ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

Transcript

1 Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Σχολή Θετικών Επιστημών Τμήμα Βιολογίας Τομέας Ζωολογίας Εργαστήριο Φυσιολογίας Ζώων ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Μελέτη των σηματοδοτικών μονοπατιών που εμπλέκονται στις ανοσολογικές αποκρίσεις του μυδιού Mytilus galloprovincialis. Καθιέρωση νέων βιομαρτύρων περιβαλλοντικής ρύπανσης και μόλυνσης Κουτσογιαννάκη Σοφία Βιολόγος, M.Sc ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2013

2 Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Σχολή Θετικών Επιστημών Τμήμα Βιολογίας Τομέας Ζωολογίας Εργαστήριο Φυσιολογίας Ζώων ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Μελέτη των σηματοδοτικών μονοπατιών που εμπλέκονται στις ανοσολογικές αποκρίσεις του μυδιού Mytilus galloprovincialis. Καθιέρωση νέων βιομαρτύρων περιβαλλοντικής ρύπανσης και μόλυνσης Κουτσογιαννάκη Σοφία Βιολόγος, M.Sc ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2013

3 Aristotle University of Thessaloniki Faculty of Science School of Biology Department of Zoology Laboratory of Animal Physiology Doctorate Thesis Signal transduction pathways involved in immune responses of mussel Mytilus galloprovincialis. Establishment of new biomarkers for environmental contamination Koutsogiannaki Sophia Biologist, M.Sc THESSALONIKI 2013

4 - H παρούσα έρευνα έχει συγχρηματοδοτηθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο - ΕΚΤ) και από εθνικούς πόρους μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» του Εθνικού Στρατηγικού Πλαισίου Αναφοράς (ΕΣΠΑ) Ερευνητικό Χρηματοδοτούμενο Έργο: Ηράκλειτος ΙΙ. Επένδυση στην κοινωνία της γνώσης μέσω του Ευρωπαϊκού Κοινωνικού Ταμείου.

5 Επιβλέπουσα Καθηγήτρια Καλογιάννη-Δημητριάδη Μάρθα (Καθηγήτρια Τμήματος Βιολογίας, ΑΠΘ) Τριμελής Συμβουλευτική Επιτροπή Καλογιάννη-Δημητριάδη Μάρθα (Καθηγήτρια Τμήματος Βιολογίας, ΑΠΘ) Δημητριάδης Κ. Βασίλειος (Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας, ΑΠΘ) Νταϊλιάνης Στέφανος (Επίκουρος Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πάτρας) Επταμελής Εξεταστική Επιτροπή Καλογιάννη-Δημητριάδη Μάρθα (Καθηγήτρια Τμήματος Βιολογίας, ΑΠΘ) Δημητριάδης Κ. Βασίλειος (Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας, ΑΠΘ) Νταϊλιάνης Στέφανος (Επίκουρος Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πάτρας) Μιχαηλίδης Βασίλειος (Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας, ΑΠΘ) Παπαδόπουλος Αθανάσιος (Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας, ΑΠΘ) Κουβάτση Αναστασία (Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τμήματος Βιολογίας, ΑΠΘ) Κολιάκος Γεώργιος (Καθηγητής Τμήματος Ιατρικής, ΑΠΘ)

6 Η έγκριση της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής από το τμήμα Βιολογίας της Σχολής Θετικών Επιστημών του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των απόψεων του συγγραφέα Ν. 5343/1932, άρθρο 202

7 Πρόλογος Η εκπόνηση της παρούσας διδακτορικής διατριβής ξεκίνησε τον Φεβρουάριο του 2009 στο Εργαστήριο Φυσιολογίας Ζώων, του Τμήματος Βιολογίας, του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, με επιβλέπουσα την καθηγήτρια του Τμήματος Βιολογίας του ΑΠΘ κα. Μάρθα Καλογιάννη. Ήταν μεγάλη τιμή και ιδιαίτερη χαρά για εμένα να βρίσκομαι στο εργαστήριο της κα. Καλογιάννη τα τελευταία 10 χρόνια και να δουλεύω δίπλα της. Μετά από τόσα χρόνια στο εργαστήριό της, είναι δύσκολο να βρω τις κατάλληλες λέξεις για να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου. Την ευχαριστώ ιδιαιτέρως για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε όλα αυτά τα χρόνια, για την συνεχή υποστήριξή της και την αμέριστη βοήθειά της. Πιστεύω ότι είναι παραπάνω από αυτονόητο, ότι χωρίς την αρωγή της και την ακούραστη επίβλεψή της, αυτή η διατριβή δεν θα είχε ολοκληρωθεί. Την ευχαριστώ πολύ για όλες τις ευκαιρίες που μου έδωσε και για την πολύτιμη καθοδήγησή της σε όλη τη διάρκεια των προπτυχιακών και μεταπτυχιακών σπουδών μου. Θα ήθελα επίσης, να ευχαριστήσω θερμά τον καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας, του ΑΠΘ κ. Βασίλειο Δημητριάδη για την καθοδήγηση καθ όλη την διάρκεια διεκπεραίωσης της παρούσας διατριβής, για την βοήθεια και τις συμβουλές του, καθώς και για τη συνεχή υποστήριξή του όλα αυτά τα χρόνια. Πολλά ευχαριστώ και στον Επίκουρο καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών κ. Στέφανο Νταϊλιάνη, για την πολύτιμη βοήθειά του και την καταλυτική συμβολή του στην διεκπεραίωση της παρούσας διατριβής. Τον ευχαριστώ που ήταν πάντα πρόθυμος, όποτε και αν ζήτησα την βοήθειά του. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τον Καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας του ΑΠΘ κ. Βασίλειο Μιχαηλίδη και τον Αναπληρωτή Καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας του ΑΠΘ κ. Αθανάσιο Παπαδόπουλο όχι μόνο για τις συμβουλές και την βοήθειά τους στην ολοκλήρωση της συγγραφής της παρούσας διατριβής αλλά και για την υποστήριξη και την πολύτιμη βοήθειά τους όλα αυτά τα χρόνια που ήμουν στο Εργαστήριο Φυσιολογίας Ζώων. Επίσης, ευχαριστώ θερμά την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια του Τμήματος Βιολογίας του ΑΠΘ κα. Αναστασία Κουβάτση και τον Καθηγητή της Ιατρικής σχολής του ΑΠΘ κ. Γεώργιο Κολιάκο για τις παρατηρήσεις και τις συμβουλές τους για την ολοκλήρωση της παρούσας διδακτορικής διατριβής.

8 Πολλά ευχαριστώ σε όλα τα άτομα του Εργαστηρίου Φυσιολογίας Ζώων για την συνεργασία και την βοήθειά τους. Θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαιτέρως τον Μετα-διδάκτορα του Τμήματος Βιολογίας Κωνσταντίνο Φειδάντση και τις υποψήφιες Διδάκτορες του Τμήματος Βιολογίας Ελευθερία Γαλάτου και Ελευθερία Μπαρλάκα για όλη την συμπαράσταση, την βοήθεια και την φιλία τους, που ήταν και θα είναι για εμένα υπερ-πολύτιμες. Ιδιαίτερες ευχαριστίες και στις Διδάκτορες του Τμήματος Βιολογίας Έλενα Ραφτοπούλου και Κατερίνα Ίτζιου για την υποστήριξη και την βοήθειά τους όποτε και αν την χρειάστηκα. Πολλά πολλά ευχαριστώ! Φυσικά, ευχαριστώ ιδιαιτέρως θερμά όλους τους φοιτητές του εργαστηρίου της κα. Καλογιάννη, με τους οποίους συνεργάστηκα όλα αυτά τα χρόνια. Καθένας τους ξεχωριστά συντέλεσε στην ολοκλήρωση της παρούσας διατριβής και συνέβαλε σημαντικά στην εξέλιξή μου. Για τους πολύ δικούς μου ανθρώπους και για την οικογένειά μου δεν υπάρχουν λέξεις

9 Περίληψη Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να μελετηθούν οι μηχανισμοί και τα μόρια επαγωγής τοξικότητας από περιβαλλοντικούς παράγοντες στο ανοσοποιητικό σύστημα του μυδιού M.galloprovincialis και να προταθούν νέοι βιομάρτυρες για τη βιοπαρακολούθηση των θαλάσσιων οικοσυστημάτων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η επίδραση μολυσματικών παραγόντων (E.coli TNF-α), νανοσωματιδίων (νανοσωματίδιο μαγνητίτη), πολυκυκλικών αρωματικών υδρογονανθράκων (PAHs) (μίγμα από ανθρακένιο, φαινανθρένιο και ναφθαλίνιο), φυτοφαρμάκων (λινδάνιο), βαρέων μετάλλων (κάδμιο) και ορμονών (17βοιστραδιόλη), που ήταν αντιπροσωπευτικοί των περισσοτέρων περιβαλλοντικών παραγόντων που απαντώνται στο θαλάσσιο περιβάλλον, ενεργοποίησαν το ανοσοποιητικό σύστημα των μυδιών, όπως παρατηρήθηκε από τη στατιστικά σημαντική αύξηση της φαγοκυτταρικής ικανότητας και συγκεκριμένα του βαθμού προσκόλλησης των αιμοκυττάρων στις πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας, λαμινίνη- 1, κολλαγόνο IV και οξειδωμένο κολλαγόνο IV. Επίσης, προκάλεσαν στατιστικά σημαντική αύξηση στα επίπεδα της α 2 υπομονάδας της ιντεγκρίνης, με εξαίρεση το E. coli. Για την περαιτέρω διερεύνηση των μηχανισμών επαγωγής τοξικότητας στα αιμοκύτταρα του μυδιού, επιλέχθηκαν οι ρύποι κάδμιο και 17β-οιστραδιόλη, που προκάλεσαν τη μεγαλύτερη απόκριση του ανοσοποιητικού συστήματος. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η επίδραση 5 μμ καδμίου ή 25 nm 17βοιστραδιόλης σε απομονωμένα αιμοκύτταρα για 30 λεπτά προκάλεσε οξειδωτικό stress στα αιμοκύτταρα του μυδιού, το οποίο εκφράστηκε με στατιστικά σημαντική αύξηση στα ενδοκυτταρικά επίπεδα των ROS, στατιστικά σημαντικά αυξημένα επίπεδα βλάβης του γενετικού υλικού, οξείδωσης των πρωτεϊνών και υπεροξείδωσης των λιπιδίων καθώς και με ενεργοποίηση των αμυντικών μηχανισμών των αιμοκυττάρων, η οποία εκδηλώθηκε με στατιστικά σημαντική επαγωγή της μεταγραφικής δραστηριότητας των γονιδίων που κωδικοποιούν τα αντιοξειδωτικά ένζυμα καταλάση (CAT), δισμουτάση του σουπεροξειδίου (SOD) και τρανσφεράση S της γλουταθειόνης (GST). Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής έδειξαν επίσης, ότι η επίδραση 5 μμ καδμίου ή 25 nm 17β-οιστραδιόλης σε απομονωμένα αιμοκύτταρα για 4 ώρες προκάλεσε σημαντική επαγωγή της μεταγραφικής δραστηριότητας των γονιδίων της CAT, της SOD και της GST, όπως φάνηκε από τα αυξημένα επίπεδα έκφρασης του

10 mrna των τριών αντιοξειδωτικών ενζύμων CAT, SOD, GST, στις περισσότερες περιπτώσεις που εξετάστηκαν. Έκθεση μυδιών M. galloprovincialis σε 0,3 μμ καδμίου ή σε 50 nm 17βοιστραδιόλης για 1, 3 και 7 ημέρες προκάλεσε στατιστικά σημαντική αύξηση στα επίπεδα παραγωγής ROS, στατιστικά σημαντική αύξηση στα επίπεδα απόπτωσης των αιμοκυττάρων και στατιστικά σημαντική μείωση στα επίπεδα έκφρασης του mrna των τριών αντιοξειδωτικών ενζύμων CAT, SOD, GST. Επιπρόσθετα, τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής προτείνουν την συμμετοχή της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + (NHE-1), όλων των ισομορφών της πρωτεϊνικής κινάσης C (PKC), των ισομορφών της PKC που εξαρτώνται από Ca 2+, της κινάσης της φωσφατοδυλικής ινοσιτόλης (PI3-Κ) και της κινάσης του αμινοτελικού άκρου της c-jun (JNK), στους σηματοδοτικούς μηχανισμούς, που σχετίζονται με την επαγωγή τοξικότητας από περιβαλλοντικούς ρύπους. Η συμμετοχή της NAD(P)H οξειδάσης, της συνθάσης του οξειδίου του αζώτου (NO) και των δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) στους σηματοδοτικούς μηχανισμούς που επάγονται, προτείνουν την επαγωγή της «αναπνευστικής έκρηξης» στα αιμοκύτταρα του μυδιού, ως απόκριση στους περιβαλλοντικούς ρύπους. Αυξημένα ενδοκυτταρικά επίπεδα κυκλικής 3-5 -μονοφωσφορικής αδενοσίνης (camp) φάνηκε να λειτουργούν προστατευτικά για το κύτταρο έναντι του περιβαλλοντικού στρες. Η αυξημένη προσκόλληση στις πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας, η αύξηση των επιπέδων της α 2 υπομονάδας της ιντεγκρίνης, τα αυξημένα επίπεδα των ROS, η βλάβη του DNA, η οξείδωση των πρωτεϊνών, η υπεροξείδωση των λιπιδίων και η απόπτωση, καθώς και οι τροποποιήσεις στα επίπεδα έκφρασης του mrna των αντιοξειδωτικών ενζύμων CAT, SOD και GST στα αιμοκύτταρα του μυδιού Mytilus galloprovincialis προτείνονται ως κατάλληλοι βιομάρτυρες περιβαλλοντικής ρύπανσης ή/και μόλυνσης, ενώ η ταυτόχρονη χρήση τους θα μπορούσε να αποτελέσει μία νέα πολύ-παραμετρική προσέγγιση για την έγκαιρη διάγνωση πρώιμων σταδίων της θαλάσσιας ρύπανσης ή/και μόλυνσης. Τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής 1) ανέδειξαν για πρώτη φορά τη σημασία των αλληλεπιδράσεων των αιμοκυττάρων του μυδιού M. galloprovincialis και των πρωτεϊνών της εξωκυττάριας ουσίας μετά την επίδραση περιβαλλοντικών ρύπων και μολυσματικών παραγόντων. 2) Έδειξαν την αύξηση των επιπέδων του υποδοχέα της ιντεγκρίνης, μετά την επίδραση ρύπων και μολυσματικών παραγόντων. 3) Ανέδειξαν την επαγωγή της «αναπνευστικής έκρηξης» από

11 επιλεγμένους ρύπους στα αιμοκύτταρα. 4) Ανέδειξαν τη σημασία των ελευθέρων ριζών στην επαγωγή βλάβης του γενετικού υλικού των αιμοκυττάρων, στην οξείδωση των πρωτεϊνών, στην υπεροξείδωση των λιπιδίων και στην απόπτωση. 5) Έδειξαν την τροποποίηση της μεταγραφικής δραστηριότητας των γονιδίων αντιοξειδωτικών ενζύμων, μετά την επίδραση των επιλεγμένων ρύπων. 6) Πρότειναν ένα βιολογικό μοντέλο μετά την επίδραση των επιλεγμένων ρύπων και εμπλούτισαν τις γνώσεις για τους σηματοδοτικούς μηχανισμούς, που υιοθετούν τα αιμοκύτταρα ως απόκριση στην επίδραση περιβαλλοντικών παραγόντων. 7) Έδωσαν χρήσιμα στοιχεία για την περαιτέρω κατανόηση των μηχανισμών επαγωγής τοξικότητας στους θαλάσσιους οργανισμούς και 8) πρότειναν νέους βιομάρτυρες ρύπανσης και μόλυνσης, για τη βιοπαρακολούθηση των θαλάσσιων οικοσυστημάτων.

12 Abstract The main objective of the present doctorate thesis was to study the mechanisms and the molecules, which mediate environmentally- induced toxicity in M.galloprovincialis immune system and to suggest new biomarkers for biomonitoring of marine ecosystems. The results of the present study showed that treatment with infectious factors (E.coli TNF-α), nanoparticles (nanoparticle of magnetide), polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) (mixture of anthracene, phenanthrene, napthalin), pesticides (lindane), heavy metals (cadmium) and hormones (17β-estradiol), representing the main categories of environmental stressors found in marine environment, activated the immune system of mussels, as observed through the statistically significant increase in phagocytic activity and specifically in the number of adherent hemocytes to extracellular matrix (ECM) proteins laminin-1, collagen-iv and oxidized collagen- IV. In addition, they caused statistically significant elevation in a 2 integrin subunit levels, except for E. coli. Subsequently, cadmium and 17β-estradiol were selected, since they triggered the most significant response of the immune system, for further investigation of the mechanisms which mediate toxicity in hemocytes of mussels. The results showed that treatment of isolated hemocytes with either 5 μμ of cadmium or 25 nm of 17β-estradiol for 30 min resulted in oxidative stress, exemplified by statistically increase in intracellular ROS levels, statistically significant levels of DNA damage, of protein oxidation and of lipids peroxidation, as well as significant up-regulation of the genes encoding for the antioxidant enzymes catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and glutathione-s transferase (GST). Furthermore, the results of the present study showed that treatment of isolated hemocytes with either 5 μμ of cadmium or 25 nm of 17β-estradiol for 4 hr caused increased mrna expression levels of the three antioxidant enzymes CAT, SOD and GST in most of the cases tested. Exposure of mussels M. galloprovincialis to either 0.3 μμ of cadmium or 50 nm 17β-estradiol for 1, 3 and 7 days induced statistically significant increase in ROS levels, statistically significant increase in apoptotic levels of hemocytes and statistically significant decrease in mrna expression levels of the three antioxidant enzymes CAT, SOD, GST.

13 Additionally, the results of the present study suggest the involvement of Na + /H + exchanger (NHE-1), all isoforms of protein kinase C (PKC), Ca 2+ -dependent PKC isoforms, phosphatidyl-inositol 3-kinase (PI3-Κ) and c-jun N-terminal kinase (JNK), in signal transduction mechanisms related to environmentally-induced toxicity. NAD(P)H oxidase, nitric oxide (NO) synthase and reactive oxygen species (ROS) were also shown to be involved in these signaling pathways, suggesting the induction of respiratory burst in mussel hemocytes, as response to environmental stress. Increased intracellular levels of cyclic adenosine monophosphate (camp) are protective against environmental stress. The increase in hemocyte adhesion to ECM proteins, in α 2 integrin subunit levels, in ROS levels, in DNA damage, in protein oxidation, in lipid peroxidation, as well as the increased mrna expression levels of the antioxidant enzymes CAT, SOD και GST in Mytilus galloprovincialis hemocytes are suggested as suitable biomarkers of environmental contamination, while their simultaneous use could be suggested as a multi-biomarker approach for an early-warning system in marine contamination. The results of the present doctorate thesis 1) revealed for the first time the significance of the interactions between M. galloprovincialis hemocytes and extracellular matrix proteins, after environmental pollutants and infectious factors effect. 2) Showed an increase in integrin receptor levels, after environmental stressors effect. 3) Suggested the induction of respiratory burst by the selective environmental pollutants in mussel hemocytes. 4) Revealed the significance of ROS in DNA damge of hemocytes, in protein oxidation, in lipid peroxidation and in apoptosis. 5) Suggested the modulation in transcriptional activity of genes encoding for antioxidant enzymes. 6) Suggested a biological model after environmental pollutants effect and enriched the field of signaling mechanisms, adapted by hemocytes as a response to environmental stress. 7) Gave important information for further elucidation of the mechanisms that induce toxicity in marine organisms and 8) suggested new biomarkers for biomonitoring of marine ecosystems.

14 Περιεχόμενα 1.Εισαγωγή Ρύπανση των υδάτων Βιοπαρακολούθηση θαλάσσιων οικοσυστημάτων με χρήση βιομαρτύρων Τα μύδια ως κατάλληλοι βιο-ενδείκτες οργανισμοί Ανοσοποιητικό σύστημα μυδιών Προσκόλληση αιμοκυττάρων σε πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας Εξωκυττάρια ουσία (Extracellular Matrix, ECM)- Κολλαγόνο- Λαμινίνη Ιντεγκρίνες Δραστικές μορφές Οξυγόνου (ROS Οξειδωτική καταπόνηση (Οξειδωτικό στρες) Βιομάρτυρες οξειδωτικού στρες στα αιμοκύτταρα του μυδιού Επίπεδα ROS Οξείδωση πρωτεϊνών Υπεροξείδωση λιπιδίων Απώλεια της δομικής ακεραιότητας του γενετικού υλικού (DNA damage) Απόπτωση Αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί Επίδραση περιβαλλοντικών παραγόντων Escerichia coli Ογκονεκρωτικός παράγοντας-α (Tumor-Necrosis Factor-α, TNF-α) Νανοσωματίδιο μαγνητίτη (μικτό οξείδιο δισθενούς και τρισθενούς σιδήρου) Πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες (PAHs) Λινδάνιο ή γ-εξαχλωροκυκλοεξάνιο Κάδμιο (Cd) β-οιστραδιόλη (Ε 2 ) Ενδοκρινικοί Αποδιοργανωτές (Endrocrine disrupting compounds, EDCs) Σηματοδοτικά μονοπάτια Σηματοδοτικά μόρια που μελετήθηκαν Αντλία ανταλλαγής ιόντων Na + /H +, ΝΗΕ (Na + /H + exchanger) Πρωτεϊνική κινάση C, PKC (Protein kinace C) Κινάση της 3-φωσφατοδυλοινοσιτόλης, PI3K (Phosphatidyl-inositide 3-kinase) Κινάση του αμινοτελικού άκρου του c-jun, JNK (c-jun N-terminal kinase)...35

15 NADPH (nicotamide adenine dinucleotide hydrophosphate) οξειδάση Συνθετάση του οξειδίου του αζώτου (ΝΟ συνθάση) ,5-κυκλική μονό-φωσφορική αδενοσίνη, camp (cyclic adenosinemonophosphate) 39 Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής Υλικά και Μέθοδοι Συλλογή μυδιών και διατήρηση αυτών σε εργαστηριακές συνθήκες (εγκλιματισμός) Απομόνωση αιμοκυττάρων Πειραματική διαδικασία Προσδιορισμός προσκόλλησης των αιμοκυττάρων σε λαμινίνη-1, κολλαγόνο τύπου IV και οξειδωμένο κολλαγόνο τύπου ΙV Προσδιορισμός προσκόλλησης αιμοκυττάρων σε κολλαγόνο τύπου IV και οξειδωμένο κολλαγόνο τύπου ΙV παρουσία του ειδικού μονοκλωνικού αντισώματος της α 2 υπομονάδας των ιντεγκρινών (CD49b) Μέθοδος Οξείδωσης Κολλαγόνου Προσδιορισμός των επιπέδων της α 2 υπομονάδας των ιντεγκρινών Προσδιορισμός των επιπέδων του ανιόντος του σουπεροξειδίου (Ο - 2 ) με τη χρήση της φθορίζουσας ουσίας διϋδροαιθίδιο (dihydroethidium, DHE) Προσδιορισμός των επιπέδων των δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) με τη χρήση της ουσίας DCFH-DA με κυτταρομετρία ροής Προσδιορισμός των επιπέδων απόπτωσης με κυτταρομετρία ροής Ποσοτικός προσδιορισμός των επιπέδων καρβονυλίωσης των πρωτεϊνών στα αιμοκύτταρα με την ανοσοενζυμική μέθοδο ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Προσδιορισμός των επιπέδων υπεροξείδωσης των λιπιδίων Εκτίμηση της βλάβης του γενετικού υλικού με τη χρήση της μεθόδου των κομητών/ Ηλεκτροφόρηση (Comet assay/ Alkaline single-cell gel electrophoresis) Προσδιορισμός των επιπέδων γλουταθειονυλίωσης των πρωτεϊνών σε απομονωμένα αιμοκύτταρα του μυδιού Mytilus galloprovincialis με ανοσο-αποτύπωση πρωτεϊνών κατά Western (Western Blotting)

16 2.14. Προσδιορισμός των επιπέδων έκφρασης του mrna των αντιοξειδωτικών γονιδίων του μυδιού καταλάση (CAT), δισμουτάση του σουπεροξειδίου (SOD) και τρανσφεράση-s- της γλουταθειόνης (GST) Σταθερότητα της λυσοσωμικής μεμβράνης των αιμοκύτταρων (Κατακράτηση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό) (NRR) Προσδιορισμός της συγκέντρωσης μέσης απόκρισης [Half maximal (50%) Effective Concentration, EC50] καδμίου και 17β-οιστραδιόλης Μέτρηση της συνολικής ποσότητας της πρωτεΐνης με τη χρήση Coomasie Plus-200 (Μέθοδος Bradford) Προσδιορισμός αριθμού κυττάρων Έλεγχος βιωσιμότητας Στατιστική ανάλυση Αποτελέσματα Προσκόλληση αιμοκυττάρων στη λαμινίνη 1, στο κολλαγόνο IV ή στο οξειδωμένο κολλαγόνο IV, μετά από την επίδραση μολυσματικών παραγόντων (E. coli, TNF-α), νανοσωματιδίων (νανοσωματίδιο μαγνητίτη), πολυκυκλικών αρωματικών υδρογονανθράκων (PAHs) (μίγμα από ανθρακένιο, φαινανθρένιο και ναφθαλίνιο), φυτοφαρμάκων (λινδάνιο), βαρέων μετάλλων (κάδμιο) και ορμονών (17β-οιστραδιόλη), σε απομονωμένα αιμοκύτταρα του μυδιού Mytilus galloprovincialis Προσδιορισμός των επιπέδων της α 2 υπομονάδας των ιντεγκρινών, μετά από την επίδραση μολυσματικών παραγόντων (E. coli, TNF-α), νανοσωματιδίων (νανοσωματίδιο μαγνητίτη), πολυκυκλικών αρωματικών υδρογονανθράκων (PAHs) (μίγμα από ανθρακένιο, φαινανθρένιο και ναφθαλίνιο), φυτοφαρμάκων (λινδάνιο), βαρέων μετάλλων (κάδμιο) και ορμονών (17β-οιστραδιόλη), σε απομονωμένα αιμοκύτταρα του μυδιού Mytilus galloprovincialis Σηματοδοτικά μόρια που εμπλέκονται στην προσκόλληση των αιμοκυττάρων του μυδιού Mytilus galloprovincialis στη λαμινίνη 1, στο κολλαγόνο IV ή στο οξειδωμένο κολλαγόνο IV, μετά από την επίδραση καδμίου (5 μm) ή 17β-οιστραδιόλης (25 nm) για 30 λεπτά Σηματοδοτικά μόρια που εμπλέκονται στην αύξηση των επιπέδων της α 2 υπομονάδας των ιντεγκρινών στην επιφάνεια των αιμοκυττάρων του μυδιού Mytilus galloprovincialis,

17 μετά από την επίδραση καδμίου (5 μm) ή 17β-οιστραδιόλης (25 nm) για 30 λεπτά Προσδιορισμός των επιπέδων ROS και. O 2 - μετά από την επίδραση καδμίου ή 17βοιστραδιόλης για 30 λεπτά, σε απομονωμένα αιμοκύτταρα του μυδιού Mytilus galloprovincialis. Διερεύνηση των πιθανών σηματοδοτικών μορίων που μετέχουν Προσδιορισμός του ποσοστού βλάβης του γενετικού υλικού (DNA damage) μετά από την επίδραση καδμίου ή 17β-οιστραδιόλης για 30 λεπτά, σε απομονωμένα αιμοκύτταρα του μυδιούν Mytilus galloprovincialis. Διερεύνηση των πιθανών σηματοδοτικών μορίων που μετέχουν Προσδιορισμός των επιπέδων υπεροξείδωσης των λιπιδίων μετά από την επίδραση καδμίου ή 17β-οιστραδιόλης για 30 λεπτά, σε απομονωμένα αιμοκύτταρα του μυδιού Mytilus galloprovincialis. Διερεύνηση των πιθανών σηματοδοτικών μορίων που μετέχουν Προσδιορισμός των επιπέδων καρβονυλίωσης των πρωτεϊνών μετά από την επίδραση καδμίου ή 17β-οιστραδιόλης, σε απομονωμένα αιμοκύτταρα του μυδιούν Mytilus galloprovincialis. Διερεύνηση των πιθανών σηματοδοτικών μορίων που μετέχουν Προσδιορισμός των επιπέδων γλουταθειονυλίωσης των πρωτεϊνών μετά από την επίδραση καδμίου ή 17β-οιστραδιόλης, σε απομονωμένα αιμοκύτταρα του μυδιού Mytilus galloprovincialis. Διερεύνηση των πιθανών σηματοδοτικών μορίων που μετέχουν Προσδιορισμός των επιπέδων απόπτωσης μετά από την επίδραση καδμίου ή 17βοιστραδιόλης, σε απομονωμένα αιμοκύτταρα του μυδιού Mytilus galloprovincialis. Διερεύνηση των πιθανών σηματοδοτικών μορίων που μετέχουν Προσδιορισμός των επιπέδων έκφρασης του mrna των αντιοξειδωτικών ενζύμων καταλάση (CAT), δισμουτάση του σουπεροξειδίου (SOD) και τρανσφεράση S της γλουταθειόνης (GST) στα αιμοκύτταρα του μυδιού Mytilus galloprovincialis μετά από την επίδραση καδμίου

18 ή 17β-οιστραδιόλης σε απομονωμένα αιμοκύτταρα για 30 λεπτά. Διερεύνηση των πιθανών σηματοδοτικών μορίων που μετέχουν Προσδιορισμός των επιπέδων έκφρασης του mrna των αντιοξειδωτικών ενζύμων καταλάση (CAT), δισμουτάση του σουπεροξειδίου (SOD) και τρανσφεράση-s της γλουταθειόνης (GST) στα αιμοκύτταρα του μυδιού Mytilus galloprovincialis μετά από την επίδραση καδμίου ή 17β-οιστραδιόλης σε απομονωμένα αιμοκύτταρα για 4 ώρες. Διερεύνηση των πιθανών σηματοδοτικών μορίων που μετέχουν Προσδιορισμός της συγκέντρωσης μέσης απόκρισης (EC50) του καδμίου και της 17βοιστραδιόλης μετά από έκθεση μυδιών για 7 ημέρες σε διαφορετικές συγκεντρώσεις των δύο αυτών ρύπων Προσδιορισμός των επιπέδων έκφρασης του mrna των αντιοξειδωτικών ενζύμων καταλάση (CAT), δισμουτάση του σουπεροξειδίου (SOD) και τρανσφεράση-s της γουταθειόνης (GST) στα αιμοκύτταρα του μυδιού Mytilus galloprovincialis μετά από έκθεση ατόμων σε 0,3 μμ καδμίου ή 50 nm 17β-οιστραδιόλης για 0,1,3 και 7 ημέρες Προσδιορισμός των επιπέδων ROS στα αιμοκύτταρα του μυδιού Mytilus galloprovincialis μετά από έκθεση ατόμων σε 0,3 μμ καδμίου ή 50 nm 17β-οιστραδιόλης για 0,1,3 και 7 ημέρες Προσδιορισμός των επιπέδων απόπτωσης στα αιμοκύτταρα του μυδιού Mytilus galloprovincialis μετά από έκθεση ατόμων σε 0,3 μμ καδμίου ή 50 nm 17β-οιστραδιόλης για 0,1,3 και 7 ημέρες Ανάλυση συσχέτισης των αποτελεσμάτων, με σκοπό την πρόταση νέων βιομαρτύρων περιβαλλοντικής ρύπανσης και μόλυνσης (Correlation Analyses) Συζήτηση Επίδραση διαφόρων περιβαλλοντικών παραγόντων 1) στην προσκόλληση των αιμοκυττάρων του M. galloprovincialis στις πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας λαμινίνη-1, κολλαγόνο-iv και οξειδωμένο κολλαγόνο-iv, 2) στα επίπεδα της α 2 υπομονάδας των ιντεγκρινών στην επιφάνεια των αιμοκυττάρων

19 4.2. Μελέτη της επίδρασης καδμίου και 17β-οιστραδιόλης στις ανοσολογικές αποκρίσεις των μυδιών. Διερεύνηση των σηματοδοτικών μονοπατιών, μέσω των οποίων επάγονται οι επιδράσεις αυτές Συμμετοχή της ΝΗΕ στην επαγόμενη από το κάδμιο ή τη 17β-οιστραδιόλη προσκόλληση των αιμοκυττάρων του M. galloprovincialis στις πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας λαμινίνη-1, κολλαγόνο-iv και οξειδωμένο κολλαγόνο-iv Συμμετοχή κινασών στην επαγόμενη από το κάδμιο ή τη 17β-οιστραδιόλη προσκόλληση των αιμοκυττάρων του M. galloprovincialis στις πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας λαμινίνη-1, κολλαγόνο-iv και οξειδωμένο κολλαγόνο-iv Συμμετοχή των ROS στην επαγόμενη από το κάδμιο ή τη 17β-οιστραδιόλη προσκόλληση των αιμοκυττάρων του M. galloprovincialis στις πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας λαμινίνη-1, κολλαγόνο-iv και οξειδωμένο κολλαγόνο-iv Συμμετοχή του υποδοχέα της α 2 υπομονάδας της ιντεγκρίνης στην επαγόμενη από το κάδμιο ή τη 17β-οιστραδιόλη προσκόλληση των αιμοκυττάρων του M. galloprovincialis στις πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας λαμινίνη-1, κολλαγόνο-iv και οξειδωμένο κολλαγόνο- IV. Διερεύνηση του ρόλου της α 2 υπομονάδας στις επαγόμενες από το κάδμιο και την 17βοιστραδιόλη ανοσολογικές αποκρίσεις Σηματοδοτικά μόρια που συμμετέχουν στην επαγωγή της α 2 υπομονάδας της ιντεγκρίνης, μετά την επίδραση ρύπων Ο ρόλος του camp στις ανοσολογικές αποκρίσεις των μυδιών Μελέτη των μηχανισμών επαγωγής τοξικότητας από περιβαλλοντικούς ρύπους στο Mytilus galloprovincialis Επίδραση καδμίου ή 17β-οιστραδιόλης στα επίπεδα των ROS στα αιμοκύτταρα του μυδιού M. galloprovincialis Επίδραση καδμίου ή 17β-οιστραδιόλης στα επίπεδα βλάβης του γενετικού υλικού (DNA damage) στα αιμοκύτταρα του μυδιού M. galloprovincialis...147

20 Επίδραση καδμίου ή 17β-οιστραδιόλης στα επίπεδα οξείδωσης των πρωτεϊνών (καρβονυλίωση, γλουταθειονυλίωση) στα αιμοκύτταρα του μυδιού M. galloprovincialis Επίδραση καδμίου ή 17β-οιστραδιόλης στα επίπεδα υπεροξείδωσης των λιπιδίων στα αιμοκύτταρα του μυδιού M. galloprovincialis Επίδραση καδμίου ή 17β-οιστραδιόλης στα επίπεδα απόπτωσης των αιμοκυττάρων του μυδιού M. galloprovincialis Μελέτη των σηματοδοτικών μορίων, που συμμετέχουν στην επαγωγή οξειδωτικού στρες από τους περιβαλλοντικούς ρύπους κάδμιο και 17β-οιστραδιόλη Ο ρόλος του camp στην επαγωγή οξειδωτικού στρες από περιβαλλοντικούς ρύπους Επίδραση καδμίου ή 17β-οιστραδιόλης για 30 λεπτά στα επίπεδα έκφρασης του mrna των αντιοξειδωτικών ενζύμων καταλάση (CAT), δισμουτάση του σουπεροξειδίου (SOD) και τρανσφεράση-s της γλουταθειόνης (GST) στα αιμοκύτταρα του μυδιού M. galloprovincialis. Διερεύνηση των σηματοδοτικών μορίων που συμμετέχουν Επίδραση καδμίου ή 17β-οιστραδιόλης για 4 ώρες στα επίπεδα έκφρασης του mrna των αντιοξειδωτικών ενζύμων καταλάση (CAT), δισμουτάση του σουπεροξειδίου (SOD) και τρανσφεράση-s της γλουταθειόνης (GST) στα αιμοκύτταρα του μυδιού M. galloprovincialis. Διερεύνηση των σηματοδοτικών μορίων που συμμετέχουν Σηματοδοτικά μονοπάτια και μόρια, που συμμετέχουν στις επαγόμενες από περιβαλλοντικούς ρύπους ανοσολογικές αποκρίσεις στα αιμοκύτταρα του μυδιού M. galloprovincialis. Πρόταση βιολογικού μοντέλου EC50 καδμίου και 17β-οιστραδιόλης στην ΝRR Επίδραση καδμίου ή 17β-οιστραδιόλης στα επίπεδα ROS και απόπτωσης των αιμοκυττάρων μετά από έκθεση μυδιών M. galloprovincialis για 1, 3 και 7 ημέρες Επίδραση καδμίου ή 17β-οιστραδιόλης στα επίπεδα έκφρασης του mrna των αντιοξειδωτικών ενζύμων καταλάση (CAT), δισμουτάση του σουπεροξειδίου (SOD) και τρανσφεράση-s της γλουταθειόνης (GST) των αιμοκυττάρων μετά από έκθεση μυδιών M. galloprovincialis για 1, 3 και 7 ημέρες

21 4.13. Πρόταση νέων βιομαρτύρων και μεθοδολογιών βιοπαρακολούθησης των θαλάσσιων οικοσυστημάτων Συμπεράσματα Βιβλιογραφία Παράρτημα Υλικών και Μεθόδων.201 Παράρτημα Αποτελεσμάτων Παράρτημα Δημοσιεύσεων και ανακοινώσεων

22 1. Εισαγωγή 1.1 Ρύπανση των υδάτων Τα τρία τέταρτα της επιφάνειας του πλανήτη καλύπτονται από νερό, το μεγαλύτερο μέρος του οποίου είναι αλατούχο (θαλάσσια οικοσυστήματα). Οποιαδήποτε φυσική, χημική ή βιολογική αλλαγή στην ποιότητα του ύδατος, η οποία επηρεάζει αρνητικά τους ζωντανούς οργανισμούς ή καθιστά το νερό ακατάλληλο για χρήση, μπορεί να θεωρηθεί ως ρύπανση. Ως ρυπογόνοι παράγοντες ή ρύποι χαρακτηρίζονται τα υπολείμματα, υποπροϊόντα ή παραπροϊόντα της ανθρώπινης κυρίως δραστηριότητας, τα οποία ανιχνεύονται στο περιβάλλον και προκαλούν αλλαγές στην λειτουργία των οργανισμών. Στις κύριες κατηγορίες υδάτινων ρύπων περιλαμβάνονται παθογόνοι μικροοργανισμοί (βακτήρια, ιοί, πρωτόζωα, παράσιτα) που προέρχονται κυρίως από τις αποχετεύσεις και τα μη επεξεργασμένα λύματα, υδατοδιαλυτά ανόργανα συστατικά (οξέα, άλατα, μέταλλα), οργανικά συστατικά (πετρέλαιο, πλαστικό, φυτοφάρμακα, απορρυπαντικά), αδιάλυτα στερεά σωματίδια (νανοσωματίδια) και υδατοδιαλυτά ραδιενεργά ισότοπα (Miller, 1999). 1.2 Βιοπαρακολούθηση θαλάσσιων οικοσυστημάτων με χρήση βιομαρτύρων Τα θαλάσσια οικοσυστήματα και κυρίως αυτά που βρίσκονται κατά μήκος της ακτογραμμής, εκτίθενται καθημερινά σε πλήθος περιβαλλοντικών ρύπων (Adams, 2005). Η άμεση ή έμμεση απελευθέρωση των ρύπων αυτών στο θαλάσσιο περιβάλλον προκαλεί ή είναι δυνατόν να προκαλέσει επιπτώσεις στην ανθρώπινη υγεία, βλάβη στους ζωντανούς οργανισμούς και υποβιβασμό της ποιότητας των θαλάσσιων οικοσυστημάτων και των φυσικών πόρων (OSPAR Commission, 2000). Ένας συνεχώς αυξανόμενος αριθμός χημικών εισέρχονται στο θαλάσσιο περιβάλλον, που προέρχονται κυρίως από αστικά και βιομηχανικά απόβλητα, έκπλυση γεωργικών εδαφών, λύματα υπονόμων, εξόρυξη πετρελαίου, φυσικού αερίου και ορυκτών, τουρισμό, υδατοκαλλιέργειες, αλιεία και θαλάσσιες μεταφορές (ΕΕΑ 1999, GESAMP, 2001). 1

23 Η διαδικασία αποτίμησης των επιπτώσεων της ρύπανσης των θαλάσσιων οικοσυστημάτων στους ζωντανούς οργανισμούς που διαβιούν σε αυτά, ονομάζεται βιοπαρακολούθηση (biomonitoring). Οι οργανισμοί, που χρησιμοποιούνται για την διεξαγωγή τέτοιων μελετών ονομάζονται βιο-ενδείκτες (bioindicators). Η παρατήρηση και μέτρηση κάθε μεταβολής που γίνεται σε μοριακό, βιοχημικό και κυτταρικό επίπεδο, καθώς και μεταβολές σε επίπεδο φυσιολογίας και συμπεριφοράς ενός τέτοιου βιο-ενδείκτη, που έχει εκτεθεί ή εκτίθεται σε τουλάχιστον ένα ρυπογόνο παράγοντα, μπορεί να χαρακτηριστεί ως βιομάρτυρας (Adams, 1990; Roy και Hanninen, 1993; Fishelson, 1995; Fishelson και συν., 1999; Lagadic και συν., 1997; Bresler και συν., 1999). Τα τελευταία χρόνια παρατηρείται αυξανόμενη χρήση βιομαρτύρων, που υποδεικνύουν την έκθεση σε περιβαλλοντικούς ρύπους και τις επιπτώσεις αυτών στους οργανισμούς. Παρόλα αυτά, ο αριθμός των καθιερωμένων και επαρκώς τεκμηριωμένων βιομαρτύρων για την βιοπαρακολούθηση των θαλάσσιων οικοσυστημάτων παραμένει περιορισμένος, καθιστώντας επιτακτική την ανάγκη για την καθιέρωση νέων βιομαρτύρων, οι οποίοι θα αποτελέσουν χρήσιμα διαγνωστικά εργαλεία για συγκεκριμένες ομάδες χημικών ή συγκεκριμένους τύπους αποκρίσεων (Porte και συν., 2006). Τις προηγούμενες δεκαετίες η μελέτη μοριακών βιομαρτύρων στηριζόταν κυρίως στα θηλαστικά. Τα τελευταία χρόνια παρατηρείται μία στροφή των επιστημόνων προς την χρήση θαλάσσιων οργανισμών, κυρίως ασπόνδυλων, στις μελέτες βιοπαρακολούθησης των θαλάσσιων οικοσυστημάτων (Livingstone, 2001). Οι περισσότερο διαδεδομένοι οργανισμοί, που χρησιμοποιούνται εκτεταμένα για την εκτίμηση της κατάστασης των θαλάσσιων οικοσυστημάτων είναι τα μαλάκια και συγκεκριμένα τα στρείδια, οι πεταλίδες και περισσότερο τα μύδια (Marigomez και συν., 2006). 1.3 Τα μύδια ως κατάλληλοι βιο-ενδείκτες οργανισμοί Το γένος Mytilus πρωτοεμφανίστηκε πριν από 1-2 εκατομμύρια χρόνια (Seed, 1976) και παρουσιάζει ευρεία κατανομή τόσο στο Βόρειο όσο και στο Νότιο ημισφαίριο. Περιλαμβάνει τα είδη Μ. edulis, M. trossulus και M. californianus και M. galloprovincialis (Gosling, 1992). Είδη του γένους Mytilus χρησιμοποιούνται ευρύτατα τόσο σε εργαστηριακό επίπεδο, όσο και στο πεδίο (Μussel Watch 2

24 Programmes) για την εκτίμηση της επίδρασης περιβαλλοντικών παραγόντων (Goldberg, 1986; Bayne, 1989). Είναι πλευρικά πιεσμένοι, αιωρηματοφάγοι οργανισμοί. Μετακινούνται ελάχιστα, σχηματίζοντας μεγάλους πληθυσμούς και ζουν προσκολλημένοι σε στερεό υπόστρωμα, π.χ., πέτρες, βράχια, κλπ. Πρόκειται για εδώδιμα είδη, τα οποία καλλιεργούνται σε ευρεία κλίμακα. Το είδος Mytilus galloprovincialis (Βασίλειο: Animalia, Φύλο: Mollusca, Κλάση: Bivalvia, Υπόκλαση: Pteriomorphia, Τάξη: Lamellibranchia) εξαπλώνεται γεωγραφικά σε όλη τη Μεσόγειο Θάλασσα και αποτελεί αντικείμενο περιβαλλοντικής και εργαστηριακής μελέτης. Τα μύδια θεωρούνται κατάλληλοι βιοενδείκτες και χρησιμοποιούνται ευρέως σε τοξικολογικές μελέτες και προγράμματα βιοπαρακολούθησης των θαλάσσιων οικοσυστημάτων, αφού διαβιούν προσκολλημένοι σε σκληρά υποστρώματα και είναι διηθηματοφάγοι οργανισμοί (NRC, 1980; Phillips, 1980; Widdows, 1985; Farrigton και συν., 1987). Ως εκ τούτου, τα ζώα αυτά εκτίθενται συνεχώς σε ποικίλους περιβαλλοντικούς παράγοντες καθώς και μικροοργανισμούς και συσσωρεύουν στους ιστούς τους μεγάλες ποσότητες βακτηρίων και ρύπων σε συγκεντρώσεις υψηλότερες από τις αντίστοιχες του θαλασσινού νερού. Τα βακτήρια αυτά είναι κυρίως κατά Gram αρνητικά εντεροβακτήρια (E. coli) και βακτήρια του γένους Vibrios, τα οποία είναι παθογόνα τόσο για τα μύδια, όσο και για τον άνθρωπο. Στους κύριους χημικούς ρύπους περιλαμβάνονται τα βαρέα μέταλλα (κυρίως χαλκός, κάδμιο, μαγγάνιο), οι πολυκυκλικοί υδρογονάνθρακες και τα εντομοκτόνα (Mydlarz και συν., 2006). Δεδομένου επίσης, ότι τα δίθυρα συγκριτικά με τα αρθόποδα και τα ψάρια, εμφανίζουν χαμηλότερο επίπεδο δραστικότητας των ενζυμικών συστημάτων, που είναι υπεύθυνα για το μεταβολισμό των τοξικών ουσιών, οι συγκεντρώσεις ρύπων και παθογόνων μικροοργανισμών στους ιστούς τους αντικατοπτρίζουν με μεγαλύτερη ακρίβεια την έκταση της περιβαλλοντικής ρύπανσης και μόλυνσης. Άλλα χαρακτηριστικά που τα καθιστούν κατάλληλους βιο-ενδείκτες είναι η ευρεία γεωγραφική εξάπλωση που παρουσιάζουν, η μεγάλη ανθεκτικότητα σε ένα ευρύ φάσμα περιβαλλοντικών συνθηκών, η μεγάλη αντοχή σε σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις ρύπων και μολυσματικών παραγόντων και η σχετικά εύκολη μεταφορά και διατήρησή τους στο εργαστήριο. Επιπρόσθετα, τα μύδια σχηματίζουν σταθερούς και πολυπληθείς πληθυσμούς, καθιστώντας εύκολη την πραγματοποίηση επανειλημμένων δειγματοληψιών για τη μακροπρόθεσμη παρακολούθηση του 3

25 θαλάσσιου περιβάλλοντος (NRC, 1980; Phillips, 1980; Widdows, 1985; Farrigton και συν., 1987). Παρά το γεγονός ότι τα μύδια είναι εξαιρετικά απλοί οργανισμοί, έχουν σχετικά μεγάλο κύκλο ζωής (περίπου 10 χρόνια) κατά τη διάρκεια του οποίου, όπως προαναφέρθηκε, εκτίθενται συνεχώς σε μικρόβια και τοξικούς περιβαλλοντικούς παράγοντες και επομένως, απαιτούν περίπλοκους ομοιοστατικούς μηχανισμούς (Canesi και συν., 2006). Οι μηχανισμοί και τα μόρια, που εμπλέκονται στο αμυντικό σύστημα των δίθυρων, θα μπορούσαν να αποτελέσουν κατάλληλους βιομάρτυρες για την βιοπαρακολούθηση μολυσμένων περιοχών ή περιοχών με αυξημένη ρύπανση (Tiscar και Mosca, 2004; Pipe και συν., 1995). 1.4 Ανοσοποιητικό σύστημα μυδιών Η μελέτη του ανοσοποιητικού συστήματος των ασπόνδυλων έχει εξελιχθεί τα τελευταία χρόνια. Η εξέλιξη αυτή έγκειται σε δύο κυρίως λόγους: Πρώτον, η συγκριτική μελέτη των διαφόρων ανοσοποιητικών συστημάτων στα ασπόνδυλα μπορεί να οδηγήσει στην καλύτερη κατανόηση των πιο περίπλοκων φαινομένων, που παρατηρούνται στα σπονδυλωτά. Ο δεύτερος λόγος είναι κοινωνικοοικονομικός. Η κατανόηση της φυσιολογίας των αμυντικών μηχανισμών στα ασπόνδυλα μπορεί αφενός να οδηγήσει σε πιο αποδοτικό έλεγχο των οργανισμών αυτών, οι οποίοι αποτελούν φορείς μολυσματικών ασθενειών και προκαλούν καταστροφές στην γεωργία, την δασοκομία και τις υδατοκαλλιέργειες. Αφετέρου εξασφαλίζει καλύτερη προστασία στις καλλιέργειες ασπόνδυλων με μεγάλη οικονομική αξία (Canesi και συν., 2002a). Τα ασπόνδυλα, συμπεριλαμβανομένων των μυδιών διαθέτουν μη εξειδικευμένο και έμφυτο ανοσοποιητικό σύστημα, το οποίο στερείται μνήμης μετά την πρώτη επαφή με ένα παθογόνο (Tiscar και Mosca, 2004). Στους μηχανισμούς άμυνας των ασπόνδυλων ανήκουν αφενός οι διάφοροι φυσικοχημικοί φραγμοί (εξωτερικοί σκελετοί, όστρακα, επιδερμίδα, βλέννα), οι οποίοι εμποδίζουν την είσοδο των ξενιστών και αφετέρου τα συστατικά της αιμολέμφου (κυκλοφορικά αιμοκύτταρα και διαλυτοί παράγοντες), τα οποία επάγουν ένα ευρύ φάσμα ανοσολογικών αποκρίσεων (Canesi και συν., 2002a). Από τη μελέτη του 4

26 ανοσοποιητικού συστήματος των ασπόνδυλων προκύπτει ότι οι θεμελιώδεις διαδικασίες της έμφυτης ανοσίας εμπίπτουν σε τρεις κατηγορίες που καθορίζουν την αποτελεσματικότητα μίας ανοσολογικής απόκρισης. Αρχικά, ο οργανισμός αναγνωρίζει το εαυτό από το μη- εαυτό. Στη συνέχεια, ο οργανισμός επιστρατεύει μία κατάλληλη αμυντική απόκριση για την εξόντωση ή την αδρανοποίηση του ξενιστή και τέλος, ο οργανισμός αποβάλλει τα δικά του κατεστραμμένα ή αδρανοποιημένα κύτταρα. Οι προϋποθέσεις αυτές οδηγούν στις τρεις συνιστώσες της έμφυτης ανοσίας: 1. φαγοκυττάρωση (κυτταρική ανοσία), 2. ενεργοποίηση χυμικών αποκρίσεων, που οδηγούν στην παραγωγή αντισωμάτων (οψωνινοποίηση), στην δημιουργία μελανώματος και στην συγκόλληση (ακυτταρική ή χυμική ανοσία) και 3. παραγωγή χυμικών αντιμικροβιακών συστατικών (ακυτταρική ανοσία) (Mydlarz και συν., 2006). Το ανοσοποιητικό σύστημα των μυδιών αποτελείται από την αιμόλεμφο. Η αιμόλεμφος αποτελείται από τα αιμοποιητικά κύτταρα (αιμοκύτταρα) και από διαλυτούς παράγοντες της αιμολέμφου, που ενεργούν συνεργατικά για την άμυνα του οργανισμού. Τα αιμοκύτταρα, τα οποία έχουν αντίστοιχη δράση μακροφάγων, κατέχουν πρωτεύοντα ρόλο στις ανοσολογικές αποκρίσεις των δίθυρων και διαμεσολαβούν την κυτταρική ανοσία, η οποία περιλαμβάνει την φαγοκυττάρωση και διάφορες κυτταροτοξικές αντιδράσεις (όπως η «αναπνευστική έκρηξη» ή «οξειδωτική μεταβολική έκρηξη», η οποία οδηγεί στην άμεση παραγωγή και απελευθέρωση οξειδωτικών ριζών και νιτρικού οξειδίου-νο κυρίως μέσω της NADPH οξειδάσης και της ΝΟ συνθετάσης, και η παραγωγή και απελευθέρωση λυσοσσωμικών και αντιμικροβιακών πεπτιδίων) (Renwrantz, 1990; Rinkevich και Muller, 1996; Hine, 1999; Little, 2005). Τα αιμοκύτταρα στα είδη Mytilus αντιπροσωπεύονται κυρίως από κοκκιώδη αιμοκύτταρα, τα οποία χαρακτηρίζονται από μικρή αναλογία πυρήνα προς κυτταρόπλασμα, μεγάλη φαγοκυτταρική δράση και ικανότητα παραγωγής οξειδωτικών ριζών (Wootton και συν., 2003). Τα κοκκιώδη κύτταρα των μυδιών περιέχουν δύο διαφορετικούς τύπους κοκκίων, τα οποία διαφέρουν στο μέγεθος και στην σύστασή τους σε ένζυμα. Η παρουσία στα μεγάλα κοκκία πλήθους υδρολυτικών ενζύμων, όπως πρωτεΐνάσες, γλυκοσιδάσες και σουλφατάσες, αποτελεί ένδειξη σύνδεσης με τα λυσοσώματα (Pipe, 1990). Τα αιμοκύττρα, συμμετέχουν, επίσης, στην αποτοξίνωση μέσω συσσώρευσης μεταλλικών και οργανικών ξενοβιοτικών ουσιών στο καλά ανεπτυγμένο ενδολυσοσσωμικό σύστημα που διαθέτουν 5

27 (Cajaraville και συν., 1995). Ο ορός της αιμολέμφου του Mytilus galloprovincialis διαμεσολαβεί τη χυμική ανοσία αφού περιέχει τους χυμικούς αμυντικούς παράγοντες, στους οποίους συμπεριλαμβάνονται διαλυτές λεκτίνες, λυσοσωμικά ένζυμα και αντιμικροβιακά πεπτίδια. Τα πεπτίδια αυτά είναι μικρού μεγέθους, κατιονικά και πλούσια σε κυστεΐνη (Leclerc, 1996; Canesi και συν., 2002a; Pruzzo και συν., 2005). Η φαγοκυττάρωση, που πραγματοποιείται από τα αιμοκύτταρα, αποτελεί την κύρια διαδικασία ολόκληρου του κυτταρικού μηχανισμού άμυνας. Συνίσταται από διάφορες φάσεις, στις οποίες περιλαμβάνονται, η αναγνώριση (μέσω υποδοχέων), η προσκόλληση, η απορρόφηση (ingestion), η αποικοδόμηση και η εξουδετέρωση των ξένων κυττάρων (Tiscar και Mosca, 2004). Η προσκόλληση μεταξύ των αιμοκυττάρων και της εξωκυττάριας ουσίας, όπως είναι η λαμινίνη και το κολλαγόνο, αποτελεί διαδικασία ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη, τη διατήρηση και τη λειτουργία των πολυκύτταρων οργανισμών ενώ λαμβάνει χώρα επίσης όταν τα αιμοκύτταρα μετακινούνται και προσκολλώνται σε θέσεις φλεγμονής (Hynes και Lκαιer, 1992). Αποτέλεσμα της προσκόλλησης είναι η επαγωγή μιας σειράς γεγονότων που περιλαμβάνουν τη μετανάστευση, την κυτταροτοξικότητα, την παραγωγή παραγόντων φλεγμονής κ.α. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αλληλεπίδρασης αιμοποιητικών κυττάρων με τα συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας είναι η μετανάστευση των κυττάρων αυτών προς την περιοχή της μόλυνσης, όπου είναι αποτέλεσμα διαδοχικής δέσμευσης-αποδέσμευσης μεταξύ κυττάρων και συστατικών της εξωκυττάριας ουσίας (Owen και συν., 1992). 1.5 Προσκόλληση αιμοκυττάρων σε πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας Η προσκόλληση σε πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας αποτελεί ένα βασικό στάδιο της διαδικασίας της φαγοκυττάρωσης ξένων σωματιδίων και της μετανάστευσης προς τις εστίες της φλεγμονής. Τα πειράματα προσκόλλησης στη λαμινίνη και το κολλαγόνο αποτελούν καλή αναπαράσταση των πραγματικών διαδικασιών της πρόσδεσης των αιμοκυττάρων στην εξωκυττάρια ουσία και της μετανάστευσής τους διαμέσου αυτής σε θέσεις φλεγμονής ή μόλυνσης. Δεδομένου ότι οι περιβαλλοντικοί παράγοντες δύνανται να προκαλέσουν τροποποιήσεις στις ανοσολογικές αποκρίσεις των οργανισμών και να τροποποιήσουν την φαγοκυτταρική τους ικανότητα (Καιerson, 1992; Pipe και συν., 1999; Sauve και συν., 2002), η 6

28 προσκόλληση των αιμοκυττάρων σε πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας, θα μπορούσε να αποτελέσει έναν κατάλληλο βιομάρτυρα ρύπανσης και μόλυνσης των θαλάσσιων οικοσυστημάτων. Η κυτταρική προσκόλληση διακρίνεται σε δύο τύπους: προσκόλληση τύπου κύτταρο-κύτταρο και προσκόλληση τύπου κύτταρο-υπόστρωμα, όπως είναι η εξωκυττάρια ουσία και αποτελούν διαδικασίες ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη, την διατήρηση και την λειτουργία των πολυκύτταρων οργανισμών. Η προσκόλληση τύπου κύτταρο-κύτταρο μεταξύ των αιμοκυττάρων ή μεταξύ των αιμοκυττάρων σε άλλα κύτταρα ή σε οργανισμούς ξενιστές καθώς και η προσκόλληση τύπου κύτταρουπόστρωμα μεταξύ των αιμοκυττάρων και της εξωκυττάριας ουσίας λαμβάνει χώρα όταν τα αιμοποιητικά κύτταρα μετακινούνται και προσκολλώνται σε θέσεις φλεγμονής ή μόλυνσης (Hynes και Lκαιer, 1992). Επιπρόσθετα, η προσκόλληση των αιμοκυττάρων σε διαφορετικές επιφάνειες μπορεί να επάγει σημαντικές κυτταρικές διαδικασίες όπως είναι η εγκύστωση παρασίτων και άλλες ανοσολογικές αποκρίσεις (Yoshino, 1998). Η προσκόλληση τύπου κύτταρο-κύτταρο στα ασπόνδυλα εμπλέκεται επίσης και στο φαινόμενο της ιστοσυμβατότητας, το οποίο απαντάται σε ζώα που σχηματίζουν αποικίες (Johansson, 1999). Κάποιοι τύποι κυτταρικής προσκόλλησης είναι ιδιαίτερα σταθεροί, όπως είναι η προσκόλληση τύπου κυττάροκύτταρο, η οποία οργανώνει το επιθήλιο και άλλους ιστούς καθώς και η προσκόλληση τύπου κύτταρο-υπόστρωμα των επιθηλιακών κυττάρων στην υποκείμενη εξωκυττάρια ουσία, τη βασική μεμβράνη. Από την άλλη πλευρά, κάποιοι τύποι προσκόλλησης παρουσιάζονται ιδιαίτερα ασθενείς και μεταβατικοί, όπως συμβαίνει στην περίπτωση του ανοσοποιητικού συστήματος. Οι υποδοχείς και τα μόρια πρόσδεσης (ligκαιs) που εμπλέκονται στην κυτταρική προσκόλληση έχουν μελετηθεί εκτενώς στα σπονδυλωτά. Στους υποδοχείς ανήκουν σχετικά λίγες οικογένειες διαμεμβρανικών πρωτεϊνών, στις οποίες περιλαμβάνονται οι καδερίνες, κάποιες ανοσοσφαιρίνες, όπως οι N-CAM, οι σελεκτίνες και οι ιντεγκρίνες. Στα μόρια πρόσδεσης περιλαμβάνονται για παράδειγμα συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας. Μεταξύ των υποδοχέων και των μορίων πρόσδεσης που αναφέρθηκαν παραπάνω, οι καδερίνες, οι ανοσοσφαιρίνες, οι ιντεγκρίνες, τα κολλαγόνα και οι λαμινίνες έχουν βρεθεί σε πολλά ασπόνδυλα (Johansson, 1999). 7

29 1.6 Εξωκυττάρια ουσία (Extracellular Matrix, ECM)- Κολλαγόνο- Λαμινίνη Τα κύτταρα των ιστών, συνδέονται μεταξύ τους και συνιστούν ένα οργανωμένο λειτουργικό σύνολο. Τα περισσότερα κύτταρα εκκρίνουν βιομόρια, που συνήθως παραμένουν στη γειτονία της πλασματικής μεμβράνης, σχηματίζοντας την εξωκυττάρια ουσία (extracellular matrix-ecm). Με τον όρο εξωκυττάρια ουσία, αναφερόμαστε σε ένα σύστημα αλληλοσυμπλεκόμενων μακρομορίων, που παρεμβάλλονται μεταξύ κυττάρων και ιστών και επηρεάζουν τη συμπεριφορά τους (Bruijn και συν., 1988). Η ECM, αλληλεπιδρά με τις γλυκοπρωτεΐνες και τα γλυκολιπίδια της κυτταρικής επιφάνειας και συμβάλλει σημαντικά στην επιβίωση και στη λειτουργικότητα των κυττάρων και των ιστών. Σε ορισμένους ιστούς, το εξωκυττάριο στρώμα είναι άφθονο και εξαιρετικά σημαντικό από μηχανικής άποψης. Αντίθετα, σε ιστούς όπως στους μύες και στην επιδερμίδα, είναι λιγοστό και το μηχανικό φορτίο το αναλαμβάνουν τα κύτταρα μέσω του κυτταροσκελετού. Θα πρέπει να αναφερθεί ότι κάθε τύπος ιστού χαρακτηρίζεται από ένα μοναδικό συνδυασμό βιομορίων της ECM. Παράλληλα, είναι χαρακτηριστικό πως η ECM έχει την ικανότητα να ανακυκλώνεται. Η ECM παρέχει στήριξη και σταθερότητα στους ιστούς και στα όργανα. Παρέχει επίσης τον σκελετό για την κυτταρική προσκόλληση και την ανάπτυξη των ιστών. Εμφανίζεται κατά τη διάρκεια της εξέλιξης με την έλευση των πολυκύτταρων ασπόνδυλων ζώων (Harel και Tanzer, 1993). Η ECM περιέχει: α) ινώδεις πρωτεΐνες, οι οποίες διακρίνονται σε δομικές (ελαστίνη, κολλαγόνο) και σε πρωτεΐνες προσκόλλησης (λαμινίνη, φιμπρονεκτίνη), και β) γλυκοζαμινογλυκάνες, ελεύθερες ή συνδεμένες με πρωτεΐνες-πρωτεογλυκάνες (Lohr και Strobel, 1991). Ουσιαστικά τα κύτταρα επικοινωνούν με την εξωκυττάρια ουσία μέσω της βασικής μεμβράνης και του ενδιάμεσου υλικού. Βασικές μεμβράνες διαθέτουν όλα τα σπονδυλωτά, αλλά και τα ασπόνδυλα, με μοναδική εξαίρεση τους σπόγγους. Συνήθως, βρίσκονται κάτω από το επιθήλιο των διαφόρων συστημάτων (πεπτικό, αναπνευστικό, ουροποιητικό), αλλά συχνά περιβάλλουν ολόκληρο τον ιστό (Kefalides και συν., 1979). Οι λαμινίνες ανήκουν στις γλυκοπρωτεΐνες και αποτελούν κύρια δομικά και λειτουργικά συστατικά των βασικών μεμβρανών. Οι λαμινίνες, μαζί με τις φιμπρονεκτίνες, αποτελούν τις καλύτερα μελετημένες, μετά τα κολλαγόνα, οικογένειες γλυκοπρωτεϊνών της εξωκυττάριας ουσίας. Η λαμινίνη είναι μία 8

30 γλυκοπρωτεΐνη υψηλού μοριακού βάρους και συντίθεται από 3 αλυσίδες τις α, β και γ, οι οποίες συνδέονται μεταξύ τους με δισουλφιδικούς δεσμούς (Ekblom και Timpl, 1996). Διαδραματίζει σημαντικό ρόλο σε πολλές βιολογικές λειτουργίες όπως είναι η κυτταρική προσκόλληση, η διαφοροποίηση και η μετανάστευση σε πολλούς τύπους κυττάρων (Castronovo, 1993; Chang και συν., 1995; De Arcangelis και συν., 1996). Οι λειτουργίες που επιτελούν οι λαμινίνες είναι απόρροια της χαρακτηριστικής τους δομής. Σχετικά με την εύρεση των δομικών χαρακτηριστικών των μορίων λαμινίνης, το ενδιαφέρον επικεντρώθηκε στη λαμινίνη-1, η βασική δομή της οποίας υπάρχει σε όλους τους τύπους της λαμινίνης, με ορισμένες τροποποιήσεις. Εκτός από τις λαμινίνες, το κολλαγόνο τύπου ΙV αποτελεί κύριο συστατικό της βασικής μεμβράνης, το οποίο μετέχει στην κυτταρική προσκόλληση, τη διαφοροποίηση και τη μετανάστευση. Σε αντίθεση με τους περισσότερους τύπους κολλαγόνου, το κολλαγόνο IV απαντάται αποκλειστικά στις βασικές μεμβράνες. Το κολλαγόνο IV εκτός από την κύρια ιδιότητά του να παρέχει ένα είδος ικριώματος- «σκαλωσιάς» απαραίτητου για τη συνάθροιση και τη μηχανική σταθερότητα, αποτελεί και σημαντικό παράγοντα για τις αλληλεπιδράσεις των κυττάρων με την υποκείμενη βασική μεμβράνη. Το κολλαγόνο IV αποτελεί το υπόστρωμα προσκόλλησης για μια ποικιλία κυττάρων (Cheng και Kramer, 1989; Setty και συν., 1988; Kaido και συν., 2004; Dedhar και συν., 1993; Knight και συν., 2000; Rubin και συν., 1981). Η κυτταρική προσκόλληση μεσολαβείται από πολλαπλές περιοχές σύνδεσης, γεγονός που μαρτυρά τη συμμετοχή πλήθους υποδοχέων (Chelberg και συν., 1989). Οι υποδοχείς αυτοί διακρίνονται σε ιντεγκρινικούς και μη ιντεγκρινικούς υποδοχείς. Οι κυριότεροι υποδοχείς κολλαγόνου ανήκουν στη β1 υπο-οικογένεια των ιντεγκρινών και είναι οι α1β1 και α2β1 (Leitinger και Hohenester, 2007). Αντίθετα με τη λαμινίνη, το κολλαγόνο τύπου ΙV αποτελείται από δύο αλυσίδες τύπου α1 και μία α2 αλυσίδα, οι οποίες συγκροτούνται σε ένα δίκτυο, που είναι κυρίως υπεύθυνο για τη δομή, τη μορφολογία αλλά και τη λειτουργικότητα της βασικής μεμβράνης (Yurchenco και Schittny, 1990). Έτσι, οι βασικές μεμβράνες συμβάλλουν στη διαμερισματοποίηση των αναπτυσσόμενων οργάνων, στη διατήρηση της πολικότητας των κυττάρων, ενώ παρεμποδίζουν τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων. Οι αλληλεπιδράσεις των συστατικών των βασικών μεμβρανών με τα κύτταρα είναι καθοριστικές για τον έλεγχο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της μετανάστευσης και της διαφοροποίησης (Sorokin και συν., 2001). Παράλληλα, οι βασικές μεμβράνες 9

31 λειτουργούν και ως εκλεκτικά φίλτρα διήθησης για διάφορες ουσίες, ενώ επηρεάζουν και το φαινότυπο παρακείμενων κυττάρων. Επιπρόσθετα, μελετάται η συμβολή τους σε διεργασίες, όπως η προσκόλληση των κυττάρων, η επούλωση των τραυμάτων και η κυτταρική σηματοδότηση. Οι πρωτεΐνες της ECM υπόκεινται σε πλήθος μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων, όπως η οξείδωση, η φωσφορυλίωση, και η γλυκοζυλίωση, ως αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης της εξωκυττάριας ουσίας με τα κύτταρα (Raabe και συν., 1996; Mattana και συν., 1997; Koliakos και συν., 2000). Οξείδωση ονομάζεται η διαδικασία κατά την οποία παρατηρείται απώλεια ηλεκτρονίων. Διακρίνεται σε ενζυμική και σε μη ενζυμική. Η μη ενζυμική οξείδωση μπορεί να είναι αποτέλεσμα της οξειδωτικής καταπόνησης (οξειδωτικό stress) και περιλαμβάνει την καρβονυλίωση, τη νιτροζυλίωση τυροσίνης, την οξείδωση μεθειονίνης σε σουλφοξείδιο μεθειονίνης, τη γλουταθειονυλίωση, την S-νιτροζυλίωση κυστεΐνης καθώς και την οξείδωση κυστεΐνης που οδηγεί στο σχηματισμό δισουλφιδίων (Ghezzi, 2005). Η οξείδωση των πρωτεϊνών της ECM επάγεται κατά κύριο λόγο από τις δραστικές μορφές οξυγόνου (ROS). Μάλιστα τα πλέον ευπρόσβλητα αμινοξέα τους είναι η τρυπτοφάνη, η τυροσίνη, η ιστιδίνη και η κυστεΐνη. Οι οξειδωμένες πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας αποτελούν αντικείμενο εντατικής έρευνας καθώς εμφανίζουν αλλαγές στα χαρακτηριστικά τους σε σχέση με τις μη οξειδωμένες μορφές τους, αλλά και γιατί εμπλέκονται σε πλήθος φυσιολογικών και παθολογικών καταστάσεων (Hadjigogos, 2003). Παρ' όλο που η λαμινίνη και το κολλαγόνο IV αποτελούν τις κύριες πρωτεΐνες κυτταρικής προσκόλλησης των βασικών μεμβρανών, η επίδραση της οξείδωσης στη λειτουργία τους δεν έχει ακόμη μελετηθεί στα μαλάκια. Συνήθως εξετάζονται ως συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας και δε μελετώνται ξεχωριστά. 1.7 Ιντεγκρίνες Οι ιντεγκρίνες είναι μία υπερ-οικογένεια υποδοχέων της πλασματικής μεμβράνης, οι οποίες απαντώνται ως διαμεμβρανικά αβ ετεροδιμερή. Παρουσιάζουν πολύ υψηλό βαθμό συντήρησης και αναμένεται να απαντώνται σε όλα τα μεταζωικά κύτταρα. Στα σπονδυλωτά, οι δύο κύριες λειτουργίες, στις οποίες εμπλέκονται οι 10