2. Υδατική Καταπόνηση

Transcript

1 Ι. ΓΕΝΙΚΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ

2 1. Πικροδάφνη Η πικροδάφνη (Nerium oleander L.) είναι δικότυλο φυτό. Ανήκει στην οικογένεια Αποκυνίδες (Apocynaceae) και είναι γνωστή με διάφορα ονόματα όπως ροδοδάφνη, φυλλάδα, αριοδάφνη, αροδάφνη (Κύπρος), σέψα (Μάνη), λέανδρος (Κέρκυρα), σφάκα (Κρήτη), ψουράκα (Χαλκιδική). Το γένος Νήριον (Nerium) περιλαμβάνει 1-3 είδη (ή παραλλαγές) ευαίσθητων αειθαλών θάμνων, με πλούσια ανθοφορία που απαντώνται στις παραμεσόγειες περιοχές και στην Ασία μέχρι την Ιαπωνία. Έχουν δερματώδη, λογχοειδή φύλλα με πτερωτή νεύρωση και άνθη σε διάφορα χρώματα που ανοίγουν ενωμένα σε βοτρυόμορφο κόρυμβο, με κάλυκα κωδωνοειδή πεντάλοβο, νεκταριοφόρο στη βάση και στεφάνη χοανοειδή με σωλήνα σχεδόν κυλινδρικό, κωνοειδώς πεπλατυσμένο στο λαιμό και έλασμα με 5 βαθείς λοξούς λοβούς, φέροντας κάθε ένας από αυτούς εσωτερικά και από τη βάση πολυσχιδές λεπιοειδές εξάρτημα, σχηματίζοντας κάποιο είδος εσωτερικής παραστεφάνης. Το άνθος φέρει 5 στήμονες οι οποίοι είναι έγκλειστοι, με ανθήρες συμφυείς με τα στίγματα να στενεύουν στη βάση τους προς ουραία επιμήκυνση. Η ωοθήκη αποτελείται από δύο καρπόφυλλα, που σχηματίζουν κατά την ωρίμανση μακρύ κυλινδρικό, γραμμωτό κατά μήκος, χεδροπόμορφο θύλακα αποτελούμενο από πολλά σπέρματα που φέρουν στη κορυφή τους θύσσανο τριχών. Η χρωματοσωμική σύνθεση είναι n=11 και 2n=22. Όλα τα μέρη του φυτού περιέχουν το τοξικό αλκαλοειδές νηριίνη. Τα διάφορα είδη καθώς και ορισμένες ποικιλίες τους είναι: i) Νήριον το εύοσμον (Nerium odorum Soland). Κατάγεται από την Ασία και φτάνει σε ύψος και διάμετρο τα 2-4 μέτρα. Έχει ρόδινα άνθη που ανοίγουν ενωμένα σε βότρεις καθ όλη τη διάρκεια του καλοκαιριού. Σε σχέση με το άλλο είδος, διαφέρει στο γεγονός ότι φέρει στενότερα φύλλα και ταξιανθίες με μεγαλύτερο αριθμό ανθέων (μέχρι 80). ii) Νήριον ο ολέανδρος (Nerium oleander L). Είναι η γνωστή μας ροδοδάφνη ή πικροδάφνη, είδος πιο εύρωστο από το προηγούμενο, διαδεδομένο σε αυτοφυή κατάσταση στις μεσογειακές περιοχές και στη χώρα μας. Φτάνει σε ύψος και διάμετρο τα 4-6m και έχει δερματώδη λογχοειδή φύλλα, αντίθετα ή ενωμένα γύρω από το στέλεχος ανά 3. Τα άνθη σωληνοειδή, πλάτους 2,5-4cm, αποτελούνται από 5 πεπλατυσμένους λοβούς και εμφανίζονται ενωμένα σε επάκριους βότρεις. Η ανθοφορία παρατηρείται από τον Ιούνιο έως τον Σεπτέμβριο. Τα άνθη του τυπικού είδους είναι λευκά ενώ των πολυάριθμων ποικιλιών του υπόλευκα, ρόδινα, ερυθρά, κίτρινα, πορτοκαλορόδινα, πορτοκαλόχροα. Από τις διάφορες ποικιλίες γνωστότερες είναι η Λαμπρή ( Splendens ) με διπλά ζωηρά ερυθρά άνθη, η Κίτρινη Διπλανθής ( Luteum Plenum ) με διπλά ιώδη άνθη και η Μεγανθής Μαντόνι ( Madoni Grandiflora ) με διπλά λευκά άνθη. Η πικροδάφνη είναι γνωστή ως ένα εντυπωσιακό φυτό, ανθισμένο τους καλοκαιρινούς μήνες. Σε φυσικές συνθήκες της υπαίθρου κατά τους χειμερινούς μήνες βρίσκεται σε λήθαργο (Stromme και Hildrum, 1972). Παρουσιάζει μεγάλο ενδιαφέρον στην ανθοκομία και κηποτεχνία 11

3 λόγω της καλής της προσαρμογής στα άγονα εδάφη και στην έλλειψη νερού. Συναντάται να στολίζει με την πλούσια ανθοφορία της τις παρειές των αυτοκινητοδρόμων σε πολλά σημεία της ηπειρωτικής Ελλάδας και των νησιών, προσδίδοντας ένα πραγματικά εντυπωσιακό θέαμα. 2. Υδατική Καταπόνηση Στη φύση τα φυτά συχνά εκτίθενται σε διάφορες περιβαλλοντικές καταπονήσεις που επιδρούν δυσμενώς στην ανάπτυξη, στον μεταβολισμό και στην απόδοσή τους. Οι καταπονήσεις αυτές διακρίνονται σε βιοτικές και αβιοτικές. Από τις αβιοτικές οι σημαντικότερες είναι η ξηρασία, η αλατότητα, οι χαμηλές και υψηλές θερμοκρασίες, οι πλημμύρες, η ατμοσφαιρική ρύπανση και η ακτινοβολία (Lawlor, 2002). Συνήθως τα φυτά υπόκεινται σε ένα συνδυασμό καταπονήσεων όπως έλλειψη νερού, υψηλές θερμοκρασίες και υψηλή ένταση φωτός. Από τους παραπάνω αβιοτικούς παράγοντες, ο πλέον περιοριστικός της απόδοσης των καλλιεργειών είναι η ξηρασία. Τα φυτά για να ανταπεξέλθουν σε συνθήκες έλλειψης νερού έχουν αναπτύξει δύο μηχανισμούς, της αποφυγής και της ανοχής στην αφυδάτωση. Η αποφυγή της αφυδάτωσης είναι η ικανότητα του φυτού να διατηρεί υψηλό υδατικό δυναμικό και επιτυγχάνεται μέσω μορφολογικών αλλαγών όπως κλείσιμο στομάτων, μείωση της φυλλικής επιφάνειας και ανάπτυξη εκτεταμένου ριζικού συστήματος (Levitt, 1980). Η ανοχή είναι η ικανότητα του φυτού να διατηρεί τις λειτουργίες του ακόμα και σε πολύ χαμηλά υδατικά δυναμικά και επιτελείται με ειδικούς φυσιολογικούς, βιοχημικούς και μοριακούς κυτταρικούς μηχανισμούς που περιέχουν την έκφραση εξειδικευμένων γονιδίων και τη συσσώρευση εξειδικευμένων πρωτεϊνών σε συνθήκες ξηρασίας (Bohnert και Jenson, 1996; Shinozaki κ.ά., 1999). Η σύνθεση πρωτεϊνών με εξειδικευμένο ρόλο παρατηρείται σε αντίδραση οποιασδήποτε περιβαλλοντικής συνθήκης που προκαλεί αφυδάτωση όπως ξηρασία, αλατότητα, παγετός και υψηλή θερμοκρασία. Όταν η καταπόνηση είναι ήπια μπορεί να έχει θετική επίδραση στην ανάπτυξη του φυτού ενεργοποιώντας τον μεταβολισμό του, ενώ όταν είναι έντονη μπορεί να προκαλέσει βλάβες που επιδρούν αρνητικά στον μεταβολισμό και την ανάπτυξή του. Η διαδικασία της ανάνηψης μετά τη καταπόνηση πολλές φορές οδηγεί όχι μόνο στην επαναφορά των φυσιολογικών λειτουργιών σε κανονικά επίπεδα και την προσαρμογή στην ξηρασία αλλά και στη σκληραγώγηση των φυτών, χαρακτηριστικό ιδιαίτερα επιθυμητό αν ληφθούν υπόψη οι αλλαγές στις περιβαλλοντικές συνθήκες (Yordanov, 2003). Η ξηρασία είναι μια πολυδιάστατη μορφή καταπόνησης που επηρεάζει τα φυτά στο επίπεδο της φωτοσύνθεσης, των ενζύμων, των πρωτεϊνών, των λιπιδίων, των σακχάρων, του DNA, καθώς και σε ανατομικά και μορφολογικά χαρακτηριστικά των φυτικών οργάνων. Η έλλειψη νερού έχει ως αποτέλεσμα το κλείσιμο των στομάτων, τη μείωση της φωτοσύνθεσης, της διαπνοής, τη μείωση του 12

4 υδατικού δυναμικού των φυτικών ιστών και της ανάπτυξης του φυτού, τη συσσώρευση αψισικού οξέος (ΑΒΑ), προλίνης, σορβιτόλης και άλλων μεταβολιτών καθώς και την παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου που προκαλούν καταστροφή των κυτταρικών μεμβρανών, των πρωτεϊνών και του DNA (Yordanov, 2000). Επιπλέον, παράγονται ενώσεις που δεσμεύουν και εξουδετερώνουν τις δραστικές μορφές οξυγόνου, όπως ασκορβικό οξύ, γλουταθειόνη, α-τοκοφερόλη καθώς και αντιοξειδωτικά ένζυμα, νέες πρωτεΐνες και mrnas. Τα φυτά ανταποκρίνονται και προσαρμόζονται στην έλλειψη νερού τροποποιώντας διάφορα φυσιολογικά, βιοχημικά, μοριακά, ανατομικά και μορφολογικά τους χαρακτηριστικά (Σχήμα 1.1). Υδατική καταπόνηση Φυσιολογικές αντιδράσεις Βιοχημικές αντιδράσεις Μοριακές αντιδράσεις - αναγνώριση του σήματος της καταπόνησης από τις ρίζες - απώλεια σπαργής και ωσμωτική προσαρμογή - μείωση υδατικού δυναμικού φύλλων - μείωση στοματικής αγωγιμότητας - μείωση συγκέντρωσης του ενδοκυττάριου CO 2 (Ci) - προσωρινή μείωση της φωτοχημικής αποδοτικότητας - μείωση δραστικότητας της RubisCO - συσσώρευση μεταβολιτών όπως προλίνη, γλουταθειόνη, γλυκίνη-μπεταΐνη, πολυαμίνες, α-τοκοφερόλη κ.ά. - αύξηση αντιοξειδωτικών ενζύμων όπως SOD, CAT, APX, POD, GR και MDHAR - μείωση συσσώρευσης ROS - έκφραση γονιδίων επαγόμενων από καταπόνηση - αυξημένη έκφραση γονιδίων βιοσύνθεσης του ΑΒΑ - έκφραση ΑΒΑεπαγόμενων γονιδίων - σύνθεση εξειδικευμένων πρωτεϊνών (όψιμης εμβρυογένεσης, θερμοπληξιακές, αφυδρίνες) - αντοχή στην υδατική καταπόνηση - μείωση φωτοσύνθεσης -μείωση ρυθμού αύξησης των φυτών Σχήμα 1.1. Φυσιολογικές, βιοχημικές και μοριακές αντιδράσεις των ανώτερων φυτών στην υδατική καταπόνηση (Ramachandra-Reddy κ.ά., 2004). Η μείωση του υδατικού δυναμικού των φύλλων, σε συνθήκες υδατικής καταπόνησης, έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση του ρυθμού φωτοσύνθεσης (Lawlor και Cornic, 2002). Η μείωση αυτή οφείλεται τόσο στο κλείσιμο των στομάτων, προκαλώντας μείωση του Ci, όσο και σε βλάβες που υφίσταται ο φωτοσυνθετικός μηχανισμός (Tezara κ.ά., 1999; Graan κ.ά., 1990; Cornic κ.ά., 1991; Lawson κ.ά., 2003). Το κλείσιμο των στομάτων είναι η πρώτη αντίδραση των φυτών στην έλλειψη ύδατος και πιστεύεται πως είναι ο κύριος λόγος της μείωσης της φωτοσύνθεσης (Kaiser κ.ά., 1981; 13

5 Alexander κ.ά., 1995; Cornic, 2000). Αυτό αποδίδεται στη μείωση τόσο της αφομοίωσης του CO 2 όσο και του Ci, που οδηγούν τελικά στην αναχαίτιση της φωτοσυνθετικής διαδικασίας. Τα περισσότερα ξηρανθεκτικά είδη ελέγχουν τη στοματική λειτουργία επιτρέποντας μερικώς την αφομοίωση CO 2 κατά τη διάρκεια της καταπόνησης. Κατά τον Cornic (2000) το κλείσιμο των στομάτων παίζει σημαντικό ρόλο μόνο σε συνθήκες ήπιας υδατικής καταπόνησης, ενώ οι Tezara κ.ά. (1999) υποστηρίζουν πως ακόμα και σε ήπιες συνθήκες η αναχαίτιση της φωτοσύνθεσης οφείλεται και σε μεταβολικές διαταραχές οι οποίες εντείνονται καθώς η έλλειψη νερού γίνεται εντονότερη. Ο έλεγχος της κίνησης των στομάτων σε φυτά που υφίστανται υδατική καταπόνηση οφείλεται σε μεγάλο βαθμό στο αψισικό οξύ (ΑΒΑ) που προέρχεται από τις ρίζες που πρώτες λαμβάνουν το ερέθισμα της ξηρασίας και το μεταδίδουν στο υπέργειο τμήμα του φυτού μέσω του ρεύματος της διαπνοής (Blum, 1996). Το ΑΒΑ παράγεται εξ υπαρχής σε συνθήκες υδατικής καταπόνησης και παίζει σημαντικό ρόλο στην ανταπόκριση και την αντοχή του φυτού στην αφυδάτωση (Shinozaki κ.ά., 1999). Η συγκέντρωση του ΑΒΑ στο διάλυμα των ξυλωδών αγγείων αυξάνεται σταδιακά καθώς μειώνεται η διαθεσιμότητα του νερού στο έδαφος, με αποτέλεσμα να συσσωρεύεται σε διάφορα τμήματα του φύλλου. Αύξηση του ΑΒΑ στο διάλυμα των ξυλωδών αγγείων και στα φύλλα έχει συσχετισθεί με μειωμένη στοματική αγωγιμότητα σε συνθήκες έλλειψης νερού (Stoll κ.ά., 2000). Εκτός όμως από το κλείσιμο των στομάτων η μείωση της φωτοσύνθεσης οφείλεται και σε αλλαγές στο μεταβολισμό του άνθρακα στο φυτό (Lawlor, 2002). Ο ρυθμός της φωτοσύνθεσης εξαρτάται από την ποσότητα και τη δραστικότητα της καρβοξυλάσης της 1,5-διφωσφορικήςριβουλόζης (RubisCO) καθώς και από την σύνθεση της 1,5-διφωσφορικής-ριβουλόζης (RuBP) (Ramachandra-Reddy, 1996). Σε συνθήκες υδατικής καταπόνησης σε διάφορα είδη φυτών τόσο η ποσότητα (Vu κ.ά., 1999) όσο και η δραστικότητα της RubisCO μειώνονται (Parry κ.ά., 2002; Chaitanya κ.ά., 2003). Επίσης, σε συνθήκες έλλειψης νερού το ph του στρώματος των χλωροπλαστών μειώνεται με αποτέλεσμα να αναστέλλεται η δράση της RubisCO (Meyer και Genty, 1999). Ακόμα και στα C4 φυτά η δραστικότητα του καρβοξυλιωτικού ενζύμου, της φωσφοενολοπυρουβικής καρβοξυλάσης (PEP), επίσης μειώνεται σε συνθήκες ξηρασίας (Boyer κ.ά., 1997). Η μείωση της φωτοσύνθεσης σε συνθήκες υδατικής καταπόνησης οφείλεται επίσης στη μερική μείωση της δράσης και άλλων ενζύμων όπως της φωσφοριβουλοκινάσης και της διφωσφατάσης της 1,6-διφωσφορικής φρουκτόζης (FBPase) (Haupt-Herting και Fock, 2002). Επίσης, σε συνθήκες ξηρασίας παρατηρείται καταστροφή των φωτοσυνθετικών χρωστικών (Wingler κ.ά., 1999). Μείωση της περιεκτικότητας των χλωροφυλλών, του β-καροτινίου, της νεοξανθίνης και της λουτεΐνης, υποδηλώνει σημαντική βλάβη του φωτοσυνθετικού μηχανισμού (Iturbe-Ormaetxe κ.ά., 1998). 14

6 Η έλλειψη νερού στο έδαφος λόγω ξηρασίας αλλά και αλατότητας ή παγετού επιφέρει μείωση του ωσμωτικού δυναμικού του εδάφους, που όταν πάρει τιμές αρνητικότερες από αυτές του φυτού, προκαλείται στα κύτταρα ωσμωτική καταπόνηση, δηλαδή δυσχέρεια απορρόφησης νερού από το έδαφος και αύξηση της συγκέντρωσης ανόργανων ιόντων στο κύτταρο σε τοξικά επίπεδα (Κωνσταντινίδου, 2003). Πολλά φυτά αντιμετωπίζουν την ωσμωτική καταπόνηση με τη σύνθεση και τη συσσώρευση διαλυτών ουσιών που ονομάζονται ωσμωπροστατευτικές ουσίες ή ωσμωλύτες. Οι ενώσεις αυτές είναι μικρά, ηλεκτρικώς ουδέτερα μόρια, μη τοξικά ακόμα και σε υψηλές συγκεντρώσεις (Alonso κ.ά., 2001). Κατά τη διάρκεια της καταπόνησης τα κύτταρα συσσωρεύουν ωσμωλύτες για να αποτρέψουν την απώλεια νερού και να διατηρήσουν τη σπαργή τους. Στις ουσίες αυτές περιλαμβάνονται τα ιόντα Κ +, Na +, Cl - ή οργανικοί μεταβολίτες όπως προλίνη, σορβιτόλη, διάφορα αμινοξέα, πολυαμίνες και τετραδικές ενώσεις αμμωνίου όπως, γλυκίνη-μπεταΐνη (Tamura κ.ά., 2003). Στα φυτικά κύτταρα οι ωσμωλύτες περιορίζονται στους χλωροπλάστες και στους διάφορους κυτταροπλασματικούς χώρους που καταλαμβάνουν περί το 20% του όγκου ενός ώριμου φυτικού κυττάρου (Ain-Lhout κ.ά., 2001). Η συγκέντρωση των ωσμωλυτών στα φυτικά κύτταρα μπορεί να φτάσει τα 200 mm ή και παραπάνω, συγκέντρωση που είναι τόσο σημαντική ώστε να βοηθήσει στη διατήρηση της σπαργής των κυττάρων σε συνθήκες ξηρασίας (Rhodes και Samaras, 1994). Οι ωσμωλύτες παίζουν σημαντικό ρόλο όχι μόνο στην ωσμωτική προσαρμογή αλλά και στη προστασία των κυττάρων από τις δραστικές μορφές οξυγόνου (Pinherpo κ.ά., 2001). Η προλίνη εμπλέκεται στην προστασία της μεμβράνης των θυλακοειδών καταστρέφοντας ή/και μειώνοντας την παραγωγή 1 O 2. Η συγκέντρωση της προλίνης αλλά και άλλων αμινοξέων όπως η γλυκίνη, η σερίνη και το γλουταμικό οξύ συνήθως αυξάνεται σε καταπονημένους από ξηρασία φωτοσυνθετικούς ιστούς (Bertamini κ.ά., 2006; Pinheiro κ.ά., 2004; Lawlor και Cornic, 2002). Η συσσώρευση της προλίνης προκαλείται τόσο από νέα σύνθεσή της όσο και από την αδρανοποίηση της αντίδρασης αποικοδόμησής της. O ρόλος της προλίνης στην αντοχή σε υδατική καταπόνηση είναι πιθανώς πιο σημαντικός ως αντιοξειδωτική παρά ως απλή ωσμωρυθμιστική ουσία (Delauney και Verma, 1993; Ramachandra-Reddy κ.ά., 2004), ενώ ο κύριος ρόλος των άλλων αμινοξέων πιθανώς είναι η ωσμωτική προσαρμογή (Hanson και Hitz, 1982). Σε μερικά είδη φυτών συσσωρεύεται γλυκίνη-μπεταΐνη (GlyBet) η οποία συντίθεται στους χλωροπλάστες. Έχει αποδειχθεί πως η GlyBet επίσης προστατεύει τα ένζυμα, τις μεμβράνες καθώς και το PSII σε συνθήκες καταπόνησης (Papageorgiou και Morata, 1995), ενώ εμπλέκεται και στη σύνθεση πρωτεϊνών στο στάδιο ανάνηψης των φυτών (Sakamoto και Murata, 2000). Πολλοί ερευνητές αναφέρουν πως στη φυσιολογική αντίδραση των φυτών που εκτίθενται σε ξηρασία, συμμετέχουν φυσικοί ρυθμιστές της αύξησης και ανάπτυξης (Fletcher κ.ά., 2000; Gilley και Fletcher, 1997; Asare-Boamah κ.ά., 1986). Η εφαρμογή φυσικών ή συνθετικών ρυθμιστών της 15

7 αύξησης μειώνει τις βλαβερές συνέπειες της καταπόνησης (Stoyanova και Yordanov, 2000). Οι φυτικοί ρυθμιστές προκαλούν αλλαγές στο μεταβολισμό των φυτών αυξάνοντας έτσι την αντοχή τους σε αντίξοες περιβαλλοντικές συνθήκες (Fletcher κ.ά., 2000; Dat κ.ά., 1998; Senaratna κ.ά., 2000). Στους φυσικούς φυτικούς ρυθμιστές ανήκουν διάφορες ενώσεις όπως οι πολυαμίνες και το σαλικυλικό οξύ που προωθούν την αύξηση και ανάπτυξη (86-Rajasekaran και Blake, 1999). Το σαλικυλικό οξύ (2-hydroxy benzoic acid) παίζει σημαντικό ρόλο στην άμυνα πολλών φυτικών ειδών από προσβολές παθογόνων (Raskin, 1992; Yalpani κ.ά., 1993). Επίσης, έχει δειχθεί πως δρα ως σήμα για τη διέγερση των αντιοξειδωτικών μηχανισμών σε συνθήκες αβιοτικής καταπόνησης (Singh και Usha, 2003; Janda κ.ά., 1999; Yalpani κ.ά., 1994; και Senaratna κ.ά., 2000). Σε συνθήκες έλλειψης νερού έχει βρεθεί πως το σαλικυλικό οξύ μειώνει τη σύνθεση του αιθυλενίου (Rajasekaran και Blake, 1999). Επιπλέον, η προσθήκη εξωγενώς σαλικυλικού οξέος προκαλεί πλήθος φυσιολογικών και βιοχημικών μεταβολών όπως, επαγωγή της άνθησης και σχηματισμό επίκτητων ριζών, αναστολή της απορρόφησης καλίου και φωσφορικών αλάτων, σύνθεση θερμοπληξιακών πρωτεϊνών, αποτροπή του κλεισίματος των στομάτων και της αποκοπής των φύλλων που επάγονται από το ΑΒΑ (Malamy και Klessig, 1992; Burkhanova κ.ά., 1999). Η ξηρασία επηρεάζει το μεταβολισμό των διαλυτών υδατανθράκων, που δύνανται να δρουν είτε ως συμβατοί μεταβολίτες είτε ως αντιοξειδωτικές ενώσεις (Taiz και Zeiger, 1991). Τα ολικά σάκχαρα συνήθως αυξάνονται ως αποτέλεσμα της υδατικής καταπόνησης συμβάλλοντας στην ωσμωτική προσαρμογή (Morgan, 1984; Hanson και Hintz, 1982; Smirnoff και Cumbes, 1989; Mohsenzadeh κ.ά., 2006). Η έλλειψη νερού προκαλεί τη μετατροπή του αμύλου σε σακχαρόζη (Stewart, 1971; Fox και Geier, 1986; Beck και Ziegler, 1989), ενώ η δραστικότητα της διφωσφατάσης της 1,6-διφωσφορικής φρουκτόζης (FBPase) μειώνεται υποδηλώνοντας πως ο ρυθμός σύνθεσης της σακχαρόζης επηρεάζεται σε συνθήκες υδατικής καταπόνησης (Wardlaw και Willenbrink, 1994; Haupt-Herting και Fock, 2002). Κατά τη διάρκεια της αφυδάτωσης των ιστών που συμβαίνει σε μία ομάδα φυτών εξαιρετικά ανθεκτικών στην έλλειψη νερού, που ονομάζονται αναβιώνοντα φυτά (resurrection plants) και έχουν τη δυνατότητα να ανακάμπτουν ταχύτατα μετά από περιόδους παρατεταμένης ξηρασίας, έχει δειχθεί πως τα σάκχαρα αλληλεπιδρούν με τις προεξέχουσες πολικές κεντρικές ομάδες των πρωτεϊνών αντικαθιστώντας τα μόρια του νερού. Έτσι τα σάκχαρα επιτρέπουν την απομάκρυνση του νερού από τις πρωτεΐνες χωρίς αυτή να οδηγεί σε αλλαγές στη διάταξή τους ή σε απώλεια της ενζυμικής λειτουργίας. Σύμφωνα με αυτή την υπόθεση, τα σάκχαρα λειτουργούν ως υποκατάστατα του νερού ικανοποιώντας την απαίτηση για ύπαρξη δεσμών υδρογόνου των πολικών ομάδων των πρωτεϊνών (Carpenter και Gowe, 1988; Wolkers κ.ά., 1998). 16

8 Σε συνθήκες έλλειψης νερού παράγονται και συσσωρεύονται δραστικές μορφές οξυγόνου (Reactive Oxygen Species-ROS) (O - 2, 1 O 2, H 2 O 2,. OH), ιδιαίτερα καταστρεπτικές για τα φυτά (Peltzer κ.ά., 2002). Οι δραστικές μορφές του οξυγόνου είναι ελεύθερες ρίζες, δηλαδή μόρια με ένα ή περισσότερα ασύζευκτα ηλεκτρόνια στην εξωτερική τους στιβάδα. Η αυξημένη παραγωγή των ROS κατά τη διάρκεια της καταπόνησης αποτελεί απειλή για το φυτικό κύτταρο ωστόσο δρουν και ως σήματα για την ενεργοποίηση αμυντικών μηχανισμών για αντιμετώπισή της (Desikin κ.ά., 2001; Knight και Knight, 2001). Οι δραστικές μορφές οξυγόνου είναι μερικώς ανηγμένες μορφές του ατμοσφαιρικού οξυγόνου (Ο 2 ). Προέρχονται είτε από τη διέγερση του Ο 2 οπότε δημιουργείται το οξυγόνο απλής κατάστασης ( 1 O - 2 ) ή από τη μεταφορά ενός, δύο ή τριών ηλεκτρονίων στο Ο 2 οπότε δημιουργούνται το σουπεροξειδικό ανιόν (O - 2 ), το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H 2 O 2 ) ή η υδροξυλική ρίζα (. OH), αντιστοίχως. Σε αντίθεση με το ατμοσφαιρικό οξυγόνο, τα ROS έχουν τη δυνατότητα να οξειδώνουν διάφορα συστατικά του κυττάρου οδηγώντας στην οξειδωτική καταστροφή του (Asada και Takahashi, 1987; Hammond-Kosack και Jones, 1996). Το H 2 O 2 είναι μια ισχυρά οξειδωτική ένωση που προκαλεί οξειδωτική ζημιά η οποία μπορεί να οδηγήσει σε διαταραχή του μεταβολισμού και απώλεια της ακεραιότητας των κυττάρων σε σημεία όπου συσσωρεύεται (Foyer κ.ά., 1997). Το H 2 O 2 είναι ιδιαίτερα τοξικό στους χλωροπλάστες διότι ακόμα και σε χαμηλές συγκεντρώσεις αναστέλλει τη δραστικότητα των ενζύμων του κύκλου Calvin, μειώνοντας έτσι την αφομοίωση του CO 2 (3-Takeda κ.ά., 1995). Το. OH είναι από τα πλέον δραστικά μόρια στα βιολογικά συστήματα, ικανό να αντιδράσει σχεδόν με όλα τα κυτταρικά συστατικά (Κωνσταντινίδου, 2003). Τα ROS διαχέονται μέσω των υδατοπορινών σε σχετικά μεγάλες αποστάσεις από το σημείο σύνθεσής τους επηρεάζοντας και άλλα κυτταρικά οργανίδια, βλάπτοντας τους αντιοξειδωτικούς μηχανισμούς και τροποποιώντας την έκφραση των γονιδίων σε συνθήκες καταπόνησης (Henzier κ.ά., 2000). Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες ανάπτυξης η παραγωγή των ROS στα κύτταρα είναι χαμηλή (240 μμ s -1 - O 2 και 0,5 μm H 2 O 2 στους χλωροπλάστες) ενώ κάτω από αντίξοες περιβαλλοντικές συνθήκες η παραγωγή αυξάνεται ( μμ s -1 O - 2 και 5-15 μm s -1 H 2 O 2 ) (Polle, 2001). Οι ROS παράγονται όχι μόνο στους χλωροπλάστες αλλά και στα μιτοχόνδρια, υπεροξυσωμάτια και στο κυτόπλασμα (Mittler, 2002). Ο θάνατος των κυττάρων από ROS προκαλείται από οξειδωτικές διαδικασίες όπως, υπεροξείδωση των λιπιδίων των μεμβρανών που οδηγεί σε απώλεια της ακεραιότητάς τους, οξείδωση αμινοξέων και πρωτεϊνών και τεμαχισμό των DNA και RNA (Asada και Takahashi, 1987; Mittler, 2002). Τα ROS προσβάλλουν τα πιο ευαίσθητα μακρομόρια των κυττάρων επηρεάζοντας δυσμενώς τη λειτουργία τους. Τα προσβεβλημένα μόρια ανακτούν τη λειτουργία τους είτε με επισκευή είτε με αντικατάσταση τους μέσω της εκ νέου βιοσύνθεσής τους. Η πορεία των κυττάρων 17

9 εξαρτάται από τη διάρκεια της υδατικής καταπόνησης και από την προστατευτική ικανότητα του φυτού. Τα ROS παίζουν σημαντικό ρόλο στην καταστροφή των κυττάρων σε συνθήκες ξηρασίας. Η αλληλουχία των γεγονότων στο φυτό που υπόκειται σε έλλειψη νερού είναι η εξής: α) αυξημένη παραγωγή ROS και των οξειδωμένων μορφών των μακρομορίων β) αύξηση της έκφρασης των γονιδίων για αντιοξειδωτική λειτουργία γ) αύξηση των αντιοξειδωτικών ενζύμων και των αντιοξειδωτικών ουσιών και δ) αυξημένη ικανότητα απομάκρυνσης των ROS που οδηγεί σε αντοχή στην υδατική καταπόνηση (Mano, 2002). Τα φυτά για να αντιμετωπίσουν την οξειδωτική ζημιά που προκαλείται από τα ROS διαθέτουν έναν αμυντικό αντιοξειδωτικό μηχανισμό που περιλαμβάνει πλήθος αντιοξειδωτικών ενζύμων και μη ενζυμικών αντιοξειδωτικών ουσιών. Υπό φυσιολογικές συνθήκες τα φυτά είναι πλούσια σε αντιοξειδωτικά ένζυμα και μεταβολίτες που αντιδρούν με τις δραστικές μορφές οξυγόνου ελαχιστοποιώντας την οξειδωτική ζημιά. Οι αντιοξειδωτικοί μεταβολίτες (ασκορβικό οξύ, ανηγμένη γλουταθειόνη, τοκοφερόλες, φλαβονοειδή, ανθοκυάνες, καροτινοειδή) βρίσκονται στους χλωροπλάστες και άλλα τμήματα του κυττάρου σε πολύ υψηλές συγκεντρώσεις (5-20 mm ασκορβικό οξύ, 1-5 mm γλουταθειόνη) και παίζουν σημαντικό ρόλο στην άμυνα για την οξειδωτική καταπόνηση (Noctor κ.ά., 1998; Iturbe-Ormaetxe κ.ά., 1998). Οι μεταβολίτες αυτοί εκτός από τον ρόλο τους ως ενζυμικά υποστρώματα αντιδρούν σχεδόν με όλες τις δραστικές μορφές του οξυγόνου (Halliwell και Gutteringe, 1989). Η συγκέντρωση των αντιοξειδωτικών ουσιών στο φυτό κατά τη διάρκεια της υδατικής καταπόνησης μπορεί να αυξάνεται, να μειώνεται ή και να παραμένει σταθερή ανάλογα με το είδος και την ηλικία του φυτού και τη διάρκεια της καταπόνησης (30 Boo και Jung, 1999; Munne-Bosch και Penuelas, 2004; Zagdanska και Wisniewski, 1996; Zhang και Kirkham, 1996). Το ασκορβικό οξύ (Βιταμίνη C) είναι βασικός μεταβολίτης (Noctor και Foyer, 1998). Το ασκορβικό οξύ αντιδρά με το H 2 O 2 αλλά και με τα O.- 2 και OH.. Επίσης, χρησιμοποιείται από το φυτό ως συμπαράγοντας ενζύμων αλλά και ως δότης/δέκτης ηλεκτρονίων στην πλάσμα-μεμβράνη συνεισφέροντας έτσι στην αντοχή στην οξειδωτική καταπόνηση (Conklin, 2001). Επιπρόσθετα το ασκορβικό οξύ βοηθά στην προστασία και την αναγέννηση των οξειδωμένων καροτινοειδών και τοκοφερολών (Imai κ.ά., 1999). Η γλουταθειόνη αποτελεί έναν ακόμα αμυντικό μηχανισμό του φυτού στην οξειδωτική καταπόνηση που προστατεύει πολλά συστατικά του κυττάρου και τις σουλφυδριλικές ομάδες των πρωτεϊνών (Gilbert κ.ά, 1990). Η γλουταθειόνη επίσης μεταβολίζει το H 2 O 2 συμμετέχοντας στον κύκλο ασκορβικού-γλουταθειόνης ή στην αντίδραση που καταλύεται από την υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (Drotar κ.ά., 1985) Η α-τοκοφερόλη (Βιταμίνη Ε) που βρίσκεται στα πράσινα μέρη των φυτών επίσης χρησιμεύει ως καθαριστής των ROS σε συνεργασία με τις υπόλοιπες αντιοξειδωτικές ουσίες (Munne-Bosch και 18

10 Alegre, 2002). Εκτός της α-τοκοφερόλης και άλλες τοκοφερόλες προστατεύουν τα λιπίδια και άλλα συστατικά των μεμβρανών είτε με τη φυσική εξουδετέρωση είτε με τη χημική αντίδραση με 1 O 2 στους χλωροπλάστες, προστατεύοντας έτσι τη δομή και τη λειτουργία του PSII (Trebst κ.ά., 2002). Ο ενζυμικός αντιοξειδωτικός μηχανισμός αποτελείται από τα ένζυμα υπεροξειδική δισμουτάση (SOD; EC ), διάφορες μη εξειδικευμένες υπεροξειδάσες (PODs; EC ), την καταλάση (CAT; EC ) και τα ένζυμα του κύκλου ασκορβικού-γλουταθειόνης (Dalton, 1995; Asada, 1996; Blokhina κ.ά., 2003). Ο κύκλος αυτός περιλαμβάνει την υπεροξειδάση του ασκορβικού οξέως (APX, EC ) και τις αντίστοιχες αναγωγάσες που ανάγουν τις οξειδωμένες μορφές του ασκορβικού οξέος (μονο-αφυδρογονωμένο και δις-αφυδρογονωμένο ασκορβικό οξύ) και της οξειδωμένης γλουταθειόνης (Σχήμα 1.2). Τα αντιοξειδωτικά ένζυμα συμμετέχουν στον κύκλο ως προστατευτικά ένζυμα, καθώς εξουδετερώνουν άμεσα τα τοξικά μόρια που παράγονται, ενώ οι αναγωγάσες υποβοηθούν στη διατήρηση των αντιοξειδωτικών ουσιών στην ανηγμένη μορφή τους (Polle και Rennenberg, 1994). Τελικά, κατά τη λειτουργία του κύκλου, το H 2 O 2 ανάγεται σε H 2 O καταναλώνοντας NADH ή NADPH (Asada, 1996). Σχήμα 1.2. Τα αντιοξειδωτικά ένζυμα στα ανώτερα φυτά. Το σχήμα περιγράφει τον κύκλο του ασκορβικού-γλουταθειόνης (μεταβολική οδός Asada-Halliwell) καθώς και τις αντιδράσεις που καταλύονται από τη υπεροξειδική δισμουτάση (SOD), υπεροξειδάση (POD) και την καταλάση (CAT). Η οικογένεια των ενζύμων της υπεροξειδικής δισμουτάσης (SODs) αποτελείται από μεταλλοπρωτεΐνες που καταλύουν την απομάκρυνση της σουπεροξειδικής ανιονικής ρίζας (. O 2 - ) με τη δις-μετάλλαξή του σε H 2 O 2, σύμφωνα με την παρακάτω αντίδραση: (. O 2 - ) + (. O 2 - ) +2Η + H 2 O 2 + Ο 2 Συνεπώς, οι SODs θεωρούνται ότι αποτελούν την πρώτη γραμμή του αντιοξειδωτικού μηχανισμού των ανωτέρων φυτών καθώς καθορίζουν τη συγκέντρωση του σουπεροξειδικού ανιόντος και του H 2 O 2 (Fridovich, 1986; Bowler κ.ά., 1994). Ανάλογα με το μέταλλο που περιέχουν ως συμπαράγοντα, οι SODs διακρίνονται σε τρεις κατηγορίες που περιέχουν είτε Mn (Mn-SOD), Fe 19

11 (Fe-SOD) ή Cu και Zn (Cu/Zn-SOD). Γενικά, η δράση της Mn-SOD εντοπίζεται στα μιτοχόνδρια και στα περοξυσωμάτια, της Fe-SOD κυρίως στο χλωροπλάστη, αλλά και στα περοξυσωμάτια και μιτοχόνδρια μη φωτοσυνθετικών ιστών και των Cu/Zn-SOD στο κυτόπλασμα και το χλωροπλάστη (Bowler κ.ά., 1994). Η πιο συχνά απαντούμενη μορφή SOD στα ανώτερα φυτά είναι η μορφή CuZn-SOD, ενώ οι Mn-SOD και Fe-SOD συμβάλλουν λιγότερο στη συνολική δράση του ενζύμου (Alscher κ.ά., 1997). Αν και η μετατροπή του. O - 2 σε H 2 O 2 από τις SODs θεωρείται επωφελής στα κύτταρα, για να αποβεί πραγματικά ωφέλιμη η δράση τους θα πρέπει να συνδυαστεί με την ενεργοποίηση της καταλάσης αλλά και των υπεροξειδασών για τη διάσπαση του παραγόμενου H 2 O 2. Η γενική αντίδραση των υπεροξειδασών είναι η ακόλουθη : AH 2 + H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 (AH 2 δότης ηλεκτρονίων, π.χ. φαινόλη, ασκορβικό οξύ) Οι φυτικές υπεροξειδάσες (PODs; EC ) καταλύουν την οξείδωση διαφόρων υποστρωμάτων στο κύτταρο με δαπάνη υπεροξειδίου (H 2 O 2 ). Οι υπεροξειδάσες βρίσκονται σε διάφορους ιστούς και σε διάφορα μέρη των κυττάρων στα φυτά (Mäder και Füssl 1982; Jackson και Ricardo 1998; Bellani κ.ά., 2002). Αυτές οι διάφορες ισοενζυματικές πολυμορφικές αλλαγές κατά τη διάρκεια της φυτικής ανάπτυξης, δείχνουν ότι η κατανομή των υπεροξειδασών στους ιστούς μπορεί να σχετίζεται με συγκεκριμένες φάσεις τις ανάπτυξης (Mäder και Füssl 1982, Jackson και Ricardo 1998). Σημαντικός είναι ο ρόλος των υπεροξειδασών στη φυτική ανάπτυξη (Gaspar κ.ά. 1985, 1991) όπως επίσης και στην ανταπόκριση σε αβιοτικές και βιοτικές καταπονήσεις (Repka κ.ά., 2000; Gaspar κ.ά., 2002; Metaxas κ.ά., 2004; Simonovicova κ.ά., 2004; Syros κ.ά. 2004, 2005). Οι υπεροξειδάσες φαίνονται να λειτουργούν στην κυτταρική ανάπτυξη και αύξηση (Wallace και Fry, 1994), στον καταβολισμό της αυξίνης (Gaspar κ.ά., 1985; Beffa κ.ά., 1990; Gazaryan κ.ά., 1996), στον αμυντικό μηχανισμό των φυτών (Bolwell και Wojtaszek, 1997) και ιδιαίτερα στη σύνθεση της λιγνίνης και του φελλού (Mäder και Füssl, 1982; Gaspar κ.ά., 1985, 1991; Bruce και West, 1989; Repka κ.ά., 2000; Chen κ.ά., 2002; Syros κ.ά., 2004) Η διαμερισματοποίηση των αντιοξειδωτικών ενζύμων, ακόμη και η διαφορετική τους θέση μέσα στο ίδιο οργανίδιο, είναι κρίσιμη για τη λειτουργία τους καθώς οι ίδιες αντιοξειδωτικές λειτουργίες επιτυγχάνονται με διακριτά, τοπικώς ολοκληρωμένα αντιοξειδωτικά συστήματα. Η αύξηση της ποσότητας των αντιοξειδωτικών ουσιών και της δραστικότητας των αντιοξειδωτικών ενζύμων σε συνθήκες υδατικής καταπόνησης διαφοροποιείται μεταξύ των φυτικών ειδών ακόμα και μεταξύ δυο ποικιλιών του ίδιου είδους. Η αντίδραση του φυτού εξαρτάται από το στάδιο ανάπτυξης του, τη μεταβολική του κατάσταση, καθώς και από τη διάρκεια και την ένταση της καταπόνησης. Η μείωση της παραγωγής των ROS μπορεί να είναι το ίδιο σημαντική με την απομάκρυνση τους. Μηχανισμοί που μπορεί να μειώσουν την παραγωγή τους κατά τη διάρκεια καταπόνησης 20

12 είναι: 1) προσαρμογή της ανατομίας των φυτών όπως κίνηση και καρούλιασμα των φύλλων, δημιουργία επιδερμίδας που διαθλά το φως και απόκρυψη των στομάτων σε ειδικές κατασκευές, 2) φυσιολογικές προσαρμογές, όπως συμβαίνουν στο μεταβολισμό των C4 και CAM φυτών, 3) καταστολή της φωτοσύνθεσης και 4) παραγωγή ή αύξηση της δραστικότητας των εναλλακτικών oξειδασών (AOXs) οι οποίες χρησιμοποιούν τα ηλεκτρόνια από την αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων σε χλωροπλάστες και μιτοχόνδρια για την αναγωγή του Ο 2 σε νερό (Maxwell κ.ά., 1999). Εκτός από τα αντιοξειδωτικά ένζυμα σε συνθήκες έλλειψης νερού, επάγεται και η σύνθεση πολλών εξειδικευμένων πρωτεϊνών. Οι γνωστότερες είναι οι πρωτεΐνες όψιμης εμβρυογένεσης (LEA), οι αφυδρίνες (Dhns), η ωσμωτίνη (OSM), θερμοπληξιακές πρωτεΐνες (HSPs), πρωτεάσες, ένζυμα για τη βιοσύνθεση των ωσμωπροστατευτικών ουσιών, πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη μετάδοση του σήματος της καταπόνησης και την έκφραση των γονιδίων, όπως οι κινάσες των πρωτεϊνών και οι φωσφατάσες καθώς και παράγοντες μεταγραφής (Tzvi κ.ά., 2000). Αντίθετα με τα αντιοξειδωτικά ένζυμα, για τα οποία υπάρχει εκτεταμένη βιβλιογραφία, λιγοστές είναι οι αναφορές για τη δράση άλλων ενζύμων του μεταβολισμού όπως των φωσφατασών, εστερασών και των νουκλεολυτικών ενζύμων σε συνθήκες καταπόνησης. Η απομάκρυνση των φωσφορικών ομάδων από τις φωσφορυλιωμένες ενώσεις (αποφωσφορυλίωση) με τη δράση των φωσφατασών είναι μια σημαντική διαδικασία για τον ενεργειακό μεταβολισμό και τη ρύθμιση του μεταβολισμού των φυτικών κυττάρων (Duff κ.ά., 1994; Vance, 2003). Η έκφραση των ειδικών αυτών ενζύμων, των φωσφατασών, ρυθμίζεται από πλήθος αναπτυξιακών και περιβαλλοντικών παραγόντων (Szabo-Nagy κ.ά., 1992; Hurry κ.ά., 1993; Yupsanis κ.ά., 1994; Murata και Los, 1997). Ωστόσο, σε αντίθεση με τις κινάσες των πρωτεϊνών, οι οποίες καταλύουν την προσθήκη της ορθοφωσφορικής ομάδας (φωσφορυλίωση), για τις οποίες υπάρχει πληθώρα ερευνητικών εργασιών, μόνο τα τελευταία χρόνια έγιναν έρευνες για τη συμμετοχή των φωσφατασών στις θεμελιώδεις λειτουργίες των φυτών (Smith και Walker, 1996). Οι φωσφατάσες είναι ένζυμα πολύ διαδεδομένα στη φύση. Διακρίνονται στις αλκαλικές (EC ) και τις όξινες φωσφατάσες (EC ), ενώ συναντώνται και ειδικές φωσφατάσες όπως η 5 -νουκλεοτιδάση (EC ), η φυτάση (EC ), η φωσφατάση της 6-φωσφορικής γλυκόζης (EC ) κ.ά. Ωστόσο αναφέρονται και φωσφατάσες που χαρακτηρίζονται ως ουδέτερες, όπως η φωσφατάση πρωτεϊνών τυροσίνης που απομονώθηκε σε βλαστημένους σπόρους σίτου. Οι όξινες φωσφατάσες παρουσιάζουν ph δράσης μικρότερο του 6 και καταλύουν την αντίδραση: R(PO 4 ) -2 + H 2 O ROH + H(PO 4 ) -2 Ειδικότερα οι όξινες φωσφατάσες είναι ευρέως διαδεδομένα ένζυμα και δεν παρουσιάζουν υψηλή εξειδίκευση. Είναι γλυκοπρωτεΐνες και πιθανώς η δράση τους ρυθμίζεται από την παρουσία 21

13 διαφόρων λεκτινών που έχουν τη δυνατότητα σύνδεσης μεταξύ τους. Οι όξινες φωσφατάσες συναντώνται σε πολύ μικρές ποσότητες, είναι ασταθείς σε αραιά διαλύματα και υπόκεινται σε μετουσίωση σε καθαρή κατάσταση. Αυτό, σε συνδυασμό με την τάση τους να συναντώνται σε πολλές μορφές κάνει δύσκολη την απομόνωση τους. Οι φωσφατάσες εντοπίζονται ενδοκυτταρικά στο κυτόπλασμα και τα χυμοτόπια και εξωκυταρρικά στα κυτταρικά τοιχώματα (Lee, 1998). Σε αντίξοες περιβαλλοντικές συνθήκες όπως αλατότητα και υδατική καταπόνηση αναφέρεται αύξηση της δράσης των όξινων και αλκαλικών φωσφατασών, με αποτέλεσμα τη διατήρηση του ανόργανου φωσφόρου σε ικανοποιητικά επίπεδα στο φυτικό κύτταρο (Lefebvre κ.ά., 1990; Chiun- Yueh κ.ά., 1998; Olmos και Hellin, 1997; Barrett-Lannared κ.ά., 1982; Sharma κ.ά., 2005). Οι εστεράσες υδρολύουν εστερικούς δεσμούς διαφόρων μεταβολιτών και απαντώνται σε όλα τα στάδια της ανάπτυξης των φυτών σε διάφορες ισομορφές (Rasol κ.ά., 1999). Αλλαγές στη δραστικότητα αλλά και στην έκφρασή τους έχουν παρατηρηθεί σε συνθήκες αβιοτικών (Hassanein, 1999; Syros κ.ά., 2005; Abdel-Tawab κ.ά., 2003; El-Sayed κ.ά., 2002; ) και βιοτικών καταπονήσεων (De Carvalho κ.ά., 2003; Muarlidharan κ.ά., 1996). Οι εστεράσες είναι ένζυμα που καταλύουν την επόμενη αμφίδρομη αντίδραση: RCOOR + H 2 O R-COOH + R OH Οι εστεράσες μπορούν να χωριστούν σε απλές εστεράσες, οι οποίες υδρολύουν μικρής αλυσίδας αλειφατικούς εστέρες, σε λιπάσες, οι οποίες υδρολύουν μεγάλου μήκους ανθρακικές αλυσίδες, φωσφολιπάσες, που υδρολύουν εστερικούς δεσμούς των γλυκεροφωσφολιπιδίων και σε χολινοεστεράσες, οι οποίες επιδρούν σε εστέρες της χολίνης. Οι χολινοεστεράσες συνήθως χωρίζονται σε ειδικές οι οποίες υδρολύουν ακετυλοχολίνη και μη ειδικές οι οποίες επιδρούν σε άλλους εστέρες της χολίνης (De Robertis, 1975). Ένας αρκετά μεγάλος αριθμός νουκλεολυτικών ενζύμων έχει απομονωθεί και μελετηθεί έως σήμερα, από διάφορους ιστούς και διάφορα μέρη των κυττάρων. Οι κυριότερες εργασίες αφορούν τη μελέτη νουκλεασών (ένζυμα που υδρολύουν και τα δυο υποστρώματα DNA και RNA) και RNAσων (Yupsanis κ.ά., 2004). Ο φυσιολογικός τους ρόλος συνίσταται στο ότι αποικοδομούν τα νουκλεϊνικά οξέα και συμμετέχουν στο μεταβολισμό τους τον οποίο και πιθανόν μπορούν να ρυθμίζουν (Wyen κ.ά., 1971). Οι λειτουργίες αυτές έχουν μελετηθεί κυρίως σε βακτήρια ενώ πολύ λιγότερα είναι γνωστά για το ρόλο των νουκλεολυτικών ενζύμων σε ευκαρυωτικά κύτταρα και ανώτερους οργανισμούς. Όσον αφορά τα φυτικά νουκλεολυτικά ένζυμα, εκτός από την αποικοδόμηση συμμετέχουν και στο μεταβολισμό των νουκλεϊνικών οξέων, στις διαδικασίες αντιγραφής, μεταγραφής, ανασυνδυασμού και επιδιόρθωσης του DNA (Xodo κ.ά.,1991). Μέσα στο κύτταρο αποικοδομούνται άχρηστα πλέον νουκλεϊνικά οξέα, ώστε τα συστατικά τους να χρησιμοποιηθούν για τη σύνθεση νέων νουκλεϊνικών οξέων. Η καταβολική είναι και η πρώτη λειτουργία των νουκλεολυτικών ενζύμων που ανακαλύφθηκε. Μια σημαντική λειτουργία των 22

14 νουκλεολυτικών ενζύμων είναι η υδρόλυση του RNA ή DNA διαφόρων ιών ή παθογόνων παραγόντων που προσβάλλουν το κύτταρο. Τα βακτήρια π.χ. αντιμετωπίζουν τους ιούς με ενδονουκλεάσες περιορισμού, ενώ το DNA του μικροοργανισμού προστατεύεται συνήθως με μεθυλίωση (Kochanek κ.ά., 1993). Υπάρχουν ενδείξεις για το ρόλο των φυτικών νουκλεολυτικών ενζύμων σε διάφορα στάδια ανάπτυξης των φυτών. Αύξηση της δραστικότητας των νουκλεολυτικών ενζύμων έχει παρατηρηθεί κατά τη γήρανση (Wyen κ.ά., 1971; Lers κ.ά., 1998; Perez-Amador κ.ά., 2000), τη βλάστηση (Wilson, 1975), την ξυλοποίηση (Thelen και Northcote 1989; Green, 1994; Ye και Droste, 1996), την ωρίμανση (Mckeon κ.ά., 1991) και την αναπαραγωγή (Huang κ.ά., 1994). Αυτή η αύξηση αποδόθηκε στην ανάγκη αποικοδόμησης του ενδογενούς RNA αλλά και γενικότερα των νουκλεϊνικών οξέων (Thelen και Northcote, 1989) σε νουκλεοτίδια και νουκλεοζίτες για να χρησιμοποιηθούν από τα αναπτυσσόμενα μέρη των φυτών (Mckeon κ.ά., 1991; Bariola κ.ά., 1994). Σημαντικός ρόλος των νουκλεολυτικών ενζύμων είναι η επιδιόρθωση του DNA από βλάβες που προξενούν ιονίζουσες, υπεριώδεις ή άλλες ακτινοβολίες και χημικές ουσίες. Οι βλάβες στο DNA ενός κυττάρου μπορεί να προκαλέσουν ανωμαλίες στην πρωτεϊνοσύνθεση, νεοπλασματικές παραμορφώσεις, μεταλλάξεις ή και θάνατο του κυττάρου. Για την επιδιόρθωση τους οι ενδονουκλεάσες υδρολύουν φωσφοδιεστερικούς δεσμούς για την απομάκρυνση των διαφοροποιημένων νουκλεοτιδίων. Στα φυτά η επιδιόρθωση των διαφόρων βλαβών του DNA από ακτινοβολίες ίσως εκτελείται από εξειδικευμένα συστήματα για την κάθε μια (Murphy κ.ά., 1993). Ο φυσιολογικός ρόλος των νουκλεολυτικών ενζύμων στο μεταβολισμό του RNA είναι περισσότερο εκτεταμένος από ότι του DNA, λόγω του πλήθους των λειτουργιών του RNA μέσα στο κύτταρο. Συμπερασματικά τα νουκλεολυτικά ένζυμα συμμετέχουν σε διάφορες διεργασίες του κυττάρου όπως η υδρόλυση, ο αναδιπλασιασμός, η μεταγραφή και η επιδιόρθωση των νουκλεϊνικών οξέων (Wilson, 1975; Matousek και Tupy, 1987; Yupsanis και Pantazaki, 1988; Rzepecki κ.ά., 1989; Thelen και Northcote, 1989; Strickland κ.ά., 1991). Τα φυτά υφίστανται μεταβολές στα επίπεδα των νουκλεολυτικών ενζύμων ως απόκριση σε συνθήκες καταπόνησης (Green, 1994). Έχουν παρατηρηθεί μεταβολές των RNασών κατά τη διάρκεια της επίδρασης άλατος (Rouxel κ.ά., 1987; Gomes Filho και Sodek, 1988; Rouxel κ.ά., 1989), όζοντος (110-Booker κ.ά., 2004) και υψηλής θερμοκρασίας (Chang και Gallie, 1997), αύξηση της δραστικότητας των DNασών και RNασών στο Glycine max σε αυξημένες συγκεντρώσεις Cd (Lee κ.ά., 1976) και διαφορετική απόκριση των νουκλεασών στην οικογένεια Leguminosae κάτω από μη ιοντική-ωσμωτική και ιοντική καταπόνηση (Yupsanis κ.ά., 2001). Οι Abel κ.ά. (2000) και Pérez-Amador κ.ά. (2000) αναφέρουν πως κατά την αποικοδομητική διαδικασία των κυττάρων, οι RNάσες καθώς και άλλες νουκλεάσες δρουν συνεργιστικά με τις φωσφατάσες, κυρίως για την απελευθέρωση φωσφόρου (Pi) από το RNA. 23

15 Επιπλέον, οι MacIntosh κ.ά., (2001) αναφέρουν πως σε συνθήκες ωσμωτικής καταπόνησης, στο Saccharomyces cerevisiae οι εξωκυτταρικές RNάσες παίζουν ρόλο στη ρύθμιση της διαπερατότητας της μεμβράνης, αποικοδομώντας τα δεσμευμένα στη μεμβράνη RNAs που επηρεάζουν τη διαπερατότητα των ιόντων, επιτρέποντας έτσι τη διατήρηση της κυτταρικής ομοιόστασης. Η διαδικασία της ανάκαμψης των φυτών μετά από υδατική καταπόνηση είναι ένα θέμα με μεγάλο ενδιαφέρον. Αρκετοί ερευνητές υποστηρίζουν πως η πιο κρίσιμη περίοδος όσον αφορά στην οξειδωτική καταπόνηση, που συμβαίνει σε συνθήκες έλλειψης νερού, εντοπίζεται κατά την έναρξη της ανάνηψης των φυτών (Veljovic-Jovanovic, 2006; Sgherri κ.ά., 1994a, 1994b). Στις εργασίες τους μελετούν φυτά που ανήκουν στα αναβιώνοντα φυτά (resurrection plants) και που διαθέτουν τη μοναδική ικανότητα να επιβιώνουν διατηρώντας τις μεταβολικές τους λειτουργίες ακόμη και σε σχεδόν αφυδατωμένη κατάσταση και να ανακάμπτουν εύκολα και γρήγορα μετά από ενυδάτωση. Ποσοστό λιγότερο από 1% των ανθοφόρων φυτών ανήκει στην ομάδα αυτή (Porembski και Barthlott, 2001). Ο Oliver (1991) προσδιόρισε μία τάξη πρωτεϊνών ενυδάτωσης που ενεργοποιούνται στη φάση της ανάνηψης και δύνανται να εμπλέκονται στην παραγωγή αντιοξειδωτικών ουσιών. Ο ρυθμός επαναφοράς των φυσιολογικών λειτουργιών σε κανονικά επίπεδα μετά από ανάνηψη πιθανώς εκφράζει την αντοχή των φυτών στην καταπόνηση. 24