ΕΘΝΙΚΟ ΜΕΤΣΟΒΙΟ ΠΟΛΥΤΕΧΝΕΙΟ ΣΧΟΛΗ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΩΝ ΜΑΘΗΜΑΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΜΕΤΣΟΒΙΟ ΠΟΛΥΤΕΧΝΕΙΟ ΣΧΟΛΗ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΩΝ ΜΑΘΗΜΑΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΟΜΕΑΣ ΦΥΣΙΚΗΣ In vitro συγκριτική μελέτη κιναζολινικών παραγώγων με απώτερο στόχο την χρήση τους στην Ραδιοφαρμακευτική για απεικόνιση όγκων που υπερεκφράζουν τον Yποδοχέα του Eπιδερμικού Aυξητικού Παράγοντα (EGFR) ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Bασιλείου Μαρία-Αικατερίνη Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή Ε.Μ. ΠΟΛΥΤΕΧΝΕΙΟΥ Υπεύθυνος: Καθ. Θεόδωρος Αλεξόπουλος Καθ. Μιχαήλ Κόκκορης Καθ. Γεώργιος Τσιπολίτης Επιβλέπουσα: Μαρία Παραβατού Ερευνήτρια Β ΕΚΕΦΕ «Δ» ΑΘΗΝΑ 2013

2 1 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ... 5 ΡΑΔΙΟΦΑΡΜΑΚΑ Ραδιοφάρμακα Ραδιοϊσότοπα για ραδιοφάρμακα: ιστορία Γενικά περί ραδιοφαρμάκων Ραδιοφάρμακα για διάγνωση Ανιχνευτικές διατάξεις Ραδιοφάρμακα για θεραπεία Ραδιοφάρμακα 99m Tc Έλεγχος ποιότητας ραδιοφαρμάκων Ραδιοφάρμακα προϊόντα σχεδιασμού MΟΡΙΑΚΗ ΣΤΟΧΕΥΣΗ ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΟΥ ΕΠΙΔΕΡΜΙΚΟΥ ΑΥΞΗΤΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ (EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR, EGFR) EGFR Γιατί ο EGFR είναι καλό «μόριο στόχος» για την ραδιοφαρμακευτική Μόρια στόχευσης του EGFR Κιναζολίνες ΙΟΝΤΙΖΟΥΣΑ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑ Ορισμός και πηγές ιοντιζουσών ακτινοβολιών Διεισδυτική ικανότητα των ιοντιζουσών ακτινοβολιών Στάδια αλληλεπίδρασης ακτινοβολίας βιολογικής ύλης... 27

3 Δράση των ιοντιζουσών ακτινοβολιών στα βιολογικά μόρια Ακτινοθεραπεία και ο σκοπός της ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Κιναζολινικά παράγωγα Ακτινοβόληση Δειγμάτων Κυτταρικές καλλιέργειες Δοκιμασία τοξικότητας (Μέθοδος ΜΤΤ) Καμπύλες Κυτταρικής Επιβίωσης (Clonogenic Assay) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ... 61

4 3 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Θεωρητικό μέρος. Ως ραδιοφάρμακο ορίζουμε κάθε φάρμακο το οποίο είναι επισημασμένο με ένα ή περισσότερα ραδιονουκλίδια (ραδιενεργά ισότοπα) και είναι έτοιμο προς χρήση για ιατρικούς σκοπούς. Τα ραδιοφάρμακα χρησιμοποιούνται κυρίως, στη διάγνωση διαφόρων ασθενειών και, σε μικρότερο ποσοστό, ως μέσα θεραπείας. Η χρήση τους εξαρτάται από τα ραδιοϊσότοπα με τα οποία είναι επισημασμένα. Χορηγούμενα στον οργανισμό, παρουσιάζουν εκλεκτική εντόπιση σε ένα όργανο ή ιστό του σώματος η οποία οφείλεται είτε στις βιολογικές ιδιότητες του ραδιοφαρμάκου είτε στην κατάλληλη φαρμακοτεχνική μορφή του φαρμάκου. Καθώς καθηλώνεται για μικρό ή μεγάλο χρονικό διάστημα στα διάφορα όργανα ή ιστούς μεταφέρει δόση ακτινοβολίας στο όργανο-στόχο. Η ακτινοβολία αυτή είτε δρα θεραπευτικά είτε ανιχνεύεται εξωτερικά με κατάλληλη ανιχνευτική διάταξη (σπινθηρογράφος ή γ-camera) και χρησιμεύει για τη μελέτη της μορφολογίας, της λειτουργικότητας του οργάνου, ή τον εντοπισμό τυχούσας βλάβης. Τα ραδιοφάρμακα της τελευταίας γενιάς είναι προϊόντα σχεδιασμού. Οι κιναζολίνες είναι μόρια που χρησιμοποιούνται ως χημειοθεραπευτικά φάρμακα σε ασθενείς που υπερεκφράζουν στους όγκους τους τον Υποδοχέα του Επιδερμικού Αυξητικού Παράγοντα (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR). Ο EGFR είναι μόριο που χρησιμοποιείται ευρέως στη στοχευμένη αντικαρκινική θεραπεία, καθώς υπερεκφράζεται σε πολλούς τύπους καρκίνου και τα σηματοδοτικά μονοπάτια που συνδέονται με αυτόν σχετίζονται άμεσα με μηχανισμούς κεντρικούς στη διαδικασία της καρκινογένεσης, όπως ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, ο κυτταρικός κύκλος, η επιδιόρθωση του DNA, η απόπτωση, η μετάσταση κλπ. Ασθενείς που υπερεκφράζουν τον υποδοχέα παρουσιάζουν αντίσταση σε πολλές μορφές θεραπείας. Όταν η θεραπεία τους υπόκειται σε χημειοθεραπευτικά πρωτόκολλα με κιναζολινικά παράγωγα, έχει παρατηρηθεί κλινικά και εργαστηριακά ότι ανταποκρίνονται καλύτερα στην ακτινοθεραπεία. Πειραματικό μέρος. Στην παρούσα διπλωματική μελετήθηκαν 3 κιναζολινικά παράγωγα ως προς την κυτταροτοξικότητά τους και στην δράση τους στην κυτταρική επιβίωση με απώτερο στόχο τη χρήση τους ως βάσεις συνθέσεων νέων ραδιοφαρμάκων 99m Tc για την απεικόνιση όγκων που υπερεκφράζουν τον EGFR. Στην μελέτη αυτή συνδυάστηκε και η δράση της ιοντίζουσας ακτινοβολίας καθώς, όπως προαναφέρθηκε, στην κλινική πρακτική οι δύο θεραπείες συνδυάζονται. Από τα τρία παράγωγα που μελετήθηκαν, αυτό που δεσμεύεται μη αντιστρεπτά με τον υποδοχέα δίνει τα καλύτερα αποτελέσματα στις συγκεκριμένες δοκιμασίες.

5 4 ABSTRACT Theoretical part: Radiopharmaceuticals are defined as every radioactively labeled compound, which have one or numerous radionuclides (radioactive isotopes), and are ready to be used for medical purposes. Radiopharmaceuticals are mostly used in the diagnosis of several illnesses and, to a lesser extent, as remedies. Their use depends on the radionuclides with which they have been labeled. When administered, they exhibit an eclectic tracking of an organ or body tissue which is caused by either the biological qualities of the drug or its appropriate structure. As the drug remains for etheir a short or long period of time on the organ or tissue, it emits a radiation dose to the target organ. That radiation works either therapeutically or is externally detected with the appropriate scanning device (γ-camera/scintillator) and is used for examining the morphology of the organ or detecting possible damage. New generation radiopharmaceuticals are design products. Quinasolines are molecules used as chemotherapeutic drugs on patients whose tumors overexpress the Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR). The EGFR is a vastly used molecule in targeted cancer treatment, since its over-expression is common in a number of cancer types and the signaling pathways connected to it are directly connected to central mechanisms of carcinogenesis, such as cell proliferation, cell cycle, DNA repairing, apoptosis, metastasis etc... Patients who over-express EGFR are resistant to several forms of treatment. However, when their treatment consists on chemotherapeutic protocols using quinasolinic compounds, it has been clinically and experimentally observed that they respond better to radiotherapy. Experimental part: Having as an ultimate goal their use as the fundamentals for synthesizing new radiopharmaceuticals 99mTc for tumor imaging of tumors that over-express EGFR, three quinasolinic compounds have been studied, regarding their cytotoxicity and their effect in cell survival. In this study has also been included the effect of ionizing radiation since, as mentioned earlier, the two treatments are combined in clinical practices. Out of the three compounds studied, the best results come from the one which binds irreversibly to the EGFR.

6 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 5

7 6 ΡΑΔΙΟΦΑΡΜΑΚΑ Ραδιοφάρμακα Τα ραδιοφάρμακα αποτελούν ανόργανες ή οργανικές φαρμακευτικές ενώσεις ραδιονουκλιδίων (ιχνηθέτες) οι οποίες χρησιμοποιούνται για διαγνωστικούς και για θεραπευτικούς σκοπούς. Ο όρος ραδιονουκλίδιο αναφέρεται στους ραδιενεργούς πυρήνες. O ιστορικός όρος ιχνηθέτης αναφέρεται στην δυνατότητα εντοπισμού, παρακολούθησης ή και μελέτης μιας διεργασίας που διενεργείται στον οργανισμό του ασθενή που χορηγείται το ραδιοφάρμακο. [1, 2] Η χρήση των ραδιοφαρμάκων για την απεικόνιση οργανικών λειτουργιών και ασθενειών είναι μια μοναδική ικανότητα της πυρηνικής ιατρικής. Σε αντίθεση με άλλες μορφές απεικόνισης, όπως η Αξονική Τομογραφία (CT), η Μαγνητική Τομογραφία (MRI) και το υπερηχογράφημα (US), οι διαδικασίες πυρηνικής ιατρικής είναι ικανές να αποτυπώνουν τη φυσιολογική λειτουργία και τη μεταβολική δραστηριότητα δίνοντας έτσι πιο συγκεκριμένες πληροφορίες σχετικά με την οργανική λειτουργία και δυσλειτουργία. Η διαδεδομένη χρήση και η αυξανόμενη ζήτηση για αυτές τις τεχνικές συνδέονται άμεσα με την ανάπτυξη και τη διαθεσιμότητα ενός ευρύ φάσματος ειδικών ραδιοφαρμάκων. Ραδιοϊσότοπα για ραδιοφάρμακα: ιστορία Μολονότι αμέσως μετά την ανακάλυψη της ραδιενέργειας, οι ραδιοϊχνηθέτες δοκιμάστηκαν στη θεραπευτική ιατρική, οι πρώτες σημαντικές εφαρμογές ήρθαν πολύ αργότερα με τη διαθεσιμότητα των κυκλοτρονίων. Οι εφαρμογές αυξήθηκαν μετέπειτα με τους πυρηνικούς αντιδραστήρες οι οποίοι πρόσφεραν την ικανότητα παραγωγής ακόμα μεγαλύτερων ποσοτήτων ραδιοϊσοτόπων. Το Ραδιοϊώδιο ( 131 I), για παράδειγμα, εισήχθη για πρώτη φορά το 1946 για τη θεραπεία του καρκίνου του θυρεοειδούς, και παραμένει μεχρι σήμερα η πιο αποτελεσματική μέθοδος για τη θεραπεία του υπερθυρεοειδισμού και του καρκίνου του θυρεοειδούς. [3] Έχει γίνει φανερό οτι ένας από τους κύριους στόχους για τη δημιουργία ερευνητικών πυρηνικών αντιδραστήρων ήταν η παρασκευή ραδιοϊσοτόπων καθώς οι ιατρικές εφαρμογές θεωρήθηκαν υψηλότερης προτεραιότητας. Ο πιο κοινός χρησιμοποιούμενος αντιδραστήρας που παράγει ισότοπα σε ιατρικές εφαρμογές είναι εκείνος που παράγει το 99 Mo (για την παραγωγή 99m Tc), 131 I, 32 P, 51 Cr, 89 Sr, 153 Sm, 186 Re και 177 Lu. [3]

8 7 Η έγκαιρη χρήση του κυκλοτρονίου στο τομέα των ραδιοφαρμάκων έδωσε την δυνατότητα για παραγωγή ραδιοϊσοτόπων μεγάλης διάρκειας ζωής που μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την παρασκευή ιχνηθετών για διαγνωστική απεικόνιση. Για το σκοπό αυτό, μεσαίας έως υψηλής ενέργειας (20-70 MeV) κυκλοτρόνια με υψηλή ένταση ρεύματος δέσμης ήταν απαραίτητα. Ισότοπα όπως 201 Tl, 123 I και 111 In παρασκευάστηκαν για τη χρήση σε υπολογιστική τομογραφία εκπομπής ενός φωτονίου (SPECT). Με την έλευση της τομογραφίας εκπομπής ποζιτρονίων (PET), έχει υπάρξει μια αύξηση στην παραγωγή κυκλοτρονίων χαμηλών ενεργειών (9-19 MeV) αποκλειστικά για την παραγωγή βραχύβιων ραδιονουκλιδίων PET όπως 18 F, 11 C, 13 N και 15 O. Η πλειοψηφία των κυκλοτρονίων (~ 350) παγκοσμίως χρησιμοποιείται σήμερα για την παρασκευή του 18 F για την παρασκευή ραδιοεπισημασμένης γλυκόζης για ιατρική απεικόνιση. [3, 4] Γενικά περί ραδιοφαρμάκων Οι ραδιοφαρμακευτικές ενώσεις χορηγούμενες στον οργανισμό εντοπίζονται εκλεκτικά σε ένα όργανο ή ιστό του σώματος. Η εκλεκτική εντόπιση οφείλεται στη συμμετοχή σε βιολογικούς μηχανισμούς και είναι αποτέλεσμα του κατάλληλου σχεδιασμού της δομής του μορίου. Ο σχεδιασμός αυτός πραγματοποιείται μετά την βιολογική ανάλυση της λειτουργίας του οργάνου ή του ιστού στόχου έτσι ώστε να είναι γνωστές οι ουσίες που συμμετέχουν στις λειτουργίες αυτές. Έτσι, ραδιονουκλίδια που είναι εκπομποί ποζιτρονίων όπως 11 C, 15 O, 13 N μπορούν να ενσωματωθούν σε πολλές ενώσεις που αποτελούν μέρος φυσιολογικών διεργασιών π.χ. αέριο οξυγόνο (O), διοξείδιο (CO 2 ) και μονοξείδιο του άνθρακα (CO). Αυτά είτε ως αέρια είτε συνδεδεμένα με την αιμοσφαιρίνη μπορούν να λειτουργήσουν ως δείκτες της αιματικής ροής, του όγκου του αίματος και της χρησιμοποιήσεως του οξυγόνου. [1, 2, 5] Η κατάλληλη φαρμακοτεχνική μορφή π.χ. η διαμόρφωση σε κολλοειδή ή συσσωματώματα, μπορεί επίσης να κατευθύνει ένα ραδιοφάρμακο στο όργανο στόχο. Ανάλογα με τις φυσικοχημικές ή βιολογικές ιδιότητες του σκευάσματος, αυτό καθηλώνεται για μικρό ή μεγάλο χρονικό διάστημα στα διάφορα όργανα ή τους ιστούς μεταφέροντας μια δόση ακτινοβολίας στο όργανο στόχο. Η ακτινοβολία αυτή είτε δρα θεραπευτικά είτε ανιχνεύεται εξωτερικά με την κατάλληλη ανιχνευτική διάταξη (σπινθηρογράφος ή γ-camera) οπότε χρησιμεύει για την μελέτη της μορφολογίας, της λειτουργικότητας του οργάνου ή τον εντοπισμό τυχούσας βλάβης. [6] Τα ραδιοφάρμακα συνήθως χορηγούνται σε μικρές ποσότητες, εκπέμπουν ένα είδος ακτινοβολιών και δεν προκαλούν αντιδράσεις υπερευαισθησίας όπως τα ακτινολογικά σκιαστικά. Το ραδιονουκλίδιο του ραδιοφαρμάκου είναι απαλλαγμένο από άλλους σταθερούς ή

9 8 ραδιενεργούς πυρήνες του ίδιου στοιχείου καθώς η παρουσία αυτών των προσμίξεων μπορεί να επηρεάσει την αποτελεσματικότητα του ραδιοφαρμάκου. Τα ραδιοφάρμακα έχουν ορισμένες βασικές ιδιότητες : (1) Ο μεταβολισμός τους είναι παρόμοιος με τον μεταβολισμό φυσιολογικών ουσιών, (2) Συγκεντρώνονται εκλεκτικά σε κάποιο όργανο ή σύστημα, (3) Η παρασκευή τους γίνεται υπό στείρες συνθήκες, (4) Η ραδιοϊσοτοπική, ραδιοχημική και ραδιοβιολογική καθαρότητα έχει ελεγχθεί. Αν τα ραδιοφάρμακα πληρούν όντως τις παραπάνω ιδιότητες, η χρήση τους είναι ασφαλής και επιτυγχάνεται το καλύτερο δυνατό αποτέλεσμα από τις διαγνωστικές εφαρμογές. Σήμερα υπάρχουν πάνω από 100 ραδιοφάρμακα που αναπτύχθηκαν είτε σε αντιδραστήρα ή είτε σε κυκλοτρόνιο παράγοντας ραδιοϊσότοπα τα οποία χρησιμοποιούνται για τη διάγνωση πολλών κοινών ασθενειών και τη θεραπεία μερικών επιλεγμένων ασθενειών, συμπεριλαμβάνοντας και το καρκίνο. Η παραγωγή ραδιοφαρμάκων περιλαμβάνει το χειρισμό μεγάλων ποσοτήτων ραδιενεργών ουσιών καθώς και χημική επεξεργασία αυτών. Οι πτυχές που πρέπει να αντιμετωπιστούν στη παραγωγή ραδιοφαρμάκων (συμπεριλαμβάνοντας και τη διαχείριση της παραγωγής ραδιοϊσοτόπων) περιλαμβάνουν την εισαγωγή, τη λειτουργία και τη συντήρηση των εγκαταστάσεων επεξεργασίας σύμφωνα με τους κώδικες των ορθών παρασκευαστικών πρακτικών (cgmp), την εξασφάλιση των αποτελεσματικών συστημάτων ελέγχου ποιότητας (QC), την εγγραφή των προϊόντων στις εθνικές / περιφερειακές αρχές σχετικά με την υγεία και τη μεταφορά ραδιενεργού υλικού κ.ά. [3] Η παραγωγή ραδιοφαρμάκων, σε αντίθεση με τη συμβατική παραγωγή φαρμακευτικών προϊόντων, εξακολουθεί να είναι σε σχετικά μικρή κλίμακα καθώς η εφαρμογή των cgmp πρακτικών είναι δύσκολη και δαπανηρή. Η εξασφάλιση της τήρησης των cgmp πρακτικών είναι ένα δύσκολο έργο για έναν κατασκευαστή μικρής κλίμακας, δεδομένου ότι περιλαμβάνει τη φροντίδα διαφόρων θεμάτων πρίν, κατά και μετά την παραγωγή. Αυτοί οι cgmp κώδικες περιλαμβάνουν την ύπαρξη εξειδικευμένου προσωπικού, τη χρήση ελεγχόμενων υλικών και διαδικασιών, τη διαθεσιμότητα εξειδικευμένου εξοπλισμού, τη παραγωγή των προϊόντων σε καθορισμένες καθαρές περιοχές, την εφαρμογή τεκμηριωμένων διαδικασιών και αναλυτικών μεθόδων, την πλήρη γραπτή τεκμηρίωση της διαδικασίας και την απελευθέρωση του τελικού προϊόντος από ένα ειδικευμένο πρόσωπο. [3]

10 9 Την τελευταία δεκαετία έχει παρατηρηθεί μια αύξηση της χρήσης του ΡΕΤ στη τακτική διαγνωστική απεικόνιση, και ανάλογη χρήση των ΡΕΤ ραδιοφαρμάκων, ιδιαίτερα του 18 F, με τη μορφή της φθοριοδεοξυγλυκόζης ( 18 F-FDG). Η ακτινοβολία υψηλής ενέργειας 511 kev του 18 F απαιτεί παχύτερη θωράκιση και πιο εξελιγμένες συσκευές χειρισμού. Λόγω της μικρής ημιζωής (Τ 1/2 = min), η έμφαση επικεντρώνεται στην αυστηρή τήρηση εγκεκριμένων διαδικασιών κατά τη διάρκεια όλων των σταδίων της παραγωγής, αντί να υπάρχει στήριξη μόνο στα τελικά αποτελέσματα των δοκιμών QC. Η ανάγκη για γρήγορη, απομονωμένη και αξιόπιστη σύνθεση ραδιοφαρμάκων ΡΕΤ με 18 F έχει οδηγήσει στην εισαγωγή μονάδας αυτοματοποιημένης σύνθεσης. Αυτή η εμπειρία έχει επίσης οδηγήσει στην ανάπτυξη παρόμοιων συστημάτων αυτοματοποιημένης σύνθεσης και για άλλα ραδιοφάρμακα. [3, 7, 8] Τα ραδιοφάρμακα κατατάσσονται σε τέσσερις κυρίως κατηγορίες: Ραδιοφάρμακα έτοιμα για χρήση. Αυτά φέρουν στο μόριό τους κατά κανόνα μακρόβιο ραδιοϊσότοπο, το οποίο επιτρέπει τη διάθεσή τους από την παραγωγή στο νοσηλευτικό ίδρυμα με τη μορφή διαλυμάτων, έτοιμων για χρήση. Ο όγκος του ραδιοφαρμάκου που πρόκειται να χορηγηθεί στον ασθενή υπολογίζεται αφού ληφθεί υπόψιν η ραδιενεργός συγκέντρωση και ο χρόνος υποδιπλασιασμού του ραδιοϊσοτόπου. Ραδιοφάρμακα διατιθέμενα σε τυποποιημένη συσκευασία ( kit ). Στην περίπτωση αυτή διατίθεται από το πυρηνικό κέντρο ή την παραγωγό εταιρεία μία μή ραδιενεργός, τυποποιημένη συσκευασία (kit). Η συσκευασία αυτή περιέχει τα δραστικά συστατικά του ραδιοφαρμάκου σε λυοφιλοποιημένη μορφή και η τελική διαμόρφωση σε ραδιοφάρμακο γίνεται στο νοσηλευτικό ίδρυμα με την προσθήκη κατάλληλου ραδιοϊσοτόπου. Για την παρασκευή και την εμπορική διάθεση των ραδιοϊσοτόπων για κλινική εφαρμογή, ιδιαίτερα δε των βραχυβίων, έχουν σε πολλές περιπτώσεις αναπτυχθεί ειδικά συστήματα παραγωγής, το κυριότερο των οποίων είναι οι γεννήτριες. Το πιο αντιπροσωπευτικό παράδειγμα είναι η γεννήτρια 99m Tc. Ραδιοφάρμακα παρασκευαζόμενα λίγο προ της χορηγήσεως. Στην περίπτωση αυτή το χρησιμοποιούμενο ραδιοϊσότοπο έχει τόσο μικρό χρόνο υποδιπλασιασμού ώστε, επιβάλλεται η χορήγησή του αμέσως μετά την παρασκευή του. Τέτοια είναι διάφορα ραδιενεργά αέρια ή διαλύματα αυτών παραγόμενα στο κυκλοτρόνιο ή λαμβανόμενα από γεννήτριες υπερβραχυβίων ραδιοϊσοτόπων. Ραδιοφάρμακα βασιζόμενα σε δείγμα που λαμβάνεται από τον ασθενή. Στην περίπτωση αυτή κύτταρα ή πρωτεΐνες του πλάσματος λαμβάνονται από τον ασθενή

11 10 και αφού επισημανθούν με ένα ραδιονουκλίδιο επαναχορηγούνται στον ίδιο τον ασθενή. Τα ραδιοφάρμακα των διαφόρων αυτών κατηγοριών απαιτούν διάφορα επίπεδα και απαιτήσεις οργάνωσης προσωπικού και εγκαταστάσεων για την παρασκευή τους. Η πολυπλοκότητα στους χειρισμούς που πρέπει να γίνουν στο νοσηλευτικό ίδρυμα, αυξάνει από την πρώτη κατηγορία προς την τέταρτη. Η καλή ποιότητα των ραδιοφαρμάκων και η χορήγηση της κατάλληλης δόσης εξασφαλίζουν την ασφάλεια του ασθενούς, την αξιοπιστία της διαγνωστικής εξέτασης ή το καλύτερο δυνατό αποτέλεσμα της θεραπευτικής χορήγησης. Βασική επιδίωξη αποτελεί το βέλτιστο αποτέλεσμα με την ελάχιστη επιβάρυνση του ασθενούς σε δόση ακτινοβολίας. [2] Ένα ραδιοφάρμακο μετά την χορηγησή του στον εξεταζόμενο διασπάται ανάλογα με τον φυσικό χρόνο υποδιπλασιασμού (χρόνος ημιζωής) του ραδιονουκλιδίου με το οποίο έχει επισημανθεί. Παράλληλα όμως αποβάλλεται από τον οργανισμό μέσω διαφόρων φυσιολογικών μηχανισμών με ρυθμό ο οποίος καθορίζεται από τον βιολογικό χρόνο υποδιπλασιασμού. Ο βιολογικός χρόνος υποδιπλασιασμού εξαρτάται από τον μεταβολισμό της σταθεράς ουσίας του ραδιοφαρμάκου. Επομένως, η τελική απομάκρυνση του ραδιοφαρμάκου από τον οργανισμό ακολουθεί τον συνδυασμό του φυσικού και του βιολογικού χρόνου υποδιπλασιασμού του, ο οποίος ονομάζεται ενεργός χρόνος υποδιπλασιασμού. Ο ενεργός χρόνος υποδιπλασιασμού δίνεται από τη σχέση: 1 / t eff = 1 / t biol + 1 / t phys όπου t eff είναι ο ενεργός χρόνος ημιζωής, t biol είναι ο βιολογικός χρόνος ημιζωής, t phys είναι ο φυσικός χρόνος ημιζωής. Ο ενεργός χρόνος ημιζωής του ιδανικού ραδιοφαρμάκου πρέπει να έχει διάρκεια περίπου 1.5 φορές τη διάρκεια της εξέτασης ώστε η δόση ακτινοβολίας που λαμβάνει ο ασθενής να είναι η μικρότερη δυνατή, καθώς και η στατιστική ανιχνεύσεων και η ποιότητα της εξαγόμενης εικόνας να είναι ικανοποιητικές. [2]

12 11 Ραδιοφάρμακα για διάγνωση Τα ραδιοφάρμακα για διάγνωση πρέπει να έχουν τις εξής ιδιότητες: Εκπομπή του ραδιοϊσοτόπου μόνο ακτινοβολίας γάμμα Ενέργεια ακτινοβολίας 100 kev με 250 kev Ενεργός χρόνος ημιζωής μικρότερος απο 1.5 φορές τη διάρκεια της εξέτασης Υψηλός λόγος στόχου προς μη στόχο Ελάχιστη δόση στον ασθενή και στο ιατρικό προσωπικό Απόλυτα ασφαλές για τον ασθενή Καλές δυνατότητες επισήμανσης από τον ιχνηθέτη Χαμηλό κόστος και εύκολη διαθεσιμότητα του ραδιοφαρμάκου Απλή προετοιμασία και ποιοτικός έλεγχος του ραδιοφαρμάκου αν παρασκευάζεται σε κλινικά εργαστήρια. Στα ραδιοφάρμακα για διάγνωση γίνεται χρήση ακτινοβολίας μεγάλης διεισδυτικότητας (που δεν απορροφάται από τους ιστούς) και η εξωτερική ανίχνευση αυτής πραγματοποιείται από κατάλληλες ανιχνευτικές διατάξεις (SPECT, PET) Διαγνωστικά ραδιονουκλίδια SPECT PET 99m Tc (T 1/2 = 6h, 140 kev) 68 Ga (T 1/2 = 68.3 min) 123 I (T 1/2 =13.3h, 159 kev) 82 Rb (T 1/2 = 1.2 min) 111 In (T 1/2 =2.8d, 173 kev) 18 F (T 1/2 = min) 201 Tl (T 1/2 = 74h, 68 kev) 11 C (T 1/2 = 20.3 min) 67 Ga (T 1/2 = 78h, 93 kev) 13 N (T 1/2 = 9.9 min) 15 O (T 1/2 = 123 sec) Πίνακας 1-1: Διαγνωστικά ραδιονουκλίδια.

13 12 Ανιχνευτικές διατάξεις Η γ-camera αποτελεί το βασικό διαγνωστικό σύστημα της Πυρηνικής Ιατρικής. Η συγκεκριμένη διάταξη μπορεί να χρησιμοποιηθεί είτε για μελέτη στατικής εικόνας, στην οποία η εικόνα μιας σταθερής κατανομής των ραδιοϊσοτοπών καταγράφεται για ένα παρατεταμένο χρόνο, είτε για την μελέτη δυναμικής εικόνας όπου γίνεται δυνατή η απεικόνιση της μεταβολής της κατανομής του ραδιοφαρμάκου από το εξεταζόμενο όργανο συναρτήσει του χρόνου. Η εικόνα που λαμβάνεται από μια γ-camera αποτελεί μια δισδιάστατη προβολή της τρισδιάστατης κατανομής του ραδιοφαρμάκου, μέσα στο σώμα του ασθενούς. Η απόκτηση της πληροφορίας της τρίτης διάστασης επιτυγχάνεται με την μεθοδολογία της τομογραφίας. Το σύστημα εφαρμογής της ονομάζεται SPECT από τα αρχικά των λέξεων Single Photon Emission Computerised Tomography δηλαδή μονοφωτονιακή τομογραφία εκπομπής. Ένα τέτοιο σύστημα χαρακτηρίζεται από τον συνδυασμό της γ-camera με υπολογιστή. Η διάταξη SPECT αποτελείται από μία ή περισσότερες κεφαλές γ-camera με δυνατότητα αυτόματης και προγραμματιζόμενης περιστροφής της γύρω από τον ασθενή σε επιθυμητή ακτίνα και ταχύτητα περιστροφής. Για την πραγματοποιήση της τομογραφίας πρέπει να ληφθούν εικόνες της κατανομής του ραδιοφαρμάκου υπό διάφορες γωνίες. Έτσι, γίνεται δυνατός ο ακριβής προσδιορισμός της θέσης και της έκτασης της βλάβης του οργάνου. Η τελευταία εξέλιξη αυτών των ανιχνευτικών συστημάτων είναι ένα σύστημα SPECT με δυνατότητα λειτουργίας και ως ποζιτρονιακή τομογραφία εκπομπής (Positron Emission Tomography, PET), γνωστό ως υβριδική κάμερα PET. [1, 9] Εικόνα 1-1: Τομογραφία μονοφωτονικής εκπομπής (SPECT). Η ποζιτρονιακή τομογραφία εκπομπής (Positron Emission Tomography, PET) είναι ταχέως αναπτυσσόμενη τεχνολογία της Πυρηνικής Ιατρικής. Είναι τεχνική λήψεως τομογραφικών εικόνων της κατανομής βραχύβιων ραδιενεργών ιχνηθετών οι οποίοι εκπέμπουν ποζιτρόνια. Οι εικόνες αυτές αντιπροσωπεύουν φυσιολογικές και βιοχημικές διεργασίες στην

14 13 υπό εξέταση περιοχή. Οι ανιχνευτές ποζιτρονίων οι οποίοι ανιχνεύουν το ζεύγος των ακτίνων γ που προκύπτει από την εξαύλωση ποζιτρονίου-ηλεκτρονίου, είναι τοποθετημένοι ο ένας απέναντι από τον άλλον σε αντίθετα σημεία ως προς την πηγή ποζιτρονίων. Όταν και οι δύο ανιχνευτές ανιχνεύσουν ένα φωτόνιο την ίδια ακριβώς στιγμή, καταγράφουν μια μέτρηση. Ένα σύστημα PET αποτελείται από πολλούς ανιχνευτές τοποθετημένους σε κυκλική ή πολυγωνική διάταξη γύρω από τον ασθενή στον οποίο έχει χορηγηθεί ένα ραδιονουκλίδιο που εκπέμπει ποζιτρόνια. Ηλεκτρονικά κυκλώματα και υπολογιστές ζευγνύουν τους ανιχνευτές ώστε να λειτουργούν σε σύμπτωση. Ωστόσο, μετά το 2000 έχουν κατασκευασθεί και ήδη χρησιμοποιούνται συστήματα PET στα οποία υπάρχει ενσωματωμένος και αξονικός τομογράφος (CT) με χαμηλής ενέργειας ακτίνες Χ. Τα συστήματα αυτά αναφέρονται ως συστήματα PET/CT. Προσεχώς, θα είναι διαθέσιμα και τα συστήματα PET-MRI. [1, 7] Εικόνα 1-2: Τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίου (PET). Ραδιοφάρμακα για θεραπεία Τα ραδιοφάρμακα για θεραπευτική χρήση πρέπει να πληρούν τις εξής ιδιότητες: Διάσπαση ραδιονουκλιδίου είτε με εκπομπή σωματιδίων β - είτε με εκπομπή σωματιδίωνα είτε με εκπομπή ηλεκτρονίων Auger είτε με ηλεκτρόνια εσωτερικής μετατροπής. [10] Μέση/υψηλή ενέργεια ακτινοβολίας (πάνω από 1 Mev) Μεγάλος ενεργός χρόνος ημιζωής (π.χ. μερικές ημέρες) Υψηλός λόγος στόχου προς μη στόχο Ελάχιστη δόση στον ασθενή και στο ιατρικό προσωπικό Απόλυτα ασφαλές για τον ασθενή Καλές δυνατότητες επισήμανσης από τον ιχνηθέτη Χαμηλό κόστος και εύκολη διαθεσιμότητα του ραδιοφαρμάκου

15 14 Απλή προετοιμασία και ποιοτικός έλεγχος του ραδιοφαρμάκου αν παρασκευάζεται σε κλινικά εργαστήρια. Η θεραπεία που χρησιμοποιεί ραδιοφάρμακα επισημασμένα με ραδιονουκλίδια που εκπέμπουν ακτινοβολία-β, αναδεικνύεται ως ένα σημαντικό μέρος της πυρηνικής ιατρικής. Εκτός από την διαχείριση του καρκίνου του θυρεοειδούς, η θεραπεία με ραδιονουκλίδια χρησιμοποιείται για την ανακούφιση του πόνου των οστών, παρέχοντας σημαντική βελτίωση στην ποιότητα ζωής των καρκινοπαθών ασθενών που υποφέρουν από πόνους που σχετίζονται με μετάσταση στα οστά, καθώς και για τη θεραπεία του πόνου στις αρθρώσεις, όπως στη ρευματοειδή αρθρίτιδα. [3, 7, 8] Άτομα που υποφέρουν από καρκίνο του μαστού, του πνεύμονα και του προστάτη αναπτύσσουν μετάσταση στα οστά σε προχωρημένο στάδιο των παθήσεων τους και θεραπευτικά ραδιοφάρμακα που περιέχουν ραδιονουκλίδια, όπως το 89 Sr, 153 Sm, 186 Re και 188 Re χρησιμοποιούνται για την αποτελεσματική ανακούφιση του πόνου από σκελετικές μεταστάσεις. Η ΙΑΕΑ έχει ξεκινήσει ένα πρόγραμμα για την ανάπτυξη και τη κλινική εφαρμογή του 177 Lu ως βάση σε ραδιοφάρμακα για την ανακούφιση του πόνου των οστών. Το 177 Lu μπορεί να παρασκευαστεί σε μεγάλες ποσότητες σε ερευνητικούς αντιδραστήρες χαμηλής / μεσαίας ροής, οι οποίοι είναι διαθέσιμοι σε πολλές χώρες. Ο μεγάλος χρόνος ημίσειας ζωής του παρέχει πλεονεκτήματα υλικοτεχνικής υποστήριξης για την παραγωγή και τη δοκιμή των προϊόντων, καθώς και τη δυνατότητα προσφοράς των προϊόντων σε τόπους μακριά από τον τόπο παραγωγής. [3] Ραδιονουκλίδια Τ 1/2 Θεραπεία Ενεργότητα mci (MBq) 131 I 8 days Θυροειδής ( ) 89 Sr 51 days Παρηγορητική θεραπεία 4 (148) οστικών μεταστάσεων 153 Sm 47 h Παρηγορητική θεραπεία 70 (2590) οστικών μεταστάσεων 186 Re 90h Παρηγορητική θεραπεία 35 (1295) οστικών μεταστάσεων 90 Y 64h Non Hodgkins λέμφωμα 35 (1295) Πίνακας 1-2: Ραδιονουκλίδια για θεραπευτική χρήση. Οι πρόοδοι στην ογκολογία, στη τεχνολογία ανασυνδυασμένου αντισώματος, στη πεπτιδική σύνθεση στερεάς φάσης και στη χημεία ραδιοφαρμάκων οδήγησαν την έρευνα σε διάφορα νέα

16 15 ράδιο-θεραπευτικά μέσα. Για παράδειγμα, ραδιοεπισημασμένα πεπτίδια, ανάλογα αυξητικών παραγόντων, αναπτύσσονται ως μοριακοί φορείς για στοχευμένη θεραπεία πρωτογενούς καρκίνου. Όταν τα πεπτιδικά μόρια επισημανθούν με θεραπευτικά ραδιονουκλίδια, αυτά έχουν τη δυνατότητα να καταστρέφουν καρκινικά κύτταρα που υπερεκφράζουν τον υποδοχέα. [3] Ραδιοφάρμακα 99m Tc Το 99m Tc είναι το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο ραδιοϊσότοπο στη διαγνωστική πυρηνική ιατρική καθώς έχει την ιδιότητα να ιχνηθετεί μια πολύ μεγάλη ποικιλία ενώσεων κάτω απο φυσιολογικές συνθήκες. Υπολογίζεται ότι πάνω από το 80% των σχεδόν 25 εκατομμυρίων διαγνωστικών μελετών πυρηνικής ιατρικής που πραγματοποιούνται σε ετήσια βάση γίνονται με αυτό το ισότοπο. Το ποσοστό αυτό αναμένεται να παραμείνει σταθερό στο εγγύς μέλλον, παρά την εισαγωγή νέων διαγνωστικών ραδιοφαρμάκων με άλλα ραδιονουκλίδια.[3] Η διαθεσιμότητα του βραχύβιου 99m Tc (με χρόνο ημιζωής 6 ώρες), ως το θυγατρικό προϊόν του 99 Μο (με σχετικά μεγάλο χρόνο ημιζωής 66 ώρες) είναι ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες που προωθεί την καθολική χρήση αυτού του ραδιοϊσοτόπου. Ο μικρός χρόνος υποδιπλασιασμού του 99m Tc και η έλλειψη ακτινοβολίας-β επιτρέπει την χορήγηση σημαντικής ποσότητας χωρίς την σημαντική επιβάρυνση του ασθενούς. Σε αυτό συμβάλλει και η μετάπτωση του 99m Tc στο ψευδοσταθερό ισότοπο 99 Tc. Έτσι, η προκύπτουσα ακτινοβολία-γ των 140 KeV διαπερνά άνετα τους ιστούς του σώματος και εστιάζεται εύκολα σε ανιχνευτικές διατάξεις. Οι υψηλοί ρυθμοί κρούσεων παρέχουν τη δυνατότητα εκτελέσεων μετρήσεων με μεγάλη ακρίβεια. Μεγάλα πλεονεκτήματα αποτελούν το χαμηλό σχετικά κόστος καθώς και η ικανότητα διαθεσής του σε μεγάλες αποστάσεις απο τον τόπο παραγωγής με τις γεννήτριες 99 Μο- 99m Tc. Σημαντικό ρόλο παίζει το γεγονός ότι το πατρικό ραδιονουκλίδιο 99 Μο μπορεί να παρασκευαστεί σε άφθονες ποσότητες από τη σχάση του 235 U σε έναν πυρηνικό αντιδραστήρα με απόδοση σχάσης περίπου 6%. Πάνω από το 95% του 99 Μο σήμερα παράγεται με τη χρήση στόχων εμπλουτισμένου ουρανίου. [2, 3]

17 16 Σχήμα 1-1: Διάγραμμα αποδιέγερσης του 99 Μο. Τα πρώτα ραδιοφάρμακα 99m Tc αναπτύχθηκαν εκμεταλλεύοντας τις φυσιολογικές ιδιότητες όπως είναι η προσρόφηση, η διανομή, ο μεταβολισμός και η απέκκριση των διαφόρων σύμπλοκων 99m Tc, και χρησιμοποιήθηκαν για την απεικόνιση του θυρεοειδή, του ήπατος, των οστών, των νεφρών κ.λ.π. Ο προσεκτικός σχεδιασμός νέων συμπλόκων 99m Tc οδήγησε στην ανακάλυψη παραγόντων για την απεικόνιση της αιματικής ροής (αιμάτωσης) στο μυϊκό ιστό της καρδιάς (μυοκάρδιο) και του εγκεφάλου. Η SPECT απεικόνιση με προϊόντα 99m Tc είναι συχνά ένα σημαντικό στοιχείο της αξιολόγησης των ασθενών με γνωστές ή πιθανολογούμενες ασθένειες της στεφανιαίας αρτηρίας. Το 99m Tc -MDP (methylene diphophonate) είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο ραδιοφάρμακο για την ανίχνευση μεταστάσεων των οστών που σχετίζονται με πολλές μορφές καρκίνου. Eχει επίσης ανακαλυφθεί ότι ορισμένα ραδιοφάρμακα 99 Tc που χρησιμοποιούνται για νεφρικές και καρδιακές μελέτες, συσσωρεύονται σε ορισμένες μορφές καρκίνου πρώτου σταδίου, γεγονός που έχει οδηγήσει στη χρήση του ραδιοφαρμάκου 99m Tc για την απεικόνιση πρωτογενών καρκίνων εκτός του θυρεοειδούς. Η πλειονότητα των σημερινών ερευνών για την ανάπτυξη απεικονιστικών παραγόντων καρκίνου χρησιμοποιεί κυρίως πεπτίδια και αντισώματα ως μόρια μεταφορείς για την στοχεύση περιοχών όγκου. [3, 11] Επί του παρόντος, μια περιοχή υψηλού ενδιαφέροντος είναι τα αναπτυσσόμενα προϊόντα 99m Tc για την απεικόνιση SPECT των υποδοχέων στον εγκέφαλο, γεγονός που θα βοηθήσει στη διαχείριση ασθενών με κινητικές διαταραχές. Προόδοι σε νέες τεχνικές επισήμανσης και

18 17 αναγνώρισης των κατάλληλων μορίων-φορείς έχουν ενισχύσει τις προσπάθειες προς αυτή την κατεύθυνση. [3, 11] Έλεγχος ποιότητας ραδιοφαρμάκων Τρία είναι τα κύρια μέρη του ελέγχου ποιότητας των ραδιοφαρμακευτικών παρασκευασμάτων: Ραδιοϊσοτοπικός Έλεγχος Ραδιοχημικός Έλεγχος Ραδιοβιολογικός Έλεγχoς Ο έλεγχος ποιότητας ενός ραδιοφαρμακευτικού παρασκευάσματος έχει σαν σκοπό να εξακριβώσει, βάση των προδιαγραφών του, την καταλληλότητα των συστατικών για μια συγκεκριμένη χρήση. Συνήθως περιλαμβάνει πλήρεις και αναλυτικές δοκιμασίες του κάθε επιμέρους υλικού που χρησιμοποιείται κατά την παρασκευή του ραδιοφαρμάκου. Βασίζεται επίσης και στον έλεγχο της μεθόδου παρασκευής, με τον συνεχή προσδιορισμό των καθοριστικών παραμέτρων ανεξάρτητα απο το συγκεκριμένο προϊόν. Ραδιοϊσοτοπική καθαρότητα ορίζεται το ποσοστό της συνολικής ραδιενέργειας που αντιστοιχεί στο συγκεκριμένο ραδιοϊσότοπο που εξετάζεται και αναφέρεται στην πιθανή παρουσία πρόσθετων ραδιοϊσοτόπων του ίδιου στοιχείου. Τα πρόσθετα ραδιοϊσότοπα έχουν διαφορετικούς χρόνους ημιζωής από το συγκεκριμένο ραδιοϊσότοπο με συνέπεια η καμπύλη εκπομπής δεν είναι καθαρά εκθετική στο αντίστοιχο φάσμα των σωματιδίων-β ή των ακτίνων-γ που αλλάζει με το χρόνο. Τα πρόσθετα μακρόβια ραδιοϊσότοπα (προσμίξεις) αυξάνουν την απορροφούμενη δόση ακτινοβολίας που λαμβάνει ο ασθενής, που υφίσταται τον διαγνωστικό έλεγχο. [2] Υπάρχουν δύο είδη ραδιοϊσοτοπικής μόλυνσης: Τα συνυπάρχοντα άλλα ραδιοϊσότοπα είναι του ίδιου στοιχείου. Το επιθυμητό ραδιοϊσότοπο μπορεί να συνοδεύεται από ραδιοϊσότοπο ενός άλλου στοιχείου. Οι ραδιοϊσοτοπικές μολύνσεις μπορούν να προκαλέσουν λάθη στη μέτρηση της χορηγούμενης δόσης, σημαντική αύξηση της απορροφούμενης απο το ανθρώπινο σώμα δόσης, διαγνωστικά λάθη και ακαταλληλότητα του ραδιοϊσοτόπου για επισήμανση. Για τους παραπάνω λόγους, η

19 18 ραδιοϊσοτοπική καθαρότητα είναι απολύτως απαραίτητη στις περισσότερες ιατρικές και βιολογικές εφαρμογές. Ραδιοχημική καθαρότητα είναι το ποσοστό της συνολικής ραδιενέργειας που αντιστοιχεί στην καθορισμένη επιθυμητή χημική μορφή του ραδιοφαρμακευτικού παρασκευάσματος και αναφέρεται στο ποσοστό της ολικής ενεργότητας η οποία υπάρχει στο συγκεκριμένο χημικό τύπο ή ένωση. Για παράδειγμα, η παρουσία ενός μικρού ποσοστού οργανικού ιωδίου ( CH 3 I ) σε δείγμα ανόργανου ιωδίου (NaI) το οποίο χρησιμοποιείται για θεραπεία της θυρεοτοξίκωσης, θα μπορούσε να επηρεάσει το ποσό της ενεργότητας που λαμβάνει ο ασθενής. Η ραδιοχημική καθαρότητα κρίνεται απλά επιθυμητή. Ένα ραδιοφαρμακευτικό παρασκευάσμα θεωρείται ραδιοχημικά αποδεκτό όταν η καθαρότητα του είναι πάνω από 95%. Ραδιοβιολογικός έλεγχος. Επειδή σχεδόν όλα τα ραδιοφάρμακα χορηγούνται σε ενέσιμη μορφή ενδοφλεβίως, για την εξασφάλιση της ασφάλειας θα πρέπει τα διαλύματα που χορηγούνται να πληρούν τις παρακάτω προϋποθέσεις: Να είναι αποστειρωμένα και να μην υπάρχουν πυρετογόνες ουσίες. Πυρετογόνα είναι βακτηριδιακές ενδοτοξίνες, προερχόμενες απο τα κυτταρικά τοιχώματα βακτηριδίων κατά Gram, οι οποίες προκαλούν πυρετούς στον άνθρωπο και τα ζώα. Να είναι ισοτονικά και να έχουν φυσιολογικό ph. Η ισοτονικότητα πρέπει να είναι ίση με το 0.9% διαλύματος NaCl και το ph να είναι ίδιο με αυτό του αίματος (ph 7.5). Να έχει γίνει ρύθμιση της δόσης. Δηλαδή η ποσότητα του ραδιοφαρμάκου που δίνεται στον ασθενή να είναι τέτοια ώστε η δόση που θα πάρει να είναι μέσα στο +10% με -10% της προκαθορισμένης διαγνωστικής ή θεραπευτικής δόσης. [2] Ραδιοφάρμακα προϊόντα σχεδιασμού Η νέα γενιά (ραδιο)φαρμάκων είναι προϊόντα σχεδιασμού που προκύπτουν από την ανάγκη ανάπτυξης φαρμάκων με αυξημένη εξειδίκευση, μειωμένη τοξικότητα και μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα από τα συμβατικά αντικαρκινικά (ραδιο)φάρμακα. Στην προσπάθεια αυτή συμβάλλουν και οι ερευνητικές προσπάθειες ανακάλυψης νέων μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στις διάφορες νόσους και στην εξέλιξή τους π.χ. στην καρκινογένεση. Οι έρευνες αυτές έφεραν στο φως πολλά σηματοδοτικά μόρια των οποίων ο ρόλος είναι κεντρικός για παράδειγμα στην διαδικασία της καρκινογένεσης. Πολλά από αυτά τα σηματοδοτικά μόρια έχουν προσδιορισθεί και αναγνωρισθεί σαν «εν δυνάμει μόρια-στόχοι» για θεραπευτικό σκοπό. Παράλληλα έχουν συντεθεί και βρίσκονται σε διάφορα στάδια κλινικής μελέτης πολλά μόρια

20 19 (φάρμακα και ραδιοφάρμακα) διαφορετικών τάξεων και με διαφορετικούς μηχανισμούς δράσης για τον ίδιο σκοπό. Ο σχεδιασμός των νέων ραδιοφαρμάκων είναι αποτέλεσμα της συστηματικής αυτής μελέτης του βιολογικού υποστρώματος με το οποίο πρόκειται να αλληλεπιδράσουν τα φάρμακα, ώστε ο εντοπισμός τους να είναι κατά το δυνατόν περισσότερο εξειδικευμένος. Επίσης για τον σχεδιασμό των ραδιοφαρμάκων, επιλέγονται κατάλληλοι χημικοί υποκαταστάτες στους οποίους θα προσδεθεί το ραδιονουκλίδιο. Τα δύο τμήματα συνδέονται απευθείας ή με τη μεσολάβηση ενδιάμεσης αλυσίδας. Κατά το σχεδιασμό νέων ραδιοφαρμάκων καθώς και κατά τα στάδια της in vitro και in vivo αξιολόγησής, λαμβάνονται υπόψη οι βιολογικές καθώς και οι φυσικοχημικές ιδιότητες των ενώσεων αυτών, όπως δομή, στερεοχημεία, λιποφιλικότητα, φορτίο, κ.λ.π., οι οποίες επηρεάζουν τον εντοπισμό των ενώσεων αυτών σε όργανα ή ιστούς στόχους καθώς και την φαρμακοκινητική τους στον οργανισμό ώστε να επιτυγχάνεται το επιθυμητό διαγνωστικό ή θεραπευτικό αποτέλεσμα. Ένα από τα μόρια που μελετάται ως μόριο στόχος για την ανάπτυξη (ραδιο)φαρμακευτικών αγωγών είναι ο Υποδοχέας του Επιδερμικού Αυξητικού Παράγοντα (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR). Για το μόριο αυτό και το ερευνητικό ενδιαφέρον που παρουσιάζει, θα μιλήσουμε στο επόμενο κεφάλαιο.

21 20 MΟΡΙΑΚΗ ΣΤΟΧΕΥΣΗ ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΟΥ ΕΠΙΔΕΡΜΙΚΟΥ ΑΥΞΗΤΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ (EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR, EGFR) EGFR Ο επιδερμικός αυξητικός παράγοντας (Epidermal Growth Factor, EGF) είναι το πρώτο μέλος που ανακαλύφθηκε της μεγάλης οικογένειας των αυξητικών παραγόντων που ρυθμίζουν την κυτταρική διαίρεση κατά την εμβρυική ανάπτυξη, αλλά και κατά την ενήλικη περίοδο των ζωικών οργανισμών. [12] Ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) ανήκει στην οικογένεια ErbB. Οι υποδοχείς της οικογένειας ErbB ανήκουν στη μεγάλη οικογένεια των πρωτεϊνικών κινασών και μάλιστα στην οικογένεια των υποδοχέων με δραστικότητα κινάσης τυροσίνης (Receptor Tyrosine Kinases, RTK). Η οικογένεια των ErbB (HER) υποδοχέων περιλαμβάνει εκτός από τον ΕGFR (ErbB-1 ή ΗER-1), τους ErbB-2 (HER-2), ErbB-3 (ΗER-3) και ErbB-4 (HER-4). Είναι μια διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη, που αποτελείται από τρεις περιοχές: (1) την εξωκυττάρια περιοχή, στην οποία δεσμεύεται ο αντίστοιχος αυξητικός παράγοντας που είναι ένα γλυκοζυλιωμένο αμινοτελικό (-NH 2 ) τμήμα, (2) τη διαμεμβρανική περιοχή, δηλαδή ένα υδρόφοβο τμήμα, που συγκρατεί τον υποδοχέα στην κυτταρική μεμβράνη και (3) την ενδοκυτταρική περιοχή που είναι υπεύθυνη για την ενδοκυτταρική μεταγωγή σημάτων, ένα καρβοξυτελικό (-COOH) τμήμα εντός του κυτταροπλάσματος με δραστικότητα κινάσης τυροσίνης. Για την ενεργοποίηση ο EGFR συνδέεται επιλεκτικά με ένα μόριο προσδέτη, όπως για παράδειγμα τον EGF. Το προσδενόμενο μόριο επάγει τον ομο- ή ετερο-διμερισμό του EGFR. Ο EGFR αυτοφωσφορυλιώνεται. Ενεργοποιείται η περιοχή του EGFR με δραστικότητα κινάσης τυροσίνης. Ενεργοποιούνται σηματοδοτικά μόρια και σηματοδοτικά μονοπάτια. Τα σηματοδοτικά μονοπάτια που συνδέονται με τον EGFR σχετίζονται με σημαντικές βιολογικές διεργασίες, καθώς καταλήγουν στην έκφραση γονιδίων που αφορούν στη ρύθμιση του

22 21 κυτταρικού κύκλου, στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, στην απόπτωση, στην επιβίωση των κυττάρων, στη διαφοροποίηση των κυττάρων κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης, στο νευρικό σύστημα, στην καρδιά κλπ. Τα κυτταροπλασματικά μονοπάτια είναι τα κυριότερα και καλύτερα χαρακτηρισμένα σηματοδοτικά μονοπάτια του EGFR. Τέτοια μονοπάτια είναι τα εξής: το σηματοδοτικό μονοπάτι Ras-Raf-MAPK, το σηματοδοτικό μονοπάτι της κινάσης της 3-φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης (ΡΙ3Κ) και της πρωτεϊνικής κινάσης Akt (phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway), το σηματοδοτικό μονοπάτι της φωσφολιπάσης C (Phospholipase C, PLC) και το σηματοδοτικό μονοπάτι των STAT πρωτεϊνών. Ο EGFR εμπλέκεται όμως και σε πυρηνικά μονοπάτια, όπως φαίνεται στην εικόνα 2.1. Εικόνα 2-1: Σηματοδοτικά μονοπάτια τα οποία ενεργοποιούνται από τον ΕGFR. Ένας μηχανισμός ρύθμισης της σηματοδότησης είναι η ενδοκυττάρωση του ενεργοποιημένου EGFR, ενώ απορύθμιση της σηματοδότησης μπορεί να οδηγήσει σε ογκογόνο σηματοδότηση και καρκινογένεση. Γενικά, μηχανισμοί που απορυθμίζουν το σύστημα EGFR-προσδενόμενο μόριο και οδηγούν σε ογκογόνο σηματοδότηση είναι [Εικόνα 2-2] : I. η αυξημένη παραγωγή προσδενόμενων μορίων II. τα υψηλά επίπεδα EGFR (υπερέκφρασή του) III. οι μεταλλαγμένες ενεργές δομές του EGFR IV. η ατελής καθοδική ρύθμιση του EGFR καθώς και V. ο ετεροδιμερισμός και η διεπικοινωνία (cross-talk) του EGFR με υποδοχείς που δεν ανήκουν στην οικογένεια ErbB.

23 22 Εικόνα 2-2: Μηχανισμοί που απορρυθμίζουν το σύστημα EGFR-προσδενόμενο μόριο και οδηγούν σε ογκογόνο σηματοδότηση. Γιατί ο EGFR είναι καλό «μόριο στόχος» για την ραδιοφαρμακευτική Οι λόγοι για τους οποίους ο EGFR είναι καλό «μόριο στόχος» για την ραδιοφαρμακευτική είναι οι ακόλουθοι: (1) Γιατί υπερεκφράζεται σε πολλούς τύπους καρκίνου, (2) Η υπερέκφρασή του συνδέεται με αντίσταση σε πολλές μορφές θεραπείας (χημειοθεραπεία, ραδιοθεραπεία), (3) Τα σηματοδοτικά μονοπάτια που ενεργοποιούνται από τον EGFR είναι κεντρικά στη διαδικασία της καρκινογένεσης (κυτταροπλασματικά και πυρηνικά σηματοδοτικά μονοπάτια), (4) Η απορύθμιση των σηματοδοτικών μονοπατιών μπορεί να οδηγήσει σε ογκογόνο σηματοδότηση. [12,13,14,15,16,17,18,19] Μόρια στόχευσης του EGFR Η στόχευση των υποδοχέων EGFR γίνεται με τρεις κατηγορίες μορίων:. (1) με τα μονοκλωνικά αντισώματα (mabs), (2) με τα μικρού μοριακού βάρους μόρια που δρούν ως αναστολείς της δράσης κινάσης της τυροσίνης του EGFR (αναστολείς ΤΚ) και (3) με πεπτίδια ανάλογα του αυξητικού παράγοντα EGF. Οι δύο πρώτες κατηγορίες έχουν δώσει φάρμακα που κυκλοφορούν στο εμπόριο. [20] Κιναζολίνες Το πρώτο βήμα για την ανάπτυξη μικρού μοριακού βάρους μορίων που αναστέλλουν τη δράση κινάσης της τυροσίνης των πρωτεϊνών έγινε στις αρχές του 1980 μετά την αναγνώριση φυσικών παραγώγων όπως η κερκετίνη (quercetin), η γενιστεΐνη (genistein), η λαβεντουστίνη

24 23 (lavendustin), η ερμπστατίνη (erbstatin) και η χερβιμυκίνη Α (herbimycin A), τα οποία αποδείχτηκαν ότι είναι ισχυροί αναστολείς της δράσης ΤΚ των πρωτεϊνών. Οι κιναζολίνες είναι μόρια μικρού μοριακού βάρους, τα οποία είναι αναστολείς της δράσης ΤΚ των υποδοχέων. Έχουν την ικανότητα να διαπερνούν την κυτταρική μεμβράνη και να στοχεύουν το ενδοκυττάριο τμήμα του υποδοχέα και πιο συγκεκριμένα την περιοχή στην οποία δεσμεύεται το ΑΤΡ. Οι κιναζολίνες συνδέονται με τον υποδοχέα αντιστρεπτά ή μη αντιστρεπτά. Με τον τρόπο αυτό, επιτυγχάνουν τελικά την αναστολή της φωσφορυλίωσης του υποδοχέα και την απενεργοποίηση των σηματοδοτικών του μονοπατιών. [21, 22] Οι δομές που μελετώνται περισσότερο για το σκοπό αυτό είναι: οι ανιλινοκιναζολίνες (anilinoquinazolines) [Σχήμα 2-1], οι ανιλινοκινολίνες (anilinoquinolines) και οι ανιλινοπυριδοπυριμιδίνες (anilinopyridopirimidines). HN N N Σχήμα 2-1: Χημική δομή 4-ανιλινοκιναζολινών. Τα τελευταία χρόνια έχουν σχεδιαστεί και βρίσκονται σε διάφορα στάδια μελέτης πάνω από 30 μόρια αναστολείς της δράσης κινάσης της τυροσίνης των υποδοχέων EGFR. Μετά από κλινικές μελέτες, κάποια από αυτά τα μόρια έχουν αναγνωρισθεί ως θεραπευτικά φάρμακα για συγκεκριμένους τύπους καρκίνου. Το Lapatinib, το Gefitinib και το Erlotinib (Σχήμα 2-2), τα οποία είναι αντιστρεπτοί αναστολείς της δράσης κινάσης της τυροσίνης του διμερούς EGFR/ErbB2 και ανήκουν στην τάξη των ανιλινοκιναζολινών, έχουν εγκριθεί για κλινική χρήση, ενώ πολλά άλλα βρίσκονται σε διάφορα στάδια ανάπτυξης χημειοθεραπευτικής θεραπείας.

25 24 Σχήμα 2-2: Xημικές δομές αναστολέων της δράσης ΤΚ που έχουν εγκριθεί για κλινική χρήση. Κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι ασθενείς που υπερεκφράζουν τον υποδοχέα δεν ανταποκρίνονται καλά στην ακτινοβολία γιατί ο υποδοχέας όταν υπερεκφράζεται φαίνεται να ενεργοποιείται από την ιοντίζουσα ακτινοβολία καθώς φαίνεται να διμερίζεται χωρίς την παρουσία μορίων προσδετών. Επίσης, κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι κάποιοι ασθενείς που παίρνουν ως αντικαρκινικά φάρμακα αναστολείς της δράσης του EGFR ανταποκρίνονται καλύτερα στην ακτινοθεραπεία. [23] Φαίνεται λοιπόν ότι οι αναστολείς του υποδοχέα έχουν και δράση ακτινοευαισθητοποιητών. Οι μηχανισμοί όμως που ελέγχουν αυτή τη δράση δεν είναι μέχρι σήμερα όλοι και πλήρως γνωστοί. Τα (ραδιο)φάρμακα είναι πιστεύουμε θεμιτό να αξιολογούνται και για τις δύο ιδιότητές τους (αντικαρκινική δράση και ακτινοευαισθησία). Τέλος, σημειώνεται ότι έχουν γίνει πολλές προσπάθειες για την ανάπτυξη ραδιοφαρμάκων, κυρίως ως διαγνωστικών εργαλείων, βασιζόμενων στην φαρμακολογική δράση των κιναζολινών. [19, 20, 21] Για τις προσπάθειες αυτές χρησιμοποιήθηκαν κυρίως ως βάσεις συνθέσεων παράγωγα των κιναζολινών που παρουσιάζουν καλή πρόσληψη από τον υποδοχέα. Στα πλαίσια μια τέτοιας επιλογής ενώσεων (που παρουσιάζουν καλή πρόσληψη από τον υποδοχέα) κινείται και η παρούσα διπλωματική εργασία.

26 25 ΙΟΝΤΙΖΟΥΣΑ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑ Ορισμός και πηγές ιοντιζουσών ακτινοβολιών Η ανακάλυψη της ραδιενέργειας έγινε απο τον Henri Becquerel τo Ένα κοινό γνώρισμα όλων των ακτινοβολιών (α, β, γ) συμπεριλαμβανομένων και της ακτινοβολίας Χ είναι ότι κατά την αλληλεπίδραση τους με την ύλη την ιοντίζουν, προκαλώντας τη βίαιη διάσπαση χημικών δεσμών και κατά συνέπεια βιολογικές βλάβες σε ζωντανούς οργανισμούς. Γι αυτό ανήκουν στην λεγόμενη κατηγορία των ιοντιζουσών ακτινοβολιών. [1, 2] α. β. Εικόνα 3-1: α.,β.: Ιοντισμός του ατόμου. Οι ιοντίζουσες ακτινοβολίες προέρχονται από το φυσικό περιβάλλον και από τεχνητές πηγές. Η ακτινοβολία που παρατηρείται στο περιβάλλον έχει δύο δυνατές προελεύσεις. Η μία προέλευση οφείλεται στην κοσμική και ηλιακή ακτινοβολία, που προέρχεται από το διάστημα και τον ήλιο και προσπίπτει στα ανώτερα στρώματα της ατμόσφαιρας της γής, η δε άλλη από το έδαφος. Η σύσταση της κοσμικής ακτινοβολίας είναι πρωτόνια, ελαφροί πυρήνες και ηλεκτρόνια, τα οποία κατά την αλληλεπίδραση τους με την ατμόσφαιρα προκαλούν τη γένεση δευτερογενούς ακτινοβολίας, που αποτελείται από σωματίδια συμπεριλαμβανόμενων και των βραχύβιων π-μεσονίων και μ-λεπτονίων. Η δεύτερη προέλευση φυσικής πηγής των ιοντιζουσών

27 26 ακτινοβολιών είναι αυτή που ανακαλύφτηκε απο τον Becquerel το 1896 σε ορυκτά Ουρανίου (U) και αποτελείται απο σωματίδια-α (πυρήνες He), σωματίδια-β (ηλεκτρόνια) και ακτίνες γ (ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία). Οι τεχνητές πηγές προέρχονται από τη διαγνωστική και θεραπευτική ακτινολογία, τη χρήση των ραδιοϊσοτόπων στην ιατρική, τα ραδιενεργά απόβλητα, τη ραδιενεργή σκόνη στην ατμόσφαιρα από τις δοκιμές των πυρηνικών όπλων και την επαγγελματική έκθεση από τους πυρηνικούς αντιδραστήρες και τους επιταχυντές. [2] Διεισδυτική ικανότητα των ιοντιζουσών ακτινοβολιών Οι ακτινοβολίες έχουν την ικανότητα να αλληλεπιδρούν με την ύλη και να χάνουν ένα μέρος της ενέργειάς τους. Τα σωματίδια-α είναι βαριά σωματίδια που ταξιδεύουν αργά μέσα στην ύλη. Έτσι η πιθανότητα να αλληλεπιδράσουν με άτομα στην πορεία τους είναι πολύ μεγάλη. Σε κάθε αλληλεπίδραση χάνουν μέρος της ενέργειάς τους με αποτέλεσμα να χάνουν γρήγορα όλη τους την ενέργεια και να διεισδύουν έτσι σε μικρές αποστάσεις. Δεν μπορούν να διαπεράσουν ένα κομμάτι χαρτί ή την επιφάνεια του δέρματος (Εικόνα 3-2). Τα σωματίδια-α θεωρούνται επικίνδυνα για την υγεία μας μόνο στην περίπτωση που εισέλθουν στον οργανισμό μας με την κατάποση ή την εισπνοή αντίστοιχου υλικού που τα εκπέμπει. Τα σωματίδια-β και τα ποζιτρόνια είναι πολύ ελαφρύτερα από τα σωματίδια-α και ταξιδεύουν πολύ πιο γρήγορα. Έτσι αλληλεπιδρούν πιο αργά με την ύλη με αποτέλεσμα να διεισδύουν σε μεγαλύτερες αποστάσεις μέσα σε αυτή. Δεν μπορούν να διαπεράσουν λεπτά στρώματα πλαστικού ή μετάλλου και όπως και τα σωματίδια-α είναι επικίνδυνα μόνο κατά την εισπνοή ή την κατάποση ενός β-εκπομπού. Τα σωματίδια-β διεισδύουν έως ένα 1cm περίπου στους ιστούς (Εικόνα 3-2). Οι ακτίνες Χ και γ είναι ηλεκτρομαγνητικές ακτινοβολίες υψηλής ενέργειας, που αλληλεπιδρούν ελάχιστα με την ύλη. Για το λόγο αυτό διανύουν μεγάλες αποστάσεις στο περιβάλλον μέσο και θεωρούνται επικίνδυνες για τον άνθρωπο. Η καλύτερη προστασία από αυτές γίνεται με πολλά στρώματα μολύβδου ή άλλου πυκνού μέσου (Εικόνα 3-2).

28 27 Τα νετρόνια χάνουν την ενέργειά τους με μια σειρά αλληλεπιδράσεων και χωρίζονται σε τρεις ομάδες, τα γρήγορα, τα μεσαία και τα θερμικά νετρόνια. Είναι τρομερά διεισδυτικά και η καλύτερη προστασία από αυτά γίνεται με πολλά στρώματα από μπετό. [2, 24] Εικόνα 3-2: Η διεισδυτική ικανότητα των ιοντιζουσών ακτινοβολιών. Στάδια αλληλεπίδρασης ακτινοβολίας βιολογικής ύλης Η ακτινοβόληση οποιουδήποτε βιολογικού υλικού προκαλεί μια αλληλουχία διαδικασιών, με μεγάλες διαφορές στην κλίμακα του χρόνου εμφανίσεώς τους. Γενικά όμως η αλληλουχία αυτή των διαδικασιών μπορεί να χωριστεί σε τρία στάδια: το φυσικό, το χημικό και το βιολογικό. Η ιοντίζουσα ακτινοβολία κατά τη διέλευσή της μέσω της ύλης, με φυσικούς μηχανισμούς αλληλεπιδράσεων, αποδίδει ενέργεια σε αυτήν μέσω ιοντισμών και διεγέρσεων. Αυτή η μεταφορά ενέργειας πραγματοποιείται σε χρόνο <10-18 s, αλλά η κατανομή της στο χώρο, υπό συνεχή μορφή, εξαρτάται από το είδος και την ενέργεια της ιοντίζουσας ακτινοβολίας. Εάν η τιμή της LET (γραμμική μεταφορά ενέργειας) είναι χαμηλή, αυτό σημαίνει ακτινοβολία που προκαλεί μικρό αριθμό ιοντισμών και διεγέρσεων ανά μm διαδρομής της. Αντιθέτως, ακτινοβολίες όπως τα σωματίδια-α, τα πρωτόνια ή τα βαρέα ιόντα που προκαλούν πυκνούς ιοντισμούς ανά μm διαδρομής τους, χαρακτηρίζονται ως ακτινοβολίες με υψηλή LET.[1, 2] Εικόνα 3-3: Ακτινοβολίες και τιμές LET.

29 28 Κατά το χημικό στάδιο τα ιοντισμένα άτομα που έχουν προκύψει από την ακτινοβόληση αντιδρούν με άλλα συστατικά των κυττάρων με ταχείες αντιδράσεις. Αυτό οφείλεται στο ότι οι ιοντισμοί και διεγέρσεις που συνέβησαν κατά το φυσικό στάδιο, προκαλούν ρήξη χημικών δεσμών και δημιουργία ελεύθερων ριζών [1, 25]. Επειδή τα βιολογικά συστήματα αποτελούνται κυρίως από νερό, ο μεγαλύτερος αριθμός των ιοντισμών συμβαίνει στα μόρια του νερού. Τα αρνητικώς φορτισμένα ελεύθερα ηλεκτρόνια (e - ) που παράγονται κατά τους ιοντισμούς, συνδέονται με πολικά μόρια νερού. Το σύμπλεγμα αυτό ονομάζεται υδρογονωμένο ηλεκτρόνιο (e - aq), έχει ελαττωμένη κινητικότητα και χρόνο ζωής λίγα ms. Το μόριο του νερού που έχει χάσει το ηλεκτρόνιο αποτελεί ένα θετικώς φορτισμένο ιόν το οποίο γρήγορα διασπάται σε ένα ιόν υδρογόνου H + και σε μία ηλεκτρικά ουδέτερη ρίζα. Η ρίζα αποτελείται από εννέα ηλεκτρόνια, επομένως το ένα από αυτά είναι ασύζευκτο, και αποτελεί μια υψηλής δραστικότητας ελεύθερη ρίζα που μπορεί να διανύσει μια μικρή απόσταση μέσα στο κύτταρο [2]. Παρομοίως η ρίζα που επίσης δημιουργείται, αποτελείται από ένα πρωτόνιο και ένα ηλεκτρόνιο, αλλά χημικώς είναι πολύ δραστική, διότι η σταθερή μορφή του υδρογόνου είναι το Η 2. Περίπου σε ραδιόλυσης του νερού e - aq, s μετά την ακτινοβόληση, τα ανωτέρω τρία βασικά προϊόντα της και, δημιουργούν επιπλέον αντιδράσεις όπως : 2 2. Οι βλάβες των κυττάρων που οφείλονται στη δράση των ελεύθερων ριζών αναφέρονται σαν έμμεσος δράση της ακτινοβολίας, ενώ οι βλάβες που οφείλονται στον απευθείας ιοντισμό των ατόμων ονομάζονται άμεσος δράση της ακτινοβολίας. [1, 25] Το βιολογικό στάδιο ακολουθεί αμέσως μετά το χημικό στάδιο. Αρχίζει με την εμφάνιση ενζυμικών μηχανισμών που δρουν επιδιορθωτικά στους μοριακούς σχηματισμούς που έχουν υποστεί βλάβη κατά το χημικό στάδιο. Η διάρκεια της επιδιόρθωσης διαρκεί κατά το κύριο μέρος της 15 min -1 h ενώ σε περίπου 4 h έχει ολοκληρωθεί. Το μεγαλύτερο μέρος των βλαβών που υφίστανται τα βιολογικά μόρια όπως το μόριο του DNA, επιδιορθώνονται μέσα στο ανώτερο χρονικό διάστημα. [1, 2] Οι οργανισμοί έχουν αναπτύξει μηχανισμούς απόκρισης στην επίδραση των ιοντιζουσών ακτινοβολιών. Τον ρόλο του «φύλακα του γονιδιώματος» στο κύτταρο μετά από την προσβολή του από ιοντίζουσες ακτινοβολίες τον εκτελεί η πρωτεΐνη p53. Όταν απαιτείται η διακοπή του κυτταρικού κύκλου λόγω βλάβης του DNA, η p53 δραστηριοποιείται και διακόπτει τον κυτταρικό

30 29 κύκλο, έτσι ώστε να δοθεί ο απαραίτητος χρόνος στο κύτταρο να επιδιορθώσει την βλάβη ή να οδηγήσει το κύτταρο σε απόπτωση όταν η βλάβη είναι ανεπανόρθωτη. [26] Σχήμα 3-1: Η πρωτεΐνη p53 και ο έλεγχος του κυτταρικού κύκλου. Για την διόρθωση των βλαβών στο DNA που προκαλούν οι ιοντίζουσες ακτινοβολίες, το κύτταρο έχει αναπτύξει λιγότερο ή περισσότερο εξειδικευμένους μηχανισμούς. Στα θηλαστικά είναι γνωστοί πολλοί πολύπλοκοι ή απλούστεροι επιδιορθωτικοί μηχανισμοί που δεν αναλύονται εδώ διεξοδικά. Τις τελευταίες δεκαετίες έχουν ορισθεί δύο τύποι κυτταρικού θανάτου: η νέκρωση και η απόπτωση. Η νέκρωση είναι μια παθητική διαδικασία που συμβαίνει μετά από μη αναστρέψιμη βλάβη, η οποία οφείλεται σε περιβαντολογικές αλλαγές, όπως οι ακραίες θερμοκρασίες και τα μηχανικά τραύματα. Αποτέλεσμά της είναι η προοδευτική διάλυση των κυτταρικών δομών. Η άλλη μορφή κυτταρικού θανάτου είναι η απόπτωση ή αλλιώς προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος. Όταν το κύτταρο λάβει συγκεκριμένα σήματα από το εξωτερικό ή εσωτερικό περιβάλλον του, ενεργοποιείται η έκφραση συγκεκριμένου γονιδιακού προγράμματος που οδηγεί το κύτταρο σε κυτταρικό θάνατο.

31 30 Υπάρχουν δύο κατηγορίες αποπτωτικών σημάτων. Η πρώτη κατηγορία αφορά μόριααισθητήρες που ελέγχουν στο εσωτερικό του κυττάρου τις συνθήκες οξυγόνωσης, την ακεραιότητα του DNA, το επίπεδο μεταβολισμού, την είσοδο ιών, τη σωστή λειτουργία των ρυθμιστών του κυτταρικού πολλαπλασιασμού κ.ά. Αν διαπιστωθεί κάποια δυσλειτουργία που δεν είναι δυνατό να επιδιορθωθεί, κινητοποιούν μόρια εκτελεστές του προγράμματος της απόπτωσης. Η δεύτερη κατηγορία αφορά μόρια-αισθητήρες στην κυτταρική μεμβράνη (υποδοχείς θανάτου), οι οποίοι μπορούν να παραλαμβάνουν και να μεταβιβάζουν μέσα στο κύτταρο εντολές απόπτωσης που προέρχονται από το εξωκυττάριο περιβάλλον και αφορούν γενικότερες αποφάσεις που λαμβάνονται σε επίπεδο ιστού ή οργανισμού. Τα μορφολογικά χαρακτηριστικά ενός αποπτωτικού κυττάρου είναι η συρρίκνωση του κυτταροπλάσματος, η αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, η δημιουργία φυσαλίδων στην κυτταρική μεμβράνη, η καταστροφή της πυρηνικής μεμβράνης, η συμπύκνωση της χρωματίνης, αλλαγές στα μιτοχόνδρια και δημιουργία αποπτωτικών σωματίων. Τα βιοχημικά και μοριακά χαρακτηριστικά ενός αποπτωτικού κυττάρου είναι η διακοπή της επικοινωνίας με τα γειτονικά κύτταρα, η διακοπή της αντιγραφής, μεταγραφής και επιδιόρθωσης του DNA, κατακερματισμός του DNA, εκπομπή σημάτων προσέλκυσης μακροφάγων για απομάκρυνση του κυττάρου. Η φυσιολογική ανάπτυξη ενός πολυκύτταρου οργανισμού βασίζεται σημαντικά στην ισορροπία των διεργασιών του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της απόπτωσης. Ένα από τα κυριότερα χαρακτηριστικά ενός όγκου είναι η αύξηση του αριθμού των κυττάρων. Το φαινόμενο αυτό μπορεί να οφείλεται σε αυξημένο κυτταρικό πολλαπλασιασμό ή σε ελαττωμένο κυτταρικό θάνατο ή και στα δύο. Στη βιολογία του καρκίνου, γίνεται ολοένα πιο εμφανές ότι πολλά καρκινικά κύτταρα αναχαιτίζουν τους φυσιολογικούς αποπτωτικούς μηχανισμούς για να εμποδίζουν την αυτοκαταστροφή, η οποία θα ήταν ενδεδειγμένη εξαιτίας των πολλών μεταλλάξεων που φιλοξενούν. Οι διάφορες μορφές θεραπείας του καρκίνου, όπως και η ακτινοθεραπεία, είναι σε θέση κάτω από ορισμένες συνθήκες να επάγουν την απόπτωση. Συνεπώς, η κατανόηση της βιοχημείας και της γενετικής της απόπτωσης καθώς και οι μελλοντικές έρευνες σε αυτό το πεδίο μπορούν να βοηθήσουν σημαντικά στο πεδίο της ακτινοθεραπείας και γενικότερα στη θεραπεία του καρκίνου. [27]

32 31 Δράση των ιοντιζουσών ακτινοβολιών στα βιολογικά μόρια Οι ιοντίζουσες ακτινοβολίες προκαλούν, όπως προαναφέρθηκε, έμμεσες ή αμέσες χημικές μεταβολές στα βιολογικά μόρια.[2] Η επιστήμη της Ραδιοβιολογίας, μέσω πληθώρας πειραματικών δεδομένων, έχει καταλήξει στο συμπέρασμα, ότι το πιο κρίσιμο στοιχείο που καθορίζει τη θανάτωση των κυττάρων που είναι και το ζητούμενο της ακτινοθεραπείας - είναι η αλλοίωση του γενετικού υλικού λόγω ακτινοβολίας. Σαν παράδειγμα αποδείξεως, σε μελέτες μικροδοσιμετρίας έχει αποδειχθεί ότι η θανάτωση κυττάρων στα οποία ακτινοβολείται μόνο το κυτταρόπλασμα, απαιτεί πολύ υψηλότερες δόσεις σε σύγκριση με τις δόσεις που απαιτούνται για τη θανάτωση κατά την ακτινοβόληση του κυτταρικού πυρήνα.[1, 2] Οι αλλοιώσεις του DNA που προκαλούν οι ιοντίζουσες ακτινοβολίες είναι: 1. Ρήξεις απλής έλικας (single strand breaks - SSB) (Εικόνα 3-4). 2. Ρήξεις διπλής έλικας (double strand breaks - DSB). Οι βλάβες αυτές είναι υπεύθυνες για τις χρωμοσωματικές αλλοιώσεις. Σχηματικά οι βλάβες στο DNA παρουσιάζονται στην Εικόνα Ενδομοριακή και διαμοριακή σύνδεση μεταξύ DNA ή μεταξύ DNA-πρωτεΐνης. 4. Αλλοίωση των οργανικών βάσεων (π.χ αλκυλίωση συνήθως μεθυλίωση, οξείδωση, υδρόλυση). 5. Σπάσιμο των δεσμών υδρογόνου που προκαλεί μόνιμη παραμόρφωση της δομής του DNA. 6. Απώλειες βάσεων 7. Αλλαγές βάσεων α. β Εικόνα 3-4: α. Θραύση στη μία ή και στις δύο έλικες του DNA, αντίστοιχα, β. Βλάβες στο DNA: SSB Μονή θραύση και DSB: Διπλή θραύση.

33 32 Όσον αφορά τις ανωμαλίες λόγω ακτινοβολίας που παρατηρούνται σε ένα κύτταρο κατά τη μετάφαση, αυτές είναι δύο τάξεων, οι χρωμοσωμικές ανωμαλίες και οι χρωματιδιακές ανωμαλίες. Χρωμοσωμικές ανωμαλίες (δακτύλιος, δικεντρικό χρωμόσωμα) προκύπτουν εάν ένα κύτταρο ακτινοβοληθεί νωρίς στην μεσόφαση, πριν την αντιγραφή του DNA. Κατά τη διάρκεια της φάσης της σύνθεσης του DNA που ακολουθεί, αυτός ο κλώνος της χρωματίνης θα αναπαράγει το σπάσιμο που είχε παραχθεί από την ακτινοβολία. Εάν, η δόση της ακτινοβολίας δοθεί αργότερα στη μεσόφαση, αφού το υλικό του DNA έχει διπλασιαστεί τότε οι ανωμαλίες που προκύπτουν ονομάζονται χρωματιδιακές ανωμαλίες (γέφυρα ανάφασης). [1, 25] Ακτινοθεραπεία και ο σκοπός της Η Ακτινοθεραπεία ως ιατρική δραστηριότητα ακολούθησε την ανακάλυψη των ιοντιζουσών ακτινοβολιών, των ακτίνων Χ από τον Roentgen το 1895 και της ραδιενέργειας από τον Becquerel το Ήδη από τα πρώτα έτη μετά την ανακάλυψη των ιοντιζουσών ακτινοβολιών, έγινε φανερή η χρήση τους για θεραπευτικούς σκοπούς με σκοπό την καταστροφή καρκινικών κυττάρων. Τα κύτταρα κακοήθων νεοπλασιών αναπτύσσονται χωρίς να υπακούουν στους φυσιολογικούς μηχανισμούς ελέγχου του σώματος προκαλώντας μεταστάσεις και καταστροφή της λειτουργίας του οργάνου ή ιστού που έχουν καταλάβει. Η θεραπεία του καρκίνου έχει ως στόχο την θανάτωση ή την απομάκρυνση καρκινικών κυττάρων και την παύση του περαιτέρω πολλαπλασιασμού τους. Ιδιαίτερα η Ακτινοθεραπεία προσπαθεί να το πετύχει αυτό με τη χρήση ιοντιζουσών ακτινοβολιών εφόσον όλα τα κύτταρα υγιή ή μη υγιή μπορούν να φονευθούν με την ιοντίζουσα ακτινοβολία. Οι δόσεις διαφέρουν όμως, για τα διάφορα κύτταρα διότι αυτά παρουσιάζουν διαφορά στην ακτινοευαισθησία τους. Επομένως, ο σκοπός της Ακτινοθεραπείας είναι να χορηγήσει την κατά το δυνατόν υψηλότερη απορροφούμενη δόση στους καρκινικούς ιστούς ώστε έτσι να επιτευχθεί η μέγιστη πιθανότητα ελέγχου της αναπτύξεως των καρκινικών κυττάρων, ενώ ταυτόχρονα πρέπει να περιορίζεται η βλάβη των ακτινοβολούμενων μη καρκινικών ιστών και οργάνων σε αποδεκτό επίπεδο. [1, 28]

34 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 33

35 34 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Από τα τέλη της δεκαετίας του 1980 μελετώνται οι τρόποι ενεργοποίησης των ενδοκυττάριων σηματοδοτικών μονοπατιών που διεγειρούν την κυτταρική αύξηση και την κυτταρική διαίρεση και σχετίζονται άμεσα με την καρκινογένεση. Γνωρίζοντας το γεγονός οτι οι αυξητικοί παράγοντες (όπως οι EGF, PDGF, FGF, VEGF και HGF) προσδένονται σε υποδοχείς της κυτταρικής μεμβράνης ενεργοποιώντας τα σηματοδοτικά αυτά μονοπάτια, γίνεται μία μεγάλη προσπάθεια αναστολής των πρωτεϊνικών κινασών (υποδοχείς). [29] Στις καλύτερα μελετημένες πρωτεϊνικές κινάσες περιλαμβάνονται ο υποδοχέας του επιδερμικού παράγοντα αύξησης (EGFR) και γενικά όλη η οικογένεια των υποδοχέων ErbBs. Δυσλειτουργίες του υποδοχέα του EGF (EGFR) συνδέονται με πολλά νοσήματα ενώ αυτός υπερεκφράζεται σε πολλούς τύπους καρκίνου [19]. Η υπερέκφραση του υποδοχέα στις μεμβράνες των καρκινικών κυττάρων προσδίδει στα κύτταρα αυτά γνωρίσματα, τα οποία τα διαφοροποιούν από τα υπόλοιπα -φυσιολογικά- κύτταρα με αποτέλεσμα να αντιστέκονται σε όλες τις μορφές θεραπείας. Για τους παραπάνω λόγους, ο EGFR μπορεί να αποτελέσει ένα καλό μόριο-στόχος κατά την ανάπτυξη αντικαρκινικών φαρμάκων [30]. Ο EGFR είναι ο πιο καλά μελετημένος απ όλους τους υποδοχείς στις στρατηγικές στόχευσης. Η στόχευση των υποδοχέων έχει προσεγγιστεί κυρίως με τρεις κατηγορίες φαρμακοφόρων ομάδων [31, 32]. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν αντισώματα που αναγνωρίζουν την εξωκυττάρια περιοχή του υποδοχέα και ανταγωνίζονται την πρόσδεση του μορίου προσδέτη. Στην δεύτερη κατηγορία ανήκουν μικρά οργανικά μόρια, οι κιναζολίνες που διαπερνούν την κυτταρική μεμβράνη, εισέρχονται στο κύτταρο και δεσμεύονται στην ενδοκυττάρια περιοχή του υποδοχέα ανταγωνιζόμενα τη θέση δέσμευσης του μορίου ATP. Τα πιο δραστικά μόρια της κατηγορίας αυτής είναι η οικογένεια των 4-ανιλινοκιναζολινών. Στην τρίτη κατηγορία ανήκουν πεπτίδια που μοιάζουν με τα μόρια-προσδέτες των υποδοχέων αυτών. Στις δύο πρώτες κατηγορίες ανήκουν τα αντικαρκινικά φάρμακα που κυκλοφορούν στο εμπόριο, το Gefitinib και το Erlotinib (παράγωγα κιναζολινών) και το Cetuximab (μονοκλωνικό αντίσωμα). [33]

36 35 Από τα αποτελέσματα των κλινικών μελετών των εμπορικών αντικαρκινικών φαρμάκων φαίνεται πως η ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος είναι σημαντικό στοιχείο για την αποτελεσματικότητα της θεραπείας. Για τον παραπάνω λόγο, οι ανιλινοκιναζολίνες συνδυάζονται στην θεραπεία με φάρμακα που ενεργοποιούν το ανοσοποιητικό σύστημα όπως είναι τα μονοκλωνικά αντισώματα. Η συνδυασμένη θεραπεία είναι σήμερα πιο διαδεδομένη από τη μονοθεραπεία [33], όμως χρειάζεται να αναπτυχθούν περισσότερο τα κριτήρια επιλογής των ασθενών καθώς η αντίδραση κάθε ασθενούς σε κάθε θεραπεία είναι διαφορετική. Επίσης, η ακτινοθεραπεία σε συνδυασμό με τους αναστολείς των κινασών φαίνεται να βελτιώνει τα αποτελέσματα της θεραπείας γιατί οι αναστολείς των κινασών έχουν και δράση ακτινοευαισθητοποιητών. Με τα κατάλληλα ραδιοφάρμακα-ανιχνευτές μπορεί να γίνει συγκεκριμένη στόχευση στους υποδοχείς ErbBs απεικονίζοντας μοριακά τον όγκο. Έτσι προσφέρεται η δυνατότητα να προσδιοριστεί εάν η στοχευόμενη πρωτεΐνη εκφράζεται σε ένα συγκεκριμένο όγκο, ενώ δίνεται η δυνατότητα της χρονικής παρακολούθησης της πρόσδεσης του φαρμάκου στον υποδοχέα και του ελέγχου της πρόσδεσής του σε αυτόν. Επίσης, μπορεί να προσδιοριστεί η διάρκεια της αναστολής του υποδοχέα με δράση κινάσης της τυροσίνης in vivo, ενώ είναι δυνατός ο προσδιορισμός της ύπαρξης κάποιας μετάλλαξης η οποία μπορεί να οδηγήσει είτε στην αλληλεπίδραση του φαρμάκου με την μεταλλαγμένη μορφή του υποδοχέα είτε στην απώλεια της αναγνώρισης του υποδοχέα από τον ανιχνευτή. [34] Τα τελευταία χρόνια έχουν επισημανθεί αρκετά παράγωγα των 4-ανιλινοκιναζολινών με βραχύβια ισότοπα εκπομπής ποζιτρονίων, όπως 11 C, 18 F, και 124 Ι αλλά μέχρι τώρα λίγες προσπάθειες έχουν γίνει για επισήμανσή τους με 99m Tc, αν και υπάρχει ενδιαφέρον σχεδιασμού συμπλόκων με 99m Tc που δεσμεύονται ειδικά στην περιοχή με δράση κινάσης της τυροσίνης του EGFR. [35, 36, 37] Σκοπός της παρούσης πειραματικής εργασίας είναι η in vitro σύγκριση 3 κιναζολινικών παραγώγων (Βλ. Σελ 36 Υλικά και Μέθοδοι) στην καρκινική σειρά Α431, με απώτερο στόχο την χρήση τους ως ραδιοφάρμακα απεικόνισης καρκίνων που υπερεκφράζουν τον EGFR. Στην παρούσα εργασία παρουσιάζονται οι δοκιμασίες τοξικότητας των παραγώγων, η δράση των παραγώγων σε διάφορες συγκεντρώσεις στην δημιουργία αποικιών παρουσία ή απουσία ακτινοβόλησης, καθώς και οι καμπύλες επιβίωσης για τα δύο καλύτερα παράγωγα Α και Γ.

37 36 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Κιναζολινικά παράγωγα Στην παρούσα διπλωματική εργασία χρησιμοποιήθηκαν τα κάτωθι τρια κιναζολινικά παράγωγα: Παράγωγο Α: 6-αμινο-4-[(3-βρωμοφαινυλ)αμινο]-κιναζολίνη Παράγωγο Γ: Ν-{4-[(3-βρωμοφαινυλ)αμινο]-κιναζολιν-6-υλ}-2-χλωροακεταμίδιο Παράγωγο Δ: 4-[(3-βρωμοφαινυλ)αμινο]-6-νιτρο-κιναζολίνη HN Br H 2 N N Σχήμα 4-1: Χημική δομή του κιναζολινικού παραγώγου Α. N HN Br Cl H N N O N Σχήμα 4-2 : Χημική δομή του κιναζολινικού παραγώγου Γ. 2' Br 4' 5' HN 5 6' O 2 N N 7 2 N 8 Σχήμα 4-3 : Χημική δομή του κιναζολινικού παραγώγου Δ.

38 37 Τα παράγωγα Α, Γ και Δ είναι γνωστά στη βιβλιογραφία. Τα δύο εξ αυτών, τα κιναζολινικά παράγωγα Α και Γ έχουν ήδη αποτελέσει βάση πολλών συνθέσεων και αντικείμενα παλαιοτέρων μελετών. Το Δ θεωρήθηκε σωστό να προστεθεί στον κατάλογο των άλλων παραγώγων για να δοκιμαστεί ο ρόλος της νίτρο ομάδας παρουσία ακτινοβολίας καθώς είναι γνωστό ότι σε πολλούς ακτινοευαισθητοποιητές ο ρόλος της είναι κεντρικός. Ακτινοβόληση Δειγμάτων Η ακτινοβόληση των δειγμάτων έγινε με πηγή κοβαλτίου ( 60 Co) GammaCell 220 Irradiator (Atomic Energy of Canada Ltd, Ottawa, Canada, Ιανουαρίου 1974) σε θερμοκρασία δωματίου. Πριν την ακτινοβόληση έγινε μέτρηση του ρυθμού δόσης με την βοήθεια φορητού δοσίμετρου, που τοποθετείται στο σημείο που θα ακτινοβοληθούν τα δείγματα (Δρ. Γ. Τερζούδη, ΕΚΕΦΕ «Δ»). Ύστερα από βαθμονόμηση της πηγής βρέθηκε ότι τη στιγμή που έγινε η ακτινοβόληση χρειάζονταν 2 min και 15 sec για να δεχτούν τα κύτταρα ακτινοβολία 1 Gy (δηλαδή 0,5 Gray/min). Κυτταρικές καλλιέργειες Οι κυτταρικές καλλιέργειες αναπτύχθηκαν αρχικά ως μια μέθοδος μελέτης της συμπεριφοράς των κυττάρων, ελεύθερων από πιθανές in vivo επιδράσεις που συμβαίνουν στον οργανισμό. Σκοπός των κυτταροκαλλιεργειών είναι να διατηρηθούν τα κύτταρα βιώσιμα, μακριά από το φυσιολογικό οργανισμό από τον οποίον προήλθαν και κάτω από ελεγχόμενες εργαστηριακές συνθήκες. Όλες οι εργασίες γίνονται σε θάλαμο κάθετης νηματικής ροής, ο οποίος είναι εξοπλισμένος με υπεριώδης (UV) λάμπα και φίλτρα αέρος ώστε οι συνθήκες εργασίας να είναι άσηπτες (Εικόνα 4-1). Τα κύτταρα επωάζονται στους 37 0 C στον επωαστικό κλίβανο (incubator) σε κορεσμένες συνθήκες υγρασίας και παρουσία 5% CO 2 (Εικόνα 4-2) [25]. Τα υλικά και τα διαλύματα που χρησιμοποιούνται για τις κυτταρικές καλλιέργειες βρίσκονται διαθέσιμα στο εμπόριο. [38] Η κυτταρική σειρά που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη ήταν η Α431 (human epidermoid carcinoma cells). Η συγκεκριμένη κυτταρική σειρά προέρχεται από ανθρώπινο καρκίνωμα και υπερεκφράζει τον EGFR. Κάθε κύτταρο Α431 περιέχει 2*10 6 υποδοχείς, σε σύγκριση με άλλα επιδερμικά κύτταρα που περιέχουν 10 4 έως 10 5 υποδοχείς [39]. Ο μεγάλος

39 38 αριθμός υποδοχέων στα κύτταρα Α431 είναι αποτέλεσμα γονιδιακής ενίσχυσης (πολλά αντίγραφα του ίδιου γονιδίου στα κύτταρα). Τα κύτταρα αυτά έχουν επιτρέψει την κλωνοποίηση του γονιδίου του υποδοχέα και έχουν καταστήσει δυνατή τη μελέτη των ιδιοτήτων του [40]. Υποδομές και Υλικά Mικροσκόπιο ανάστροφης φάσης, Αxiovert 25 Zeiss Επωαστικός κλίβανος με παροχή CO 2, Format Scientific Θάλαμος κάθετης νηματικής ροής (Laminar flow), ELMED Δοχείο υγρού αζώτου, Forma Φιάλες κυτταροκαλιεργειών 75 cm 3, Οrange Scientific Φιάλη κυτταροκαλιεργειών 100 cm 3, Οrange Scientific Σιφώνια ακριβείας, Οrange Scientific Ειδικά κρυοάντοχα σωληνάρια ψύξης κυττάρων των 2 ml, Οrange Scientific Πιππέτες, Gilson Φυγόκεντρος, Heraeus Christ Κυτταρική σειρά A431 (επιδερμικά επιθηλιακά κύτταρα), ATCC DMSO, Sigma Θρεπτικό υλικό: D-MEM HIGH GLUCOSE, PAA Laboratories. Εμβρυικός ορός μόσχου (FΒS), PAA Laboratories Διάλυμα L-γλουταμίνης 200 mm, PAA Laboratories Διάλυμα πενικιλλίνης / στρεπτομικίνης 100 Units/mL και 10mg/ ml, PAA Laboratories Διάλυμα θρυψίνης/edta: 0,05% / 0,02 % σε PBS χωρίς Ca2+, Mg 2+, Biochrom AG Eμπλουτισμένο θρεπτικό υλικό: D-MEM HIGH GLUCOSE (10% FBS, 1% L-Glutamine, 1% Penicillin/Streptomycin) Διάλυμα ψύξης: 10% DMSO σε ορό μόσχου Διάλυμα μονιμοποίησης (Fixative): Μεθανόλης Οξικό οξύ σε αναλογία 3:1 Διάλυμα θρυψίνης/edta: 0,05% / 0,02 % σε PBS χωρίς Ca2+, Mg 2+, Biochrom Αντικειμενοφόρες πλάκες Iσοτονικό ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών χλωριούχων (PBS), ph 7.4

40 39 Απόψυξη κυτταρικής σειράς Η κυτταρική σειρά Α431 παραλαμβάνεται από συνθήκες βαθιάς ψύξης (υγρό άζωτο -196 ο C, 10 7 κύτταρα / ml διαλύματος ψύξης σε ειδικά κρυοάντοχα σωληνάρια ψύξης κυττάρων των 2ml ή από ειδικά ψυγεία φύλαξης παγωμένων κυττάρων στους -80 ο C). Κατά την απόψυξη, τα σωληνάρια μεταφέρονται αμέσως από το υγρό άζωτο ή από τους -80 ο C στο θάλαμο κάθετης νηματικής ροής (Εικόνα 4-1), όπου με την προσθήκη εμπλουτισμένου θρεπτικού υλικού, προθερμασμένο στους 37 ο C, γίνεται σιγά σιγά η απόψυξη των κυττάρων. Αμέσως μετά την απόψυξη τα κύτταρα μεταφέρονται σε φιάλες ή τριβλία καλλιέργειας εμπλουτισμένα με 10ml θρεπτικό υλικό προθερμασμένο στους 37 ο C και τοποθετούνται στον επωαστικό κλίβανο (Εικόνα 4-2). Εικόνα 4-1: Θάλαμος κάθετης νηματικής ροής. Εικόνα 4-2: Επωαστικός κλίβανος. Εικόνα 4-3: Οπτικό μικροσκόπιο.

41 40 Καλλιέργεια κυττάρων Τα κύτταρα της σειράς Α431 καλλιεργούνται με εμπλουτισμένο θρεπτικό υλικό D-MEM στον επωαστικό κλίβανο στους 37 0 C παρουσία CO 2 5% και κορεσμένη σε υδρατμούς ατμόσφαιρα (Εικόνα 4-2). Κάθε δύο με τρεις μέρες πραγματοποιείται ανακαλλιέργεια. Ανακαλλιέργεια κυττάρων Όταν τα κύτταρα έχουν καλύψει το 80-90% της επιφάνειας της φιάλης στο οποίο καλλιεργούνται, πραγματοποιείται ανακαλλιέργεια. Ο προσδιορισμός του ποσοστού κάλυψης γίνεται με παρατήρηση στο μικροσκόπιο ανάστροφης φάσης. Αρχικά εργαζόμαστε μέσα στο θάλαμο κάθετης νηματικής ροής όπου αφαιρείται το παλιό θρεπτικό υλικό της καλλιέργειας και τα κύτταρα ξεπλένονται πρώτα με διάλυμα PBS. Με την διαδικασία αυτή απομακρύνονται ίχνη ορού βοηθώντας τα κύτταρα να ξεκολλήσουν πιο γρήγορα. Έπειτα αφαιρούμε το PBS και προσθέτουμε 2ml ανά φιάλη διαλύματος θρυψίνης/edta και τα κύτταρα επωάζονται στον επωαστικό κλίβανο για περίπου 3-5 λεπτά (μεγαλύτερος χρόνος επώασης στη θρυψίνη πιθανών να επιφέρει λύση των κυττάρων). Η πορεία αποκόλλησης των κυττάρων παρακολουθείται στο μικροσκόπιο. Μετά την ολοκλήρωση της αποκόλλησης των κυττάρων το αιώρημα αυτών χωρίζεται σε 3-4 φιάλες στις οποίες προστίθενται 10ml εμπλουτισμένου θρεπτικού υλικού. Ψύξη κυττάρων Η διατήρηση κάθε κυτταρικής σειράς για μεγάλο χρονικό διάστημα είναι δυνατή με την αποθήκευσή της σε υγρό άζωτο. Η ψύξη των κυττάρων πραγματοποιείται βαθμιαία. Αρχικά τα κύτταρα που βρίσκονται σε εκθετική φάση ανάπτυξης μέσα στον επωαστικό κλίβανο αποκολλούνται από τη φιάλη, με την διαδικασία της ανακαλλιέργειας που περιγράψαμε παραπάνω. Στην συνέχεια μεταφέρονται σε σωλήνα φυγοκέντρησης όπου φυγοκεντρούνται για 10 λεπτά στα 500g. Όταν ολοκληρωθεί η φυγοκέντρηση, αφαιρείται το υπερκείμενο θρεπτικό υλικό και γίνεται επαναιώρηση του ιζήματος των κυττάρων σε 1 ml διαλύματος ψύξης. Τέλος, μεταφέρονται σε ειδικά σωληνάρια ψύξης, τα οποία τοποθετούνται διαδοχικά στους -4 0 C για μία ώρα, στους C για 4 ώρες, στους C για 12 ώρες και τέλος μεταφέρονται στο υγρό άζωτο.

42 41 Μέτρηση κυττάρων σε εναιώρημα με αιματοκυτταρόμετρο Η μέτρηση των κυττάρων με αιματοκυτταρόμετρο είναι μια άμεση και εύκολη μέθοδος προσδιορισμού του αριθμού των κύτταρων σε εναιώρημα γνωστού όγκου. Το αιματοκυτταρόμετρο είναι μια τροποποιημένη αντικειμενοφόρος πλάκα με δύο κατάλληλα επεξεργασμένες επιφάνειες. Η κάθε επιφάνεια αποτελείται από εννέα μεγάλα τετράγωνα σε μορφή πλέγματος (Εικόνα 4-4). Κάθε ένα από τα τέσσερα τετράγωνα στις γωνίες χωρίζεται σε δεκαέξι μικρότερα τετράγωνα. Κάθε μεγάλο τετράγωνο (κόκκινο τετράγωνο) έχει επιφάνεια 1mm 2, έτσι ώστε όταν καλύπτεται με καλυπτρίδα ο όγκος του υγρού σε κάθε τετράγωνο να είναι 10-4 ml. Γνωρίζοντας τον όγκο του κυτταρικού εναιωρήματος και μετρώντας τα κύτταρα σε ένα τετράγωνο μπορεί να προσδιορισθεί ο αριθμός και η συγκέντρωση τους. Τοποθετείται η καλυπτρίδα στο αιματοκυτταρόμετρο και με πιπέττα Pasteur τοποθετούνται 10μL από το κυτταρικό εναιώρημα στην άκρη της καλυπτρίδας, έτσι ώστε να καλυφθεί η κατάλληλα επεξεργασμένη επιφάνεια λόγω του τριχοειδούς φαινομένου. Τα κύτταρα που βρίσκονται στα τέσσερα ακριανά μεγάλα τετράγωνα διαμερίσματα του αιματοκυτταρομέτρου μετρώνται στο οπτικό μικροσκόπιο. Ο αριθμός των κυττάρων ανά ml αρχικού εναιωρήματος ισούται με τον μέσο όρο του αριθμού των κυττάρων στα τέσσερα διαμερίσματα του αιματοκυτταρομέτρου επί Εικόνα 4-4: Αιματοκυτταρόμετρο.

43 42 Δοκιμασία τοξικότητας (Μέθοδος ΜΤΤ) Γενικά Η χρωματομετρική μέθοδος ΜΤΤ {3-(4,5-dimethylthiazol -2 yl)-2.5-diphenyltetrazolium bromide}, που περιγράφεται για πρώτη φορά από τον Mosmann το 1983 βασίζεται στην ικανότητα των ζωντανών κυττάρων να μετατρέπουν το διαλυτό κίτρινο άλας τετραζολίου (ΜΤΤ) σε αδιάλυτους πορφυρούς κρυστάλλους φορμαζάνης (Σχήμα 4-4). Συγκεκριμένα ο δακτύλιος του τετραζολίου μεταβολίζεται στα ενεργά μιτοχόνδρια από τη δραστικότητα διαφόρων αφυδρογονασών και το απαλό κίτρινο χρώμα του υποστρώματος μετατρέπεται σε πορφυρούς κρυστάλλους, οι οποίοι μετά τη διάλυσή τους με ισοπροπανόλη δίνουν ένα σκούρο μπλε/μοβ χρώμα. Τα άλατα τετραζολίου δέχονται ηλεκτρόνια από τα οξειδωμένα υποστρώματα ή από κατάλληλα ένζυμα όπως NADH και NADPH (Σχήμα 4-4). Η συγκέντρωση των κρυστάλλων στα μιτοχόνδρια των κυττάρων είναι ευθέως ανάλογη της μεταβολικής δραστηριότητας των κυττάρων. Σχήμα 4-4: Αντίδραση αναγωγής του κίτρινου άλατος τετραζολίου (ΜΤΤ) σε μπλε/μοβ φορμαζάνη από το ένζυμο ρεδουκτάση. Υποδομές και Υλικά Επωαστικός κλίβανος με παροχή CO 2, Format Scientific Πλακίδια κυτταροκαλλιεργειών επίπεδου πυθμένα με 96 μικροφρεάτια, Μετρητής οπτικής απορρόφησης πλακιδίων ELISA, Dynatech, MR 5000 Ισοπροπανόλη, Sigma Κυτταρική σειρά Α431 (επιδερμικά επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα), ATCC

44 43 Θρεπτικό υλικό D-MEM HIGH GLUCOSE, PAA Laboratories {3-(4,5-dimethylthiazol -2 yl)-2.5-diphenyltetrazolium bromide}(μττ), Sigma RPMI χωρίς κόκκινο της φαινόλης, PAA Laboratories Διάλυμα ΜΤΤ 1 mg/ml σε RPMI χωρίς κόκκινο της φαινόλης. Μέθοδος Γίνεται σπορά κυττάρων Α431 ( κύτταρα / μικροφρεάτιο) σε πλακίδια κυτταροκαλλιεργειών με 96 μικροφρεάτια. Την επόμενη ημέρα αφαιρείται το εμπλουτισμένο θρεπτικό υλικό και προστίθενται σε φρέσκο θρεπτικό υλικό τα παράγωγα κιναζολινών σε διάφορες συγκεντρώσεις. Τα πλακίδια τοποθετούνται σε επωαστικό κλίβανο στους 37 ο C. Μετά από 72 ώρες αφαιρείται το θρεπτικό υλικό και προστίθενται 100 μl διαλύματος ΜΤΤ. Τα κύτταρα επωάζονται με το ΜΤΤ για 4 ώρες στους 37 ο C. Κατά τη διάρκεια της επώασης σχηματίζονται μπλε/μοβ κρύσταλλοι φορμαζάνης. Μετά το τέλος της επώασης απομακρύνεται το θρεπτικό υλικό και προστίθεται σε κάθε μικροφρεάτιο 100 μl ισοπροπανόλης. Ακολουθεί καλή ανάδευση ώστε να διαλυθούν οι μπλε/μοβ κρύσταλλοι και μετράται η απορρόφηση σε φωτόμετρο ELISA και μήκος κύματος 540 nm. Εικόνα 4-5: Πλακίδια κυτταροκαλλιεργειών 96 μικροφρεατίων όπου είναι ευδιάκριτος ο σχηματισμός μπλε/μοβ χρώματος μετά την διάλυση του ιζήματος της φορμαζάνης σε ισοπροπανόλη.

45 44 Καμπύλες Κυτταρικής Επιβίωσης (Clonogenic Assay) Γενικά Η ικανότητα των κυττάρων να δημιουργούν αποικίες (κλώνους) περιγράφτηκε κατά τη δεκαετία του 1950 και αποτέλεσε ένα βασικό εργαλείο για τη μελέτη των επιπτώσεων της ακτινοβολίας. Μεγάλο μέρος των πληροφοριών σχετικά με την επίδραση της ακτινοβολίας σε κύτταρα θηλαστικών, έχει ληφθεί από δοκιμασίες επιβίωσης κυττάρων και δημιουργίας αποικιών (κλώνων). Μολονότι αυτές οι δοκιμασίες αρχικά χρησιμοποιούνταν για τη μελέτη των συνεπειών της ακτινοβολίας στα κύτταρα, σήμερα χρησιμοποιούνται πλέον ευρέως για την εξέταση των επιδράσεων διάφορων παραγόντων με πιθανές εφαρμογές στην κλινική χρήση. Η δράση χημειοθεραπευτικών παραγόντων όπως η ετοποσίδη (etoposide) και η σισπλατίνη (cisplatin), καθώς και η δράση παραγόντων αντιαγγειογένεσης όπως η ενδοστατίνη (endostatin) και η αγγειοστατίνη (angiostatin) μελετήθηκαν στα καρκινικά κύτταρα με την βοήθεια των δοκιμασιών αυτών. Επίσης, με τις δοκιμασίες αυτές μελετώνται σήμερα συνδυασμοί παραγόντων για θεραπευτικούς σκοπούς - (ακτινοβολίες και χημειοθεραπευτικοί παράγοντες, κλπ). Στην παρούσα διπλωματική η μέθοδος αυτή χρησίμευσε για την μελέτη της δράσης του συνδυασμού της ιοντίζουσας ακτινοβολίας και των κιναζολινών. [41] Για διαφοροποιημένα κύτταρα τα οποία δεν πολλαπλασιάζονται, όπως τα νευρικά, τα μυϊκά ή τα εκκριτικά κύτταρα, ο κυτταρικός θάνατος μπορεί να οριστεί ως η απώλεια μιας συγκεκριμένης λειτουργίας. Για πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα, όπως τα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα ή τα κύτταρα που αναπτύσσονται σε καλλιέργεια, η απώλεια της ικανότητας για διαρκή πολλαπλασιασμό αποτελεί την απώλεια της αναπαραγωγικής ακεραιότητας. Επομένως, ένα κύτταρο που διατηρεί την ικανότητά του να συνθέτει πρωτεΐνες και DNA και να ολοκληρώνει μιά ή δύο μιτώσεις, αλλά δεν είναι σε θέση να διαιρεθεί και να παράγει ένα μεγάλο αριθμό απογόνων, θεωρείται νεκρό. Αυτό πολύ συχνά αναφέρεται ως απώλεια της αναπαραγωγικής ακεραιότητας ή αναπαραγωγικός θάνατος. Από την άλλη πλευρά, ένα κύτταρο που δεν είναι αναπαραγωγικά νεκρό και έχει διατηρήσει την ικανότητα να διαιρείται και να πολλαπλασιάζεται επ αόριστον, παράγοντας ένα κλώνο ή καλύτερα μια μεγάλη αποικία τότε αναφέρεται ως «κλωνογόνο». [25]

46 45 Η ικανότητα ενός και μόνου (single) κυττάρου να αναπτυχθεί σε μια μεγάλη αποικία που μπορεί να παρατηρηθεί με γυμνό μάτι είναι η απόδειξη ότι έχει διατηρήσει την ικανότητά του για αναπαραγωγή. Η απώλεια αυτής της ικανότητας ως συνάρτηση της δόσης της ακτινοβολίας ή της συγκέντρωσής του περιγράφεται από την καμπύλη κυτταρικής επιβιώσης. Μια τέτοια καμπύλη απεικονίζει τη σχέση μεταξύ της δόσης ακτινοβολίας και του ποσοστού των κυττάρων που επιβιώνουν. Μέθοδος Κύτταρα που προέρχονται από μια ενεργά αναπτυσσόμενη μητρική καλλιέργεια επαναιωρούνται με την βοήθεια της θρυψίνης. Ο αριθμός των κυττάρων ανά μονάδα όγκου του συγκεκριμένου εναιωρήματος μετράται με έναν αιματοκυτταρόμετρο. Συγκεκριμένος αριθμός κυττάρων σπέρνονται σε τριβλία κυτταροκαλλιεργειών. Εάν ένα από αυτά τα τριβλία επωαστεί για 1 έως 2 εβδομάδες χωρίς να ακτινοβοληθεί, τότε κάθε μονό κύτταρο θα διαιρεθεί πολλές φορές και θα σχηματίσει μια αποικία που θα είναι εύκολα ορατή με γυμνό μάτι, ειδικά αν είναι και βαμμένη [Εικόνα 4-6]. Όλα τα κύτταρα που περιλαμβάνονται σε κάθε αποικία είναι οι απόγονοι ενός και μόνου (single) προγόνου. Για συγκεκριμένα 100 κύτταρα που εμβολιάστηκαν μέσα στο μη ακτινοβολημένο τριβλίο, ο αριθμός των μετρούμενων αποικιών ιδανικά, θα πρέπει να είναι 100, αλλά σπάνια είναι τόσα για διάφορους λόγους, συμπεριλαμβάνοντας το μη βέλτιστο μέσο ανάπτυξης, τα σφάλματα κατά την καταμέτρηση του κυτταρικού εναιωρήματος, τα λάθη στην καταμέτρηση του αρχικού αριθμού των επιστρωμένων κυττάρων, την απώλεια των κυττάρων λόγω θρυψινοποίησης καθώς και λάθη γενικού χειρισμού και άλλα. Ο όρος αποδόση τριβλίου [plating efficiency - ΡΕ] υποδεικνύει το ποσοστό των σπαρμένων κυττάρων που αναπτύσσονται σε αποικίες στο μη ακτινοβολημένο τριβλίο. Αν μετρηθούν για παράδειγμα 30 αποικίες σε ένα τέτοιο τριβλίο όπου έχουν σπαρθεί 100 κύτταρα, το ΡΕ είναι 30%. [41] PE= (ο αριθμός των μετρούμενων αποικιών/ο αριθμός των σπαρμένων κυττάρων)*100 Όταν παράλληλα ένα από τα υπόλοιπα τριβλία εμβολιαστεί με κύτταρα τα οποία εκτίθονται για παράδειγμα σε μία δόση των 8 Gy από ακτίνες Χ και επωαστεί για 1 έως 2 εβδομάδες πριν τα κύτταρα σταθεροποιηθούν και χρωματιστούν, τότε μπορούν να παρατηρηθούν τα ακόλουθα: 1. ορισμένα από τα σπαρμένα μεμονωμένα κύτταρα εξακολουθούν να είναι μεμονωμένα και να μην έχουν διαιρεθεί,

47 46 2. μερικά κύτταρα έχουν καταφέρει να ολοκληρώσουν μια ή δύο διαιρέσεις σχηματίζοντας μια μικρή αποικία και, 3. μερικά κύτταρα έχουν εξελιχθεί σε μεγάλες αποικίες που διαφέρουν ελάχιστα από το μη ακτινοβολημένο δείγμα, αν και μπορούν να διαφέρουν περισσότερο ως προς το μέγεθος. Αυτά τα κύτταρα διαπιστώνονται οτι έχουν επιζήσει, δεδομένου ότι έχουν διατηρήσει την αναπαραγωγική τους ακεραιότητα. Εικόνα 4-6: Αποικίες που ελήφθησαν απο καλλιεργημένα in vitro κύτταρα κινέζικου χάμστερ. [Α] Σε αυτό το μη ακτινοβολημένο τριβλίο 100 κύτταρα σπάρθηκαν και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 7 ημέρες πριν χρωματιστούν. Υπάρχουν 70 αποικίες. Επομένως η αποδόση τριβλίου (the plating efficiency) είναι 70/100, ή 70%. [Β] Δύο χιλιάδες κύτταρα σπάρθηκαν, στη συνέχεια εκτέθηκαν σε 800 rads [8 Gy] από ακτίνες-χ. Υπάρχουν 32 αποικίες στο τριβλίο. Έτσι ορίζεται ώς κλάσμα επιβίωσης = καταμετρημένες αποικίες /σπαρμένα κύτταρα * [PE/100] = =32/(2000* 0.70)=0.023 [25] Στο παράδειγμα που φαίνεται στην εικόνα 4-6Β, κύτταρα σπάρθηκαν στο τριβλίο εκτιθέμενα σε 8 Gy. Δεδομένου ότι η αποδόση τριβλίου είναι 70%, από καλλιεργούμενα κύτταρα θα είχαν μεγαλώσει σε αποικίες αν το τριβλίο δεν είχε ακτινοβοληθεί. Στην πραγματικότητα, υπάρχουν μόνο 32 αποικίες επί του τριβλίου στην εικόνα 4-6Β. Το κλάσμα των κυττάρων που επιζούν της δόσης των ακτίνων Χ είναι επομένως 32 /1400 = 0,023.

48 47 Σε γενικές γραμμές, το Kλάσμα Eπιβίωσης (Survival Fraction, SF) δίνεται από: Κλάσμα επιβίωσης = καταμετρώμενες αποικίες / (σπαρμένα κύτταρα * (PE/100)). Αυτή η διαδικασία επαναλαμβάνεται έτσι ώστε οι εκτιμήσεις της επιβίωσης να λαμβάνονται για ένα εύρος δόσεων. Ο αριθμός των σπαρμένων κυττάρων ανά τριβλίο ρυθμίζεται έτσι ώστε να έχουμε έναν μετρήσιμο αριθμό αποικιών. Πολύ λίγες αποικίες θα μείωναν τη στατιστική σημαντικότητα, ενώ πάρα πολλές δεν θα μπορούσαν να μετρηθούν με ακρίβεια επειδή θα έτειναν να συγχωνευθούν η μία με την άλλη. Η τεχνική απεικονίζεται στην Εικόνα 4-7. Εικόνα 4-7: Η τεχνική καλλιέργειας κυττάρων που χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργήσει μια καμπύλη κυτταρικής επιβιώσης. Ο αριθμός των αρχικά εμβολιασμένων κυττάρων ανά τριβλίο ποικίλλει ανάλογα με την δόση έτσι ώστε ο αριθμός των αποικιών που επιβιώνουν να είναι εύκολα μετρήσιμος. [25]

49 48 Εικόνα 4-8: Clonogenic Assay σε πλακίδιο έξι φρεατίων εικονίζονται ευδιάκριτα οι αποικίες. Το σχήμα της καμπύλης επιβίωσης: Οι καμπύλες επιβίωσης για κύτταρα θηλαστικών συνήθως παρουσιάζονται με τις μορφές που παρατηρούνται στο σχήμα 4-5, με τη δόση σχεδιασμένη σε γραμμική κλίμακα και το κλάσμα επιβίωσης σε λογαριθμική κλίμακα. Σε ιοντίζουσες ακτινοβολίες χαμηλής LET, όπως οι ακτίνες Χ ή ακτίνες γ, η καμπύλη επιβίωσης ξεκινά από το λογαριθμικό άξονα με περιορισμένη αρχική κλίση. Κι αυτό γιατί το κλάσμα επιβίωσης είναι μια εκθετική συνάρτηση της δόσης. Σε υψηλότερες δόσεις, όμως η καμπύλη κάμπτεται. Αυτή η κάμψη της καμπύλης εκτείνεται σε ένα δοσολογικό εύρος των μερικών εκατοντάδων rads. Σε πολύ υψηλές δόσεις η καμπύλη επιβίωσης τείνει συχνά να ξαναγίνει γραμμική. Το κλάσμα επιβίωσης ξαναγίνεται εκθετική συνάρτηση της δόσης. [25] Σχήμα 4-5: Το σχήμα καμπύλης επιβίωσης για κύτταρα θηλαστικών εκτιθέμενα σε ακτινοβολία. Αντίθετα, για τις ιοντίζουσες ακτινοβολίες υψηλής LET όπως τα σωματίδια-α ή τα νετρόνια χαμηλής ενέργειας, η καμπύλη κυτταρικής επιβίωσης είναι μια ευθεία γραμμή κατά την οποία η επιβίωση περιγράφεται ως εκθετική συνάρτηση της δόσης [Σχήμα 4-5].