την ενζυματική της δραστηριότητα σε ασθενείς μετά από θεραπεία με αντι-tnfα παράγοντα, εξετάσαμε τα επίπεδα της φωσφορυλιώμενης κινάσης Syk στην θέση τυροσίνης 348 (ΡΥ348-Syk). Η τυροσίνη που βρίσκεται στην θέση 348 φωσφορυλιώνεται άμεσα από την κινάση Lyn μετά από διέγερση του BCR και οδηγεί στην πλήρη ενεργοποίηση της Syk (Keshvara LM, 1998). Aπομονώσαμε Β λεμφοκύτταρα από το περιφερικό αίμα τριών ασθενών (2 με ΣπΑ και 1 με ΡΑ) πριν και μετά την έναρξη θεραπείας με αντι-tnfα βιολογικό παράγοντα, καθώς επίσης και από τρεις υγιείς μαρτυρες. Τα Β λεμφοκύτταρα είτε διατηρήθηκαν σε κατάσταση ηρεμίας σε θερμοκρασία 37 C είτε διεγέρθηκαν με 10μg ανά εκατομμύριο κύτταρα με το F(ab) τμήμα ενός ανθρώπινου IgM αντισώματος για 1 λεπτό σε θερμοκρασία 37 C, δόση που θεωρήθηκε βέλτιστη σύμφωνα με καμπύλη δόσης-αποτελέσματος που καταστρώσαμε πειραματικά. Η μελέτη των επιπέδων της φωσφορυλιωμένης Y348-Syk έγινε σε εκχύλισμα ολικής πρωτεΐνης Β λεμφοκυττάρων με ανοσοαποτύπωμα κατά Western, με τη χρήση μονοκλωνικού αντισώματος (purified mouse anti-syk PY348) που ανιχνεύει αποκλειστικά αυτό το φωσφορυλιωμένο υπόλειμμα τυροσίνης που βρίσκεται μόνο στην πρωτεΐνη Syk και όχι σε άλλη πρωτεΐνη. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ο λόγος της PY348-Syk μετά την θεραπεία με αντι-tnfα παράγοντα προς τα επίπεδα της PY348-Syk πριν την έναρξη 58

59 της αγωγής. Από τα πειράματα αυτά διαπιστώσαμε ότι τα επίπεδα της PΥ348-Syk αυξήθηκαν κατά 2.9 φορές στα εν ηρεμία Β λεμφοκύτταρα και των τριών ασθενών (p= 0.05) (Εικονα 5), ενώ σύμφωνα με τα προαναφερθέντα πειράματα τα επίπεδα της πρωτεΐνης Syk παραμένουν ανεπηρέαστα πριν και μετά την έναρξη αγωγής. Φαίνεται, επομένως, ότι μετά την έναρξη θεραπείας με αντι-tnfα βιολογικό παράγοντα όχι μόνο αυξάνονται τα επίπεδα της κινάσης Lyn, αλλά διατηρεί πλήρως την ενζυματική της δραστηριότητα και συμμετέχει στην ενεργοποίηση κεντρικών μορίων-κλειδιών στην σηματοδότηση του BCR, όπως είναι η Syk. Εικόνα 5: επίπεδα της φωσφορυλιωμένης Syk στην θέση τυροσίνης 348 (ΡΥ348- Syk) (A) επώαση Β λεμφοκυττάρων υγιών μαρτύρων με F(ab) τμήμα ενός ανθρώπινου ΙgM αντισώματος για 60 δευτερόλεπτα έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση των επιπέδων της ΡY348- Syk (Β) Έκφραση της Lyn και της ΡY348-Syk σε μη-διεγερμένα Β λεμφοκύτταρα ασθενούς με ΣπΑ ο οποίος έλαβε θεραπεία με αντι-tnfα βιολογικό παράγοντα. Τα επίπεδα της Lyn καθώς και της ΡΥ348-Syk αυξάνονται κατά τη διάρκεια της θεραπείας (αντιπροσωπευτικό πείραμα) (Γ) συγκεντρωτικά αποτελέσματα της έκφρασης της ΡΥ348-Syk πριν και 30 εβδομάδες μετά την έναρξη αγωγής με ανταγωνιστή του TNFα. Τα αποτέλεσματα εκφράστηκαν ως ο λόγος της ΡY348-Syk μετά από θεραπεία με αντι-tnfα παράγοντα προς τα baseline επίπεδα προ της ενάρξεως της αγωγής. 59

60 Αύξηση των επιπέδων των φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών σε θέσεις τυροσίνης σε μη-διεγερμένα Β λεμφοκύτταρα ασθενών υπό θεραπεία με ανταγωνιστές του TNFα. To πρώτο ανιχνεύσιμο βιοχημικό συμβάν στο κυτταρόπλασμα του Β-λεμφοκυττάρου, μετά την διέγερση του BCR, είναι η παραγωγή φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών σε θέσεις τυροσίνης (P-Y), και οφείλεται στην ενεργοποίηση των κινασών της οικογένειας Src (Lyn, Fyn, Blk κτλ). Τα παρακάτω πειράματα διενεργήθησαν για να διαπιστώσουμε εάν τα αυξημένα επίπεδα της Lyn, μετά από αγωγή με αντι-tnfα βιολογικό παράγοντα σχετίζονται με την ενεργοποίηση της οδού του BCR και την παραγωγή Ρ-Υ πρωτεϊνών. Για το λόγο αυτό απομονώσαμε Β λεμφοκύτταρα από το περιφερικό αίμα ασθενών πριν και μετά την έναρξη θεραπείας με αντι-tnfα βιολογικό παράγοντα. Ένα μέρος αυτών των Β λεμφοκυττάρων διατηρήθηκε σε ηρεμία και τα υπόλοιπα τα διεγείραμε με 10μg ανά εκατομμύριο κύτταρα με το F(ab) τμήμα ενός ανθρώπινου IgM αντισώματος, σε θερμοκρασία 37 C για 60 δευτερόλεπτα. Τα επίπεδα των Ρ-Υ πρωτεϊνών βρέθηκαν να είναι αυξημένα στο κυτταρόπλασμα Β λεμφοκυττάρων (που δεν είχαν υποστεί διέγερση) σε 9 από τους 16 ασθενείς (11 με ΣπΑ και 5 με ΡΑ) μετά από την έναρξη θεραπείας με ανταγωνιστές του TNFα, σε σύγκριση με τα μη-διεγερμένα Β λεμφοκύτταρα των ιδίων πριν την έναρξη της συγκεκριμένης αγωγής, αλλά και των Β λεμφοκυττάρων υγιών μαρτύρων, χωρίς ωστόσο η αύξηση αυτή να φτάσει επίπεδα στατιστικής σημαντικότητας (μέση έκφραση P-Y/GAPDH ± SD: 24,900 ± 5,214 vs. 30,320 ± 11,180 την ημέρα 0 και την 30 η εβδομάδα της θεραπείας, p = 0.064) (Εικόνα 6). 60

61 Εικόνα 6: επίπεδα των Ρ-Υ πρωτεϊνών σε ασθενή με ΣπΑ πριν και μετά την θεραπεία με αντι- TNFα βιολογικό παράγοντα και σε υγιή μάρτυρα (αντιπροσωπευτικό πείραμα). (Α) Απομονώσαμε Β λεμφοκύτταρα από περιφερικό αίμα με μαγνητικό διαχωρισμό και είτε τα διατηρήσαμε σε κατάσταση ηρεμίας είτε τα διεγείραμε με 10μg aνά εκατομμύριο κύτταρα με F(ab) τμήμα ενός ανθρώπινου ΙgM αντισώματος για 60 δευτερόλεπτα σε θερμοκρασία δωματίου. Τα επίπεδα των Ρ-Υ πρωτεϊνών αξιολογήθηκαν με ανοσοαποτύπωμα κατά Western. Οι Ρ-Υ πρωτεΐνες ήταν αυξημένες στα μη-διεγερμένα Β λεμφοκύτταρα ασθενών που έλαβαν θεραπεία με αντι-tnfα βιολογικούς παράγοντες σε σχέση με τα μη-διεγερμένα Β λεμφοκύτταρα των ιδίων προ θεραπείας και με τα μη-διεγερμένα Β λεμφοκύτταρα υγιών εθελοντών. Παράλληλα παρατηρήθηκε αύξηση των επιπέδων της Lyn. (B) Διέγερση των Β λεμφοκυττάρων των υπο αντι-tnfα ασθενών με F(ab) τμήμα ενός ανθρώπινου ΙgM αντισώματος είχε ως αποτέλεσμα την περαιτέρω επίταση των Ρ-Υ πρωτεΐνών σε επίπεδα παρόμοια με αυτά που παρατηρούνται στα διεγερμένα Β λεμφοκύτταρα των ασθενών πριν την έναρξη της αγωγής και των υγιών μαρτύρων. (Γ) συγκεντρωτικά αποτελέσματα των μετρήσεων των Ρ-Υ πρωτεϊνών πριν και μετά την θεραπεία με αντι-tnfα αγωγής. Ct= υγιής μάρτυρας 61

62 Η αύξηση των επιπέδων των Ρ-Υ πρωτεϊνών αφορούσε κυρίως τις πρωτεΐνες μεταξύ 37 και 100kDa και η αύξησή τους ήταν εμφανής ήδη από την 6 η εβδομάδα θεραπείας με αντι-tnfα βιολογικό παράγοντα (Εικόνα 6Β). Η διέγερση του BCR με το F(ab) τμήμα του ανθρώπινου ΙgM αντισώματος είχε ως αποτελέσμα την περαιτέρω αύξηση των Ρ-Υ πρωτεϊνών, υποδηλώνοντας ότι η οδός μεταγωγής του σήματος μέσω του BCR υποδοχέα παραμένει άθικτη (Εικόνα 6Β). Κατά πόσο τα παραπάνω ευρήματα σχετίζονται με τη χρήση κάποιου συγκεκριμένου αντι-tnfα βιολογικού παράγοντα ή τελικά αντιπροσωπεύουν χαρακτηριστικό γνώρισμα της ευρύτερης αυτής κατηγορίας φαρμάκων είναι κάτι το οποίο δεν κατέστη δυνατό να διερευνηθεί περαιτέρω, καθώς η πλειοψηφία των υπό μελέτη ασθενών έλαβε infliximab ή adalimumab και μόνο 2 ασθενείς έλαβαν θεραπεία με etanercept. H θεραπεία με αντι-τνfα επάγει την έκφραση του CD20, αλλά όχι του CD21 στην επιφάνεια των περιφερικών Β λεμφοκυττάρων Για να διερευνήσουμε αν και κατά πόσο η θεραπεία με αντι-tnfα βιολογικούς παράγοντες θα μπορούσε να προκαλέσει αλλαγές στον φαινότυπο του Β λεμφοκυττάρου σε μόρια που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση και τη διατήρηση της διέγερσής του, αναλύσαμε τα Β λεμφοκύτταρα 28 ασθενών (16 ασθενείς με ΣπΑ, 10 με ΡΑ, 1 με σύνδρομο SAPHO και 1 με νόσο Αδαμαντιάδη-Βehçet) καθώς και 10 υγιείς μάρτυρες για την έκφραση των δεικτών επιφανείας CD20 και CD21. H ανάλυση πραγματοποιήθηκε με κυτταρομετρία ροής 2 χρωμάτων. Η έκφραση του CD20 αυξήθηκε σε 16 από τους 28 ασθενείς μετά από θεραπεία με αντι-tnfα βιολογικό παράγοντα [μέση ένταση φθορισμού (MFI) του CD20 ± SD: ± vs ± την ημέρα 0 και την 30 η εβδομάδα της θεραπείας με ανταγωνιστή 62

63 του TNFα, p = 0.009] (Εικόνα 7Α, Γ και Ε). H αύξηση της έκφρασης του CD20 ήταν περισσότερο εμφανής σε ασθενείς με ΡΑ, αλλά όχι σε ασθενείς με ΣπΑ. Πιο συγκεκριμένα διαπιστώθηκε αύξηση της έκφρασης του CD20 μετά την έναρξη αντι- TNFα αγωγής σε 8 από 10 ασθενείς με ΡΑ (μέσο MFI ± SD: ±2.012 vs ± σε χρόνο 0 και την 30 η εβδομάδα, p = 0.038). Στους ασθενείς με ΣπΑ (ν = 16) η αύξηση του CD20 ήταν εμφανής σε 7 από τους 16 ασθενείς που αναλύθηκαν (μέσο MFI ± SD: ± vs ± 1.219, την ημέρα 0 και την 30 η εβδομάδα αντιστοίχως, p = NS) (Εικόνα 7ΣΤ). H ένταση της έκφρασης του CD20 στην επιφάνεια των περιφερικών Β λεμφοκυττάρων πριν την έναρξη αγωγής με ανταγωνιστές του TNFα δεν διέφερε μεταξύ των ασθενών με ΡΑ (μέσο MFI ± SD: ± 2.012) ή με ΣπΑ (μέσο MFI ± SD: ± 1.219) και υγιών μαρτύρων (μέσο MFI ± SD: ± 1.901) (p = NS). Παρά το γεγονός ότι η πλειοψηφία των ασθενών της μελέτης ανταποκρίθηκαν κλινικά στην αγωγή με τους αντι-tnfα βιολογικούς παράγοντες, η επαγωγή της έκφρασης του CD20 παρατηρήθηκε και στα Β λεμφοκύτταρα ασθενών οι οποίοι δεν ωφελήθηκαν από τη συγκεκριμένη θεραπευτική αντιμετώπιση, πράγμα που υποδηλώνει ότι η αύξηση της έκφρασης του CD20 είναι αποτέλεσμα της χορήγησης ανταγωνιστή του TNFα και δεν σχετίζεται με την ενεργότητα της νόσου. Δεν διαπιστώθηκε κάποια συσχέτιση ανάμεσα στη μέση ένταση φθορισμού του CD20 (MFI) και τις τιμές του DAS-28 για τους ασθενείς με ΡΑ (r = , p = NS) ή του BASDAI για τους ασθενείς με ΣπΑ (r = , p = NS). Σχετικά με το CD21, γνωρίζουμε ότι η έκφρασή του είναι μειωμένη στα Β λεμφοκύτταρα ασθενών με ΣΕΛ και η μείωση αυτή είναι αντιστρόφως ανάλογη της ενεργότητας της νόσου. Σύμφωνα με τα δικά μας πειράματα η έκφραση του CD21 στην επιφάνεια των CD20 + B λεμφοκυττάρων παρέμεινε ανεπηρέαστη στους ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με αντι-tnfα βιολογικό παράγοντα (μέσο MFI ± SD: 63

64 2.230 ± vs ± 0.564, την ημέρα 0 και την 30 η εβδομάδα αντιστοίχως, p = NS) (Εικόνα 7Β και Δ). Εικόνα 7: Έκφραση του CD20 και του CD21 στην επιφάνεια Β λεμφοκυττάρων από δύο ασθενείς με φλεγμονώδη αρθροπάθεια πριν (καμπύλη με σκίαση) και μετά την θεραπεία με αντι-tnfα βιολογικό παράγοντα. (Α) αύξηση έκφρασης του CD20 μετά από θεραπεία με αντι- TNFα σε ασθενή με ΣπΑ, ενώ η έκφραση του CD21 παραμένει ανεπηρέαστη (Β). (Γ) Η έκφραση του CD20 αυξάνεται σε ασθενή με ΡΑ μετά από 30 εβδομάδες θεραπείας με αντι- TNFa παράγοντα. (Δ) Η έκφραση του δείκτη επιφανείας CD21 δεν μεταβάλλεται πριν και μετά τη θεραπεία με ανταγωνιστή του TNFα στον ίδιο ασθενή με ΡΑ. Τα συγκεντρωτικά αποτελέσματα του ΜFI του CD20 υγιών μαρτύρων και ασθενών απεικονίζονται στο (Ε). Η αύξηση της έκφρασης του CD20 χαρακτήριζε τους ασθενείς με ΡΑ (p = 0.038), αλλά όχι τους ασθενείς με ΣπΑ. 64

65 Σε ασθενείς υπό θεραπεία με αντι-tnfα βιολογικούς παράγοντες αυξάνεται το ποσοστό των κυκλοφορούντων CD5 + B λεμφοκυττάρων Τα CD5 + B λεμφοκύτταρα αποτελούν έναν υποπληθυσμό Β λεμφοκυττάρων τα οποία θεωρούνται υπεύθυνα για την παραγωγή των φυσικών αυτοαντισωμάτων και τα οποία θα μπορούσαν ενδεχομένως να παίζουν ρόλο στην επαγωγή αυτοανοσίας που προκαλείται από την χρήση των ανταγωνιστών του TNFα και η οποία χαρακτήριζεται από την παρουσία IgM τύπου αυτοαντισωμάτων. Για εξετάσουμε την πιθανή επίδραση των αντι-tnfα βιολογικών παραγόντων στα περιφερικά CD5 + B λεμφοκύτταρα, αναλύσαμε τα ποσοστά των κυκλοφορούντων CD20 + B λεμφοκυττάρων που εκφράζουν στην επιφάνειά τους τον δείκτη CD5 πριν και μετά την έναρξη αγωγής με αντι-tnfα βιολογικό παράγοντα. Τα CD5 + B λεμφοκύτταρα αυξήθηκαν σημαντικά στην περιφέρεια σε ασθενείς (ν = 12) που ξεκίνησαν αντι- TNFα αγωγή (μέσο ποσοστό ± SD: 5.4 ± 3.5 vs. 7.4 ± 5.4, την ημέρα 0 και την 30 η εβδομάδα θεραπείας αντιστοίχως, p = 0.031) (Εικόνα 8). H διαπιστωθείσα αυξηση του ποσοστού των κυκλοφορούντων CD5 + B λεμφοκυττάρων μπορεί εν μέρει να συνεισφέρει στην εμφάνιση της αντι-tnfα επαγόμενης αυτοανοσίας. 65

66 Εικόνα 8 : ποσοστό των κυκλοφορούντων CD20 + CD5 + κυττάρων σε ασθενείς υπό θεραπεία με αντι-tnfα βιολογικό παράγοντα. Το ποσοστό των CD5 + B λεμφοκυττάρων αυξάνεται σε ασθενείς που λαμβάνουν αγωγή με ανταγωνιστές του TNFα σε (Α) ασθενή με ΣπΑ και (Β) ασθενή με ΡΑ (αντιπροσωπευτικά πειράματα). Τα συγκεντρωτικά αποτελέσματα απεικονίζονται στην εικόνα (Γ). 66