ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΦΥΤΩΝ

Transcript

1 ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΦΥΤΩΝ Μοριακοί Δείκτες Επιμέλεια διαφανειών Τραντάς Μάνος 1

2 Μοριακοί Δείκτες είναι αλληλουχίες DNA (ή πρωτεϊνών) που μπορούν να συσχετιστούν με συγκεκριμένα χαρακτηριστικά ώστε να ανιχνευτούν και να μελετηθεί η κληρονομικότητά τους 2

3 Χρήσεις Μοριακών Δεικτών Επιλογή ατόμων με συγκεκριμένα χαρακτηριστικά (Marker Assisted Selection) Ανίχνευση διαφορών μεταξύ φυτών/ατόμων σε επίπεδο DNA (διαφορές στο γενότυπο) Ταυτοποίηση και πιστοποίηση γενετικού υλικού/δημιουργία τραπεζών φυτικού/γενετικού υλικού 3

4 Επιλογή με Μοριακούς Δείκτες (Marker Assisted Selection, MAS) Κατά την επιλογή με Μοριακούς Δείκτες προσπαθούμε να εμφανίσουμε διαφορές στο γονιδίωμα των οργανισμών που να αντιπροσωπεύουν τα χαρακτηριστικά για τα οποία θέλουμε να επιλέξουμε Το γεγονός ότι άτομα εμφανίζουν διαφορετικά χαρακτηριστικά (αναπτυσσόμενα σε παρόμοιες συνθήκες), οφείλεται κυρίως στο γεγονός ότι έχουν διαφορετικό γενετικό υλικό. Με τους Μοριακούς Δείκτες προσπαθούμε να εμφανίσουμε αυτές τις διαφορές 4

5 Επιλογή με Μοριακούς Δείκτες (Marker Assisted Selection, MAS) Η Βελτίωση συμβατικών καλλιεργειών είναι χρονοβόρα και επηρεάζεται από τις περιβαλλοντικές συνθήκες. Μπορεί να διαρκέσει πολλά χρόνια Οι μοριακοί δείκτες δίνουν τη δυνατότητα για βελτίωση της απόδοσης της κλασικής βελτίωσης 5

6 Πλεονεκτήματα Μοριακών Δεικτών Ανεξάρτητοι από το αναπτυξιακό στάδιο Ανεξάρτητοι από τις συνθήκες του περιβάλλοντος 6

7 Διαφορετικές μεθοδολογίες Μοριακών Δεικτών RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) SSR (Simple Sequence Repeats) AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) SSRP (Simple Sequence Repeat Polymorphism) SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions) CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) 7

8 8

9 RFLPs Η μεθοδολογία Μοριακών Δεικτών RFLPs στηρίζεται στα περιοριστικά ένζυμα Περιοριστικά ένζυμα είναι βακτηριακής προέλευσης ένζυμα που αναγνωρίζουν συγκεκριμένες αλληλουχίες DNA και κόβουν στα σημεία εκείνα το DNA 9

10 RFLPs Γονίδιο 1 Γονίδιο 2 Γονίδιο 3 Γονίδιο 4 Γονίδιο ν θέσεις κοπής/περιοριστικά τμήματα Arabidopsis thaliana bp Εάν ένα ένζυμο αναγνωρίζει 6 βάσεις θα εντοπίζει ένα σημείο κοπής κάθε 4 6 bp = 4096 bp θα δημιουργούνται /4 6 ~ περιοριστικά τμήματα 10

11 RFLPs Έστω ότι κάθε βελάκι «δείχνει» σε θέση αναγνώρισης του ενζύμου EcoRI, το οποίο αναγνωρίζει την αλληλουχία GAATTC Γονίδιο 1 Γονίδιο 2 Γονίδιο 3 Γονίδιο 4 Γονίδιο ν Ανθεκτικό φυτό Γονίδιο 1 Γονίδιο 2 Γονίδιο 3 Γονίδιο 4 Γονίδιο ν Ευαίσθητο φυτό Γονίδιο 3: Γονίδιο υπεύθυνο για την ανθεκτικότητα 11

12 RFLPs 1 2 GAATTC GAATTC GAATTC Ανθεκτικό Γονίδιο 3 3 Έστω ότι κάθε βελάκι «δείχνει» σε θέση αναγνώρισης του ενζύμου EcoRI, το οποίο αναγνωρίζει την αλληλουχία GAATTC GAATTC GGGTTC GAATTC Ευαίσθητο Γονίδιο 3 12

13 13

14 RFLPs Συμπέρασμα: Με την μεθοδολογία των RFLPs ψάχνουμε να βρούμε ένα περιοριστικό ένζυμο με το οποίο θα εμφανίσουμε παραλλακτικότητα η οποία να μπορεί να συσχετιστεί με κάποιο επιθυμητό χαρακτηριστικό όπως π.χ. της ανθεκτικότητας 14

15 RFLPs Πολυμορφισμός μεγέθους περιοριστικών τμημάτων Είναι πολυμορφισμοί που παράγονται από τα διαφορετικά σημεία κοπής των περιοριστικών ενζύμων στα διαφορετικά άτομα ενός πληθυσμού Πολυμορφισμοί είναι οι κληρονομήσιμες διαφορές που παρουσιάζουν τα άτομα ενός πληθυσμού Περιοριστικά ένζυμα είναι βακτηριακής προέλευσης ένζυμα που αναγνωρίζουν συγκεκριμένες αλληλουχίες DNA Εφαρμόζονται στο σύνολο του κυτταρικού DNA Απαιτούν υψηλής καθαρότητας DNA 15

16 Βήματα RFLPs 1. Απομόνωση ολικού DNA 2. Πέψη DNA σε μικρότερα τμήματα 3. Διαχωρισμός τμημάτων με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 16

17 Ηλεκτροφόρηση 17

18 Ηλεκτροφόρηση 18

19 Ηλεκτροφόρηση 19

20 Πρέπει να εμφανιστεί η κρυμμένη παραλλακτικότητα 20

21 RFLPs 4. Μεταφορά των τμημάτων σε μεμβράνη 5. Κατασκευή (ραδιο)σημασμένου ανιχνευτή (ιχνηλάτη) 6. Υβριδοποίηση 21

22 RFLPs 7. Τοποθέτηση φιλμ 8. Εμφάνιση περιοριστικών τμημάτων DNA στα οποία έχει δεσμευτεί ο ανιχνευτής 9. Ανάλυση αποτελεσμάτων Παρουσία απουσία ζωνών Διαφορές στο προφίλ των ζωνών συνολικά 22

23 Εύρεση παραλλακτικότητας RFLPs Έστω ότι θέλετε να ελέγξετε ως προς την γενετική τους ομοιομορφία ένα πληθυσμό φυτών 23

24 RFLPs 24

25 RFLPs 25

26 RFLPs Πλεονεκτήματα: Παράγονται ημικυρίαρχοι δείκτες, επιτρέποντας την διάκριση μεταξύ ομόζυγων και ετερόζυγων Τα αποτελέσματα είναι σταθερά και επαναλήψιμα Μειονεκτήματα: Το πρωτόκολλο είναι αρκετά μεγάλο αυξάνοντας την δυσκολία Μέθοδος εντατική σε εργασία Απαιτούνται μεγάλες ποσότητες DNA, υψηλής καθαρότητας Συνήθως χρησιμοποιείται ραδιενέργεια Δεν είναι διαθέσιμοι οι ανιχνευτές Οι ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται μπορεί να μην είναι ειδικοί Υψηλό κόστος εξοπλισμού 26

27 RAPDs Τυχαία Ενισχυόμενο Πολυμορφικό DNA Είναι μια τεχνική που στηρίζεται στην PCR χρησιμοποιώντας έναν εκκινητή μικρού μεγέθους (10-12 νουκλεοτίδια) κατασκευασμένους με τυχαία σύνθεση 27

28 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης 1 ο βήμα αποδιάταξη DNA C, 1 min 2 ο βήμα υβριδισμός εκκινητών C, 1 min 3 ο βήμα αντιγραφή DNA 72 C, 1-2 min 28

29 RAPDs Είναι πολύ χρήσιμοι στις ακόλουθες περιπτώσεις: Εκτίμηση ποικιλομορφίας σε πληθυσμούς Στην κατασκευή γενετικών χαρτών Στην ταυτοποίηση ποικιλιών

30 RAPDs

31 RAPDs Πλεονεκτήματα: Απλή και γρήγορη τεχνική Εμφανίζει περισσότερο πολυμορφισμό από τα RFLPs Δεν κάνει χρήση ραδιοϊσοτόπων Δεν απαιτεί υψηλής καθαρότητας DNA Δημιουργείται μεγάλος πληθυσμός ζωνών ανά εκκινητή Οι εκκινητές είναι έτοιμοι Μειονεκτήματα: Κυρίαρχοι δείκτες άρα δεν είναι δυνατή ο διαχωρισμός ομόζυγων από ετερόζυγα άτομα Η ανίχνευση πολυμορφισμού κυμαίνεται και πάλι σε χαμηλά επίπεδα Τα αποτελέσματα δεν έχουν υψηλά ποσοστά επαναληψιμότητας Τα αποτελέσματα ηλεκτροφορούνται σε πήκτωμα αγαρόζης που δεν έχει μεγάλη διαχωριστική ικανότητα Ανιχνεύουν κυρίαρχους δείκτες

32 RAPDs RAPDs για έλεγχο γενετικής ομοιομορφίας καθαρής σειράς

33 RAPDs RAPDs για έλεγχο γενετικής ομοιομορφίας καθαρής σειράς

34 RAPDs RAPDs για έλεγχο γενετικής ομοιομορφίας καθαρής σειράς A E

35 RAPDs