ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΑΙ ΔΡΑΣΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΜΑΓΝΗΤΙΚΩΝ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ- ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΣΤΙΣ ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ

Transcript

1 ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΑΙ ΔΡΑΣΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΜΑΓΝΗΤΙΚΩΝ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ- ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΣΤΙΣ ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ Ευδοκία Πατρικιάδου, Λώρη Ναλμπαντιάν, Βασίλης Ζασπάλης Ινστιτούτο Τεχνικής Χημικών Διεργασιών ΙΤΧΗΔ/ΕΚΕΤΑ, Τ.Θ , 57001, Θέρμη, Θεσσαλονίκη Άννα Πατρικίδου, Χατζηδάκη Ελεάνα, Χρήστος Ν. Παπανδρέου Τμήμα Παθολογικής Ογκολογίας, Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο Λάρισας και Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας ΠΕΡΙΛΗΨΗ Τα μαγνητικά νανοσωματίδια βρίσκουν εφαρμογές τόσο στη διαγνωστική ιατρική όσο και σε θεραπευτικές μεθόδους. Στην παρούσα εργασία συντέθηκαν νανοσωματίδια μαγνητίτη, επικαλυμμένα με λεπτό στρώμα πυριτίας τα οποία δραστικοποιήθηκαν, οι επιφανειακές τους ομάδες ενεργοποιήθηκαν και συζεύχθηκαν μέσω της δημιουργίας ομοιοπολικών δεσμών με πρωτεΐνη BSA (Bovine Serum Albumin). Μελετήθηκε ένας μεγάλος αριθμός παραμέτρων τόσο κατά την σύνθεση όσο και κατά την δραστικοποίηση και ενεργοποίηση των επιφανειακών τους ομάδων, με στόχο την παραγωγή νανοσωματιδίων με κατάλληλο μέγεθος, μεγάλη ικανότητα διασποράς σε υδατικά διαλύματα και ικανότητα σύζευξης με πρωτεΐνες Ο φυσικοχημικός χαρακτηρισμός των υλικών περιλαμβάνει ρόφηση N 2, ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM) και διερχόμενης δέσμης (HRTEM), μικροανάλυση ακτίνων Χ (EDS). ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα μαγνητικά νανοσωματίδια χρησιμοποιούνται ευρέως τα τελευταία χρόνια σε ένα συνεχώς αυξανόμενο αριθμό βιοϊατρικών εφαρμογών [1,2]. Tα υπερπαραμαγνητικά νανοσωματίδια είναι πολύ αποτελεσματικά ως ενισχυτές χαλάρωσης στο MRI ακόμα και σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις [3]. Επομένως για να αυξηθεί η ευαισθησία του MRI στην ανίχνευση καρκινικών κυττάρων ώστε αυτά να είναι ανιχνεύσιμα ακόμα και σε μικρούς αριθμούς, αρκεί τα κύτταρα να σημανθούν με υπερπαραμαγνητικά νανοσωματίδια. Η σήμανση των καρκινικών κυττάρων μπορεί να πραγματοποιηθεί μέσω της αλληλεπίδρασης αντισώματοςαντιγόνου. Σε αυτή την περίπτωση πρέπει να παρασκευασθούν μαγνητικά νανοσωματίδια που είναι ικανά να συνδέονται με κατάλληλα αντισώματα-πρωτεΐνες, μέσω χημικών δεσμών και να κατευθύνονται εκλεκτικά σε συγκεκριμένα όργανα ή ιστούς [4]. Στόχος της εργασίας είναι η επιλογή της καταλληλότερης μεθόδου για τη σύνθεση μαγνητικών νανοσωματιδίων Fe 3 O 4 τα οποία έχουν επιθυμητές φυσικοχημικές ιδιότητες, δηλαδή κατάλληλο μέγεθος, ικανότητα διασποράς σε υδατικά διαλύματα και μπορούν να συζευχθούν με πρωτεΐνες - αντισώματα. 1 of 11

2 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΣΥΝΘΕΣΗ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ ΜΑΓΝΗΤΙΤΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΑΛΥΨΗ ΜΕ ΠΥΡΙΤΙΑ Τα νανοσωματίδια Fe 3 O 4 συντέθηκαν με δύο μεθόδους, με συγκαταβύθιση και με τη μέθοδο αντίστροφων μικκυλίων (reverse micelles). Στη συνέχεια τα νανοσωματίδια επικαλύφθηκαν με λεπτό στρώμα πυριτίας προκειμένου να γίνουν βιοσυμβατά και υδρόφιλα. Σ1. Μέθοδος συγκαταβύθισης Για την σύνθεση των νανοσωματιδίων μαγνητίτη, γίνεται αρχικά ανάμειξη δύο υδατικών διαλυμάτων FeCl 3 6H 2 O και FeCl 2 4H 2 O (αναλογία mol 2:1) σε θερμοκρασία δωματίου και υπό ροή αζώτου, προκειμένου να αποφευχθεί η οξείδωση του δισθενούς σιδήρου. Στη συνέχεια υπό συνεχή έντονη ανάδευση προστίθεται στο διάλυμα των χλωριούχων ιόντων σιδήρου υδατικό διάλυμα NaOH 1.5 Μ μέχρι ph=12. Αμέσως καταβυθίζεται σαν μαύρο ίζημα ο μαγνητίτης (Fe 3 Ο 4 ) σύμφωνα με την αντίδραση: Fe Fe OH - Fe 3 O 4 + 4H 2 O (1) Το διάλυμα αναδεύεται μηχανικά επί 20-30min σε θερμοκρασία δωματίου και με υπερήχους για 30min και γίνεται πλύση με αποσταγμένο νερό και αιθανόλη. Κατά την σύνθεση με την μέθοδο συγκαταβύθισης μελετήθηκε η επίδραση στις ιδιότητες των νανοσωματιδίων μιας σειράς παραμέτρων: - Προσθήκη διαλύματος κιτρικού οξέος 1Μ στο αρχικό υδατικό διάλυμα χλωριούχου σιδήρου, πριν την ανάμειξη της βάσης. - Ταχύτητα προσθήκης του αλκαλικού διαλύματος. Ο συνολικός χρόνος για την προσθήκη της βάσης μεταβλήθηκε από 0.5 έως 15 min. - Μέθοδος ξήρανσης των νανοσωματιδίων. Οι εναλλακτικές λύσεις που μελετήθηκαν ήταν: - εξάτμιση του διαλύτη - ξήρανση με λυοφίλιωση (freeze drying) - καθόλου ξήρανση, διατήρηση των νανοσωματιδίων ως υδατικό αιώρημα. Για την επικάλυψη των νανοσωματιδίων Fe 3 O 4 με πυριτία, αυτά προστίθενται σε διάλυμα αιθανόλης - νερού και αναδεύονται στη συσκευή υπερήχων για 10 min. Στη συνέχεια προσαρμόζεται το ph τους στο 9 και προστίθεται η πηγή πυριτίου, το τετρααιθοξυσιλάνιο (Tetraethoxysilane, TEOS). Το προϊόν αναδεύεται για 10 ώρες, πλένεται με νερό και αιθανόλη και αποθηκεύεται ως υδατικό αιώρημα. Σ2. Μέθοδος αντίστροφων μικυλίων Για την σύνθεση νανοσωματιδίων μαγνητίτη με τη μέθοδο αντίστροφων μικυλίων (reverse micelles) χρησιμοποιήθηκαν: Ελαιώδης φάση: κανονικό εξάνιο (n-hexane) Επιφανειοδραστική ουσία: Triton X-100 Συνεπιφανειοδραστικό: κανονική εξανόλη (n-hexanol) Αρχικά προετοιμάζονται δύο μικρογαλακτώματα ΜΕ1 και ΜΕ2. Η αναλογία επιφανειοδραστικού : ελαίου : συνεπιφανειοδραστικού : νερού στα ΜΕ1 και ΜΕ2 είναι 1.77: 8.54: 1.86: 1. Στην υδατική φάση του μικρογαλακτώματος ΜΕ1 διαλύονται χλωριούχα ιόντα Fe 2+ και Fe 3+ (αναλογία mol 2:1) ενώ στην υδατική φάση του ΜΕ2 διαλύεται NaOH σε συγκέντρωση 3Μ. Υπό ροή N 2 και υπό έντονη ανάδευση, το ΜΕ2 προστίθεται κατά σταγόνες στο ΜΕ1. Ο μαγνητίτης σχηματίζεται στα σταγονίδια της υδατικής φάσης του τελικού μικρογαλακτώματος, σύμφωνα με την αντίδραση (1). Το τελικό μικρογαλάκτωμα αναδεύεται για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. 2 of 11

3 Για την επικάλυψη των νανοσωματιδίων Fe 3 O 4 με πυριτία, προστίθεται στη συνέχεια στο μικρογαλάκτωμα η πηγή πυριτίου, το τετρααιθοξυσιλάνιο (TEOS) και ακολουθεί ανάδευση για 16 ώρες. Το υλικό πλένεται με μεθανόλη και νερό και αποθηκεύεται ως υδατικό αιώρημα. ΔΡΑΣΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ Στόχος της δραστικοποίησης είναι η μετατροπή των υδροξυλικών ομάδων στην επιφάνεια της πυριτίας σε αμινικές [5]. Σαν πηγή αμινικών ομάδων χρησιμοποιήθηκαν οι ενώσεις: Δα. 3 αμινοπροπυλτριαιθοξυσιλάνιο (3-aminopropyltriethoxysilane, APTES) ή Δβ. 3-(τριαιθοξυσιλυλ) προπυλαμίνη (3-(triethoxysilyl) propylamine) Η αντίδραση δραστικοποίησης πραγματοποιήθηκε με δύο μεθόδους: APT1: μία από τις ενώσεις Δα ή Δβ διαλύεται σε υδατικό διάλυμα που περιέχει μεθανόλη και γλυκερόλη. Η αντίδραση πραγματοποιείται σε θερμοκρασία 65 C. APT2: μία από τις ενώσεις Δα ή Δβ διαλύεται σε τολουόλιο, στο οποίο έχει διαλυθεί επίσης διμεθυλφορμαμίδιο (dimethylformamide, DMF). Η αντίδραση πραγματοποιείται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος ΣΥΖΕΥΞΗ ΑΛΒΟΥΜΙΝΗΣ (BSA) Για την μελέτη της ικανότητας σύζευξης των νανοσωματιδίων με πρωτεΐνες χρησιμοποιήθηκε η βοείας προέλευσης πρωτεΐνη αλβουμίνη (Bovine Serum Albumin, BSA) σαν δείγμα ελέγχου. Η σύζευξη της πρωτεΐνης με τα νανοσωματίδια επιτυγχάνεται μέσω της δημιουργίας ομοιοπολικών δεσμών ανάμεσα στις αμινικές ομάδες της πρωτεΐνης και κατάλληλων ομάδων που δημιουργούνται στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων. Στην παρούσα εργασία δοκιμάστηκε η δημιουργία δύο διαφορετικών τύπων ομάδων στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων, αλδεϋδικών και καρβοξυλικών. ΕΝ1: Με χρήση γλουταραλδεΰδης οι αμινικές ομάδες μετατρέπονται σε αλδεϋδικές. Τα νανοσωματίδια διασπείρονται σε Φωσφορικό Ρυθμιστικό Διάλυμα (Phosphate Buffer Saline, PBS), στο οποίο έχει διαλυθεί 5% γλουταραλδεΰδη. Το διάλυμα αναδεύεται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για 16 ώρες. Τέλος τα σωματίδια πλένονται με νερό και PBS και αποθηκεύονται σε διάλυμα PBS. Η σύζευξη της πρωτεΐνης μπορεί να γίνει είτε άμεσα, είτε μετά από αποθήκευση σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για μικρό χρονικό διάστημα (1-10 ημέρες). Για την σύζευξη της πρωτεΐνης, τα νανοσωματίδια διασπείρονται σε διάλυμα PBS (Phosphate Buffer Saline) στο οποίο έχει διαλυθεί κατάλληλη ποσότητα πρωτεΐνης BSA. Το μίγμα αναδεύεται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για 2-4 ώρες. ΕΝ2: Με χρήση γλουταρικού ανυδρίτη οι αμινικές ομάδες στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων μετατρέπονται σε καρβοξυλικές ομάδες. Τα νανοσωματίδια διασπείρονται σε τολουόλιο που περιέχει 10% w/v γλουταρικό ανυδρίτη και αναδεύονται για 2 ώρες σε θερμοκρασία περιβάλλοντος υπό ροή N 2. Ακολουθεί πλύση με μεθανόλη και νερό και αποθήκευση ως υδατικό αιώρημα. Για την σύζευξη της πρωτεΐνης, γίνεται αρχικά ενεργοποίηση των καρβοξυλικών ομάδων των νανοσωματιδίων μέσα σε διάλυμα 2-(Ν-μορφολίνο)αιθανοσουλφονικό οξύ (2-(Nmorpholino)ethanesulfonic acid, MES buffer) που περιέχει υδροχλωρικό Ν-(3 διμεθυλάμινο προπυλ)-ν - αιθυλοκαρβοδιιμίδιο (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydro chloride, EDC). Στη συνέχεια διασπείρονται τα νανοσωματίδια μέσα σε Βορικό Ρυθμιστικό Διάλυμα (Borate buffer) στο οποίο έχει διαλυθεί πρωτεΐνη BSA και αναδεύονται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για 2-4 ώρες. Για τον προσδιορισμό της ποσότητας BSA που παρακρατήθηκε από τα νανοσωματίδια, τα μαγνητικά νανοσωματίδια διαχωρίζονται μαγνητικά και μετράται η απορρόφηση του καθαρού 3 of 11

4 διαλύματος στα 280nm σε φασματοφωτόμετρο υπεριώδους ορατού (UV-Vis) η οποία συγκρίνεται με την αντίστοιχη απορρόφηση πρότυπων διαλυμάτων. Για τον προσδιορισμό της ικανότητας των νανοσωματιδίων για σύζευξη με πρωτεΐνες, παρασκευάζονται διαλύματα που περιέχουν πρωτεΐνη σε διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις και σχεδιάζεται η ποσότητα πρωτεΐνης που δεσμεύτηκε από τα νανοσωματίδια, σαν συνάρτηση της αρχικής συγκέντρωσης του διαλύματος πρωτεΐνης (Σχήμα 1) Ποσότητα συζευγνένης πρωτείνης (mg BSA / mg NP) Αρχική συγκέντρωση BSA (mg/ml) Σχήμα 1. Ποσότητα συζευγμένης σε νανοσωματίδια πρωτεΐνης σαν συνάρτηση της αρχικής συγκέντρωσης πρωτεΐνης ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΟΣ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ Η ειδική επιφάνεια των σωματιδίων προσδιορίστηκε με φυσική ρόφηση αζώτου (Tristar, Micromeritics). Οι κρυσταλλικές ενώσεις που σχηματίστηκαν ταυτοποιήθηκαν με περίθλαση ακτινών Χ (XRD) (Siemens D-500). Η μορφολογία των νανοσωματιδίων μελετήθηκε με Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης σε συνδυασμό με Μικροανάλυση Ακτίνων Χ (SEM- EDS) (JEOL 6300) και Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Διερχόμενης Δέσμης Υψηλής Διακριτικής Ικανότητας (HRTEM) (JEOL 2011). Τα φάσματα υπεριώδους-ορατού (UV-Vis) ελήφθησαν σε φασματοφωτόμετρο Hitachi U-3010, στην περιοχή nm, με ταχύτητα 60 nm/min και διακριτική ικανότητα 2 nm, σε κυψελίδες από χαλαζία με μήκος οπτικής διαδρομής 1 cm. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Οι φυσικοχημικές ιδιότητες των υλικών επηρεάζονται από ένα σύνολο παραμέτρων οι οποίες μεταβάλλονται κατά τη διάρκεια της σύνθεσης και της δραστικοποίησης. Οι παράμετροι που μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία, παρουσιάστηκαν αναλυτικά στο Πειραματικό Μέρος. Στις επόμενες παραγράφους θα παρουσιασθούν τα πειραματικά αποτελέσματα που αφορούν 4 of 11

5 την επίδραση των παραμέτρων αυτών, τόσο στην μορφή και τις φυσικοχημικές ιδιότητες των νανοσωματιδίων, όσο και στην ικανότητα αυτών για σύζευξη με πρωτεΐνες. Παράμετροι κατά την σύνθεση των νανοσωματιδίων. Η επίδραση των παραμέτρων της σύνθεσης αφορά κατά κύριο λόγο τις φυσικοχημικές ιδιότητες των λαμβανομένων σωματιδίων, πολλές φορές ωστόσο επηρεάζουν και την ικανότητα σύζευξης αυτών με πρωτεΐνες. Όπως αναφέρθηκε πιο πάνω, κατά την σύνθεση με την μέθοδο συγκαταβύθισης μελετήθηκαν οι εξής παράμετροι: - Ταχύτητα προσθήκης του αλκαλικού διαλύματος. Ο συνολικός χρόνος για την προσθήκη της βάσης μεταβλήθηκε από 0.5 έως 15 min. Η ταχύτητα προσθήκης της βάσης επηρεάζει το μέγεθος των νανοσωματιδίων που σχηματίζονται. Μελετώντας τις ειδικές επιφάνειες των νανοσωματιδίων που παρασκευάστηκαν με διαφορετική ταχύτητα προσθήκης της βάσης (Σχήμα 2), διαπιστώνεται ότι ο παράγοντας αυτός επηρεάζει σημαντικά την ειδική επιφάνεια και επομένως το μέγεθος των σωματιδίων. Οι ειδικές επιφάνειες των υλικών κυμαίνονται από 100 έως 260 m 2 /g ενώ οι υψηλότερες τιμές παρατηρούνται στα υλικά τα οποία παρασκευάστηκαν με ταχεία προσθήκη της βάσης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, ο βέλτιστος χρόνος προσθήκης της βάσης κυμαίνεται μεταξύ 1-5 min. 300 Ειδική Επιφάνεια ΒΕΤ (m 2 /g) χρόνος προσθήκης αλκαλικού διαλύματος (min) Σχήμα 2. Μεταβολή της ειδικής επιφάνειας των νανοσωματιδίων σαν συνάρτηση της ταχύτητας προσθήκης του αλκαλικού διαλύματος - Προσθήκη διαλύματος κιτρικού οξέος. Η προσθήκη κιτρικού οξέος στο αρχικό υδατικό διάλυμα χλωριούχου σιδήρου πριν την προσθήκη του αλκαλικού διαλύματος, αποδεικνύεται ότι έχει θετική επίδραση στην διασπορά των νανοσωματιδίων. Στο Σχήμα 3 παρουσιάζεται μια εικόνα HRTEM από το υλικό το οποίο παρασκευάστηκε με προσθήκη κιτρικού οξέος. Φαίνεται ότι αυτό αποτελείται από μικρά νανοσωματίδια μεγέθους nm, τα οποία έχουν πολύ μικρότερο βαθμό συσσωμάτωσης, σε σχέση με τα αντίστοιχα σωματίδια που παρασκευάστηκαν χωρίς προσθήκη κιτρικού οξέος. 5 of 11

6 Σχήμα 3. Εικόνα HRΤΕΜ δείγματος το οποίο συντέθηκε παρουσία κιτρικού οξέος Η προσθήκη κιτρικού οξέος έχει θετική επίδραση και στην ικανότητα σύζευξης των νανοσωματιδίων με πρωτεΐνη. Στο Σχήμα 4 παρουσιάζεται η σύγκριση της ποσότητας πρωτεΐνης BSA που μπορεί να συζευχθεί με νανοσωματίδια που έχουν συντεθεί με ή χωρίς προσθήκη κιτρικού οξέος. Αποδεικνύεται ότι τα πρώτα εμφανίζουν πολύ μεγαλύτερη ικανότητα σύζευξης πρωτεΐνης BSA σε σχέση με τα δεύτερα. Ποσότητα συζευγμένης πρωτεϊνης (mg BSA / mg solid) Χωρίς κιτρικό οξύ Με προσθήκη κιτρικού οξέος Αρχική συγκέντρωση BSA (mg/ml) Σχήμα 4. Επίδραση στην ικανότητα σύζευξης με πρωτεΐνες, της προσθήκης κιτρικού οξέος κατά την σύνθεση νανοσωματιδίων με την μέθοδο συγκαταβύθισης - Μέθοδος ξήρανσης των νανοσωματιδίων. Η μέθοδος ξήρανσης επηρεάζει την διασπορά των νανοσωματιδίων. Στο Σχήμα 5α φαίνονται νανοσωματίδια που ξηράνθηκαν με λυοφίλιωση (freeze drying) τα οποία είναι πολύ καλύτερα διασπαρμένα από τα αντίστοιχα σωματίδια τα οποία ξηράνθηκαν με απλή εξάτμιση του διαλύτη (Σχήμα 5β), τα οποία είναι εμφανώς συσσωματωμένα. Η τρίτη εναλλακτική λύση που μελετήθηκε είναι η διατήρηση των σωματιδίων σε νερό, σαν αιώρημα. Αποδείχτηκε ότι αυτή η μέθοδος είναι η βέλτιστη, διότι 6 of 11

7 ακόμα και με λυοφίλιωση παρατηρείται μια μικρή συσσωμάτωση των νανοσωματιδίων, ενώ η διασπορά των σωματιδίων τα οποία δεν έχουν υποστεί κανενός είδους ξήρανση είναι η βέλτιστη. (α) (β) Σχήμα 5. Εικόνες SEM (α) από το υλικό που ξηράνθηκε με λυοφίλιωση και (β) από το υλικό που ξηράνθηκε με απλή εξάτμιση του διαλύτη Σύνθεση νανοσωματιδίων με την μέθοδο αντίστροφων μικκυλίων Η σύνθεση με την μέθοδο των αντίστροφων μικκυλίων (reverse micelles) δίνει νανοσωματίδια με ελεγχόμενο μέγεθος και πολύ καλά διασπαρμένα, σε σχέση με την μέθοδο συγκαταβύθισης [6-7]. Η μέθοδος αυτή εφαρμόστηκε μόνο για μικρό αριθμό δειγμάτων, στα πλαίσια της παρούσας εργασίας, προκειμένου να αποδειχθεί αρχικά κατά πόσο τα σωματίδια που συντίθενται με την μέθοδο αυτή είναι ικανά για σύζευξη με πρωτεΐνες. Στο Σχήμα 6 παρουσιάζεται η σύγκριση της ικανότητας σύζευξης με πρωτεΐνες των νανοσωματιδίων που παρασκευάζονται με την μέθοδο reverse micelles (RM-NP) με αυτήν αντίστοιχων νανοσωματιδίων που συντέθηκαν με την μέθοδο συγκαταβύθισης (CP-NP). Φαίνεται από το σχήμα ότι η ποσότητα BSA που δεσμεύεται από τα RM-NP είναι της ίδιας τάξης μεγέθους με αυτή που δεσμεύεται από τα CP-NP. Επομένως αποδεικνύεται ότι η μέθοδος reverse micelles είναι καταρχήν ικανή να παράγει νανοσωματίδια κατάλληλα για σύζευξη με αντισώματα. Χρειάζεται περεταίρω μελέτη των παραμέτρων σύνθεσης, με στόχο την βελτιστοποίηση της ικανότητας σύζευξης με πρωτεΐνες των παραγόμενων με την μέθοδο reverse micelles νανοσωματιδίων. Ποσότητα συζευγμένης πρωτεϊνης (mg BSA / mg NP) μέθοδος συγκαταβύθισης μέθοδος 'reverse micelles' Αρχική συγκέντρωση BSA (mg/ml) Σχήμα 6. Σύζευξη πρωτεΐνης BSA με νανοσωματίδια που συντέθηκαν με την μέθοδο συγκαταβύθισης και τη μέθοδο reverse micelles 7 of 11

8 Μέθοδοι δραστικοποίησης και ενεργοποίησης επιφανειακών ομάδων Η μελέτη της επίδρασης των παραμέτρων των μεθόδων δραστικοποίησης και σύζευξης πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκε στα υλικά τα οποία συντέθηκαν με τις βέλτιστες παραμέτρους σύνθεσης, όπως προσδιορίστηκαν στις προηγούμενες παραγράφους. Σε αυτά ανήκουν τα νανοσωματίδια τα οποία παρασκευάστηκαν παρουσία κιτρικού οξέος, στα οποία η προσθήκη της βάσης έγινε σε χρόνο 1min και τα οποία δεν ξηράνθηκαν αλλά αποθηκεύτηκαν ως υδατικό αιώρημα. Οι παράμετροι των μεθόδων δραστικοποίησης και σύζευξης πρωτεϊνών που μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία, είναι οι ακόλουθες: - πηγή αμινικών ομάδων Στο Σχήμα 7 συγκρίνεται η ικανότητα σύζευξης πρωτεΐνης, μεταξύ των νανοσωματιδίων στα οποία η δημιουργία των αμινικών ομάδων (δραστικοποίηση) έγινε με χρήση 3-(τριαίθοξυσιλυλ)προπυλαμίνης και 3-αμινοπροπυλτριαίθοξυσιλανίου (APTES). Αποδεικνύεται ότι το APTES αποτελεί πολύ αποτελεσματικότερη πηγή αμινικών ομάδων αφού οδηγεί σε πολύ περισσότερο δραστικά νανοσωματίδια συζευγμένη ποσότητα πρωτεϊνης (mg BSA / mg NP) 3-(triethoxysilyl)propylamine aminopropyl thiethoxysilane Αρχική συγκεντρωση BSA (mg/ml) Σχήμα 7. Σύζευξη πρωτεΐνης BSA με νανοσωματίδια που δραστικοποιήθηκαν με 3- (τριαίθοξυσιλυλ)προπυλαμίνη ή με 3-αμινοπροπυλτριαίθοξυσιλάνιο (APTES) - περιβάλλον αντίδρασης δραστικοποίησης Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, η αντίδραση των νανοσωματιδίων με την ένωση που παρέχει τις αμινικές ομάδες, μπορεί να πραγματοποιηθεί είτε σε διάλυμα μεθανόλης και γλυκερόλης σε υψηλή θερμοκρασία (μέθοδος ΑΡΤ1) είτε σε διάλυμα DMF σε τολουόλιο σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (μέθοδος ΑΡΤ2). Από τη σύγκριση των δύο μεθόδων δραστικοποίησης (Σχήμα 8) διαπιστώνεται ότι στην πρώτη μέθοδο ΑPT1, η ποσότητα της συζευγμένης πρωτεΐνης είναι σημαντικά υψηλότερη σε σχέση με την άλλη μέθοδο APT2. 8 of 11

9 0.25 Ποσότητα συζευγμένης πρωτεϊνης (mg BSA / mg NP) Μέθοδος APT1 Μέθοδος APT Αρχική συγκέντρωση BSA (mg/ml) Σχήμα 8. Σύζευξη πρωτεΐνης BSA με νανοσωματίδια που δραστικοποιήθηκαν με τις μεθόδους ΑΡΤ1 και ΑΡΤ2 (επεξήγηση στο κείμενο) - είδος ομάδων στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων Όπως αναφέρθηκε παραπάνω οι αμινικές ομάδες που δημιουργήθηκαν στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων κατά την δραστικοποίηση ενεργοποιήθηκαν μετατρεπόμενες είτε σε αλδεϋδικές είτε σε καρβοξυλικές, προκειμένου να επιτευχθεί σύζευξη μέσω ομοιοπολικού δεσμού με τις αμινικές ομάδες της πρωτεΐνης. Στο Σχήμα 9 συγκρίνονται οι ποσότητες πρωτεΐνης που συζεύχθηκαν με τα νανοσωματίδια που είχαν αλδεϋδικές και καρβοξυλικές ομάδες στην επιφάνεια τους. Παρατηρείται ότι δεν υπάρχει σαφής διαφορά. Η παρουσία και των δύο ομάδων φαίνεται να ευνοεί εξίσου την σύζευξη της πρωτεΐνης BSA με τα νανοσωματίδια Δραστικοποίηση με αλδευδικές ομάδες Ποσότητα συζευγμένης πρωτεϊνης (mg BSA / mg NP) Δραστικοποίηση με καρβοξυλικές ομάδες Aρχική ποσότητα BSA (mg/ml) Σχήμα 9. Σύζευξη πρωτεΐνης BSA με νανοσωματίδια με αλδεϋδικές και καρβοξυλικές ομάδες - χρόνος μετά την ενεργοποίηση των επιφανειακών ομάδων Η σύζευξη των δραστικοποιημένων νανοσωματιδίων με την πρωτεΐνη μπορεί να γίνει είτε αμέσως μετά την ενεργοποίηση των αμινικών ομάδων, είτε μετά από αποθήκευση των ενεργοποιημένων ΝΡ για κάποιο χρονικό διάστημα. Η επίδραση του χρόνου αποθήκευσης των νανοσωματιδίων με ενεργοποιημένες ομάδες μελετήθηκε και παρουσιάζεται στο Σχήμα 10. Όπως φαίνεται στο διάγραμμα, η ικανότητα των νανοσωματιδίων για σύζευξη 9 of 11

10 με πρωτεΐνη BSA μειώνεται σταδιακά, όσο αυξάνει ο χρόνος αποθήκευσης. Ο ρυθμός μείωσης της ικανότητας σύζευξης με το χρόνο δεν είναι σταθερός, αλλά εξαρτάται από το είδος των σωματιδίων και την μέθοδο δραστικοποίησης και ενεργοποίησης. Ποσότητα συζευγμένης πρωτείνης (mg BSA / mg NP) Χρόνος από την δραστικοποίηση (ημέρες). Σχήμα 10. Επίδραση του χρόνου δραστικοποίησης στην ποσότητα συζευγμένης πρωτεΐνης ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Από την μελέτη των παραμέτρων κατά την σύνθεση των νανοσωματιδίων αποδείχτηκε ότι κατά την μέθοδο συγκαταβύθισης, η ταχεία προσθήκη της βάσης οδηγεί στο σχηματισμό μικρότερων νανοσωματιδίων ενώ σημαντική επίδραση έχει η παρουσία κιτρικού οξέος κατά τη σύνθεση καθώς έχει σαν αποτέλεσμα τον σχηματισμό σωματιδίων με καλύτερη ικανότητα διασποράς. Τέλος η μέθοδος ξήρανσης αποτελεί σε κάθε περίπτωση πολύ σημαντικό παράγοντα για τον σχηματισμό συσσωματωμάτων, επομένως είναι προτιμότερο τα υλικά που παρασκευάζονται να αποθηκεύονται ως αιωρήματα. Η χρήση της μεθόδου των αντίστροφων μικκυλίων (reverse micelles) οδηγεί στην σύνθεση νανοσωματιδίων κατάλληλου μεγέθους, με πολύ καλή διασπορά. Τα σωματίδια αυτά αποδείχτηκε ότι μετά από κατάλληλη δραστικοποίηση μπορούν να συζευχθούν με πρωτεΐνες. Όσον αφορά τις παραμέτρους κατά την δραστικοποίηση των νανοσωματιδίων, αποδείχτηκε ότι η χρήση του 3-αμινοπροπυλτριαίθοξυσιλανίου (APTES) σαν πηγής αμινικών ομάδων και η προσθήκη του στα νανοσωματίδια σε υψηλή θερμοκρασία, σε διάλυμα μεθανόλης και γλυκερόλης (μέθοδος ΑΡΤ1), έχει σαν αποτέλεσμα την περισσότερο επιτυχή ενεργοποίηση των υδροξυλικών ομάδων της πυριτίας και άρα την σύζευξη μεγαλύτερης ποσότητας πρωτεΐνης με τα νανοσωματίδια. Η παρουσία τόσο αλδεϋδικών όσο και καρβοξυλικών ομάδων στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων, οι οποίες προκύπτουν από την ενεργοποίηση των αμινικών ομάδων, τα καθιστούν εξίσου ικανά να συζευχθούν με σημαντική ποσότητα πρωτεΐνης. Τέλος διαπιστώθηκε ότι η αποθήκευση των νανοσωματιδίων μετά την ενεργοποίηση των επιφανειακών τους ομάδων οδηγεί σε σταδιακή μείωση της ικανότητας αυτών για σύζευξη με πρωτεΐνες. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] Conroy S., Jerry S.H. Lee, Miqin Zhang, Advanced Drud Delivery Reviews, 60:1252 (2008) 10 of 11

11 [2] Shubayev I.V., Pisanic II R. T., Jin S., Adv. Drug Del. Rev.: 61:467 (2009) [3] Berry C. Catherine., Curtis S. G. Adam, J. Phys. D: Appl. Phys. 36:198 (2003) [4] Arruebo M., Fernadez-Racheco R, Velasco B., Marquina C., Arbiol J., Irusta S., Ibarra R. M., Santamaria J., Adv. Funct. Mater. 17:1473 (2007) [5] He. Y.P., Wang S. Q., Li C.R., Miao Y.M., Wu Z. Y., Zou B.S., J. Phys. D:Appl. Phys. 38:1344 (2005) [6] Uscovic V., Drofenik M., Surf. Review and Letters, 12:239 (2005) [7] Mathew S. D., Juang R-S., Chem. Eng. Journ: 129:51 (2007) 11 of 11