Ορισµός αντοχής. µείωση στην ανασταλτική επίδραση της θεραπείας στον ιικό πολλαπλασιασµό. θεραπείας. ιολογικής ανταπόκρισης στη θεραπεία

Transcript

1

2 Ορισµός αντοχής ü Ως αντοχή στην αντιρετροϊκή θεραπεία ορίζεται η µείωση στην ανασταλτική επίδραση της θεραπείας στον ιικό πολλαπλασιασµό ü Η αντοχή µπορεί και να προϋπάρχει της θεραπείας ü Η αντοχή µπορεί να είναι συνέπεια, ή αιτία της µη ιολογικής ανταπόκρισης στη θεραπεία

3 Γενετική ετερογένεια (1) Ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά του ιού είναι η εκτενής γενετική του ετερογένεια που είναι συνέπεια του ότι: Ο ιός ενσωµατώνει ~ 1 µεταλλαγή ανά γονιδίωµα ανά κύκλο πολλαπλασιασµού Ο ιός HIV πολλαπλασιάζεται µε ρυθµούς ~ ιικά σωµάτια την ηµέρα Παρουσιάζει υψηλό ρυθµό ανασυνδυασµού (7-30/γονιδίωµα) Ho et al. 1995; Wei et al. 1995; Perelson et al. 1996; Mansky and Temin 1995; O Neil et al. 2002; Abram et al. 2010

4 Γενετική ετερογένεια (2) Τα παραπάνω έχουν ως συνέπεια ο ιός να πολλαπλασιάζεται µε τη µορφή ενός γενετικά ετερογενούς πληθυσµού: O ιός, σε κάθε χρονική στιγµή, αποτελείται από µεγάλο πλήθος στελεχών που διαφέρουν γενετικά µεταξύ τους (quasispecies) Ε π ε ι δ ή ο χ ρ ό ν ο ς η µ ί σ ε ι α ς ζω ή ς τ ω ν περισσότερων κυττάρων στόχων είναι πολύ µικρός, ο πληθυσµός του HIV ανανεώνεται κατά το ήµισυ σε περίπου 15 µέρες Ho et al. 1995; Wei et al. 1995; Perelson et al. 1996; Mansky and Temin 1995; O Neil et al. 2002; Abram et al. 2010

5 Καταστολή ιικού πολ/σµού και αντοχή (2) Έναρξη θεραπείας Κυρίαρχο στέλεχος Στελέχη µε φυσικούς πολυµορφισµούς ΙΙκός πολλαπλασιασµός Ανθεκτικά στελέχη Μερική καταστολή - Μικρή δραστικότητα/επίπεδα φαρµάκου - Μη ικανοποιητική συµµόρφωση Χρόνος Όριο ανίχνευσης

6 Καταστολή ιικού πολ/σµού και αντοχή (1) Έναρξη θεραπείας Κυρίαρχο στέλεχος Ιικός πολλαπλασιασµός Μέγιστη καταστολή = Πολύ µικρή πιθανότητα αντοχής Χρόνος Στελέχη µε φυσικούς πολυµορφισµούς Όριο ανίχνευσης

7 Δυνατότητα ανάπτυξης αντοχής ü Λόγω των χαρακτηριστικών του ιικού πολλαπλασιασµού: Οποιαδήποτε απλή µεταλλαγή προϋπάρχει της θεραπείας Μαθηµατικά µοντέλα υποδεικνύουν ότι αν η θεραπεία απαιτεί τουλάχιστον 3 µεταλλαγές αντοχής τότε επιτυγχάνει ιική καταστολή Ο αριθµός µεταλλαγών αντοχής χαρακτηρίζεται ως γενετικός φραγµός Frost and McLean 1994; Coffin 1995; Nowak et al. 1997; Stengel 2008

8 Συνδυαστική θεραπεία ü Σε αυτήν τη απλή αλλά θεµελιώδη αρχή βασίζεται η επιτυχία της συνδυαστικής θεραπείας: Highly active antiretroviral therapy (HAART) ü Στην πορεία επιβεβαιώθηκε το πλεονέκτηµα των φαρµάκων µε υψηλό γενετικό φραγµό ü Η ανάπτυξη νέας γενεάς φαρµάκων (TDF, boosted PIs, ETV, Dolutegravir) σε κάθε κατηγορία βασίστηκε Στην απουσία διασταυρούµενης αντοχής µε τα υπάρχοντα φάρµακα Υψηλότερο γενετικό φραγµό Larder et al. 1995; Kempf et al. 1997; Hsu et al. 1998

9 Εξέλιξη αντοχής στην αντιρετροϊκή θεραπεία

10

11 Εξέλιξη αντιρετροϊκής αγωγής

12 Είδη θεραπείας Bontell et al, PLOS one 2013

13 Αντοχή στον πληθυσµό µε αποτυχία θεραπείας

14 Επιπολασµός µεταλλαγών αντοχής

15 Αντοχή στον πληθυσµό υπό θεραπεία Bontell et al, PLOS one 2013

16 Κατευθυντήριες οδηγίες

17 Κατευθυντήριες οδηγίες αντοχής (1) Ευρέως χρησιµοποιούµενα φάρµακα N(t)RTIs, NNRTIs, PIs Πριν τη θεραπεία ü Σε όλους τους οροθετικούς πριν την έναρξη θεραπείας ü Σε όλους τους οροθετικούς µε πρωτοδιαγνωσθείσα λοίµωξη (µε πρωτολοίµωξη ή οξεία λοίµωξη) ακόµα και αν δεν τους χορηγηθεί άµεσα θεραπεία ü Ό έλεγχος αντοχής συστήνεται στο πρώτο διαθέσιµο χρονικά δείγµα Vandamme et al, AIDS Rev. 2011

18 Κατευθυντήριες οδηγίες αντοχής (2) Ευρέως χρησιµοποιούµενα φάρµακα N(t)RTIs, NNRTIs, PIs Πριν τη θεραπεία ü Αν είναι γνωστός ο δότης µετάδοσης της λοίµωξης και λαµβάνει θεραπεία συστήνεται ο έλεγχος αντοχής στο δότη ü Προϋπόθεση για τον έλεγχο αντοχής: HIV-RNA > 500 αντίγραφα/ml Vandamme et al, AIDS Rev. 2011

19 Κατευθυντήριες οδηγίες αντοχής (3) Ευρέως χρησιµοποιούµενα φάρµακα N(t)RTIs, NNRTIs, PIs ü Σε οροθετικούς µε αποτυχία θεραπείας (δειγµατοληψία όσο λαµβάνουν θεραπεία) ü Κατόπιν επαγγελµατικής έκθεσης (PEP) ü Σε HIV(+)-έγκυες και νεογνά από οροθετικές µητέρες πριν τη χορήγηση και µετά από αποτυχία θεραπείας ü Σε οροθετικούς που έχουν διακόψει θεραπεία Vandamme et al, AIDS Rev. 2011

20 Κατευθυντήριες οδηγίες αντοχής (4) Ευρέως χρησιµοποιούµενα φάρµακα N(t)RTIs, NNRTIs, PIs Σε οροθετικούς που έχουν διακόψει θεραπεία ü Ο έλεγχος αντοχής συστήνεται στο τελευταίο διαθέσιµο δείγµα πριν τη διακοπή θεραπείας ü Όταν στο σχήµα περιλαµβάνονται NNRTIs συστήνεται ο έλεγχος αντοχής, αφού έχει διακοπεί η θεραπεία (στο πρώτο διαθέσιµο δείγµα µε ανιχνεύσιµο HIV-RNA) ü Παρόµοια και σε οροθετικούς µε άγνωστο ιστορικό θεραπείας Vandamme et al, AIDS Rev. 2011

21 Κατευθυντήριες οδηγίες αντοχής (5) Νέα φάρµακα (ΙΝSTIs, EI) ü Ο έλεγχος αντοχής συστήνεται σε οροθετικούς µε αποτυχία θεραπείας µόνο όταν λαµβάνουν φάρµακα αυτών των κατηγοριών ü Παρόµοια συστήνεται σε HIV(+)-έγκυες και νεογνά από οροθετικές µητέρες ü Δεν συστήνεται πριν τη χορήγηση θεραπείας Vandamme et al, AIDS Rev. 2011

22 Κατευθυντήριες οδηγίες τροπισµού (1) O έλεγχος τροπισµού συστήνεται: ü Πριν την έναρξη θεραπείας µε ανταγωνιστές συνυποδοχέων ü Μετά την αποτυχία θεραπείας µε τα συγκεκριµένα φάρµακα ü Σε οροθετικούς υπό τροποποίηση θεραπείας ανεξάρτητα από τα επίπεδα HIV-RNA ü Ο έλεγχος συστήνεται όταν το ΗΙV-RNA > 1000 c/ml. Εναλλακτικά ο έλεγχος γίνεται στο HIV-DNA ü Ο έλεγχος τροπισµού δεν συστήνεται σε νεοδιαγνωσθένετες ασθενείς Vandekerckhove et al, Lancet Infect Dis. 2011

23 Κατευθυντήριες οδηγίες τροπισµού (2) ü Αναδροµικές µελέτες έδειξαν ότι η εκτίµηση τροπισµού είτε µέσω γονοτυπικών ή φαινοτυπικών µεθόδων προβλέπει την ανταπόκριση στη θεραπεία ü Δεν γίνεται σύσταση υπέρ των γονοτυπικών ή των φαινοτυπικών µεθόδων ü Οι γονοτυπικές µέθοδοι γενικά είναι προτιµητέες λόγω µικρότερου κόστους και χρόνου απάντησης ü Υπάρχουν υψηλά επίπεδα συσχέτισης των εκτιµήσεων τροπισµού από HIV-RNA και HIV-DNA ü Για οροθετικούς που έχουν µη ανιχνεύσιµο HIV-RNA για µεγάλο διάστηµα, το HIV DNA, µπορεί να µην ανιχνεύεται Vandekerckhove et al, Lancet Infect Dis. 2011

24 Επιπολασµός αντοχής σε naïve οροθετικούς

25 Aνταπόκριση στο πρώτο σχήµα (n=10.056, 25 cohorts, έναρξη θεραπείας: ) (months Wittkop et al, Lancet Infect Dis 2011

26 Aνταπόκριση στο πρώτο σχήµα Wittkop et al, Lancet Infect Dis 2011

27 Συµπεράσµατα ü Η επιλογή του πρώτου θεραπευτικού σχήµατος πρέπει να βασίζεται σε έλεγχο αντοχής ü Η πιθανότητα αποτυχίας δεν διαφέρει µεταξύ ασθενών χωρίς µεταδιδόµενη αντοχή και εκείνων µε αντοχή και πλήρως ενεργή θεραπεία ü Ασθενείς µε µεταδιδόµενη αντοχή και θεραπεία χαµηλού γενετικού φραγµού (ΝRTIs+NNRTIs) έχουν µάλλον υψηλότερη πιθανότητα αποτυχίας στη θεραπεία ü Αυτό οφείλεται ίσως σε επιπλέον µεταδιδόµενη αντοχή που δεν µπορεί να ανιχνευθεί Wittkop et al, Lancet Infect Dis 2011

28 Eπιπολασµός αντοχής σε naive Ανασκόπηση από 264 µελέτες και αλληλουχίες από οροθετικούς HIV-1 Drug Resistance database

29 Επιπολασµός αντοχής σε naïve στην Ευρώπη n=4.317, 27 χώρες Frentz et al, BMC Infectious Diseases 2014

30 Παραµονή µεταλλαγών αντοχής σε naïve Castro et al, JID 2013

31 Αντοχή στον πληθυσµό µε αποτυχία θεραπείας Bontell et al, PLOS one 2013

32 Ανάπτυξη αντοχής στο πρώτο σχήµα

33 Ανταπόκριση στο πρώτο σχήµα (Συστηµατική ανασκόπηση (n=7.970 ασθενείς) Gupta et al, CID 2008

34 Επιπολασµός αντοχής στις αποτυχίες * * * p< wks analysis * Gupta et al, CID 2008

35 Επίπτωση αντοχής (ΙΤΤ analysis) 96 wks analysis Gupta et al, CID 2008

36 Μεθοδολογία (1) Γονοτυπικές µέθοδοι ü Ταυτοποίηση νουκλεοτιδικής αλληλουχίας ü Εκτίµηση επιπέδων αντοχής από το γονότυπο Φαινοτυπικές µέθοδοι ü Άµεση ταυτοποίηση των επιπέδων αντοχής του ιού in vitro

37 Μεθοδολογία (2) Εικονικού φαινότυπου ü Έµµεση εκτίµηση φαινοτυπικής αντοχής από το γονότυπο Εκτίµηση τροπισµού ü Φαινοτυπικές µέθοδοι ü Εκτίµηση τροπισµού µε γονοτυπικές µεθόδους

38 Χαρακτηριστικά µεθόδων ελέγχου αντοχής

39 ω ω ω ω ω

40 Genotyping Γονοτυπικές Procedure µέθοδοι PATIENT PLASMA (> 200 µl) Αποµόνωση PR/RT total RNA cdna extraction RT PCR Αντίδραση αντίστροφης µεταγραφής PR/RT GENES (amplicon) T C G A T G T A C Sequence Interpretation - - Translate into amino acids - - Compare to wild-type reference sequences - - Identify resistance mutations - - Interpret mutation patterns, using rules-based - algorithms and/or expert opinion Αυτόµατο DNA sequencing

41 PCR

42 Chain termination sequencing

43 Gel electrophoresis

44 ViroSeq HIV-1 Throughput options / Platforms ABI 310 single capillary 1.5 to 3 complete HIV samples/24h ABI 3100 Avant 4 capillaries 5-6 complete HIV samples/24h ABI capillaries complete HLA samples/24h

45 The TRUGENE HIV-1 Genotyping Test, Siemens

46 Εκτίµηση αντοχής - αλγόριθµοι Μετά το γονοτυπική εξέταση τα επίπεδα αντοχής εκτιµώνται µέσω αλγόριθµων Οι αλγόριθµοι βασίζονται σε δεδοµένα µελετών αντοχής για όλα τα φάρµακα Απαραίτητη προϋπόθεση είναι η επικαιροποίηση και η κλινική αξιολόγηση τους Υπάρχουν αρκετοί διαθέσιµοι αλγόριθµοι αλλά οι πιο συχνά χρησιµοποιούµενοι είναι τρείς

47 Εκτίµηση αντοχής - αλγόριθµοι

48 ω ω ω ω ω

49 Εκτίµηση φαινοτυπικής αντοχής

50 Μεθοδολογία φαινοτυπικής αντοχής (HIV) PLASMA (200 µl) total RNA cdna Διαγραφή γονιδίων πρωτεάσης (PR) και αντίστροφης µεταγραφάσης (RT) Αποµόνωση ιικών γονιδίων PR/RT Μεταφορά γονιδίων/ electroporation HIV genome of lab. virus HIV genome minus PR/RT gene linearized genome CD4+ T- cells (MT4) Ενδοκυτταρικός ανασυνδυασµός

51 Ορισµός ορίων (cut-off) Cut-off: To όριο εκτιµώµενης αντοχής (FC) πάνω από το οποίο ένας ιός θεωρείται ότι έχει αναπτύξει αντοχή Biological cut-off: Εκτίµηση των επιπέδων «φυσικής» αντοχής σε κάθε φάρµακο σε µεγάλο αριθµό naïve ασθενών Clinical cut-off: Εκτίµηση επιπέδων αντοχής που συνδέονται µε µειωµένη ή αυξηµένη πιθανότητα ανταπόκρισης σε κάθε φάρµακο

52 Εκτίµηση συσχέτισης αντοχής µε ανταπόκριση

53

54

55 Εικονικός φαινότυπος - Virtual Phenotyping Ύπαρξη βάσης δεδοµένων γονότυπωνφαινότυπων Ο φαινότυπος εκτιµάται από στελέχη µε παρόµοιο «γονότυπο» και γνωστό φαινότυπο. Ο εικονικός φαινότυπος εκτιµάται ως η µέση τιµή του IC50 από τις αλληλουχίες στη βάση δεδοµένων µε διαθέσιµο φαινότυπο Ο εικονικός φαινότυπος είναι διαθέσιµος από την εταιρεία Virco και ελεύθερα διαθέσιµος από Ακαδηµαϊκά κέντρα

56 Πλεονεκτήµατα-µειονεκτήµατα Πλεονεκτήµατα Γονοτυπικές ü ü ü Ευκολία πραγµατοποίησης Μικρό κόστος Μεγαλύτερη ευαισθησία από το φαινότυπο Φαινοτυπικές ü ü Άµεση εκτίµηση αντοχής Ευκολότερη ερµηνεία αποτελεσµάτων στην κλινική πράξη Μειονεκτήµατα Γονοτυπικές ü Δυσκολία εκτίµησης αντοχής σε πολυθεραπευµένους ασθενείς Φαινοτυπικές ü Υψηλό κόστος και χρόνος που απαιτείται για απάντηση ü Καθορισµός κλινικών cutoff

57

58

59

60

61 Υπερευαίσθητες µέθοδοι

62 Next generation sequencing

63 Ευαισθησία µεθόδων αντοχής Συχνότητα υποπληθυσµού Ανιχνεύεται µε τις συµβατικές µεθόδους Ανιχνεύεται µε τις υπερευαίσθητες µεθόδους 0.001

64 Υπερευαίσθητες µέθοδοι Οι υπερευαίσθητες µέθοδοι προσδιορισµού αλληλουχίας βασίζονται: Στην αποµόνωση γονιδιωµάτων από επιµέρους ιικά στελέχη (κλωνοποίηση) Στον πολλαπλασιαµό του γονιδιώµατος των κλώνων Στον ταυτόχρονο προσδιορισµό νουκλεοτιδικής αλληλουχίας από όλους τους κλώνους µε µεθόδους υψηλής απόδοσης (high-throughput)

65 Σύγκριση µεθόδων Χαρακτηριστικά Μέθοδος Sanger NGS (Junior) Απόδοση 5 x10 4 bp 3,5 x10 7 bp Διάρκεια ~ 24 ώρες < 10 ώρες Mήκος αλληλουχίας Aριθµός αλληλουχιών bp bp ~ 1x x10 5

66 Εφαρµογές NGS Aντοχή σε naïve ασθενείς συσχέτιση µε ανταπόκριση στο πρώτο σχήµα Εκτίµηση τροπισµού συσχέτιση µε ανταπόκριση σε θεραπεία µε maraviroc Aντοχή σε πολυθεραπευµένους ασθενείς Αντοχή µετά από διακοπή θεραπείας µε NNRTIs Aντοχή µετά από αποτυχία θεραπείας µε bpis Αντοχή µετά από επαναµόλυνση (superinfection) Μελέτη γενετικής ετερογένειας του ιού Εύρεση θέσεων ενσωµάτωσης στο DNA του ξενιστή >120 δηµοσιεύσεις αναφορικά µε HIV σε µια πλατφόρµα

67 Naïve ασθενείς

68 Mεταλλαγές αντοχής µε NGS Johnson et al, Plos Med. 2008

69 Συστηµατική ανασκόπηση (Ν=808 ασθενείς) Ανταπόκριση και υποπληθυσµοί Jonathan et al, JAMA, 2011

70 Αποτυχία θεραπείας

71 Aντοχή σε πολυθεραπευµένους ασθενείς Μελέτη σε 7 πολυθεραπευµένους ασθενείς µε προηγούµενη εµπειρία σε 15 φάρµακα (διάµεση τιµή) έδειξε: Με NGS βρέθηκαν παραπάνω µεταλλαγές σε 6/7 ασθενείς πριν την αλλαγή θεραπείας Οι µεταλλαγές που ανιχνεύθηκαν µε NGS (π.χ. Κ103Ν, Μ41L, Τ215Υ) εµφανίστηκαν κατά την αποτυχία της νέας θεραπείας Codoner et al, PloS one, 2011

72 Aντοχή σε πολυθεραπευµένους ασθενείς Η µέθοδος NGS µπορεί να βελτιώσει την εκτίµηση αποτελεσµατικότητας της θεραπείας σε ασθενείς που έχουν ήδη αποτύχει σε θεραπεία Το πλεονέκτηµα οφείλεται στη µεγαλύτερη ευαισθησία να ανιχνεύει υποπληθυσµούς µε χαµηλά ποσοστά H µελέτη αφορούσε µικρό αριθµό ασθενών και συνεπώς τα αποτελέσµατα δεν µπορούν να γενικευθούν Codoner et al, PloS one, 2011

73 Συµπεράσµατα Η εφαρµογή του ελέγχου αντοχής έχει βοηθήσει πολλαπλά τη θεραπεία της HIV λοίµωξης Παρότι τα ποσοστά αντοχής έχουν µειωθεί στους ασθενείς µε αποτυχία θεραπείας, ο έλεγχος αντοχής συστήνεται σε θεραπευµένους ασθενείς Η αντοχή σε naïve συνεχίζει να ανιχνεύεται σε µέτριαυψηλά επίπεδα και σχετίζεται µε χαµηλότερη ανταπόκριση στην πρώτη θεραπεία Οι νέες µέθοδοι παρέχουν τη δυνατότητα αξιόπιστης ανίχνευσης στελεχών σε µικρή συχνότητα

74 Aντοχή µετά από αποτυχία µε bpis Μελέτη NGS σε ασθενείς µετά αποτυχία θεραπείας σε bpis, µε απουσία αντοχής σε PΙs µε συµβατικές µεθόδους έδειξε: 19/24 (79%) είχαν τουλάχιστον µια µεταλλαγή αντοχής σε N(t)RTIs, PΙs ή NNRTIs 18/24 (75%) είχαν αντοχή σε N(t)RTIs: M184V/I, K65R, TAMs 9/24 (35%) είχαν µεταλλαγές σε PΙs: Μ46Ι/V (1.2%), F53L (0.7%), I50V (0.4%), D30N (0.7%) & N88S (0.4%) Ο ρόλος των παραπάνω µεταλλαγών δεν µελετήθηκε αναφορικά µε την ανταπόκριση στη θεραπεία Lataillade et al, PloS one, 2012

75 Aντοχή µετά από αποτυχία µε bpis Μετά την αποτυχία θεραπείας, αντοχή σε bpis ανιχνεύεται σε µικρό ποσοστό ασθενών και αφορά υποπληθυσµούς µε µικρή συχνότητα (<1.5%) Oι παραπάνω µεταλλαγές δεν σχετίζονται µε αυξηµένα επίπεδα αντοχής (φαινοτυπικός έλεγχος) Σε ασθενείς µε αποτυχία θεραπείας σε bpis, η συγκεκριµένη κατηγορία παραµένει ενεργή αν δεν ανιχνευθεί αντοχή µε συµβατικές µεθόδους Lataillade et al, PloS one, 2012

76 Μεθοδολογία NGS (1)

77 Μεθοδολογία NGS (2)

78

79 Patterns of drug resistance among newly diagnosed HIV-1 infected patients in Greece during the last decade: The crucial role of transmission networks D. Paraskevis 1, A. Zavitsanou 1, E. Magiorkinis 1, P. Gargalianos 2, G. Xylomenos 2, M. Lazanas 3, M. Chini 3, A. Skoutelis 4, V. Papastamopoulos 4, A. Antoniadou 5, A. Papadopoulos 5, M. Psichogiou 6, G.L. Daikos 6, A. Vassilakis 1, G. Chrysos 7, V. Paparizos 8, S. Kourkounti 8, H. Sambatakou 9, T. Kordossis 10 G. Koratzanis 11, P. Panagopoulos 12, E. Maltezos 12, S. Drimis 7, A. Hatzakis 1 1 Department of Hygiene, Epidemiology and Medical Statistics, University of Athens, 2 G. Genimatas GH, Athens, 3 Red Cross Hospital, Athens, 4 Evaggelismos GH, Athens, 5 Αttikon University GH, Athens, Laikon GH (Departments of Propedeutic Medicine I 6 and Pathophysiology 10 ), 7 Tzaneio GH, Piraeus, 8 A. Syngros Hospital, Athens, 9 Ippokrateion GH, Athens, 11 Sismanogleio GH Athens, 12 Democritus University of Thrace, Greece

80 Αποτελέσµατα Ο επιπολασµός αντοχής ήταν 19.6% (490/2499). Σε NNRTIs ήταν (397/2499, 15,9%), σε PIs : (116/2499, 4,6%) και N(t)RTIs: (79/2499, 3,2%) Παρατηρήσαµε µια σηµαντική τάση για µείωση της αντοχής σε NRTIs (6,7% -1,6%) Δεν υπήρχε τάση για την αντοχή σε PIs και NNRTIs Ο επιπολασµός των K103N και E138Q αυξήθηκε σηµαντικά κατά τη διάρκεια του Οι Κ103Ν, E138Q συνδέονται µε µεταδόσεις σε τοπικά δίκτυα σε MSM και ΧΕΝ, αντίστοιχα. Το δίκτυο Κ103Ν περιλαµβάνει οροθετικούς από όλη την Ελλάδα, ενώ η δεύτερη µόνο από την πρόσφατη επιδηµία ΧΕΝ στην Αθήνα