Μηχανισµός αναγνώρισης σε ατοµικό επίπεδο και δράσης του καταστολέα Lac

Transcript

1 Μηχανισµός αναγνώρισης σε ατοµικό επίπεδο και δράσης του καταστολέα Lac Γκίλης Νικόλαος, AM Δοδόπουλος Αθανάσιος, ΑΜ , Παυλοπούλου Εµµανουέλα-Ελευθερία, ΑΜ Επιβλέπων: Κωνσταντίνος Ε. Βοργιάς ΕΚΠΑ, Τµήµα Βιολογίας, Τοµέας Βιοχηµείας και Μοριακής Βιολογίας Πανεπιστηµιούπολη-Ζωγράφου, Αθήνα 2015 Το οπερόνιο της λακτόζης στο βακτήριο Escherichia coli αποτελείται από 3 δοµικά γονίδια που κωδικοποιούν τα ένζυµα που συµµετέχουν στη διαδικασία µεταβολισµού της λακτόζης αλλά και τα ακόλουθα ρυθµιστικά στοιχεία: Έναν υποκινητή, έναν χειριστή καθώς και το γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεϊνη-καταστολέα (Lac repressor), η οποία αποτελεί το αντικείµενο της εργασίας αυτής. Εν συντοµία η λειτουργία της είναι η αρνητική ρύθµιση, δηλαδή η καταστολή της µεταγραφής των δοµικών γονιδίων του οπερονίου. Παρακάτω παρουσιάζεται η δοµή της πρωτεϊνης-καταστολέα, η αλληλεπίδραση της µε την αλληλουχία του χειριστή και συγκεκριµένα ο τρόπος µε τον οποίο συνδέεται η πρωτεϊνη µε το DNA, και ακόµη η διαδικασία σύνδεσης του επαγωγέα στον καταστολέα, κατά την οποία αλλάζει η στερεοδιαµόρφωση της πρωτεϊνης και αίρεται πλέον η καταστολή της µεταγραφής. Τέλος, αντί επιλόγου, αναφέρεται η σηµασία του οπερονίου της λακτόζης στη Βιοτεχνολογία και η συνεχής ανάγκη για περαιτέρω µελέτη και βελτίωση του συστήµατος Εισαγωγή: Το συνεργίωµα της λακτόζης (Lac operon) Στους προκαρυώτες, σε αντίθεση µε τους ευκαρυωτικούς οργανισµούς, τα δοµικά γονίδια οργανώνονται σε συστοιχίες. Η οµαδοποίηση των δοµικών γονιδίων επιτρέπει το συντονισµένο έλεγχό τους µέσω αλληλεπιδράσεων σε ένα µόνο υποκινητή, µε αποτέλεσµα το σύνολο των γονιδίων µιας τέτοιας συστοιχίας είτε να µεταγράφεται είτε όχι. Συνήθως τα γονίδια αυτά κωδικοποιούν πρωτεϊνες µε λειτουργίες που σχετίζονται µεταξύ τους, δρουν για παράδειγµα στο ίδιο µεταβολικό µονοπάτι. Έτσι, τα βακτηριακά δοµικά γονίδια µαζί µε τα στοιχεία (cis- και trans-δραστικά) που ελέγχουν την έκφραση τους σχηµατίζουν µια µονάδα κοινής ρύθµισης που ονοµάζεται συνεργίωµα ή οπερόνιο (operon). Το οπερόνιο της λακτόζης του βακτηρίου Escherichia coli είναι ένα χαρακτηριστικό και πολύ καλά µελετηµένο παράδειγµα. Τα πρωτεϊνικά προϊόντα των τριών δοµικών γονιδίων που 1

2 περιλαµβάνει καθιστούν τα κύτταρα ικανά να προσλαµβάνουν και να µεταβολίζουν β- γαλακτοζίτες, όπως η λακτόζη. Συγκεκριµένα: -Το γονίδιο lacz κωδικοποιεί το ένζυµο β-γαλακτοζιδάση, το οποίο διασπά έναν β-γαλακτοζίτη στα συστατικά του σάκχαρα. Για παράδειγµα, η λακτόζη διασπάται σε γλυκόζη και γαλακτόζη. -Το γονίδιο lacy κωδικοποιεί την περµεάση του β-γαλακτοζίτη η οποία αποτελεί συστατικό του συστήµατος που µεταφέρει τους β-γαλακτοζίτες µέσα στο κύτταρο. -Το γονίδιο laca κωδικοποιεί την τρανσακετυλάση του β-γαλακτοζίτη, ένα ένζυµο που µεταφέρει µια ακετυλο-οµάδα από το ακετυλο-coa στους β-γαλακτοζίτες. Τα γονίδια laczya ελέγχονται µε αρνητική ρύθµιση (negative regulation), µεταγράφονται δηλαδή εκτός αν απενεργοποιηθούν από τη ρυθµιστική πρωτεϊνη. Αυτή συντίθεται από το γονίδιο laci, το οποίο εντοπίζεται δίπλα στα δοµικά γονίδια αλλά είναι µια ανεξάρτητη µεταγραφική µονάδα µε το δικό της υποκινητή και τη δική της αλληλουχία τερµατισµού. Η ρυθµιστική πρωτεϊνη ονοµάζεται καταστολέας Lac (Lac repressor) γιατί η λειτουργία της είναι να καταστέλλει την έκφραση των δοµικών γονιδίων του συνεργιώµατος. Ο καταστολέας είναι ένα τετραµερές πανοµοιότυπων υποµονάδων 38 kd η καθεµία και υπάρχουν περίπου 10 τέτοια τετραµερή σε ένα κύτταρο αγρίου τύπου. Ο ρόλος του καταστολέα είναι να προσδένεται σε ένα χειριστή (O lac ), που βρίσκεται ανάµεσα στον υποκινητή (P lac ) και τα δοµικά γονίδια (laczya), και να εµποδίζει την RNA πολυµεράση να αρχίσει τη µεταγραφή από τον υποκινητή. [1] Μελέτη του οπερονίου Τα δοµικά γονίδια laczya µεταγράφονται σε ένα ενιαίο mrna υπό τον έλεγχο του υποκινητή που βρίσκεται ακριβώς ανοδικά του γονιδίου lacz. Η κατάσταση του καταστολέα καθορίζει αν ο υποκινητής ενεργοποιείται ή απενεργοποιείται: Ø Απουσία επαγωγέα τα δοµικά γονίδια δε µεταγράφονται, επειδή η πρωτεϊνηκαταστολέας βρίσκεται στην ενεργή της µορφή και προσδένεται στον χειριστή. Ø Όταν προστεθεί ο επαγωγέας, ο καταστολέας αλληλεπιδρά µε αυτόν και απελευθερώνεται από τον χειριστή, οπότε ξεκινά η µεταγραφή. Το κύκλωµα ελέγχου βασίζεται στην ιδιότητα του καταστολέα να εµποδίζει τη µεταγραφή αλλά και να αναγνωρίζει το µικροµοριακό επαγωγέα. Ο καταστολέας έχει δύο θέσεις πρόσδεσης, µία για το χειριστή και µία για τον επαγωγέα. Όταν ο επαγωγέας προσδεθεί στην ειδική θέση αλλάζει τη στερεοδιαµόρφωση της πρωτεϊνης-καταστολέα κατά τέτοιον τρόπο ώστε να επηρεάζεται η λειτουργία της θέσης πρόσδεσης στο χειριστή. Η ικανότητα µιας περιοχής της πρωτεϊνης να ελέγχει τη λειτουργία µιας άλλης ονοµάζεται αλλοστερικός έλεγχος (allosteric control). 2

3 Με την επαγωγή επιτυγχάνεται η συντονισµένη ρύθµιση (coordinate regulation): όλα τα γονίδια εκφράζονται (ή δεν εκφράζονται) ταυτόχρονα. Το πολυσιστρονικό mrna µεταφράζεται διαδοχικά από το 5' άκρο του και έτσι εξηγείται η εµφάνιση της β-γαλακτοζιδάσης, της περµεάσης του β-γαλακτοζίτη και της τρανσακετυλάσης του β-γαλακτοζίτη µε αυτή τη συγκεκριµένη σειρά, όπως και το γεγονός ότι οι σχετικές ποσότητες των 3 ενζύµων παραµένουν πάντα ίδιες κάτω από διαφορετικές συνθήκες επαγωγής. Μόρια που επάγουν τη σύνθεση ενός ενζύµου αλλά δε µεταβολίζονται από αυτό ονοµάζονται µη µεταβολίσιµοι επαγωγείς και είναι εξαιρετικά χρήσιµα, αφού παραµένουν στο κύτταρο στην αρχική τους µορφή (Ένας γνήσιος επαγωγέας θα µεταβολιζόταν παρεµβαίνοντας στη µελέτη του συστήµατος). Ένα χαρακτηριστικό παράδειγµα είναι ο ισοπροπυλο-θειο-γαλακτοζίτης (IPTG): Παρόλο που δεν αναγνωρίζεται από τη β-γαλακτοζιδάση ως υπόστρωµα, είναι πολύ αποτελεσµατικός επαγωγέας των γονιδίων lac. Η ύπαρξη µη µεταβολίσιµων επαγωγέων αποκάλυψε µια σηµαντική λεπτοµέρεια: Το σύστηµα θα πρέπει να περιέχει ένα διαφορετικό µόριο από το ένζυµο-στόχο, του οποίου η ικανότητα να αναγνωρίζει εν δυνάµει υποστρώµατα είναι διαφορετική από εκείνη του ενζύµου. Το µόριο αυτό είναι η πρωτεϊνη-καταστολέας που κωδικοποιείται από το γονίδιο laci, και αποµονώθηκε αρχικά βάσει αυτής ακριβώς της ικανότητας να προσδένεται στο µη µεταβολίσιµο επαγωγέα IPTG. Επειδή η ποσότητα του καταστολέα στο κύτταρο είναι πολύ µικρή (όπως αναφέρθηκε στην εισαγωγή), για να αποµονωθεί αρκετό υλικό ήταν απαραίτητο αφενός µεν να χρησιµοποιηθεί µια αυξορυθµική µετάλλαξη του υποκινητή του γονιδίου laci, ώστε να αυξηθούν τα επίπεδα µεταγραφής του, και αφετέρου να τοποθετηθεί το τµήµα του DNA που φέρει το µεταλλαγµένο γενετικό τόπο laci σε πολλά αντίγραφα ανά κύτταρο. Έτσι επιτεύχθηκε µια συνολική υπερέκφραση που επέτρεψε την αποµόνωση και µελέτη της πρωτεϊνης-καταστολέα. Η αλληλουχία του χειριστή (operator) Ο καταστολέας, σύµφωνα µε βιοχηµικές µελέτες προσδένεται στο δίκλωνο DNA (ds DNA) και συγκεκριµένα στην αλληλουχία του χειριστή (Ο lac ). Η αλληλουχία αυτή οµοιάζει µε παλίνδροµο, κοινό χαρακτηριστικό των αλληλουχιών αναγνώρισης πολλών βακτηριακών ρυθµιστικών πρωτεϊνών. Φέρει δηλαδή ανεστραµµένες επαναλήψεις, και κάθε µία εξ αυτών θεωρείται ως µια ηµιθέση του χειριστή. Ουσιαστικά, η συµµετρία της αλληλουχίας του χειριστή αντικατοπτρίζει την συµµετρία της πρωτεΐνης. [1] Κάθε υποµονάδα του τετραµερούς καταστολέα φέρει λειτουργικές περιοχές σύνδεσης µε το DNA. Κάθε ανεστραµµένη επανάληψη έχει το ίδιο πρότυπο επαφών µε το κάθε µονοµερές του καταστολέα. Ως «παλίνδροµο» µπορεί να θεωρηθεί µια ηµιθέση του χειριστή. Παρά ταύτα ο χειριστής δεν είναι απόλυτα συµµετρικός, µε το αριστερό του ήµισυ να αλληλεπιδρά ισχυρότερα µε την πρωτεΐνη. Ο καταστολέας συνδέεται σε τρείς αλληλουχίες-ψευδοπαλίνδροµα του χειριστή (25bp). Η συµµετρία του Ο διακόπτεται από µικρές διαφοροποιήσεις στην αλληλουχία των 2 ηµίσεων και από ένα κεντρικό GC. Πειραµατικά παρατηρήθηκε ότι ο καταστολέας προσδένεται 8 φορές ισχυρότερα σε πλήρως ταυτόσηµες ηµιαλληλουχίες χειριστή. [2] 3

4 Εικόνα 1. Οι αλληλουχίες των 3 φυσικών lac χειριστών σε στοίχιση. Με αστερίσκο σηµειώνεται το κεντρικό ζεύγος βάσεων και µε σκίαση τα συντηρηµένα κατάλοιπα. Οι δύο θέσεις πρόσδεσης (δεξιά 1-10bp και αριστερή 12-21bp) είναι ασύµµετρες. [5] Στην πραγµατικότητα υπάρχουν δύο επιπλέον χειριστές στην περιοχή του οπερονίου Lac. Αρχικά χαρτογραφήθηκε ο πρωτότυπος χειριστής Ο1 στην αρχή του γονιδίου LacZ, ο οποίος έχει και την µεγαλύτερη σύγγενεια για τον καταστολέα. Δύο ασθενέστεροι χειριστές (Ο2,Ο3) βρίσκονται εκατέρωθεν του Ο1 µε τον Ο2 να βρίσκεται 410bp καθοδικά (downstream) του 5 άκρου του γονιδίου, ενώ ο Ο3 83 bp ανοδικά (upstream) αυτού. Οι δυο βοηθητικοί ψευδοχειριστές απαιτούνται για µέγιστη καταστολή. Ο τετραµερής LacR δεσµεύει δύο χειριστές ταυτόχρονα σχηµατίζοντας βρόχο στο DNA. Το φαινόµενο αυτό αυξάνει την υπερελίκωση του DNA και σταθεροποιεί το σύµπλοκο αυξάνοντας σηµαντικά την συγγένεια του καταστολέα για τoν χειριστή. [3] Η πρωτεΐνη LacR (Lactose repressor protein): Δοµή και λειτουργικές περιοχές Ο Lac καταστολέας είναι ένα δύσκαµπτο τετραµερές σχήµατος V. Αποτελείται από όµοια µονοµερή µήκους 347 αµινοξέων και µοριακού βάρους 37.5 kda, δοµούµενα από 6 λειτουργικές περιοχές. Τα κατάλοιπα 1-59 συγκροτούν την περιοχή πρόσδεσης στο DNA (DNA binding domain,dbd) γνωστή µε το όνοµα κεφαλή (headpiece). Έχει σφαιρική δοµή και αποτελείται από 3 α-έλικες. Το ικρίωµα της πρωτεΐνης για την δέσµευση του DNA ρυθµίζεται κατάλληλα ανάλογα µε την ειδικότητα της σύνδεσης. Μετά την κατεργασία της πρωτεϊνης µε θρυψίνη αποµονώνεται η κεντρική επικράτεια του µονοµερούς, ο πυρήνας (core). Η κεφαλή συνδέεται µε την µεγάλη αύλακα του κάθε ηµίσεως και η άρθρωση µε την µικρή αύλακα στο κέντρο του χειριστή, η οποία κάµπτεται 40 o µακριά από τον καταστολέα. Αλληλεπιδράσεις µεταξύ της DBD και του πυρήνα σταθεροποιούν την δέσµευση του στον χειριστή µε το DNA να λυγίζει σχηµατίζοντας έναν βρόχο. Η ηλεκτρονιακή πυκνότητα της DBD είναι διάχυτη λόγω έντονης θερµικής κίνησης, ενώ για τον χειριστή είναι µεγαλύτερη στο κέντρο όπου προσδένεται η άρθρωση. [2] Η φασµατοσκοπία πυρηνικού µαγνητικού συντονισµού (NMR) µαζί µε την κρυσταλλογραφική µελέτη αποκάλυψε τις επιµέρους λειτουργικές περιοχές της πρωτεϊνης-καταστολέα. Πιο συγκεκριµένα, το αµινοτελικό άκρο (N-terminal) του µονοµερούς αποτελείται από 2 α-έλικες διαχωριζόµενες από µια στροφή. Το µοτίβο αυτό ονοµάζεται έλικα-στροφή-έλικα (Ηelix Turn Helix, HTH) και απαντάται συχνά µεταξύ άλλων στις πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν µε ds DNA. Το µοτίβο ΗΤΗ αποµονώθηκε από τους λ βακτηριοφάγους της E.coli και είναι µια ιδιαίτερα 4

5 συντηρηµένη δοµή που απαντάται σε πλειάδα ρυθµιστικών συστηµάτων. Αποτελείται από δύο R έλικες που διαχωρίζοντα µε ένα κατάλοιπο γλυκίνης (σύνδεσµος). Το αµινοξύ αυτό αλληλεπιδρά ως εύκαµπτη άρθρωση στρέφοντας το πολυπεπτίδιο µεταξύ των δύο ελίκων και επάγοντας τον σχηµατισµό υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων. Η δεύτερη R έλικα (αναγνώρισης) προσδένεται στην µεγάλη αύλακα και αλληλεπιδρά µε το σακχαροφωσφορικό σκελετό. [5] Η δοµή ΗΤΗ αλληλεπιδρά µε συγκριµένα κατάλοιπα της µεγάλης αύλακας του DNA. Η ανωτέρω περιοχή σύνδεεται µε το «σώµα» της πρωτεΐνης µέσω µιας άρθρωσης (hinge), η οποία σχηµατίζει µια α-έλικα µόνο κατά την πρόσδεση του LacR στον χειριστή (κατάλοιπα 50-60). Η κεφαλή του καταστολέα αποτελείται από την περιοχή ΗΤΗ µαζί µε την άρθρωση. Οι αντιπαράλληλες έλικες της άρθρωσης αποτελούν τον σύνδεσµο της κεφαλής µε τις αζωτούχες βάσεις της µικρής αύλακας στο κέντρο του χειριστή. O µηχανισµός δέσµευσης του LacR στο DNA είναι ίδιος µε εκείνον του καταστολέα πουρινών (PurR). Στις αλληλεπιδράσεις αυτές το DNA υιοθετεί Β-διαµόρφωση µε ηπίου βαθµού παραµόρφωση-κάµψη. [5] Η κεντρική λειτουργική περιοχή (κατάλοιπα ) αποτελείται κυρίως από 2 υποπεριοχές µε παρόµοια δοµή (κεντρική λειτουργική περιοχή 1 και 2). Κάθε µία εξ αυτών φέρει ένα εξάκλωνο, παράλληλο β-πτυχωτό φύλλο ανάµεσα σε 2 α-έλικες (α/β/α). Ανήκει στην υπεροικογένεια των πρωτεϊνών περιπλασµικού χώρου µε το χαρακτηριστικό µοτίβο της διωναίας (σαρκοφάγο φυτό). Ο επαγωγέας προσδένεται σε µια σχισµή µεταξύ αµινοτελικού και καρβοξυτελικού άκρου. Στο καρβοξυτελικό (C-terminal) εντοπίζεται µια α-έλικα µε διπλή επανάληψη µιας επτάδας καταλοίπων Leu (Leucine heptad repeats) και ονοµάζεται περιοχή ολιγοµερισµού. Οι έλικες ολιγοµερισµού συνδέουν το κάθε µονοµερές σταθεροποιώντας την τετραµερή δοµή του καταστολέα. [3] Εικόνα 2. Η τρισδιάστατη δοµή: a) του συµπλέγµατος του τετραµερούς LacR µε τον χειριστή O. Το DNA προσδένεται σε κάθε διµερές εντός του τετραµερούς. Με µπλε-γκρι χρώµα απεικονίζεται το αριστερό και µε πράσινο-ροζ το δεξιό ήµισυ του χειριστή, b) του µονοµερούς LacR παρουσία (χρυσό) και απουσία 5

6 (µαύρο) του DNA. Η DBD εµφανίζει υψηλή κινητικότητα στην δοµή της απoπρωτεiνης. Η C-terminal περιοχή, αντίθετα µε την N-terminal, µετακινείται ελάχιστα κατά την πρόσδεση επαγωγέα ή DNA. Η N- terminal εκτελεί κίνηση που παραπέµπει στο άνοιγµα του καπακιού ενός βάζου µαρµελάδας, c) του µονοµερούς LacR µε έµφαση στις διασυνδέσεις µεταξύ των Ν,C-terminal περιοχών, d) του συµπλέγµατος (ειδικού και µη) του DNA µε την DBD (κατάλοιπα 1-62) Παρουσία του επαγωγέα αίρεται η κατασταλτική δράση του LacR µε την δραµατική µείωση της συγγένειας του για τον Ο σε µη ειδικά επίπεδα. Η σύνδεση του στην C-terminal περιοχή της δοµής ολιγοµερισµού επηρεάζει την DBD της N-terminal περιοχής που βρίσκεται 40 Å πιο µακριά. Η διαβίβαση του αλλοστερικού σήµατος γίνεται από την περιοχή ολιγοµερισµού. Η αναδίπλωση του LacR ή η παραµόρφωση του ds DNA δεν έχει ιδιαίτερη σηµασία διότι και τα 2 δεν αλλάζουν τις δοµές τους κατά την µη ειδική σύνδεση. [5] Από την τρισδιάστατη απεικόνιση του κρυστάλλου της πρωτεΐνης προκύπτει ότι ο τετραµερής καταστολέας είναι στην πραγµατικότητα ένα διµερές διµερών. Κάθε διµερές περιέχει τα N- terminal των δύο µονοµερών σε χαλαρή σύνδεση, την σχισµή-θέση πρόσδεσης του επαγωγέα και ένα ύδροφοβο πυρήνα. Οι C-terminal περιοχές του κάθε µονοµερούς προεξέχουν ως παράλληλες έλικες. Η κεφαλή του LacR ενώνεται στις N-terminal περιοχές στο πάνω µέρος. Ο τετραµερής πυρήνας συγκρατείται από ένα δεµάτιο 4 α-ελίκων στην C-terminal περιοχή κατά την αλληλεπίδραση των διµερών. Το διµερές καλύπτει περιοχή 2200Å κατά µήκος του χειριστή, ενώ η προσθήκη επαγωγέα προκαλεί κίνηση της N-terminal περιοχής σε σχέση µε το σύµπλοκο LacR-O. Αντίθετα, η C-terminal περιοχή δεν µεταβάλλει τον προσανατολισµό της. Η χηµική κατεργασία της πρωτεΐνης και η φασµατοφωτοµετρία υπεριώδους (UV) έδειξαν ότι η πρόσδεση του επαγωγέα µεταβάλλει την ταχύτητα καθίζησης (S) και καθιστά τα αρωµατικά αµινοξέα ανθεκτικά στη θρυψίνη λόγω διαµορφωτικών αλλαγών (ισοµερισµός). [3] Ο LacR συνδέει το ένα διµερές µε τον κύριο χειριστή O1 και το άλλο µε ένα από τους βοηθητικούς (O2,O3). Η δοµή της lac κεφαλής (HP51) µαζί µε το ήµισυ του χειριστή ήταν το πρώτο υβρίδιο DNA-πρωτεΐνης που αποµονώθηκε µέσω NMR φασµατοσκοπίας. [5] Παρουσία του επαγώγεα αποσταθεροποιείται η σύνδεση των ελίκων της άρθρωσης στην µικρή αύλακα του χειριστή. Τα αµινοξέα στην θέση αυτή είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα σε µη συνώνυµες µεταλλαγές. Η παραµόρφωση του DNA χρησιµεύει ως σήµα µοριακής αναγνώρισης λόγω της σφικτής πρόσδεσης του καταστολέα. Οι θερµοδυναµικές αλλαγές περιλαµβάνουν µεταβολή στην εντροπία µε την ενθαλπία του συστήµατος να παραµένει σταθερή. Αποτέλεσµα της η αύξηση της συστροφής, των γωνιών τον βάσεων και η απόκλιση της µικρής και της µεγάλης αύλακας από το πρότυπο του B-DNA. Για την προσέγγιση των DNA και πρωτεΐνης απαιτείται εναλλακτική διαµόρφωση του LacR µαζί µε την εξαρτώµενη από την αλληλουχία ικανότητα του χειριστή να τροποποιεί την στερεοδιάταξη του συνδεόµενου καταστολέα. 6

7 Μηχανισµοί αλληλεπίδρασης DNA και πρωτεϊνών: Το παράδειγµα του καταστολέα LacR Οι διάφοροι επαγωγείς προκαλούν χαρακτηριστική µείωση της συγγένειας του καταστολέα για το χειριστή in vitro. Αυτές οι αλλαγές συσχετίζονται µε την αποτελεσµατικότητα των επαγωγέων in vivo, υποδηλώνοντας ότι η επαγωγή προκύπτει από µια µείωση στην έλξη µεταξύ του χειριστή και του καταστολέα. Έχουν προταθεί δύο µοντέλα για το πως επιτυγχάνεται αυτό: [4] Το πρώτο, το µοντέλο ισοζυγίου (equilibrium model), προϋποθέτει ότι τα µόρια καταστολέα που είναι προσδεδεµένα στο DNA βρίσκονται σε ταχεία ισορροπία µε τα ελεύθερα µόρια καταστολέα. Ο επαγωγέας µπορεί να προσδεθεί στον ελεύθερο καταστολέα, µε αποτέλεσµα να διαταράξει τη χηµική αυτή ισορροπία και να αποτρέψει την πρόσδεση του καταστολέα ξανά στο DNA. Ωστόσο, ο ρυθµός της αυθόρµητης αποδέσµευσης του καταστολέα από το χειριστή είναι υπερβολικά αργός για να είναι συµβατός µε αυτό το µοντέλο (ο χρόνος ηµιζωής in vitro, απουσία του επαγωγέα, είναι >15 min). Σύµφωνα µε το δεύτερο µοντέλο, ο επαγωγέας µπορεί να δεσµευτεί στον καταστολέα που είναι προσδεδεµένος στο DNA, προκαλώντας µια δοµική αλλαγή η οποία αποδεσµεύει τον καταστολέα από τον χειριστή. Πράγµατι, η προσθήκη IPTG προκαλεί την άµεση αποσταθεροποίηση του συµπλόκου καταστολέα-χειριστή in vitro, οπότε το µοντέλο αυτό είναι και το ευρέως αποδεκτό. Πειραµατικά αποδείχτηκε ότι η αλλαγή της συγγένειας του καταστολέα για το DNA προκαλείται από τη γενική µεταβολή της χωροδιάταξης της πρωτεϊνης, που καθορίζει την ικανότητα της να δεσµεύει DNA, και όχι από την δηµιουργία ή τη διάσπαση ενός ή µερικών µεµονωµένων δεσµών. Η διµερής µορφή του καταστολέα επιτρέπει σε δύο κεφαλές να έρθουν ταυτόχρονα σε επαφή µε το χειριστή, σε µία από τις δύο ηµιθέσεις η καθεµία. Σε µια διµερή µονάδα του καταστολέα οι δύο κεφαλές δηµιουργούν επαφές µε το DNA, εισερχόµενες σε διαδοχικές στροφές της µεγάλης αύλακας, όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Η πρόσδεση του επαγωγέα προκαλεί µια άµεση αλλαγή στη στερεοδιαµόρφωση του καταστολέα: Η πρόσδεση δύο µόνο µορίων επαγωγέα στο τετραµερές του καταστολέα επαρκεί για τη δράση της καταστολής, αφού αλλάζει τον προσανατολισµό των κεφαλών σε σχέση µε την κεντρική επικράτεια, µε αποτέλεσµα οι δύο κεφαλές ενός διµερούς να µη µπορούν πια να προσδεθούν ταυτόχρονα στο DNA. Αυτό εξουδετερώνει το πλεονέκτηµα του τετραµερούς καταστολέα και µειώνει τη συγγένειά του για το χειριστή. Κάθε διµερές του καταστολέα µπορεί να προσδεθεί σε µία αλληλουχία χειριστή. Αυτό καθιστά το τετραµερές του καταστολέα ικανό να προσδεθεί σε δύο θέσεις χειριστή ταυτόχρονα. Πράγµατι, υπάρχουν δύο επιπλέον αλληλουχίες χειριστή στην περιοχή του οπερονίου lac. Ο πρωτότυπος χειριστής, Ο1, βρίσκεται ακριβώς στην αρχή του γονιδίου lacz και έχει την 7

8 ισχυρότερη συγγένεια για τον καταστολέα. Δύο ασθενέστεροι χειριστές (αναφέρονται και ως ψευδο-χειριστές) εντοπίζονται εκατέρωθεν του Ο1. Ο Ο2 βρίσκεται 410 bp καθοδικά από το σηµείο έναρξης και ο Ο3 βρίσκεται 83 bp ανοδικά από αυτό. Όταν µια πρωτεϊνη προσδένεται ταυτόχρονα σε δύο διαφορετικές θέσεις DNA, το DNA ανάµεσα στις δύο αυτές θέσεις σχηµατίζει ένα βρόχο που το µήκος του εξαρτάται από την απόσταση ανάµεσα στις δύο θέσεις πρόσδεσης. Έτσι, όταν ο καταστολέας Lac προσδένεται ταυτόχρονα στον Ο1 και σε έναν από τους άλλους δύο χειριστές η δοµή του DNA ανάµεσά τους παραµορφώνεται σηµαντικά σχηµατίζοντας ένα µικρό βρόχο. Η πρόσδεση στους επιπλέον χειριστές επηρεάζει το επίπεδο καταστολής. Η εξάλειψη του καθοδικού χειριστή (Ο2) ή του ανοδικού (Ο3) µειώνει την αποτελεσµατικότητα της καταστολής κατά 2-4 φορές. Ωστόσο, αν και οι δύο χειριστές εξαλειφθούν, η καταστολή µειώνεται κατά 100 φορές. Αυτό υποδηλώνει ότι η ικανότητα του καταστολέα να προσδένεται στον ένα από τους δύο επιπλέον χειριστές παράλληλα µε τον Ο1 είναι σηµαντική για την εδραίωση της καταστολής. Οι πρωτεϊνες µε υψηλή συγγένεια για µια ειδική αλληλουχία έχουν χαµηλή συγγένεια για οποιαδήποτε άλλη αλληλουχία DNA. Επιπλέον, ένας µεγάλος αριθµός θέσεων χαµηλής συγγένειας θα ανταγωνιστεί το ίδιο καλά για την πρόσδεση ενός τετραµερούς καταστολέα, όπως ο καταστολέας LacR, όσο και ένας µικρός αριθµός θέσεων υψηλής συγγένειας.στο γονιδίωµα της E.coli υπάρχει µόνο µια θέση υψηλής συγγένειας για τον καταστολέα LacZ, ο χειριστής.το υπόλοιπο DNA περιέχει θέσεις πρόσδεσης χαµηλής συγγένειας.(4,2 Χ 10 6 θέσεις χαµηλής συγγένειας στο γονιδίωµα της Ε.coli ). Ο µεγάλος αριθµός αυτών των θέσεων σηµαίνει ότι ακόµα και αν απουσιάζει η ειδική θέση πρόσδεσης του καταστολέα, όλη σχεδόν η ποσότητα του θα βρίσκεται προσδεδεµένη στο DNA και δεν θα υπάρχει ελεύθερος καταστολέας. Αυτό σηµαίνει ότι έχουµε να κάνουµε µε την κατανοµή (partioning) του καταστoλέα στο DNA, όπου η µοναδική θέση υψηλής συγγένειας του χειριστή ανταγωνίζεται µε το µεγάλο αριθµό θέσεων χαµηλής συγγένειας. Σε αυτόν τον ανταγωνισµό, οι απόλυτες τιµές των σταθερών πρόσδεσης για το χειριστή και τις υπόλοιπες θέσεις δεν είναι σηµαντικές από µόνες τους αλλά σηµαντική παράµετρος είναι ο λόγος τους. Η προσθήκη του επαγωγέα µειώνει σηµαντικά την ικανότητα πρόσδεσης του καταστολέα στον χειριστή. Οι καταστολείς που ήταν προσδεδεµένοι στον χειριστή αποδεσµεύονται και προσδένονται σε θέσεις χαµηλής συγγένειας. Έτσι, σε ένα επαγόµενο κύτταρο, τα τετραµερή του καταστολέα αποθηκεύονται στις τυχαιές θέσεις του DNA. Αντίθετα σε ένα µη επαγόµενο κύτταρο, ενα τετραµερές βρίσκεται συνδεδεµένο στον χειριστή και τα υπόλοιπα στις τυχαίες θέσεις. Συνεπώς το αποτέλεσµα της επαγωγής είναι να αλλάζει την κατανοµή του καταστολέα στο DNA παρά να δηµιουργεί ελεύθερους καταστολείς. Ο καταστολέας µεταβάλλεται ανάµεσα σε δύο διακριτές δοµές, την R και R *. H R επιτυγχάνεται απουσία του επαγωγέα µε τον καταστολέα να έχει υψηλότερη συγγένεια ως προς τον χειριστή και η R * επιτυγχάνεται παρουσία του επαγωγέα µε τον καταστολέα να αποκτά υψηλότερη συγγένεια ως προς τον επαγωγέα. Η διαφορά ανάµεσα στις δύο δοµές έγκειται σε µία µικρή στροφική κίνηση των δύο Ν τελικών περιοχών σε σχέση µε τις 2 C τελικές περιοχές. Η 8

9 προσθήκη επαγωγέα στο κύτταρο οδηγεί σε αλλαγή του λόγου [R]/[R * ] µειώνοντας τον, δηλαδή αυξάνωντας την συγκέντρωση του καταστολέα που βρίσκεται στην R * δοµή. Απουσία του επαγωγέα ο καταστολέας προσδένεται στον χειριστή για µεγάλο χρονικό διάστηµα(περίπου 1600s), και έπειτα αποχωρίζεται. Η πολυµέραση εκείνη την στιγµή έχει ελάχιστο χρόνο για να ξεκινήσει την µεταγραφή (χρείαζεται τουλάχιστον 60s). Παρουσία του επαγωγέα, ο καταστολέας που βρίσκεται στην R* µορφή, µπορεί και πάλι να προσδένεται στον χειριστή αλλα µε πολύ µικρότερη συγγένεια. Η πολυµέραση τότε έχει περισσότερο χρόνο για να ξεκινήσει την µεταγραφή του οπερονίου, γιατί ο καταστολέας συνδεέται για λιγότερο χρόνο στον χειριστή από ότι προηγουµένως, και διότι χρειάζεται περισσότερο χρόνο να επανασυνδεθεί στον χειριστή λόγω της χαµηλότερης συγγένειας. Αυτό µας οδηγεί στα εξής δύο συµπεράσµατα: Εικόνα 3. Οι δύο διακριτές δοµές του καταστολέα Lac Η καταστολή απουσία επαγωγέα έχει διαρροές αφού τα γονίδια του οπερονίου µεταγράφονται σε πολύ µικρό ρυθµό όταν ο καταστολέας αποχωρίζεται για ελάχιστο χρόνο από τον χειριστή. Αυτή η διαρροή όµως έιναι επιτακτική για το κυττάρο, καθώς τα προϊόντα αυτής της µεταγραφής βοηθούν να εισέρχεται η λακτόζη στο κύτταρο, όταν υπάρχει στο θρεπτικό υλικό, και να επιτελεί το ρόλο του επαγωγέα. Η ποσότητα του επαγωγέα καθορίζει τον ρυθµό της µεταγραφής των γονιδίων. Πράγµατι όσο περισσότερος επαγωγέας υπάρχει στο κύτταρο, τόσο περισσότερο µικραίνει ο λόγος R/R* µε αποτέλεσµα ο καταστολέας να προσδένεται όλο και λιγότερο χρόνο στον χειριστή και η πολυµεράση να έχει περισσότερο χρόνο να µεταγράψει τα γονίδια. Η συγγένεια µεταξύ του χειριστή και του καταστολέα επηρεάζει τόσο την διαρροή όσο και την ικανότητα επαγωγής του συστήµατος. O καταστολέας αναγνωρίζει συγκεκριµένες βάσεις στην µεγάλη αύλακα του χειριστή χρησιµοποιώντας µια δοµή έλικας-στροφής-έλικας όπου συγκεκριµένες πλευρικές αλυσίδες αµινοξέων αναγνωρίζουν τις βάσεις στην µεγάλη αύλακα. Τροποποιώντας την νουκλεοτιδική αλληλουχία του χειριστή ή ορισµένα αµινοξικά κατάλοιπα του καταστολέα, επηρεάζεται η συγγένεια πρόσδεσης καταστολέα-χειριστή. Για παράδειγµα ένα τελείως συµµετρικό κοµµάτι DNA το οποίο περίεχει µια τελείως ανεστραµµένη περιοχή του αριστερού τµήµατος του χειριστή συνδέεται στο καταστολέα 10 φορές ισχυρότερα από την 9

10 φυσιολογική ακολουθία. Παρόµοια αύξηση της συγγένειας παρατηρείται και όταν αλλάζουµε ορισµένα αµινοξικά κατάλοιπα της περιοχής του καταστολέα που αναγνωρίζει τον χειριστή. Αυξάνοντας την συγγένεια µεταξύ καταστολέα και χειριστή µειώνουµε σηµαντικά το ποσοστό της διαρροής, όµως περιορίζουµε το δυναµικό εύρος επαγωγής του συστήµατος. Ο επαγωγέας, είτε µέσω επαγώµενης διάσπασης είτε µέσω διαµορφωτικής επιλογής, σταµατάει την καταστολή δηµιουργώντας έναν δεσµό µεταξύ της Ν-τελικής περιοχής και της C-τελικής περιοχής του καταστολέα. Επιπλέον δηµιουργείτε ένα εκτεταµένο δίκτυο υδρογονικών δεσµών µεταξύ του καταστολέα και του επαγωγέα. Όλα τα άτοµα οξυγόνου του γαλακτοσιδικού δακτυλίου σχηµατίζουν δεσµούς υδρογόνου είτε αλληλεπιδρώντας άµεσα µε τις πλευρικές αλυσίδες των αµινοξέων του καταστολέα είτε διαµέσου µορίων νερού. Η αλλοστερική διαφοροποιήση µε την οποία ο καταστολέας αποχωρίζεται απο τον χειριστή µεταφέρεται διαµέσου της αλληλεπίδρασης µονοµερούς-µονοµερούς του καταστολέα και προφανώς δεν αρκεί ένα µόνο µονοµερές για αυτό, ενισχύοντας την άποψη ότι οι αλλοστερικές πρωτεϊνες δεν είναι δυνατόν να είναι µονοµερείς. Μεταλλαγµένοι καταστολείς οι οποιοί συνδέεονται στον χειριστή µε την ίδια συγγένεια που συνδέεται ο καταστολέας αγρίου τύπου αλλά δεν µπορούν να προκαλέσουν επαγωγή της µεταγραφής χαρακτηρίζονται ως I s µεταλλάγµατα. Αυτά τα µεταλλάγµατα είναι είτε ανίκανα να συνδεθούν µε τον επαγωγέα ή ανίκανα να µεταφέρουν το αλλοστερικό σήµα. Αυτές οι µεταλλαγές εντοπίζονται κυρίως σε 5 γενικευµένες περιοχές όσο αναφορά στην γραµµική ακολουθία, αλλά όσον αναφορά την τρισδιάστατη δοµή του µορίου εµφανίζονται είτε στην περιοχή σύνδεσης του καταστολέα είτε στις περιοχές που συµµετέχουν στις αλληλεπιδράσεις µεταξύ των µονοµερών δηλαδή τις Ν τελικές περιοχές. Το διµερές του καταστολέα LacR έχει την ικανότητα να συνδέεται στον χειριστή αλλά και στον επαγωγέα καθώς και να µεταφέρει το αλλοστερικό σήµα. Το αλλοστερικό σήµα δηµιουργείται στην περιοχή που συνδέεται ο επαγωγέας στον καταστολέα και µεταδίδεται στην κεφαλή αλλάζοντας των προσανατολισµώ των Ν-τελικών περιοχών. Το κυριότερο αµινοξύ που συµµετέχει στον αλλοστερικό αυτόν µετασχηµατισµό βρέθηκε ότι είναι το ασπαρτικό οξύ D149. Αλλάζωντας αυτό το αµινοξύ σε οποιοδήποτε άλλο δηµιουργούµε είτε έναν υπερ-καταστολέα ή ένα µόριο που αδυνατεί να προσδεθεί στον χειριστή. Πιο συγκεκριµένα κινήσεις δηµιουργούνται ασύµµετρα στην περιοχή στην οποία συνδέεται ο επαγωγέας κοντά στο αµινοξύ D149 ένός µονοµερούς και µεταδίδεται στο γειτονικό του µέσω ενός δικτύου µη οµοιοπολικών δεσµών τριών συνδεδεµένων διαδροµών. Οι πρώτες αλλαγές ξεκινούν στην περιοχή πρόσδεσης του επαγωγέα ενός µονοµερούς και µεταδίδεται διαµέσου της κεντρικής β-πτυχωτής επιφάνειας του πυρήνα της Ν-τελικής περιοχής στη περιοχή αλληλεπίδρασης των Ν τελικών περιοχών των µονοµερών που περιλαµβάνουν το κατάλοιπο Κ84. Σε αυτό το σηµείο, το Κ84 εξέρχεται από την υδροφοβική περιοχή, µέσω ενός δεύτερου µονοπατιού το οποίο έχει ως αποτέλεσµα την δηµιουργία παροδικών δεσµών µεταξή των Η74 και Η74'. Αυτή η αλληλεπίδραση είναι µέρος και του τρίτου µονοπατιού το οποίο συµβαίνει κοντά στην περιοχή σύνδεσης του επαγωγέα και πιο συγκεκριµένα κοντά στο κατάλοιπο F

11 Οι ενδιάµεσες δοµές παρουσιάζουν σηµαντική ασσυµετρία µεταξύ του οµοδιµερούς. Όλες αυτές οι αλλαγές έχουν ως αποτέλεσµα την αλλαγή θέσης των Ν-περιοχών, η οποία µε την σειρά της τροποποιεί τις απαιτούµενες θέσεις επαφής στην περιοχή σύνδεσης µε το DNA που εν τέλει έχει ως αποτέλεσµα την αλλαγή της συγγένειας. Όταν το DNA συνδέεται στον καταστολέα σχηµατίζεται δισουλφιδικός δεσµός στην θέση 52 του καταστολέα (V52). O δεσµός αυτός διατηρεί την διµερή µορφή του καταστολέα, που είναι απαραίτητη για την σύνδεση DNA-καταστολέα, ο οποίος είναι συνδεδεµένος στο DNA. Πειράµατα ΝΜR που έγιναν κάτω από συνθήκες υψηλής αλατότητας έδειξαν ότι η δοµή έλικαςστροφής-έλικας παραµένει διπλωµένη ενώ η άρθρωση είναι µη δοµηµένη όταν ο καταστολέας είναι ελεύθερος ή συνδεδεµένος σε κάποια θέση χαµηλής συγγένειας στο DNA. Επιπλέον η σηµαντική ελαστικότητα της περιοχής σύνδεσης µε το DNA του καταστολέα του επιτρέπει να σκανάρει γραµµικά και σε µία διάσταση τo DNA. Όταν ο χειριστής στον οποίο θα προσδεθεί αναγνωριστεί από τον καταστολέα η άρθρωση αυθόρµητα αλλάζει µορφή και αλληλεπιδρά αµέσως µε την µικρή αύλακα του κοντινότερου παλίνδροµου χειριστή. [3] Η επιτυχής καταστολή του συστηµάτος απαιτεί την σύνδεση ενός από τα διµερή του καταστολέα µε τον Ο1 και στην συνέχεια την σύνδεση του άλλου διµερούς είτε µε τον Ο2 είτε µε τον Ο3. Το DNA αρχικώς αναγνωρίζεται από την δοµή έλικας-στροφής-έλικας της κεφαλής, µια δοµή που συναντάται σε πολλούς οργανισµούς και θεωρείται αρκετά συντηρηµένη. Αποτελείται από δύο µικρές α-έλικες οι οποίες χωρίζονται από ένα µικρό συνδέτη που φέρει ένα κατάλοιπο γλυκίνης. Το αµινοξύ αυτό σε συνδυασµό µε τα γειτονικά του λειτουργούν ως µια άρθρωση που επιτρέπει στις δύο αλυσίδες να πρειστραφούν και να δηµιουργήσουν δεσµούς υδρογόνου µεταξύ τους.η δεύτερη από τις δύο έλικες ονοµάζεται έλικα αναγνώρισης και εισέρχεται στην µεγάλη αύλακα για να σχηµατίσει δεσµούς µε τις βάσεις και τον σακχαροφωσφορικό σκελετό του DNA. [5] Ενδοµοριακές αλληλεπιδράσεις Η αλληλεπίδραση των διµερών είναι αρκετά ισχυρή λόγω του πλήθους των άλληλεπιδράσεων. Ο τετραµερισµός επάγεται από υδρόφοβες άλληλεπιδράσεις µεταξύ επτάδων Leu (Leucine heptad repeats) της C-terminal έλικας του κάθε µονοµερούς. Η ρόλος στον καθορισµό της τεταρτοταγούς δοµής φάνηκε από σηµειακές µεταλλαγές στα αµινοξέα Αυτές δυσχεραίνουν την αλληλεπίδραση των ελίκων ολιγοµερισµού µε αποτέλεσµα να προκύπτουν δύο ασύνδετα διµερή. Υπάρχουν 4 βασικές οµάδες αµινοξέων (70-100, , , ) υπεύθυνες για τον διµερισµό των µονοµερών. Σηµειακές µεταλλαγές στα παραπάνω κατάλοιπα συνήθως οδηγούν σε µονοµερή (µη λειτουργικό) καταστολέα. [5] Διαµοριακές αλληλεπιδράσεις Ο τετραµερής LacR προσδένεται µε τα 2 διµερή του σε 2 ανεξάρτητους και συµµετρικούς χειριστές (dsdna). Συνήθως απέχουν από 93 έως και 401bp. Τα διµερή του καταστολέα προσδένονται στους χειριστές και σχηµατίζουν µια θηλιά (βρόχος). Η δοµή αυτή δυσχεραίνει ακόµη περισσότερο την προσέγγιση της RNA πολυµεράσης συγκριτικά µε την απλή πρόσδεση 11

12 ενός διµερούς. Προφανώς ο µηχανισµός αυτός εξελίχθηκε για αυστηρότερη ρύθµιση του lac οπερονίου στα βακτηριακά κύτταρα, καταδεικνύοντας την σηµασία της ρύθµισης του µεταβολισµού. Εικόνα 4. Τα διαδοχικά στιγµιότυπα κατά τον σχηµατισµό βρόχου στο DNA σύµφωνα µε το µοντέλο της προσοµοίωσης των Villa et al, 2005 Η αλληλουχία του αλληλεπιδρά κυρίως µε την κεφαλή της πρωτεΐνης. Οι 2 έλικες αναγνώρισης της HTH (λειτουργική περιοχή της DBD) ευθύνονται για την πρόσδεση στο DNA (Asn25,His29) (Slipjer et al, 1997). Επαφή της His-29 του µονοµερούς µε την Thy-3 της µεγάλης αύλακας ελαττώνουν την ευκαµψία της θηλιάς στο µοτίβο HTH. Επίσης στην αύξηση της κινητικότητας του LacR συµβάλλουν τα κατάλοιπα Gln18 and Arg22. Η Leu56 διαµεσολαβεί την άµεση προσέγγιση του µονοµερούς στην µικρή αύλακα. Πρόσδενεται πλησίον του κεντρικού ζεύγους GC και µειώνει το µήκος της µικρής αύλακας. Το γεγονός αυτό προκαλεί κάµψη στο DNA (συνολικά 60Å). Τα τµήµατα DNA στις θέσεις πρόσδεσης του LacR απέχουν ~25Å και δεν φαίνεται να αλληλεπιδρούν. Εικόνα 5. Η δοµή της κεφαλής (headpiece) του διµερούς κατά την πρόσδεση της στον χειριστή Ο1. Με µωβ και µπλε χρώµα φαίνονται οι έλικες αναγνώρισης και άρθρωσης για την κάθε πλευρά του διµερούς. Σηµειώνονται οι ειδικές επαφές καταλοίπων του διµερούς µε το dsdna. Στην αλληλουχία του χειριστή διακρίνεται το κεντρικό ζεύγος βάσεων και οι µη συµµετρικές αλληλουχίες (8_ 12) 12

13 Ο συνηθέστερος µη µεταβολίσιµος επαγωγέας (IPTG) προσδένεται στην υποπεριοχή των πυρήνων του διµερούς. Συγκεκριµένα, τα κατάλοιπα Leu73, Ala75, Pro76, Ile79, Trp220, Phe293 σχηµατίζουν µια σχισµή (cleft) για την πρόσδεση του σακχάρου. Επειδή το µόριο είναι ηµισυµµετρικό αλληλεπιδρά µε την πρωτεΐνη µε 2 τρόπους. Πρώτον, τα άτοµα Ο 2-6 των υδροξυλοµάδων του σακχάρου σχηµατίζουν δεσµούς υδρογόνου µε την ΝΗ2 οµάδα των Asn246, Arg197 και το καρβοξύλιο του Asp149. Δεύτερον, η ισοπροπυλοµάδα του επαγωγέα σχηµατίζει δεσµούς Van der Waals µε το ινδόλιο της Trp220. Κατά την επαγώγιµη µορφή σηµειώνονται επίσης και ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις µεταξύ των ζευγαριών (διµερές): Lys84 και Glu100, Gln117 και Arg118, His 74 και Asp 278. Στις παραπάνω κατάλοιπα παρατηρείται εκτροπή του ασύµµετρου C a κατά 3Å. Εικόνα 6. (Λακ_αλλοστερυ) Η πρόσδεση του επαγωγέα διασυνδέει τις Ν (κάτω) και C-terminal (πάνω) υποπεριοχές του πυρήνα της πρωτείνης. Το σύµπλοκο σταθεροποιείται από δεσµούς υδρογόνου παρουσία µορίων Η 2 Ο. Η επαγώµενη (αποσύνδεση από το DNA) στερεοδιαµόρφωση του LacR εξαρτάται από την κινητικότητα της κεφαλής. Αλλαγές στην Ν-terminal περιοχή, παρουσία επαγωγέα, οδηγούν σε µετατόπιση του ασύµµετρου ατόµου C a 62. Το αµινοξύ αυτό αποτελεί τον σύνδεσµο της άρθρωσης µε τον πυρήνα της πρωτεΐνης. Η αλλαγή αυτή οδηγεί σε διαταραχή της δοµής της α- έλικας της άρθρωσης, αποµάκρυνση της ΗΤΗ από το dsdna και µείωση της συγγένειας του LacR για τον χειριστή. Ο µηχανισµός αυτός µοιάζει µε εκείνον της αποσύνδεσης του Ο 2 από την οξυαιµοσφαιρίνη. Μεταλλαγές στην περιοχή πρόσδεσης του σακχάρου ή σε θέσεις µε υψηλή κινητικότητα οδηγούν σε Ι S φαινότυπο. Δηλαδή, ο καταστολέας βρίσκεται συνεχώς προσδεδεµένος στο DNA και τα δοµικά γονίδια καταστέλλονται ανεξάρτητα από την παρουσία του επαγωγέα. Αφορούν κυρίως οµάδες αµινοξέων (70-80, , , ) που συγκροτούν την θέση πρόσδεσης του επαγωγέα. Τα κατάλοιπα συµµετέχουν σε αλλοστερικές αλλαγές και σχηµατίζουν β-φύλλο στην N-terminal περιοχή του πυρήνα κατά την συγκρότηση του διµερούς. [8] 13

14 Μη ειδική σύνδεση και ειδική σύνδεση Ο καταστολέας συνδέεται µη ειδικά στο DNA επιτρέποντας του να ολισθήσει επάνω του µέχρι να συναντήσει την ειδική αλληλουχία του χειριστή. Κατά την µη ειδική σύνδεση η άρθρωση έχει µια χαλαρή δοµή. Όταν το DNA αναγνωρίσει την αλληλουχία του χειριστή, οι µη ειδικές αλληλεπιδράσεις δίνουν την θέση τους σε πιο ειδικές αλληλεπιδράσεις. Κατα την διάρκεια αυτής της αλλαγής, η περιοχή της άρθρωσης αλλάζει διαµόρφωση, δηµιουργώντας α-έλικες οι οποίες συνδέονται στην µικρή αύλακα του DNA. Όπως θα αναφερθεί παρακάτω αυτή η αλληλεπίδραση σταθεροπεί την "kink'' δοµή του DNA. Αναγνώριση DNA Οι πρωτείνες συνήθως αναγνωρίζουν συγκεκριµένες αλληλουχίες DNA στην µεγάλη αύλακα του DNA µε άµεση ανάγνωση, δηµιουργώντας ειδικούς δεσµούς υδρογόνου µε τα άκρα συγκεκριµένων βάσεων του DNA που είναι εκτεθειµένα στην µεγάλη αύλακα του DNA. Αναγνώριση αλληλουχιών του DNA γίνεται και στην µικρή αύλακα του DNA, συχνά συνοδευόµενη από συστροφές ή κάµψεις του DNA, που θα αναλυθούν παρακάτω. Σε αυτή την περίπτωση, η άµεση ανάγνωση είναι λιγότερο σηµαντική αφού οι 4 βάσεις του DNA δεν εµφανίζουν ειδικές επιφάνειες δηµιουργίας υδροφοβικών δεσµών, όπως συµβαίνει στην µεγάλη αύλακα του DNA. Αντίθετα αυτό που φαίνεται να διαδραµατίζει σηµαντικότερο ρόλο είναι η αναγνώριση του σχήµατος του DNA. Σε πολλές περιπτώσεις, θετικά φορτισµένες αργινίνες έλκονται σε µια περιοχή της µικρής αύλακας µε ισχυρά αρνητικό φορτίο µε αποτέλεσµα την στένωση της µικρής αύλακας. Τότς το DNA αναγνωρίζει το αλλαγµένο σχήµα του DNA. Στο σύµπλοκο του καταστολέα µε τον χειριστή, ένα ζεύγος απο αργινίνες (Arg51, µία από κάθε αλυσίδα του διµερόυς) βρίσκονται κοντά στην µικρή αύλακα αλλά ο προσανατολισµός τους είναι προς το εξωτερικό. [8] Κάµψεις DNA ( DNA kinks) Το DNA λέµε ότι έχει καµφθεί όταν η κάθετη επαφή µεταξύ δύο συνεχόµενων ζευγών βάσεων έχει διαταραχθεί. To DNA σε κάθε πλευρά της κάµψης µπορεί να είναι είτε ευθές είτε συνεστραµµένο. Κάµψη συµβαίνει και στο σύµπλοκο του καταστολέα µε το DNA καθώς ένα ζευγάρι βάσεων CpG (στον ίδιο κλώνο, όχι συµπληρωµατικές) διαχωρίζεται µερικώς από το γειτονικό του ζευγάρι CpG. Γενικά τα ζευγάρια βάσεων πυριµιδίνη-πουρίνη έχουν της ασθενέστερες κάθετες αλληλεπιδράσεις και είναι θέσεις στις οποίες γίνονται συχνότερα οι κάµψεις. Στο σύµπλοκο καταστολέα χειριστή, δύο λευκίνες (Leu56) παρατίθονται µερικώς ανάµεσα στα διαχωρισµένα CpG ζευγάρια, γεγονός που σταθεροποιεί την κάµψη. Πολλές φορές οι κάµψεις προϋπάρχουν της σύνδεσης της πρωτείνης. [9] 14

15 Συστροφές DNA (DNA bents) Σε αντίθεση µε της κάµψεις του DNA, συστροφή ονοµάζουµε µια καµπυλότητα στο DNA που αφορά αρκετές βάσεις και όχι µόνο µία όπως η κάµψη. Χαρακτηριστικό παράδειγµα συστροφής συναντούµε στο σύµπλοκο DNA και ΗPV E2 πρωτείνης. [9] Εφαρµογές του Lac operon στη Βιοτεχνολογία Η Συνθετική Βιολογία είναι ένας νέος κλάδος της επιστήµης της Βιολογίας που εµπλέκει επίσης τα Μαθηµατικά, την Πληροφορική και τη Μηχανική. Οι επιστήµονες αυτού του κλάδου σχεδιάζουν και πραγµατοποιούν αλλαγές στο γενετικό υλικό των κυττάρων ώστε τα τροποποιηµένα προϊόντα που προκύπτουν να έχουν εφαρµογή στην Ιατρική, στη Βιοµηχανία, στην Ενέργεια, στην Τεχνολογία, στο Περιβάλλον. Για να φτιαχτούν τέτοια 'συστήµατα' που µπορούν να παράγουν αποτελεσµατικά τα επιθυµητά προϊόντα, απαιτείται αυστηρός έλεγχος των γενετικών κυκλωµάτων, ώστε να πετυχαίνουµε έναρξη ή τερµατισµό της λειτουργίας του κυκλώµατος ανάλογα µε τα περιβαλλοντικά ερεθίσµατα. Αν το ρυθµιστικό σύστηµα δεν δουλεύει σωστά, τότε πιθανώς υπάρχει πρόβληµα στη λειτουργία όλου του κυτταρικού 'εργοστασίου', και για αυτό το λόγο έχουν πραγµατοποιηθεί µελέτες µε στόχο τη µείωση της διαρροής στη µεταγραφή τέτοιων ρυθµιστικών συστηµάτων, και κυρίως στο οπερόνιο της λακτόζης στην E.coli, που αποτελεί το πιο δηµοφιλές και ευρέως διαδεδοµένο σύστηµα στο πεδίο της Βιοτεχνολογίας. Είναι σηµαντικό να αναφερθεί ότι το πλασµιδιακό Lac operon που χρησιµοποιείται στη Βιοµηχανία διαφέρει σε αρκετά σηµεία από το χρωµοσωµικό οπερόνιο του βακτηρίου, όπως στο γεγονός ότι η πρωτεϊνη καταστολέας συνδέεται µόνο σε µια αλληλουχία πρόσδεσης, εποµένως η διαρροή στη µεταγραφή είναι αρκετά µεγαλύτερη. Επιπλέον, το DNA στο πλασµιδιακό οπερόνιο δε δηµιουργεί σωστά το βρόχο κατά την πρόσδεση του καταστολέα, ενισχύοντας έτσι περισσότερο τη µη αποτελεσµατική καταστολή. Έτσι, γίνονται διαρκώς µελέτες για την βελτίωση του συστήµατος (ελαχιστοποίηση της διαρροής- µεγαλύτερα επίπεδα επαγωγής), αφού η προβλέψιµη ρύθµιση των δοµικών γονιδίων του οπερονίου επιτρέπει το σχεδιασµό και την κατασκευή γενετικών κυκλωµάτων (circuits), άρα και τεχνητών κυττάρων-εργοστασίων που θα παράγουν επιθυµητά προϊόντα µε ποικίλες εφαρµογές στη Βιοτεχνολογία. Βιβλιογραφία 1)Benjamin Lewin, 2004, Genes VIII. Pearson Education Inc. 2) Charles E. Bell, Mitchell Lewis, 2001, Crystallographic Analysis of Lac Repressor Bound to Natural Operator O1. J.Mol. Biol., ) C.J Wilson, H.Zan, L.Swint-Kruse, K.S. Matthews, 2007, The Lactose Repressor System: paradigms for regulation, allosteric behavior and protein folding. Cellular and Molecular Life Sciences, 64,

16 4) Mitchell Lewis, 2013, Allostery and the lac Operon, Department of Biochemistry and Biophysics, School of Medicine, University of Pennsylvania 5) Charalampos G. Kalodimos, Rolf Boelens, Robert Kaptein, 2004, Toward an Integrated Model of Protein DNA Recognition as Inferred from NMR Studies on the Lac Repressor System, American Chemical Society 6) Konrad Beyreuther, Klaus Adler, Norbert Geisler, Alex Klemm, 1973, The Amino-Acid Sequence of Lac Repressor, Proc. Nat. Acad. Sci. USA ) Pallavi Penumetcha, Kin Lau, Xiao Zhu, Kelly Davis, Todd T. Eckdahl, A. Malcolm Campbell, 2010, Improving the Lac System for Synthetic Biology, Bios 81(1): ) 9) 16