ΜΕΛΕΤΗ ΒΙΟΜΟΡΙΩΝ ΣΕ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΑ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΑΥΤΟΑΝΟΣΑ ΡΕΥΜΑΤΙΚΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΠΡΟΛΗΠΤΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ: ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΣΟΦΙΑ ΚΟΥΙΔΟΥ-ΑΝΔΡΕΟΥ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ Αριθμ ΜΕΛΕΤΗ ΒΙΟΜΟΡΙΩΝ ΣΕ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΑ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΑΥΤΟΑΝΟΣΑ ΡΕΥΜΑΤΙΚΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ ΝΙΚΗΦΟΡΟΥ ΔΗΜΗΤΡΑ ΙΑΤΡΟΣ ΡΕΥΜΑΤΟΛΟΓΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2012

2 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΝΤΑΟΥΝΤΑΚΗ ΜΑΡΙΑ, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια (επιβλέπουσα) ΧΙΤΟΓΛΟΥ ΣΟΥΛΤΑΝΑ, Ομότιμος Καθηγήτρια ΓΑΡΥΦΑΛΛΟΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ, Καθηγητής ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΝΤΑΟΥΝΤΑΚΗ ΜΑΡΙΑ, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια ΧΙΤΟΓΛΟΥ ΣΟΥΛΤΑΝΑ, Ομότιμος Καθηγήτρια ΓΑΡΥΦΑΛΛΟΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ, Καθηγητής ΒΑΒΑΤΣΗ-ΧΡΙΣΤΑΚΗ ΝΟΡΜΑ, Καθηγήτρια ΚΥΡΙΑΖΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ, Καθηγητής ΜΠΕΝΟΣ ΑΛΕΞΙΟΣ, Καθηγητής ΣΕΤTΑΣ ΛΟΥΚΑΣ, Καθηγητής (Νό 5343/32 ἂ θ. 202 & 2 ί. 1268/82 ἂ θ. 50 & 8)».

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ Βασίλειος Κ. Ταρλατζής Καθηγητής

4

5 Αφιερωμένο στην οικογένεια μου η οποία με στηρίζει όλα αυτά τα χρόνια

6

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ... 1 Α. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Α.1. Ενεργοποίηση Τ λεμφοκυττάρων... 5 Α.2. ΒΙΟΜΟΡΙΑ 2.1. CD26, διπεπτιδύλο πεπτιδάση IV (dipeptil peptidase, DPPIV) Δεαμινάση της Αδενοσίνης (ADA) CD Α.3. ΝΟΣΗΜΑΤΑ 3.1. Ρευματοειδής Αρθρίτιδα Συστηματικός Ερυθηματώδης Λύκος (ΣΕΛ) Οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ) Α.4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 4.1. Τα βιομόρια CD26, CD45 και το ένζυμο ADA στη Ρευματοειδή Αρθρίτιδα και στο Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο Βιβλιογραφική ανασκόπηση Β. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Β.1. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ 1.1. Ασθενείς και μέθοδοι Κλινική και εργαστηριακή αξιολόγηση ασθενών Κυτταρομετρία ροής Ενζυμική ενεργότητα ADA Στατιστική Ανάλυση Β.2. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 2.1. Δημογραφικά στοιχεία και ιατρικό ιστορικό ασθενών Ηλικία Δείκτες φλεγμονής και Ενεργότητα νόσου Κυτταρομετρία ροής Ενζυμική ενεργότητα της tada και ADA Β.3. ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΣΤΙΣ ΟΜΑΔΕΣ 3.1. Σύγκριση ηλικίας στις ομάδες Η έκφραση των μορίων CD3CD4 και CD3CD8 στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων στις υπό μελέτη ομάδες Σύγκριση της ομάδας της Ρευματοειδούς Αρθρίτιδας με την ομάδα ελέγχου Σύγκριση της ομάδας του Συστηματικού Ερυθηματώδους Λύκου με την ομάδα ελέγχου Σύγκριση αποτελεσμάτων στις τρεις κύριες ομάδες (ΡΑ, ΣΕΛ, ΟΑ) Αποτελέσματα συσχέτισης στην ομάδα των ασθενών με Ρευματοειδή Αρθρίτιδα

8 3.7. Αποτελέσματα συσχέτισης στην ομάδα των ασθενών με Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο Αποτελέσματα συσχέτισης στην ομάδας ελέγχου (ασθενείς με οστεοαρθρίτιδα) Β.4. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 4.1. Συγκεντρωτικοί πίνακες αποτελεσμάτων Σύνοψη αποτελεσμάτων Συζήτηση Συμπέρασμα ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ Acknowledgments (ειδικές ευχαριστίες) ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

9 1 1. ΠΡΟΛΟΓΟΣ Τα αυτοάνοσα νοσήματα στα οποία ανήκουν η ρευματοειδής αρθρίτιδα, ο συστηματικός ερυθηματώδης λύκος, το σκληρόδερμα, το σύνδρομο Sjögren, οι οροαρνητικές αρθρίτιδες, η σαρκοείδωση, οι αγγειίτιδες και άλλα νοσήματα, είναι μια ομάδα νοσημάτων στα οποία παρατηρείται ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος κατά των ιδίων αντιγόνων υπό τη μορφή αυτοαντισωμάτων αλλά και αυτοαντιδραστικών κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων. Ένα νόσημα για να χαρακτηριστεί ως αυτοάνοσο θα πρέπει τα αυτοαντισώματα να προκαλούν ιστική καταστροφή και η νόσος να μεταδίδεται σε πειραματόζωα μετά από τη χορήγηση σε αυτά τόσο αυτοαντισωμάτων όσο και αυτοαντιδραστικών λεμφοκυτταρικών κλώνων. Τα αυτοάνοσα νοσήματα αφορούν όλους τους κλάδους της ιατρικής καθώς τις περισσότερες φορές επηρεάζουν πολλά όργανα (μη οργανοειδικά) αλλά είναι δυνατόν, οι κλινικές εκδηλώσεις να αφορούν και ένα μόνο όργανο (οργανοειδικά). Στην προσπάθεια κατανόησης της παθογένειας των νοσημάτων αυτών ένας σημαντικός τομέας της έρευνας κατευθύνεται στη διερεύνηση των δρόμων μεταφοράς των μηνυμάτων στα Τ λεμφοκύτταρα και της πιθανής σχέσης τους με τα αυτοάνοσα νοσήματα επειδή στην παθογένειά τους ενέχονται κυτταρικοί μηχανισμοί ενεργοποίησης των Τ λεμφοκυττάρων. Στη διεθνή βιβλιογραφία υπάρχουν μελέτες για το ρόλο της κυτταρικής και χυμικής ανοσίας στη παθοφυσιολογία των αυτοάνοσων ρευματικών νοσημάτων. Τα τελευταία χρόνια η μελέτη των Τ και Β λεμφοκυττάρων, των κυτταροκινών και των χημειοκινών έχει διευκρινίσει το ρόλο τους σε αυτά τα νοσήματα. Η κατανόηση μέρους του καταρράκτη της φλεγμονώδους διεργασίας οδήγησε στη στοχευμένη θεραπεία και την τελευταία δεκαετία έχουν εισαχθεί στην θεραπευτική προσέγγιση αυτών των νοσημάτων οι βιολογικοί παράγοντες, με πρώτους τους αντι-tnf. Έχουν αναγνωριστεί συνδιεγερτικά μόρια, υπάρχουν δεδομένα για το ρόλο των Τ και Β λεμφοκυττάρων και των κυτταροκινών στην αυτοανοσία, αλλά ακόμα δεν έχει σχηματιστεί η ολοκληρωμένη εικόνα. Η εμφάνιση των αυτοάνοσων νοσημάτων παρουσιάζει γενετική προδιάθεση, ε- πηρεάζεται από περιβαλλοντολογικούς και ορμονικούς παράγοντες (προσβάλλονται συχνότερα οι γυναίκες), αλλά τα νοσήματα αυτά δεν είναι κληρονομικά. Τα μόρια CD26, CD45RA, CD45RO και το ένζυμο δεαμινάση της αδενοσίνης (ADA), εμπλέκονται στην παθογένεια πολλών νοσημάτων ανάμεσα στα οποία και τα αυτοάνοσα νοσήματα. Σκοπός αυτής της διατριβής είναι η διερεύνηση της εμπλοκής των συγκεκριμένων μορίων στην παθογένεια της Ρευματοειδούς Αρθρίτιδας (ΡΑ) και του Συστηματικού Ερυθηματώδους Λύκου (ΣΕΛ) και των μεταβολών τους στα επίπεδα έκφρασης και δραστικότητας υπό τη δράση διαφορετικών θεραπευτικών πρωτοκόλλων και σε διαφορετικές φάσεις της πορείας των νοσημάτων. Τα μόρια αυτά εξετάστηκαν σε CD4 και CD8 Τ λεμφοκύτταρα και η ενζυμική ενεργότητα της ADA στον ορό ασθενών με ΡΑ, με ΣΕΛ και ασθενών με οστεοαρθρίτιδα (ομάδα ελέγχου). Οι ασθενείς είχαν διαφορετική ενεργότητα νόσου και βρίσκονταν σε φαρμακευτική αγωγή με ανοσοτροποποιητικά φάρμακα και βιολογικούς παράγοντες.

10 Από τη θέση αυτή αισθάνομαι την ανάγκη να ευχαριστήσω την Ομότιμo Καθηγήτρια Βιολογίας της Ιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ. κ. Σουλτάνα Χίτογλου, η οποία με εμπιστεύτηκε δίνωντας μου το θέμα της διδακτορικής διατριβής και ήταν αρχικά η επιβλέπουσα και στη συνέχεια μέλος της τριμελούς επιτροπής ως ομότιμη καθηγήτρια. Ευχαριστώ επίσης την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Βιοχημείας και Ανοσοβιοχημείας της Ιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ κ. Μαρία Νταουντάκη, μετέπειτα επιβλέπουσα μου, η οποία συνέβαλε καθοριστικά σε όλη την πορεία της εκπόνησης της διατριβής. Η καθοδήγησή της όλα αυτά τα χρόνια και η αγάπη και συνέπεια της όσον αφορά στο αντικείμενο της, μου ενέπνευσε απεριόριστη εκτίμηση και σεβασμό προς το πρόσωπό της. Αισθάνομαι επίσης την ανάγκη να ευχαριστήσω τον Καθηγητή Παθολογίας του Α.Π.Θ. κ. Αλέξανδρο Γαρύφαλο, μέλους της τριμελούς, ο οποίος μου ενέπνευσε την αγάπη για τη Ρευματολογία και με καθοδήγησε κατά την πρώτη μου επαφή με τους ρευματολογικούς ασθενείς. Οι γνώσεις και των τριών μελών της τριμελούς επιτροπής, ήταν για μένα πηγή πολύτιμων πληροφοριών και οι παρατηρήσεις τους γόνιμες για την διεκπεραίωση της διατριβής. Πρέπει ακόμα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή Βιοπαθολογίας-Ανοσολογίας κ. Γεώργιο Κυριαζή, διευθυντή του Εργαστήριου Βιοπαθολογίας, Ανοσολογικό Τμήμα, ΓΝΘ Παπανικολάου και μέλους της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής για την ουσιαστική συμβολή του και την άριστη συνεργασία στο πειραματικό σκέλος της διατριβής καθώς και τη διευθύντρια του εργαστηρίου κ. Όλγα Χατζηζήση και τις Βιολέτα Κικιδάκη και Σοφία Ποζίδου τεχνολόγους του εργαστηρίου. Ευχαριστώ ιδιαίτερα την Καθηγήτρια Βιοχημείας της Ιατρικής Σχολής Α.Π.Θ. κ. Νόρμα Βαβάτση-Χριστάκη, μέλους της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής, για την ουσιαστική συμβολή της στη διεκπεραίωση της διδακτορικής διατριβής. Ευχαριστώ επίσης τον Καθηγητή Παθολογίας και Ρευματολογίας της Ιατρικής Σχολής Α.Π.Θ. κ. Λουκά Σέττα και τον Καθηγητή Κοινωνικής Ιατρικής της Ιατρικής Σχολής Α.Π.Θ. κ. Αλέξιο Μπένο, μελών της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω τις διευθύντριες του Εργαστηρίου Βιοπαθολογίας του ΓΝΘ Άγιος Παύλος κ. Βαρβάρα Γαλανοπούλου και την κ. Ασημούλα Κότελη καθώς και το προσωπικό του εργαστηρίου, τον κ. Γιάννη Χατζηγιάννη διευθυντή της Ρευματολογικής Κλινικής και τον κ. Παναγιώτη Αθανασίου συντονιστή διευθυντή της Ρευματολογικής Κλινικής του ΓΝΘ Άγιος Παύλος οι οποίοι μου έδωσαν τη δυνατότητα να παρακολουθώ ασθενείς στη Ρευματολογική Κλινική κάνοντας δυνατή την εκπόνηση της διδακτορικής διατριβής. 2

11 3 Α. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ A1 Ενεργοποίηση Τ λεμφοκυττάρων A2 ΒΙΟΜΟΡΙΑ 2.1. CD26, διπεπτιδύλο πεπτιδάση IV (dipeptil peptidase, DPPIV) 2.2. Δεαμινάση της Αδενοσίνης 2.3. CD45 A3 ΝΟΣΗΜΑΤΑ 3.1. Ρευματοειδής Αρθρίτιδα 3.2. Συστηματικός Ερυθηματώδης Λύκος (ΣΕΛ) 3.3. Οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ) A4 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 4.1. Τα βιομόρια CD26, CD45 και το ένζυμο ADA στη Ρευματοειδή Αρθρίτιδα και στο Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο 4.2. Ανασκόπηση βιβλιογραφίας

12 4

13 5 A1 Ενεργοποίηση Τ λεμφοκυττάρων H ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων, μετά από αντιγονικό ερέθισμα, έχει ως τελικό αποτέλεσμα την έναρξη της μεταγραφής των γονιδίων, η οποία οδηγεί στην παραγωγή πρωτεϊνών, απαραίτητων για τις λειτουργίες των ενεργοποιημένων Τ λεμφοκυττάρων. Η ενεργοποίηση του Τ λεμφοκυττάρου μετά από την αναγνώριση του αντιγόνου από τον υποδοχέα των Τ λεμφοκυττάρων, TCR (T cell receptor) εξαρτάται από τη διάρκεια της σύνδεσης και τη συνάφεια των δύο μορίων. Επειδή η σύνδεση αυτή έχει μικρή διάρκεια, χρειάζεται η άθροιση πολλών επαφών αντιγόνου και TCR για την ενεργοποίηση του κυττάρου. Αν τα επεισόδια σύνδεσης δεν είναι αρκετά τότε το κύτταρο δεν ενεργοποιείται πλήρως, απενεργοποιείται ή δεν έχει καμία αντίδραση 1,2. Το σύμπλεγμα του TCR αποτελείται από το TCR, το CD3 και τις ζ αλύσους. Ό- ταν το αντιγονικό πεπτίδιο, το οποίο βρίσκεται στο αντιγονοπαρουσιαστικό κύτταρο (APC, antigen presenting cell) συνδεδεμένο με τους υποδοχείς MHC, συνδεθεί με το TCR τότε δημιουργείται η ανοσολογική σύζευξη. Πολλά μόρια κινητοποιούνται ώστε να βρεθούν στη σύζευξη, η οποία ουσιαστικά είναι η περιοχή μεταξύ του Τ λεμφοκύτταρου και του αντιγονοπαρουσιαστικού κυττάρου. Αυτά τα μόρια είναι το CD4 ή το CD8, το σύμπλεγμα TCR, οι συνδιεγέρτες όπως το CD28, διάφορα ένζυμα και προσαρμογείς (adapter). Το CD4 και το CD8 εκφράζονται στα ώριμα Τ λεμφοκύτταρα και αντιδρούν με μόρια MHC τάξης ΙΙ και Ι, αντίστοιχα τα οποία βρίσκονται στα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα. Τα μόρια αυτά είναι συνυποδοχείς οι οποίοι συμμετέχουν στη δημιουργία της ανοσολογικής σύζευξης, στην ενδοκυττάρια μεταγωγή των μηνυμάτων και πιθανόν στην ενδυνάμωση της σύνδεσης του Τ λεμφοκυττάρου με το APC. Το CD4 εκφράζεται στα βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα ενώ το CD8 στα κυτταροτοξικά 1. Η σύνδεση του αντιγόνου με το σύμπλεγμα TCR οδηγεί σε μια σειρά αντιδράσεων οι οποίες καταλήγουν υπό τις κατάλληλες συνθήκες στην ενεργοποίηση του Τ λεμφοκυττάρου (σχήμα Α). Αρχικά, ενεργοποιούνται οι κινάσες της τυροσίνης οι οποίες βρίσκονται στις κυτταροπλασματικές περιοχές των CD4/CD8 και άλλων πρωτεϊνικών συνυποδοχέων. Αυτές οι κινάσες είναι ένζυμα τα οποία καταλύουν τη φωσφορυλίωση καταλοίπων τυροσίνης σε διάφορα πρωτεϊνικά υποστρώματα. Ο TCR αποτελεί στόχο για αυτές τις κινάσες όπως και οι κυτταροπλασματικές περιοχές των CD3 και των ζ αλύσων σε 9 περιοχές με τυποποιημένη πεπτιδική αλληλουχία οι οποίες ονομάζονται ITAMs (immunoreceptor tyrosine-based activation motifs). Όταν λοιπόν ο TCR δεσμεύσει το αντιγόνο, ταυτόχρονα το CD4 ή το CD8 μόριο συνδέεται με μια περιοχή του MHC τάξεως ΙΙ ή Ι αντίστοιχα και έτσι έρχονται κοντά η Lck με τις περιοχές ITAMs των CD3 και ζ αλύσων. Η Lck είναι κινάση της τυροσίνης της οικογένειας Src, η οποία σχετίζεται με την κυτταροπλασματική ουρά των CD4 και CD8. Η Lck ενεργοποιείται πιθανόν με αυτοφωσφορυλίωση και στη συνέχεια φωσφορυλιώνει τις τυροσίνες των ITAMs. Το CD45 διατηρεί την καταλυτική περιοχή της Lck κινάσης σε ανοιχτή μορφή ώστε να είναι έτοιμη να ενεργοποιηθεί με αυτοφωσφορυλίωση της τυροσίνης στο ενεργό κέντρο της κινάσης. Η κινάση της τυροσίνης Fyn, η οποία σχετίζεται με την κυτταροπλασματική περιοχή του CD3, πιθανόν να έχει παρόμοιο ρόλο με τη Lck 1. Στη συνέχεια οι φωσφορυλιωμένες τυροσίνες των ITAMs των ζ αλύσων γίνονται θέσεις πρόσφυσης για τις κινάσες τυροσίνης ZAP-70 (ζ-associated Protein of 70-kD). Η ZAP-70 έχει δύο περιοχές, τις SH2 (Src homology 2), οι οποίες συνδέονται με φωσφοτυροσίνες. Για να συνδεθούν με τις ITAMs πρέπει και τα δύο υπολείμματα τυροσίνης των

14 ITAMs να είναι φωσφορυλιωμένα. Αφού συνδεθούν, οι ZAP-70 φωσφορυλιώνονται με τη σειρά τους από τις γειτονικές Lck και αποκτούν και αυτές δράση κινάσης και μπορούν να φωσφορυλιώσουν άλλες πρωτεΐνες αλλά και να αυτοφωσφορυλιωθούν 1. Η ενεργότητα των κινασών ελέγχεται από φωσφατάσες της τυροσίνης οι οποίες αποφωσφορυλιώνουν τα υπολείμματα τυροσίνης με αποτέλεσμα την αναστολή ή την ε- νεργοποίηση των κινασών. Τέτοιες φωσφατάσες είναι οι SHP-1, SHP-2, SHIP και το μόριο CD45, το οποίο αποφωσφορυλιώνει ένα υπόλειμμα τυροσίνης στην Lck με ανασταλτική δράση επιτρέποντας έτσι στην Lck να ενεργοποιηθεί 1. Οι ενεργοποιημένες ZAP-70 φωσφορυλιώνουν με τη σειρά τους διάφορες πρωτεΐνες προσαρμογείς (Adapter Proteins) οι οποίες δεσμεύουν μόρια που συμμετέχουν στη μεταγωγή του μηνύματος. Η LAT (linker of ativation of T cells), μια πρωτεΐνη προσαρμογέας, φωσφορυλιώνεται από τις ZAP-70 και συνδέεται στη συνέχεια με τις SH2 περιοχές άλλων πρωτεϊνών προσαρμογής και ενζύμων που συμμετέχουν στον καταρράκτη μεταφοράς του μηνύματος. Τέτοιες πρωτεΐνες είναι η Grp-2, η φωσφολιπάση Cγ1 και η SLP-76 (SH2-binding Leukocyte Phosphoprotein of 76kD). Η επαφή της Grp-2 με τη LAT οδηγεί σε αύξηση της συγκέντρωσης του Sos (Ras GTP/GDP exchange factor) στη μεμβράνη. Η Ras είναι μια μικρή G πρωτεΐνη η ο- ποία συνδέεται χαλαρά με τη μεμβράνη και ενεργοποιείται όταν η συνδεδεμένη GDP, (διφωσφορική γουανοσίνη), αντικατασταθεί με GTP, (τριφωσφορική γουανοσίνη). Αυτή η αντίδραση καταλύεται από το Sos. Το σύμπλοκο Ras GTP ενεργοποιεί ακολούθως τις MAP (Mitogen Activated Protein kinases) κινάσες. Υπάρχουν τρεις βασικές MAP κινάσες στα Τ λεμφοκύτταρα: η ERK (Extracellular Receptor-activated Kinase), η JNK (c- Jun N-terminal Kinase) και η p38 1. Η πρώτη MAP κινάση, η ERK, δεν ενεργοποιείται άμεσα από το σύμπλοκο Ras GTP αλλά με διαδοχική ενεργοποίηση τριών άλλων κινασών. Αφού ενεργοποιηθεί η ERK φωσφορυλιώνει στη συνέχεια την πρωτεΐνη Elk η οποία με τη σειρά της διεγείρει τη μεταγραφή του Fos. Ο Fos αποτελεί συστατικό του μεταγραφικού παράγοντα ΑΡ-1 (Αctivation Protein-1). Παράλληλα με την ενεργοποίηση της Ras, οι φωσφορυλιωμένοι προσαρμογείς ενεργοποιούν και μια άλλη πρωτεΐνη ανταλλαγής GTP/GDP, την Vav η οποία καταλύει την προσθήκη GTP στη Rac. H Rac GTP, με μια σειρά ενζυμικών αντιδράσεων καταλήγει στην ενεργοποίηση της δεύτερης MAP κινάσης, της JNK. Η JNK ονομάζεται και SAP (Stress Activated-Protein) γιατί σε πολλά κύτταρα ενεργοποιείται από διάφορες στρεσογόνες καταστάσεις όπως η υπεριώδης ακτινοβολία, το ωσμωτικό στρες και παράγοντες που προάγουν τη φλεγμονή όπως ο TNF (Tumor Necrosis Factor) και η ιντερλευκίνη-1 (IL-1). Η ενεργοποιημένη JNK φωσφορυλιώνει το c-jun το οποίο αποτελεί το δεύτερο συστατικό του μεταγραφικού παράγοντα ΑΡ-1 1. Η τρίτη MAP κινάση, η ρ38, ενεργοποιείται και αυτή μέσω της οδού Rac GTP και ενεργοποιεί και αυτή διάφορους μεταγραφικούς παράγοντες. Η δραστηριότητα των ERK και JNK ρυθμίζεται από ειδικές φωσφατάσες τυροσίνης/θρεονίνης οι οποίες ενεργοποιούνται από τα ίδια τα μόρια και παρέχουν ένα μηχανισμό αρνητικής ανατροφοδότησης για τον τερματισμό της ενεργοποίησης των Τ λεμφοκυττάρων. H φωσφολιπάση PLCγ1 (γ1 ισομορφή του ενζύμου φωσφολιπάση C), ένα ένζυμο ειδικό για φωσφολιπίδια ινοσιτόλης, συγκεντρώνεται στην κυτταροπλασματική πλευρά της μεμβράνης με τη δράση της φωσφορυλιωμένης LAT. Το ένζυμο φωσφορυλιώνεται 6

15 7 Αντιγονοπαρουσιαστικό κύτταρο CD3 CD4/ CD8 HLA TCR ζ άλυσοι ZAP-70 P Lck P πρωτείνες Ρ Ρ προσαρμογείς Ρ Ρ Ρ Τ λεμφοκύτταρο Ρ Ρ Ενεργοποίηση PLCγ1 Αύξηση του ενδοκυττάριου Ca DAG Αντικατάσταση GDP με GTP στη Ras Ras GT P Καλσινευρίνη Πρωτεϊνική κινάση C MAP κινάσες Ενεργοποίηση μεταγραφικών παραγόντων Σχήμα Α: Tο σύμπλεγμα TCR και η σχηματική απεικόνιση της ενδοκυττάριας μεταφοράς του σήματος με τη διαδοχική φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών που καταλήγουν στην ενεργοποίηση μεταγραφικών παραγόντων και στην έκφραση γονιδίων 1. από τις ZAP-70 και τις Itk κινάσες που ανήκουν στην οικογένεια των Tec κινασών. Η φωσφορυλιωμένη PLCγ1 καταλύει την υδρόλυση της 4,5-διφωσφορικής φωσφατιδυλινοσιτόλης (ΡΙΡ 2 ), ενός φωσφολιπιδίου της μεμβράνης, σε 1,4,5-τριφωσφορική ινοσιτόλη (ΙΡ 3 ) και διακυλογλυκερόλη (DAG) 1. Η ΙΡ 3 προκαλεί ταχεία αύξηση του ενδοκυττάριου ασβεστίου, το οποίο ελευθερώνεται από το ενδοπλασματικό δίκτυο και/ή εισέρχεται δια των διαύλων ασβεστίου από τον εξωκυττάριο χώρο. Με αυτό τον τρόπο διατηρούνται τα επίπεδα του ασβεστίου ψηλά για μια ώρα περίπου. Το ασβέστιο συμμετέχει στη μετάδοση του ενδοκυττάριου μηνύματος αφού συνδεθεί με την καλμοδουλίνη, η οποία στη συνέχεια ενεργοποιεί διάφορα ένζυμα. Ανάμεσα σε αυτά είναι και η καλσινευρίνη, η οποία είναι μια φωσφατάση σερίνης/θρεονίνης και έχει σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση μεταγραφικών παραγόντων 1.

16 Η DAG μαζί με το ασβέστιο ενεργοποιούν την πρωτεϊνική κινάση C (ΡΚC), η οποία συμμετέχει στην δημιουργία ενεργών παραγόντων μεταγραφής. Οι μεταγραφικοί παράγοντες, αφού ενεργοποιηθούν, μπαίνουν στον πυρήνα και ρυθμίζουν την μεταγραφή γονιδίων τα οποία οδηγούν στον πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση των κυττάρων. 8

17 9 A2 ΒΙΟΜΟΡΙΑ 2.1. CD26, διπεπτιδύλο πεπτιδάση IV (dipeptil peptidase IV, DPPIV) Το μόριο CD26 είναι γνωστό ως διπεπτιδύλο πεπτιδάση IV (dipeptil peptidase IV, DPPIV) αλλά και ως πρωτεΐνη που συνδέει την δεαμινάση της αδενοσίνης (adenosine deaminase binding protein, ADAbp). Βρίσκεται σε όλα τα όργανα του οργανισμού (στο έντερο, στον προστάτη και στα εγγύς σωληνάρια του νεφρού) 3, στα Τ και στα Β λεμφοκύτταρα, στο ενδοθήλιο των αγγείων, στα επιθηλιακά κύτταρα 4 και στα φυσικά κυτταροκτόνα κύτταρα (ΝΚ) Δομή και Λειτουργία Το μόριο CD26 κλωνοποιήθηκε το αλλά η διπεπτιδύλο-πεπτιδάση ΙV ήταν γνωστή από το 1966 όταν την περιέγραψαν οι Hopsu-Havu και Glenner 6. Το γονίδιο του CD26 στον άνθρωπο αποτελείται από 26 εξόνια μεγέθους από 45bp ως 1.4kb 7 και βρίσκεται στο μακρύ σκέλος του χρωματοσώματος 2 (2q24.3). Η πρωτεΐνη έχει μοριακό βάρος (ΜΒ) 110 KD και αποτελείται από 766 αμινοξέα. Είναι γλυκοπρωτεΐνη επιφανείας τύπου ΙΙ και ανήκει στην οικογένεια των ολιγοπεπτιδασών της προλίνης (prolyl oligopeptidase, ΡΟΡ), οι οποίες είναι άτυπες πρωτεϊνάσες της σερίνης ικανές να υδρολύσουν δεσμούς οι οποίοι περιέχουν προλίνη. Οι ΡΟΡ χαρακτηρίζονται από την παρουσία της καταλυτικής τριάδας Ser 630, Asp 708, His 740. Η ενεργή Ser 630 περιβάλλεται από την αλληλουχία αμινοξέων Gly-Trp-Ser-Tyr-Gly στις θέσεις Το μόριο CD26 ανιχνεύεται σε διαμεμβρανική μορφή και σε διαλυτή μορφή 3. Στη διαμεμβρανική του μορφή, το μόριο έχει μόνο 6 αμινοξέα στην κυτταροπλασματική περιοχή και μια υδρόφοβη διαμεμβρανική περιοχή 22 υπολειμμάτων αμινοξέων. Το εξωκυττάριο τμήμα έχει 9-10 πιθανές θέσεις Ν-γλυκοσυλίωσης και μπορεί να χωριστεί σε τρεις περιοχές: 1) την αμινοτελική βαριά γλυκοζυλιωμένη περιοχή η οποία αρχίζει με μια εύκαμπτη περιοχή η οποία τη συνδέει με το διαμεμβρανικό τμήμα (υπολείμματα ), 2) μια πλούσια σε κυστεΐνη περιοχή η οποία περιέχει 10 από τις 12 κυστεΐνες του μορίου (υπολείμματα ) και 3) την καρβοξυτελική περιοχή (υπολείμματα ) η οποία περιέχει την καταλυτική τριάδα Ser 630, Asp 708, His 740 και έχει δράση διπεπτιδίλο πεπτιδάσης. Σύμφωνα με μελέτες οι δυο πρώτες περιοχές έχουν μια άτυπη δομή β-προπέλας (β-propeller), η οποία αποτελείται από τις επαναλαμβανόμενες τετραμερείς αντιπαράλληλες β πτυχώσεις των ΡΟΡ. Η καρβοξυτελική περιοχή χαρακτηρίζεται από την αναδίπλωση α/β των υδρολασών, η οποία έχει δομή παρόμοια με εκείνη των POP και των ιμιδοπεπτιδασών (imidopeptidase). Οι περιοχές των υδρολασών και της β προπέλλας συμβάλλουν στη δημιουργία της εσωτερικής κοιλότητας όπου και γίνεται η κατάλυση 5,8 (σχήμα Α, Β). Το μόριο βρίσκεται είτε ως μονομερές είτε ως διμερές. Ως διμερές λαμβάνει το σχήμα του γράμματος U με τις περιοχές α/β υδρολάσης στη βάση και τις περιοχές β- προπέλας στους βραχίονες 9 (σχήμα Β).

18 10 Σχήμα A: Πιθανή διαμόρφωση του μορίου του CD26 η οποία αφορά τα υπολείμματα αμινοξέων Από το μπλε στο κόκκινο φαίνεται η περιοχή της β-προπέλας, υπολείμματα , και τμήμα της περιοχής υδρολάσης, υπολείμματα Το υπόλοιπο τμήμα της περιοχής α/β υδρολάσης σχηματίζεται από τα 100 αμινοξέα που βρίσκονται στο αμινοτελικό άκρο μετά τη Αsp133. Η διαμεμβρανική περιοχή, υπολείμματα 7-28, τοποθετείται σε αυτό το σχεδιάγραμμα πάνω από την περιοχή υδρολάσης. Η πρόσβαση στην καταλυτική περιοχή γίνεται μάλλον από ένα άνοιγμα στη κατώτερη πλευρά της προπέλας ενώ η περιοχή σύνδεσης της ADA βρίσκεται στο αριστερό τμήμα της κατώτερης πλευράς 3. Το μόριο CD26 δεσμεύει την ADA, έχει δράση πεπτιδάσης, συμμετέχει στην ε- ξωκυττάρια δέσμευση ως υποδοχέας του κολλαγόνου, εμπλέκεται στη διαδικασία της απόπτωσης και έχει δράση συνδιεγέρτη στην ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων. Όλες αυτές οι λειτουργίες μπορούν να επηρεάσουν τον πολλαπλασιασμό και τη χημειοταξία των Τ λεμφοκυττάρων. Ο ρόλος του μορίου έχει μελετηθεί στην ανοσολογία, στη φλεγμονή, στην ομοιόσταση της γλυκόζης, στην καρκινογένεση και στη νευροενδοκρινολογία. Το μόριο είναι ενεργό μόνο ως διμερές. Στα Τ λεμφοκύτταρα τα οποία βρίσκονται σε κατάσταση ηρεμίας η έκφραση του είναι χαμηλή, η δε ενεργοποίησή τους συνοδεύεται από αύξηση της έκφρασης του μορίου 3. Η έκφρασή του επηρεάζεται επίσης από το είδος του κυττάρου καθώς και από το βαθμό διαφοροποίησης του Δράση διπεπτιδύλο πεπτιδάσης IV, DPPIV Το ένζυμο διπεπτιδύλο πεπτιδάσης IV, απομακρύνει τα αμινοτελικά διπεπτίδια από πολυπεπτίδια με L-προλίνη ή L-αλανίνη στην προτελευταία θέση και διπεπτίδια από πολυπεπτίδια με υδροξυπρολίνη, σερίνη, γλυκίνη, βαλίνη ή λευκίνη στην προτελευταία θέση, αλλά με λιγότερη ευαισθησία. Εκτός από την αλληλουχία των αμινοξέων η ενζυμική δράση του εξαρτάται και από το μέγεθος του υποστρώματος, με αυξημένη αποτελεσματικότητα σε πεπτίδια με μικρό μέγεθος 6. Το φυσικό υπόστρωμα του CD26/DPPIV δεν έχει αναγνωριστεί ακόμα αλλά έχουν προταθεί πολλές πρωτεΐνες στις οποίες το μόριο έχει ενζυμική δράση. Βρέθηκε ότι το ένζυμο απενεργοποιεί κατά κύριο λόγο αλλά και μεταβάλλει (ενισχύοντας μερικές φορές) τις βιολογικές ιδιότητες πολλών κυτταροκι-

19 11 νών ή χημειοκινών, νευροπεπτιδίων, ορμονών και αυξητικών παραγόντων. Όλα τα στοιχεία συνηγορούν στο ότι το ένζυμο στερείται ενδοπεπτιδικής δράσης. Η διπεπτιδύλο-πεπτιδάση αδρανοποιεί ή μεταβάλλει την ειδικότητα του νευροπεπτιδίου Υ και του πεπτιδίου ΥΥ, τα οποία ανήκουν στην οικογένεια των παγκρεατικών πολυπεπτιδίων, του υποστρώματος Ρ και της β-κασομορφίνης (β-casomorphin). Επιπλέον το γλουκαγόνο, τα ομοιάζοντα με το γλουκαγόνο πεπτίδια, Β Σχήμα B: Το διμερές CD26 με ένα μόριο ADA συνδεδεμένο στον κάθε βραχίονα. Στο αμινοτελικό άκρο του CD26 είναι η κυτταροπλασματική περιοχή, αμέσως από πάνω η διαμεμβρανική περιοχή, με κόκκινο είναι η περιοχή α/β υδρολάσης 3. GLP-1 και GLP-2, η σεκρετίνη, το αγγειοδραστικό εντερικό πεπτίδιο, το γλυκοζοεξαρτώμενο ινσουλινοτρόπο πεπτίδιο και άλλα πεπτίδια τα οποία ανήκουν στην οικογένεια του γλουκαγόνου αποτελούν υποστρώματα του ενζύμου 3. Αυτά τα πεπτίδια έχουν σημαντικό ρόλο στην έκκριση της ινσουλίνης και στο μεταβολισμό της γλυκόζης 10. Το SDF- 1α (stromal derived factor-1α) και η ιντερλευκίνη-2 (IL-2) αποτελούν πιθανά υποστρώματα του DPPIV. Η πλήρης μετατροπή της ιντερλευκίνης-2 σε ενεργό μόριο γίνεται από το DPPIV, ενώ το SDF-1α αδρανοποιείται από το ένζυμο 6. Τέλος, σημαντικό υπόστρωμα του ενζύμου αποτελούν οι χημειοκίνες RANTES ή CCL5 11, η CCL3, η CCL4,, η CCL11 (εοτοξίνη), η CCL22, η CXCL9, η CXCL10, η CXCL11 και η CXCL12. Οι CCL3, CCL5, CCL11, CCL22 και CXCL12 παρουσιάζουν αλλαγή στη χημειοτακτική τους δράση μετά τη διάσπασή τους από το ένζυμο 12. Οι χημειοκίνες έχουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη, στην ομοιόσταση και στη λειτουργία του ανοσιακού συστήματος. Ρυθμίζουν την ανάπτυξη των λεμφικών ιστών, την ωρίμανση και την κυκλοφορία των λεμφοκυττάρων στα σημεία φλεγμονής και μόλυνσης, και ενεργοποιούν τα κύτταρα στόχους. Επιπλέον, η έκφραση των υποδοχέων των χημειοκινών έχει μεγάλη σημασία. Το μόριο CXCR4 που εκφράζεται στα Τ λεμφοκύτταρα ενώνεται με το CD26 και παρουσία του SDF-1α το σύμπλοκο εισέρχεται στο κύτ-

20 12 ταρο. Ο SDF-1α είναι ο συνδέτης του CXCR4 και ο οποίος ουσιαστικά στρατολογεί τα Τ λεμφοκύτταρα σε περιοχές όπου υπάρχει φλεγμονή. Ο SDF-1α αδρανοποιείται από το DPPIV. Το σύμπλοκο CD26/CXCR4 είναι σημαντικό στη ρύθμιση της λειτουργίας των Τ λεμφοκυττάρων 12. Η αναστολή της ενζυμικής δραστηριότητας του μορίου οδηγεί στην καταστολή τόσο του πολλαπλασιασμού των Τ λεμφοκυττάρων όσο και της παραγωγής κυτταροκινών. Αν και δεν έχει διευκρινιστεί ο μηχανισμός δράσης, αναστέλλεται η σύνθεση του DNA, η παραγωγή και έκκριση ανοσοσφαιρινών, η παραγωγή ιντερλευκίνης 2 (IL-2), ιντερφερόνης γ (IFN-γ) αλλά και ιντερλευκίνης 6 (IL-6) και 1β (IL-1β). Το ίδιο φαίνεται να συμβαίνει και στη σύνθεση του DNA των Β λεμφοκυττάρων ενώ στα φυσικά κυτταροκτόνα κύτταρα (ΝΚ) μειώνεται ο πολλαπλασιασμός χωρίς να επηρεάζεται η εξαρτώμενη από την ιντερλευκίνη 2 κυτταροτοξικότητά τους 13,14,15. Επίσης, οι αναστολείς της DPPIV αναστέλλουν τη φωσφορυλίωση της κινάσης της τυροσίνης p56lck, την κινητοποίηση του ενδοκυττάριου ασβεστίου (Ca 2+ ) καθώς και την ενεργοποίηση της φωσφοϊνοσιτόλης-3 και των κινασών ERK1 και ERK2 (πρωτεϊνών που συμμετέχουν στην ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων) 16. Παραδόξως πρωτεΐνες, των οποίων η φωσφορυλίωση της τυροσίνης τους δεν επηρεάζεται από το CD26, όπως η p38 ΜΑΡ κινάση, φαίνεται ότι επάγονται από τους αναστολείς του ενζύμου. Αυτές οι ιδιότητες των αναστολέων του ενζύμου δεν αποκλείεται να οφείλονται σε άσχετη με το ένζυμο δράση του αναστολέα 17. Ωστόσο, υπάρχουν μελέτες που υποστηρίζουν ότι οι αναστολείς της ενζυμικής δράσης του DPPIV του CD26 δεν επηρεάζουν την εξαρτώμενη από το μόριο κυτταροτοξικότητά των ενεργοποιημένων Τ λεμφοκυττάρων 18. Επιπλέον, τα κύτταρα jurkat τα οποία εκφράζουν το CD26 και τα κύτταρα jurkat τα οποία δεν το εκφράζουν είναι το ίδιο επιρρεπή στη δράση των DPPIV αναστολέων, υποδεικνύοντας ότι η καταστολή της ενεργοποίησης των Τ λεμφοκυττάρων από αυτούς, πιθανόν να οφείλεται σε μη ενζυμική δράση 19. Το CD26 εκφράζεται κατά προτίμηση στα Th1 T λεμφοκύτταρα και μέσω της δράσης του DPPIV στις χημειοκίνες, επιτυγχάνεται η καταστολή της Th2 απόκρισης από τα Th1 CD4 T λεμφοκύτταρα Αλληλεπιδράσεις του CD26 με την εξωκυττάρια ουσία ECM, (extracellular matrix) Η εξωκυττάρια ουσία κατά τη διάρκεια της αγγειογένεσης υφίσταται τροποποίηση από πρωτεϊνάσες η οποία είναι αναγκαία για τη μετανάστευση και τη διείσδυση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες, η πλασμίνη-ενεργοποιητής πλασμινογόνου (plasminogen activator-plasmin) και οι τύπου ΙΙ διαμεμβρανικές πρωτεάσες σερίνης έχουν ρόλο στην αγγειογένεση. Σε μικροπεριβάλλον με αυξημένη παρουσία των α- νωτέρω πρωτεϊνασών, το CD26 και η σεπράση (seprase) φαίνεται ότι επηρεάζουν τη διεισδυτική ικανότητα των κυττάρων. Η ενζυμική δράση του CD26 αλλάζει τις βιολογικές ιδιότητες του νευροπεπτιδίου Υ, όπως ήδη αναφέρθηκε, σχηματίζοντας το νευροπεπτίδιο Υ 3-36 το οποίο συμμετέχει στην αγγειογένεση προωθώντας τις μεταναστευτικές ιδιότητες των ενδοθηλιακών κυττάρων. Η σεπράση είναι μια γλυκοπρωτεΐνη μεμβράνης η ο- ποία όπως και η DPPIV απομακρύνει προλίνη από πρωτεϊνικά μόρια. Εκφράζεται σε διάφορα κύτταρα για σύντομο χρόνο και η παρουσία της αυξάνεται στα ψευδοπόδια (in-

21 13 vadopodia) τα οποία σχηματίζονται στη μεμβράνη κατά τη μετανάστευση. Η αύξηση της σεπράσης στα ψευδοπόδια έχει συσχετιστεί με την πρωτεόλυση της ζελατίνης και την είσοδο των κυττάρων στην εξωκυττάρια ουσία. Η σεπράση και το DPPIV φαίνεται ότι σχηματίζουν συμπλέγματα στα ψευδοπόδια τα οποία έχουν ρόλο στη μετακίνηση των ενδοθηλιακών κυττάρων στην εξωκυττάριο ουσία. Το CD26 έχει μια περιοχή σύνδεσης για τη ζελατίνη, με αποτέλεσμα το σύμπλεγμα CD26/σεπράσης να έρχεται σε επαφή με υποστρώματα τα οποία έχουν ζελατίνη όπως η εξωκυττάρια ουσία. Αυτές οι ιδιότητες έχουν μεγάλη σημασία στη νεοαγγειογένεση και κατ επέκταση στην καρκινογένεση 4,12. Η μεταναστευτική συμπεριφορά των Τ λεμφοκυττάρων και των ηπατοκυττάρων έχει αποδεικτεί ότι βελτιώνεται από την παρουσία των CD26, κολλαγόνου και ινωδονεκτίνης. Τα Τ λεμφοκύτταρα τα οποία μεταναστεύουν δια μέσου των ενδοθηλιακών κυττάρων έχουν υψηλά επίπεδα έκφρασης CD Η άτυπη δομή β-προπέλας του μορίου πιθανόν να έχει πολλές πρωτεΐνες συνδέτες με παρόμοια δομή. Έτσι πχ το CD26 στα ποντίκια συνδέεται με την ινωδονεκτίνη, το κολλαγόνο και τη ζελατίνη 5. Μελέτες έδειξαν ότι το CD26 στον άνθρωπο δεν δεσμεύεται άμεσα με το κολλαγόνο, οπότε η σύνδεσή, γίνεται έμμεσα, με πιθανή παρεμβολή άλλων πρωτεϊνών. Οι ιντεγκρίνες είναι υποψήφιες για το ρόλο του συνδέτη σε αυτή την έμμεση α- ντίδραση μεταξύ CD26 και εξωκυττάριας ουσίας. Η ιντεγκρίνη α3β1 είναι συνδέτης για την πρωτεΐνη ενεργοποίησης των ινοβλαστών (fibroblast activation protein, FAP). H FAP και το CD26, παρουσιάζουν 63% ομοιότητα στα γονίδιά τους και βρίσκονται στο ίδιο χρωμόσωμα. Πιθανότατα οι ιντεγκρίνες να αποτελούν συνδέτη και του CD26. Παρά τις ομοιότητες όμως με τη FAP, το μόριο CD26 στερείται τη δράση γελατινάσης που έχει η FAP. Στην προσκόλληση των Τ λεμφοκυττάρων με άλλα κύτταρα φαίνεται να έχει ένα σημαντικό ρόλο το σύμπλεγμα CD26/ADA. Στη περίπτωση αυτή, η ADA είναι συνδεδεμένη με τον υποδοχέα της αδενοσίνης Α 1 (adenosine receptor, Α 1 R) σε ένα κύτταρο, το οποίο με τη σειρά του την παρουσιάζει στο CD26 ενός άλλου κυττάρου. Η αναγνώρισή της από το CD26 οδηγεί στη μεταγωγή του ενδοκυττάριου μηνύματος, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των ιντεγκρινών CD26 και η ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων Η έκφραση του μορίου στα Τ λεμφοκύτταρα Το χαμηλό ποσοστό έκφρασης του CD26 στα ήρεμα Τ λεμφοκύτταρα αυξάνει κατά 5-10 φορές με την ενεργοποίηση τους, κάνοντας δυνατή την ανίχνευση του σε όλα τα ενεργοποιημένα CD3CD4 και CD3CD8 Τ λεμφοκύτταρα, αλλά και σε Τ κυτταρικές σειρές και κλώνους 3. Η πλέον υψηλή έκφραση του CD26 ανιχνεύεται σε κύτταρα που εκφράζουν σε υψηλές συγκεντρώσεις και άλλους δείκτες ενεργοποίησης όπως το CD25, το CD71, το CD45RO και το CD29, και σχετίζεται με αύξηση της ευαισθησίας στο αντιγόνο, κάνοντας δυνατή τη διατήρηση της μνήμης των Τ λεμφοκυττάρων, παρά τη μείωση της συγκέντρωσης των αντιγόνων. Ο πληθυσμός των Τ βοηθητικών λεμφοκυττάρων μνήμης CD26brightCD4 + με CD45RO + CD29 + είναι ο μόνος που μπορεί να απαντήσει σε αντιγόνα με τα οποία τα κύτταρα ήρθαν σε επαφή στο παρελθόν, προάγοντας τη σύνθεση ανο-

22 14 σοσφαιρινών από τα Β λεμφοκύτταρα και την ενεργοποίηση των κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων 22. Η έκφραση του CD26 δεν είναι σταθερή στην επιφάνεια των λεμφοκυττάρων. Σε καλλιέργειες, κατά την ενεργοποίηση και στα αρχικά στάδια του πολλαπλασιασμού των Τ λεμφοκυττάρων, αυξάνεται η έκφραση του μορίου στην επιφάνειά τους φτάνοντας στην μέγιστη έκφραση σε τρεις μέρες. Στην συνέχεια μειώνεται και τα κύτταρα μετά από 11 μέρες στην καλλιέργεια σταματούν να πολλαπλασιάζονται 23. Η αύξηση του CD26 στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων κατά την ενεργοποίηση και τον πολλαπλασιασμό είναι μεγαλύτερη στα Th1 κύτταρα από ότι στα Th2 κύτταρα, παρόλο που η ενζυμική δραστηριότητα DPPIV είναι ίδια και στους δύο τύπους κυττάρων 24. Η Th1 κυτταρική απάντηση οδηγεί σε αύξηση της INF-γ, η οποία ενισχύει περαιτέρω την Th1 διαφοροποίηση των κυττάρων. Αυτά τα κύτταρα εκφράζουν υποδοχείς των χημειοκινών CCR5, CXCR3 και CXCR4, οι οποίοι είναι υποστρώματα του CD26/DPPIV. Το CD26/DPPIV το οποίο είναι επίσης αυξημένο όπως αναφέρεται πιο πάνω έχει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της φλεγμονής με τη δράση του στις χημειοκίνες. Η ενζυμική δράση της DPPIV οδηγεί στη μείωση της βιοενεργότητας των χημειοκινών 24. Η ενεργότητα της DPPIV στα Τ λεμφοκύτταρα εξαρτάται από την ηλικία. Στα νεογνά η ενεργότητα του ενζύμου είναι υψηλότερη στα Τ λεμφοκύτταρα σε σχέση με τους ενήλικες. Στη νεογνική ηλικία ο σχηματισμός του ρεπερτορίου των Τ λεμφοκυττάρων είναι πιο δυναμικός και πιο γρήγορος και ίσως η διαφορά στην έκφραση του CD26/DPPIV να έχει σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση των Τ λεμφοκυττάρων CD26 ως συνδιεγέρτης Το σύμπλεγμα CD3/TCR (T cell receptor) έχει κεντρικό ρόλο στην ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων. Γενικά όμως αντιγόνα και αντισώματα από μόνα τους δεν μπορούν να προάγουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την έκκριση κυτταροκινών. Τα κύτταρα χρειάζονται δεύτερα σήματα, τα οποία προέρχονται από βοηθητικά μόρια που λέγονται συνδιεγερτικά μόρια. Τέτοια μόρια είναι το CD28 αλλά και το CD26. Η συνδιέγερση ορίζεται ως ένα ερέθισμα, απαραίτητο για τη μέγιστη ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων, το οποίο παραδίδεται μαζί με το σήμα από το TCR στα Τ λεμφοκύτταρα 26. Το CD26 ως συνδιεγέρτης ενισχύει τις απαντήσεις των Τ λεμφοκυττάρων στα ξένα αντιγόνα, δηλαδή προκαλεί τον πολλαπλασιασμό, την έναρξη της μεταγωγής του μηνύματος, αυξάνει την παραγωγή κυτταροκινών και επάγει δείκτες ενεργοποίησης ό- πως είναι τα μόρια CD25, CD71 και CD69. Επιπλέον, προάγει τη διαφοροποίηση των Τ λεμφοκυττάρων σε κύτταρα τελεστές και βελτιώνει την παροχή βοήθειας στα Β λεμφοκύτταρα και στα κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα (CTL cytotoxic T lymphocyte) 3. Το μόριο CD26 αποτελεί δείκτη παραγωγής ιντερλευκίνης-2. Τα κύτταρα τα ο- ποία εκφράζουν το CD26 στην επιφάνεια τους, παράγουν IL-2 ανεξάρτητα από την έκφραση του CD4, ενώ τα κύτταρα τα οποία δεν εκφράζουν το μόριο, παράγουν πολύ λιγότερη IL-2 27 (σχήμα Γ). Επιπλέον, το CD26 παίζει ρόλο και στην ανάπτυξη των δραστικών λειτουργιών των CD8 Τ λεμφοκυττάρων. Η κυτταροτοξική τους δράση, η οποία προάγεται από το CD26 απαιτεί την παρουσία του Fc υποδοχέα στα κύτταρα στόχους. Ο πολλαπλασιασμός, η κυτταροτοξικότητα και η εξωκύττωση των κοκκίων από τα κύτταρα αυτά μέσω

23 του CD26 γίνεται μόνο παρουσία IL-2 και αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων με ψηλά επίπεδα έκφρασης Fc υποδοχέων 28. Η ενζυμική δράση του CD26 ως διπεπτιδίλο-πεπτιδάση φαίνεται να είναι ανεξάρτητη από τη δράση του ως συνδιεγέρτης, αφού η δράση του αυτή παραμένει σε μεταλλαγμένα μόρια τα οποία δεν έχουν την περιοχή της υδρολάσης. Αυτό χρήζει περαιτέρω έρευνας, επειδή τα αποτελέσματα διαφόρων μελετών είναι αντικρουόμενα 3. Ο μηχανισμός με τον οποίο γίνεται η μεταγωγή του σήματος από το μόριο στο εσωτερικό του κυττάρου δεν είναι ακόμα πλήρως κατανοητός. Αυτό που είναι γνωστό είναι ότι η διαδικασία ξεκινά από το μόριο CD26, προηγείται του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και καταλήγει στην κινητοποίηση του ενδοκυττάριου ασβεστίου 3. Η μεταγωγή του σήματος μέσω του CD26 έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση υποστρωμάτων κοινά σε μεγάλο βαθμό με αυτά τα οποία ενεργοποιούνται από τη μεταγωγή σήματος μέσω του συμπλέγματος TCR/CD3. Μελέτες απέδειξαν τη λειτουργική σχέση μεταξύ του CD26 και του συμπλέγματος TCR/CD3. Τα CD3 + κύτταρα ενεργοποιούνται με αντι-cd26 αντίσωμα, ενώ τα CD3 - κύτταρα δεν ενεργοποιούνται 29. Η μεταφορά μηνύματος λοιπόν μέσω του CD26 χρειάζεται την έκφραση του TCR και της ζ αλύσου του συμπλέγματος CD3. Αυτή η συσχέτιση δεν οφείλεται σε άμεση φυσική σύνδεση του CD26 με το TCR/CD3 3. H ενεργοποίηση του συμπλέγματος TCR/CD3 μέσω του συμπλέγματος αντιγονικού πεπτιδίου-mhc (μείζον σύστημα ιστοσυμβατότητας) ενός αντιγονοπαρουσιαστικού κυττάρου οδηγεί σε μια σειρά φωσφορυλιώσεων και αποφωσφορυλιώσεων. Στο δρόμο αυτό ενεργοποιούνται κινάσες της τυροσίνης, όπως οι PTKs (protein tyrosine kinases) p59fyn και p56lck, οι οποίες φωσφορυλιώνουν τις περιοχές ΙΤΑΜs των ζ αλύσων του CD3 μορίου του συμπλέγματος TCR/CD3. Στη συνέχεια ενεργοποιούνται και άλλες ΡΤΚs όπως οι ΖΑΡ-70 αλλά και η ΜΑΡ, η c-jun η οποία είναι ΜΑΡ κινάση, η LAT, οι ΡΚC και το Fos (συστατικό της ΑΡ-1). Ο καταρράκτης αυτών των αντιδράσεων καταλήγει στην ενεργοποίηση των παραγόντων μεταγραφής, οι οποίοι μετά την είσοδό τους στον πυρήνα μεταγράφουν το DNΑ (Σχήμα Γ) 1. Σύμφωνα με την αλληλουχία των αμινοξέων η οποία προκύπτει από το κλωνοποιημένο cdna του CD26, τα 6 αμινοξέα της κυταρροπλασματικής περιοχής του μορίου είναι πολύ λίγα για να εξηγήσουν τη μεταγωγή του σήματος. Η θέση του CD26 και η φυσική συσχέτιση του με το CD45 και την ADA στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων υποδεικνύουν μηχανισμούς οι οποίοι πιθανόν μεσολαβούν στη συμμετοχή του CD26 στη μεταφορά του μηνύματος 30. Η ΑDA αφού δεν έχει κυτταροπλασματική και διαμεμβρανική περιοχή είναι απίθανο να έχει άμεσο ρόλο στη μεταγωγή του μηνύματος. Παρόλα αυτά, η δέσμευση της ADA από το CD26 οδηγεί στον πολλαπλασιασμό των Τ λεμφοκυττάρων και στην αυξημένη παραγωγή κυτταροκινών Th1 απάντησης (INF-γ) αλλά και κυτταροκινών που προάγουν τη φλεγμονή (TNF-α, IL-6) 3. Τα δενδριτικά κύτταρα, τα οποία είναι αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα, φέρουν στην επιφάνεια τους την ADA συνδεδεμένη πιθανότατα με τον υποδοχέα αδενοσίνης Α 2Β R και η αλληλεπίδραση της με το CD26 το οποίο εκφράζεται στην επιφάνεια των Τλεμφοκυττάρων οδηγεί στην ενεργοποίηση των τελευταίων 31. Το CD45, μια φωσφατάση της τυροσίνης, ίσως να είναι ο συνδετικός κρίκος. Φαίνεται ότι το CD45 και συγκεκριμένα το CD45RO, επηρεάζεται από το CD26 περισ- 15

24 16 Γ Σχήμα Γ: Μοντέλο δράσης του CD26 στην επιφάνεια του Τ λεμφοκυττάρου. Η ADA που συνδέεται με το CD26 ελέγχει τα επίπεδα της αδενοσίνης. Το μόριο είναι ενεργό ως διμερές και η μετάδοση μηνυμάτων είναι εξαρτώμενη από τη ζ άλυσο του CD3 και αφορά φωσφορυλιώσεις πρωτεϊνικών κινασών (ΡΤΚs) όπως οι p56lck, p59fyn, ZAP-70 και MAP κινάση 3. σότερο από ο,τι οι άλλες μορφές του μορίου 30,32. Η φωσφατάση αυτή αποφωσφορυλιώνει την κινάση της τυροσίνης ρ56lck, η οποία βρίσκεται στο σύμπλεγμα TCR/CD3 και συμμετέχει στην ενδοκυττάρια μεταφορά του μηνύματος. Η αλληλεπίδραση των CD45RO και CD26 βελτιώνει την ενεργότητα της ρ56lck και προκαλεί αύξηση της δράσης των ΡΤΚs, της φωσφορυλίωσης του CD3 και της κινητοποίησης του ασβεστίου 3. Κατά συνέπεια επηρεάζει την ενδοκυττάρια μεταφορά του μηνύματος. Σε με μια πρόσφατη αναφορά 20 αποδείχτηκε ότι στο ρόλο του CD26 ως συνδιεγέρτη συμβάλλει η καβεολίνη-1 (caveolin-1). Η ενδοκυττάρια μεταφορά του μηνύματος στα ΑPC από την καβεολίνη-1 αυξάνεται μετά από διέγερση με εξωγενές CD26. Η καλβεολίνη-1 αποτελεί συστατικό του caveolae το οποίο είναι ένας σχηματισμός στην κυτταρική μεμβράνη που μοιάζει με μικρές οπές. Η καβεολίνη-1 εκφράζεται σε ποικίλα κύτταρα συμπεριλαμβανομένων των ενδοθηλιακών, των τύπου ΙΙ πνευμονοκυττάρων και λείων μυϊκών κυττάρων και έχει σημαντικό ρόλο στην ενδοκυττάρια μεταγωγή των μηνυμάτων. Η διαδικασία γίνεται με τη μεσολάβηση μορίων όπως η πρωτεΐνη G, οι Src και Fyn, ο επιδερμικός αυξητικός παράγοντας, ο υποδοχέας ινσουλίνης, οι κινάσες της σερίνης και θρυψίνης, η συνθετάση του νιτρικού οξειδίου του ενδοθηλίου κτλ. Αν και δεν έχει αποδειχθεί άμεση συσχέτιση των δύο μορίων στη μεμβράνη, το μόριο CD26 έχει μια περιοχή σύνδεσης της καβεολίνης-1, η οποία βρίσκεται στην ίδια περιοχή με την ενζυμική δραστηριότητα DPPIV. Αυτό το εύρημα θέτει ξανά το ερώτημα κατά πόσο η ενζυμική δραστηριότητα συμμετέχει ή όχι στη λειτουργία του μορίου ως συνδιεγέρτης. Με την

25 17 δέσμευση της καβεολίνης από το CD26 ξεκινά ένας ενδοκυττάριος καταρράκτης ενεργοποίησης μορίων, ο οποίος καταλήγει στην αυξημένη έκφραση του CD86 στα APC, το οποίο συμμετέχει στην ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων ως συνδιεγερτικό μόριο α- ντιδρώντας με το CD28 στα Τ λεμφοκύτταρα. Προϋπόθεση για αυτή την αλληλεπίδραση είναι η δημιουργία ανοσολογικής σύναψης μεταξύ των δύο κυττάρων, την είσοδο των αντιγόνων από τα caveolae στα APC, η παρουσίαση τους στο μείζον σύστημα ιστοσυμβατότητας και η αποκάλυψη της καβεολιν-1 στη μεμβράνη. Ουσιαστικά λοιπόν το σύμπλοκο CD26-καβεολιν-1 ενισχύει και παρατείνει την ενεργοποίηση του TCR 20. Όλα τα ανωτέρω συνηγορούν στην αλληλοεπικάλυψη των δρόμων μεταγωγής του σήματος μέσω του CD26 και μέσω του συμπλέγματος TCR/CD3, ενισχύοντας το ρόλο του CD26 ως συνδιεγέρτη. Και οι δύο περιπτώσεις καταλήγουν στην ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB (nuclear factor-κb) Απόπτωση Το CD26 φαίνεται να έχει αντιαποπτωτική δράση αλλά και να προάγει την απόπτωση ανάλογα με τα συνεκφραζόμενα μόρια. Τα λευχαιμικά Τ λεμφοκύτταρα (jurkat cells) τα οποία εκφράζουν CD26 με ενζυμική δραστηριότητα DPPIV αποπίπτουν λιγότερο από τα αντίστοιχα τα οποία εκφράζουν CD26 χωρίς ενζυμική δραστηριότητα. Αυτό αποδίδεται στην υπερέκφραση του μορίου CD95 (Fas/Apo-1) στα κύτταρα με CD26 χωρίς ενζυμική δράση. Το CD95 ανήκει στην οικογένεια των υποδοχέων για τους νευρικούς αυξητικούς παράγοντες/παράγοντες νέκρωσης των όγκων και οδηγεί στην απόπτωση 33. Αντίθετα, σε κυτταρικές σειρές από ηπάτωμα που εξέφραζαν το CD26/DPPIV παρατηρήθηκε αύξηση της απόπτωσης μετά από διέγερση με αντι-cd26/dppiv αντισώματα. Αυτό αποδόθηκε σε δράση κάποιας κινάσης τυροσίνης που προκάλεσε αναστολή των φωσφατασών οδηγώντας στην απόπτωση 33. Αυτή διαφορά των δύο κυτταρικών σειρών αποδίδεται στην πολύπλευρη δράση του μορίου Διαλυτό CD26 Το διαλυτό CD26 έχει ΜΒ 110 KD και είναι ίδιο με αυτό της μεμβράνης χωρίς τη διαμεμβρανική του περιοχή. Τα πειράματα δείχνουν ότι το διαλυτό μόριο προέρχεται από αυτό της μεμβράνης. Ο μηχανισμός αποκοπής είναι άγνωστος αλλά πιθανότατα γίνεται με πρωτεόλυση. Τα επίπεδα του μειώνονται σε παθολογικές καταστάσεις, εκτός και αν συνυπάρχει τραυματισμός του ήπατος ή έντονος πολλαπλασιασμός λεμφοκυττάρων. Όσον αφορά τη δράση του, το διαλυτό CD26 φαίνεται ότι έχει ανοσορυθμιστικό ρόλο. Ο μηχανισμός με τον οποίο το διαλυτό CD26 επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των Τ λεμφοκυττάρων είναι άγνωστος Ο ρόλος του μορίου CD26 στη φλεγμονή και τα νοσήματα Φλεγμονή Το CD26 έχει ρόλο τόσο στην προαγωγή όσο και στον περιορισμό της φλεγμονής. Ως συνδιεγέρτης ενισχύει την ενεργοποίηση και τον πολλαπλασιασμό των Τ λεμφοκυττάρων, αλληλεπιδρώντας με την Εξωκυττάριο Ουσία συμβάλλει στη μετανάστευση

26 18 των κυττάρων σε σημεία φλεγμονής και η ενζυμική του δραστηριότητα μετατρέπει τα πρόδρομα μόρια των κυτταροκινών σε ενεργείς κυτταροκίνες. Η ενζυμική του δραστηριότητα δεν περιορίζεται εκεί αφού και οι χημειοκίνες είναι υποστρώματά του με τη διαφορά ότι σε αυτές μειώνει τη ενεργότητά τους με αποτέλεσμα τον έλεγχο της φλεγμονώδους διαδικασίας. Η αποπτωτική και αντιαποπτωτική του δράση ενισχύει το διπλό αυτό ρόλο στην φλεγμονή Αναστολείς του μορίου CD26 Το CD26 συμμετέχει με ποικίλους τρόπους στην ενεργοποίηση, μετανάστευση και πολλαπλασιασμό των Τ λεμφοκυττάρων αλλά και στην ανοσιακή απάντηση γενικότερα τροποποιώντας τις δραστηριότητες μεταξύ άλλων κυτταροκινών, χημειοκινών και αυξητικών παραγόντων. Οι ιδιότητες των αναστολέων του DPPIV να αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των Τ λεμφοκυττάρων και την παραγωγή IL-2, οδήγησαν στο ερώτημα αν και κατά πόσο έχουν αντιρευματικές ιδιότητες και αν μπορούν να χρησιμοποιηθούν στη θεραπεία αυτοάνοσων νοσημάτων. O Williams και συνεργάτες μελέτησαν in vitro τη δράση του αναστολέα της DPPIV, TMC-2 (ένα αντιβιοτικό που παράγεται από τον Aspergillus oryzae), σε CD26 στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων και σε διαλυτό DPPIV. Στη συνέχεια χορήγησαν τον αναστολέα σε ποντίκια με αρθρίτιδα με ενθαρρυντικά αποτελέσματα 34. Στη ΡΑ υ- πάρχει αυξημένη έκφραση του μορίου στα Τ λεμφοκύτταρα του περιφερικού αίματος αλλά και στο αρθρικό υγρό, οπότε η αναστολή της δράσης της DPPIV πιθανότατα θα βοηθήσει αυτούς τους ασθενείς. Αναστολείς του ενζύμου χρησιμοποιήθηκαν και στη θεραπεία του σακχαρώδη διαβήτη τύπου ΙΙ στην αρχική φάση της νόσου με ενθαρρυντικά αποτελέσματα 35. Η DPPIV δράση του ενζύμου στο εξαρτώμενο από τη γλυκόζη ινσουλινότροπο πολυπεπτίδιο (GIP) και στο ομοιάζον με το γλουκαγόνο πεπτίδιο-1 (GLP-1), οδηγεί στην απώλεια της ινσουλινότροπης δράσης τους, οπότε αναστολή του ενζύμου θα μπορούσε να μειώσει τα επίπεδα της γλυκόζης στους διαβητικούς ασθενείς. Αναστολή της δράσης του μορίου θα μπορούσε να μειώσει τις μεταστάσεις κακοήθων όγκων όπως του μαστού και του προστάτη ενώ διέγερση ή εξωγενής χορήγηση του μορίου θα μπορούσε να βοηθήσει τους ασθενείς με AIDS. Οι αναστολείς του DPPIV, οι οποίοι φαίνεται να επηρεάζουν εκτός από την ενζυμική του δραστηριότητα και τη σχέση του με άλλα μόρια, όπως το CD45 μπορεί να α- ποτελέσουν μελλοντικά, θεραπευτική επιλογή για τα αυτοάνοσα νοσήματα 34. Παρόλο που η πολύπλευρη δράση του CD26/DPPIV και η ύπαρξη άλλων μορίων με δράση DPPIV όπως οι πρωτεΐνες της οικογένειας DASH (DPPIV activity structurehomologues) περιπλέκουν την προσπάθεια για στοχευμένη θεραπεία, τα αποτελέσματα των κλινικών δοκιμών είναι ενθαρρυντικά. Το μόριο συνεχίζει να είναι στο επίκεντρο της έρευνας αφού δεν είναι ακόμα γνωστοί ούτε όλοι οι τρόποι δράσης του ούτε και το φυσικό του υπόστρωμα Νοσήματα και CD26 Μεταβολές στην έκφραση του CD26 παρατηρήθηκαν σε διάφορα νοσήματα ό- πως στα κακοήθη νοσήματα και ιδιαίτερα του αίματος, στα αυτοάνοσα και φλεγμονώδη

27 νοσήματα και στις βακτηριακές και ιογενείς λοιμώξεις. Το ερώτημα είναι ποιος είναι ο ρόλος του στην παθογένεια αυτών των νόσων και κατά πόσο η μεταβολή στην έκφραση του μορίου είναι η αιτία ή το αποτέλεσμα 10. Έτσι παρατηρείται μεταβολή στην έκφραση του μορίου στο μελάνωμα, στις νεοπλασίες του προστάτη, του θυρεοειδή και του παχέος εντέρου. Στο μελάνωμα παρατηρείται μείωση της έκφρασης του CD26/DPPIV στα κακοήθη κύτταρα. Όταν η έκφραση του μορίου αποκαταστάθηκε πειραματικά σε αυτά τα κύτταρα παρατηρήθηκε αλλαγή στο φαινότυπο τους σε μη κακοήθη. Η μειωμένη έκφραση του μορίου φαίνεται να έχει σημαντικό ρόλο στην εμφάνιση των μελανωμάτων 36. Στους μεταστατικούς όγκους του προστάτη η έκφραση του μορίου είναι μειωμένη 6. Στα κακοήθη νοσήματα Τ λεμφοκυττάρων, το CD26 αποτελεί δείκτης φτωχής πρόγνωσης και μπορεί να έχει ρόλο ως προγνωστικός παράγοντας στην ανταπόκριση στη θεραπεία με dcf (2 -deoxycoformycin, πιθανός αναστολέας της ΑDA) 37. Στην οξεία Τ λεμφοβλαστική λευχαιμία η έκφραση του CD26/DPPIV είναι ψηλή αλλά η ενζυμική του δραστηριότητα είναι μέτρια 38. Το CD26/DPPIV φαίνεται να επηρεάζει άμεσα τη διήθηση και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων. Από τη μια η αλληλεπίδραση του με το πλασμινογόνο, η οποία οδηγεί στην ρύθμιση της έκφρασης της ΜΜΡ-9 (μεταλλοπρωτεϊνάση-9) στα προστατικά καρκινικά κύτταρα 39 και από την άλλη η προσκόλληση του CD26 των ενδοθηλιακών κυττάρων του πνεύμονα στην ινωδονεκτίνη των μεταστατικών καρκινικών κυττάρων του μαστού 40 στοιχειοθετούν την εμπλοκή του στη μετάσταση. Η έκφραση του CD26 στα Τ λεμφοκύτταρα βρέθηκε αυξημένη σε ασθενείς με σκλήρυνση κατά πλάκας, νόσο του Graves και ρευματοειδή αρθρίτιδα. Ίσως λοιπόν το μόριο να έχει ένα σημαντικό ρόλο στη χρόνια φλεγμονή και στην επακόλουθη ιστική καταστροφή 30. Η ενεργότητα του μορίου στον ορό ήταν μειωμένη σε ασθενείς με νόσο του Crohn, ελκώδη κολίτιδα, κατάθλιψη, ανορεξία και ατοπική δερματίτιδα 30. Το διαλυτό CD26 ήταν ελαττωμένο στον ορό ασθενών με ρευματοειδή αρθρίτιδα (ΡΑ) 41,42. Οι Cuchacovich και συνεργάτες διαπίστωσαν ότι το CD26 στον ορό ασθενών με ΡΑ ήταν στα φυσιολογικά επίπεδα, με ελαττωμένη όμως την ενζυμική ενεργότητα 43. Στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων του περιφερικού αίματος η έκφραση του μορίου βρέθηκε αυξημένη σε ασθενείς με ενεργό ΡΑ, όπως επίσης και στα Τ λεμφοκύτταρα του αρθρικού υγρού 44,45. Διαπιστώθηκε μάλιστα θετική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του μορίου στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων και την ενεργότητα της νόσου 20. Στο συστηματικό ερυθηματώδη λύκο (ΣΕΛ) τα επίπεδα του διαλυτού CD26 και της ενεργότητας του ενζύμου DPPIV βρέθηκαν ελαττωμένα στον όρο των ασθενών και φαίνεται να έχουν αρνητική συσχέτιση με το δείκτη SLEDAI. Σχετίζονται δηλαδή αντίστροφα με την ενεργότητα της νόσου άσχετα από τη συμμετοχή των οργάνων στόχων 41. Στην ίδια μελέτη υπάρχουν αναφορές για χαμηλά επίπεδα και σε διάφορα είδη καρκίνου, σε μείζονα κατάθλιψη και στη λοίμωξη από HIV. Το CD26 στην επιφάνεια των CD4 T λεμφοκυττάρων ασθενών με ΣΕΛ βρέθηκε ελαττωμένο σε μια πρόσφατη σχετικά μελέτη 46. Μετά από την χορήγηση εμβολίου για την ηπατίτιδα Β παρατηρείται αύξηση της ενεργότητας του διαλυτού CD26 (scd26) και αυτό φαίνεται να σχετίζεται με την επιτυχή ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος και την απόκτηση ανοσιακής επάρκειας μετά τον εμβολιασμό 47. Στην ηπατίτιδα C η ενεργότητα του μορίου στον ορό βρέθηκε αυξημένη. 19

28 Τα κύτταρα τα οποία εκφράζουν το CD26 είναι πιο ευαίσθητα στη λοίμωξη από τον ιό HIV, σε αντίθεση με τα κύτταρα που δεν εκφράζουν το μόριο, αλλά και με τα κύτταρα τα οποία εκφράζουν πολύ υψηλές συγκεντρώσεις CD26, τα οποία καταστέλλουν την είσοδο του ιού σε αυτά. Κάποιες πρωτεΐνες του ιού όπως η gp120 και η Tat συνδέονται με το CD26 μεταβάλλοντας τις ικανότητές του και ίσως αναστέλλουν την συμμετοχή του στη μεταφορά του μηνύματος βλάπτοντας την ανοσολογική απάντηση των Τ λεμφοκυττάρων. Η σύνδεση της πρωτεΐνης Tat εξαρτάται από το βαθμό σιάλωσης του CD26, η οποία αυξάνεται στα μολυσμένα από τον ιό κύτταρα. Επιπλέον, η πρωτεΐνη του ιού gp120 δεσμεύει τη θέση σύνδεσης της ADA, προκαλώντας αύξηση της συγκέντρωσης της αδενοσίνης στο μικροπεριβάλλον γύρω από τα κύτταρα, καταστέλλοντας έτσι την ανοσιακή απάντηση. Οι χημειοκίνες RANTES και SDF-1 (stromal cell-derived factor-1) προστατεύουν τα κύτταρα από τη λοίμωξη από τον ιό HIV. Όταν όμως το CD26/DPPIV απομακρύνει δύο υπολείμματα αμινοξέων (2 aa-truncation) από τις πρωτεΐνες, αυτές χάνουν τις προστατευτικές τους ιδιότητες 48. Τα CD26/DPPIV θετικά Τ λεμφοκύτταρα στους ασθενείς με AIDS μειώνονται και μάλιστα αυτή η μείωση προηγείται της γενικής μείωσης των CD4 Τ λεμφοκυττάρων η οποία παρατηρείται στην λοίμωξη από τον ιό HIV

29 Δεαμινάση της αδενοσίνης (ADA) Δομή Η δεαμινάση της αδενοσίνης, ADA, είναι πρωτεΐνη με σφαιρική δομή και δράση υδρολάσης. Η περιοχή της πρωτεΐνη της δεαμινάσης σχηματίζεται από οκτώ παράλληλες β πτυχώσεις οι οποίες σχηματίζουν κύλινδρο περιβαλλόμενο από κλασσικές α/β-έλικες. Το ενεργό ενζυμικά τμήμα βρίσκεται κοντά στο καρβοξυτελικό άκρο. Το ένζυμο περιέχει ένα άτομο ψευδαργύρου στην ενεργό περιοχή, το οποίο συμμετέχει άμεσα στην απαμίνωση των πουρίνων 50,51. Το 90% της ADA βρίσκεται ενδοκυττάρια και απαντάται σε όλους τους ιστούς (βρίσκεται σε αφθονία στο θύμο και στους βλεννογόνους) παίζοντας σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και λειτουργία του λεμφικού συστήματος. Η ADA εκτός από την ενζυμική δραστηριότητα υδρολάσης έχει και μη ενζυμική δράση, συμμετέχοντας στη συνδιέγερση. Εκφράζεται στην επιφάνεια των Τ και Β λεμφοκυττάρων καθώς και στην επιφάνεια και στο κυτταρόπλασμα των μονοκυττάρων και των ινοβλαστών 3,5. Η ADA στην επιφάνεια των κυττάρων ονομάζεται ectoada 52. Η ενεργότητα του ενζύμου είναι μεγαλύτερη στα Τ λεμφοκύτταρα 53. Δύο ισοένζυμα με δράση δεαμινάσης της αδενοσίνης είναι γνωστά, η ADA1 και η ADA2. Τα δύο αυτά ένζυμα και οι ανάλογες με τη δεαμινάση της αδενοσίνης πρωτεΐνες (ADA-like proteins), γνωστές και ως ADA3, οι οποίες απομονώθηκαν πρόσφατα, παρουσιάζουν μικρό βαθμό ομολογίας στην αλληλουχία αμινοξέων της καταλυτικής τους περιοχής. Η ADA3 δεν έχει ακόμα διευκρινιστεί αν παρουσιάζει δράση δεαμινάσης 54. Η ADA1 η οποία βρίσκεται σε όλους τους ιστούς καθώς και στον ορό είναι απαραίτητη για την ανοσοαπάντηση, έχει μοριακό βάρος (ΜΒ) 41kDa και αποτελείται από 363 αμινοξέα. Το γονίδιό της βρίσκεται στο μακρύ σκέλος του χρωματοσώματος 20 στη θέση (20q13.12) και αποτελείται από 12 εξόνια μεγέθους από 62 εως 325bp (base pairs) 55.Η κύρια της λειτουργία είναι η μείωση των ενδοκυττάριων επιπέδων της αδενοσίνης η οποία είναι τοξική για τα κύτταρα και ιδιαίτερα για τα λεμφοκύτταρα. Οι κληρονομικές μεταλλάξεις της ADA1 προκαλούν σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια. Στον ορό βρίσκεται σε πολύ μικρές ποσότητες παρόλο που δεν έχει αλληλουχίες αμινοξέων οι οποίες να δικαιολογούν την έκκρισή της από τα κύτταρα (secretion signal sequences). Η ADA1 συνδέεται με πρωτεΐνες στην επιφάνεια των κυττάρων 56,57 όπως το CD26 και ο A1R. Η ADA2 με μοριακό βάρος 100kDa περίπου 58 ανήκει στην οικογένεια των αυξητικών παραγόντων της δεαμινάσης της αδενοσίνης (adenosine deaminase growth factors, ADGFs) και έχει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των ιστών. Το γονίδιο της βρίσκεται στο χρωματόσωμα 22 (22q11.2) στην περιοχή του γονιδίου του συνδρόμου οφθαλμού γάτας 59,60. Η δράση της ως αυξητικός παράγοντας αποδίδεται στην επέκταση της αλληλουχίας των αμινοξέων της στο αμινοτελικό άκρο κατά αμινοξέα 61. Πειράματα σε αμφίβια απέδειξαν τη μεγάλη σημασία την οποία έχει στην εμβρυογένεση 62. Η πρωτεΐνη διαθέτει αλληλουχία αμινοξέων η οποία δικαιολογεί την έκκριση της από τα κύτταρα 54. Παρόλα αυτά, ανιχνεύεται σε πολύ χαμηλές ποσότητες στον ορό υγειών ατόμων, ενώ σε φλεγμονώδεις παθήσεις αυξάνεται 63. Η ADA2 διαφέρει από την ADA1 στις καταλυτικές και στις βιοχημικές τους ιδιότητες 59. Βρέθηκε ότι η ADA2 στον άνθρωπο παράγεται από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα και προκαλεί διαφοροποίηση των μο-

30 22 νοκυττάρων σε μακροφάγα και τον πολλαπλασιασμό των μακροφάγων και CD4 T λεμφοκυττάρων. H δράση της ως αυξητικός παράγοντας στα κύτταρα, γίνεται μέσω επιφανειακών υποδοχέων και η σύνδεση γίνεται μέσω πρωτεογλυκάνων. Αντίθετα στα Τ λεμφοκύτταρα ο υποδοχέας είναι άγνωστος 64. Η έλλειψη της ADA1 προκαλεί σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια στους ανθρώπους (SCID severe combined immunodeficiency) -λεμφοπενία και βλάβες στη κυτταρική και χυμική ανοσία- και σχετίζεται με ανωμαλίες του σκελετού, του ήπατος και του νευρικού συστήματος Ενζυμική δράση Η δεαμινάση της αδενοσίνης (ADA) καταλύει τη μετατροπή της αδενοσίνης και της δεοξυαδενοσίνης σε ινοσίνη και δεοξυϊνοσίνη αντίστοιχα (σχήμα Α). Η αδενοσίνη είναι πουρίνη η οποία προέρχεται από την ΑΜΡ και βρίσκεται σε χαμηλά επίπεδα στην εξωκυττάρια περιοχή. Τα επίπεδα της αυξάνονται πολύ σε συνθήκες ισχαιμίας και υποξίας. Οι υποδοχείς της αδενοσίνης, οι Α 1, Α 2Α, Α 2Β, και Α 3 στα κύτταρα ενεργοποιούν ένα ανοσοκατασταλτικό ενδογενή δρόμο για τον έλεγχο της ανοσιακής απάντησης 5 και προκαλούν τον κυτταρικό θάνατο ή οδηγούν στην ενεργοποίηση των κυττάρων 65. Εξαιρείται ο υποδοχέας Α 1 ο οποίος δεν εκφράζεται στα Τ λεμφοκύτταρα του ανθρώπου 5. Δεαμινάση της AMP AMP (μονοφωσφορική αδενοσίνη) IMP (μονοφωσφορική ινοσίνη) Αδενοσίνη ADA (Δεαμινάση της αδενοσίνης) Ινοσίνη Σχήμα Α Σχήμα Α: ενζυμική μετατροπή αδενοσίνης σε ινοσίνη 66. Σε περίπτωση απουσίας της ADA, η αδενοσίνη αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των Τ λεμφοκυττάρων με δοσοεξαρτώμενο τρόπο και επηρεάζει την παραγωγή της IL Η ενζυμική δράση της ADA1 και της ADA2 γίνεται σε ph 7,5 και 6,5 αντίστοιχα, οπότε η ADA2 δρα σε ελαφρώς όξινο περιβάλλον σε περιοχές πχ στις οποίες υπάρχει υποξεία 63.

31 Αλληλεπίδραση με άλλες πρωτεΐνες Η ectoada1 αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες της επιφάνειας των κυττάρων. Οι δύο γνωστές πρωτεΐνες με τις οποίες συνδέεται είναι το CD26 και οι υποδοχείς αδενοσίνης Α1 (A1 adenosine receptor A1R). Επιπλέον, η ectoada1 διατηρεί την ενζυμική της δραστηριότητα πάνω στις πουρίνες, προστατεύοντας τον οργανισμό από τις τοξικές τους επιδράσεις 18. Η ADA1 συνδέεται με το CD26 με Κ Α 4-20nM 67, και τα δύο μόρια συνεκφράζονται και αντιδρούν στην επιφάνεια του Τ λεμφοκυττάρου, όπου και εντοπίζονται. Τα υ- πολείμματα Leu 294 και η περιοχή από τη Leu 340 ως την Arg 343 (Leu 340 -Val-Ala-Arg 343 ) του CD26 και τα υπολείμματα Glu 139, Arg 142, Asp 143 της ADA είναι βασικά για τη σύνδεση των δύο μορίων 68,69. Το CD26 δεν μεταφέρει την ADA μέσα στο κύτταρο. Συγκεκριμένα η ADA συνδέεται στην εξωκυττάρια περιοχή του CD26, χωρίς οι δράσεις των δύο ενζύμων να επηρεάζονται από αυτή τη σύνδεση. Η ADA συνδέεται με το CD26 μόνο σε ορισμένα από τα πρωτεύοντα θηλαστικά όπως στον άνθρωπο. Τα δύο μόρια συνδέονται στα κουνέλια επίσης, αλλά όχι στα ποντίκια 3 (Σχήμα Γ). H σύνδεση της ADA1 με τον υποδοχέα Α1 της αδενοσίνης πιθανόν να συμβάλλει στην προσκόλληση των Τ λεμφοκυττάρων σε άλλα κύτταρα. Έτσι, η ADA, η οποία είναι συνδεδεμένη με τον A 1 R σε ένα κύτταρο αλληλεπιδρά με το CD26 σε ένα Τ λεμφοκύτταρο με αποτέλεσμα την προσκόλληση του Τ λεμφοκυττάρου. Δεν έχει αποσαφηνιστεί κατά πόσο στο σύμπλοκο ADA/A 1 R η ADA διατηρεί την ενζυμική της δράση 3,21. Η ADA2 δεν συνδέεται με το CD26 70, συνδέεται όμως με την ηπαρίνη 63. Οι ανάλογες με την ηπαρίνη πρωτεογλυκάνες όπως η θειική ηπαράνη βρίσκονται στην επιφάνεια των κυττάρων και έχουν σημαντικό ρόλο στη μεταγωγή των ενδοκυττάριων σημάτων Συνδιέγερση και ενεργοποίηση κυττάρων Ανεξάρτητα από την ενζυμική δράση της, η ADA φαίνεται ότι συμμετέχει και στην ενδοκυττάρια μεταγωγή του μηνύματος. Αυτό πιθανόν να γίνεται με τη σύνδεση της με το CD26 αφού μόνο η ADA η οποία συνδέεται με το CD26 φαίνεται να συμμετέχει σε αυτή τη μεταφορά 71. Ορισμένοι ερευνητές παρατήρησαν ότι η εξωγενής ADA ε- πάγει τον πολλαπλασιασμό των CD4 + Τ λεμφοκυττάρων με αντι-cd3 αντισώματα, ακόμα και στη παρουσία αναστολέων του ενζύμου της ADA 31. Επιπλέον, ρυθμίζει την διαφοποίηση των CD4 Τ λεμφοκυττάρων σε κύτταρα μνήμης (CD4CD45RA σε CD4CD45RO) 72. Η επώαση με εξωγενή ADA ενεργοποιημένων με αντι-cd3 αντισώματα Τ λεμφοκυττάρων, προκαλεί αύξηση της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης του Ca ++, α- ποδεικνύοντας ότι προωθείται η ενδοκυττάρια μεταφορά των μηνυμάτων. Τέλος, αντι- CD26 αντισώματα τα οποία δεσμεύουν την περιοχή σύνδεσης της ADA, ενισχύουν τον εξαρτώμενο από το CD26 πολλαπλασιασμό των Τ λεμφοκυττάρων, ενισχύοντας την υ- πόθεση ότι η δέσμευση της περιοχής σύνδεσης είναι αρκετή για τη μεταφορά του μηνύματος 71. Ο υποδοχέας της αδενοσίνης Α 2Β R είναι πιθανόν μια πρωτεΐνη σύνδεσης της ADA1. Τα δενδριτικά κύτταρα, τα οποία είναι αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα, φέρουν στην επιφάνεια τους την ADA1 συνδεδεμένη πιθανότατα με τον υποδοχέα αδενοσίνης Α 2Β R και η αλληλεπίδραση της με το CD26 το οποίο εκφράζεται στην επιφάνεια των Τ

32 24 λεμφοκυττάρων οδηγεί στην ενεργοποίηση των τελευταίων. Η δέσμευσή της από το CD26 οδηγεί στην αυξημένη παραγωγή Th1 κυτταροκινών (INF-γ) αλλά και κυτταροκινών που προάγουν τη φλεγμονή (TNF-α, IL-6) 31. Η ADA1 και η ADA2 αυξάνει τον πολλαπλασιασμό των ενεργοποιημένων από μονοκύτταρα CD4 Τ λεμφοκυττάρων, ανεξάρτητα από την ενζυμική της δράση. Επιπλέον, η ADA2 βελτιώνει την εξαρτώμενη από τα Τ λεμφοκύτταρα διαφοροποίηση των μονοκυττάρων σε μακροφάγα και το πολλαπλασιασμό των μακροφάγων 64. Ο ρόλος ADA στην ενεργοποίηση και στη λειτουργία των Τ λεμφοκυττάρων αλλά και στην ωρίμανση και διαφοροποίηση του θύμου επιβεβαιώνεται από μελέτες που αφορούν στην επίδραση των κυτταροκινών στην έκφραση της ectoada. Σε μια μελέτη 70 φαίνεται ότι η εξωγενής προσθήκη κυτταροκινών και η επίδρασή τους στην ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων επηρεάζει την έκφρασή της. Πιο συγκεκριμένα η IL-2 και η IL-12 αυξάνουν την έκφραση της ectoada στα ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα, ενώ η IL-4 τη μειώνει. Σύμφωνα με την ίδια μελέτη οι κυτταροκίνες δεν επηρέασαν τα επίπεδα της πρωτεΐνης στον ορό αλλά ούτε και τα επίπεδα του mrna της. Η μεταβολή στην έκφρασή της αποδίδεται στη ρύθμιση από αυτές τις κυτταροκίνες της μετατόπισης της ενδοκυττάριας ADA στην επιφάνεια του κυττάρου 73. Στο Κεντρικό Νευρικό Σύστημα η ectoada πιθανόν να έχει νευρορρυθμιστικό ρόλο. Η εξωγενής ADA προκαλεί εισροή Ca ++ και υδρόλυση πολυφωσφοινοσιτιδίων στους παρεγκεφαλιδικούς νευρώνες 74. Αυτό εν μέρει ίσως γίνεται από τον Α1 υποδοχέα της αδενοσίνης. Το CD26 εκφράζεται σε αφθονία στο νευρικό σύστημα και ίσως έχει και αυτό ρόλο στη νευρορρύθμιση ADA και νοσήματα Η μέτρηση της ενεργότητας του ενζύμου έχει εφαρμοστεί στη διάγνωση της φυματίωσης όπου έχει διαφοροδιαγνωστική σημασία. Οι ασθενείς με περικαρδίτιδα και πλευρίτιδα λόγω φυματίωσης έχουν αυξημένη ενεργότητα ενζύμου σε σχέση με αυτούς στους οποίους η περικαρδιακή συλλογή οφείλεται σε νεοπλασία, ΣΕΛ, ουραιμία ή ιδιοπαθή περικαρδίτιδα. Αυξημένη ενεργότητα της ADA παρατηρείται και στην πλευριτική συλλογή στη ρευματοειδή αρθρίτιδα 76. Μελέτες σε ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα, συστηματική σκλήρυνση, ψωρίαση και συστηματικό ερυθηματώδη λύκο, έδειξαν αυξημένη ενζυμική ενεργότητα ADA στον ορό. Στους ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα διαπιστώθηκε σε μια μελέτη θετική συσχέτιση μεταξύ της ενζυμικής ενεργότητας της ολικής ADA (tada) και του δείκτη ενεργότητας της νόσου DAS (disease activity score), ενώ και η ενζυμική ενεργότητα της ADA2 ήταν αυξημένη 77. Στη νεανική ιδιοπαθή αρθρίτιδα 78 διαπιστώθηκε αύξηση της ενζυμικής ενεργότητας της ADA2, ενώ στο ΣΕΛ 79,80,81,82 παρατηρήθηκε αύξηση στην ενζυμική ενεργότητα της tada και της ADA2. Διαπιστώθηκε επίσης ότι η ενζυμική ε- νεργότητα του μορίου αλλάζει σε καλοήθη και κακοήθη νοσήματα όπως λευχαιμία, λέμφωμα, μυασθένεια και σύνδρομο επίκτητης ανοσοανεπάρκειας (AIDS) 32. Αντισώματα κατά της ADA, βρέθηκαν σε ασθενείς με σύνδρομο ανεπάρκειας ADA οι οποίοι ελάμβαναν εξωγενή ADA ως θεραπεία αλλά και σε κάποιους ασθενείς με συστηματικό ερυθηματώδη λύκο. Πιθανόν στους ασθενείς με ΣΕΛ το μόριο να είναι α- ντιγονικός στόχος για τα αυτοαντισώματα και πιθανόν σε αυτή τη διεργασία να οφείλεται η λεμφοπενία που παρατηρείται σε αυτούς τους ασθενείς. Το γεγονός ότι δεν παρατηρεί-

33 ται λεμφοπενία σε όλους τους ασθενείς με αντι-ada αντισώματα υποδηλώνει την ανάγκη για περαιτέρω έρευνα για άλλους παράγοντες οι οποίοι πιθανόν να επηρεάζουν στην εμφάνιση λεμφοπενίας

34 CD Δομή Το μόριο CD45 είναι διαμεμβρανική πρωτεΐνη τύπου Ι με δράση φωσφατάσης της τυροσίνης και ανήκει στην οικογένεια της ινωδονεκτίνης τύπου ΙΙ (fibronectin type II protein). Ανιχνεύεται στην επιφάνεια όλων των εμπύρηνων κυττάρων του αίματος καθώς και στις προγονικές μορφές τους 83. Το CD45 είναι μια τις πλέον άφθονες επιφανειακές γλυκοπρωτεΐνες. Στα Β και Τ λεμφοκύτταρα καταλαμβάνει το 10% της επιφάνειας της κυτταρικής μεμβράνης. Η κυτταροπλασματική περιοχή του μορίου παρουσιάζει 95% ομολογία ενώ η εξωκυττάρια περιοχή μόνο 35% στα θηλαστικά τα οποία έχουν μελετηθεί 84. Το γονίδιο του μορίου CD45 βρίσκεται στο χρωματόσωμα 1 (1q31-32). Η πρωτεΐνη αποτελείται από μια μονή αλυσίδα με περίπου αμινοξέα, από τα οποία βρίσκονται στην εξωκυττάρια περιοχή και 700 στην ενδοκυττάρια όπου και ανιχνεύονται οι δύο περιοχές με δράση φωσφατάσης. Η πρώτη περιοχή D1 της φωσφατάσης, είναι η πλέον ενεργή συγκρινόμενη με τη δεύτερη D2 και αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι η D2 στερείται των απαραίτητων αμινοξέων τα οποία είναι απαραίτητα για την κατάλυση. Η εξωκυττάρια περιοχή σχηματίζεται από τρεις υπομονάδες ινωδονεκτίνης τύπου ΙΙΙ 85,86. Οι ισομορφές του CD45 (CD45RA, CD45RB, CD45RC, CD45RO) προκύπτουν από το συνδυασμό των εξονίων 4, 5 και 6 τα οποία κωδικοποιούν τις περιοχές Α, Β και C αντίστοιχα του αμινοτελικού άκρου του εξωκυττάριου τμήματος της πρωτεΐνης. Ανάλογα με τη συμμετοχή των εξονίων τα οποία εκφράζονται σχηματίζονται: 1) οι ισομορφές με 220κD οι οποίες εκφράζουν και τα τρία εξόνια, 2) οι ισομορφές με 210κD οι οποίες εκφράζουν το εξόνιο 5 (Β περιοχή) και ένα από τα άλλα δύο, 3) οι ισομορφές με 200κD οι οποίες εκφράζουν μόνο το εξόνιο 5 (Β περιοχή) (CD45RB) και 4) η ισομορφή 180κD η οποία δεν εκφράζει κανένα εξόνιο (CD45RO) 86. Οι ισομορφές της εξωκυττάριας δομής του μορίου μπορεί να εκφράζονται όλες σε ένα κύτταρο γεγονός το οποίο εξαρτάται από το στάδιο διαφοροποίησης και ενεργοποίησης στο οποίο βρίσκεται το κύτταρο 87,88,89. Από τους διάφορους συνδυασμούς συναρμολόγησης των εξονίων 4,5 και 6 προκύπτουν τουλάχιστον οχτώ ισομορφές 84,85. Οι πέντε έχουν ανιχνευτεί στον άνθρωπο. Μελέτες σε επίπεδο mrna έδειξαν συνδυασμό και στη συναρμολόγηση των εξονίων 7, 8 και 10 χωρίς όμως να έχουν ανιχνευθεί οι αντίστοιχες πρωτεΐνες 90. Οι ποικίλες μορφές της εξωκυττάριας δομής του CD45 σχηματίζονται υπό τον έλεγχο των παραγόντων οι οποίοι δρουν cis και trans (cis και trans-acting). Οι αλληλουχίες των βάσεων των εξονίων 4 και 6 είναι απαραίτητες αλλά και αρκετές, για τη ρύθμιση της συναρμολόγησης για τον κάθε κυτταρικό τύπο. Φυσικά και τα τρία εξόνια 4,5 και 6 βρίσκονται στο mrna του CD45, αλλά μόνο το 4 και το 6 ελέγχονται αυστηρά ως προς το αν θα συμπεριληφθούν. Αυτές οι cis-acting ρυθμιστικές περιοχές στα εξόνια φαίνεται ότι ευθύνονται για την διαφορετική έκφραση των ισομορφών κατά τη διάρκεια της ενεργοποίησης των Τ λεμφοκυττάρων. Έτσι, την πρώτη μέρα αυξάνεται η έκφραση των μεγάλων ισομορφών (CD45RA, CD45RB) και στη συνέχεια μειώνονται για να αντικατασταθούν την τρίτη μέρα από τις μικρότερες ισομορφές (CD45RO). Αυτή η αλλαγή στην έκφραση των πρωτεϊνών αντανακλά αλλαγές στο επίπεδο του mrna 91,92. Οι trans-

35 27 acting παράγοντες είναι άγνωστοι. Υπάρχουν στοιχεία για την ύπαρξη θετικών και αρνητικών παραγόντων οι οποίοι μεσολαβούν στην ειδική για το κάθε ιστό συναρμολόγηση των εξονίων. Οι πρωτεΐνες της οικογένειας SR (serine/arginine-rich proteins) είναι πιθανόν τέτοιοι παράγοντες. Οι πρωτεΐνες SR είναι βασικό συστατικό του spliceosome machinery 93. Οι ισομορφές του CD45 έχουν λειτουργικές διαφορές. Ειδικότερα, η ισομορφή CD45RA + εκφράζεται σε μη διεγερμένα Τ λεμφοκύτταρα, ενώ η CD45RΟ + στα Τ λεμφοκύτταρα μνήμης. Επιπλέον, φαίνεται ότι τα CD4 + CD45RA + Τ λεμφοκύτταρα διεγείρουν τα CD8 + κατασταλτικά Τ λεμφοκύτταρα ενώ τα CD4 + CD45RΟ + Τ λεμφοκύτταρα ασκούν βοηθητική δράση στα Β λεμφοκύτταρα σε καλλιέργειες κυττάρων διεγερμένων με μιτογόνα 94. Η γλυκοζυλίωση του μορίου προκύπτει από Ν-γλυκοζυλίωση της εξωκυττάριας περιοχής και από Ο-γλυκοζυλίωση της κάθε περιοχής η οποία κωδικοποιείται από τα ε- ξόνια. Η μορφή και η έκταση της γλυκοζυλίωσης του CD45 δεν εξαρτάται μόνο από την έκφραση των εξονίων αλλά και από τον τύπο του κυττάρου, το στάδιο εξέλιξης και ενεργοποίησης του κυττάρου. Αυτό οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η γλυκοζυλίωση έχει λειτουργική σημασία Λειτουργία Το CD45 ρυθμίζει τη μεταγωγή του μηνύματος από τον υποδοχέα των Τ λεμφοκυττάρων, TCR, στα Τ λεμφοκύτταρα αλλά και από τον υποδοχέα των Β λεμφοκυττάρων, ΒCR, στα Β λεμφοκύτταρα 96. Η απουσία του οδηγεί σε σοβαρή ανοσοανεπάρκεια γνωστή ως SCID. Στα Τ λεμφοκύτταρα, το πρώτο βήμα μετά τη σύνδεση του αντιγόνου στο σύμπλεγμα TCR, είναι η φωσφορυλίωση των κινασών της τυροσίνης και ειδικότερα των Lck οι οποίες ανήκουν στην οικογένεια Src και βρίσκονται στην κυτταροπλασματική περιοχή των CD4 και CD8, αλλά και των Fyn, οι οποίες ανήκουν επίσης στην ίδια οικογένεια. Στη συνέχεια οι Lck κινάσες φωσφορυλιώνουν τις ΙΤΑΜs των ζ αλύσων και του CD3 οι οποίες με τη σειρά τους φωσφορυλιώνουν τις ΖΑΡ70 πρωτεΐνες 1. Οι ενεργοποιημένες ΖΑΡ70 φωσφορυλιώνουν τις πρωτεΐνες προσαρμογείς και μετά από μια σειρά φωσφορυλιώσεων και αποφωσφορυλιώσεων διαφόρων ενζύμων ενεργοποιούνται οι μεταγραφικοί παράγοντες οι οποίοι εισέρχονται στον πυρήνα και πυροδοτούν τη μεταγραφή των γονιδίων με αποτέλεσμα την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, παραγωγή κυτταροκινών και πολλαπλασιασμό των κυττάρων 95. Οι κινάσες Lck (ρ56) και Fyn (ρ59) είναι το κύριο υπόστρωμα του CD45 στα Τ λεμφοκύτταρα 1,83. Οι κινάσες Src παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανοσιακή απάντηση τόσο στα Τ όσο και στα Β λεμφοκύτταρα όπου δρουν ως θετικοί ρυθμιστές. Οι ίδιες αυτές κινάσες δρουν ως αρνητικοί ρυθμιστές όταν φωσφορυλιώσουν τις περιοχές ITIMs (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs), οι οποίες βρίσκονται σε ανασταλτικούς υποδοχείς και οι οποίοι οδηγούν στην ενεργοποίηση ανασταλτικών μορίων (όπως οι φωσφατάσες τυροσίνης SHP-1 και SHP-2) 95. Η θέση αυτών των κινασών, πολύ κοντά στο σύμπλεγμα του TCR, τις καθιστά ρυθμιστικούς κόμβους στην ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων. H ενεργότητα των κινασών τυροσίνης ρυθμίζεται εν μέρει, από τη φωσφορυλίωση δύο υπολειμμάτων τυροσίνης τα οποία βρίσκονται σε θέσεις κλειδιά. Η μια τυ-

36 28 ροσίνη βρίσκεται στο καρβοξυτελικό άκρο και υπόκειται σε αρνητική ρύθμιση και η άλλη βρίσκεται μέσα στην περιοχή της κινάσης (Σχήμα Α). Η φωσφοτυροσίνη η οποία TCR CD3 CD4 P Κινάση Lck ανενεργός Cbp Csk CD4 Ρ κινάση Lck ενεργός + P CD45 π Ρ π Ρ Σχήμα Α: Η ανενεργός κλειστή μορφή της Lck (δεξιά) η ποία σχηματίζεται με τη φωσφορυλίωση της καρβοξυτελικής τυροσίνης από την Csk κινάση και η ενεργός ανοικτή μορφή (αριστερά) η οποία σχηματίζεται με την αποφωσφορυλίωση της ίδιας τυροσίνης από το CD (Το σχήμα βασίζεται στο αντίστοιχο σχήμα των JM Pennonger et al 2001) προκύπτει από τη φωσφορυλίωση της τυροσίνης στο καρβοξυτελικό άκρο, σχετίζεται άμεσα και αντιδρά με την περιοχή SH2 του ίδιου μορίου. Αυτή η αντίδραση οδηγεί σε αλλαγή στη διαμόρφωση του μορίου σε μια πιο κλειστή μορφή καθιστώντας την (καταλυτική) ενεργό περιοχή της κινάσης απροσπέλαστη. Το CD45 αποφωσφορυλιώνει αυτή την τυροσίνη στο καρβοξυτελικό άκρο και έτσι αλλάζει τη διαμόρφωση του μορίου σε πιο ανοικτή, δίνοντας τη δυνατότητα στην κινάση να ενεργοποιηθεί με αυτοφωσφορυλίωση της τυροσίνης η οποία βρίσκεται μέσα στην περιοχή της κινάσης 83. Το ένζυμο το οποίο είναι υπεύθυνο για τη φωσφορυλίωση της τυροσίνης στο καρβοξυτελικό άκρο ανήκει και αυτό στην οικογένεια των Src κινασών και είναι η Csk (C-terminal Src kinase) (ρ50) κινάση 95. Η Csk βρίσκεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα. Η είσοδός της στη μεμβράνη διευκολύνεται από τη διαμεμβρανική φωσφοπρωτεΐνη PAG (phosphoprotein associated with glycosphingolipid enriched microdomains). Η αποφωσφορυλίωση της PAG, μετά από την ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων, οδηγεί στην απελευθέρωση της Csk. Η τυροσίνη στο καρβοξυτελικό άκρο των Src κινασών, δεν υπόκειται πλέον σε φωσφορυλίωση και είναι δυνατή η αποφωσφορυλίωσή της από το CD45. Η Csk τέλος φωσφορυλιώνοντας τυροσίνες στο CD45, δημιουργεί θέσεις σύνδεσης για την Lck και ενεργοποιεί τη φωσφατάση 83. Το CD45 έχει επίσης ρόλο ως αρνητικός ρυθμιστής στις κινάσες της Src οικογένειας, αποφωσφορυλιώνοντας την τυροσίνης στο ενεργό κέντρο του ενζύμου 97. Επομένως, το μόριο CD45 έχει και θετικό και αρνητικό ρόλο στη ρύθμιση της μεταφοράς του μηνύματος. Πειράματα σε ποντίκια έδειξαν ότι υπερισχύει η θετική ρύθμιση. Αυτός ο παράδοξος διπλός ρυθμιστικός ρόλος του CD45 φαίνεται ότι έχει σχέση

37 29 με την θέση των υποστρωμάτων του στη κυτταρική μεμβράνη 98,99. Έτσι, όταν το κύτταρο είναι σε ηρεμία, το CD45 αποφωσφορυλιώνει την καρβοξυτελική τυροσίνη δίνοντας στο μόριο της Src κινάσης μια πιο ανοικτή μορφή, όμως αποφωσφορυλιώνει και την τυροσίνη στο ενεργό κέντρο, σε μικρότερο βέβαια βαθμό. Όταν γίνει η αναγνώριση του αντιγόνου από το σύμπλεγμα TCR, όλο το σύμπλεγμα με τα βοηθητικά μόρια μετακινείται μέσα στην ανοσολογική σύναψη (immunological synapse) και έτσι τα μόρια CD4 και CD8 απομακρύνονται από το CD45, το οποίο δεν συμμετέχει στο σχηματισμό της ανοσολογικής σύναψης 100. Οι Src κινάσες που ενεργοποιήθηκαν με αυτοφωσφορυλίωση δεν υπόκεινται πλέον στην αρνητική ρύθμιση του CD45 και διατηρούν την ενεργότητα τους για όσο χρόνο χρειαστεί. Ένα δεύτερο υπόστρωμα του CD45 είναι οι JAKs (Janus kinases) κινάσες. Το CD45 αποφωσφορυλιώνει και αδρανοποιεί in vitro και τις τέσσερις κινάσες της οικογένειας: jak1, jak2, jak3 και Tyk Οι JAKs κινάσες συνδέονται στην κυτταροπλασματική περιοχή των υποδοχέων των κυτταροκινών και φωσφωρυλιώνονται μετά τη σύνδεση των κυτταροκινών στους υποδοχείς τους. Στη συνέχεια φωσφορυλιώνουν μόρια μεταφορείς μηνυμάτων και ενεργοποίησης μεταγραφικών παραγόντων οι οποίοι ανήκουν στην οικογένεια STATs (signal transducers and activators of transcription). Οι φωσφορυλιωμένοι μεταγραφικοί παράγοντες STATs μπαίνουν στον πυρήνα και ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τις κυτταροκίνες και τις χημειοκίνες. Έτσι, το CD45 ρυθμίζει αρνητικά την δια μέσου των υποδοχέων των κυτταροκινών και της ι- ντερφερόνης διαφοροποίηση, τον πολλαπλασιασμό των αιμοποιητικών κυττάρων και την απάντησή τους σε ιούς. Ειδικότερα, υπάρχουν στοιχεία ότι παρεμβαίνει στο δρόμο της ιντερλευκίνης-3 και του παράγοντα αρχέγονων κυττάρων, οι οποίοι συμμετέχουν στην ενεργοποίηση της jak2, στον πολλαπλασιασμό μαστικών κυττάρων, στην ερυθροποίηση κτλ. Επίσης, παρεμβαίνει και στο δρόμο της ιντερφερόνης-α (αντιϊκή δράση) 101.Οι ΖΑΡ70 και το CD3/ζ είναι επίσης πιθανά υποστρώματα του CD45. Αυτό όμως χρειάζεται περαιτέρω έρευνα αφού τα μέχρι τώρα στοιχεία είναι αντιφατικά 83,102,103. Στα Β λεμφοκύτταρα η μεταγωγή του σήματος από το BCR ξεκινά μετά από τη σύνδεση του αντιγόνου. Το BCR επηρεάζεται από το στάδιο ωρίμανσης των κυττάρων, την ισχύ της σύνδεσης με το αντιγόνο και την παρουσία συνυποδοχέων. Οι κινάσες Lyn, Fyn και Blk οι οποίες ανήκουν στην οικογένεια Src έχουν σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση του Β λεμφοκυττάρου. Οι κινάσες αυτές φωσφορυλιώνουν τις ΙΤΑΜs του BCR συμπλέγματος. Ακολουθεί αύξηση της συγκέντρωσης της κινάσης Syk η οποία ενεργοποιείται από τις ΙΤΑΜs και ακολουθεί ο καταρράκτης της ενδοκυττάριας μεταφοράς του μηνύματος ο οποίος καταλήγει στην ενεργοποίηση των μεταγραφικών παραγόντων. Η κινάση Lyn έχει θετικό ρυθμιστικό ρόλο με την ενεργοποίηση των ΙΤΑΜs αλλά και αρνητικό με τη φωσφορυλίωση των ΙΤΙΜs των ανασταλτικών υποδοχέων όπως το CD22 και ο FcγRΙΙΒ. H αρνητική ρύθμιση γίνεται μετά την ενεργοποίηση του BCR και οδηγεί στην καταστολή των Β λεμφοκυττάρων 1,95. Το CD45 ρυθμίζει την μεταγωγή του μηνύματος στα Β λεμφοκύτταρα επηρεάζοντας την κατάσταση φωσφορυλίωσης των κινασών της οικογένειας Src. Οι κινάσες Lyn και Fyn είναι υπερφωσφορυλιωμένες και ενεργοποιημένες σε κύτταρα CD45 -/-104,105,106. Από πολλές εργασίες οι οποίες έγιναν σε κυτταρικές σειρές Β λεμφοκυττάρων, φαίνεται ότι το CD45 είναι αρνητικός ρυθμιστής στα ανώριμα Β λεμφοκύτταρα και ότι το στάδιο ανάπτυξης διαφοροποίησης των κυττάρων καθορίζει τον αρνητικό ή θετικό ρόλο του μο-

38 30 ρίου στη μεταφορά του μηνύματος από το BCR 106,107,108. Αυτό πιθανόν γίνεται αλλάζοντας την πρόσβαση στο υπόστρωμα. Ο ρόλος του μορίου στα υπόλοιπα εμπύρηνα κύτταρα του αίματος ακόμα δεν έχει αποσαφηνιστεί. Στα μακροφάγα είναι σημαντικό για την προσκόλληση, ενώ στα ουδετερόφιλα για τη μεταφορά σημάτων από τις χημειοκίνες 95. Οι διάφορες ισομορφές του μορίου έχουν την ίδια δράση φωσφατάσης in vitro. Αυτό δεν σημαίνει ότι η εξωκυττάρια δομή δεν παίζει κάποιο ρόλο in vivo. Μάλιστα πειράματα σε ποντίκια αποδεικνύουν αυτό το ρόλο της εξωκυττάριας περιοχής του CD45. Tα αποτελέσματα των ερευνών αυτών είναι αντιφατικά και άλλοτε δίνουν τις πιο βαριές ισομορφές RABC του μορίου πιο αποτελεσματικές στη μεταφορά του μηνύματος και άλλοτε τις πιο ελαφριές RO 89,109, Ρύθμιση της δράσης του CD45 Η ρύθμιση της ενεργότητας φωσφατάσης του CD45 γίνεται πιθανόν: με δέσμευση του μορίου από συνδέτες (ligands), με διμερισμό του μορίου, με την θέση του στη κυτταρική μεμβράνη και την πρόσβαση στο υπόστρωμα, με αντιδράσεις με άλλες πρωτεΐνες και με τη δράση ειδικών ενδοκυττάριων αναστολέων. Οι λεκτίνες CD22 και galectin-1 προτάθηκαν για συνδέτες του CD45 αλλά δεν υπάρχουν αποδείξεις ότι επηρεάζουν τη δράση του μορίου και επιπλέον συνδέονται με μη ειδικό τρόπο και σε άλλες γλυκοπρωτεΐνες στα Τ λεμφοκύτταρα 111,112. Οι προσπάθειες για εύρεση κάποιου άλλου συνδέτη δεν κατέληξαν θετικά σε κάποιο μόριο. Ο διμερισμός του CD45 παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της δράσης της φωσφατάσης. Με το διμερισμό φαίνεται ότι δημιουργείται ένα συμμετρικό διμερές οπότε μπλοκάρεται η καταλυτική περιοχή της φωσφατάσης αναστέλλοντας τη δράση της. Πειράματα σε ποντίκια έδειξαν ότι αν εμποδιστεί ο διμερισμός με μια μετάλλαξη τότε τα ζώα οδηγούνται σε πρόωρο θάνατο 113. Το CD45RA έχει ισχυρό αρνητικό φορτίο στην εξωκυττάρια περιοχή του, το οποίο οφείλεται στην ύπαρξη πολλών περιοχών Ο- γλυκοζυλίωσης, δημιουργώντας ηλεκτροστατικό εμπόδιο στον ομοδιμερισμό του μορίου. Η μικρότερη ισομορφή του μορίου, το CD45RO σχηματίζει ευκολότερα ομοδιμερή αφού δεν έχει αυτές τις περιοχές γλυκοζυλίωσης 113. Σύμφωνα με τις παραπάνω παρατηρήσεις προτάθηκε ένα πρότυπο για τη ρύθμιση της δράσης του CD45 με το διμερισμό. Στα μη διεγερμένα Τ λεμφοκύτταρα υπερισχύουν οι μεγάλες ισομορφές του μορίου, οι RΑ, οι οποίες επειδή σχηματίζουν δυσκολότερα ομοδιμερή διατηρούν τη συγκέντρωση υπέρ των μονομερών. Τα μονομερή έχουν αυξημένη δράση φωσφατάσης και έτσι οι κινάσες Src είναι έτοιμες για ενεργοποίηση. Μετά την ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων αυξάνεται η συγκέντρωση των μικρότερων ι- σομορφών, RO, τα οποία σχηματίζουν εύκολα ομοδιμερή, στρέφοντας τη συγκέντρωση υπέρ αυτών και αναστέλλοντας τη δράση της φωσφατάσης 113. Πέρα από τις μεταπτώσεις μεταξύ των ισομορφών, η ενεργότητα της φωσφατάσης ίσως να επηρεάζεται από την ποσότητα του CD45 η οποία εκφράζεται στη μεμβράνη. Η έκφραση του μορίου αυξάνεται κατά τη διαφοροποίηση των κυττάρων και κατά την ενεργοποίησή τους. Η θέση του CD45 στην κυτταρική μεμβράνη και η πρόσβαση του στο υπόστρωμα έχει σημασία στη μεταγωγή των μηνυμάτων. Η σύνδεση του αντιγόνου στο ΤCR οδηγεί στη συγκέντρωση των σχετιζόμενων πρωτεϊνών όπως των Lck, LAT κτλ αλλά όχι του

39 31 CD45 114,115. Παρόμοιο φαινόμενο παρατηρείται και στα Β λεμφοκύτταρα 116. Ο λόγος για τον οποίο το CD45 αποκλείεται από την ανοσολογική σύναψη φαίνεται ότι είναι το μεγάλο του μέγεθος σε σχέση με το μέγεθος των υπολοίπων μορίων 83. Σύμφωνα με κάποιες μελέτες βρέθηκε μικρή ποσότητα του μορίου στην περιοχή της ανοσολογικής σύναψη 117,118,119. Αυτό πιθανώς οφείλεται στη μεθοδολογία η οποία χρησιμοποιήθηκε αλλά και στην πιθανή ύπαρξη μεμβρανών με διαφορετική σύσταση σε λιπίδια καθώς και στις διάφορες ισομορφές του CD45. Οι αντιδράσεις με άλλες πρωτεΐνες οι οποίες αλλάζουν την ενεργότητα της φωσφατάσης ή την πρόσβαση στο υπόστρωμα ίσως επηρεάζουν την λειτουργία του μορίου. Η διαμεμβρανική περιοχή του CD45 σχετίζεται με την LPAP (lymphocyte phosphatase-associated phosphoprotein), της οποίας η λειτουργία είναι άγνωστη ακόμα. Η LPAP συνδέεται με το μονομερές μόριο αλλά δεν έχει αποσαφηνιστεί αν έχει κάποιο ρυθμιστικό ρόλο στη λειτουργία του CD45 120,121. Το μόριο CD45 αλληλεπιδρά με το CD100 επηρεάζοντας την προσκόλληση των Τ λεμφοκυττάρων αλλά και με τον υποδοχέα της α αλύσου της ιντερφερόνης (INF). H αλληλεπίδραση του τελευταίου με το CD45 είναι απαραίτητη για τη μεταγωγή των μηνυμάτων του υποδοχέα της α αλύσου, επηρεάζοντας τη λειτουργία των Τ λεμφοκυττάρων 122. Η κυτταροπλασματική περιοχή του CD45, δεσμεύει τη φοδρίνη (fodrin) και τη SKAP55 (Src kinase-associated phosphoprotein of 55 kda). Η φοδρίνη είναι πρωτεΐνη του κυτταροσκελετού και η σχέση της με το CD45 ίσως είναι ο σύνδεσμος μεταξύ του ενδοκυττάριου δικτύου μικροϊνιδίων και αυτής της επιφανειακής πρωτεΐνης 123. Η σύνδεση με τη φοδρίνη in vitro μπορεί να διεγείρει σημαντικά την ενεργότητα της φωσφατάσης 124. Η SKAP55 είναι πρωτεΐνη προσαρμογέας και ίσως η δέσμευση της από το CD45 οδηγεί στην ένωση με τις κινάσες της οικογένειας Src η οποία καταλήγει στην αποφωσφορυλίωσή τους 125. Επιπλέον, η περιοχή της φωσφατάσης του μορίου είναι συνεχώς φωσφορυλιωμένη στα κατάλοιπα σερίνης και είναι υπόστρωμα για την πρωτεϊνική κινάση C και την κινάση καζεΐνης ΙΙ. Αυτή η φωσφορυλίωση μπορεί να αλλάζει την ενεργότητα του μορίου καθώς και την ειδικότητά του ως προς το υπόστρωμα 126,127. Τέλος η μικρή ισομορφή του μορίου, το CD45RO, βρέθηκε ότι συσχετίζεται με το CD4/CD8 και τον TCR περισσότερο από ότι οι μεγάλες ισομορφές 128,129,130,131. Έτσι, τα κύτταρα που εκφράζουν CD45RO απαντούν πιο αποτελεσματικά σε κάποιες περιπτώσεις στη μεταφορά μηνυμάτων από το TCR Αλληλεπίδραση του μορίου CD45 με το μόριο CD26 Το μόριο CD26 συμμετέχει στην ενδοκυττάρια μεταγωγή των μηνυμάτων. Αυτό γίνεται πιθανότατα με την αλληλεπίδρασή του με άλλα μόρια, αφού η κυτταροπλασματική περιοχή του CD26 είναι πολύ μικρή για να δικαιολογεί την ενδοκυττάρια μεταγωγή των μηνυμάτων. Η φυσική συσχέτιση των δύο μορίων στην κυτταρική μεμβράνη οδηγεί στην υπόθεση ότι το CD45 ίσως να έχει σημαντικό ρόλο στη μέσω του CD26 συνδιέγερση 30. Έχει παρατηρηθεί ότι αντι-cd26 αντισώματα προκαλούν αύξηση της συγκέντρωσης του CD26 αλλά και έκφραση του CD26 και του CD45 σε γειτονικές θέσεις (colocalizing) στην κυτταρική μεμβράνη 30. Επιπλέον, το CD26 δεσμεύει την κυτταροπλασματική περιοχή του CD45 μετά από είσοδο του πρώτου στο κύτταρο 132. Η αναδιαμόρφωση της έκφρασης του CD26 στη μεμβράνη των Τ λεμφοκυττάρων ενισχύει τη φωσφορυλίωση

40 32 πρωτεϊνών οι οποίες συμμετέχουν στην μεταγωγή των μηνυμάτων μέσω του συμπλέγματος TCR/CD3 3,133. Το CD45 έχει θετικό κυρίως ρυθμιστικό ρόλο στην ανοσολογική σύζευξη αποφωσφορυλιώνοντας τη Src κινάση καθιστώντας την έτοιμη για ενεργοποίηση. Ο έλεγχος της δράσης της φωσφατάσης γίνεται εν μέρει με το διμερισμό του CD45. Το CD26 πιθανώς να ρυθμίζει τη δράση της φωσφατάσης του CD45 με τη δέσμευση της κυτταροπλασματικής περιοχής. Η δέσμευση των δύο μορίων αναστέλλει το διμερισμό του CD45 το οποίο διατηρεί έτσι τη δράση φωσφατάσης, ρυθμίζοντας την μεταγωγή των μηνυμάτων από τον TCR CD45 και νοσήματα Η απουσία του CD45 οδηγεί στην εμφάνιση της ανοσοανεπάρκειας SCID με δυσλειτουργία των Τ και Β λεμφοκυττάρων 85. Η έκφραση, οι ισομορφές CD45 και η λειτουργική κατάσταση των Τ λεμφοκυττάρων έχουν συσχετιστεί με πολλά νοσήματα όπως η νεογνική χολόσταση, η κακή θρέψη, ο συστηματικός ερυθηματώδης λύκος (ΣΕΛ), η ρευματοειδής αρθρίτιδα και το AIDS. Επίσης, αλλαγές στη λειτουργία του μορίου διαπιστώθηκαν στα κακοήθη νοσήματα του αίματος και στη νόσο Alzheimer 83,95. Αν οι αλλαγές αυτές είναι η αιτία ή είναι το αποτέλεσμα της ανάπτυξης των νοσημάτων, αυτό είναι άγνωστο. Πιο συγκεκριμένα, στο ΣΕΛ διαπιστώθηκε μείωση στην έκφραση του μορίου αλλά και στην ενεργότητα της φωσφατάσης Αυτή η μείωση ίσως οφείλεται σε μια αποτυχημένη προσπάθεια του οργανισμού για περιορισμό της νόσου. Πειράματα σε ποντίκια με συνεχώς ενεργό CD45 οδήγησαν στην εμφάνιση φαινοτύπου λύκου 113. Φαίνεται λοιπόν ότι η αλλαγή της ισορροπίας μεταξύ θετικής και αρνητικής ρύθμισης της φωσφορυλίωσης της τυροσίνης ίσως συμβάλει στην ανάπτυξη αυτοάνοσων νοσημάτων. Ε- πιπλέον, παρατηρήθηκε μείωση των CD4+CD45RΑ+ T λεμφοκυττάρων, ενώ η αναλογία των CD4+CD45RA+CD45RO+ T λεμφοκυττάρων ήταν αυξημένη. Σε ένα μικρό ποσοστό ασθενών διαπιστώθηκε αύξηση των CD8+CD45RO+ σε σχέση με τα CD8+CD45RA+ Τ λεμφοκύτταρα. Οι ασθενείς αυτοί είχαν αυξημένη ενεργότητα της νόσου και πιθανόν αιμολυτική αναιμία. Στην πλειονότητα όμως των ασθενών δεν υπήρχαν αλλαγές ανάμεσα στις ισομορφές του μορίου στα CD8 Τ λεμφοκύτταρα 137. Σε ένα μικρό ποσοστό ασθενών (25%-66% ανάλογα με τη μέθοδο ανίχνευσης) με ΣΕΛ ανιχνεύονται αυτοαντισώματα έναντι του CD Κάποια από αυτά τα αντι-cd45 αντισώματα έχουν την ικανότητα να εξουδετερώνουν τα ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα μέσω α- δράνιας ή απόπτωσης 139. Στη Ρευματοειδή Αρθρίτιδα τα ευρήματα είναι παρόμοια. Στο περιφερικό αίμα αλλά και στο αρθρικό υγρό υπερισχύουν τα CD45RO+ T λεμφοκύτταρα σε σχέση με τα CD45RΑ+ T λεμφοκύτταρα 140. Στη νόσο του Alzheimer παρατηρήθηκε μείωση του CD45RΑ και αύξηση του CD45RO 85. Σε 50% των ασθενών με πολλαπλό μυέλωμα παρατηρήθηκε απώλεια της έκφρασης του μορίου. Επιπλέον, σε αυτούς τους ασθενείς διαπιστώθηκε ότι η διέγερση της ιντερλευκίνης-6 οδηγεί σε αύξηση της έκφρασης του CD45 και του πολλαπλασιασμού, ενώ το αντίθετο οδηγεί σε μείωση της έκφρασης του 141,142. Στη λοίμωξη από τον ιό HIV, ο ιός φαίνεται ότι πολλαπλασιάζεται κατά προτίμηση στα CD4 + CD45RO + κύτταρα μνήμης και όχι στα CD4 + CD45RΒ + κύτταρα 143,144.

41 Το CD45 ως θεραπευτικός στόχος Ο ρόλος του CD45 στα κύτταρα του αίματος και η συσχέτισή του με διάφορα νοσήματα το κάνει ελκυστικό θεραπευτικό στόχο. Η τροποποίηση της λειτουργίας του πιθανώς να παρέχει ένα μέσο ελέγχου της ανοσιακής απάντησης στα αυτοάνοσα νοσήματα, στις ανοσοανεπάρκειες και στον καρκίνο. Αυτό μπορεί να γίνει είτε με αναστολείς του μορίου είτε με αντι-cd45 αντισώματα.

42 34

43 Ρευματοειδής Αρθρίτιδα (ΡΑ) Εισαγωγή A3 ΝΟΣΗΜΑΤΑ Η αρθρίτιδα έχει περιγραφεί ως νοσολογική οντότητα από την αρχαιότητα. Ο ό- ρος ρευματοειδής αρθρίτιδα όμως, όπως χρησιμοποιείται σήμερα για την περιγραφή του αυτοάνοσου συστηματικού νοσήματος, έγινε επίσημα δεκτός στην Αγγλία για πρώτη φορά το Η νόσος εμφανίζεται συχνότερα στις γυναίκες από ότι στους άντρες 2 με 4 φορές. Η ετήσια επίπτωση υπολογίζεται μεταξύ του 0.24 με 0.6 ανά 1000 άτομα για τις γυναίκες και 0.15 με 0.26 ανά 1000 άτομα για τους άντρες 146,147. Η επίπτωση αυξάνεται με την αύξηση της ηλικίας. Ο επιπολασμός της νόσου είναι μεταξύ 0.5 και 1%. Στην Ελλάδα ο επιπολασμός της νόσου υπολογίζεται στο 0,67% των ενηλίκων 148. Παρά τις προσπάθειες των ερευνητών δεν έχει βρεθεί η αιτία η οποία προκαλεί τη νόσο. Έχουν αναγνωριστεί όμως, γενετικοί, ορμονικοί και περιβαλλοντικοί παράγοντες κινδύνου. Η αυξημένη συχνότητα του HLA-DR4 σε ασθενείς με σοβαρή ΡΑ οδήγησε στην συσχέτιση της νόσου με τα γονίδια του Μείζονος Συστήματος Ιστοσυμβατότητας (MHC) και ειδικά με το αντιγόνο HLA-DRB1 και τον μοιραζόμενο επίτοπο. Τα HLA αντιγόνα είναι υπεύθυνα μόνο για το 30-50% της γενετικής επιδεκτικότητας για τη ΡΑ 149. Τα μη-hla γονίδια, τα οποία συμβάλλουν στην εκδήλωση της νόσου είναι μεταξύ άλλων, το γονίδιο της ιντερλευκίνης-1 (IL-1) και του υποδοχέα του παράγοντα νέκρωσης των όγκων Ι και ΙΙ (TNFRI και TNFRII) 150. Η εγκυμοσύνη και η έλλειψη ανδρογόνων αναγνωρίστηκαν ως παράγοντες κινδύνου 151,152. Στους περιβαλλοντικούς παράγοντες κινδύνου ανήκουν το κάπνισμα, η καφεΐνη και η παχυσαρκία 153. Η προσπάθεια για ανεύρεση κάποιου μικροοργανισμού ως αιτιολογικό παράγοντα δεν απέδωσε. Παρ όλα αυτά, σε κάποιες μελέτες διαπιστώθηκαν αυξημένα αντισώματα για τους ιούς Epstein Bar και Parvovirus B19 σε ασθενείς με ΡΑ 154, Διαγνωστικά κριτήρια Η διάγνωση της Ρευματοειδούς Αρθρίτιδας βασίζεται σε κλινικά και εργαστηριακά κριτήρια. Το 1987 η ARA (American Rheumatism Association) όρισε τα επτά διαγνωστικά κριτήρια: 1. Πρωινή δυσκαμψία διάρκειας τουλάχιστον μίας ώρας 2. Αρθρίτιδα σε τουλάχιστον τρεις αρθρικές περιοχές η οποία διαρκεί τουλάχιστον για έξι εβδομάδες. Οι αρθρικές περιοχές οι οποίες αξιολογούνται είναι οι μετακαρπιοφαλαγγικές, οι εγγύς φαλαγγοφαλαγγικές, οι καρποί, οι αγκώνες, τα γόνατα, οι ποδοκνημικές και οι μεταταρσιοφαλαγγικές. 3. Αρθρίτιδα στα χέρια διάρκειας τουλάχιστον έξι εβδομάδων 4. Συμμετρική αρθρίτιδα διάρκειας τουλάχιστον έξι εβδομάδων 5. Ρευματοειδή οζίδια 6. Ρευματοειδής παράγοντας θετικός 7. Ακτινολογικές αλλοιώσεις

44 36 Για να τεθεί η διάγνωση πρέπει να πληρούνται τουλάχιστον τέσσερα από τα επτά κριτήρια 156. Το 2010 ανακοινώθηκαν από τη ACR (American College of Rheumatology) και την EULAR (European League Against Rheumatism) τα νέα κριτήρια για την πρώιμη διάγνωση της ΡΑ. Σύμφωνα με αυτά αξιολογείται η προσβολή των αρθρώσεων, τα ορολογικά ευρήματα όσον αφορά στο ρευματοειδή παράγοντα και στα αντισώματα κατά των κιτρουλλοποιημένων πρωτεϊνών (αντι-ccp), η διάρκεια της υμενίτιδας και οι εργαστηριακοί δείκτες φλεγμονής. Ανάλογα με τη βαρύτητα τους, τα εργαστηριακά και κλινικά ευρήματα, βαθμολογούνται με μέγιστο συνολικό αποτέλεσμα το 10. Η βαθμολόγηση για τα τέσσερα θεματικά πεδία τα οποία αξιολογούνται είναι: 1. Προσβολή αρθρώσεων 1 μέσου μεγέθους ή μεγάλη άρθρωση (0 βαθμοί) 2-10 μέσου ή μεγάλου μεγέθους αρθρώσεις (βαθμός 1) 1-3 μικρές αρθρώσεις (βαθμοί 2) 4-10 μικρές αρθρώσεις (βαθμοί 3) περισσότερες από 10 μικρές αρθρώσεις ( βαθμοί 5) 2. Ορολογικός έλεγχος για αυτοαντισώματα αρνητικός για ρευματοειδή παράγοντα και για αντικιτρουλινικά αντισώματα CCP (βαθμοί 0) τουλάχιστον μία από τις δύο αυτές εξετάσεις θετική σε χαμηλό τίτλο. Ως χαμηλός τίτλος ορίζεται ως τρεις φορές η ανώτερη φυσιολογική τιμή (βαθμοί 2) τουλάχιστον μία από τις αυτές εξετάσεις μεγαλύτερη από τρεις φορές τη φυσιολογική τιμή (βαθμοί 3) 3. Διάρκεια υμενίτιδας λιγότερο από έξι εβδομάδες (βαθμοί 0) έξι εβδομάδες ή περισσότερο (βαθμοί 1) 4. Πρωτεΐνες οξείας φάσης φυσιολογική ΤΚΕ και C-αντιδρώσα πρωτεΐνη (CRP) (βαθμοί 0) αυξημένη ΤΚΕ ή CRP (βαθμοί 1) Αν το σύνολο των βαθμών είναι μεγαλύτερο ή ίσο του 6 τότε ο ασθενής έχει ρευματοειδή αρθρίτιδα 157. Είναι σημαντικό να τονιστεί ότι στην πρώιμη ΡΑ τα παλαιότερα κριτήρια μπορεί να μην πληρούνται, αλλά αν υπάρχει σημαντική κλινική υπόνοια είναι σημαντική η έ- ναρξη θεραπείας λόγω των σοβαρών συνεπειών της νόσου. Τόσο τα παλιότερα όσο και τα νέα κριτήρια είναι ένα χρήσιμο διαγνωστικό εργαλείο Κλινική εικόνα Η ΡΑ είναι ένα αυτοάνοσο ρευματικό νόσημα με κύριο χαρακτηριστικό τη φλεγμονώδη πολυαρθρίτιδα. Προσβάλλει κυρίως τις μικρές αρθρώσεις των χεριών και των ποδιών. Μπορεί να προσβάλλει σχεδόν όλες τις αρθρώσεις: καρπούς, ποδοκνημικές, α- γκώνες, ώμους, αυχενική μοίρα της σπονδυλικής στήλης, τα ισχία και τα γόνατα ενώ δεν προσβάλλονται σχεδόν ποτέ οι άπω φαλαγγοφαλαγγικές και η θωρακική και οσφυϊκή μοίρα της σπονδυλικής στήλης. Η υμενίτιδα προκαλεί τον πόνο-ευαισθησία, το οίδημα και την πρωινή δυσκαμψία. Ο αρθρικός υμένας φλεγμαίνει και παχύνετε σχηματίζοντας

45 τον πάννο, ο οποίος προκαλεί διαβρώσεις στις παρακείμενες αρθρικές επιφάνειες των οστών. Τα ρευματοειδή οζίδια εμφανίζονται στο 20% των ασθενών, οι οποίοι συνήθως είναι οροθετικοί στο ρευματοειδή παράγοντα και έχουν βαρύτερη νόσο 158. Εντοπίζονται στις εκτατικές επιφάνειες του σώματος και των αρθρώσεων σε σημεία που ασκούνται μηχανικές πιέσεις. Οι αγκώνες, τα δάκτυλα των ποδιών και των χεριών και οι πτέρνες είναι τα κύρια σημεία όπου εντοπίζονται 156. Η τενοντοελυτρίτιδα των καμπτήρων οφείλεται σε φλεγμονή των τενόντιων ελύτρων και μπορεί να οδηγήσει σε εκτινασσόμενο δάκτυλο. Οι παραμορφώσεις λαιμός κύκνου (swan-neck), η δυσμορφία κομβιοδόχης (boutonniere deformity) και τα υπερξαρθρήματα, τα οποία οδηγούν σε ωλένια απόκλιση, αποτελούν εκδηλώσεις προχωρημένης νόσου και δεν είναι αναστρέψιμες 156. Οι θυλακίτιδες του ωλεκράνου, των γονάτων, του αχίλλειου μπορεί να είναι επίσης εκδήλωση της ΡΑ. Οφείλονται σε φλεγμονή στους παρακείμενους των αρθρώσεων θυλάκους. Εκτός από τις εκδηλώσεις στο μυοσκελετικό σύστημα, η ΡΑ είναι δυνατόν να προσβάλει τον πνεύμονα, την καρδιά, το δέρμα, τους οφθαλμούς, το ήπαρ, τους μυς, το αιμοποιητικό και το νευρικό σύστημα. Οι κύριες αιματολογικές διαταραχές είναι η αναιμία, η θρομβοκυττάρωση, η θρομβοπενία και η λεμφαδενοπάθεια. Η αναιμία οφείλεται στη χρόνια νόσο, αλλά και στην ελαττωμένη ερυθροποίηση. Η θρομβοκυττάρωση παρατηρείται κυρίως σε ενεργό νόσο και η αιτία της είναι αδιευκρίνιστη. Η θρομβοπενία είναι σπάνιο εύρημα στη ΡΑ, αλλά μπορεί εκδηλωθεί στο σύνδρομο Felty και ως παρενέργεια της φαρμακευτικής α- γωγής. Τέλος, η λεμφαδενοπάθεια είναι συχνό εύρημα στην ενεργό νόσο και οφείλεται σε καλοήθη υπερπλασία των λεμφαδένων 156. Στη ΡΑ υπάρχει αυξημένος κίνδυνος για μη-hodgkin λέμφωμα όποτε η λεμφαδενοπάθεια μπορεί να μην είναι καλοήθης 159. Το σύνδρομο Felty παρουσιάζεται συνήθως σε οροθετικούς ασθενείς με μακρά διάρκεια νόσου και οζίδια. Χαρακτηρίζεται από το συνδυασμό ΡΑ, λευκοπενίας και σπληνομεγαλίας. Οι ασθενείς μπορεί να παρουσιάσουν θρομβοπενία, όπως αναφέρθηκε και πιο πάνω. Οι εκδηλώσεις από το ήπαρ στην ενεργό ΡΑ είναι κυρίως η τρανσαμινασαιμία, ενώ οι ασθενείς με σύνδρομο Felty μπορεί να παρουσιάσουν ηπατομεγαλία. Οι εκδηλώσεις από τον πνεύμονα είναι ποικίλες και μερικές από αυτές είναι πολύ σοβαρές. Οι ασθενείς μπορεί να παρουσιάσουν πλευρίτιδα, πνευμονικά οζίδια, πνευμονοκονίαση, διάχυτη διάμεση πνευμονική ίνωση, βρογχιολίτιδα, αποφρακτική πνευμονοπάθεια και απόφραξη ανώτερων αεροφόρων οδών. Η διάμεση πνευμονική ίνωση συνήθως εκδηλώνεται με προσβολή των βάσεων των πνευμόνων άμφω. Οι κλινικές εκδηλώσεις και η πορεία των ασθενών είναι ίδιες με αυτές που παρατηρούνται στην ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση. Βέβαια υπάρχουν αναφορές για καλύτερη ανταπόκριση των ασθενών με πνευμονική ίνωση στα πλαίσια αυτοάνοσου ρευματικού νοσήματος στα ανοσοτροποποιητικά φάρμακα. Η βρογχιολίτιδα διακρίνεται σε αποφρακτική γνωστή ως BOOP (Bronchiolitis obliterans organizing pneumonia), η οποία ανταποκρίνεται καλά στη θεραπεία και σε συμπιεστική η οποία έχει κακή πρόγνωση 160. Η προσβολή της κρικοαριταινοειδούς άρθρωσης μπορεί να προκαλέσει απόφραξη ανώτερων αεροφόρων οδών 161. Οι ασθενείς με ΡΑ τέλος, μπορεί να παρουσιάσουν σπάνια πνευμονική αρτηρίτιδα και πνευμονική υπέρταση. 37

46 38 Η φλεγμονή οξεία ή χρόνια στη ΡΑ μπορεί να προκαλέσει περικαρδίτιδα, μυοκαρδιακή νόσο, συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια, βαλβιδοπάθεια και στεφανιαία αρτηρίτιδα. Στις εξωαρθρικές εκδηλώσεις από την καρδιά μπορεί να ταξινομηθεί και η α- θηροσκλήρωση 162. Η κερατοεπιπεφυκίτιδα είναι από τις συχνότερες οφθαλμικές εκδηλώσεις στη ΡΑ. Λιγότερο συχνές, είναι η επισκληρίτιδα, η σκληρίτιδα, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε σκληρομαλακία, η ραγοειδίτιδα και η ελκωτική κερατίτιδα 156. Οι κύριες νευρολογικές εκδηλώσεις στη ΡΑ είναι η περιφερική νευροπάθεια, η οποία εκδηλώνεται ως αισθητικοκινητική νευροπάθεια ή ως πολλαπλή μονονευρίτιδα και η συμπίεση νεύρων στα σημεία διέλευσης τους. Το κεντρικό νευρικό σύστημα σπάνια προσβάλλεται από διάχυτη οζώδη παχυμηνιγγίτιδα, αγγειίτιδα και αμυλοείδωση 156. Η αμυλοείδωση, αν και σπάνια εκδήλωση στη ΡΑ, μπορεί να προσβάλει καρδιά νεφρούς, ήπαρ, σπλήνα, έντερο και δέρμα 163. Οι εκδηλώσεις από τους νεφρούς είναι σπάνιες και συνήθως αποδίδονται στη φαρμακευτική αγωγή, εκτός από τις εκδηλώσεις οι οποίες οφείλονται στην αμυλοείδωση και τη μεσαγγειακή σπειραματονεφρίτιδα. Οι εκδηλώσεις από τους μυς, αν και πιο συχνές, είναι συνήθως δευτεροπαθείς. Η μυϊκή ατροφία και αδυναμία αποδίδονται στην φλεγμονή των αρθρώσεων, ενώ η μυοπάθεια στη φαρμακευτική αγωγή. Η ρευματοειδής αγγειίτιδα προσβάλλει μικρά αγγεία κυρίως σε ασθενείς με οροθετική νόσο. Η αγγειίτιδα μικρών αγγείων είναι το πρώτο στάδιο στην ανάπτυξη οζιδίων. Τα έμφρακτα στη κοίτη των νυχιών, η γάγγραινα στα άκρα, τα έλκη στα πόδια και η αισθητική νευροπάθεια οφείλονται σε αγγειίτιδα μικρών και μέσου μεγέθους αγγείων 156. Στις συστηματικές εκδηλώσεις της ΡΑ ανήκουν η κόπωση, η ανορεξία και η α- πώλεια βάρους, ενώ στους ηλικιωμένους μπορεί να προεξέχει η πολυμυαλγία Διάγνωση Η διάγνωση της ΡΑ βασίζεται στην κλινική εικόνα. Η πρωινή δυσκαμψία και η συμμετρική αρθρίτιδα, διάρκειας πάνω από έξι εβδομάδες είναι κύρια χαρακτηριστικά της νόσου. Η παρουσία ρευματοειδούς παράγοντα (RF) και αντισωμάτων κατά των κιτρουλινοποιημένων πρωτεϊνών (αντι-ccp) βοηθούν στη διάγνωση αλλά ένα ποσοστό των ασθενών μπορεί να είναι οροαρνητικοί. Η ευαισθησία του ρευματοειδούς παράγοντα είναι 70-80%, αλλά η ειδικότητά του είναι πιο χαμηλή. Αντίθετα, η ευαισθησία των αντι- CCP είναι 50% στην πρώιμη ΡΑ, αλλά με την πάροδο του χρόνου ανεβαίνει έως 85%, ενώ η ειδικότητα τους είναι 97%. Τα θετικά αντι-ccp σε συνδυασμό με θετικό ρευματοειδή παράγοντα έχουν 99% ειδικότητα στη διάγνωση της ΡΑ 164. Στη πρώιμη ΡΑ οι α- κτινογραφίες δεν είναι διαγνωστικές, αφού οι χαρακτηριστικές διαβρώσεις εμφανίζονται μέσα στα επόμενα δύο χρόνια. Ο υπέρηχος και η μαγνητική τομογραφία μπορούν να α- ναδείξουν νωρίτερα τις αλλοιώσεις στις αρθρικές επιφάνειες των οστών. Το αρθρικό υγρό συνήθως είναι ημιδιαυγές έχει περισσότερα από 2000 κύτταρα ανά οπτικό πεδίο, με υπεροχή των πολυμορφοπυρήνων. Η έγκαιρη διάγνωση στην πρώιμη ΡΑ έχει μεγάλη σημασία γιατί η έγκαιρη έναρξη θεραπευτικής αγωγής μπορεί να προλάβει τις αλλοιώσεις στα οστά και την καταστροφή των αρθρώσεων.

47 39 Στις πρώιμες ακτινολογικές αλλοιώσεις ανήκει το οίδημα μαλακών μορίων, το οποίο οφείλεται στον ύδραρθρο, στην υμενίτιδα και στις τενοντοελυτρίτιδες. Αργότερα προστίθεται στην ακτινολογική εικόνα η περιοχική οστεοπόρωση, οι διαβρώσεις, η στένωση του μεσάρθριου διαστήματος, τα υπερξαρθρήματα και η αγκύλωση των αρθρώσεων Παρακολούθηση ασθενών Στη πορεία του χρόνου διαπιστώθηκε ότι κάποια χαρακτηριστικά της νόσου, όταν υπάρχουν, αποτελούν δυσμενείς προγνωστικούς παράγοντες. Η παρουσία του RF και των αντι-ccp, του μοιραζόμενου επίτοπου, των πρωτεϊνών οξείας φάσης, CRP και ΤΚΕ, των πρώιμων διαβρώσεων στις ακτινογραφίες 165,166 και του ψηλού δείκτη λειτουργικότητας HAQ είναι ενδεικτικά για βαρύτερη νόσο. Η πολυαρθρίτιδα, οι εξωαρθρικές εκδηλώσεις, το φύλο, η εμμηνόπαυση, η μεγάλη ηλικία κατά την εκδήλωση της νόσου 167 και το χαμηλό επίπεδο εκπαίδευσης είναι επίσης δυσμενείς προγνωστικοί παράγοντες. Για την παρακολούθηση της νόσου έχουν αναπτυχθεί δέκτες για την ενεργότητα, την λειτουργικότητα και ακτινολογικοί δείκτες αρθρικής καταστροφής. Υπάρχουν επίσης κλίμακες αξιολόγησης του πόνου και της συνολικής ενεργότητας της νόσου από ασθενή και γιατρό και ερωτηματολόγια για την αξιολόγηση της ποιότητας της ζωής των ασθενών. Ο πιο γνωστός δείκτης ενεργότητας είναι ο DAS28 (disease activity score) 168, ο οποίος συνιστάται από τέσσερεις παραμέτρους: τις ευαίσθητες αρθρώσεις, τις οιδηματώδεις αρθρώσεις, το δείκτη φλεγμονής ΤΚΕ ή CRP και τη γενική κατάσταση υγείας του ασθενή. Οι αρθρώσεις οι οποίες εξετάζονται είναι οι ώμοι, οι αγκώνες, οι πηχεοκαρπικές, οι μετακαρπιοφαλαγγικές, οι μεσοφαλαγγικές και τα γόνατα. Ο DAS28 ουσιαστικά προέκυψε από την απλοποίηση του DAS, όπου εξετάζονται 44 αρθρώσεις -οι 28 οι ο- ποίες αναφερθήκαν- και οι ποδοκνημικές, οι μεταταρσιοφαλαγγικές, οι ακρωμιοκλειδικές και οι στερνοκλειδικές. Στους δείκτες ενεργότητας ανήκει και ο Ritchie Articular Index, στον οποίο αξιολογούνται ακόμα περισσότερες αρθρώσεις. Οι δύο τελευταίοι δείκτες δεν χρησιμοποιούνται στην καθημερινή κλινική πρακτική. Ο DAS28 έχει επικρατήσει λόγω της ευχρηστίας του αλλά και της αξιοπιστίας του. Η αξιολόγηση της λειτουργικότητας των ασθενών γίνεται με το HAQ (Health Assessment Questionnaire). Πρόκειται για ένα ερωτηματολόγιο 20 ή 8 ερωτήσεων, με τις οποίες καταγράφεται ο βαθμός δυσχέρειας στην εκτέλεση των καθημερινών δραστηριοτήτων. Επίσης, χρησιμοποιείται η κλίμακα της φυσικής λειτουργικότητας της AIMS (arthritis impact measurement scales) και το SF-36 (medical outcome study short form 36) 156. Οι Sharp και Larsen-Dale είναι οι ακτινολογικοί δείκτες, οι οποίοι χρησιμοποιούνται για την καταγραφή της ακτινολογικής εξέλιξης της ΡΑ. Το μειονέκτημα αυτών των δεικτών είναι το φαινόμενο ταβανιού. Όταν φτάσουν δηλαδή στη μέγιστη τους τιμή και ενώ οι καταστροφή των αρθρώσεων συνεχίζεται, δεν προσφέρουν κάτι στην αξιολόγηση των ασθενών 156. Η καταγραφή του πόνου, της ενεργότητας και της γενικής κατάστασης της υγείας από ιατρό και ασθενή γίνεται με τη χρήση κλιμάκων. Οι οπτικές αναλογικές κλίμακες VAS (visual analog scales) είναι οι πιο εύχρηστες 156.

48 40 Τέλος, υπάρχουν δείκτες και ερωτηματολόγια για την ποιότητα ζωής, την αρθρική καταστροφή και για την αξιολόγηση της ανικανότητας των ασθενών. Στους δείκτες, οι οποιοι προαναφέρθηκαν, βασίζονται τα κριτήρια βελτίωσης και ύφεσης της ΡΑ και κατά συνέπεια η ανταπόκριση των ασθενών στην φαρμακευτική αγωγή Παθοφυσιολογία Γενικά Η ρευματοειδής αρθρίτιδα είναι ένα αυτοάνοσο νόσημα, στο οποίο το ανοσολογικό σύστημα έχει ένα σημαντικό ρόλο στην παθογένεια του. Η αντίδραση του οργανισμού σε ένα άγνωστο προς το παρόν αντιγόνο, αυτοαντιγόνο ή αλλοαντιγόνο, οδηγεί μέσο του HLA στην ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων και στην έκκριση κυτταροκινών, την ενεργοποίηση πρωτεϊνασών και τελικά την καταστροφή του αρθρικού χόνδρου 156. Τα Τ λεμφοκύτταρα έχουν σημαντικό ρόλο στη παθογένεια της ΡΑ, αλλά τα τελευταία χρόνια δίνεται έμφαση και στο ρόλο των Β λεμφοκυττάρων. Τα αυτοαντιγόνα τα οποία έχουν προταθεί ως αντιγόνα στόχοι για τη νόσο είναι περιορισμένα στην άρθρωση, όπως το κολλαγόνο τύπου ΙΙ 169, οι πρωτεογλυκάνες και οι γλυκοπρωτείνες 170 ή δεν είναι περιορισμένα στην άρθρωση, όπως οι κιτρουλλοποιημένες πρωτεΐνες, ο ρευματοειδής παράγοντας 171,172 και οι πρωτεΐνες του θερμικού σοκ. Τα υ- ποψήφια εξωγενή αντιγόνα προέρχονται από μικρόβια και ιούς. Η μοριακή μίμηση ίσως είναι ένας μηχανισμός, o οποίος οδηγεί σε αυτοανοσία μετά από την επαφή του ανοσιακού συστήματος με ένα εξωγενές αντιγόνο. Τα γονίδια του HLA (Human Leukocyte antigen) εξηγούν ένα μέρος της γενετικής προδιάθεσης στη ΡΑ. Τα HLA αντιγόνα τάξης ΙΙ και πιο συγκεκριμένα τα HLA DR4 αλλήλια τα οποία βρίσκονται στην περιοχή του HLA DRB1 του μείζονος συστήματος ιστοσυμβατότητας -MHC- σχετίζονται με την εμφάνιση της νόσου. Αυτά τα αλλήλια έ- χουν κοινή μια σειρά αμινοξέων στην τρίτη υπερμεταβλητή περιοχή της αλυσίδας του HLA DRβ1 στη θέση 70-74, το μοιραζόμενο επίτοπο 173. Οι ασθενείς, οι οποίοι φέρουν την αλληλουχία του μοιραζόμενου επίτοπου, είναι πιο επιδεκτικοί σε σοβαρότερη νόσο. Τα HLA μόρια δεσμεύουν αντιγονικά πεπτίδια και τα παρουσιάζουν στα Τ λεμφοκύτταρα και έχουν σημαντικό ρόλο στην επιλογή και στη δημιουργία της ποικιλίας των αντιγονοειδικών Τ λεμφοκυττάρων Ο ρόλος των κυτταροκινών Η αγγειογένεση στον αρθρικό υμένα, η οποία παρατηρείται από τα αρχικά στάδια της νόσου, αυξάνει την είσοδο λευκοκυττάρων στην άρθρωση. Τα Τ λεμφοκύτταρα είναι κυρίως κύτταρα μνήμης, τα οποία φέρουν τον τύπο CD45RO και παρόλο τον φαινότυπο τους είναι ανθεκτικά στην απόπτωση. Αυτό οφείλεται σε παράγοντες, οι οποίοι βρίσκονται μέσα στην άρθρωση, όπως η τύπου Ι ιντερφερόνη και η ιντερλεκίνη Τα περισσότερα είναι Th1 τύπου και προάγουν την παραγωγή από τα μακροφάγα του υμένα IL-1, TNFa, IL-15, IL-17, IL-18 και IL-6 μέσα στην άρθρωση 156. Η IL-1 είναι κυτταροκίνη με κύριο ρόλο στη φλεγμονή. Παράγεται από τα μονοκύτταρα αλλά και από τα μακροφάγα, τα ουδετερόφιλα, τα επιθηλιακά και τα ενδοθηλια-

49 κά κύτταρα 1. Υπάρχουν δύο μορφές της ιντερλευκίνης-1, η IL-1a και η IL-1b, δύο υποδοχείς, ο IL-1RI και ο IL-1RII και ένας αναστολέας του υποδοχέα Ι της ιντερλευκίνης-1, ο IL-1Ra. Στην ρευματοειδή άρθρωση η IL-1a ανιχνεύεται κυρίως ενδοκυτταρίως, ενώ η IL-1b κυρίως στο αρθρικό υγρό 176. Η παραγωγή της IL-1 από τα μονοκύτταρα προάγεται από τα ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα αλλά και από τον TNF και την ίδια την IL-1 in vitro. Η IL-1 δρα ως μεσάζον στην τοπική φλεγμονή, προκαλεί πυρετό και καχεξία και αυξάνει τη σύνθεση των πρωτεϊνών οξείας φάσης. Μέσα στις αρθρώσεις ασθενών με ρευματοειδή αρθρίτιδα διεγείρει την απελευθέρωση προσταγλανδινών, μεταλλοπρωτεϊνασών και χημειοκινών από τους ινοβλάστες, την παραγωγή μονοξειδίου του αζώτου και προσταγλαδινών καθώς και την έκφραση μορίων προσκόλλησης από τα ενδοθηλιακά κύτταρα, την έκκριση TNF από τα μακροφάγα και την παραγωγή IL-6 και IL-8 από τα χονδροκύτταρα. Η επίδραση της στα χονδροκύτταρα οδηγεί σε μείωση της παραγωγής πρωτεογλυκάνων. Συνεργικά, η IL-1 και ο TNF επάγουν τις πρωτεϊνάσες, τις προσταγλαδίνες και τις κυτταροκίνες των ινοβλαστών. Ο IL-1RI είναι ο κύριος υποδοχέας για τις βιολογικές λειτουργίες της ιντερλευκίνης-1. Αντίθετα, ο υποδοχέας IL-1RII στερείται της ικανότητας να μεταφέρει ενδοκυττάρια μηνύματα. Ο IL-1Ra συνδέεται με τον IL-1RI αλλά δεν προάγει την μεταγωγή ενδοκυττάριων μηνυμάτων 156 λειτουργώντας έτσι ανταγωνιστικά με την ιντερλευκίνη-1. Η ισορροπία μεταξύ της IL-1, των υποδοχέων και του ανταγωνιστή καθορίζουν τη συμμετοχή της ιντερλευκίνης-1 στη φλεγμονώδη διαδικασία. Στην ΡΑ διαταράσσεται αυτή η ισορροπία υπέρ της IL Ο TNF-α είναι κύριος μεσολαβητής στην οξεία φλεγμονή, όπως και η IL-1. Παράγεται κυρίως από τα μονοκύτταρα-μακροφάγα, τα φαγοκύτταρα αλλά και από τα ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα, τα φυσικά κυτταροκτόνα και τα μαστικά κύτταρα 1. Η παραγωγή του TNF αυξάνει στην παρουσία κυτταροκινών όπως INF-γ, IL-1, του ίδιου του TNF και λιποπολυσαγχαριδών (από τα μικρόβια). Έχει δύο υποδοχείς κυτταρικής επιφανείας, τον TNF-RI (p55) και τον TNF-RII (p75). Η σύνδεση του TNF με τον υποδοχέα ΙΙ οδηγεί τελικά στην ενεργοποίηση μεταγραφικών παραγόντων, ενώ η σύνδεση με τον υ- ποδοχέα Ι οδηγεί στην ενεργοποίηση της κασπάσης, την απόπτωση αλλά και στην ενεργοποίηση μεταγραφικών παραγόντων 156. Η κύρια δράση του TNF είναι να αυξάνει τη συγκέντρωση των ουδετεροφίλων και των μονοκυττάρων στα σημεία της φλεγμονής και να τα ενεργοποιεί. Επιπλέον, αυξάνει την έκφραση μορίων προσκόλλησης από τα ενδοθηλιακά κύτταρα στα αγγεία, διεγείρει τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα μακροφάγα να εκκρίνουν χημειοκίνες και προάγει την απόπτωση κάποιων κυτταρικών τύπων. Όπως και η IL-1, δρα στον υποθάλαμο προκαλώντας πυρετό, αυξάνει την σύνθεση πρωτεϊνών ο- ξείας φάσης από το ήπαρ και προκαλεί καχεξία. Τέλος η μεγάλη ποσότητα TNF μειώνει την αρτηριακή πίεση, προκαλεί ενδοαγγειακή θρόμβωση και σοβαρές μεταβολικές διαταραχές 1. Μέσα στην άρθρωση ο TNF αυξάνει την έκφραση της IL-6, της IL-8 και της IL-10. Η επίδραση του στους ινοβλάστες οδηγεί σε αύξηση της προσταγλαδίνης Ε2, των μεταλλοπρωτεϊνασών και των χημειοκίνων 178. Η IL-6 έχει αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες, αλλά είναι και μια προάγουσα τη φλεγμονή κυτταροκίνη. Παράγεται από τους ινοβλάστες 179, τα μακροφάγα και τα χονδροκύτταρα 180 υπό την επίδραση του TNF και της IL-1 στα κύτταρα. Ο υποδοχέας της, IL-6R, βρίσκεται και σε διαλυτή μορφή, sil-6r, και έχει ρόλο στην μεταγωγή των μηνυμάτων σε αντίθεση με τις διαλυτές μορφές των υποδοχέων της IL-1 και του TNF. Επιδρά σε αιμοποιητικά, αλλά και σε μη αιμοποιητικά κύτταρα, έχει πυρετογόνο δράση και αυξάνει τις πρωτεΐνες οξείας φάσης. Τα Β λεμφοκύτταρα υπό την επίδραση της αυξάνουν την 41

50 42 παραγωγή IgG και διαφοροποιούνται σε πλασματοκύτταρα. Η IL-6 μειώνει την έκφραση του TNF, της IL-1 και των χημειοκινών οι οποίες προσελκύουν ουδετερόφιλα. Στην ΡΑ τα επίπεδα της IL-6 στον ορό και στο αρθρικό υγρό είναι ανάλογα με τα επίπεδα των πρωτεϊνών οξείας φάσης 181. Η IL-17 έχει παρόμοια βιολογική δραστηριότητα με τον TNF και την IL-1. Επάγει τις προσταγλαδίνες, το οξείδιο του αζώτου, κυτταροκίνες και χημειοκίνες. Η IL-17 συμπράττει με την IL-1 αυξάνοντας την έκφραση διαφόρων μεσολαβητών της φλεγμονής οι οποίοι παράγονται από τους ινοβλάστες 156. Στις αρθρώσεις ασθενών με ΡΑ συμβάλλει στη φλεγμονή, στην αγγειογένεση και αυξάνει την έκφραση του RANKL, ο ο- ποίος οδηγεί στη διαφοροποίηση και ωρίμανση των οστεοκλαστών και στη δημιουργία διαβρώσεων 182,183. Η IL-2 είναι αυξητικός παράγοντας για τα Τ λεμφοκύτταρα από τα οποία και παράγεται. Στο ρευματοειδή υμένα, ενεργοποιεί τα κυτταροκτόνα κύτταρα ΝΚ και διαφοροποιεί τη λειτουργία των Β λεμφοκυττάρων, των μακροφάγων και των ινοβλαστών. Επιπλέον, η IL-2 έχει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των Τ ρυθμιστικών λεμφοκυττάρων, Treg 156. Παρόλα αυτά, ο τίτλος της IL-2 στο αρθρικό υγρό ασθενών με ΡΑ είναι πολύ μικρός, οπότε ο ρόλος της στην παθογένεια της νόσου μάλλον είναι περιορισμένος 184. H IL-10 είναι μια αντιφλεγμονώδης κυτταροκίνη, η οποία χαρακτηρίζει την Th2 κυτταρική απάντηση και παράγεται κυρίως από τα μακροφάγα. Στο αρθρικό υγρό ασθενών με ΡΑ η IL-10 είναι αυξημένη και τα επίπεδα της συσχετίζονται αρνητικά με την αρθρική καταστροφή 185, Ο αρθρικός υμένας στη ΡΑ Η άρθρωση και ειδικά ο αρθρικός υμένας είναι ο κύριος στόχος στη ΡΑ. Ο αρθρικός υμένας αποτελείται από μια καλυπτήρια στιβάδα, η οποία σχηματίζεται από ένα ή δύο στρώματα υμενοκυττάρων. Τα υμενοκύτταρα είναι δύο τύπων, ο ένας με χαρακτηριστικά μακροφάγων και ο άλλος ινοβλαστών. Οι αρχικές αλλοιώσεις, οι οποίες παρατηρούνται στον υμένα, αφορούν το μικροαγγειακό δίκτυο. Η απόφραξη του αυλού των αγγείων, το κυτταρικό οίδημα και η δημιουργία οπών μεταξύ των κυττάρων είναι οι πρώτες αλλοιώσεις οι οποίες παρατηρούνται. Ακολουθεί η υπεραιμία και η υπερπλασία της καλυπτήριας στιβάδας του υμένα. Στη συνέχεια σχηματίζονται κυτταρικές διηθήσεις από λεμφοκύτταρα και μακροφάγα, οι οποίες μπορεί να έχουν κατανομή τριτογενούς λεμφικού ιστού και αποτελούνται από CD4 Τ λεμφοκύτταρα, CD8 Τ λεμφοκύτταρα και Β λεμφοκύτταρα, μπορεί να έχουν χαρακτηριστικά δευτεροπαθών λεμφοζιδίων ή τέλος να δημιουργούν κοκκιώδεις σχηματισμούς. Επιπλέον, παρατηρείται νεοαγγειογένεση και ιστική ίνωση. Ο φλεγμαίνον αρθρικός υμένας επεκτείνεται στον αρθρικό χόνδρο και στο οστό σχηματίζοντας τον πάννο, ο οποίος εισβάλλει και καταστρέφει το χόνδρο στα όρια μεταξύ αρθρικού υμένα και οστού. Στα σημεία τα οποία εισβάλλει ο αρθρικός υμένας σχηματίζονται βοθρία με πολυπύρηνα κύτταρα, τα οποία έχουν την ίδια γονιδιακή έκφραση με τους οστεοκλάστες 156. Τα μακροφάγα (τύπου Α υμενοκύτταρα) στον αρθρικό υμένα είναι άφθονα, ενεργοποιημένα και εκφράζουν υψηλούς τίτλους MHC μορίων τάξεως ΙΙ, τα οποία είναι σημαντικά για την αντιγονοπαρουσίαση στα CD4 Τ λεμφοκύτταρα. Ο αριθμός των μακροφάγων στις βιοψίες αρθρικού υμένα συσχετίζεται με την αρθρική καταστροφή 187. Τα μα-

51 κροφάγα του αρθρικού υμένα δεν εκφράζουν όλα τα ίδια μόρια προσκόλλησης, ούτε εκκρίνουν τους ίδιους μεσολαβητές 187. Αυτά τα οποία βρίσκονται στο βασικό στρώμα, εκκρίνουν κυτταροκίνες όπως η IL-1, ο TNF αλλά και IL-6, IL-12, IL-15 και GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor), οι οποίες έχουν επίδραση στην ανοσιακή και φλεγμονώδη απάντηση. Εκκρίνουν επίσης αναστολείς όπως ο IL-1Ra (IL-1 receptor antagonist) και ο TGF-β (transforming growth factor) 176,177,180,188. Επιπλέον, συμμετέχουν στη σύνθεση λιπιδιακών διαμεσολαβητών φλεγμονής, στην καταστροφή του χόνδρου και του οστού και στην παρουσίαση του αντιγόνου στα Τ λεμφοκύτταρα. Ο TNF, η IL-1 και η IL-15 είναι μερικές από τις κυτταροκίνες, οι οποίες έχουν την ικανότητα να διεγείρουν τα μακροφάγα, ενώ κάποιες κυτταροκίνες όπως ο IL-1Ra τα καταστέλλουν 189. Τα υμενοκύτταρα τύπου Β, τα οποία έχουν χαρακτηριστικά ινοβλαστών, όπως και τα μακροφάγα, διαφέρουν μεταξύ τους στις στιβάδες του αρθρικού υμένα. Ο φυσιολογικός τους ρόλος είναι να παράγουν πρωτεογλυκάνες για το αρθρικό υγρό και το εξωκυττάριο στρώμα. Στην ΡΑ παράγουν ένζυμα τα οποία αποδομούν τον αρθρικό χόνδρο. Διεγείρονται από την IL-1, τον TNF, τους μικροβιακούς λιποπολυσαγχαρίτες και τις πεπτιδογλυκάνες και εκκρίνουν IL-6, IL-11, IL-16, οξείδιο του αζώτου και χημειοκίνες, οι οποίες δρουν στα αιμοποιητικά κύτταρα. Επιπλέον, διαφοροποιούνται σε δενδριτικά κύτταρα και έχουν την ικανότητα να παρουσιάζουν στα Τ λεμφοκύτταρα υπεραντιγόνα 190,191. Τα Β λεμφοκύτταρα παράγουν τα αυτοαντισώματα, τα οποία χαρακτηρίζουν τη ΡΑ όπως ο ρευματοειδής παράγοντας και αντισώματα κατά των κιτρουλινοποιημένων πρωτεϊνών. Η παθολογική σημασία των αντισωμάτων αυτών δεν έχει προσδιοριστεί πλήρως ακόμα 156. Τα Β λεμφοκύτταρα λειτουργούν ως αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα για τα CD4 Τ λεμφοκύτταρα και εκκρίνουν κυτταροκίνες. Η έγκριση του αντι-cd20 α- ντισώματος (rituximab) για τη θεραπεία της ΡΑ και τα θετικά αποτελέσματα στους οροθετικούς ασθενείς επιβεβαιώνει την σημασία των Β λεμφοκυττάρων τουλάχιστο σε ένα ποσοστό ασθενών και τη συμμετοχή τους στην παθογένεια της νόσου. Τα Β λεμφοκύτταρα στο περιφερικό αίμα ασθενών με ΡΑ είναι ενεργοποιημένα και αυτοαντιδραστικά και εκφράζουν γονίδια με ποικίλη δραστηριότητα. Έτσι, τα Β λεμφοκύτταρα στη ΡΑ διαφέρουν στην ικανότητα πολλαπλασιασμού, ενεργοποίησης και απόπτωσης, στην αυτοανοσία, στις νεύρο-ανοσιακές ρυθμίσεις, στη αγγειογένεση και στην έκκριση κυτταροκινών από τα φυσιολογικά Β λεμφοκύτταρα 192. Επιπλέον, τα Β λεμφοκύτταρα μπορεί να είναι μειωμένα στο περιφερικό αίμα ασθενών με ΡΑ, πιθανών λόγω της συγκέντρωσής τους στον αρθρικό υμένα των φλεγμαινουσών αρθρώσεων 193. Τα γονίδια αναστολής της απόπτωσης υπερεκφράζονται και έτσι τα αυτοαντιδραστικά Β λεμφοκύτταρα αποφεύγουν την αρνητική επιλογή. Αυτά τα γονίδια επηρεάζονται (modulated) από διάφορους παράγοντες όπως η IL-1, η IL-5, η IL-6 και η IL-10 οι οποίες στην ΡΑ είναι αυξημένες. Τα γονίδια που σχετίζονται με την αυτοανοσία όπως του TLR9 (Toll-like receptor 9), με τις νευροανοσιακές ρυθμίσεις όπως του χολινεργικού υποδοχέα νικοτινικού β-πολυπεπτιδίου 1 (cholinergic receptor, nicotinic, β-polypeptide 1, CHRNB1) και του ντοπαμινικού υποδοχέα 2D (dopamine receptor D2, DRD2), και με την αγγειογένεση όπως των προαγγειογενετικών παραγόντων VEGFC (Vascular endothelium growth factor C), FGF1 (Fibroblast growth factor 1) και F2RL2 (Coagulation factor II receptor-like 2) υπερεκφράζονται. Ο TLR9 εκφράζεται στα Β λεμφοκύτταρα και στα δενδριτικά κύτταρα και έχει ρόλο στην αναγνώριση του βακτηριακού DNA. Στην 43

52 ΡΑ ίσως να εμπλέκεται στην εγκατάσταση και διατήρηση της αυτοανοσίας και της φλεγμονής με μηχανισμό ο οποίος δεν σχετίζεται με τις λοιμώξεις 192. Επιπλέον, τα γονίδια των κυτταροκινών και των υποδοχέων τους είναι επηρεασμένα στα Β λεμφοκύτταρα στους ασθενείς με ΡΑ. Το γονίδιο του υποδοχέα της IL-5 υπερεκφράζεται στα Β λεμφοκύτταρα, ενώ τα επίπεδα της IL-5 είναι αυξημένα στον ορό. Μόνο τα Β λεμφοκύτταρα τα οποία είναι σε τελικό στάδιο διαφοροποίησης είναι επιρρεπή στην IL-5. Η αύξησή της στον όρο υποδεικνύει τον πιθανό ρόλο της στην απορύθμιση των Β λεμφοκυττάρων. Ο υποδοχέας της IL-17Ε βρέθηκε αυξημένος στα Β λεμφοκύτταρα όπως και τα επίπεδα της IL-17 στον ορό. Η IL-17 έχει σημαντικό ρόλο στην παθογένεια της ΡΑ. Τέλος, τα αντίγραφα των γονιδίων των IL-10 και IL-12Α υπερεκφράζονται στα Β λεμφοκύτταρα. Η IL-10 επηρεάζει τη βιωσιμότητα και τη διαφοροποίηση των Β λεμφοκυττάρων, βελτιώνει την έκφραση των μορίων του μείζωνος συστήματος ιστοσυμβατότητας τάξης ΙΙ (MHC II) και των ανοσοσφαιρινών και αναστέλλει την απόπτωσή τους. Η IL-12 αυξάνει τον αντιγονοεξαρτώμενο πολλαπλασιασμό των Τ λεμφοκυττάρων πιθανόν μέσω θετικής ανατροφοδότησης κατά την αλληλεπίδρασή τους με τα Β λεμφοκύτταρα 192. Το κυρίαρχο λεμφοκύτταρο στην άρθρωση είναι το Τ λεμφοκύτταρο. Τα CD4 θετικά είναι περισσότερα από τα CD8 θετικά Τ λεμφοκύτταρα και αυτό συνδέεται με τη γενετική προδιάθεση στη νόσο μέσω των HLA DR αλληλίων. Τα ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα προσελκύονται στην άρθρωση ανεξάρτητα από την ειδικότητα τους στο αντιγόνο που τα ενεργοποίησε αρχικά. Τα CD4 T λεμφοκύτταρα είναι κυρίως κύτταρα μνήμης, τα οποία φέρουν τον τύπο CD45RO και παρόλο τον φαινότυπο τους είναι ανθεκτικά στην απόπτωση. Τείνουν σε Th1 κυτταρικό τύπο και στην άρθρωση υπάρχει αυξημένη παρουσία INF-γ, IL-1, TNFa, IL-17, IL-6 και LT-a (lymphotoxin-a) 156. Αυτό δεν είναι απόλυτο γιατί άλλες κυτταροκίνες οι οποίες παράγονται από κύτταρα τύπου Th1 όπως η IL-2 δεν ανευρίσκονται στην άρθρωση ενώ η IL-10 μια τυπική κυτταροκίνη κυττάρων τύπου Th2 ανευρίσκεται 194. Οι Th1 κυτταροκίνες, οι οποίες προαναφέρθηκαν ανιχνεύονται και στο περιφερικό αίμα. Φαίνεται ότι η υπεροχή των Th1 κυτταροκινών οδηγεί σε φλεγμονή, ενώ οι Th2 κυτταροκίνες δρουν προστατευτικά. Η ανισορροπία μεταξύ Th1/Th2 στο περιφερικό αίμα και η παρεμπόδιση της διαφοροποίησης των Τ λεμφοκυττάρων σε Th2 κύτταρα πιθανών να σχετίζεται με την παθογένεια της νόσου 195. Οι κυτταροκίνες, οι οποίες παράγονται από τα Τ λεμφοκύτταρα έχουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεια της ΡΑ. Υπάρχουν όμως και κυτταροκίνες οι οποίες έχουν προστατευτικό ρόλο. Τα CD8 Τ λεμφοκύτταρα στις αρθρώσεις των ασθενών με ΡΑ παράγουν την IL-16, η οποία μειώνει τη σύνθεση των προάγουσων τη φλεγμονή κυτταροκινών όπως της INF-γ, της IL-1β και του TNF 196. Η IL-4, η οποία παράγεται από τα κύτταρα φυσικούς φονείς (ΝΚ) έχει σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση των Τ λεμφοκυττάρων σε Th2 κύτταρα. Τα ΝΚ κύτταρα σε ασθενείς με ΡΑ είναι μειωμένα στο περιφερικό αίμα, σύμφωνα με μελέτες, οπότε ίσως τα ΝΚ σχετίζονται με την ανισορροπία μεταξύ Th1 και Th2 απάντησης, η οποία παρατηρείται στη ΡΑ 197. Η αλληλεπίδραση των Τ λεμφοκυττάρων με τα μονοκύτταρα εξαρτάται από τον τρόπο ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων. Αν τα Τ λεμφοκύτταρα έχουν ενεργοποιηθεί από κυτταροκίνες, τότε η αλληλεπίδραση οδηγεί στην παραγωγή TNF, ενώ αν έχουν ε- νεργοποιηθεί μέσω του υποδοχέα TCR τότε εκκρίνονται TNF και IL-10 από τα μονοκύτ- 44

53 45 ταρα/μακροφάγα 198. Η ενεργοποίηση μέσω κυτταροκινών φαίνεται να υπερισχύει σε ε- γκατεστημένη νόσο 199. Μια άλλη προάγουσα τη φλεγμονή κυτταροκίνη, η IL-15, η οποία είναι αυξημένη στο αρθρικό υγρό αλλά και στον ορό ασθενών με ΡΑ είναι σημαντική για την ωρίμανση και την αντιγονοπαρουσίαση των δενδριτικών κυττάρων, επάγει την παραγωγή TNF-α, IL-1β και φλεγμονωδών χημειοκινών και συμβάλει στην επιβίωση των Τ λεμφοκυττάρων μνήμης. Επιπλέον, φαίνεται ότι η IL-15 διεγείρει τα μονοκύτταρα τα οποία με τη σειρά τους ενεργοποιούν τα αυτοαντιδραστικά CD4 Τ λεμφοκύτταρα τα οποία πολλαπλασιάζονται 200. Τα Treg λεμφοκύτταρα (ρυθμιστικά Τ λεμφοκύτταρα) είναι CD4 Τ λεμφοκύτταρα με σημαντικό ρόλο στην περιφερική ανοσιακή ανοχή. Ρυθμίζουν την λειτουργία των αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό των Τ λεμφοκυττάρων και την παραγωγή κυτταροκινών από αυτά και την έκκριση αντισωμάτων από τα Β λεμφοκύτταρα. Επίσης, διατηρούν υπό έλεγχο τα αυτοαντιδραστικά Τ λεμφοκύτταρα και προστατεύουν τον ξενιστή κατά την κάθαρση των παθογόνων ώστε να μη χάσει την ανοχή του στα ιδία αντιγόνα. Ο φυσιολογικός ρόλος αυτών των κυττάρων είναι να καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των Τ λεμφοκυττάρων και την παραγωγή από αυτά TNF και IFN-γ 156. Η παραγωγή της IL-17 δεν επηρεάζεται από τα Treg κύτταρα 201. Φαίνεται όμως ότι ένας υποπληθυσμός Treg τα οποία εκφράζουν το CD39 (εκτονουκλεοτιδάση η οποία υδρολύει το ΑΤΡ) μόριο στην επιφάνεια τους έχει την ικανότητα να καταστέλλει τις T H 17 κυτταρικές απαντήσεις 202. Στη ΡΑ τα Treg κύτταρα είναι ανίκανα να ρυθμίσουν την παραγωγή αυτών των κυτταροκινών και να καταστείλουν την έκφραση της IL Στην άρθρωση τα κύτταρα αυτά είναι αυξημένα, ενώ στο περιφερικό αίμα δεν επηρεάζεται ο αριθμός τους 204. Τα ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα στον αρθρικό υμένα φαίνεται να είναι ανθεκτικά στα Treg κύτταρα 204, ενώ στο περιφερικό αίμα ασθενών τα Τreg είναι ελαττωματικά 203. Αυτή διαταραχή συνδέεται με την ελαττωματική έκφραση και λειτουργία του CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte antigen 4), το οποίο είναι συνδιεγερτικό μόριο και στα Treg λεμφοκύτταρα έχει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της ομοιόστασης και της λειτουργίας τους όπως φαίνεται από πειράματα σε ζωικά μοντέλα 205,206. Τα ουδετερόφιλα βρίσκονται σε αφθονία στο αρθρικό υγρό αλλά είναι αραιά στον αρθρικό υμένα. Στα αρχικά στάδια της νόσου όμως, κατά την οξεία φλεγμονή, μπορεί να είναι τα κυρίαρχα κύτταρα στον υμένα 207. Τα ουδετερόφιλα μπορούν να εκφράσουν IL-1 και IL-8, οι οποίες με τη σειρά τους προκαλούν την αποπυρήνωση και τη φαγοκυττάρωση από τα ουδετερόφιλα Αποδόμηση αρθρικού χόνδρου Ο καταρράκτης, ο οποίος περιλαμβάνει την ενεργοποίηση των κυττάρων και την παραγωγή κυτταροκινών και χημειοκινών, καταλήγει στην παραγωγή πρωτεϊνασών, οι οποίες αποδομούν τον αρθρικό χόνδρο. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες (ΜΜΡ) αποτελούν μια οικογένεια ενζύμων με ένα ιόν ψευδαργύρου στην καταλυτική τους περιοχή και έχουν την ικανότητα να αποδομούν το εξωκυττάριο στρώμα του χόνδρου. Η οικογένεια των μεταλλοπρωτεϊνασών περιλαμβάνει ένζυμα όπως τις κολλαγενάσες, τις στρομελυσίνες, τις ζελατινάσες και τις ADAMTs (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs).

54 46 Οι κολλαγενάσες (ΜΜΡ-1, ΜΜΡ-8, ΜΜΡ-13) έχουν ως υπόστρωμα το κολλαγόνο τύπου Ι και ΙΙ. Η κολλαγενάση-1 (ΜΜΡ-1) πιθανόν να επηρεάζεται σε γονιδιακό επίπεδο από την IL-1 και τον TNF και ανιχνεύονται αυξημένα τα επίπεδα της, στις αρθρώσεις ασθενών με ΡΑ. Οι άλλες κολλαγενάσες επίσης εμπλέκονται στην καταστροφή της άρθρωσης στη ΡΑ 209. Οι στρομελυσίνες (ΜΜΡ-3, ΜΜΡ-10, ΜΜΡ-11) αποδομούν μη κολλαγονικά στοιχεία όπως είναι οι πρωτεογλυκάνες, η ινοδονεκτίνη και η λαμινίνη, αλλά και μικρά κολλαγόνα. Η ΜΜΡ-3 επιπλέον, έχει την ικανότητα να αποκόπτει τμήματα από τα προκολλαγόνα και να τα ενεργοποιεί. Βρίσκεται σε αυξημένα επίπεδα στις αρθρώσεις ασθενών με ΡΑ 156. Οι ζελατινάσες ( ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9) τέλος αποδομούν το κολλαγόνο επίσης. Οι ADAMTS είναι πρωτεϊνάσες με ποικίλες ιδιότητες. Η αγγρεκανάση 1 και 2 ανήκουν σε αυτή την οικογένεια και έχουν την ικανότητα να αποδομούν την αγγρεκάνη. Εκτός από τις επιδράσεις τους στον εξωκυττάριο διάμεσο ιστό οι ΜΜΡ και ειδικά οι ΜΜΡ-2 και 3 έχουν αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες με επίδραση στις χημειοκίνες 210. Οι πρωτεάσες κυστεΐνης, καθεψίνες B,L και K, έχουν ως υπόστρωμα το κολλαγόνο, τις πρωτεογλυκάνες, τις ινωδονεκτίνες, το ινωδογόνο, την ελαστίνη και την λαμινίνη, τα οποία είναι συστατικά του χόνδρου. Στην αποδόμηση του χόνδρου συμμετέχουν και πρωτεάσες σερίνης. Κάποιες από τις πρωτεϊνάσες, όπως οι ΜΜΡ και οι καθεψίνη Κ παράγονται από τους οστεοκλάστες. Οι οστεοκλάστες είναι κύτταρα με προέλευση ίδια με τα μακροφάγα και είναι υπεύθυνοι για τη απομάκρυνση των μετάλλων από το οστό συμμετέχοντας με τους οστεοβλάστες στη συνεχή ανανέωση του οστού. Ο RANKL (receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand) είναι μια κυτταροκίνη απαραίτητη για την ωρίμανση των οστεοκλαστών συνδεόμενη με το RANK (receptor activator of nuclear factor-kappa B) στην επιφάνεια των οστεοκλαστών. Εκφράζεται από τους ινοβλάστες και από τα Τ λεμφοκύτταρα μέσα στην άρθρωση 211. Η οστεοπροτεγερίνη, OPG, είναι αναστολέας της σύνδεσης των δυο μορίων και κατά συνέπεια της ωρίμανσης των οστεοκλαστών. Ο TNF και η IL-1 δρουν κατευθείαν στους οστεοκλάστες ως πιθανός παράγοντας διαφοροποίησης ο πρώτος και εμποδίζοντας την απόπτωση η δεύτερη 212,213. Οι οστεοκλάστες έχουν σαφή ρόλο στη δημιουργία διαβρώσεων στη ΡΑ. Η παρουσία πολυπύρηνων κυττάρων με χαρακτηριστικά οστεοκλαστών στα βοθρία τα οποία σχηματίζονται στις αρθρικές επιφάνειες στη ΡΑ αλλά και η παρουσία οστεοκλαστών στις διαβρώσεις σε πειραματικά μοντέλα το αποδεικνύει Συμπέρασμα Η παθογένεια της ΡΑ βασίζεται στην παρουσία κυτταροκινών οι οποίες προάγουν τη φλεγμονή όπως η IL-1 και ο TNF, και συνεχώς ενεργοποιημένων κυττάρων στον υμένα συμπεριλαμβανομένων των Τ λεμφοκυττάρων, των μακροφάγων, των ινοβλαστών και άλλων κυττάρων. Η θετική ανατροφοδότηση μεταξύ κυττάρων, κυτταροκινών και χημειοκινών πιθανόν οδηγεί στη διατήρηση της φλεγμονής. Τα Τ λεμφοκύτταρα έχουν σημαντικό ρόλο στην παθοφυσιολογία της ΡΑ, αφού αλληλεπιδρούν άμεσα ή μέσω κυτταροκινών με τα υπόλοιπα κύτταρα, παράγουν τα ίδια κυτταροκίνες προάγουσες τη φλεγμονή και είναι ανθεκτικά στον έλεγχο ο οποίος τους ασκείται από τα ρυθμιστικά κύτταρα αλλά και στην απόπτωση. Οι κυτταροκίνες, οι οποίες προάγουν τη φλεγμονή στην άρθρωση ενεργοποιούν τα υμενοκύτταρα τα οποία παράγουν πρωτεολυτικά ένζυμα, τα οποία κα-

55 47 ταστρέφουν το αρθρικό χόνδρο και τους περιβάλλοντες ιστούς. Επομένως, οι κυτταροκίνες όπως και τα Τ λεμφοκύτταρα έχουν πρωταγωνιστικό ρόλο στην παθογένεια της ΡΑ αλλά γεννάται το ερώτημα κατά πόσο κατευθύνουν αυτές τη φλεγμονώδη διαδικασία ή είναι το αποτέλεσμα της Θεραπεία Η θεραπεία στη ΡΑ πρέπει να ξεκινά άμεσα μετά τη διάγνωση για την πρόληψη της καταστροφής των αρθρώσεων. Τα DMARDs (disease modifying antirheumatic drugs) είναι η πρώτη επιλογή του ρευματολόγου. Σε αυτά ανήκουν η μεθοτρεξάτη, η κυκλοσπορίνη, η σουλφασαλαζίνη, η λεφλουνομίδη, o χρυσός και η υδροξυχλωροκίνη. Η μεθοτρεξάτη είναι το φάρμακο εκλογής συνήθως. Πρόκειται για ένα αναστολέα του μεταβολισμού του φολικού οξέως ο οποίος παρεμβαίνει στην παραγωγή πουρινών και πυριμιδινών. Έχει αντιμεταβολικές ιδιότητες, προκαλεί την απόπτωση των κυττάρων, μειώνει την ενεργοποίηση, την παραγωγή ανοσοσφαιρινών και την έκφραση μορίων προσκόλλησης, αναστέλλει την κυκλο-οξειγενάση και τη λιπο-οξειγενάση και αυξάνει την εξωκυττάρια αδενοσίνη η οποία οδηγεί σε υπορύθμιση των παραγόντων της φλεγμονής. Χορηγείται πάντα με φολικό οξύ για πρόληψη της τοξικότητας 214. Η λεφλουνομίδη είναι αναστολέας της διυδροοροτικής αφυδρογονάσης και παρεμβαίνει στην παραγωγή πυριμιδινών μειώνοντας των πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Το φάρμακο αυτό σύμφωνα με μελέτες, έχει την ίδια αποτελεσματικότητα με τη μεθοτρεξάτη 215. Η σουλφασαλαζίνη είναι ένα σύμπλοκο σουλφαπυριδίνης και 5-αμινοσαλικικού οξέως. Μειώνει τη συγκέντρωση των ουδετεροφίλων στην άρθρωση, αλλάζει τη λειτουργία των φυσικών κυτταροκτόνων, αναστέλλει την IL-2, τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών και των ενδοθηλιακών κυττάρων, μειώνει την IL-1, την IL-6 και τον TNF και όπως η ΜΤΧ αυξάνει την εξωκυττάρια αδενοσίνη. Η αποτελεσματικότητα της στη θεραπεία της ΡΑ διαπιστώθηκε από τη δεκαετία του 1940 και για πολλά χρόνια ήταν το φάρμακο πρώτης γραμμής μέχρι που εκτοπίστηκε από τη μεθοτρεξάτη 156. Η κυκλοσπορίνη είναι ένας αναστολέας της καλσινευρίνης. Αναστέλλει την παραγωγή της IL-2, του IL-1R, της IFN-γ και την παραγωγή αντισωμάτων για αντιγόνα εξαρτώμενα από τα Τ λεμφοκύτταρα. Επιπλέον επηρεάζει την απαντητικότητα των Τ λεμφοκυττάρων, τις αλληλεπιδράσεις Τ λεμφοκυττάρων και μακροφάγων και τη δραστηριότητα των φυσικών φονέων. Η κυκλοσπορίνη είναι αποτελεσματική στη θεραπεία της ΡΑ, αλλά όχι όσο η μεθοτρεξάτη. Ο συνδυασμός των δύο φαρμάκων μετά από αποτυχία της μονοθεραπείας με μεθοτρεξάτη έχει καλά αποτελέσματα στον έλεγχο της ενεργότητας της νόσου 216. Η υδροξυχλωροκίνη είναι ένα ανθελονοσιακό φάρμακο με κατασταλτική επίδραση στο ανοσιακό σύστημα. Σταθεροποιεί τη μεμβράνη των λυσοσωματίων, αναστέλλει το μεταβολισμό των δεοξυριβονουκλεοτιδίων και την απελευθέρωση της IL-1β και μειώνει την απελευθέρωση του TNF. Το φάρμακο έχει ήπια ανοσοτροποποιητική δράση και χρησιμοποιείται στην ήπια μορφή της νόσου ή σε συνδυασμό με άλλα ανοσοτροποποιητικά φάρμακα. Τα άλατα χρυσού αν και παλαιότερα ήταν βασικό φάρμακο για τη ΡΑ έχουν παραμεριστεί λόγω των παρενεργειών, της τοξικότητας και της αναποτελεσματικότητας η οποία αφορούσε την από του στόματος χορήγηση. Προκαλούν την απόπτωση των ουδε-

56 τεροφίλων και αναστέλλουν την ενεργοποίηση του NF-Κβ, τα Β λεμφοκυττάρων, τους οστεοκλάστες, την κασπάση 1 και τον TNF ενώ αυξάνουν την παραγωγή IL1Ra. Τα φάρμακα από αναφέρθηκαν πιο πάνω δεν έχουν άμεση ανοσοκατασταλτική επίδραση. Χρειάζονται από 1 ½ μέχρι και 3 μήνες για να φτάσουν σε θεραπευτικά επίπεδα. Η κορτιζόνη αντίθετα, δρα αμέσως και συγχορηγείται με τα DMARDs. Έχει αντιφλεγμονώδεις αλλά και ανοσοκατασταλτικές ιδιότητες. Οι συστάσεις είναι να χορηγείται για όσο το δυνατό συντομότερο χρονικό διάστημα ή αν δεν μπορεί να διακοπεί σε όσο το δυνατό μικρότερη δόση λόγω των παρενεργειών της 156. Τη τελευταία δεκαετία εισήχθηκαν στη θεραπεία της ΡΑ οι βιολογικοί παράγοντες. Πρόκειται για ενέσιμα σκευάσματα τα οποία στοχεύουν κυτταροκίνες και μόρια τα οποία εκφράζονται στην επιφάνεια των κυττάρων. Οι πρώτοι που χρησιμοποιήθηκαν στη θεραπεία της ΡΑ είναι οι αντι-tnf παράγοντες οι οποίοι είναι μονοκλωνικά αντισώματα τα οποία συνδέονται με τον διαλυτό και τον διαμεμβρανικό TNF ( infliximab, adalimumab και etarnacept). Χρησιμοποιούνται μετά από αποτυχία στα DMARDs και έχουν εξαιρετικά αποτελέσματα στη φλεγμονή, στον έλεγχο της ενεργότητας της νόσου και στη αναστολή της ακτινολογικής εξέλιξης της ΡΑ 217,218,219. Η αποτελεσματικότητα των πρώτων βιολογικών παραγόντων οδήγησε στην παραγωγή και άλλων μονοκλωνικών αντι- TNF αντισωμάτων όπως είναι το certolizumab pegol και το golimumab. Το ανάλογο του ανταγωνιστή του υποδοχέα της IL-1 (IL-1Ra) anakinra χρησιμοποιείται στη θεραπεία της μέτριας προς σοβαρής ΡΑ. Έχει πολύ καλά αποτελέσματα στην συστηματική νεανική ιδιοπαθή αρθρίτιδα και στη νόσο του Still των ενηλίκων. Το Canakinumab είναι αντίσωμα κατά της IL-1b το οποίο προς το παρόν έχει πάρει ένδειξη μόνο τα σύνδρομα περιοδικού πυρετού που σχετίζονται με τις κρυοπυρίνες (CAPS cryopyrine associated periotic syndromes). Το Tocilizumab είναι αντίσωμα κατά του υποδοχέα α της IL-6 (IL-6Ra) και έχει πάρει ένδειξη για τη θεραπεία της ΡΑ. Το CTLA-4 βρίσκεται στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων και συνδέεται με τα μόρια CD80 (B7-1) και CD86 (B7-2), τα οποία βρίσκονται στα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα προκαλώντας καταστολή της ενεργοποίησης του Τ λεμφοκυττάρου. Αν τα CD80 (B7-1) και CD86 (B7-2) συνδεθούν με το CD28 στα Τ λεμφοκύτταρα τότε αυτά ενεργοποιούνται αφού αυτά είναι συνδιεγερτικά μόρια. Το αντίσωμα CTLA-4, Abatacept, συνδέεται όπως και το φυσικό CTLA-4 με το CD80 και 86 εμποδίζοντας την ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων. Το φάρμακο έχει ένδειξη για τη θεραπεία της ΡΑ. Η καταστολή των Β λεμφοκυττάρων με την χρήση του αντι-cd20 αντισώματος έχει πάρει επίσης ένδειξη για τη θεραπεία της ΡΑ. Το Rituximab εξαλείφει από την κυκλοφορία τα Β λεμφοκύτταρα τα οποόα φέρουν το CD20. Δεν επηρεάζονται τα αρχέγονα κύτταρα του μυελού, τα προ προ-β λεμφοκύτταρα και τα πλασματοκύτταρα. Το φάρμακο ανήκει στους αντινεοπλασματικούς παράγοντες και χρησιμοποιείται στη θεραπεία των μη Hodgkin λεμφωμάτων Β κυτταρικής σειράς. 48

57 Συστηματικός Ερυθηματώδης Λύκος (ΣΕΛ) Εισαγωγή Το όνομα λύκος χρησιμοποιήθηκε πρώτη φόρα το Μεσαίωνα για να περιγραφούν δερματικές βλάβες οι οποίες έμοιαζαν με δάγκωμα λύκου 220. Αν και υπάρχουν αναφορές για τις εκδηλώσεις του συστηματικού ερυθηματώδους λύκου από τον δέκατο αιώνα μχ, η πρώτη περιγραφή περιστατικού με το νόσημα έγινε το 1833 στη Γαλλία 221. Ο ΣΕΛ προσβάλλει γυναίκες αναπαραγωγικής κυρίως ηλικίας 12 φορές συχνότερα από ότι τους άντρες 156. Η επίπτωση του νοσήματος είναι 1,6-7,6/ στις Η- ΠΑ 156,222 και 2,15-4,18/ στην Ευρώπη 156,223. Είναι ένα νόσημα το οποίο παλαιότερα είχε κακή πρόγνωση με υψηλή θνητότητα. Τα τελευταία χρόνια όμως, με την καλύτερη θεραπευτική προσέγγιση του νοσήματος, η 5-ετής επιβίωση έχει βελτιωθεί σε 82-95% σε σχέση με 50% που ήταν τη δεκαετία του Ο Συστηματικός Ερυθηματώδης Λύκος είναι ένα αυτοάνοσο συστηματικό νόσημα με μεγάλο φάσμα κλινικών εκδηλώσεων. Χαρακτηρίζεται από την παρουσία αντισωμάτων έναντι των συστατικών του πυρήνα των κυττάρων. Η αιτιολογία του νοσήματος είναι άγνωστη, αφού δεν έχει βρεθεί ακόμα κάποιος αιτιολογικός παράγοντας ο οποίος να προκαλεί τη νόσο. Από τη μέχρι τώρα έρευνα φαίνεται ότι η επίδραση εξωγενών παραγόντων σε άτομα με γενετική προδιάθεση οδηγεί στην εκδήλωση του ΣΕΛ. Η διαφορετική συχνότητα εμφάνισης της νόσου μεταξύ των διάφορων φυλών αλλά και μεταξύ των δύο φύλων επιβεβαιώνει το γενετικό υπόβαθρο του νοσήματος. Οι Αφρο- Αμερικανοί παρουσιάζουν αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης λύκου σε σχέση με άλλα έθνη και οι γυναίκες αυξημένο κίνδυνο σε σχέση με τους άντρες. Το γενετικό υπόβαθρο της νόσου επιβεβαιώνει επίσης η συσσώρευση ασθενών σε μια οικογένεια 156. Η γενετική έλλειψη κλασμάτων του συμπληρώματος της κλασσικής οδού είναι προδιαθεσικός παράγοντας για την εμφάνιση του νοσήματος 225. Επιπλέον κάποια γονίδια, όπως το PDCD1 (programmed cell death 1 gene) 226, το PTPN22 (protein tyrosine phosphatase non-receptor type 22 gene) 227, το TYK2 (tyrosine kinase 2 gene) και το IRF5 (IFN regulatory factor 5 gene) 228 έχουν συσχετιστεί σε κάποιους πληθυσμούς με το λύκο. Επιπλέον το HLA DR3 και το HLA DR2 έχουν συσχετιστεί με το λύκο σε κάποιες μελέτες 229 όπως και το γονίδιο TNFB* Στους ασθενείς με ΣΕΛ έχει παρατηρηθεί μειωμένη λειτουργικότητα του υποδοχέα των Fc των ανοσοσφαιρινών 231. Οι εξωγενείς παράγοντες πυροδοτούν την εκδήλωση της νόσου σε άτομα με γενετική προδιάθεση. Η υπεριώδης ακτινοβολία προκαλεί απόπτωση των κυττάρων, ενώ τα φάρμακα τα οποία προκαλούν διμεθυλίωση του DNA επηρεάζουν το γονιδίωμα. Κάποιοι ιοί τέλος, όπως ο κυτταρομεγαλοϊός και ο ιός Epstein Barr, έχουν συσχετιστεί με το λύκο, λόγω των ομοιοτήτων στην κλινική εικόνα και στις ανοσολογικές διαταραχές Διαγνωστικά κριτήρια Για τη διάγνωση του ΣΕΛ έχουν θεσπιστεί έντεκα κριτήρια και για να τεθεί η διάγνωση είναι απαραίτητη η παρουσία τεσσάρων ή περισσότερων κριτηρίων. Τα αναθεωρημένα κριτήρια του Αμερικανικού Κολλεγίου Ρευματολογίας του 1997 είναι 232 :

58 50 1. Εξάνθημα παρειών (ερύθημα επίπεδο ή επηρμένο στα ζυγωματικά τόξα με τάση να μην προσβάλλει τις ρινοχειλικές πτυχές) 2. Δισκοειδές εξάνθημα (επηρμένες ερυθηματώδεις πλάκες με κερατωσική απολέπιση, ατροφική ουλοποίηση) 3. Φωτοευαισθησία (δερματικό εξάνθημα στην έκθεση στην ηλιακή ακτινοβολία) 4. Στοματικά έλκη (ανώδυνες συνήθως εξελκώσεις στόματος ή ρινοφάρυγγα) 5. Αρθρίτιδα (μη διαβρωτική αρθρίτιδα δύο ή περισσότερων αρθρώσεων) 6. Ορογονίτιδα (πλευρίτιδα ή περικαρδίτιδα) 7. Νεφρική νόσος (λευκωματουρία μεγαλύτερη από 500mg/24h ή κύλινδροι από κυτταρικά στοιχεία στα ούρα) 8. Νευρολογική νόσος (επιληπτοειδείς σπασμοί ή ψυχωσικές εκδηλώσεις) 9. Αιματολογική νόσος (αιμολυτική αναιμία ή λευκοπενία ή λεμφοπενία ή θρομβοκυτταροπένια) 10. Ανοσολογική διαταραχή (αντι-dsdna ή αντι-sm ή αντιφωσφολιπιδικά αντισώματα) 11. Αντιπυρηνικά αντισώματα (ΑΝΑ) Τα γενικά συμπτώματα του νοσήματος, κόπωση, πυρετός, απώλεια βάρους και αδιαθεσία, δεν περιλαμβάνονται στα κριτήρια αν και η εμφάνιση τους είναι πολύ συχνή. Στα κριτήρια επίσης δεν περιλαμβάνονται η λεμφαδενοπάθεια, η αγγειίτιδα δέρματος και μεσεντερίου, η μυοσίτιδα, η οφθαλμική προσβολή και η πνευμονίτιδα αν και αποτελούν εκδηλώσεις του νοσήματος Κλινική εικόνα Ο ΣΕΛ είναι δυνατόν να προσβάλει σχεδόν όλα τα όργανα του ανθρώπινου σώματος όπως το δέρμα και τους βλεννογόνους, τους νεφρούς, τον πνεύμονα, την καρδιά, το κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα, τις αρθρώσεις, τους ορογόνους υμένες και το γαστρεντερικό σωλήνα. Η νοσηρότητα και η θνητότητα επηρεάζονται ανάλογα με τα προσβεβλημένα όργανα και τα εργαστηριακά ευρήματα. Τα γενικά συμπτώματα του ΣΕΛ, στα οποία περιλαμβάνονται ο πυρετός, η αδιαθεσία, η κόπωση και η απώλεια βάρους, είναι μη ειδικά και μπορεί να οφείλονται σε διάφορα άλλα αίτια. Οι δερματικές αλλοιώσεις διακρίνονται σε ειδικές και μη ειδικές 233. Οι οξείες, οι υποξείες και ο χρόνιες δερματικές αλλοιώσεις ανήκουν στις ειδικές. Το εξάνθημα δίκην πεταλούδας είναι χαρακτηριστικό στον οξύ λύκο και διαρκεί από μέρες μέχρι εβδομάδες. Συνήθως εμφανίζεται μετά από έκθεση στον ήλιο. Οι ερυθηματώδεις βλατίδες ή πλάκες με λέπια, οι οποίες δεν αφήνουν ουλές χαρακτηρίζουν τον υποξύ δερματικό λύκο και εμφανίζονται σε περιοχές του σώματος οι οποίες εκτίθενται στον ήλιο αλλά μπορεί να γενικευτούν. Τέλος οι ερυθηματώδεις βλατίδες ή πλάκες με απολέπιση οι οποίες λεπτύνονται και αφήνουν ουλές και αποχρωματισμό παρατηρούνται στον χρόνιο λύκο. Οι βλάβες στο δέρμα στο χρόνιο λύκο σε απουσία συστηματικών εκδηλώσεων είναι γνωστές ως δισκοειδές λύκος 156. Στις μη ειδικές δερματικές αλλοιώσεις ανήκουν η υποδερματίτιδα, η αλωπεκία και η ουρτικάρια, η ψηλαφητή πορφύρα, τα έλκη στα άκρα, τα υποδόρια οζίδια και δικτυωτή πελίωση, οι οποίες ουσιαστικά είναι βλάβες δερματικής αγγειίτιδας 156.

59 Στο βλεννογόνο του στόματος και του κόλπου παρατηρούνται έλκη, τα οποία συνήθως είναι ανώδυνα, ενώ στο ρινικό διάφραγμα διαβρώσεις. Οι κύριες εκδηλώσεις της νόσου στο μυοσκελετικό είναι οι αρθραλγίες και η μη καταστροφική αρθρίτιδα 234. Η αρθρίτιδα Jaccoud είναι μη διαβρωτική, παραμορφωτική αρθρίτιδα των μικρών αρθρώσεων και είναι χαρακτηριστική εκδήλωση της νόσου. Η παραμόρφωση οφείλεται σε υπερξαρθρήματα τα οποία είναι ανατάξιμα. Παρατηρείται επίσης τενοντοελυτρίτιδα, ρήξη τενόντων 235, οστεονέκρωση, σηπτική αρθρίτιδα, μυαλγία, μυοσίτιδα και ινομυαλγία. Οι εκδηλώσεις από τους νεφρούς είναι σοβαρές και μπορεί να οδηγήσουν σε νεφρική ανεπάρκεια. Οι κλινικές εκδηλώσεις γίνονται εμφανείς όταν ο πλέον ασθενής έχει νεφρωτικό σύνδρομο ή νεφρική ανεπάρκεια. Οι ασθενείς παρουσιάζουν αρχικά ασυμπτωματική πρωτεϊνουρία> 0,5gr/24h, κυλίνδρους (ερυθρών αιμοσφαιρίων, αίμης) στα ούρα, αιματουρία > 5 ερυθρά ή/και πυουρία > 5 λευκά ανά οπτικό πεδίο, ενώ στο αίμα αυξάνεται η κρεατινίνη 236. Λεπτομέρειες για τη βαρύτητα της νεφρικής προσβολής δίνει η βιοψία του νεφρού. Ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας κατατάσσει τη σπειραματονεφρίτιδα του λύκου σε έξη κατηγορίες ανάλογα με τα ευρήματα της βιοψίας και του ανοσοφθορισμού: φυσιολογικά σπειράματα, μεσαγγειακή, εστιακή υπερπλαστική, διάχυτη υπερπλαστική και μεμβρανώδη σπειραματονεφρίτιδα και σπειραματοσκλήρυνση 237. Η πιο σοβαρή μορφή, η οποία οδηγεί σε νεφρική ανεπάρκεια, είναι η υπερπλαστική σπειραματονεφρίτιδα. Από το ΚΝΣ μπορεί να υπάρχουν νευρολογικές ή/και ψυχιατρικές εκδηλώσεις. Οι κύριες νευρολογικές εκδηλώσεις είναι οι κεφαλαλγίες 238, οι επιληπτικές κρίσεις, η χορεία, τα αιμορραγικά και ισχαιμικά εγκεφαλικά, η νευροπάθεια κρανιακών και περιφερικών νευρών, η πολλαπλή μόνο/πολυνευρίτιδα και η αμφιβληστροπάθεια, η οποία μάλλον είναι εκδήλωση αγγειίτιδας 239. Τα αγγειακά εγκεφαλικά επεισόδια μπορεί να σχετίζονται με αγγειίτιδα ή με αντιφωσφολιπιδικό σύνδρομο όπως και η χορεία 240. Το οργανικό ψυχοσύνδρομο με παραισθησίες, αισθηματική αστάθεια και διαταραχές συγκέντρωσης και μνήμης και οι γνωστικές διαταραχές είναι οι κύριες ψυχιατρικές εκδηλώσεις στο ΣΕΛ 156. Η ψύχωση και η κατάθλιψη είναι επίσης ψυχιατρικές εκδηλώσεις, οι οποίες μπορεί εν μέρει, να οφείλονται στην κορτιζόνη και στη χρονιότητα του νοσήματος. Οι εκδηλώσεις από τους ορογόνους υμένες είναι με σειρά συχνότητας η πλευρίτιδα, η περικαρδίτιδα και ο ασκίτης. Στον πνεύμονα οι εκδηλώσεις του λύκου είναι πολύ σοβαρές και επικίνδυνες για τη ζωή. Η οξεία πνευμονίτιδα πρέπει να διαφοροδιαγνώσκεται από πνευμονική λοίμωξη, ενώ η πνευμονική ίνωση πρέπει να ελέγχεται για στοιχεία ενεργότητας. Η πνευμονική αιμορραγία δεν παρουσιάζεται συχνά, έχει κακή πρόγνωση και οφείλεται σε αγγειίτιδα 241. Επιπλέον οι ασθενείς μπορεί να εμφανίσουν πνευμονική υπέρταση και σύνδρομο συρρικνωμένου πνεύμονα 242. Από την καρδιά οι ασθενείς παρουσιάζουν μυοκαρδίτιδα 243, ενδοκαρδίτιδα με τις εκβλαστήσεις Libman-Sacks, βαλβιδοπάθεια και στεφανιαία νόσο. Η στεφανιαία νόσος οφείλεται κυρίως στην γενικευμένη αρτηριοσκλήρωση και πολύ λιγότερο σε στεφανιαία αγγειίτιδα 244. Πολλοί ασθενείς αναφέρουν ναυτία και δυσπεψία σε ενεργό νόσο. Αυτό μπορεί να οφείλεται σε περιτοναϊκή φλεγμονή ή σε αγγειακή νόσο. Άλλες εκδηλώσεις από το γαστρεντερικό είναι η προσβολή του οισοφάγου, η αγγειίτιδα μεσεντερίου 245 η οποία είναι σοβαρή και απειλητική για τη ζωή εκδήλωση, η φλεγμονώδης νόσος του εντέρου

60 52 και η παγκρεατίτιδα. Επίσης, οι ασθενείς μπορεί να παρουσιάσουν ηπατομεγαλία, αύξηση ηπατικών ενζύμων και λιπώδη ηπατίτιδα. Οι αιματολογικές και ανοσολογικές διαταραχές αποτελούν συχνές εκδηλώσεις του λύκου. Οι ασθενείς παρουσιάζουν αναιμία, λευκοπενία, λεμφοπενία, θρομβοκυτταροπενία και μερικές φορές πανκυτταροπενία. Μπορεί επίσης να έχουν αντιπηκτικό του λύκου, παρατεταμένο χρόνο μερικής θρομβοπλαστίνης, αντισώματα κατά της καρδιολιπίνης, θετική Coomps και ψευδώς θετική την εξέταση VDRL για τη σύφιλη. Η ΤΚΕ μπορεί να είναι αυξημένη κατά την ενεργό φάση του νοσήματος όπως και η CRP. Οι τίτλοι του ολικού συμπληρώματος και των C3, C4 μπορεί να είναι χαμηλοί, ενώ τα ΑΝΑ (antinuclear antibodies) είναι θετικά στο 98% των ασθενών με παρουσία αντι-sm, αντι- Ro, αντι-la, αντι-ιστόνης και αντι-ριβοσωμιακών ΕΝΑ (extractable nuclear antibodies) αντισωμάτων και αντισωμάτων κατά της διπλής έλικας του DNA, αντι-dsdna Διάγνωση και παρακολούθηση του ΣΕΛ Η διάγνωση του συστηματικού ερυθηματώδη λύκου βασίζεται στα 11 κριτήρια τα οποία αναφέρθηκαν πιο πάνω. Για να τεθεί η διάγνωση ο ασθενής πρέπει να πληροί περισσότερα από 4 από τα 11 κριτήρια τα οποία αξιολογούν κλινικές και εργαστηριακές παραμέτρους του νοσήματος. Οι εκδηλώσεις του λύκου δεν είναι ανάγκη να εμφανιστούν ταυτόχρονα για να γίνει η διάγνωση. Κάποιοι ασθενείς μπορεί να μην πληρούν τα κριτήρια για πολλά χρόνια, παρόλα αυτά βρίσκονται υπό ιατρική παρακολούθηση και αν χρειάζεται σε φαρμακευτική αγωγή. Τα κριτήρια αυτά ουσιαστικά βοηθούν στο διαχωρισμό των ασθενών με λύκο από τους ασθενείς οι οποίοι έχουν άλλα νοσήματα του συνδετικού ιστού. Τα δύο τελευταία από τα 11 διαγνωστικά κριτήρια του ΣΕΛ αφορούν τα αντιπυρηνικά αντισώματα και τα αντισώματα κατά της διπλής έλικας του DNA (anti-dsdna) τα οποία είναι πολύ χρήσιμα στη διάγνωση της νόσου αφού τα ΑΝΑ είναι θετικά στο 98% των ασθενών. Τα ΕΝΑ περιλαμβάνουν όλα τα εκχυλίσιμα αντιπυρηνικά αντισώματα (ANA), μερικά από τα οποία είναι τα αντι-sm, τα αντι-ro και La, τα αντι-rib Ρ, τα αντι-scl70, τα αντι-urnp, τα αντι-λείων μυϊκών ινών κτλ. Στο ΣΕΛ είναι θετικά συνήθως τα αντι-sm, τα αντι-ro και τα αντι-la αντισώματα. Η ενεργότητα της νόσου καθορίζεται με βάση την κλινική εικόνα και τις εργαστηριακές εξετάσεις του ασθενή, συμπεριλαμβανομένης της βιοψίας νεφρού. Οι εργαστηριακές εξετάσεις περιλαμβάνουν την ΤΚΕ, τη CRP, το συμπλήρωμα (C3 και C4), τα αντί-dsdna, γενική αίματος, ουρία, κρεατινίνη, τρανσαμινάσες, γενική ούρων με μικροσκοπική εξέταση και ούρα 24ώρου για λεύκωμα. Η ΤΚΕ, αν και μπορεί να ανέβει στην ενεργό φάση του νοσήματος, δεν είναι απόλυτα αξιόπιστη για την παρακολούθηση του νοσήματος γιατί μπορεί να παραμείνει ψηλή παρά την ύφεση του νοσήματος. Η CRP, σε ένα μεγάλο ποσοστό ασθενών, δεν επηρεάζεται από την ενεργό νόσο αλλά επηρεάζεται πάντα από τις λοιμώξεις, οπότε είναι χρήσιμη σε συνδυασμό με την κλινική εικόνα για διαφοροδιαγνωστικούς σκοπούς 247,248. Οι τίτλοι του συμπληρώματος στην ενεργό νόσο μπορεί να μειωθούν όπως και οι κυτταρικές σειρές από τη γενική αίματος. Ο τίτλος των αντί-dsdna μπορεί να αυξηθεί και αυτό έχει συσχετιστεί με νεφρική προσβολή. Η γενική ούρων είναι πολύ σημαντική εξέταση στην παρακολούθηση του λύκου. Η πρωτεϊνουρία, η αιματουρία, η πυουρία και το ενεργό ίζημα βοηθούν στην έγκαιρη διάγνωση της νεφρικής προσβολής 156.

61 53 Λόγω της πολυοργανικής προσβολής της νόσου, η χρήση ερωτηματολογίων τα οποία καθορίζουν την ενεργότητα της νόσου είναι περιορισμένη 249. Παρόλα αυτά υπάρχουν δείκτες ενεργότητας της νόσου, οι οποίοι είναι αξιόπιστοι, όπως ο SLEDAI (systemic lupus erythematosus disease activity index), ο BILAG (British Isles Lupus Assessment Group) και ο SLEAM (Systemic Lupus Erythematosus Activity Measure). O δείκτης SLEDAI αναθεωρήθηκε το 2000 και υπάρχει στο διαδίκτυο όπου μπορεί να γίνει αυτόματα ο υπολογισμός του 250. Για τον καθορισμό των μόνιμων αλλοιώσεων στα προσβεβλημένα όργανα οι ο- ποίες οφείλονται στη φλεγμονή αλλά και στις επιπλοκές από τη θεραπεία έχουν αναπτυχθεί άλλοι δείκτες, όπως ο δείκτης καταστροφής ο οποίος ήταν αποτέλεσμα της συνεργασίας του SLICC και του ACR (Systemic Lupus International Collaborating Clinics/American College of Rheumatology) 251. Ο δείκτης καταστροφής SLICC/ACR μπορεί να προβλέψει τη θνησιμότητα των ασθενών 252. Η ποιότητα ζωής των ασθενών αξιολογείται με το MOSSF-36 (Medical Outcome Survey Short Form-36) 253. Η ίδια η νόσος αλλά και οι ψυχολογικές και κοινωνικές επιπτώσεις της επηρεάζουν τον τρόπο ζωής των ασθενών και μερικοί μπορεί να παρουσιάσουν κατάθλιψη Παθοφυσιολογία στο Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο Αυτοαντισώματα και συμπλήρωμα Τα αυτοαντισώματα στο λύκο σχηματίζονται από ανοσοσφαιρίνες όλων των τάξεων (IgG, IgM, IgA, IgE και IgD), κυρίως όμως IgG και αποτελούν τμήμα των ανοσοσυμπλεγμάτων. Πρόκειται για αντισώματα τα οποία στρέφονται κατά των ιδίων αντιγόνων, τα οποία μπορεί να είναι πρωτεΐνες, νουκλεϊνικά οξέα ή νουκλεοπρωτεϊνικά συμπλέγματα. Είναι γνωστά ως αντιπυρηνικά αντισώματα (ΑΝΑ). Τα ΑΝΑ στρέφονται κατά της διπλής έλικας του DNA (dsdna), κατά των ιστόνων και των νουκλεοσωμάτων, κατά του RNA και των ριβονουκλεοπρωτεϊνών (Sm, RNP, Ro (SS-A), La (SS-B)), ενώ υπάρχουν αντισώματα κατά των κυττάρων του αίματος και του νευρικού ιστού και κατά των φωσφολιπιδίων (ACA, b2gpi). Κάποια από τα ΑΝΑ έχουν συσχετιστεί με κλινικές εκδηλώσεις του ΣΕΛ. Οι τίτλοι των anti-dsdna σχετίζονται με την νεφρική προσβολή 254, ενώ τα anti-ro/la με τον υποξύ δερματικό λύκο, τη φωτοευαισθησία και το νεογνικό λύκο. Τα αντιριβοσωμιακά, Anti-Rib-P, έχουν συσχετιστεί με τη νεφρική προσβολή, το νευροψυχιατρικό λύκο και την ηπατίτιδα 255,256,257. Αυτές οι συσχετίσεις δεν είναι απόλυτες και η εφαρμογή τους πρέπει να εξατομικεύεται στον κάθε ασθενή. Ο φυσιολογικός ρόλος του συμπληρώματος είναι να απομακρύνει παθογόνους μικροοργανισμούς και αποπτωτικά ή τραυματισμένα κύτταρα. Στο ΣΕΛ έχει σημαντικό ρόλο στην παθογένεια της ιστικής βλάβης, συμμετέχοντας στο σχηματισμό ανοσοσυμπλεγμάτων. Επιπλέον, η ανεπάρκεια κλασμάτων του συμπληρώματος της κλασσικής οδού μπορεί να οδηγήσει σε νόσο, πιθανόν λόγω της ανεπάρκειας του να οψωνοποιήσει, να μεταφέρει και να διαλύσει ανοσοσυμπλέγματα 258. Η ανικανότητα επίσης στην απομάκρυνση αποπτωτικών σωμάτων, τα οποία περιέχουν συστατικά του πυρήνα, οδηγεί σε διαταραχή στην ανοχή των ιδίων αντιγόνων 259 και νόσο.

62 Τα ανοσοσυμπλέγματα Ο ΣΕΛ χαρακτηρίζεται από αυξημένη παραγωγή αυτοαντισωμάτων και τη δημιουργία και εναπόθεση ανοσοσυμπλεγμάτων τα οποία οδηγούν σε βλάβη των ιστών. Συγκεκριμένα παρατηρείται ινιδοειδής νέκρωση, σωμάτια αιματοξυλίνης, αγγειακές βλάβες, διάσπαση της χόριο-επιδερμικής συμβολής και σπειραματονεφρίτιδα. Τα σωμάτια αιματοξυλίνης σχηματίζονται από νεκρά κύτταρα και περιέχουν α- νοσοσφαιρίνες και DNA 260. Πιο συχνά εντοπίζονται στα σπειράματα του νεφρού και στο ενδοκάρδιο, αλλά μπορούν να βρεθούν σχεδόν σε όλα τα όργανα. Όταν τα σωμάτια αιματοξυλίνης φαγοκυτταρωθούν, σχηματίζονται τα κύτταρα λύκου. Τα ανοσοσυμπλέγματα εναποτίθενται στην καρδιά, στο δέρμα, στα αγγεία, στο νεφρό και στον πνεύμονα. Στην καρδιά εντοπίζονται κυρίως στο ενδοκάρδιο. Στη Libman-Sacks ενδοκαρδίτιδα, οι εκβλαστήσεις συνήθως βρίσκονται στις βαλβίδες και αποτελούνται από πρωτεϊνικές εναποθέσεις και μονοκύτταρα, μέσα σε ένα σχηματισμό αιμοπεταλιακού θρόμβου και κατακερματισμένων νεκρών κυττάρων. Στον πνεύμονα παρατηρούνται εναποθέσεις ανοσοσφαιρινών και συμπληρώματος στην ενδοκυψελιδική αιμορραγία 261. Στο δέρμα εντοπίζονται στο όριο χορίου και επιδερμίδας. Οι ανοσοσφαιρίνες και το συμπλήρωμα, τα οποία κυκλοφορούν στο αίμα, πιθανόν να έρχονται σε επαφή με υλικό, το οποίο προέρχεται από τον πυρήνα των αποπίπτοντων κερατινοκυττάρων, σχηματίζοντας τα ανοσοσυμπλέγματα. Ιστολογικά παρατηρείται αποδιοργάνωση της βασικής κυτταρικής στιβάδας της επιδερμίδας, ινιδοειδής νέκρωση του χορίου και περιαγγειακή και περιλεμφοζιδιακή διήθηση από φλεγμονώδη κύτταρα. Σε χρόνιες βλάβες παρατηρείται υπερκεράτωση. Στα αγγεία οι εναποθέσεις παρατηρούνται στα τοιχώματα μικρών αρτηριών και αρτηριολίων κυρίως και μπορεί να συνοδεύονται από περιαγγειακή διήθηση από μονοπύρηνα λευκοκύτταρα 262. Οι ασθενείς οι οποίοι έχουν θετικό αντιπηκτικό του λύκου ή/και αντικαρδιολιπινικά αντισώματα μπορεί να παρουσιάσουν θρομβωτική μικροαγγειοπάθεια 263. Οι εναποθέσεις στο νεφρό παρατηρούνται στο σπείραμα, στα σωληνάρια, στο μεσάγγειο/διάμεσο χώρο και στα αγγεία. Ανάλογα με την εντόπιση τους και την συνοδό κυτταροβρίθεια, τις νεκρωτικές βλάβες και τη λέπτυνση της βασικής μεμβράνης του σπειράματος, η προσβολή του νεφρού κατατάσσεται στις έξι κατηγορίες του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (WHO). Η θέση στην οποία τα ανοσοσυμπλέγματα συνδέονται πιθανόν να εξαρτάται από το φορτίο τους, το μέγεθος τους, την ειδικότητα τους, τη συνάφεια τους και τον τύπο των ανοσοσφαιρινών. Επιπλέον, φαίνεται ότι εκτός από τα κυκλοφορούντα ανοσοσυμπλέγματα στο νεφρό υπάρχει και τοπική παραγωγή ανοσοσυμπλεγμάτων 264. Οι βλάβες στο ΚΝΣ οφείλονται σε νεκρωτική ή φλεγμονώδη αγγειίτιδα, σε θρομβωτικές πλάκες στα ενδοκράνια αγγεία με ή χωρίς πολλαπλασιασμό ενδοθηλίου και περιαγγειακή φλεγμονή 265. Σε μικρότερο βαθμό οι βλάβες είναι μη αγγειακής προέλευσης. Οι μη αγγειακής προέλευσης βλάβες πιθανών να οφείλονται σε αντισώματα που στοχεύουν τα νευρικά κύτταρα και στην αντιριβοσωμιακή Ρ πρωτεΐνη, η οποία έχει συσχετιστεί με τη ψύχωση του λύκου. Τα ανοσοσυμπλέγματα έχουν διαφορετικές ιδιότητες ανάλογα με το είδος και τη συγκέντρωση του αντιγόνου και του αντισώματος που φέρουν, το μέγεθος, το φορτίο και την ικανότητα τους να συνδέονται με τα κλάσματα του συμπληρώματος. Όταν αυτά ε-

63 55 ναποτεθούν στους ιστούς κινητοποιείται η κυτταρική ανοσία και ενεργοποιούνται τα φαγοκύτταρα και τα μαστικά κύτταρα τα οποία σε συνδυασμό με τα ενεργοποιημένα κλάσματα του συμπληρώματος οδηγούν σε φλεγμονώδη διεργασία Παθητική, Κυτταρική και χυμική ανοσία Τα Τ και τα Β λεμφοκύτταρα έχουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεια του νοσήματος. Όπως έχει αναφερθεί, ο ΣΕΛ χαρακτηρίζεται από την παραγωγή αντισωμάτων, την δημιουργία ανοσοσυμπλεγμάτων, την επακόλουθη ενεργοποίηση του συμπληρώματος, τη φλεγμονή και την ιστική καταστροφή. Τα αντισώματα αφορούν τα Β λεμφοκύτταρα και την χυμική ανοσία. Στην παθογένεια του νοσήματος εμπλέκεται η παθητική και η κυτταρική ανοσία με την παραγωγή κυτταροκινών και χημειοκινών. Η παθητική, κυτταρική και χυμική ανοσία αλληλοεπηρεάζονται, όπως και τα Β, τα Τ λεμφοκύτταρα και τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα 156. Η ενεργοποίηση της παθητικής ανοσίας μέσω των Toll-like υποδοχέων φαίνεται να είναι παρόμοια στο λύκο με την ενεργοποίηση η οποία παρατηρείται ως απάντηση στα συνήθη παθογόνα 266. Οι Toll-like υποδοχείς (TLRs) ενεργοποιούν τα φαγοκύτταρα σε απάντηση διαφόρων ειδών και συστατικών των μικροβίων 1. Τα μονοπύρηνα φαγοκύτταρα αδρανοποιούν τους παθογόνους μικροοργανισμούς και απομακρύνουν πιθανός παθογόνα ανοσοσυμπλέγματα, αποπτωτικά και γερασμένα κύτταρα. Η ενεργοποίηση των Toll-like υποδοχέων στο λύκο πυροδοτείται από ανοσοσυμπλέγματα τα οποία περιέχουν DNA και RNA μαζί με τα ειδικά αντισώματα. Τα μονοπύρηνα των ασθενών παρουσιάζουν έκφραση του γονιδίου της ιντερφερόνης-α. Η παραγωγή ιντερφερόνης-α οδηγεί στην ενδοκυττάρια μεταφορά μηνυμάτων και στην μεταγραφή γονιδίων, τα οποία ελέγχονται από την ιντερφερόνη όπως αυτά τα οποία σχετίζονται με τη διαφοροποίηση των βλαστοκυττάρων, την ωρίμανση και ενεργοποίηση των δενδριτικών κυττάρων 267. Η αυξημένη παρουσία των δενδριτικών κυττάρων πιθανόν να κατευθύνει την αυτοανοσία και την απώλεια της ανοσιακής ανοχής στο λύκο 268. Ακολουθεί αυξημένη αντιγονοπαρουσίαση και ενεργοποίηση αυτοαντιδραστικών Τ λεμφοκυττάρων 269. Τα μακροφάγα (ώριμα μονοπύρηνα φαγοκύτταρα), τα οποία έχουν φυσιολογικό ρόλο στην αντιγονοπαρουσίαση αφού αλληλεπιδρούν με τα Τ λεμφοκύτταρα και συμμετέχουν στην ενεργοποίηση αυτών μέσω των συνδιεγερτικών μορίων, εκκρίνουν κυτταροκίνες όπως IL-1, IL-6, TNF και απομακρύνουν αποπτωτικά κύτταρα, είναι σημαντικά στην παθογένεια του ΣΕΛ 269. Σε ασθενείς με λύκο έχουν παρατηρηθεί διαταραχές στην απομάκρυνση αποπτωτικών κυττάρων και στην εξαρτώμενη από την INF-α ωρίμανση των μονοκυττάρων σε αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα. Επίσης έχουν καταγραφεί διαταραχές στην ικανότητα των μακροφάγων να ενεργοποιούν τα Τ λεμφοκύτταρα και στην παραγωγή κυτταροκινών. Η INF-α σχετίζεται επίσης με τη λεμφοπενία 267. Τα Β λεμφοκύτταρα έχουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεια του λύκου αφού α- ποτελούν τα πρόδρομα κύτταρα των πλασματοκυττάρων τα οποία παράγουν τα αυτοαντισώματα. Αν και το φάσμα τους είναι πολυκλωνικό, υπάρχει ειδική και αυξημένη παραγωγή συγκεκριμένου πληθυσμού αυτοαντισωμάτων. Οι κυτταροπενίες, οι οποίες στο λύκο οφείλονται σε αντισώματα και ο ρόλος των αντι-dsdna αντισωμάτων στην παθογένεια της σπειραματονεφρίτιδας επιβεβαιώνουν τον άμεσο ρόλο τους στην παθογένεια του νοσήματος 270.

64 Τα Β λεμφοκύτταρα στο λύκο είναι σε υπερλειτουργία 271, έχουν δράση αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων και ρυθμίζουν τη λειτουργία άλλων κυττάρων συμπεριλαμβανομένων των Τ λεμφοκυττάρων και των δενδριτικών κυττάρων 272,273. Η μέσω των Τ λεμφοκυττάρων αναστολή της διαφοροποίησης των Β λεμφοκυττάρων είναι ελαττωμένη στους ασθενείς με ΣΕΛ. Η αυξημένη απαντητικότητα των Β λεμφοκύτταρων αποδίδεται στους αυξητικούς παράγοντες και στους παράγοντες διαφοροποίησης οι οποίοι προέρχονται από τα Τ λεμφοκύτταρα 274, αλλά και στην εγγενή πρωτοπαθή δική τους ενεργότητα ή οφείλεται σε προηγούμενη ενεργοποίηση τους μετά από επαφή ανοσοσφαιρινών με αντιγόνα. Η μεταγωγή των πρώϊμων μηνυμάτων από τους υποδοχείς των αντιγόνων, περιλαμβανομένης και της ενισχυμένης απάντησης στο ασβέστιο, είναι διαταραγμένη 275. Η διαταραχή στη μεταγωγή των μηνυμάτων είναι ειδική για τη νόσο, οπότε πιθανόν να ο- φείλεται σε εγγενή διαταραχή των Β λεμφοκυττάρων στο λύκο. Επιπλέον τα Β λεμφοκύτταρα εκφράζουν σε αφθονία το CD40L με μεγαλύτερη τάση υπερέκφρασης μετά από διέγερση από μιτoγόνα 276. Το CD40L είναι πρωτεΐνη ενεργοποίησης των Β λεμφοκυττάρων. Η σημασία του CD40L φαίνεται στα ποντίκια, στα οποία η έκτοπη έκφραση του μορίου στα Β λεμφοκύτταρα προκαλεί λύκο 277. Οι ασθενείς με ΣΕΛ έχουν Β λεμφοπενία, η οποία αφορά τα ήρεμα Β λεμφοκύτταρα, ενώ έχουν κυκλοφορούντα βλαστοκύτταρα και πλασματοβλάστες 278. Αυτό μπορεί να οφείλεται στην αυξημένη διαφοροποίηση των ήρεμων Β λεμφοκυττάρων, σε διαταραχή στην κυκλοφορία τους, σε διαταραχή ανοσιακής ανοχής ή σε απορρύθμιση η οποία οφείλεται στις κυτταροκίνες. Η IL-10, η οποία είναι ο κύριος παράγοντας διαφοροποίησης των Β λεμφοκυττάρων, βρίσκεται σε αυξημένα επίπεδα στον ορό ασθενών με λύκο και σχετίζεται με την υπερδραστικότητα τους και την παραγωγή αυτοαντισωμάτων 279. Τα Τ λεμφοκύτταρα στους ασθενείς με λύκο μπορεί να είναι χαμηλά κατά την φάση ενεργότητας της νόσου. Αυτό αποδίδεται στα αυτοαντισώματα κατά των Τ λεμφοκυττάρων και στην περιφερική καταστροφή τους. Πρόσφατες μελέτες όμως θέτουν την πιθανότητα θάνατος των Τ λεμφοκυττάρων να είναι εξαρτώμενος από την ενεργοποίηση τους. Έχουν παρατηρηθεί διάφορες διαταραχές στα Τ λεμφοκύτταρα ασθενών με ενεργό ή σε ύφεση λύκο, όπως διαταραχές στη λειτουργία τους ειδικά στην εξαρτώμενη από την IL-2, στον εξαρτώμενο από τα μιτογόνα πολλαπλασιασμό τους, στην ανταπόκριση τους στη λεκτίνη 280 και στην ανταπόκριση τους σε αντιγόνα για τα οποία ήδη υπάρχει ανοσιακή μνήμη (recall antigen like tetanus) αλλά και στις κατασταλτικές τους ιδιότητες 281. Ο εξαρτώμενος από το CD3 μοριακό σύμπλεγμα πολλαπλασιασμός τους επηρεάζεται λόγω μείωσης των ζ αλύσων και αλλαγών στη λειτουργεία της MAP κινάσης 156. Οι εξαρτώμενες από την ιντερλευκίνη-2 διαταραχές στα Τ λεμφοκύτταρα ασθενών με λύκο φαίνεται ότι οφείλονται στη διαταραγμένη έκκριση IL-2 από αυτά, αλλά και από τη διαταραγμένη ανταπόκριση τους σε αυτήν 282. Η IL-2 παράγεται από τα Τ λεμφοκύτταρα με την επίδραση σε αυτά της IL-1, η οποία παράγεται από τα μονοκύτταρα. Στο ΣΕΛ υπάρχει ελαττωμένη παραγωγή IL-1 από τα μονοκύτταρα, αλλά και μειωμένη ανταπόκριση των Τ λεμφοκυττάρων σε αυτή 283. Σύμφωνα με κάποιες μελέτες τα CD8 λεμφοκύτταρα υπερισχύουν στο λύκο και αυξάνονται στις εξάρσεις της νόσου. Αυτά τα λεμφοκύτταρα εκφράζουν και παράγουν αυξημένα επίπεδα περφορίνης και γκρανζύμης-β στους ασθενείς με ενεργό λύκο και το ποσοστό τους σχετίζεται με το δείκτη ενεργότητας SLEDAI. Η ενεργοποίηση και η διαφοροποίηση των CD8 λεμφοκυττάρων σε κυτταροτοξικά, γίνεται με την επίδραση των δενδριτικών κυττάρων, τα οποία διεγείρονται από την ιντερφερόνη-α. Τα κυτταροτοξικά 56

65 57 λεμφοκύτταρα ίσως συμβάλλουν στην αυξημένη δημιουργία πυρηνικών αυτοαντιγόνων συμμετέχοντας στην παθογένεια του ΣΕΛ 284. Οι πολυμορφισμοί σε πρωτεΐνες, οι οποίες συμμετέχουν στην ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων, έχουν πιθανό ρόλο στην παθογένεια του νοσήματος. Ο πολυμορφισμός στο γονίδιο της φωσφατάση της τυροσίνης, (μια πρωτεΐνη η οποία σχετίζεται με την αρνητικό ρυθμιστή κινάση Csk), LYP, έχει συσχετιστεί με την αυτοάνοση θυρεοειδίτιδα σε ασθενείς με ΣΕΛ 285. Η συσχέτιση της LYP με την κινάση Csk μπορεί να μεταβάλλει τον αρνητικό έλεγχο, ο οποίος ασκείται στα Τ λεμφοκύτταρα κατά την ενεργοποίηση. Το CD40 ligand, που είναι βασικό για την άμεση βοήθεια των Τ στα Β λεμφοκύτταρα αλλά και στα ενδοθηλιακά κύτταρα, ανιχνεύεται στην επιφάνεια των κυττάρων ασθενών με ενεργό λύκο παρατεταμένα σε αντίθεση με τους υγιείς, στους οποίους ανιχνεύεται για σύντομο χρόνο μετά την μέσω του TCR ενεργοποίηση 286. Αυτό ίσως συμβάλλει στην αυξημένη ενεργοποίηση των Β λεμφοκυττάρων και των ενδοθηλιακών κυττάρων με επακόλουθο την αγγειακή βλάβη. Τέλος, η αυξημένη αυθόρμητη απόπτωση των λεμφοκυττάρων, η οποία παρατηρείται σε ασθενείς με ενεργό λύκο, υποδεικνύει την αυτοδραστικότητα των Τ λεμφοκυττάρων Θεραπεία Η θεραπευτική προσέγγιση στο λύκο εξαρτάται από την κλινική εικόνα του ασθενή. Οι ασθενείς πρέπει να αποφεύγουν την έκθεση στον ήλιο, να χρησιμοποιούν αντηλιακά, να μην εκθέτουν τον εαυτό τους σε λοιμογόνο περιβάλλον και να εμβολιάζονται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες της χώρας τους. Σημαντική θέση στη θεραπεία του ΣΕΛ έχουν τα κορτικοστεροειδή, τα οποία χρησιμοποιούνται σε χαμηλότερες δόσεις για ήπιες εκδηλώσεις του νοσήματος και σε πολύ ψηλές δόσεις για σοβαρές εκδηλώσεις. Εφόσον η ενεργότητα του νοσήματος τεθεί υπό έλεγχο, η κορτιζόνη πρέπει να μειώνεται σταδιακά σε μικρότερη δόση λόγω των παρενεργειών οι οποίες παρατηρούνται στη χρόνια χρήση της. Οι ήπιες δερματικές εκδηλώσεις, τα γενικά συμπτώματα της νόσου και οι αρθραλγίες/αρθρίτιδες αντιμετωπίζονται με ανθελονοσιακά φάρμακα (υδροξυχλωροκίνη και κουινακρίνη). Τα φάρμακα αυτά έχουν πιθανόν προφυλακτική δράση όσο αφορά στα θρομβοεμβολικά επεισόδια του αντιφωσφολιπιδικού συνδρόμου 288. Τα μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη (ΜΣΑΦ) χρησιμοποιούνται στο λύκο εφόσον δεν υπάρχει αντένδειξη (πχ νεφρίτιδα, θρομβοπενία, ηπατική προσβολή και προσβολή του ΚΝΣ), για την αντιμετώπιση των μυοσκελετικών προβλημάτων, της ορογονίτιδας και των γενικών συμπτωμάτων όπως του πυρετού 156. Οι σοβαρές εκδηλώσεις της νόσου αντιμετωπίζονται με ανοσοκατασταλτικά φάρμακα. Η αζαθειοπρίνη χρησιμοποιείται για την αντιμετώπιση του δερματικού εξανθήματος, των αιματολογικών διαταραχών, της σπειραματονεφρίτιδας αλλά και σε ασθενείς με συχνές εξάρσεις οι οποίοι είναι εξαρτώμενοι από την κορτιζόνη 156. Η μεθοτρεξάτη και η λεφλουνομίδη χρησιμοποιούνται στην αρθρίτιδα του λύκου 156. Οι πολύ σοβαρές εκδηλώσεις του λύκου όπως η σπειραματονεφρίτιδα, η προσβολή ΚΝΣ, η πνευμονική αιμορραγία και η πνευμονίτιδα του λύκου, αντιμετωπίζονται με κυκλοφωσφαμίδη 289,290,291 και μυκοφενολάτη μοφετίλ 292 σε συνδυασμό με μεγάλες δόσεις κορτικοστεροειδών. Η πλασμαφέρεση προσφέρει επιπλέον όφελος στους ασθενείς με πνευμονική αιμορραγία 293 ενώ η ανοσοσφαιρίνη σε αυτούς με πνευμονίτιδα και νευροψυχιατρικό λύ-

66 κο 294. Η πλασμαφαίρεση και η ενδοφλέβια ανοσοσφαιρίνη χρησιμοποιούνται επίσης στην αντιμετώπιση της αιμολυτικής αναιμίας 295,296. Στη θεραπεία του ΣΕΛ χρησιμοποιούνται επίσης η θαλιδομίδη και η δαψόνη για την προβολή του δέρματος, η κυκλοσπορίνη για την νεφρίτιδα και τις αιματολογικές διαταραχές, το μπόσενταν και η σιντεναφίλη στην αντιμετώπιση της πνευμονικής υπέρτασης 156. Το αντι-cd20 αντίσωμα (rituximab), αν και επίσημα δεν έχει πάρει ένδειξη, χρησιμοποιείται στη θεραπεία του ΣΕΛ για την αντιμετώπιση δύσκολων περιπτώσεων με προσβολή ΚΝΣ, νεφρού, αγγειίτιδα ή για αιματολογικές διαταραχές, με επιτυχία. Το α- ντίσωμα αυτό απομακρύνει από την κυκλοφορία τα Β λεμφοκύτταρα τα οποία εκφράζουν το CD20, δηλαδή τις πρόδρομες μορφές από τα προ-β λεμφοκύτταρα μέχρι τα πλασματοκύτταρα. Οι αναφορές αφορούν μικρό αριθμό ασθενών 297,298, αλλά τα αποτελέσματα είναι ενθαρρυντικά. 58

67 Οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ) Εισαγωγή Η οστεορθρίτιδα (ΟΑ) είναι η πιο συχνή αρθροπάθεια. Η ΟΑ προσβάλλει συχνότερα τα γόνατα, τα ισχία, τη σπονδυλική στήλη, το μεγάλο δάκτυλο του ποδιού, την πρώτη καρπομετακαρπιακή, τις εγγύς και τις άπω φαλαγγοφαλαγγικές αρθρώσεις. Η ΟΑ προσβάλλει όλες τις εθνότητες και τα φύλα, με διαφορές στη συχνότητα και στην εντόπιση στις αρθρώσεις. Για παράδειγμα στους αφροαμερικανούς παρατηρείται αυξημένη προσβολή στα γόνατα 299 ενώ στους κινέζους στα ισχία 300. Ο επιπολασμός της συμτωματικής νόσου κυμαίνεται ανάλογα με την ηλικία και την προσβεβλημένη άρθρωση. Στο Ηνωμένο Βασίλειο 18.1% των καταγεγραμμένων ασθενών, ηλικίας μεγαλύτερης από 55 ετών έχει οστεοαρθρίτιδα γονάτων, % ισχίων και 2.5% χεριών 301. Στις ΗΠΑ ο επιπολασμός της συμπτωματικής ΟΑ γονάτων για τις ηλικίες ετών είναι 1.9% 302, ενώ στους μεγαλύτερους των 63 ετών είναι 9.5% 303. Στην Ελλάδα ο επιπολασμός της συμπτωματικής νόσου στους ενήλικες με προσβολή σπονδυλικής στήλης και περιφερικών αρθρώσεων είναι 13,1% 148. Ο επιπολασμός της νόσου διαφέρει ανάλογα με τον πληθυσμό, την υπό μελέτη άρθρωση, το φύλο και αυξάνεται με την ηλικία. Η μεγάλη ηλικία, το φύλο, η εθνικότητα και η κληρονομικότητα αποτελούν μη τροποποιήσιμους παράγοντες κινδύνου. Η ηλικία είναι ο σημαντικότερος παράγοντας κινδύνου 304. Στους τροποποιήσιμους παράγοντες κινδύνου εμφάνισης ΟΑ ανήκουν η παχυσαρκία, οι κακώσεις των αρθρώσεων, η οστική πυκνότητα, η διατροφικές συνήθειες και η λανθασμένη στάση του σώματος. Η παχυσαρκία σχετίζεται με την προσβολή των γονάτων 305 ενώ η αυξημένη οστική πυκνότητα σχετίζεται με την παρουσία οστεοφύτων στο ισχίο και στο γόνατο λόγω οστεοαρθρίτιδας. Η διάγνωση τίθεται με βάση την κλινική εικόνα, τον πόνο ή τον ακτινολογικό έ- λεγχο. Οι ασθενείς μπορεί να παρουσιάζουν πόνο ο οποίος να μην δικαιολογείται από τα ακτινολογικά ευρήματα και το αντίστροφο, δηλαδή να έχουν σοβαρές αλλοιώσεις στις αρθρώσεις στις ακτινογραφίες χωρίς ιδιαίτερο πόνο. Οι ιστολογικές και οι ανατομικές αλλοιώσεις της ΟΑ έχουν μέτρια συσχέτιση με την παρουσία συμπτωμάτων Διαγνωστικά κριτήρια Το Αμερικάνικο Κολλέγιο Ρευματολογίας, ACR έχει θεσπίσει διαγνωστικά κριτήρια για την οστεοαρθρίτιδα των χεριών, των γονάτων και των ισχίων 306,307. I.Οστεοαρθρίτιδα χεριών, κλινική εκτίμηση: 1. Πόνος στα χέρια ή δυσκαμψία τις περισσότερες μέρες του προηγούμενου μήνα 2. Σκληρή διόγκωση του ιστού δύο ή περισσοτέρων από τις δέκα επιλεγμένες αρθρώσεις του χεριού (δεύτερη και τρίτη εγγύς, δεύτερη και τρίτη άπω φαλαγγοφαλαγγικη και η πρώτη καρπομετακαρπιακή άμφω) 3. Οίδημα σε δύο ή περισσότερες μετακαρπιοφαλαγγικές αρθρώσεις 4. Σκληρή διόγκωση του ιστού σε δύο ή περισσότερες άπω φαλαγγοφαλαγγικές αρθρώσεις 5. Παραμόρφωση σε μία ή περισσότερες από τις δέκα επιλεγμένες αρθρώσεις του χεριού

68 60 Η διάγνωση τίθεται αν πληρούνται τα κριτήρια 1,2,3, και 4 ή 1,2,3 και 5. II.Οστεοαρθρίτιδα ισχίων, κλινικοεργαστηριακή και ακτινολογική εκτίμηση 1. Πόνος στο ισχίο τις περισσότερες μέρες του προηγούμενου μήνα 2. ΤΚΕ 20mm/h 3. Οστεόφυτα στο μηριαίο ή/και στην κοτύλη στον ακτινογραφικό έλεγχο 4. Στένωση της κατ ισχίον άρθρωσης στις ακτινογραφίες Η διάγνωση τίθεται αν πληρούνται τα κριτήρια 1,2 και 3 ή 1,2 και 4 ή 1,3 και 4. III.α. Οστεοαρθρίτιδα γονάτων, κλινική εκτίμηση 1. Πόνος στο γόνατο τις περισσότερες μέρες του προηγούμενου μήνα 2. Κριγμός στην ενεργητική κίνηση της άρθρωσης 3. Πρωινή δυσκαμψία διάρκειας μικρότερης ή ίσης με 30 λεπτά 4. Ηλικία μεγαλύτερη ή ίση με 38 έτη 5. Οστική διόγκωση του γόνατος κατά την κλινική εξέταση Η διάγνωση τίθεται αν πληρούνται τα κριτήρια 1,2,3 και 4 ή 1,2 και 5 ή 1,4 και 5. III.β. Οστεοαρθρίτιδα γονάτων, κλινοκοεργαστηριακή εκτίμηση 1. Πόνος στο γόνατο τις περισσότερες μέρες του προηγούμενου μήνα 2. Οστεόφυτα στα όρια της άρθρωσης στις ακτινογραφίες 3. Αρθρικό υγρό τυπικό για ΟΑ 4. Ηλικία μεγαλύτερη ή ίση των 40 ετών 5. Πρωινή δυσκαμψία μικρότερη ή ίση με 30 λεπτά 6. Κριγμός στην ενεργητική κίνηση της άρθρωσης Διάγνωση τίθεται αν πληρούνται τα κριτήρια 1 και 2 ή 1,3,5 και 6 ή 1,4,5 και Κατάταξη οστεοαρθρίτιδας Η ΟΑ διακρίνεται σε ιδιοπαθή και δευτεροπαθή ανάλογα με την αιτιολογία της. Η ιδιοπαθής ΟΑ μπορεί να είναι εντοπισμένη σε μια αρθρική περιοχή (στο χέρι, στο πόδι, στα γόνατα, στα ισχία, στη σπονδυλική στήλη ή στους ώμους, στις κροταφογναθηκές κτλ) ή να είναι γενικευμένη στην οποία προσβάλλονται τρεις ή και περισσότερες αρθρικές περιοχές. Επιπλέον μπορεί να διακριθεί σε μονοαρθρική, ολιγοαρθρική ή πολυαρθρική μορφή. Η δευτεροπαθής ΟΑ μπορεί να οφείλεται σε μεταβολικές νόσους όπως η ω- χρονοσία, η ακρομεγαλία, η αιμοχρωμάτωση, η εναπόθεση κρυστάλλων ασβεστίου, σε αλλοιώσεις στα οστά, οι οποίες οφείλονται σε συγγενείς ανατομικές ανωμαλίες όπως οι δυσπλασίες των επιφύσεων, η ανισοσκέλια και το συγγενές εξάρθρημα της κεφαλής του μηριαίου οστό, σε κάκωση ή σε χρόνια επαγγελματική χρήση και σε φλεγμονώδη νοσήματα τα οποία προσβάλουν οστά και αρθρώσεις όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα, η σηπτική αρθρίτιδα, η οστεοχονδρίτιδα κτλ 156. Ανάλογα με τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά τα οποία παρουσιάζει ο ασθενής, η ο- στεοαρθρίτιδα διακρίνεται επιπλέον σε φλεγμονώδη, διαβρωτική, ατροφική ή καταστροφική και οστεοαρθρίτιδα με χονδρασβέστωση 308.

69 Κλινική εικόνα Οι κλινικές εκδηλώσεις της ΟΑ σχετίζονται με τη καταστροφή του αρθρικού χόνδρου και με αλλοιώσεις στο υποκείμενο οστό και στο οστό στα όρια της άρθρωσης. Η νόσος δεν θεωρείται πλέον απλά «εκφυλιστική» αφού παρατηρούνται βιοχημικές, κυτταρικές και βιομηχανικές διαταραχές στην άρθρωση. Αν και η ΟΑ προσβάλλει αμφοτερόπλευρα τις αρθρώσεις τα συμπτώματα συνήθως εμφανίζονται ετερόπλευρα. Οι ασθενείς με ΟΑ δεν παρουσιάζουν συστηματικές εκδηλώσεις. Το κύριο σύμπτωμα τους είναι ο πόνος, για τον οποίο παραπονιούνται λιγότεροι από 50% από τους ασθενείς οι οποίοι έχουν σοβαρές οστεοαρθριτιδικές αλλοιώσεις στις ακτινογραφίες 309. Δεν είναι γνωστός ο λόγος για τον οποίο ο πόνος παρατηρείται μόνο σε ένα ποσοστό των ασθενών. Ο πόνος στην ΟΑ είναι ασαφής και συνήθως αφορά όλη την άρθρωση ή αντανακλά σε κάποιο απομακρυσμένο σημείο από την άρθρωση. Επηρεάζεται από τις αλλαγές του καιρού και μπορεί να συνοδεύεται από πρωινή δυσκαμψία διάρκειας μικρότερης από 30 λεπτά στις προσβεβλημένες αρθρώσεις. Σε αντίθεση με τη ρευματοειδή αρθρίτιδα ο πόνος στην οστεοαρθρίτιδα επιδεινώνεται με τη φυσική δραστηριότητα κατά τη διάρκεια της ημέρας. Η άσκηση μπορεί να επιδεινώσει τον πόνο λόγω υποχονδριακής ισχαιμίας. Αν πόνος εντοπίζεται στα όρια της άρθρωσης ή υπάρχει ευαισθησία γύρω από την άρθρωση τότε μπορεί να είναι περιοστικός ή περιαρθριτιδικός από πίεση στο θύλακα ή να οφείλεται στην ανάπτυξη οστεοφύτων 156. Κύριο όργανο στόχος της οστεοαρθρίτιδας είναι ο αρθρικός χόνδρος, ο οποίος όμως στερείται νευρικών απολήξεων 310. Οι μηνίσκοι επίσης στερούνται νευρικών απολήξεων. Η καταστροφή του αρθρικού χόνδρου και των μηνίσκων διαταράσσει την ομαλότητα στην κίνηση της άρθρωσης. Καθώς οι δύο ανώμαλες αρθρικές επιφάνειες ολισθαίνουν η μία πάνω στην άλλη δημιουργείται το αίσθημα του κριγμού το οποίο μπορεί να συνοδεύεται από πόνο. Οι ανωμαλίες αυτές στην αρχιτεκτονική της άρθρωσης προκαλούν έμμεσα πόνο. Τα ελεύθερα σωμάτια μέσα στην άρθρωση τα οποία προέρχονται από τον καταστραμμένο χόνδρο και μηνίσκο μπορεί να προκαλέσουν τάση στον αρθρικό θύλακο, η οποία εκδηλώνεται με πόνο. Ο αρθρικός υμένας έχει νευρικές απολήξεις οπότε μηχανικά, θερμικά και γενικά επιβλαβή ερεθίσματα προκαλούν πόνο 156. Το υποχονδρικό οστό σχετίζεται άμεσα με τον αρθρικό πόνο 311. Η οστική ισχαιμία και η αυξημένη φλεβική πίεση οδηγούν στην αυξημένη απελευθέρωση πεπτιδίων από τις νευρικές απολήξεις. Η οστική αναδόμηση, η δημιουργία οστεοφύτων 312 και η τάση στους περιαρθρικούς μαλακούς ιστούς είναι αιτίες του πόνου 313. Οι ασθενείς μπορεί να παρουσιάζουν οίδημα, θερμότητα, ευαισθησία και μειωμένη λειτουργικότητα στην οστεαρθριτιδική άρθρωση. Η θερμότητα οφείλεται στη φλεγμονή, η οποία είναι λιγότερο σοβαρή από ότι στις νόσους του συνδετικού ιστού. Μικρά τεμάχια από τον καταστραμμένο αρθρικό χόνδρο πέφτουν μέσα στην άρθρωση και αρθρικός υμένας προσπαθεί να τα απομακρύνει μέσω της φλεγμονώδους απάντησης. Μαζί με τα χόνδρινα τεμάχια ελευθερώνονται στην άρθρωση κολλαγόνο, πρωτεογλυκάνες, κρύσταλλοι ασβεστίου, πρωτεολυτικά ένζυμα και κυτταροκίνες, τα οποία επίσης συμβάλλουν ή και προκαλούν τη φλεγμονώδη διεργασία. Το οίδημα οφείλεται σε υμενίτιδα, φλεγμονή δηλαδή του υμένα ή σε ενδοαρθρική συλλογή υγρού. Συνήθως οι οιδηματώδεις αρθρώσεις είναι ψυχρές ή ελαφρώς θερμές. Η προσβολή των αρθρώσεων, οι οποίες φέρουν το σωματικό βάρος μπορεί να προκαλέσει διαταραχές στη βάδιση και μυϊκό

70 62 σπασμό των παρακείμενων μυών. Στην υπερτροφική μορφή της νόσου, στην οποία παράγεται οστό γύρω από την άρθρωση, οι ασθενείς αντιμετωπίζουν πρόβλημα στην εκτέλεση λεπτών κινήσεων όπως απαιτείται πχ στο πλέξιμο. Επιπλέον παρατηρούνται παραμορφώσεις και αστάθεια των αρθρώσεων. Ο πόνος μπορεί να οδηγήσει σε μειωμένη δραστηριότητα, η οποία με τη σειρά της οδηγεί σε μυϊκή ατροφία 156. Η οστεοαρθρίτιδα μπορεί να προσβάλει όλες τις αρθρώσεις του σώματος. Τα χέρια, τα πόδια, οι ώμοι, τα ισχία, τα γόνατα, οι ποδοκνημικές, οι κροταφογναθικές και η σπονδυλική στήλη είναι οι αρθρώσεις οι οποίες προσβάλλονται συχνότερα 156. Οι ασθενείς με ΟΑ άκρων χειρών μπορεί να εμφανίσουν οζίδια και αποκλίσεις στις φαλαγγοφαλαγγικές αρθρώσεις. Τα οζίδια του Heberten εμφανίζονται στις άπω φαλαγγοφαλαγγικές αρθρώσεις των χεριών και μπορεί να σχετίζονται με κερκιδική, ωλένια και παλαμιαία απόκλιση των προσβεβλημένων αρθρώσεων. Συνήθως εμφανίζονται στο δεύτερο και τρίτο δάκτυλο της επικρατούσας χείρας. Τα οζίδια του Bouchard παρατηρούνται στις εγγύς φαλαγγοφαγγικές αρθρώσεις, κυρίως στο δεύτερο και τρίτο δάκτυλο. Η προσβολή της πρώτης καρπομετακαρπιακής άρθρωσης είναι συχνή και μπορεί να οδηγήσει σε υπερξάρθρημα και κερκιδική απόκλιση του πρώτου μετακαρπίου. Οι μετακαρπιοφαλαγγικές δεν προσβάλλονται συχνά. Η ΟΑ των χεριών διακρίνεται σε φλεγμονώδη και μη φλεγμονώδη ανάλογα με την επιθετικότητα των αρθρικών καταστροφών 156. Η άρθρωση, η οποία προσβάλλεται συχνότερα στο πόδι, είναι η πρώτη μεταταρσιοφαλαγγική. Η άρθρωση μπορεί να είναι διογκωμένη, με υπερξάρθρημα και πλάγια απόκλιση (ραιβό μεγάλο δάκτυλο) 156. Η προσβολή των γονάτων προκαλεί δυσφορία και πόνο στους ασθενείς ειδικά ό- ταν μεταφέρουν βαριά αντικείμενα, ανεβοκατεβαίνουν σκάλες και κατά την έγερση από την καθιστική θέση. Το οστεοαρθριτιδικό γόνατο μπορεί να είναι οιδηματώδες, ευαίσθητο, με μειωμένο εύρος κίνησης, ραιβό ή βλαισό. Ο κριγμός, ο οποίος γίνεται αισθητός κατά την κίνηση, είναι σύνηθες εύρημα στην κλινική εξέταση. Οι ασθενείς παραπονιούνται για αίσθημα αστάθειας στα γόνατα 156. Η αξιολόγηση του πόνου στους ασθενείς με οστεοαρθρίτιδα γίνεται με κλίμακες πέντε σημείων (κλίμακα πέντε σημείων Likert) ή με οπτικές αναλογικές κλίμακες τις VAS, οι οποίες χρησιμοποιούνται στην αξιολόγηση του πόνου σε πολλά νοσήματα. Η αξιολόγηση του πόνου και της φυσικής δραστηριότητας στο ισχίο και στο γόνατο γίνεται με το δείκτη WOMAC (Western Ontario McMaster Universities Osteoarthritis Index) ή με την κλίμακα Lequesne. Τέλος ο πόνος στο χέρι αξιολογείται με το δείκτη AUSCAN (Australian Canadian Hand Index) Εργαστηριακά ευρήματα στην οστεοαρθρίτιδα Η διάγνωση της ΟΑ δεν βασίζεται στο εργαστήριο. Στη φάση της φλεγμονής μπορεί να υπάρχει μικρή αύξηση των δεικτών οξείας φλεγμονής. Η ΤΚΕ δεν είναι αξιόπιστος δείκτης διότι αυξάνεται με την ηλικία. Η μικρή αύξηση της CRP, αν είναι ξεκάθαρη και σαφής, είναι πιο αξιόπιστος δείκτης ενεργού ΟΑ 314. Το αρθρικό υγρό είναι διαυγές και συνήθως άχρωμο. Τα λευκοκύτταρα είναι λιγότερα από 2000 και μπορεί να είναι πλούσιο σε κρυστάλλους ασβεστίου. Ο απεικονιστικός έλεγχος είναι χρήσιμος στη διάγνωση και στην παρακολούθηση των ασθενών με ΟΑ. Η πιο σημαντική απεικονιστική μέθοδος είναι οι απλές ακτινογραφίες. Η υποχόνδρια σκλήρυνση και τα οστεόφυτα είναι πρώιμα ακτινολογικά ευρήματα

71 63 στην ΟΑ τα οποία αυξάνονται με το χρόνο τόσο σε έκταση όσο και σε μέγεθος 315. Τα οστεόφυτα αποτελούν έκτοπη παραγωγή οστού σε σημεία στα οποία το μηχανικό φορτίο είναι μικρό. Συνήθως εντοπίζονται στα όρια της άρθρωσης, στις ενθέσεις και στις κεντρικές περιοχές της άρθρωσης όπου το φορτίο είναι μικρό 316. Η υποχόνδρια σκλήρυνση παρατηρείται πιο συχνά στις κοίλες αρθρώσεις από ότι στις κυρτές 317. Η ασύμμετρη αρθρική στένωση, οι υποχονδρικές διαβρώσεις και κύστεις και η επιπέδωση της αρθρικής επιφάνειας είναι ακτινολογικά ευρήματα στην ΟΑ. Η μαγνητική τομογραφία, το αρθρόγραμμα, ο υπέρηχος, η αξονική τομογραφία, η αρθροσκόπηση και άλλες πιο εξειδικευμένες απεικονίστηκες μέθοδοι, είναι χρήσιμες στους ασθενείς με ΟΑ εφόσον υπάρχει κλινική ένδειξη Παθοφυσιολογία στην οστεοαρθρίτιδα Η οστεοαρθρίτιδα θεωρείτο παλαιότερα μια εκφυλιστική νόσος, οι βλάβες όμως στις αρθρώσεις οι οποίες προκαλούνται με την αύξηση της ηλικίας δεν είναι ίδιες με αυτές της ΟΑ. Αν και η επίπτωση της νόσου αυξάνεται με την αύξηση της ηλικίας, η ΟΑ δεν είναι απλά μια εκφυλιστική νόσος. Οι παράγοντες κινδύνου οι οποίοι έχουν συσχετιστεί με την εκδήλωση της νόσου είναι η κληρονομικότητα, η κακή στάση του σώματος, η παχυσαρκία, οι μεταβολικές νόσοι και οι κακώσεις. Οι γενετικοί παράγοντες έχουν σημαντικό ρόλο στην εμφάνιση της νόσου και συγκεκριμένα η επιρροή τους υπολογίζεται στο 50-65% 318,319,320,321. Η ΟΑ μπορεί να προκαλέσει βλάβες σε όλη την άρθρωση και στους περιαρθρικούς ιστούς. Στο χόνδρο αρχικά παρατηρείται πολλαπλασιασμός των χονδροκυττάρων, υπερτροφία των χονδροκυττάρων με ενδοκυττάρια παρουσία πρωτεογλυκανών και τέλος απόπτωση των χονδροκυττάρων και απώλεια της αγκρεκάνης. Αυτό οδηγεί σε διαταραχή της ισορροπίας μεταξύ του αναβολισμού και του καταβολισμού στον αρθρικό χόνδρο η οποία είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της εξωκυττάριας ουσίας και τη λειτουργία του ιστού 322. Ο χόνδρος γίνεται οιδηματώδης, οι σύσταση του σε πρωτεγλυκάνες μειώνεται, επασβεστώνεται, δημιουργούνται διαβρώσεις και ίνωση. Εκτός από τη γενετική προδιάθεση, ερεθίσματα τα οποία μπορεί να προκαλέσουν διαταραχή στη λειτουργία των κυττάρων του χόνδρου είναι η μη φυσιολογική φόρτιση μιας άρθρωσης, τα προϊόντα της α- ποδόμησης της εξωκυττάριας ουσίας, τα διαταραγμένα επίπεδα κυτταροκινών και αυξητικών παραγόντων 156. Ο υμένας είναι οιδηματώδης, αγγειοβριθής και διηθημένος αραιά από λεμφοκύτταρα και πλασματοκύτταρα. Η φλεγμονή στον υμένα οδηγεί σε αυξημένη παραγωγή των κυτταρικινών IL-1 και TNF, οι οποίες οδηγούν στην παραγωγή μονοξειδίου του αζώτου και μεταλλοπρωτεϊνασών. Η IL-6 και η μηχανική φόρτιση της αρθρώσεις επάγουν την έκφραση υποδοχέων των καταβολικών κυτταροκινών, οι οποίοι συνδέονται με την IL-1 και τον TNF και προκαλούν περαιτέρω καταστροφή 323. Παρατηρείται υπερτροφία των στρωματικών κυττάρων και αύξηση του κολλαγόνου, υποενδοθηλιακή και περιαγγειακή ίνωση. Στα οστά υπάρχει δραστηριότητα των οστεοβλαστών και των οστεοκλαστών, μειωμένη επιμετάλλωση, υποχονδρική πάχυνση και διείσδυση αγγείων στο υποχόνδριο. Στην πορεία της νόσου σχηματίζονται οστεόφυτα, δημιουργούνται υποχονδρικές κύστεις και μπορεί να υπάρχει οστεονέκρωση. Τα οστεόφυτα και η υποχονδρική σκλήρυνση ίσως είναι αποτέλεσμα της προσπάθειας του οργανισμού να αντισταθμίσει την έλλειψη του

72 64 χόνδρου, αν και αυτό δεν επιβεβαιώνεται στα ζωικά μοντέλα όπου οι αλλοιώσεις των οστών προηγούνται αυτών του χόνδρου 324. Το ανώμαλο νεοσχηματισθέν οστό προκαλεί περαιτέρω καταστροφή του αρθρικού χόνδρου. Η λειτουργία των χονδροκυττάρων και των εξωκυττάριων συστατικών του χόνδρου ελέγχεται από ορμόνες, κυτταροκίνες και αυξητικούς παράγοντες. Η IL-1 πιθανόν να έχει σημαντικό ρόλο στην παθογένεια της ΟΑ. Επίσης, υπάρχουν ενδείξεις από πειράματα σε ποντίκια για το ρόλο των πρωτεϊνασών και του οξειδίου του αζώτου στην παθογένεια της νόσου. Τέλος δυσλειτουργικές μορφές του ινσουλινόμορφου αυξητικού παράγοντα 1 (Insulin-like growth factor-i) και του ΤGF, οδηγούν σε μειωμένη παραγωγή χόνδρου 324. Ουσιαστικά οι οστεοαρθριτικές αλλοιώσεις βασίζονται στην ανισορροπία στη σύνθεση και στον καταβολισμό από τα κύτταρα του αρθριτιδικού χόνδρου. Τα ερεθίσματα στα κύτταρα του χόνδρου προέρχονται από τον εξωκυττάριο χώρο του χόνδρου, από εξωτερικούς διαμεσολαβητές και από μηχανικές επιρροές. Οι γενετικές ανωμαλίες του συνδετικού ιστού και η ηλικία σε συνδυασμό με το αυξημένο σωματικό βάρος, τα τραύματα, τις μηχανικές φορτίσεις, την εναπόθεση κρυστάλλων και τη μυϊκή αδυναμία αλληλεπιδρούν στην εμφάνιση της ΟΑ. Φλεγμονώδεις και ορμονικοί παράγοντες συμβάλλουν στην εξέλιξη της, συμβάλλοντας στην καταστροφή των αρθρώσεων Θεραπεία της οστεοαρθρίτιδας Η θεραπεία της ΟΑ είναι κυρίως συμπτωματική. Για την αντιμετώπιση του πόνου χρησιμοποιούνται απλά αναλγητικά, δηλαδή παρακεταμόλη 325, ναρκωτικά αναλγητικά και μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη 326. Τα φάρμακα με πιθανά οφέλη στη δομή του χόνδρου, τα οποία χρησιμοποιούνται ως τροποποιητικά της νόσου φάρμακα, είναι η διασερίνη 327, η γλυκοζαμίνη 328 και η θειϊκή χονδροϊτίνη 329. Ο πόνος και λειτουργικότητα των αρθρώσεων μπορεί να βελτιωθεί με ενδοαρθρικές ενέσεις κορτιζόνης 330 και υαλουρονικού οξέος 331. Τα τοπικά σκευάσματα καψακαίνης και ΜΣΑΦ χρησιμοποιούνται επίσης στην αντιμετώπιση του πόνου. Σε περιπτώσεις στις οποίες η αρθρική καταστροφή είναι προχωρημένη και ο πόνος δεν ελέγχεται υπάρχει ένδειξη για χειρουργική παρέμβαση. Ο ρόλος της φυσικοθεραπείας και της γυμναστικής 332 είναι αδιαμφισβήτητος στη βελτίωση των συμπτωμάτων. Η ενδυνάμωση του μυϊκού ιστού βοηθά στην καλύτερη στάση του σώματος, στην καλύτερη ισορροπία και στη λειτουργικότητα των αρθρώσεων. Η απώλεια βάρους 333 και η χρήση μηχανικών βοηθημάτων όπως μπαστούνι και κατάλληλων παπουτσιών μπορεί να βοηθήσει τους ασθενείς.

73 65 A4 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 4.1. Τα βιομόρια CD26, CD45 και το ένζυμο ADA στη Ρευματοειδή Αρθρίτιδα και στο Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο Η συμμετοχή του CD26, του CD45 και της ADA στη διαδικασία της φλεγμονής οδήγησε στη διερεύνηση του ρόλου αυτών των μορίων στα συστηματικά αυτοάνοσα νοσήματα. Η ρευματοειδής αρθρίτιδα εκδηλώνεται όταν ένα άγνωστο προς το παρόν αντιγόνο οδηγήσει στην ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων μέσω του HLA, με αποτέλεσμα την έκκριση κυτταροκινών, την ενεργοποίηση πρωτεϊνασών και τελικά την καταστροφή του αρθρικού χόνδρου. Ο Συστηματικός Ερυθηματώδης Λύκος χαρακτηρίζεται από αυξημένη παραγωγή αυτοαντισωμάτων, τη δημιουργία και εναπόθεση ανοσοσυμπλεγμάτων και υπερλειτουργία Β λεμφοκυττάρων με αυξημένη απαντητικότητα. Η λειτουργία, ο πολλαπλασιασμός και η απαντητικότητα σε αντιγόνα για τα οποία υπάρχει μνήμη των Τ λεμφοκυττάρων είναι διαταραγμένη. Τα δύο αυτά νοσήματα έχουν ανοσολογικές διαταραχές στις οποίες περιλαμβάνονται οι διαταραχές στην κυτταρική ανοσία. Τα βιομόρια CD26 και CD45 εκφράζονται στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων και έχουν σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση τους, ενώ η ADA αυξάνει τον πολλαπλασιασμό των ενεργοποιημένων Τ λεμφοκυττάρων. Η φυσική και λειτουργική συσχέτιση των βιομορίων στην επιφάνεια των κυττάρων οδήγησε στην μελέτη τους στους ασθενείς με ΡΑ και ΣΕΛ. Το CD26, αν και είναι ένα μόριο με αρκετές μελέτες στη διεθνή βιβλιογραφία, είναι άγνωστο ακόμα πως μεταφέρει τα ενδοκυττάρια μηνύματα. Το μόριο δεσμεύει την ADA, έχει δράση πεπτιδάσης 6, συμμετέχει στην προσκόλληση των κυττάρων 4,12,20, στην ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων 3,22 και στην απόπτωση 33. Ως πεπτιδάση απενεργοποιεί αλλά και μεταβάλλει τις κυτταροκίνες, τις χημειοκίνες και άλλους παράγοντες ενισχύοντας μερικές φορές τις βιολογικές τους ιδιότητες 11,12. Η αναστολή της ενζυμικής του δραστηριότητας οδηγεί σε μείωση στην παραγωγή ιντερλευκίνης-2, ινερλευκίνης-6, ι- ντερλευκίνης-1β και ιντερφερόνης-γ 133,14,15. Το CD26 φαίνεται ότι βελτιώνει τη μεταναστευτική συμπεριφορά των Τ λεμφοκυττάρων. Το σύμπλεγμα CD26/ADA πιθανό να έχει σημαντικό ρόλο στην προσκόλληση των Τ λεμφοκυττάρων με άλλα κύτταρα με τη συμμετοχή του υποδοχέα την αδενοσίνης Α Στα ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα παρατηρείται αυξημένη έκφραση του μορίου 3,22. Η έκφραση του μάλιστα αποτελεί δείκτη παραγωγής ινερλευκίνης-2. Επιπλέον έχει ρόλο στην ανάπτυξη των δραστικών λειτουργιών των CD8 Τ λεμφοκυττάρων. Η συνδιέγερση μέσω του CD26 έχει σε μεγάλο βαθμό ο- μοιότητες με τη διέγερση μέσω του συμπλέγματος TCR/CD3 3,29. Ο τρόπος με τον οποίο γίνεται η συνδιέγερση και μεταφέρονται τα μηνύματα ενδοκυτταρίως δεν είναι ακόμα γνωστός. Το μόριο όμως ενισχύει τις απαντήσεις των κυττάρων στα αντιγόνα και αυξάνει την παραγωγή κυτταροκινών και τον πολλαπλασιασμό 3. Η φυσική συσχέτιση του CD26 με το CD45RO και με την ADA θέτουν το ερώτημα κατά πόσο η συνδιέγερση γίνεται μέσω αυτών των μορίων 30. Η αλληλεπίδραση των CD26 και CD45RO βελτιώνει την ενδοκυττάρια μεταφορά του μηνύματος μέσω του συμπλέγματος TCR/CD3 3. Η δέσμευση της ADA από το CD26 οδηγεί στον πολλαπλασιασμό των Τ λεμφοκυττάρων και σε αυξημένη παραγωγή κυτταροκινών 3,31. Ένας άλλος δρόμος συνδιέγερσης, ο οποίος είναι υπό μελέτη, είναι αυτός της καβεολίνης 20 ο οποίος οδηγεί σε αύξηση της έκφρασης του CD86 στα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα.

74 Ο ρόλος του CD45 στην ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων είναι γνωστός. Το CD45 ως φωσφατάση τυροσίνης καθιστά το ανοσολογικό σύμπλεγμα TCR ικανό να δεχτεί και να προωθήσει ενδοκυτταρίως μηνύματα 96. Η ισομορφή του μορίου, αν θα είναι δηλαδή RA, RB, RO, ή RC φαίνεται να έχει κάποια σημασία όσον αφορά στην αποτελεσματικότητα στη μεταφορά του μηνύματος 89,109,110. Επιπλέον η ισομορφή του μορίου πιθανόν να έχει κάποιο ρόλο στη ρύθμιση της δράσης του CD Η δραστικότητα του μορίου ρυθμίζεται και με το διμερισμό. Οι μεγαλύτερες ισομορφές πχ RA σχηματίζουν δυσκολότερα ομοδιμερή όποτε τα κύτταρα στα οποία εκφράζονται είναι έτοιμα για ενεργοποίηση. Αντίθετα οι μικρότερες ισομορφές πχ RO σχηματίζουν ευκολότερα ομοδιμερή. Έτσι τα προς ενεργοποίηση Τ λεμφοκύτταρα έχουν αυξημένη παρουσία μεγαλύτερων ισομορφών των CD45RA και CD45RB οι οποίες μετά την ενεργοποίηση αντικαθιστούνται από τις μικρότερες ισομορφές 113, την ισομορφή CD45RO 91,92. Η δεαμινάση της αδενοσίνης, ADA, έχει υπόστρωμα την αδενοσίνη 66, η οποία έ- χει σημαντικό ρόλο στην ανοσοκαταστολή 5. Η ADA συνδέεται με το CD26 χωρίς το ένα μόριο να επηρεάζει την ενζυμική δραστηριότητα του άλλου 3,67. Η σύνδεση των δύο μορίων φαίνεται από μελέτες ότι έχει ρόλο στην ενδοκυττάρια μεταγωγή των μηνυμάτων 31,71. Ο μηχανισμός της μεταφοράς των μηνυμάτων είναι άγνωστος. Το μόριο στερείται κυτταροπλασματικής και διαμεμβρανικής περιοχής και η κυτταροπλασματική περιοχή του CD26 είναι μικρή για ενδοκυττάρια μεταφορά μηνυμάτων. Η ADA αυξάνει τον πολλαπλασιασμό των ενεργοποιημένων Τ λεμφοκυττάρων και βελτιώνει τη διαφοροποίηση των μονοκυττάρων 64,71. Από τη διεθνή βιβλιογραφία η έκφραση του μορίου CD26 στα CD4 Τ λεμφοκύτταρα στους ασθενείς με ΡΑ είναι αυξημένη 30 ενώ στα Τ λεμφοκύτταρα υπερισχύει η ισομορφή CD45RO έναντι της CD45RA 140. Στο ΣΕΛ τα CD4CD26 Τ λεμφοκύτταρα είναι μειωμένα 46, τα CD4CD45RA Τ λεμφοκύτταρα ήταν επίσης μειωμένα ενώ τα CD4CD45RARO αυξημένα 137. Τα αποτελέσματα απόν τη μελέτη της ενζυμικής ενεργότητας της tada και της ADA2 στη ΡΑ είναι αντικρουώμενα. Γενικά όμως παρατηρήθηκε αύξηση της ενζυμικής ενεργότητας της tada και της ADA2 στους ασθενείς με ΡΑ και με ΣΕΛ 77,79,80,81,82. Οι μελέτες στη διεθνή βιβλιογραφία είναι περιορισμένες και έγιναν σε μικρό αριθμό ασθενών για την εξαγωγή συμπερασμάτων με ασφάλεια. 66

75 Ανασκόπηση της βιβλιογραφίας Τα μόρια CD26, CD45RA, CD45RO και το ένζυμο ADA είναι σαφές ότι συμμετέχουν με ποικίλους τρόπους στην ανοσιακή απάντηση. Στα αυτοάνοσα ρευματικά νοσήματα παρατηρούνται ανοσιακές διαταραχές οι οποίες αφορούν την κυτταρική, την χυμική αλλά και την παθητική ανοσία. Σε αυτή τη διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν δύο κύρια αυτοάνοσα ρευματικά νοσήματα, η ρευματοειδής αρθρίτιδα και ο συστηματικός ερυθηματώδης λύκος, τα οποία έχουν διαφορετική παθοφυσιολογία. Στη παθοφυσιολογία της ΡΑ τα Τ λεμφοκύτταρα και η κυτταρική ανοσία 156 έχουν κεντρικό ρόλο, ενώ στο ΣΕΛ κεντρικό ρόλο φαίνεται να έχει και το Β λεμφοκύτταρο, η κυτταρική, η χυμική και η παθητική ανοσία 266,270-1, Στη διδακτορική διατριβή εξετάστηκαν το CD26, το CD45RA και το CD45RO σε CD4 και CD8 Τ λεμφοκύτταρα και η ενζυμική ενεργότητα της ADA (tada και ADA2) στον ορό ασθενών με ρευματοειδή αρθρίτιδα με διαφορετική ενεργότητα και σε διαφορετική φαρμακευτική αγωγή, στον ορό ασθενών με ΣΕΛ με διαφορετική ενεργότητα του νοσήματος και σε ομάδα ασθενών με ΟΑ (ομάδα ελέγχου). Στην διεθνή βιβλιογραφία υπάρχει περιορισμένος αριθμός μελετών για τα μόρια CD26, CD45RA, CD45RO και ADA στα ρευματικά νοσήματα. Οι περισσότερες έγιναν σε μικρό αριθμό ασθενών και αφορούσαν το διαλυτό CD26 ενώ ελάχιστες αφορούσαν την έκφραση του μορίου στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων. Η ενζυμική ενεργότητα της ADA αν και μελετήθηκε περισσότερο, τα αποτελέσματα είναι αντικρουόμενα, ενώ οι μελέτες για την έκφραση των μορίων CD45RA και CD45RO στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων είναι περιορισμένες σε σχέση με τα υπό μελέτη νοσήματα. Στους πίνακες 1 και 2, φαίνονται τα αποτελέσματα των μελετών οι οποίες έγιναν για την έκφραση του μορίου CD26 στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων και για την ενζυμική ενεργότητα της ADA (tada, ADA1, ADA2) στον ορό σε ενήλικες ασθενείς με ΡΑ και ΣΕΛ. Εργασίες ΡΑ ΟΕ ΟΑ ΣΕΛ C. Muscat et al Έκφραση του CD26 στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων CD3CD26 CD4CD ΡΑ>ΟΕ (%) σε Ενεργό ΡΑ ΡΑ>ΟΕ (%) R. Gerli et al A. Mizokami et al Wong PT et al ΡΑ>ΟΕ (%) 7 7 ΡΑ>ΟΕ ΣΕΛ<ΟΕ Πίνακας 1: Αποτελέσματα εργασιών οι οποίες αφορούσαν την έκφραση του CD26 στα Τ λεμφοκύτταρα σε ασθενείς με ΡΑ και ΣΕΛ. ΡΑ: ρευματοειδής αρθρίτιδα, ΣΕΛ: συστηματικός ερυθηματώδης λύκος, ΟΑ: οστεοαρθρίτιδα, ΟΕ: ομάδα ελέγχου. (Με γκρίζο σημειώνονται οι εργάσίες οι οποίες δημοσιεύτηκαν μέτα την ημερομηνία ορισμού του θέματος της διδακτορικής διατριβής). Στον πίνακα 3 καταγράφονται τα αποτελέσματα των μελετών οι οποίες έγιναν σε ασθενείς με ΡΑ και ΣΕΛ για την έκφραση των μορίων CD45RA και CD45RO στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων.

76 68 Η έρευνα για τις μελέτες αυτές έγινε στις διαδικτυακές ιατρικές βιβλιοθήκες PubMed, Medline και Cochrane για όλα τα έτη μέχρι και σήμερα. Εργασίες ΡΑ ΟΕ ΟΑ ΣΕΛ Ενζυμική ενεργότητα ADA tada ADA2 H Yuksel and TF Akoglu ΡΑ ΟΑ ΡΑ ΟΕ Oscar J Cordero et 335 al 2001 ΡΑ ΟΕ (ΡΑ>ΟΕ? χωρίς στατ. Σημ) Sari RA et al ΡΑ>ΟΕ ΡΑ>ΟΕ r + με DAS H. Surekha Rani et al ΡΑ>ΟΕ Burak Erer et al Vasanthi Pallinti et al Zamani B et al ΡΑ>ΟΕ όχι r με DAS28 ΡΑ>ΟΕ + r με DAS28 Stancíková M et al ΣΕΛ>ΟΕ r + με ΣΕΛ>ΟΕ?? ECLAM Seyithan Taysi et al ΣΕΛ>ΟΕ σε ΣΕΛ>ΟΕ ενεργό ΣΕΛ Saghiri R et al ΣΕΛ>ΟΕ ΣΕΛ>ΟΕ σε ενεργό ΣΕΛ Πίνακας 2: Αποτελέσματα εργασιών οι οποίες αφορούσαν την ενζυμική ενεργότητα της ADA σε ασθενείς με ΡΑ και ΣΕΛ. ΡΑ: ρευματοειδής αρθρίτιδα, ΣΕΛ: συστηματικός ερυθηματώδης λύκος, ΟΑ: οστεοαρθρίτιδα, ΟΕ: ομάδα ελέγχου, r: συσχέτιση. (Με γκρίζο σημειώνονται οι εργάσίες οι οποίες δημοσιεύτηκαν μέτα την ημερομηνία ορισμού του θέματος της διδακτορικής διατριβής). Μελέτη ΡΑ ΟΕ ΟΑ ΣΕΛ Έκφραση του CD45στα Τ λεμφοκύτταρα CD45RA CD45RO Mamoune A RO>RA et al 94? 2000 T Takeuchi Ενεργός ΣΕΛ>ΟΕ et al ΣΕΛ<ΟΕ % (CD45RO + CD45RARO) CD4CD45RA CD4CD45RO CD8CD45RA CD8CD45RO Neidhart M ΣΕΛ<ΟΕ ΣΕΛ>ΟΕ ΣΕΛ ΟΕ ΣΕΛ ΟΕ et al Πίνακας 3: Αποτελέσματα μελετών οι οποίες αφορούν την έκφραση του CD45 και των ισομορφών του στα Τ λεμφοκύτταρα σε ασθενείς με ΡΑ και με ΣΕΛ. ΡΑ: ρευματοειδής αρθρίτιδα, ΣΕΛ: συστηματικός ερυθηματώδης λύκος, ΟΑ: οστεοαρθρίτιδα, ΟΕ: ομάδα ελέγχου

77 69 Β. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ B1 Πειραματικό πρωτόκολο 1.1. Ασθενείς και Μέθοδοι 1.2. Κλινική και εργαστηριακή αξιολόγηση ασθενών 1.3. Κυτταρομετρία ροής 1.4. Ενζυμική ενεργότητα της ADA 1.5. Στατιστική ανάλυση B2 Αποτελέσματα 2.1. Δημογραφικά στοιχεία και ιστορικό ασθενών 2.2. Ηλικία 2.3. Δείκτες φλεγμονής και Ενεργότητα νόσου 2.4. Κυτταρομετρία ροής 2.5. Ενζυμική ενεργότητα tada και ADA2 B3 3.1 Σύγκριση αποτελεσμάτων στις ομάδες Σύγκριση ηλικίας στις ομάδες 3.1 Η έκφραση των μορίων CD3CD4 και CD3CD8στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων στις υπό μελέτη ομάδες 3.1 Σύγκριση της ομάδας της Ρευματοειδούς Αρθρίτιδας με την ομάδα ελέγχου 3.1 Σύγκριση της ομάδας του Συστηματικού Ερυθηματώδους Λύκου με την ομάδα ελέγχου 3.1 Σύγκριση αποτελεσμάτων στις τρεις κύριες ομάδες (ΡΑ, ΣΕΛ, Μάρτυρες) 3.1 Αποτελέσματα συσχέτισης στην ομάδα των ασθενών με Ρευματοειδή Αρθρίτιδα 3.1 Αποτελεσματα συσχέτισης στην ομάδα των ασθενών με Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο 3.1 Αποτελέσματα συσχέτισης στην ομάδα ελέγχου (ασθενείς με Οστεοαρθρίτιδα) B4 Συμπεράσματα 4.1 Συγκεντρωτικοί πίνακες αποτελεσμάτων 4.2 Σύνοψη αποτελεσμάτων 4.3 Συζήτηση 4.4 Συμπεράσματα

78 70

79 71 B1 Πειραματικό πρωτόκολλο 1.1. Ασθενείς και μέθοδοι Η μελέτη των μορίων CD26, CD45RA και CD45RO στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων και της ολικής ADA, ADA1 και ADA2 στον ορό, έγινε σε ασθενείς και σε ομάδα ελέγχου. Πέρα από τον καθορισμό των ομάδων ανάλογα με το νόσημα, έγινε και περαιτέρω διαχωρισμός σε υποομάδες ανάλογα με την ενεργότητα του νοσήματος και τη φαρμακευτική αγωγή των ασθενών Ομάδες Στη μελέτη συμμετείχαν ασθενείς με Ρευματοειδή Αρθρίτιδα και Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο, ενώ η ομάδα ελέγχου ήταν ασθενείς με Οστεοαρθρίτιδα. Συμπεριλήφθηκαν ασθενείς από τη Ρευματολογική Κλινική του Γ.Ν.Θ. Άγιου Παύλου και από το εξωτερικό Ρευματολογικό Ιατρείο της Δ Παθολογικής Κλινικής του Γ.Ν.Θ. Ιπποκράτειο. Όλοι οι ασθενείς ενημερώθηκαν για τη μελέτη και έδωσαν γραπτή συγκατάθεση. Η επιλογή των ασθενών έγινε με βάση τα ακόλουθα: 1. Να πληρούν τα κριτήρια διάγνωσης του Αμερικανικού Κολλεγίου Ρευματολογίας του 1987 για τη Ρευματοειδή Αρθρίτιδα και του 1997 για το Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο 2. Να μην έχουν άλλο αυτοάνοσο συστηματικό νόσημα ή νόσημα στο οποίο επηρεάζεται το ανοσοποιητικό σύστημα όπως σακχαρώδης διαβήτης τύπου ΙΙ, αυτοάνοση θυρεοειδίτιδα, σύνδρομο Sjögren κτλ. 3. Να μην έχουν ενεργό λοίμωξη 4. Να είναι ενήλικες Πλήρες ιστορικό, δημογραφικά στοιχεία και η χρονιότητα (έτος διάγνωσης) του νοσήματος καταγράφηκαν για όλους τους ασθενείς. Αξιολογήθηκαν κλινικά και λήφθηκε αίμα από 58 ασθενείς, εκ των οποίων οι 33 είχαν Ρευματοειδή Αρθρίτιδα, οι 10 Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο και οι 15 οι οποίοι αποτέλεσαν την ομάδα των μαρτύρων είχαν ΟΑ ή ήταν φαινομενικά υγιείς. Η ομάδα της ρευματοειδούς αρθρίτιδας αποτελείτο από 33 ασθενείς, 28 γυναίκες και 5 άνδρες. Ανάλογα με την τιμή του Ρευματοειδή Παράγοντα σχηματίστηκαν δύο ο- μάδες: οι οροθετικοί ασθενείς και οι οροαρνητικοί. Ανάλογα με τον δείκτη ενεργότητας της νόσου DAS28 με CRP σχηματίστηκαν 4 υποομάδες: I. DAS28< 2,6 νόσος σε ύφεση, ασθενείς 11 II. DAS28 2,6-3,2 μικρή ενεργότητα νόσου, ασθενείς 7 III. DAS28 3,2-5,1 μέτρια ενεργότητα νόσου, ασθενείς 13 IV. DAS28> 5,1 σοβαρή ενεργότητα νόσου, ασθενείς 2 (πίνακας 1) Με τη χρήση της ΤΚΕ για την εξαγωγή του δείκτη DAS28 διαφοροποιούνται οι ομάδες ως εξής: I. DAS28< 2,6 νόσος σε ύφεση, ασθενείς 5

80 72 II. DAS28 2,6-3,2 μικρή ενεργότητα νόσου, ασθενείς 7 III. DAS28 3,2-5,1 μέτρια ενεργότητα νόσου, ασθενείς 15 IV. DAS28> 5,1 σοβαρή ενεργότητα νόσου, ασθενείς 6 (πίνακας 1) DAS28 με CRP Αριθμός ασθενών DAS28< 2,6 DAS28: 2,6-3,2 DAS28: 3,2-5,1 DAS28> 5,1 Ασθενείς σε βιολογικό παράγοντα Ασθενείς μόνο σε κορτιζόνη Ασθενείς σε DMARDs Ασθενείς χωρίς αγωγή Σύνολο DAS28 με ΤΚΕ Αριθμός ασθενών DAS28< 2,6 DAS28: 2,6-3,2 DAS28: 3,2-5,1 DAS28> 5,1 Ασθενείς σε βιολογικό παράγοντα Ασθενείς μόνο σε κορτιζόνη Ασθενείς σε DMARDs Ασθενείς χωρίς αγωγή Σύνολο Πίνακας 1: Υποομάδες ασθενών με ΡΑ με βάση το δείκτη ενεργότητας DAS28 με CRP και DAS28 με ΤΚΕ Επιπλέον, η αρχική ομάδα χωρίστηκε σε τέσσερεις ομάδες ανάλογα με τη φαρμακευτική αγωγή στην οποία βρισκόταν οι ασθενείς κατά την αιμοληψία: 1. Ασθενείς σε αγωγή μόνο με κορτικοειδή, 4 2. Ασθενείς σε ανοσοτροποποιητικά DMARDs, 12 (σε λεφλουνομίδη 4, σε μεθοτρεξάτη 6) 3. Ασθενείς σε βιολογικό παράγοντα, 14 (Anakinra 6, αντι-tnf 5, Abatacept 2, Retuximab 1) 4. Ασθενείς χωρίς φαρμακευτική αγωγή, 3 Στην κάθε ομάδα έγινε περεταίρω ανάλυση ανάλογα με το δείκτη ενεργότητας DAS28 (πίνακας 1). Στην ομάδα του συστηματικού ερυθηματώδους λύκου συμπεριλήφθηκαν 10 α- σθενείς, 9 γυναίκες και 1 άντρας. Χωρίστηκαν σε τρείς ομάδες ανάλογα με την ενεργότητα της νόσου η οποία αξιολογήθηκε με το δείκτη SLEDAI: 1. Νόσος σε ύφεση, SLEDAI< 2, ασθενείς 5 2. Νόσος σε μικρή ενεργότητα SLEDAI 2-5, ασθενής 1 3. Ενεργός νόσος (μικρή ως μεγάλη ενεργότητα), SLEDAI> 5, ασθενείς 4 Επιπλέον, οι ασθενείς χωρίστηκαν σε δύο ομάδες ανάλογα με την νεφρική προσβολή 1. Ασθενείς με νεφρική προσβολή, (3, 2 με ενεργό σπειραματονεφρίτιδα, 1 χωρίς) 2. Ασθενείς χωρίς νεφρική προσβολή (7) Στην ομάδα ελέγχου συμπεριλήφθηκαν ασθενείς με οστεοαρθρίτιδα και υγιείς ε- θελοντές οι οποίοι πληρούσαν το δεύτερο, το τρίτο και τέταρτο κριτήριο επιλογής. Λήφθηκαν δείγματα από 15 ασθενείς εκ των οποίων 9 είχαν οστεοαρθρίτιδα και 6 ήταν υγιείς εθελοντές.

81 73 Αναλυτική περιγραφή ερευνητικών μεθόδων 1.2. Κλινική και εργαστηριακή αξιολόγηση ασθενών Ασθενείς με Ρευματοειδή Αρθρίτιδα Από όλους τους ασθενείς με ΡΑ λήφθηκε λεπτομερές ιστορικό για τις κλινικές εκδηλώσεις της νόσου, τη φαρμακευτική αγωγή στην οποία βρίσκονται αλλά και τη φαρμακευτική αγωγή την οποία είχαν λάβει στο παρελθόν, για άλλα προβλήματα υγείας και τη θεραπεία στην οποία βρίσκονται για αυτά και για τυχούσα ενεργό λοίμωξη. Στην κλινική εξέταση εκτιμήθηκε το καρδιοαναπνευστικό σύστημα, το ήπαρ και ο σπλήνας και η γενική κατάσταση της υγείας τους. Οι ασθενείς εξετάστηκαν για επώδυνες και οιδηματώδεις αρθρώσεις, συγκάμψεις, μειωμένη κινητικότητα, παραμορφώσεις, ρευματικά οζίδια και άλλες δερματικές εκδηλώσεις και πνευμονική προσβολή. Ρωτήθηκαν για τη διάρκεια της πρωινής δυσκαμψίας και για τη λειτουργικότητα τους. Για την αξιολόγηση της λειτουργικότητας χρησιμοποιήθηκε το ερωτηματολόγιο HAQ. Επιπλέον χρησιμοποιήθηκε η οπτική κλίμακα VAS για την αξιολόγηση του πόνου και ο δείκτης GH για την αξιολόγηση της γενικής κατάστασης του ασθενούς DAS28 (Disease Activity Score) Ο DAS28 είναι ένας δείκτης αξιολόγησης της ενεργότητας της νόσου. Για τον υπολογισμό του χρειάζεται ο αριθμός των επώδυνων και οιδηματωδών αρθρώσεων, ένας εργαστηριακός δείκτης φλεγμονής, ο οποίος μπορεί να είναι η ΤΚΕ ή η CRP και η γενική κατάσταση υγείας του ασθενούς, GH 341. Οι αρθρώσεις οι οποίες εκτιμούνται για την εξαγωγή του DAS28 είναι 28 και είναι: οι ώμοι, οι αγκώνες, οι πηχεοκαρπικές, οι μετακαρπιοφαλαγγικές, οι εγγύς μεσοφαλαγγικές των άκρων χειρών και τα γόνατα (εικόνα 1). Αν συμπεριληφθεί ο δείκτης GH σχηματίζεται ο DAS28 4v, με 4 μεταβλητές (4 variables), αν δεν συμπεριληφθεί τότε έχουμε DAS28 3v, με 3 μεταβλητές 168. Ο DAS28 παρόλο που είναι αρκετά αξιόπιστος δείκτης ενεργότητας της νόσου, εξαρτάται από την εμπειρία του εξεταστή στην εκτίμηση της αρθρίτιδας. Επιπλέον, αξιολογεί 28 αρθρώσεις του ανθρώπινου σώματος για μια νόσο η οποία μπορεί να προσβάλει σχεδόν όλες τις αρθρώσεις του ανθρώπινου σώματος. Η χρήση του δεν υποκαθιστά τη συνολική κλινική εκτίμηση του γιατρού. Είναι όμως ένα χρήσιμο εργαλείο στα χέρια του ιατρού για την παρακολούθηση της πορείας της νόσου. Οι μαθηματικοί τύποι στους οποίους βασίζεται ο υπολογισμός του DAS28 είναι οι παρακάτω 342 : DAS28-4(CRP) = 0.56*sqrt (TJC28) *sqrt (SJC28) *ln (CRP+1) *GH DAS28-3(CRP) = [0.56*sqrt (TJC28) *sqrt (SJC28) *ln (CRP+1)] * DAS28-4(ESR) = 0.56 * sqrt (tender28) * sqrt (swollen28) * ln (ESR) * GH DAS28-3(ESR) = [0.56 * sqrt (tender28) * sqrt (swollen28) * ln (ESR)] * Όπου sqrt: τετραγωνική ρίζα, ln: φυσικός λογάριθμος, TJC: αριθμός επώδυνων αρθρώσεων, SJC: αριθμός οιδηματωδών/φλεγμαινουσών αρθρώσεων

82 74 Ανάλογα με τη τιμή του DAS28 οι ασθενείς με ΡΑ θεωρούνται σε ύφεση, με μικρή, με μέτρια ή με σοβαρή ενεργότητα. Αν DAS28< 2,6 η νόσος είναι σε ύφεση, για DAS28 από 2,6 μέχρι 3,2 έχει μικρή ενεργότητα, για DAS28 από 3,2 μέχρι 5,1 έχει μέτρια, ενώ για DAS28> 5,1 σοβαρή ενεργότητα 343. Εικόνα 1: Οι 28 αρθρώσεις οι οποίες αξιολογούνται για την εξαγωγή του δείκτη DAS Ερωτηματολόγιο MHAQ (Modified Health Assessment Questionnaire) Για την εκτίμηση της λειτουργικής ικανότητας των ασθενών χρησιμοποιήθηκε το ερωτηματολόγιο MHAQ. Με αυτό το ερωτηματολόγιο γίνεται εκτίμηση της λειτουργικής ικανότητας των ασθενών την εβδομάδα η οποία προηγείται της κλινικής εξέτασης. Οι ασθενείς απαντoύν σε 8 ερωτήσεις, οι οποίες αφορούν καθημερινές, συνήθεις δραστηριότητες, σημειώνοντας το βαθμό δυσκολίας για την κάθε δραστηριότητα (πίνακας 1). Το συνολικό άθροισμα διαιρείται δια του 8 και το αποτέλεσμα, το οποίο προκύπτει, εκφράζει την τιμή του HAQ. Ο δείκτης αυτός, ως δείκτης λειτουργικής ικανότητας, επηρεάζεται τόσο από την ενεργότητα της νόσου όσο και από την αρθρική καταστροφή. Στα αρχικά στάδια της νόσου επηρεάζεται περισσότερο από την ενεργότητα ενώ με την πάροδο του χρόνου από τις μόνιμες αλλοιώσεις των αρθρώσεων.

83 75 HAQ (Health Assessment Questionnaire) Όνομα.. Ημερομηνία Σημειώστε την απάντηση που περιγράφει καλύτερα τη συνήθη ικανότητα σας ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΠΕΡΑ- ΣΜΕΝΗ ΕΒΔΟΜΑΔΑ Χωρίς Με μικρή δυγάλη να το Με με- Ανίκανος καμία ΜΠΟΡΕΙΤΕ ΝΑ: Σύνολο δυσκολία σκολία δυσκολία κάνω (0) (1) (2) (3) Ντυθείτε μόνος/η, να δέσετε τα κορδόνια σας και να κουμπωθείτε; Ξαπλώσετε και να σηκωθείτε από το κρεβάτι; Σηκώσετε ένα γεμάτο φλιτζάνι στο στόμα σας; Περπατήσετε σε επίπεδο έδαφος; Πλύνετε και να σκουπίσετε το σώμα σας; Σκύψετε για να πάρετε ένα ρούχο από το πάτωμα; Ανοίξετε και να κλείσετε τις βρύσες; Μπείτε και να βγείτε από το αυτοκίνητο; Σημειώστε την απάντηση που σας εκφράζει για την κάθε ερώτηση Πίνακας 1: Ερωτηματολόγιο λειτουργικής ικανότητας HAQ Το τροποποιημένο ερωτηματολόγιο ΜHAQ το οποίο έχει 8 ερωτήσεις 344, βασίζεται στο ερωτηματολόγιο HAQ του πανεπιστημίου Stanford (James F. Fries 1978), το ο- ποίο έχει 20 ερωτήσεις 345. Το ελληνικό ερωτηματολόγιο είναι εγκεκριμένο από το Health Outcomes Group GH (general health) και VAS (visual analogue scale) Ο δείκτης GH χρησιμοποιείται για την εκτίμηση της συνολικής υγείας του ασθενούς 341 στην εξαγωγή του DAS28. Η ερώτηση την οποία καλείται να απαντήσει ο ασθε-

84 76 νής είναι: «σε μια κλίμακα από το 0 ως το 100, με μηδέν το καλύτερο επίπεδο υγείας το οποίο είχες ποτέ και 100 το χειρότερο, που θα τοποθετούσες τον εαυτό σου την τελευταία εβδομάδα;» Ο δείκτης είναι φανερό ότι είναι υποκειμενικός και επηρεάζεται εκτός από το βασικό νόσημα, το οποίο στην περίπτωση αυτή είναι η ΡΑ και από άλλα συνυπάρχοντα νοσήματα, από εκφυλιστικά προβλήματα των αρθρώσεων, από την ηλικία και φυσικά από την ψυχολογική κατάσταση του ασθενούς. Ο δείκτης συνολικής υγείας εκφράζεται σε ποσοστό. Με το δείκτη VAS μπορεί να εκτιμηθεί ο πόνος από τον ασθενή αλλά και άλλοι παράμετροι όπως η κλινική εικόνα του ασθενούς από την οπτική πλευρά του γιατρού. Η οπτική αναλογική κλίμακα στην εργασία αυτή χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση του πόνου από τον ασθενή. Ο δείκτης είναι αντίστοιχος του δείκτη συνολικής υγείας του α- σθενούς με τη διαφορά ότι επικεντρώνεται στο πόνο και υπάρχει οπτικό βοήθημα. Στον ασθενή παρουσιάζεται μια αριθμημένη ή όχι γραμμή 10cm, όπου 0 είναι καθόλου πόνος και 10 πολύ έντονος πόνος και ο ασθενής καλείται να βάλει μια κάθετη γραμμή στο σημείο το οποίο τον εκφράζει για την προηγούμενη εβδομάδα 156. Όπως και ο δείκτης GH είναι υποκειμενικός. Εκφράζεται σε νούμερα από 0 έως 10 ή μετά από αναγωγή στο 100, σε ποσοστά Εργαστηριακή εκτίμηση ασθενών με ρευματοειδή αρθρίτιδα Η εργαστηριακή εκτίμηση της φλεγμονής στους ασθενείς με ΡΑ έγινε με την Ταχύτητα Καθίζησης Ερυθρών (ΤΚΕ) και την πρωτεΐνη οξείας φάσης CRP (C reactive protein). Επιπλέον εξετάστηκε ο ρευματοειδής παράγοντας και τα έμμορφα στοιχεία του αίματος των ασθενών με γενική αίματος. Οι εξετάσεις έγιναν στο Εργαστήριο Βιοπαθολογίας του Γ.Ν.Θ. Άγιος Παύλος στα πλαίσια της νοσηλείας των ασθενών ή της παρακολούθησης τους στα Εξωτερικά Ιατρεία. Μικρός αριθμός ασθενών έφερε εξετάσεις από άλλα εργαστήρια Βιοπαθολογίας. Η ΤΚΕ αποτελεί ένα αξιόπιστο δείκτη οξείας ή χρόνιας φλεγμονής. Αυξάνεται σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις όπως λοιμώξεις, κακοήθειες, ρευματικά νοσήματα αλλά και σε μακροκυττάρωση, υπερχοληστεριναιμία κτλ. Η χρήση της είναι ενδεικτική της ύπαρξης και της έντασης μιας φλεγμονώδους διεργασίας, άλλα δεν είναι διαγνωστική για συγκεκριμένη νόσο λόγω της χαμηλής ειδικότητας της 346. Οι μεταβολές της όμως, χρησιμεύουν στην παρακολούθηση της πορείας της Ρευματοειδούς αρθρίτιδας αλλά και στην εκτίμηση της έντασης της φλεγμονής μια δεδομένη στιγμή 347. Η ΤΚΕ έχει την ιδιομορφία ότι δεν ανεβαίνει αλλά ούτε κατεβαίνει άμεσα κατά τη φλεγμονώδη φάση και την ύφεση του νοσήματος αντίστοιχα. Μονάδα μέτρησης της ΤΚΕ είναι mm/h, η μέτρηση γίνεται την πρώτη ώρα και οι φυσιολογικές τιμές καθορίζονται από την ηλικία. Οι φυσιολογικές τιμές 346 για τους άνδρες είναι η ηλικία/2 ενώ για τις γυναίκες είναι η (ηλικία + 10)/2. Για τη μέτρηση της ΤΚΕ χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος Westergren. Η CRP έχει περίπου τις ίδιες ενδείξεις χρήσης με την ΤΚΕ. Ο ποσοτικός της προσδιορισμός είναι χρήσιμος για τη διάγνωση μιας φλεγμονώδους διεργασίας, όσο και για την παρακολούθηση της πορείας της. Υπερέχει έναντι της ΤΚΕ γιατί είναι πιο ευαίσθητη στις μεταβολές της φλεγμονώδους διεργασίας, είτε πρόκειται για επιδείνωση είτε για υποχώρηση. Προηγείται της ΤΚΕ στην άνοδο κατά 4-6 ώρες αλλά και στην πτώση 346,. Η μέτρηση της CRP έγινε με την ανοσοδεσμευτική δοκιμασία ELISA και οι τιμές μέτρησης είναι σε mg/dl. Η φυσιολογική τιμή που δίνει το εργαστήριο του Γ.Ν.Θ. Άγιος

85 77 Παύλος, στο οποίο έγινε ο έλεγχος είναι < 0,5mg/dl. (Ανάμεσα στα εργαστήρια υπάρχουν διαφορές στις φυσιολογικές τιμές της CRP ανάλογα με τη μεθοδολογία τη οποίαν χρησιμοποιούν.) Ο θετικός ρευματοειδής παράγοντας (RF, rheumatoid factor) αποτελεί ένα από τα διαγνωστικά κριτήρια της Ρευματοειδούς Αρθρίτιδας 156. Οι ασθενείς διαχωρίζονται σε οροθετικούς και οροαρνητικούς με κριτήριο την ύπαρξη ή όχι RF. Ο θετικός ρευματοειδής παράγοντας και το ύψος του αποτελεί δυσμενή προγνωστικό παράγοντα για την έ- κβαση της ΡΑ. Παρόλα αυτά δεν έχει ρόλο στην παρακολούθηση της φλεγμονής στη νόσο. Οι οροθετικοί ασθενείς έχουν συνήθως πιο βαριές αλλά και εξωαρθρικές εκδηλώσεις της ΡΑ 348. Για τη μέτρηση του RF χρησιμοποιήθηκε η ανοσοδεσμευτική δοκιμασία ELI- SA και τα αποτελέσματα δόθηκαν σε IU/ml. Ο ρευματοειδής παράγοντας είναι θετικός για τιμές > 20U/ml. Τέλος η γενική αίματος, η μέτρηση δηλαδή των κυτταρικών σειρών του αίματος είναι απαραίτητη στους ασθενείς με ΡΑ γιατί είναι ένα νόσημα το οποίο μπορεί να επηρεάσει τις κυτταρικές σειρές αλλά και λόγω της ανοσοτροποποιητικής αγωγής και της τοξικότητας των φαρμάκων 156. Επιπλέον στη μελέτη των Τ λεμφοκυττάρων, με τη γενική αίματος εκτιμάται ο απόλυτος αριθμός των λεμφοκυττάρων Ασθενείς με Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο Οι ασθενείς με ΣΕΛ εκτιμήθηκαν κλινικά για ενεργείς εκδηλώσεις της νόσου ό- πως φωτοευαίσθητο ή μη εξάνθημα, έλκη βλεννογόνων, πλευρίτιδα, περικαρδίτιδα, αρθρίτιδα, εκδηλώσεις από το ΚΝΣ και τα περιφερικά νεύρα, για εκδηλώσεις προσβολής νεφρού (ΑΠ, οιδήματα, ολιγουρία) και για γενική συμπτωματολογία όπως καταβολή και εμπύρετο. Λήφθηκε πλήρες ιστορικό για την εμφάνιση και την πορεία της νόσου και για τη φαρμακευτική αγωγή την οποία πήραν καθώς και για τη φαρμακευτική αγωγή στην οποία ήταν κατά την εξέταση. Οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε απεικονιστικό και αιματολογικό έλεγχο στα πλαίσια της εκτίμησης των εκδηλώσεων του νοσήματος. Συγκεκριμένα, έκαναν ακτινογραφία θώρακα και Γενική Αίματος, συμπληρώματα (C3, C4), ανοσολογικό έλεγχο, γενική ούρων και ούρα 24hr για λεύκωμα, ΤΚΕ, CRP, RF. Η εκτίμηση της ενεργότητας της νόσου έγινε με το δείκτη SLEDAI SLEDAI (SLE disease activity index) Ο SLEDAI είναι ένας από τους δείκτες που χρησιμοποιούνται για την εκτίμησης της ενεργότητας του ΣΕΛ. Ο αρχικός δείκτης 349 (Τορόντο 1992, Bombardier) τροποποιήθηκε το Οι εκδηλώσεις της νόσου οι οποίες αξιολογούνται από το δείκτη αυτό είναι οι επιληπτικές κρίσεις, η ψύχωση, το οργανικό ψυχοσύνδρομο, οι οφθαλμικές διαταραχές του λύκου, η προσβολή κρανιακών νεύρων, η κεφαλαλγία του λύκου, τα αγγειακά εγκεφαλικά επεισόδια, η αγγειίτιδα, η μυοσίτιδα, η αρθρίτιδα, οι ουρικοί κύλινδροι, η αιματουρία και η πρωτεϊνουρία, η πυουρία, το εξάνθημα, η αλωπεκία, τα έλκη βλεννογόνων, η πλευρίτιδα, η περικαρδίτιδα, το χαμηλό συμπλήρωμα, η αυξημένη σύνδεση του DNA, ο πυρετός, η θρομβοκυτοπενία, η λευκοπενία και ο δείκτης συνολικής εκτίμησης του γιατρού. Οι πιο πάνω εκδηλώσεις συνοδεύονται και από ένα αριθμό, ο οποίος εκφράζει τη βαρύτητα της κλινικής εκδήλωσης πχ η ψύχωση βαθμολογείται με 8 ενώ η λευκοπενία με 1. Η συνολική εκτίμηση του γιατρού παίρνει ανάλογα με τη

86 78 Wt Present Descripter Definition 8 Seizure Recent onset. Exclude metabolic, infectious or drug cause 8 Psychosis Altered ability to function in normal activity due to severe disturbance in the perception of reality. Include hallucinations, incoherence, marked loose associations, impoverished thought content, marked illogical thinking, bizarre, disorganized, or catatonic behavior. Excluded uremia and drug causes 8 Organic Brain Syndrome Altered mental function with impaired orientation, memory or other intelligent function, with rapid onset fluctuating clinical features. Include clouding of consciousness with reduced capacity to focus, and inability to sustain attention to environment, plus at least two of the following: Β3 perceptual disturbance, incoherent speech, insomnia or daytime drowsiness, or increased or decreased psychomotor activity. Exclude metabolic, infectious or drug causes 8 Visual Disturbance Retinal changes of SLE. Include cytoid bodies, retinal hemorrhages, serious exodate or hemorrhages in the choroids, or optic neuritis. Exclude hypertension, infection, or drug causes 8 Cranial Nerve Disorder New onset of sensory or motor neuropathy involving cranial nerves 8 Lupus Headache Severe persistent headache: may be migrainous, but must be nonresponsive to narcotic analgesia 8 CVA New onset of cerebrovascular accident(s). Exclude arteriosclerosis 8 Vasculitis Ulceration, gangrene, tender finger nodules, periungual, infarction, splinter hemorrhages, or biopsy or angiogram proof of vasculitis 4 Arthritis More than 2 joints with pain and signs of inflammation (i.e. tenderness, swelling, or effusion) 4 Myositis Proximal muscle aching/weakness, associated with elevated creatine phosphokinase/adolase or electromyogram changes or a biopsy showing myositis 4 Urinary Casts Heme-granular or red blood cell cast 4 Hematuria >5 red blood cells/high power field. Exclude stone, infection or other cause 4 Proteinuria >0.5 gm/24 hours. New onset or recent increase of more than 0.5 gm/24 hours 4 Pyuria >5 white blood cells/high power field. Exclude infection 2 New Rash New onset or recurrence of inflammatory type rash 2 Alopecia New onset or recurrence of abnormal, patchy or diffuse loss of hair 2 Mucosal Ulcers New onset or recurrence of oral or nasal ulcerations 2 Pleurisy Pleuritic chest pain with pleural rub or effusion, or pleural thickening 2 Pericarditis Pericardial pain with at least 1 of the following: rub, effusion, or electrocardiogram confirmation 2 Low Complement Decrease in CH50, C3, or C4 below the lower limit of normal for testing laboratory 2 Increased DNA >25% binding by Farr assay or above normal range for testing laboratory binding 1 Fever >38 C. Exclude infectious cause 1 Thrombocytopenia <100,000 platelets/mm3 Leukopenia <3,000 White blood cell/mm3. Exclude drug causes 0-3 Physicians Global 0 None, 1 Mild, 2 Medium, 3 Severe Assessment Πίνακας 2: Permarheum SLEDAI Calculator βαρύτητα της νόσου τις τιμές από 0 μέχρι και 3 (πίνακας 2). Για την εξαγωγή του δείκτη σημειώνονται μόνο οι πρόσφατα εγκατεστημένες εκδηλώσεις. Ο SLEDAI μπορεί να πάρει τιμές από 0 ως και 108. Με SLEDAI μικρότερο από 2 η νόσος θεωρείται ανενεργής. Με τιμή μεγαλύτερη του 8 η νόσος θεωρείται επίμονα ενεργός. Σχετική έξαρση και σχετική βελτίωση είναι αύξηση κατά 3 ή περισσότερους βαθμούς και μείωση κατά 3 ή περισσότερους βαθμούς του δείκτη, αντίστοιχα. Αν η αύξηση είναι μεγαλύτερη του 12, τότε υπάρχει σοβαρή έξαρση της νόσου. Αν η τιμή του δείκτη είναι 0 η νόσος θεωρείται σε ύφεση.

87 79 Ο δείκτης υπάρχει στο διαδίκτυο στην ιστοσελίδα permarheum.org/sledai.html, στην οποία μετά την εισαγωγή των δεδομένων υπολογίζεται αυτόματα και στην ιστοσελίδα Εργαστηριακός έλεγχος στο ΣΕΛ Στην ομάδα του ΣΕΛ εξετάστηκαν η γενική αίματος, η ΤΚΕ, η CRP, το συμπλήρωμα C3 και C4, τα αντιπυρηνικά αντισώματα ANA και dsdna και τα ούρα. Η ΤΚΕ χρησιμοποιείται για την εκτίμηση της φλεγμονώδους διεργασίας. Η CRP όμως στο ΣΕΛ δεν είναι καλός δείκτης ενεργότητας της νόσου, σε αντίθεση με τη ΡΑ. Η γενική αίματος είναι απαραίτητη εξέταση τόσο κατά τη διάγνωση όσο και για την παρακολούθηση των ασθενών 232. Όλες οι κυτταρικές σειρές του αίματος μπορούν να επηρεαστούν από το ΣΕΛ 156. Η λευκοπενία, η λεμφοπενία, η θρομβοπενία και η αιμολυτική αναιμία ανήκουν στα διαγνωστικά κριτήρια ενώ η λευκοπενία και η θρομβοπενία περιλαμβάνονται και στο δείκτη ενεργότητας της νόσου. Το συμπλήρωμα, ολικό CH50 και τα κλάσματα C3 και C4, αποτελούν επίσης δείκτη ενεργότητας της νόσου. Η μείωση κάτω από τα φυσιολογικά όρια του συμπληρώματος στο ΣΕΛ είναι ενδεικτική της κατανάλωσης του κατά το σχηματισμό ανοσοσυμπλεγμάτων 156. Τα κλάσματα του συμπληρώματος μετρήθηκαν με ELISA και οι φυσιολογικές τιμές για το C3 είναι mg/dl και για το C mg/dl. Τα αντιπυρηνικά αντισώματα, ΑΝΑ, είναι θετικά στο 98% των ασθενών με ΣΕΛ. Ανήκουν στα διαγνωστικά κριτήρια αλλά δεν χρησιμοποιούνται στην παρακολούθηση της ενεργότητας της νόσου 156. Στα αντιπυρηνικά αντισώματα περιλαμβάνονται και τα αυτοαντισώματα του λύκου (Sm, Ro-SSA, La-SSB, RNP, ds-dna κτλ). Η εκτίμηση τους έγινε αρχικά με ανοσοφθορισμό. Η μέθοδος είναι υποκειμενική 350 και πολλές φορές δεν μπορεί να καθοριστεί ο τύπος του ανοσοφθορισμού και κατ επέκταση το αντίσωμα, αλλά εξακολουθεί να αποτελεί τη πιο ευαίσθητη και αποτελεσματική μέθοδο για την εξέταση των ΑΝΑ 351 και τη διαλογή των θετικών από τα αρνητικά δείγματα. Τα ΑΝΑ αξιολογούνται, αν είναι θετικά στον ανοσοφθορισμό, σε αραίωση μεγαλύτερη ή ίση με 1/160. Τα αντι-dsdna εξετάζονται ξεχωριστά με ανοσοφθορισμό με τη χρήση κριθιδίων. Σε αντίθεση με τα ΑΝΑ, η αύξηση του τίτλου τους συμπεριλαμβάνεται στο δείκτη ενεργότητας SLEDAI 250. Αποτελούν δείκτη ενεργότητας για τη νεφρική προσβολή χωρίς αυτό να είναι απόλυτο 254. Η αύξηση του τίτλου τους συνεκτιμάται με την κλινική εικόνα του ασθενούς. Τα αποτελέσματα είναι θετικά για αραιώσεις μεγαλύτερες από 1/10. Εκτός από τον ανοσοφθορισμό, η εκτίμηση των αντι-dsdna σε κάποιους ασθενείς έγινε και με Εlisa. Σε αυτή την περίπτωση αν η τιμή των αντί-dsdna είναι μικρότερη ή ίση με το 25U/ml θεωρούνται αρνητικά, ενώ για μεγαλύτερες του 25U/ml τιμές είναι θετικά. Με τη μέθοδο αυτή τα αντι-dsdna παίρνουν τιμές από 0 μέχρι 200. Τα ΕΝΑ (extractable nuclear antibodies) αποτελούν ουσιαστικά τον ποιοτικό και ποσοτικό έλεγχο των ΑΝΑ. Κάποια από αυτά έχουν συσχετιστεί με συγκεκριμένες εκδηλώσεις του ΣΕΛ. Δεν χρησιμοποιούνται όμως για την εκτίμηση της ενεργότητας της νόσου. Τα ΕΝΑ μετρήθηκαν με ELISA. Η γενική εξέταση των ούρων και το λεύκωμα ούρων 24ώρου αποτελούν δύο α- πλές μεν, αλλά πολύ βασικές εξετάσεις για τη διάγνωση και την παρακολούθηση του ΣΕΛ. Η νεφρική προσβολή είναι μια από τις πιο σοβαρές εκδηλώσεις της νόσου. Η παρουσία λευκώματος στα ούρα > από 500mg/24hr, η αιματουρία > από 5 ερυθρά ανά ο- πτικό πεδίο, η πυουρία > από 5 λευκά ανά οπτικό πεδίο και το ενεργό ίζημα (ερυθροκυτ-

88 80 ταρικοί κύλινδροι) είναι αποδείξεις ενεργού σπειραματονεφρίτιδας και συμπεριλαμβάνονται κατά την εκτίμηση του SLEDAI Ασθενείς με οστεοαρθρίτιδα Από τους ασθενείς με οστεοαρθρίτιδα, όπως και από τους υπόλοιπους ασθενείς, λήφθηκε πλήρες ιστορικό όσον αφορά στο νόσημά τους αλλά και σε άλλα προβλήματα υγείας. Καταγράφηκε η φαρμακευτική αγωγή στην οποία βρίσκονταν κατά την αιμοληψία αλλά και που πήραν στο παρελθόν. Οι ασθενείς εξετάστηκαν για οιδηματώδεις και επώδυνες αρθρώσεις καθώς και για ενεργό λοίμωξη. Επιπλέον, έγινε εργαστηριακός έ- λεγχος της ΤΚΕ, της CRP και Γενική εξέταση αίματος.

89 Κυτταρομετρία ροής Η κυτταρομετρία ροής είναι μια αυτοματοποιημένη σύγχρονη μέθοδος, η οποία επιτρέπει την ποσοτική και πολυπαραμετρική ανάλυση σημάτων, τα οποία προκύπτουν λόγω σκέδασης και φθορισμού όταν μια ακτίνα φωτός προσπίπτει πάνω σε μεμονωμένα σωματίδια όπως κύτταρα ή χρωματοσώματα όταν αυτά ρέουν μέσα από ένα λεπτό ρεύμα υγρού. Το υπό μελέτη υλικό, πρέπει να είναι πάντα σε μορφή εναιωρήματος. Η μέθοδος χρησιμοποιείται για τη μελέτη ορισμένων βιολογικών ιδιοτήτων των κυττάρων όπως τη βιωσιμότητα τους, τη φάση του κυτταρικού κύκλου στην οποία βρίσκονται, την ανάλυση και μέτρηση ενδοκυττάριων συστατικών όπως το DNA, RNA, διάφορα ένζυμα, το α- σβέστιο καθώς και προσδιορισμός του ενδοκυττάριου ph. Χρησιμοποιείται ευρύτατα στον ποσοτικό προσδιορισμό διαφόρων μορίων, τα οποία απαντώνται ενδοκυττάρια ή εκφράζονται στην επιφάνεια των κυττάρων. Η ανάλυση με κυτταρομετρία ροής δίνει πληροφορίες για τις φυσικές ιδιότητες των κυττάρων όπως είναι το μέγεθος, ο όγκος και η κοκκίωση τους και επομένως προσδιορίζοντας τις φυσικές και βιολογικές ιδιότητες των κυττάρων γίνεται εφικτή η αναγνώριση και ο διαχωρισμός κυτταρικών πληθυσμών. Η κυτταρομετρία ροής εφαρμόζεται σε ερευνητικά πρωτόκολλα, τα οποία αφορούν στην ανοσολογία, στη βιολογία των κυττάρων και στην τοξικολογία κλπ αλλά και στις κλινικές μελέτες που αφορούν αιματολογικά νοσήματα Αρχές λειτουργίας του κυτταρομετρητή ροής Ο κυτταρομετρητής ροής, γνωστός και με το ακρωνύμιο FACS (fluorescenceactivated cell sorter) αποτελείται από το οπτικό σύστημα, το σύστημα ροής υγρών, το ηλεκτρονικό σύστημα και τον υπολογιστή για την επεξεργασία των δεδομένων τα οποία λαμβάνονται από την ανάλυση των δειγμάτων 352 (εικόνα 1) Οπτικό σύστημα Η πηγή φωτός είναι συνήθως laser, το οποίο παράγει υψηλής έντασης ακτίνα μονοχρωματικού φωτός, η οποία προσπίπτει στα κύτταρα καθώς ρέουν υδροδυναμικά εστιασμένα το ένα κατόπιν του άλλου. Το πιο συχνά χρησιμοποιούμενο laser από αργόν, εκπέμπει ακτινοβολία μήκους κύματος 488nm και μήκους κύματος 514nm. Είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθεί και δεύτερο laser από ήλιον και νέον, το οποίο εκπέμπει κόκκινη ακτινοβολία, μήκους κύματος 633nm. Η εστίαση και ο προσανατολισμός της φωτεινής ακτίνας laser γίνεται με φακούς και πρίσματα της οπτικής τράπεζας 352 (optical bench). Η οπτική τράπεζα είναι ένας σταθερός σχηματισμός, ο οποίος επιτρέπει στην α- κτίνα του μονοχρωματικού φωτός (διαμέτρου 50μm), με τη χρήση φακών, να κατευθύνεται από το laser στο ρεύμα του υγρού διαμέτρου μm. Το φως με τη βοήθεια των φακών σχηματίζει μια ακτίνα η οποία προσπίπτει στο ρεύμα υγρού. Το σημείο στο οποίο ακτίνα και υγρό συναντώνται ονομάζεται σημείο ανάλυσης ή παρατήρησης. Γύρω από το σημείο ανάλυσης υπάρχουν φακοί οι οποίοι συλλέγουν το εξερχόμενο φως, το οποίο α- ποτελεί και το σήμα. Το σήμα με τη βοήθεια φωτουποδοχέων μετατρέπεται σε ηλεκτρικό σήμα. Διάφοροι φωτουποδοχείς ειδικά τοποθετημένοι συλλέγουν σήματα, τα οποία προ-

90 82 κύπτουν λόγω σκέδασης του φωτός προς όλες τις κατευθύνσεις στο χώρο μετά από την πρόσκρουση της φωτεινής δέσμης με τα κύτταρα. Δείγμα Περιβάλλον υγρό Ανιχνευτές φθορισμού Ακροφύσιο Φακοί συλλογής φθορίζοντο φωτός Διαμέρισμα ροής Φίλτρο Laser Φακοί εστίασης Φωτοανιχνευτές Συγκεντρωτικοί φακοί για πρόσθιο σκεδασμό φωτός Θετικά φορτισμένες πλάκες εκτροπής Αρνητικά φορτισμένες πλάκες εκτροπής Ηλεκτρονικός Υπολογιστής Δεξιός συλλέκτης Αριστερός συλλέκτης Απόβλητα Εικόνα 1: Τα βασικά τμήματα του κυτταρομετρητή ροής Ο σχηματισμός για τους φωτουποδοχείς αποτελείται από τρείς, τέσσερεις ή πέντε φωτοπολλαπλασιαστικές διόδους, οι οποίοι βρίσκονται σε δεξιά γωνία σε σχέση με την κατεύθυνση της φωτεινής ακτίνας εκτός από μία η οποία βρίσκεται απέναντι από τη φωτεινή ακτίνα. Αυτή η φωτοδίοδος είναι μερικώς αποφραγμένη από μια ράβδο σκίασης (obscuration bar), με αποτέλεσμα να μην ανιχνεύει την κατ ευθείαν προσπίπτουσα ακτινοβολία, αλλά μόνο εκείνη η οποία σκεδάστηκε σε πολύ μικρή γωνία (0,5-3 ) 353. Αυτή η ακτινοβολία ονομάζεται πρόσθια σκεδαζόμενη ακτινοβολία (forward scatter, FSC) και εξαρτάται από το μέγεθος των κυττάρων. Το φως, το οποίο σκεδάζεται υπό γωνία 90, σχηματίζει την πλάγια σκεδαζόμενη ακτινοβολία (side scatter, SSC) και η ένταση του είναι ευθέως ανάλογη της κοκκίωσης τον κυττάρων 352,353 (εικόνα 2). Ο συνδυασμός των πληροφοριών οι οποίες συλλέγονται από πρόσθιο και πλάγιο σκεδασμό επιτρέπει το διαχωρισμό των κυττάρων σε υποπληθυσμούς. Το μήκος κύματος της εξερχόμενης ακτινοβολίας εξαρτάται από την πηγή φωτός, από τον ενδογενή φθορισμό του υπό μελέτη υλικού και από την εξωγενή χρήση φθοριζόντων ανιχνευτών. Τα φθοριοχρώματα μπορούν να συνδεθούν άμεσα ή έμμεσα μέσω μο-

91 83 νοκλωνικών αντισωμάτων με μόρια της επιφάνειας ή του εσωτερικού του κυττάρου. Η ιδιότητα τους να διεγείρονται από το φως και να εκπέμπουν δευτερογενή ακτινοβολία, η οποία όπως και η πρωτογενής είναι χαρακτηριστική για μια δεδομένη φθορίζουσα ουσία, λέγεται φαινόμενο φθορισμού. Κανάλια ανοσοφθορισμού Φίλτρο διαλογής χρώματος Σήμα προς ΗΥ Ανιχνευτής πλάγιου σκεδασμού Φίλτρο Ανιχνευτής πρόσθιου σκεδασμού Εικόνα 2: Ανιχνευτές πρόσθιου και πλάγιου σκεδασμού (από την ιστοσελίδα της Semrock, Το σύστημα ροής υγρών Το υπό μελέτη υλικό (δείγμα) εισέρχεται σε εναιώρημα στο σύστημα ροής, το οποίο αποτελείται από δύο υδραυλικά κυκλώματα. Από το πρώτο κύκλωμα γίνεται η προσρόφηση του υπό εξέταση εναιωρήματος και η προώθηση του υπό πίεση και κατά μονάδες στο διαμέρισμα ροής (flow chamber) ή ακροφύσιο. Το δεύτερο υδραυλικό κύκλωμα αναρροφά το περιβάλλον υγρό από τον αποθηκευτικό δοχείο και το προωθεί στο διαμέρισμα ροής. Το περιβάλλον υγρό συνήθως είναι αποσταγμένο νερό. Το ρεύμα του δείγματος εγχέεται στο ρεύμα του περιβάλλοντος υγρού και η αλληλεπίδραση των δύο ρευμάτων δημιουργεί υδροδυναμικό εστιασμό, διατηρώντας τα κύτταρα σε σταθερή κεντρική θέση. Η ταχύτητα ροής του περιβάλλοντος υγρού και ο ρυθμός προσρόφησης του δείγματος ρυθμίζουν το σύστημα ροής έτσι ώστε το ρεύμα του δείγματος να έχει διάμετρο περίπου ίση με τη διάμετρο των κυττάρων 354. Έτσι καθώς τα δύο ρεύματα εξέρχονται από το ακροφύσιο υπό πίεση, χωρίς να αναμιγνύονται, τα κύτταρα οδηγούνται ένα, ένα στο σημείο ανάλυσης-μέτρησης 353. Στο σημείο ανάλυσης η εστιασμένη ακτίνα laser προσπίπτει στο ρεύμα κυττάρων και προκαλείται το φαινόμενο του σκεδασμού. Τα κύτταρα σκεδάζουν το φως ανάλογα

92 84 με τις διαστάσεις τους και την εσωτερική τους κοκκίωση 352. Η κατεργασία των κυττάρων με φθορίζοντες ανιχνευτές προκαλεί την εκπομπή και μιας άλλης ακτινοβολίας με την πρόσπτωση της ακτίνας, τη φθορίζουσα ακτινοβολία. Οι φθορίζοντες ανιχνευτές μπορεί να είναι μονοκλωνικά αντισώματα συνδεδεμένα με διάφορα φθοριοχρώματα όπως π.χ. η ισοθειοκυανική φθοριοσκείνη (fluorescein isothiocyanate, FITC), η οποία εκπέμπει πράσινο φως 514nm (FL-1, fluorescence-1) ή η φυκοερυθρίνη (phycoerythrin, PE) η οποία εκπέμπει κόκκινο φως 578nm (FL-2) 352. Με αυτά τα μονοκλωνικά αντισώματα επιτρέπεται η περαιτέρω ανάλυση και αναγνώριση κυτταρικών υποπληθυσμών, οι οποίοι εκφράζουν συγκεκριμένα μόρια στην επιφάνεια και στο εσωτερικό τους. Ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι η χρήση αντισωμάτων αντι-cd3 και αντί-cd19 για την αναγνώριση των Τ και Β λεμφοκυττάρων αντίστοιχα (εικόνα 3 και 4). Εικόνα 3 (κυτταροδιάγραμμα αριστερά): Η χρήση του πρόσθιου και πλάγιου σκεδασμού για το διαχωρισμό των λευκοκυττάρων. Εικόνα 4 (κυτταροδιάγραμμα δεξιά): Η χρήση των μονοκλωνικών αντισωμάτων για τον περαιτέρω διαχωρισμό των Τ και Β λεμφοκυττάρων Ανάλογα με το υπό μελέτη μόριο χρησιμοποιούνται και άλλα φθοριοχρώματα. Για παράδειγμα, αναφέρεται το προπίδιο του ιωδίου (propidium iodide, PI) το οποίο χρησιμοποιείται για τη ανάλυση νουκλεϊνικών οξέων, ενώ τα indo-1 και fluo-3 για την μέτρηση της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης του ασβεστίου Ηλεκτρονικό σύστημα Οι φωτοανιχνευτές συλλέγουν τα φωτεινά σήματα και τα μετατρέπουν σε αναλογικά ηλεκτρικά σήματα. Αυτά στη συνέχεια ενισχύονται και η ένταση τους αναλύεται και μετατρέπεται από αναλογικό σε ψηφιακό σήμα με τη χρήση ενός μετατροπέα ADC (analog to digital converter). Τα ψηφιακά ηλεκτρονικά σήματα κατατάσσονται σε κανάλια (channels), ο αριθμός των οποίων είναι 256 ή Το κάθε κανάλι αντιπροσωπεύει ένα καθορισμένο ειδικό εύρος έντασης φωτός, το οποίο ρυθμίζεται από το χειριστή του κυτταρομετρητή, με βάση τη γραμμική ή λογαριθμική ενίσχυση του σήματος και με τη διαφορά δυναμικού η οποία εφαρμόζεται στους φωτοανιχνευτές. Τα ηλεκτρονικά σήματα καταγράφονται έτσι σε ένα από τα κανάλια, εξέρχονται από το μετατροπέα και αποθηκεύονται στη μνήμη του ηλεκτρονικού υπολογιστή 356. Στο μετατροπέα δεν καταγράφονται όλα τα σήματα λόγω της ύπαρξης ηλεκτρονικού κατώτερου ορίου ή κατωφλιού (electronic threshold). Έτσι μόνο σήματα υψηλοτέρα από αυτό το όριο καταγράφονται.

93 85 Αυτό χρησιμοποιείται κυρίως στα σήματα τα οποία προέρχονται από πρόσθιο σκεδασμό για να αποφεύγεται η καταγραφή σημάτων από σκόνη ή ηλεκτρονικό θόρυβο 352. Η αποθήκευση στον ΗΥ γίνεται με το λειτουργικό σύστημα FCSF (flow cytometry standard format) με το οποίο γίνεται και η ανάλυση των αποτελεσμάτων. Συνήθως η αποθήκευση γίνεται με τη μέθοδο list mode κατά την οποία για το κάθε κύτταρο του δείγματος αποθηκεύονται τα φωτεινά σήματα τα οποία συλλέχθηκαν από τους φωτοανιχνευτές. Έτσι το κάθε κύτταρο μπορεί να αναλυθεί ξανά και η ένταση των σημάτων του μπορεί να συσχετιστεί με τα αντίστοιχα σήματα από άλλο κύτταρο. Με τον τρόπο αυτό, την αποθήκευση της κυττομετρικής περιγραφής όλων των κυττάρων, μπορεί να γίνει συσχέτιση και ανάλυση των παραμέτρων με όλους τους δυνατούς τρόπους. Ένας άλλος τρόπος αποθήκευσης είναι η μόνο ή διπαραμετρική αποθήκευση των στοιχείων κατά την οποία τα συλλέγονται τα σήματα από κάθε φωτοανιχνευτή και αθροίζονται πριν την αποθήκευση τους 352. Σε μια πολυπαραμετρική μελέτη με κυτταρομετρία ροής γίνεται πληρέστερη ανάλυση του δείγματος και μπορούν να αναγνωριστούν αλλά και να γίνει ποσοτικός προσδιορισμός κυτταρικών ομάδων. Με τη βοήθεια του ηλεκτρονικού παράθυρου επιλογής (gate) μπορεί να επιλεγεί μια ορισμένη κατανομή συχνοτήτων η οποία αντιστοιχεί σε συγκεκριμένα χαρακτηριστικά των υπό μελέτη σωματιδίων/κυττάρων. Το ηλεκτρονικό παράθυρο επιλογής περιορίζεται από κάποια όρια, τα οποία καθορίζουν τις υπό μελέτη παραμέτρους τις οποίες πρέπει να έχουν τα κύτταρα για να επιλέγουν και να αναλυθούν περεταίρω με την κυτταρομετρία ροής. Με αυτό τον τρόπο διαχωρίζονται νεκρά από ζωντανά κύτταρα ή ένας υποπληθυσμός κυττάρων μέσα από ένα ετερογενή πληθυσμό κυττάρων Απεικόνιση των αποτελεσμάτων Μετά τον καθορισμό του ηλεκτρονικού παράθυρου επιλογής, η κάθε υπό μελέτη παράμετρος μπορεί να εξεταστεί μεμονωμένα ή να εξεταστεί η σε σχέση με μια άλλη παράμετρο. Αν εξεταστεί μεμονωμένα μία παράμετρος (πχ όγκος του κυττάρου ή η ένταση του φθορισμού) η τιμή της συνδυάζεται με την σχετική της συχνότητα. Τα αποτελέσματα σε αυτή την περίπτωση απεικονίζονται με τη μορφή ιστογραμμάτων (εικόνα 5). Cursor Εικόνα 5 (αριστερά): ιστόγραμμα, Εικόνα 6 (δεξιά): κυτταροδιάγραμμα ή στικτόγραμμα Η συσχέτιση της έντασης δύο παραμέτρων απεικονίζεται με τη μορφή κυτταροδιαγραμμάτων ή στικτογραμμάτων (εικόνα 6).

94 86 Εικόνα 7 (αριστερά): νεφελόγραμμα, Εικόνα 8 (δεξιά): ισομετρικό διάγραμμα Τα νεφελογράμματα απεικονίζουν τη συσχέτιση της έντασης δύο παραμέτρων αλλά αποδίδουν με μεγαλύτερη ευκρίνεια την πυκνότητα των κυττάρων σε κάθε σημείο του διαγράμματος (εικόνα 7). Τέλος η τρισδιάστατη απεικόνιση γίνεται με ισομετρικά διαγράμματα (εικόνα 8) Καθορισμός θετικότητας Σε μια μελέτη με κυτταρομετρία ροής πρέπει να γίνεται έλεγχος της ορθότητας των αποτελεσμάτων. Η θετική αντίδραση, η παρουσία δηλαδή κυττάρων τα οποία έχουν αντιδράσει με το υπό μελέτη μονοκλωνικό αντίσωμα, πρέπει να επιβεβαιωθεί ότι οφείλεται στη σύνδεση του συγκεκριμένου αντισώματος και όχι σε ενδογενείς φθορίζουσες ουσίες ή σε μη ειδική αντίδραση του αντισώματος με μόρια του κυττάρου. Ο υπολογισμός της μη ειδικής αντίδρασης γίνεται με κατεργασία μέρους του υπό μελέτη κυτταρικού πληθυσμού με ένα άλλο αντίσωμα, στην ίδια ποσότητα και ισότυπο με το υπό μελέτη αντίσωμα αλλά με διαφορετική ειδικότητα, η οποία δεν του επιτρέπει να συνδεθεί με τα υπό μελέτη κύτταρα. Ένα άλλο μέρος του δείγματος ελέγχεται για αυτοφθορισμό, ο οποίος οφείλεται σε ενδογενή μόρια όπως οι φλαβίνες, οι οποίες απορροφούν στο μήκος κύματος των φθορίζουσων ουσιών. Ο συνδυασμός του ισοτυπικού ελέγχου και της μελέτης αυτοφθορισμού καθορίζουν το δείκτη (cursor ή marker) στον άξονα έντασης φθορισμού του ιστογράμματος. Ο δείκτης αυτός θέτει τα όρια μεταξύ θετικής και αρνητική αντίδρασης Διαχωρισμός κυττάρων με τον κυτταρομετρητή ροής Κάποιοι κυτταρομετρητές ροής έχουν τη δυνατότητα να φορτίζουν επιλεκτικά θετικά ή αρνητικά μικροσταγονίδια, τα οποία περιέχουν κύτταρα με συγκεκριμένα χαρακτηριστικά, καθώς εξέρχονται από το ακροφύσιο. Στη συνέχεια, με τη βοήθεια των φορτισμένων πλακών εκτροπής μπορεί να γίνει διαχωρισμός των υπό μελέτη κυτταρικών πληθυσμών (cell sorting).

95 Συλλογή και επεξεργασία δειγμάτων Τα βιομόρια CD26, CD45RA, CD45RO, CD3, CD4, CD8 και η ενεργότητα της δεαμινάσης της αδενοσίνης (ADA) και των συνενζύμων της, ADA1 και ADA2 εξετάστηκαν στο περιφερικό αίμα ασθενών και μαρτύρων. Η μέτρηση της έκφρασης των CD26, CD45RA και CD45RO στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων έγινε με κυτταρομετρία ροής, ενώ η μέτρηση της ολικής ADA και των συνενζύμων ADA1 και ADA2 έγινε με φασματοφωτομετρική μέθοδο Συλλογή δειγμάτων αίματος Οι αιμοληψίες των ασθενών με ρευματοειδή αρθρίτιδα, συστηματικό ερυθηματώδη λύκο και οστεοαρθρίτιδα καθώς και των μαρτύρων, έγιναν πρωϊνή ώρα (από 8.00 μέχρι 9.00 πμ) στη Ρευματολογική Κλινική του Γ.Ν.Θ. Άγιος Παύλος. Σε όλα τα δείγματα έγινε ανάλυση γενικής αίματος προκειμένου να καταγραφεί ο αριθμός των λευκών αιμοσφαιρίων και ο τύπος τους. Η αιμοληψία (10ml) έγινε με φλεβοκέντηση και το αίμα διαχωρίστηκε σε τρία φιαλίδια. Δύο φιαλίδια γενικής αίματος (15% EDTA και 3.8% κιτρικό νάτριο) τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη των κυτταρικών πληθυσμών και των συγκεκριμένων μορίων με κυτταρομετρία ροής. Το τρίτο φιαλίδιο βιοχημικού ελέγχου χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της ενζυμικής ενεργότητας της ADA και των συνενζύμων ADA1 και ADA2 στον ορό. Ο ορός απομονώθηκε με φυγοκέντρηση στα 3000g για 10 min στους 4 C και αμέσως ψύχθηκε στους -70 C Επεξεργασία των δειγμάτων για ανάλυση με κυτταρομετρία ροής Η ποσοτική εκτίμηση της έκφρασης των βιομορίων CD26, CD45RA, CD45RO, CD4, CD8 και CD3 έγινε στον κυτταρομετρητή ροής FACS Calibur TM, της εταιρείας Becton Dickinson (BD), του Ανοσολογικού Τμήματος του Εργαστήριου Βιοπαθολογίας του Γ.Ν.Θ. Παπανικολάου (εικόνα 1). Εικόνα 1: ο κυτταρομετρητής ροής FACS Calibur TM Για την προετοιμασία των δειγμάτων του αίματος για την κυτταρομετρική ανάλυση και τον προσδιορισμό των επιφανειακών αντιγόνων ακολουθήθηκαν τα παρακάτω βήματα: 1. Το ολικό αίμα τοποθετήθηκε σε 10 σωληνάρια, 100μL αίμα/ ανά σωληνάριο. 2. Προστέθηκαν 20μl μονοκλωνικού αντισώματος ή συνδυασμού αντισωμάτων.

96 88 3. Ακολούθησε ήπια ανάδευση και επώαση του δείγματος για 20min σε σκοτεινό μέρος. 4. Η απομάκρυνση των ερυθρών αιμοσφαιρίων έγινε με το διάλυμα λύσης FACS Lysing Solution της εταιρείας Becton Dickinson. Στο κάθε δείγμα προστέθηκαν 2ml διαλύματος λύσης και τοποθετήθηκε πάλι σε σκοτεινό μέρος για 10min. 5. Ακολούθησε φυγοκέντρηση των δειγμάτων στις 1000 στροφές για 5min. 6. Στη συνέχεια έγιναν δύο πλύσεις με 2ml υγρού BD FACS Flow και αντίστοιχες φυγοκεντρήσεις των δειγμάτων στις 1000 στροφές για 5min. Με αυτό τον τρόπο α- παλλάσσονται τα δείγματα από τα ερυθρά αιμοσφαίρια (και τα αιμοπετάλια). 7. Τέλος, στα δείγματα προστέθηκε 1ml FACS flow και τοποθετήθηκαν για ανάλυση στον κυτταρομετρητή ροής. Τα ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη των μορίων επιφανείας προέρχονται από την εταιρεία Becton Dickinson και είναι τα ακόλουθα: Αντι-CD3 μονοκλωνικό αντίσωμα, με ισότυπο IgG1, συνδεδεμένο με Percp (Peridinin Chlorophyll Protein Complex), ειδικό για την αναγνώριση Τ λεμφοκυττάρων Αντι-CD26 μονοκλωνικό αντίσωμα, με ισότυπο IgG2a κ, συνδεδεμένο με PE Αντι-CD45RA μονοκλωνικό αντίσωμα, ισότυπος IgG2b κ, συνδεδεμένο με PE, ειδικό για την αναγνώριση των κυττάρων Αντι-CD45RO μονοκλωνικό αντίσωμα, ισότυπος IgG2a κ, συνδεδεμένο με PE Αντι-CD4 μονοκλωνικό αντίσωμα με ισότυπο IgG1 κ, συνδεδεμένο με FITC, ειδικό για τον προσδιορισμό των ρυθμιστικών Τ CD4 λεμφοκυττάρων Αντι-CD8 μονοκλωνικό αντίσωμα με ισότυπο IgG1 κ, συνδεδεμένο με FITC, ειδικό για τον προσδιορισμό των κυτταροτοξικών Τ CD8 λεμφοκυττάρων Mouse γ1, μονοκλωνικό αντίσωμα, με ισότυπο IgG1 και συνδεδεμένο με PE για τον ισοτυπικό έλεγχο Οι συνδυασμοί μονοκλωνικών αντισωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: 1. Mouse γ1 για τον ισοτυπικό έλεγχο 2. CD3 3. CD3/CD4, 4. CD3/CD8, 5. CD3/CD4/CD26, 6. CD3/CD8/CD26, 7. CD3/CD4/CD45RA, 8. CD3/CD4/CD45RO, 9. CD3/CD8/CD45RA και 10. CD3/CD8/CD45RO Ανάλυση με κυτταρομετρία ροής Η ανάλυση των κυττάρων και η μελέτη έκφρασης των βιομορίων στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων έγινε με κυτταρομετρία ροής και τα αποτελέσματα ταξινομήθηκαν και αποθηκεύτηκαν σε αρχεία με τη μέθοδο list mode. Με τη χρήση του παράθυρου

97 επιλογής (gating) επί του κυτταροδιαγράμματος, έγινε η επιλογή των λεμφοκυττάρων και αποκλείστηκαν τα νεκρά κύτταρα καθώς και τα πολυμορφοπύρηνα και τα μονοκύτταρα. Το συγκεκριμένο κυτταροδιάγραμμα προέκυπτε από την ανάλυση των παραμέτρων πρόσθιας και πλάγιας σκέδασης (FSC και SSC). Με τη χρήση του αντι-cd3 μονοκλωνικού αντισώματος σεσημασμένου με Percp και με πλάγιο σκεδασμό έγινε διαχωρισμός των Τ λεμφοκυττάρων για περαιτέρω ανάλυση και μελέτη με τα υπόλοιπα μονοκλωνικά αντισώματα. Τα Τ λεμφοκύτταρα μελετήθηκαν με βάση τη θετική έκφραση του CD3 μορίου, ενώ οι ρυθμιστικοί πληθυσμοί ΤCD4 και ΤCD8 με βάση την έκφραση των CD4 και CD8 μορίων, τα οποία τα διακρίνουν σε βοηθητικά και κυτταροτοξικά αντίστοιχα. Ο φθορισμός, ο οποίος προερχόταν από την θετική αντίδραση των σεσημασμένων με FITC και PE μονοκλωνικών αντισωμάτων με τα Τ λεμφοκύτταρα, ανιχνεύτηκε στον φωτοπολλαπλασιαστή του κυτταρομετρητή ροής. Τα αποτελέσματα εκτιμήθηκαν με το ερευνητικό πρόγραμμα cell quest και καταγράφηκαν με τη μορφή κυτταροδιαγραμμάτων, όπου στη μονοπαραγοντική ανάλυση στον άξονα Χ βρίσκεται το υπό μελέτη αντίσωμα και στο άξονα Ψ ο πλάγιος σκεδασμός, ενώ στη διπαραγοντική ανάλυση στους άξονες βρίσκονται τα δύο συσχετιζόμενα αντισώματα. Η έκφραση των αντισωμάτων δόθηκε σε ποσοστά (%) θετικών κυττάρων για το υπό μελέτη επιφανειακό αντιγόνο επί της εκατό. Για την εξακρίβωση της θετικής ή αρνητικής αντίδρασης, έγινε σε όλα τα δείγματα ισοτυπικός έλεγχος και σύγκριση των δειγμάτων με το δείγμα του ισοτυπικού ελέγχου. Για το αρνητικό δείγμα ελέγχου επιλέχθηκε το Mouse γ1, IgG1PE για τον καθορισμό της θετικότητας και την εξαίρεση του μη ειδικού σήματος φθορισμού. Για το θετικό δείγμα ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν το CD4 και το CD8 τα οποία εκφράζονται, είτε το ένα είτε το άλλο στην πλειοψηφία των Τ λεμφοκυττάρων. 89

98 Ενζυμική ενεργότητα της ADA Η εκτίμηση της ενζυμικής ενεργότητας της ολικής δεαμινάσης της αδενοσίνης (tada) και δεαμινάσης της αδενοσίνης 2 (ADA2) έγινε με φασματοφωτομετρία (φασματοφωτόμετρο Shimadzu cell positioner UV-2101PC) σε θερμορυθμιζόμενη κυψελίδα στους 37 C και σε μήκος κύματος 550nm, στο εργαστήριο Βιολογικής Χημείας της Ιατρικής Σχολής του ΑΠΘ. Η μέθοδος για τη μέτρηση της ολικής ενεργότητας της δεμινάσης βασίζεται στη απαμίνωση της αδενοσίνης σε ινωσίνη, η οποία με τη δράση της φωσφορυλάσης των πουρινών (PNP) μετατρέπεται σε υποξανθίνη. Στη συνέχεια η οξειδάση της ξανθίνης (XOD) μετατρέπει την υποξανθίνη σε ουρικό οξύ και υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ), το οποίο αντιδρά με τη Ν-αίθυλο-Ν-ΟΗ-3-μεθυλοανιλίνη και την 4- Aμινοαντιπυρίνη (4-AA). Η τελική αντίδραση έχει σαν αποτέλεσμα την παραγωγή έγχρωμου προϊόντος, του οποίου η απορροφητικότητα καταγράφεται σε χρονικά διαστήματα 1 λεπτού για 3 λεπτά 357. Η μέτρηση της ενζυμικής ενεργότητας του ισοενζύμου ADA2 γίνεται με την προσθήκη του αναστολέα της ADA1, ερυθρο-9-2-οη-νονυλαδενίνη, (EHNA) και βασίζεται στην ίδια μέθοδο. Τα αντιδραστήρια R1 και R2 τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για τη μέτρηση της ενζυμικής ενεργότητας, προμηθεύτηκαν από την εταιρεία Diazyme (Diazyme Laboratories Gregg Court, Poway, CA 92064, USA), ο δε αναστολέας της ADA1 προμηθεύτηκε από την εταιρεία ENZO. Το αντιδραστήριο R1 (Reagent 1) περιέχει: 1. Tris-HCl, ph 8.0, 2. 4-AA, 3. PNP, 4. XOD, 5. Peroxidase, 6. Stabilizers Το αντιδραστήριο R2 περιέχει: 1. Tris-HCl, ph Adenosine 3. EHSPT Ο αναστολέα της ADA1, EHNA, χρησιμοποιήθηκε σε συγκέντρωση 200μmol/l 358. Για τη μέθοδο εκτίμησης της ενζυμικής ενεργότητας ακολουθήθηκαν τα παρακάτω βήματα (σχήμα 1): 1. Τοποθέτηση 5 μl ορού αίματος ασθενών και μαρτύρων στη θερμορυθμιζόμενη κυψελίδα 2. Προσθήκη 180 μl από το αντιδραστήριο R1 στην κυψελίδα σε θερμοκρασία δωματίου 3. Επώαση στους 37 C για 2 λεπτά

99 91 4. Προσθήκη 90 μl του R2 αντιδραστηρίου και περαιτέρω επώαση στους 37 C για επιπλέον 5 λεπτά 5. Καταγραφή 4 διαδοχικών μετρήσεων σε χρόνο 0, 1, 2 και 3 λεπτών μετά το τέλος της δεύτερης επώασης Η παραπάνω διαδικασία επαναλήφθηκε για τη μέτρηση του ισοενζύμου ADA2 με την προσθήκη (5 μl) του αναστολέα της ΑDA1, EHNA στον ορό των ασθενών και μαρτύρων. R1: 180μ R2: 90μL Α 3 Ορός: 5μL Α 2 Αναστολέας: 5μL Α 1 Α Χρόνος σε min Σχήμα 1: Τα βήματα για τη μέτρηση της ενζυμικής ενεργότητας της ADA Ο υπολογισμός της ενεργότητας της δεαμινάσης υπολογίστηκε από το λόγο του αθροίσματος των διαφορών μεταξύ των διαδοχικών μετρήσεων Α 0, Α 1, Α 2 και Α 3 δια του τρία και πολλαπλασιάστηκε επί 1050 σύμφωνα με τις οδηγίες της εταιρεία Diazyme, προκειμένου να ληφθεί υπόψη ο παράγοντας αραίωσης και η σταθερά της απόσβεσης. Μία μονάδα ADA ορίζεται ως η ποσότητα της ADA, η οποία είναι υπεύθυνη για την παραγωγή ενός μmole ινοσίνης ανά λεπτό στους 37 C. (ΔΑ 1 /min + ΔΑ 2 /min + ΔΑ 3 /min) ADA (U/L) = X 1050 = ΔΑ/min x ΔΑ 1 /min = Α 1 Α 0 ΔΑ 2 /min = Α 2 Α 1 ΔΑ 3 /min = Α 3 - Α 2 Ο τύπος αυτός είναι της εταιρείας Diazyme και βασίζεται στον πιο κάτω τύπο: ADA (U/L) = ΔΑ/min x Tv ε x Sv x L

100 Στατιστική Ανάλυση Τα δεδομένα από την κλινική αξιολόγηση, τους δείκτες ενεργότητας και από τον εργαστηριακό έλεγχο, καταγράφηκαν στο στατιστικό πακέτο SPSS (Statistical Package for Social Science) PASW Statistics 18 for Windows XP, με το οποίο έγινε η στατιστική ανάλυση. Ο έλεγχος κανονικότητας των κατανομών των ποσοτικών μεταβλητών έγινε με δοκιμασία Shapiro-Wilk. Διαπιστώθηκε ότι οι περισσότερες μεταβλητές ακολουθούσαν κανονική κατανομή, αλλά όχι όλες. Για την περιγραφή του υλικού χρησιμοποιήθηκαν η μέση τιμή (mean value) και η τυπική απόκλιση (standard deviation), οι οποίες απεικονίστηκαν ως γραφικές παραστάσεις κατά ομάδα ασθενών. Για τον έλεγχο των βιοστατιστικών υποθέσεων εφαρμόστηκε για όλες τις μεταβλητές η μη παραμετρική μέθοδος Mann-Whitney U για 2 ανεξάρτητα δείγματα και/ή η μη παραμετρική μέθοδος Kruskal-Wallis 1-way ANOVA για περισσότερα από 2. Επιλέχτηκαν μη παραμετρικές μέθοδοι γιατί δεν ακολουθούσαν όλες οι μεταβλητές κανονική κατανομή. Δεν έγινε μετασχηματισμός των μεταβλητών. Επιπλέον στην ομάδα των ασθενών με ΡΑ, με ΣΕΛ και με ΟΑ υπολογίστηκε ο συντελεστής συσχέτισης r (correlation coefficients) μεταξύ των δεικτών ενεργότητας των νοσημάτων και της έκφρασης των υπό μελέτη βιομορίων στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων αλλά και των βιομορίων μεταξύ τους.

101 93 Β2 Αποτελέσματα 2.1. Δημογραφικά στοιχεία και ιατρικό ιστορικό ασθενών Νο. ΣΕΛ Φύλο Ηλικία Έτος Διάγνωσης Αιμοληψίας Άλλα νοσήματα 1 ΣΑΝ Θ ΚΑ, ΑΥ, ΣΝ, NA 2 Θ Υποθυρεοειδ. 3 ΣΑΝ Θ Θ Θ Θ ΣΑΝ Θ Α Θ Θ Οζ Βρογχ Διατ. Ινσουλίνης, αδέν. Επινεφριδίων, Νεφρολιθίαση (ΑΥ/Νεφρωσικό Σ.) Φλε. Ν. εντέρου Θυρ/παθεια Παρούσα θεραπεία CYP, Medrol 24mg HCQ, Medrol 4mg CYP, HCQ, Medrol HCQ Medrol 4mg, HCQ Presolon 5mg HCQ, MTX HCQ HCQ, Medrol 2mg Medrol 48mg HCQ Medrol 32mg Προηγούμενη θεραπεία Cort, Cellcept, MTX, Cort, HCQ Cort, CYP, HCQ Cort, HCQ Cort, HCQ Cort, HCQ, MTX Cort, HCQ Cort, AZA, Loftyl AZA Cort, HCQ Πίνακας 1: Δημογραφικά στοιχεία και ιατρικό ιστορικό ασθενών με ΣΕΛ. CYP: κυκλοφωσφαμίδη, Cort: κορτιζόνη, MTX: μεθοτρεξάτη, HCQ: υδροξυχλωροκίνη, AZA: αζαθειοπρίνη, ΣΑΝ: σπειραματονεφρίτιδα Νο. Μάρτυρες Φύλο Ηλικία Έτος Διάγνωσης Αιμοληψίας 1 ΟΑ-ΕΣ Θ ΟΑ-ΕΣ, ΟΠ Θ Άλλα νοσήματα ΑΥ, Ευ. έντερο Παρούσα θεραπεία Anarthril, Ca+D Zovadronate, 3 ΟΠ Θ Ταχυκαρ. Starmelox 4 ΟΑ Θ ΟΑ ΟΑ ΟΑ, ΟΠ Υγιής Θ ΧΑΠ Θ Θ Οζ. Βρογχοκ. Θ Προηγούμενη θεραπεία Viatril, Starmelox Anarthril Starmelox, Aclasta Ca+D 9 Υγιής Θ Υγιής Α Υγιής Θ Υγιἠς Θ Υγιής Α 14 ΟΑ-ΕΣ, ΟΠ 15 ΟΑ-ΕΣ Θ Θ ΑΥ, ΦΑ Πίνακας 2: Δημογραφικά στοιχεία και ιατρικό ιστορικό μαρτύρων Fosamax, Ca, D3

102 94 Νο. ΡΑ Φύλο Ηλικία Διάγνωση Έτος Αιμ/ψιας 1 Πρώιμη Θ Χρόνια Θ _ 3 Χρόνια Θ _ 4 Χρόνια Θ Χρόνια Θ Πρώιμη Θ _ 7 8 Χρόνια Χρόνια Θ _ Θ _ 9 Χρόνια Α Χρόνια Θ _ 11 Χρόνια Θ Χρόνια Θ _ 13 Χρόνια Θ Χρόνια Θ Χρόνια Θ Χρόνια Α Πρώιμη Α Χρόνια Θ Χρόνια Θ _ 20 Χρόνια Α Πρώιμη Θ Χρόνια Θ Χρόνια Θ _ 24 Χρόνια Θ Χρόνια Θ Χρόνια Θ Χρόνια Θ Χρόνια Θ Πρώιμη Θ Χρόνια Α Πρώιμη Θ Χρόνια Θ _ 33 Χρόνια Θ ΡΠ + θερα- Παρούσα πεία Άλλα νοσήματα Προηγούμενη θεραπεία ΑΥ, ΟΠ Presolon Cort, NSAIDS ΑΥ, Θυρ/θια Presolon, LFD Cort, LFD ΟΠ Presolon, MTX Cort, MTX Ίλιγγος ΟΧΙ Cort, MTX, HCQ Presolon, LFD, HCQ Presolon, LFD MTX Presolon, HCQ Presolon, MTX, Kineret Presolon, MTX, Humira ΟΠ Presolon, LFD, Enbrel Presolon, MTX, CSA, Kineret, ΟΧΙ Θυρεοειδής, ΟΠ ΟΑ, ΠΥ, εξελ. εντέρου ΑΥ, ΟΑ Presolon, LFD, MTX ΜΤΧ, Humira Presolon Cort, LFD, HCQ Start 18d MTX Cort, HCQ Cort, CSA, MTX, Humira, Enbrel, Cort, MTX, HCQ, SSA, Humira Cort, MTX, CSA, Kineret, Humira Cort, DMARDs, Remicade, Enbrel, Humira Gold, MTX, Cort Cort, MTX, CSA, Remicade, Humira DMARDs, Humira, Enbrel, Kineret MTX, Humira ΟΑ, ΟΠ Presolon, Kineret Cort, MTX, Kineret ΑΥ, Άσθμα, Presolon, LFD Cort, LFD ΧΑΠ Presolon, MTX Cort, MTX, Remicade Presolon NAIDS ΟΑ, ΟΠ MTX MTX Θυρεοειδή Presolon, SSA, Remicade, Humira, Enbrel HCQ, Orencia ΣΔ, ΑΥ, ΟΠ Medrol, MTX Cort, MTX, Kineret Θυρεοειδή Kineret Presolon, MTX inj LFD, Humira, Kineret, Orencia Θυρεοειδή, ΟΠ, Presolon, MTX, Β3 Cort, MTX, ημικρανίες Kineret Kineret ΑΥ, ΟΠ Presolon,Humira MTX, LFD, SSA, CSA, Kineret ΑΥ, ΟΠ, ΟΑ CSA, Humira Cort, Gold, HCQ, MTX, Remicade, Αναιμία, ΟΠ OXI G6PD(-) CSA, Enbrel CSA, MTX, Enbrel, Remicade Θυρεοειδή Presolon 3d, Propiochrone 3d ago ΟΠ, ΕΣ Presolon, MTX, Mabthera 6os CSA, Kineret Cort, MTX, CSA, Enbrel Cort, MTX, CSA Πίνακας 3: Δημογραφικά στοιχεία και ιατρικό ιστορικό ασθενών με ΡΑ. Λευκό: αγωγή με κορτιζόνη, διαβαθμίσεις γκρίζου από ανοικτό προς σκούρο: βιολογικοί παράγοντες, DMARDs και χωρίς αγωγή. Cort: κορτιζόνη, NSAIDs: ΜΣΑΦ, MTX: μεθοτρεξάτη, CSA: κυκλοσπορίνη, LFD: λεφλουνομίδη, HCQ: υδροξυχλωροκίνη, Gold: άλατα χρυσού

103 95 Τα δημογραφικά στοιχεία των ασθενών με ΡΑ και το ιατρικό ιστορικό τους περιγράφονται στον πίνακα 3, των ασθενών με ΣΕΛ συνοψίζονται στον πίνακα 1 και των μαρτύρων στον πίνακα Ηλικία Ο μέσος όρος ηλικίας των ασθενών με Ρευματοειδή αρθρίτιδα, οι οποίοι συμμετείχαν στη μελέτη ήταν έτη, των ασθενών με Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο ήταν 42.4 έτη και των ασθενών στην ομάδα ελέγχου(οστεοαρθρίτιδα και υγιείς) ήταν 51.8 έτη (γράφημα 1). Ηλικία ΡΑ ΟΑ ΣΕΛ Γράφημα 1: Κατανομή της ηλικίας στις ομάδες της ΡΑ του ΣΕΛ και της ΟΑ 2.3. Δείκτες φλεγμονής και Ενεργότητα νόσου Οι δείκτες φλεγμονής είναι απαραίτητοι για το σχηματισμό ολοκληρωμένης εικόνας για την κλινική κατάσταση των ασθενών. Στη ρευματοειδή αρθρίτιδα χρησιμοποιούνται η ΤΚΕ και η CRP ενώ στο συστηματικό ερυθηματώδη λύκο η ΤΚΕ, η CRP, το C3, το C4 και τα αντι-dsdna αντισώματα, με τα πλεονεκτήματα και τους περιορισμούς που αναφέρθηκαν πιο πάνω. Η εργαστηριακή αξιολόγηση των ασθενών οι οποίοι συμμετείχαν στην έρευνα περιλάμβανε αυτές τις εξετάσεις. Η γενική κατάστασης υγείας του ασθενούς, οι επώδυνες και οιδηματώδεις αρθρώσεις και οι δείκτες φλεγμονής είναι παράμετροι του δείκτη ενεργότητας της ρευματοειδούς αρθρίτιδας DAS28, ο οποίος χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη για την ομαδοποίηση των ασθενών. Η λειτουργικότητα των ασθενών με ΡΑ εκτιμήθηκε με το ερωτηματολόγιο λειτουργικότητας HAQ και ο πόνος με την οπτική αναλογική κλίμακα VAS. Ο μέσος όρος των τιμών οι οποίες προέκυψαν για το δείκτη DAS28, το ερωτηματολόγιο HAQ και

104 96 την οπτική αναλογική κλίμακα VAS στους ασθενείς με ΡΑ καθώς και της ΤΚΕ και της CRP φαίνονται στον πίνακα 1. Νόσος Ομάδα ενεργότητας ΤΚΕ CRP HAQ VAS ΡΑ 31,9 1,09 0,74 38,64 DAS28<2,6 22,5 0,6 0,54 24,1 DAS28 2,6-3,2 25,9 0,61 0,57 27,56 DAS28 3,2-5,1 41,42 1,34 0,9 54,67 DAS28> 5,1 49 4,09 1,57 65 ΣΕΛ 26,9 0,71 Μάρτυρες 14,33 0,4 Πίνακας 1: Μέσοι όροι ΤΚΕ, CRP, HAQ και VAS Για την εκτίμηση της ενεργότητας του ΣΕΛ, εκτός από τους δείκτες φλεγμονής χρησιμοποιήθηκε ο δείκτης SLEDAI, για την εξαγωγή του οποίου αξιολογούνται κλινικά και εργαστηριακά οι ασθενείς. Οι τιμές τις οποίες παίρνει ο δείκτης για τον κάθε ασθενή με ΣΕΛ, τα ANA, τα anti-dsdna, το C3 και το C4 φαίνονται στον πίνακα 2. Ασθενείς Εξέταση SLEDAI ANA Anti-dsDNA C , ,1 84,3 58,1 97,4 C4 13, ,2 26,3 22,7 18,6 4,31 29,7 8,17 23,2 Πίνακας 2: Δείκτες ενεργότητας στους ασθενείς με ΣΕΛ Η οστεοαρθρίτιδα συνήθως δεν επηρεάζει τους δείκτες φλεγμονής, παρόλα αυτά οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε εργαστηριακό έλεγχο της ΤΚΕ και της CRP. Τα αποτελέσματα φαίνονται στον πίνακα 1. Γράφημα 2: Μέσος όρος ΤΚΕ και CRP στις ομάδες της ΡΑ, του ΣΕΛ και της ΟΑ

105 97 Ο μέσος όρος της ΤΚΕ στους ασθενείς με ΡΑ ήταν 31,9mm την πρώτη ώρα, στους ασθενείς με ΣΕΛ ήταν 26,9mm, ενώ στην ομάδα των μαρτύρων ήταν 14,33mm την πρώτη ώρα. Οι αντίστοιχες μέσοι όροι για τη CRP ήταν 1,09 mg/dl στους ασθενείς με ΡΑ, 0,71 mg/dl στους ασθενείς με ΣΕΛ, ενώ στους ασθενείς στην ομάδα ελέγχου ήταν 0,4mg/dl (γράφημα 2). Οι μέσοι όροι της ΤΚΕ και της CRP στις υποομάδες της Ρευματοειδούς Αρθρίτιδας οι οποίες σχηματίστηκαν ανάλογα με τον δείκτη DAS28 με τη χρήση της ΤΚΕ, ήταν ΤΚΕ 20,2 και CRP 0,6 για τους ασθενείς σε ύφεση, ΤΚΕ 20,7 και CRP 0,55 για τους α- σθενείς σε μικρή ενεργότητα, ΤΚΕ 33,2 και CRP 0,98 για τους ασθενείς σε μέτρια ενεργότητα και ΤΚΕ 46,9 και CRP 2,03 για τους ασθενείς σε υψηλή ενεργότητα. Οι μέσοι όροι της ΤΚΕ και της CRP στις υποομάδες της Ρευματοειδούς Αρθρίτιδας οι οποίες σχηματίστηκαν ανάλογα με τον δείκτη DAS28 με τη χρήση της CRP, ήταν ΤΚΕ 22,5 και CRP 0,6 για τους ασθενείς σε ύφεση, ΤΚΕ 25,9 και CRP 0,61 για τους α- σθενείς σε μικρή ενεργότητα, ΤΚΕ 41,42 και CRP 1,34 για τους ασθενείς σε μέτρια ε- νεργότητα και ΤΚΕ 49 και CRP 4,09 για τους ασθενείς σε υψηλή ενεργότητα. Ο διαχωρισμός των ομάδων με τη χρήση της CRP στην εξαγωγή του δείκτη ενεργότητας DAS28 είναι πιο σαφής σε σχέση με τη χρήση της ΤΚΕ (γράφημα 3). Η CRP έχει επιπλέον το πλεονέκτημα ότι κατά τις εξάρσεις και υφέσεις της νόσου ανεβαίνει αλλά και υποχωρεί πιο άμεσα σε αντίθεση με την ΤΚΕ. Σύμφωνα με μια πρόσφατη μελέτη (2010) υπάρχει υψηλή συσχέτιση μεταξύ των DASCRP και DASΤΚΕ και μπορεί να χρησιμοποιείται ένας από τους δύο. Ο DASCRP όμως, υπερείχε ως δείκτης ενεργότητας για τους περισσότερους ασθενείς 359. Για την περαιτέρω στατιστική ανάλυση, βάση των πιο πάνω, στους ασθενείς με ΡΑ και στις υποομάδες που σχηματίζονται με βάση την ε- νεργότητα της νόσου χρησιμοποιήθηκε η ομαδοποίηση βάση της CRP. Γράφημα 3: υποομάδες στη ΡΑ με βάση το δείκτη ενεργότητας DAS28 με CRP (αριστερά) και με ΤΚΕ (δεξιά)

106 Κυτταρομετρία ροής Με βάση την πρόσθια και πλάγια σκέδαση και με τη χρήση του ηλεκτρονικού παράθυρου επιλογής έγινε ο διαχωρισμός των λεμφοκυττάρων. Το ηλεκτρονικό παράθυρο επιλογής τέθηκε στη συνέχεια με βάση την πλάγια σκέδαση και το φθορισμό, ο ο- ποίος προέκυπτε από την αντίδραση των κυττάρων με το αντι-cd3 αντίσωμα, περικλείοντας έτσι μόνο τα Τ λεμφοκύτταρα (εικόνα 1 και 2). Επιπλέον, τα αντί-cd4 και αντι- CD8 αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για τον περαιτέρω διαχωρισμό των Τ λεμφοκυττάρων σε βοηθητικά και κυτταροτοξικά κύτταρα, αλλά και σε συνδυασμό με τα αντισώματα των υπό μελέτη μορίων. Εικόνα 1 (αριστερά): παράθυρο επιλογής στα λεμφοκύτταρα (κυτταροδιάγραμμα πρόσθιου και πλάγιου σκεδασμού). Εικόνα 2 (δεξιά): παράθυρο επιλογής στα Τ λεμφοκύτταρα (CD3+). Οι εικόνες προέρχονται από τα αποτελέσματα της μελέτης Τα Τ λεμφοκύτταρα και οι υποπληθυσμοί τους Η εκτίμηση της έκφρασης των μορίων CD3, CD4 και CD8 σε όλες τις ομάδες των ασθενών, έγινε με τη μέτρηση της εντάσεως του φθορισμού, καθώς και με του ποσοστού επί της εκατό των λεμφοκυττάρων τα οποία δίνουν θετική αντίδραση με τα φθορίζοντα μονοκλωνικά αντισώματα έναντι των ίδιων μορίων (αντι-cd3 συνδεδεμένο με Percp, CD4 και CD8 συνδεδεμένα με FITC)(εικόνα 1 και 2). Η ποσοστιαία έκφραση μετατράπηκε σε απόλυτο αριθμό, με τη χρήση της καταμέτρησης των λεμφοκυττάρων στη γενικής αίματος, η οποία έγινε στο ίδιο δείγμα αίματος πριν την κυτταρομέτρηση. Ο μέσος όρος της έκφρασης των μορίων CD3CD4 και CD3CD8 σε ποσοστά στο σύνολο των λεμφοκυττάρων, οι απόλυτοι αριθμοί των CD3CD4 και CD3CD8 θετικών Τ λεμφοκυττάρων καθώς και το ποσοστό και ο απόλυτος αριθμός των Τ λεμφοκυττάρων (CD3 θετικά λεμφοκύτταρα) στους υπό μελέτη πληθυσμούς φαίνονται στον πίνακα 1. Εικόνα 1 (αριστερά): παράθυρο επιλογής στα CD3CD4 θετικά λεμφοκύτταρα, Εικόνα 2 (δεξιά): παράθυρο επιλογής στα CD3CD8 θετικά λεμφοκύτταρα (εικόνες από τα αποτελέσματα της μελέτης)

107 99 Νόσος Ομάδα Λεμφ/αρα CD3% λεμφ/αρα CD3 (αρ.) CD3CD4% λεμφ/αρα CD3CD4 (αρ.) CD3CD8% λεμφ/αρα CD3CD8 (αρ.) ΡΑ ,65% ,63% ,85% 381 DAS28<2, ,04% ,56% ,39% 461 DAS28 2,6-3, ,14% ,88% ,68% 350 DAS28 3,2-5, ,25% ,12% ,35% 332 DAS28>5, ,76% ,73% ,25% 428 ΣΕΛ ,37% ,7% ,44% 531 ΟΕ ,99% ,03% ,16% 475 Πίνακας 1: Ο μέσος όρος των Τ λεμφοκυττάρων (CD3 θετικά) και της έκφρασης των μορίων CD4 και CD8 στα Τ λεμφοκύτταρα στους ασθενείς με ΡΑ και στις υποομάδες με βάση την ενεργότητα, στους ασθενείς με ΣΕΛ και στην ομάδα των μαρτύρων Έκφραση του μορίου CD26 στα Τ λεμφοκύτταρα Η μελέτη του μορίου CD26 στις ομάδες των ασθενών, έγινε με κυτταρομετρία ροής. Το αντίσωμα αντι-cd26 συνδεδεμένο με ΡΕ προστέθηκε στα υπό μελέτη δείγματα μαζί με τα αντι-cd3/αντι-cd4 και αντι-cd3/αντι-cd8 αντισώματα. Το αντι-cd3 ήταν συνδεδεμένο Percp με ενώ τα αντι-cd4 και αντι-cd8 με FITC (εικόνα 1 και 2). Τα αποτελέσματα δόθηκαν σε ποσοστά συνέκφρασης των μορίων CD4CD26 και CD8CD26 στο σύνολο των Τ λεμφοκύτταρων. Ο απόλυτος αριθμός των υποπληθυσμών των λεμφοκυττάρων υπολογίστηκε με αναγωγή του ποσοστού στον αριθμό των Τ λεμφοκυττάρων. Με τον ίδιο τρόπο υπολογίστηκε το ποσοστό των CD4CD26 και CD8CD26 λεμφοκυττάρων στο σύνολο των CD4 και CD8 θετικών λεμφοκυττάρων αντίστοιχα. Εικόνα 1 (αριστερά): κυτταροδιάγραμμα των CD4CD26 θετικών λεμφοκυττάρων (δεξί άνω τεταρτημόριο) Εικόνα 2 (δεξιά): κυτταροδιάγραμμα των CD8CD26 θετικών λεμφοκυττάρων (δεξί άνω τεταρτημόριο). Εικόνες από τα αποτελέσματα της μελέτης Ο μέσος όρος του ποσοστού των CD4CD26 στο σύνολο των Τ λεμφοκυττάρων στην ομάδα της ΡΑ ήταν 60,71±9,71% ενώ των CD8CD26 θετικών λεμφοκυττάρων στο σύνολο των Τ λεμφοκυττάρων ήταν 13,98±6,32%. Οι αντίστοιχες τιμές σε απόλυτο α- ριθμό Τ λεμφοκυττάρων ήταν 939,62±373,4 CD4CD26 Τ λεμφοκύτταρα και

108 100 ΡΑ Ομάδα CD4CD26% CD4CD26 CD8CD26% CD8CD26 CD4CD26% CD8CD26% λεμφοκύτταρα (αρ.) λεμφοκύτταρα (αρ.) στα CD4 στα CD8 1 γ 58, , α 71, , β 58, , γ 67, , β 70, , γ 59, , α 65, , β 69, , γ 49, , γ 58, , δ 58, , γ 69, , β 37, , γ 59, , β 76, , α 56, , γ 63, , α 54, , γ 66, , γ 42, , γ 56, , α 66, , α 70, , α 63, , δ 68, , α 60, , α 76, , β 46, , γ 72, , α 63, , γ 71, , β 42, , β 49, , m 60,7 939,62 13,98 228,15 84,78 57,34 Πίνακας 1: Η έκφραση του μορίου CD26 στα CD4 ή στα CD8Τ λεμφοκύτταρα ασθενών με ΡΑ. Ομάδες ενεργότητας με βάση το δείκτη DAS28/CRP, α: σε ύφεση, β:μικρή ενεργότητα, γ: μέτρια ενεργότητα, δ: υψηλή ενεργότητα 228,15±160,09 CD8CD26 Τ λεμφοκύτταρα. Ο μέσος όρος του ποσοστού των CD4CD26 λεμφοκυττάρων στο σύνολο των CD4 Τ λεμφοκυττάρων στην ίδια ομάδα ήταν 84,78±8,85%, ενώ ο μέσος όρος του ποσοστού των CD8CD26 λεμφοκυττάρων στο σύνολο των CD8 Τ λεμφοκυττάρων ήταν 57,34±19,78% (πίνακας 1). Ο μέσος όρος του ποσοστού των CD4CD26 λεμφοκυττάρων στο σύνολο των Τ λεμφοκυττάρων στην ομάδα του ΣΕΛ ήταν 43,69±18,33% ενώ των CD8CD26 λεμφοκυττάρων ήταν 21,7±10,66%. Οι αντίστοιχες τιμές σε αριθμό Τ λεμφοκυττάρων ήταν 615,4±384,96 CD4CD26 Τ λεμφοκύτταρα και 284,4±144,86 CD8CD26 Τ λεμφοκύτταρα. Ο μέσος όρος του ποσοστού των CD4CD26 Τ λεμφοκυττάρων στο σύνολο των CD4 Τ λεμφοκυττάρων στην ίδια ομάδα ήταν 77±22,85%, ενώ ο μέσος όρος

109 ΣΕΛ Ομάδα CD4CD26% λεμφοκύτταρα CD4CD26 (αρ.) CD8CD26% λεμφοκύτταρα CD8CD26 (αρ.) CD4CD26% στα CD4 Πίνακας 2: Η έκφραση του μορίου CD26 στα CD4 ή στα CD8Τ λεμφοκύτταρα ασθενών με ΣΕΛ. Ομάδες με βάση το δείκτη SLEDAI: 1 σε ύφεση, 2 μικρή ενεργότητα, 3 μέτρια-μεγάλη ενεργότητα του ποσοστού των CD8CD26 Τ λεμφοκυττάρων στο σύνολο των CD8 Τ λεμφοκυττάρων ήταν 54,1±24,5% (πίνακας 2). Ο μέσος όρος του ποσοστού των CD4CD26 λεμφοκυττάρων στο σύνολο των Τ λεμφοκυττάρων στην ομάδα της ΟΑ ήταν 55,14±7,57%, ενώ των CD8CD26 λεμφοκυττάρων ήταν 16,67±5,07%. Οι αντίστοιχες τιμές σε απόλυτο αριθμό Τ λεμφοκυττάρων ήταν 845,73±289,37 CD4CD26 και 250,73±91,48 CD8CD26 Τ λεμφοκύτταρα. Ο μέσος όρος του ποσοστού των CD4CD26 Τ λεμφοκυττάρων στο σύνολο των CD4 Τ λεμφοκυττάρων στην ίδια ομάδα ήταν 81,66±7,19%, ενώ ο μέσος όρος του ποσοστού των CD8CD26 Τ λεμφοκυττάρων στο σύνολο των CD8 Τ λεμφοκυττάρων ήταν 52,13±14,48% (πίνακας 3). 101 CD8CD26% στα CD , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , m 43,69 615,4 21,7 284, ,1 ΟΑ CD4CD26% λεμφοκύτταρα CD4CD26 (απόλυτος αρ.) CD8CD26% λεμφοκύτταρα CD8CD26 (απόλυτος αρ.) CD4CD26% στα CD4 CD8CD26% στα CD8 1 45, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , m 55,14 845,73 16,67 250,73 81,66 52,13 Πίνακας 3: Η έκφραση του μορίου CD26 στα CD4 ή στα CD8 Τ λεμφοκύτταρα ασθενών με ΟΑ.

110 102 Γράφημα 1 (αριστερά): Το ποσοστό των CD4CD26 θετικών Τ λεμφοκυττάρων στις ομάδες ΡΑ, ΟΑ και ΣΕΛ, Γράφημα 2 (δεξιά): Τα θετικά CD4CD26 Τ λεμφοκύτταρα στις ομάδες ΡΑ, ΟΑ και ΣΕΛ Οι μέσοι όροι στις υποομάδες της ΡΑ με βάση την ενεργότητα της νόσου (δείκτη DAS28) φαίνονται στον πίνακα 4. Έκφραση μορίων Ομάδα ανάλογα με τον DAS28 (CRP) (μέσοι όροι) Ύφεση Μικρή ενεργότηττηττητα Μέτρια ενεργό- Υψηλή CD4CD26% 64.92% 57.47% 60.54% 63.31% CD4CD26 (αρ.) CD8CD26% 14.76% 14.55% 11.68% 18.09% CD8CD26 (αρ.) CD26 of CD4 89.3% 80.77% 83.91% 91% CD26 of CD8 59.6% 56.11% 52.83% 78.5% Πίνακας 4: Η έκφραση του μορίου CD26 στα CD4 και στα CD8 θετικά Τ λεμφοκύτταρα στις υποομάδες της ΡΑ με βάση την ενεργότητα της νόσου ενεργό- Η έκφραση των μορίων CD4CD26 και CD8CD26 στη επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων στις υποομάδες οι οποίες σχηματίστηκαν με βάση τη θεραπευτική αγωγή των ασθενών με ΡΑ καταγράφεται στον πίνακα 5. υποο- Έκφραση μορίων (μέσοι όροι) Αγωγή Κορτιζόνη DMARDs Βιολογικοί παρ. Χωρίς αγωγή CD4CD26% 62,39% 64,35% 58,61% 59,08% CD4CD26 (αρ.) CD8CD26% 11,47% 12,72% 16,15% 10,09% CD8CD26 (αρ.) CD26 of CD4 86,75% 86,08% 86,14% 74,33% CD26 of CD8 52,75% 56,91% 58,57% 59,33% Πίνακας 5: Η έκφραση του μορίου CD26 στα CD4 και στα CD8 θετικά Τα λεμφοκύτταρα στις μάδες της ΡΑ με βάση την φαρμακευτική αγωγή

111 Έκφραση των ισομορφών CD45RA και CD45RO στα Τ λεμφοκύτταρα Η μελέτη της έκφρασης των μορίων CD45RA και CD45RO στα Τ λεμφοκύτταρα έγινε επίσης με κυτταρομετρία ροής. Τα αντι-cd45ra και αντι-cd45ro αντισώματα συνδεδεμένα με ΡΕ χρησιμοποιήθηκαν σε συνδυασμό με τα αντι-cd3/αντι-cd4 και α- ντι-cd3/αντι-cd8 αντισώματα συνδεδεμένα με Percp/FITC αντίστοιχα (εικόνες 1,2,3 και 4). Τα αποτελέσματα δόθηκαν σε ποσοστά συνέκφρασης των δύο ισομορφών του CD45 με το CD4 ή το CD8 στα Τ λεμφοκύτταρα. ΡΑ Ομάδα CD4CD45RA CD4CD45RO CD8CD45RA CD8CD45RO % Τ κύτταρα % Τ κύτταρα % Τ κύτταρα % Τ κύτταρα 1 γ 35, , , , α 52, , , , β 29, , , , γ 40, , , , β 37, , , , γ 36, , , , α 49, , , , β 53, , , , γ 27, , , , γ 34, , , , δ 42, , , , γ 44, , , , β 45, , , , γ 32, , , , β 51, , , , α 28, , , , γ 45, , , , α 36, , , , γ 40, , , , γ 18, , , , γ 43, , , , α 48, , , , α 44, , , , α 30, , , , δ 52, , , , α 35, , , , α 52, , , , β 28, , , , γ 36, , , , α 37, , , , γ 51, , , , β 29, , , , β 34, , , , m 39,2 612,46 45,4 693,31 20,23 320,4 12,85 198,78 Πίνακας 1: Η έκφραση των μορίων CD45RA και CD45RO στα CD4 και CD8 Τ λεμφοκύτταρα των ασθενών με ΡΑ. Ομάδες ενεργότητας με βάση το δείκτη DAS28CRP, α: σε ύφεση, β:μικρή ενεργότητα, γ: μέτρια ενεργότητα, δ: υψηλή ενεργότητα

112 104 Ο μέσος όρος του ποσοστού των Τ λεμφοκυττάρων τα οποία εξέφραζαν τα βιομόρια CD4CD45RA στο σύνολο των ασθενών με ΡΑ ήταν 39.2±9,01%, τα CD4CD45RO 45.4±10,04%, ενώ τα CD8CD45RA ήταν 20.23±7,42% και τα CD8CD45RO 12.85±6,67%. Οι αντίστοιχοι μέσοι όροι σε αριθμό λεμφοκυττάρων για την ίδια ομάδα ασθενών ήταν ±270,75 CD4CD45RA Τ λεμφοκύτταρα, ±277,06 CD4CD45RO Τ λεμφοκύτταρα, 320.4±184,76 CD8CD45RA Τ λεμφοκύτταρα και ±135,9 CD8CD45RO Τ λεμφοκύτταρα (πίνακας 1). Οι μέσοι όροι της έκφρασης των CD4CD45RA, CD4CD45RO, CD8CD45RA και CD8CD45RO στις υποομάδες οι οποίες σχηματίστηκαν με βάση το δείκτη ενεργότητας της νόσου DAS28 και τη CRP φαίνονται στον πίνακα 2. Βιομόρια Ομάδες με βάση την ενεργότητα Ύφεση Μικρή ενεργότητγότηττητα Μέτρια ενερ- Υψηλή ενεργό- CD4CD45RA 41.48% 38.83% 37.24% 47.89% CD4CD45RO 49.18% 46.52% 45.09% 29.93% CD8CD45RA 17.09% 23.38% 19.59% 19.88% CD8CD45RO 11.95% 15.91% 11.57% 8.84% Πίνακας 2: Ο μέσος όρος της έκφρασης των μορίων CD45RA και CD45RO στα CD4 και CD8 θετικά Τ λεμφοκύτταρα των ασθενών με ΡΑ στις υποομάδες με βάση την ενεργότητα Οι μέσοι όροι της έκφρασης των μορίων CD4CD45RA, CD4CD45RO, CD8CD45RA και CD8CD45RO στις υποομάδες οι οποίες σχηματιστήκαν με βάση τη θεραπευτική αγωγή των ασθενών με ΡΑ καταγράφονται στον πίνακα 3. Βιομόρια Ομάδες με βάση την αγωγή Κορτιζόνη DMARDs Βιολογικοί παρ. Χωρίς αγωγή CD4CD45RA 43,93% 41,85% 36,17% 40,85% CD4CD45RO 39,78% 45,14% 45,35% 58,58% CD8CD45RA 18,61% 18,34% 20,81% 23,46% CD8CD45RO 7,58% 11,4% 14,26% 17,49% Πίνακας 3: Ο μέσος όρος της έκφρασης των μορίων CD45RA και CD45RO στα CD4 και CD8 θετικά Τ λεμφοκύτταρα των ασθενών με ΡΑ στις υποομάδες με βάση τη φαρμακευτική αγωγή Εικόνα 1 και 2: κυτταροδιάγραμμα (δεξιό άνω τεταρτημόριο) των CD4CD45RA θετικών λεμφοκυττάρων (αριστερά) και των CD4CD45RO (δεξιά). Εικόνες από τα αποτελέσματα της μελέτης

113 105 Ο μέσος όρος του ποσοστού των Τ λεμφοκυττάρων τα οποία εξέφραζαν τα βιομόρια CD4CD45RA στο σύνολο των ασθενών με ΣΕΛ ήταν 31.34±13,69%, τα CD4CD45RO 35.45±11,16%, ενώ τα βιομόρια CD8CD45RA ήταν 30.85±11,26% και τα CD8CD45RO 19,82±10,51%. Οι αντίστοιχοι μέσοι όροι σε αριθμό λεμφοκυττάρων για την ίδια ομάδα ασθενών ήταν 434.5±19,57 CD4CD45RA Τ λεμφοκύτταρα, 462.8±211,74 CD4CD45RO Τ λεμφοκύτταρα, 403.8±201,78 CD8CD45RA Τ λεμφοκύτταρα και 235.1±89,34 CD8CD45RO Τ λεμφοκύτταρα (πίνακας 4). ΣΕΛ Ομάδα CD4CD45RA CD4CD45RO CD8CD45RA CD8CD45RO % Τ κύτταρα % Τ κύτταρα % Τ κύτταρα % Τ κύτταρα , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , m 31,34 434,5 35,45 462,8 30,85 403,8 19,82 235,1 Πίνακας 4: Η έκφραση των μορίων CD45RA και CD45RO στα CD4 και CD8 θετικά Τ λεμφοκύτταρα των ασθενών με ΣΕΛ. Ομάδες με βάση το δείκτη SLEDAI: 1 σε ύφεση, 2 μικρή ενεργότητα, 3 μέτρια-μεγάλη ενεργότητα Ο μέσος όρος του ποσοστού των Τ λεμφοκυττάρων τα οποία ήταν θετικά στα βιομόρια CD4CD45RA στο σύνολο της ομάδας των μαρτύρων ήταν 33.39±11,08%, στα ΟΑ Ομάδα CD4CD45RA CD4CD45RO CD8CD45RA CD8CD45RO % Τ κύτταρα % Τ κύτταρα % Τα κύτταρα % Τ κύτταρα 1 ΟΑ 22, , , , ΟΑ 20, , , , ΟΠ 22, , , , ΟΑ 51, , , , ΟΑ 38, , , ΟΑ 36, , , , ΟΑ 32, , , , Υ 33, , , Υ 22, , , , Υ 37, , , , Υ 52, , , , Υ 24, , , , Υ 17, , , , ΟΑ 49, , , , ΟΑ 39, , , , m 33, , ,8 356,06 18,76 275,93 Πίνακας 5: Η έκφραση των μορίων CD45RA και CD45RO στα CD4 και CD8 θετικά Τ λεμφοκύτταρα των ασθενών με ΟΑ

114 106 βιομόρια CD4CD45RO 45.05±8,96%, ενώ στα CD8CD45RA ήταν 23.8±5,69% και στα CD8CD45RO 18.76±7,06%. Οι αντίστοιχοι μέσοι όροι σε αριθμό λεμφοκυττάρων για την ίδια ομάδα ασθενών ήταν ±281,55 CD4CD45RA, 670±187,52 CD4CD45RO, ±104,51 CD8CD45RA και ±108,78 CD8CD45RO Τ λεμφοκύτταρα (πίνακας 5). Εικόνα 3 και 4: κυτταροδιάγραμμα των CD8CD45RA θετικών λεμφοκυττάρων (αριστερά) και των CD8CD45RO (δεξιά). Τα διπλά θετικά λεμφοκύτταρα βρίσκονται στο δεξί άνω τεταρτημόριο. Οι εικόνες προέρχονται από τα αποτελέσματα της μελέτης

115 Ενζυμική ενεργότητα της tada και ADA2 Η ενζυμική ενεργότητα της tada και του ισοενζύμου ADA2 υπολογίστηκε με φασματοφωτομετρική μέθοδο. Επιπλέον, υπολογίστηκε το ποσοστό της ADA2 ως προς την ολική ADA και η ενεργότητα του ισοενζύμου ADA1 με αφαίρεση της ADA2 από την tada Ενζυμική ενεργότητα της tada και ADA στους ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα No. Ενζυμική ενεργότητα δεαμινάσης στους ασθενείς με ΡΑ tada U/L ADA2 U/L ADA1 U/L ADA2/tADA% , ,75 5, ,25 19, , ,25 24,5 1,75 93,3 6 12,25 12, ,75 17,5 5,25 76,9 8 22, ,75 92, ,75 5, ,5 4,5 77, ,25 15,75 3,5 81, , ,75 92, ,5 20,5 2 91, ,5 10, ,4 26,25 3,15 89, , ,25 84, ,5 17, ,75 15, ,5 17, ,75 22, , ,5 31, ,25 23,5 2,75 89, ,75 18, ,5 15,75 1, ,5 3,5 82, ,25 25,5 4,75 84, ,75 24,5 3,25 88, ,5 24 1,5 94, ,5 20,25 1,25 94, ,25 20, , ,75 29,5 0,25 99, ,25 24,5 1,75 93, ,75 12,25 3,5 77,78 m 23,35 20,3 3,9 87,97% Πίνακας 1: Ενζυμική ενεργότητα δεαμινάσης της αδενοσίνης και ισοενζύμων στους ασθενείς με ΡΑ Ο μέσος όρος της ενζυμικής ενεργότητας της ολικής δεαμινάσης (tada) στους ασθενείς με ΡΑ ήταν 23,35±6,95U/L, της ADA2 20,3±5,35U/L, της ADA1 ήταν

116 108 3,9±4,55, ενώ του ποσοστού της ενζυμικής ενεργότητας της ADA2 ως προς την ενζυμική ενεργότητα της tada ήταν 87,97±11,81% (πίνακας 1). Ο μέσος όρος της ενζυμικής ενεργότητας των tada, ADA1 και ADA2 και του ποσοστού ADA2/tADA στις υποομάδες της ΡΑ, οι οποίες σχηματίστηκαν με βάση την ενεργότητα της νόσου (DAS28CRP) καταγράφονται στον πίνακα 2, ενώ στις υποομάδες οι οποίες σχηματίστηκαν με βάση τη φαρμακευτική αγωγή, στον πίνακα 3. Ομάδες ενεργότητας Ενζυμική ενεργότητα αδενοσίνης (U/L) tada ADA2 ADA1 ADA2/tADA% Ύφεση 23,15±7,3 19,2±5,85 3,93±1,58 84,02±11,36 Μικρή ενεργότητα 22,05±4,55 20,25±5 4,08±5,8 90,99±7,36 Μέτρια ενεργότητα 24,65±8,55 21,25±5,9 3,8±5 88,4±15,15 Υψηλή ενεργότητα 19,25 15,75 3,5 81,8 Πίνακας 2: Ενζυμική ενεργότητα των tada, ADA1 και ADA2στις υποομάδες της ΡΑ με βάση την ενεργότητα της νόσου Ομάδες φαρμακευτικής αγωγής Ενζυμική ενεργότητα αδενοσίνης (U/L) tada ADA2 ADA1 ADA2/tADA% Κορτικοειδή 25,65±7,25 25,3±7,1 0,33±0,55 98,81±2,06 DMARDs 23,7±7,90 19,6±4,15 5,6±5,8 85,86±13,87 Βιολογικοί παράγοντες 22±6,2 19±5,65 3±1,9 86,34±9,11 Χωρίς αγωγή 24,4 23,1 1,25 94,67 Πίνακας 3: Ενζυμική ενεργότητα των tada, ADA1 και ADA2στις υποομάδες της ΡΑ με βάση τη φαρμακευτική αγωγή Ενζυμική ενεργότητα της tada και ADA στους ασθενείς με συστηματικό ε- ρυθηματώδη λύκο Ο μέσος όρος της ενζυμικής ενεργότητας της tada στους ασθενείς με ΣΕΛ ήταν 24,25±12,25U/L, της ADA2 22,25±11,25U/L, της ADA1 2,2±2,4 U/L, το δε ποσοστό ADA2/tADA ήταν 91,59±8,67% (πίνακας 1). No Ενζυμική ενεργότητα αδενοσίνη (U/L) tada ADA2 ADA1 ADA2/tADA% 1 17,5 15,75 1, ,5 15,75 1, ,75 22,70 7,05 76, ,5 49 3,5 93, ,5 19,5 2 90, ,5 16,5 1 94, ,45 3,55 83,1 m 24,25 22,25 2,2 91,59 Πίνακας 1: Ενζυμική ενεργότητα των tada, ADA1 και ADA2 στους ασθενείς με ΣΕΛ.

117 Ενζυμική ενεργότητα της tada και ADA στους ασθενείς με οστεοαρθρίτιδα Ο μέσος όρος της ενζυμικής ενεργότητας της tada στους ασθενείς με ΟΑ ήταν 28,55±8,9U/L, της ADA2 20,4±4,3U/L, ADA1 8,15±7,25 και το ποσοστό ADA2/tADA ήταν 74,78±16,01% (πίνακας 1). Νο Ενζυμική ενεργότητα αδενοσίνης U/L tada ADA2 ADA1 ADA2/tADA% , , ,5 49, ,5 15, , , ,5 3,5 87, ,5 21 3,5 85, ,95 19,25 8,7 68, , ,5 57, ,25 19, , ,25 1,75 91, ,5 26,25 5,25 83, , ,25 69, ,95 17,45 10,5 62,43 m 28,55 20,4 8,15 74,78 Πίνακας 1: Ενζυμική ενεργότητα των tada, ADA1 και ADA2 στους ασθενείς με ΟΑ

118 110

119 111 B3 Σύγκριση αποτελεσμάτων στις ομάδες 3.1. Σύγκριση ηλικίας στις ομάδες Ο μέσος όρος ηλικίας όλων των ασθενών ήταν 49 (49,28±12,43), ενώ οι επί μέρους μέσοι όροι ηλικίας των ασθενών με ΡΑ, ΣΕΛ και ομάδας μαρτύρων ήταν 50,24±11,66, 42,4±14,07 και 51,8±12,16 έτη, αντίστοιχα (γράφημα 1). Οι μέσοι όροι η- λικίας στις υποομάδες της ΡΑ, οι οποίες σχηματίστηκαν με βάση την ενεργότητα της νόσου, ήταν 47,7±11,94 για την ομάδα των ασθενών σε ύφεση, 53,11±11,12 για τους ασθενείς με μικρή ενεργότητα, 51,92±12,38 για τους ασθενείς με μέτρια ενεργότητα και 40±2,83 για τους ασθενείς με υψηλή ενεργότητα (γράφημα 2). Στις υποομάδες της ΡΑ οι οποίες σχηματίστηκαν με βάση τη φαρμακευτική αγωγή οι μέσοι όροι ηλικίας ήταν για τους ασθενείς χωρίς φαρμακευτική αγωγή 49±7,93, για τους ασθενείς μόνο σε κορτικοστεροειδή 45,25±17,65, για τους ασθενείς σε ανοσοτροποποιητικά 52,91±10,4 και για τους ασθενείς σε βιολογικό παράγοντα 49,64±12,09 (γράφημα 3). Η ηλικία δεν είχε στατιστικά σημαντική διαφορά ανάμεσα στους ασθενείς με ΡΑ, ΣΕΛ και ΟΑ και στις υποομάδες της ΡΑ, οι οποίες σχηματίστηκαν με βάση την ενεργότητα και τη φαρμακευτική αγωγή. Η αναλογία ανδρών/γυναικών ήταν 5/28 στην ομάδα της ΡΑ, 1/9 στο ΣΕΛ και 2/13 στην ΟΑ. Γράφημα 1: Σύγκριση ηλικίας στις ομάδες ΡΑ, ΟΑ και ΣΕΛ Γράφημα 2 (δεξιά): Σύγκριση ηλικίας στις ομάδες της ΡΑ με βάση την ενεργότητα. Γράφημα 3 (αριστερά): Σύγκριση της ηλικίας στις ομάδες της ΡΑ με βάση την αγωγή

120 Η έκφραση των μορίων CD3CD4 και CD3CD8 στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων στις υπό μελέτη ομάδες Ο αριθμός των λευκοκυττάρων, των λεμφοκυττάρων και των Τ λεμφοκυττάρων δεν διέφερε στατιστικά ανάμεσα στις ομάδες. Η έκφραση των μορίων CD3CD4 και CD3CD8 στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων όμως, διέφερε με στατιστικά σημαντική διαφορά. Συγκεκριμένα, το ποσοστό των CD3CD4 Τ λεμφοκυττάρων ήταν αυξημένο στην ομάδα της ΡΑ (51,63±8,07) σε σχέση με την ομάδα των μαρτύρων (ΟΑ) (46,03±4,14) και την ομάδα του ΣΕΛ (39,07±10,58), ενώ στην ομάδα του ΣΕΛ ήταν μειωμένο σε σχέση με την ομάδα της ΟΑ (γράφημα 1). Η διαφορά ήταν στατιστικά σημαντική μεταξύ της ομάδας της ΡΑ και της ΟΑ για 0,01>p>0,001, p=0,002, της ΡΑ και του ΣΕΛ για p=0,001 και μεταξύ της ομάδας του ΣΕΛ και της ΟΑ για 0,05>p>0,01, p=0,046. Ο απόλυτος αριθμός των CD3CD4 θετικών Τ λεμφοκυττάρων ήταν επίσης υ- ψηλότερος στην ομάδα της ΡΑ, ενώ στην ομάδα του ΣΕΛ ήταν χαμηλότερος σε σχέση με τις άλλες ομάδες (γράφημα 2). Στατιστικά σημαντική διαφορά υπήρχε μόνο μεταξύ της ομάδας της ΡΑ (1090,3±404,5) και της ομάδας του ΣΕΛ (748,6±380,84) για 0,05>p>0,01, p=0,033. Το ποσοστό των CD3CD8 θετικών Τ λεμφοκυττάρων αντίθετα, ήταν χαμηλότερο στην ομάδα της ΡΑ και υψηλότερο στην ομάδα του ΣΕΛ (γράφημα 1). Η διαφορά ήταν στατιστικά σημαντική στη σύγκριση της ομάδας της ΡΑ (17,85±5,79) με την ομάδα της ΟΑ (22,16±5,59) για 0,05>p>0,01, p=0,012, της ομάδας του ΣΕΛ (30,44±11,26) με της ΟΑ για 0,05>p>0,01, p=0,035 και της ΡΑ με του ΣΕΛ για p<0,001. Ο απόλυτος αριθμός των CD3CD8 θετικών Τ λεμφοκυττάρων ήταν όπως και το ποσοστό υψηλότερος στην ομάδα του ΣΕΛ και χαμηλότερο στην ομάδα της ΡΑ (γράφημα 2). Η διαφορά ήταν στατιστικά σημαντική στη σύγκριση της ομάδας της ΡΑ (381,45±233,31) με την ομάδα της ΟΑ (475,2±127,02) για 0,05>p>0,01, p=0,021 και της ΡΑ με του ΣΕΛ (531±191,21) για 0,05>p>0,01, p=0,021. Γράφημα 1: Το ποσοστό των CD3CD4 και CD3CD8 λεμφοκυττάρων στις ομάδες ΡΑ, ΣΕΛ και ΟΑ (αριστερά). Γράφημα 2: Ο αριθμός των CD3CD4 και CD3CD8 λεμφοκυττάρων στις ίδιες ομάδες (δεξιά) Στις υποομάδες της ΡΑ οι οποίες σχηματίστηκαν με βάση την ενεργότητα της νόσου δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά στον αριθμό των λευκοκυττάρων, των

121 113 λεμφοκυττάρων, των Τ λεμφοκυττάρων καθώς και των CD3CD4 και CD3CD8 λεμφοκυττάρων. Στις υποομάδες οι οποίες σχηματίστηκαν με βάση την αγωγή υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά στο ποσοστό και τον απόλυτο αριθμό των CD3CD8 θετικών λεμφοκυττάρων, ενώ στα υπόλοιπα δεν υπήρχε. Συγκεκριμένα, υπήρχε στατιστικά σημαντική αύξηση στο ποσοστό των CD3CD8 θετικών λεμφοκυττάρων στη σύγκριση της ομάδας των βιολογικών παραγόντων (20,88±6,43) με την ομάδα των DMARDs (15,97±4,32) για 0,05>p>0,01, p=0,04 και με την ομάδα χωρίς αγωγή (12,09±2,75) για 0,05>p>0,01, p=0,021 (γράφημα 3). Ο απόλυτος αριθμός των CD3CD8 θετικών λεμφοκυττάρων ήταν αυξημένος στη σύγκριση της ομάδας των βιολογικών παραγόντων (489,21±274,03) με την ομάδα των DMARDs (288,33±109,24) για 0,05>p>0,01, p=0,015 και με την ομάδα χωρίς αγωγή (218±71,75) για 0,05>p>0,01, p=0,03 (γράφημα 4). Γράφημα 3(αριστερά): Το ποσοστό των CD3CD8 λεμφοκυττάρων στις υποομάδες της ΡΑ (DMARDs, βιολογικοί παράγοντες και χωρίς αγωγή) με βάση την αγωγή. Γράφημα 4 (δεξιά): ο αριθμός των CD3CD8 λεμφοκυττάρων στις ίδιες υποομάδες της ΡΑ Τέλος, στην ομάδα της ΟΑ προέκυψε στατιστικά σημαντική αρνητική συσχέτιση της ηλικίας με τον αριθμό των CD3CD8 λεμφοκυττάρων με r=-0,589 για 0,05>p>0,01, p=0,021 (γράφημα 5). Γράφημα 5: Αρνητική συσχέτιση ηλικίας με τον αριθμό των CD3CD8 θετικών λεμφοκυττάρων

122 Σύγκριση της ομάδας της Ρευματοειδούς Αρθρίτιδας με την ομάδα ελέγχου Από τη στατιστική ανάλυση δεν προέκυψε στατιστικώς σημαντική διαφορά στην ηλικία μεταξύ της ομάδας της ΡΑ (50,24±11,66) και της ομάδας ελέγχου (51,8±12,16) (p=0,85>0,05). Όπως αναμενόταν βρέθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στους δείκτες φλεγμονής μεταξύ των δύο ομάδων (γράφημα 1). Η ΤΚΕ ήταν 31,9±17,59mm/h στους ασθενείς με ΡΑ και 14,33±5,88mm/h στους μάρτυρες, διαφορά στατιστικά σημαντική για p=0,001 και η CRP αντίστοιχα 1,09±1,45mg/dl και 0,4±0,12mg/dl, διαφορά στατιστικά σημαντική για p<0.01 (p=0,002). Γράφημα 1: Σύγκριση ΤΚΕ και CRP στις ομάδες ΡΑ και ΟΑ (τα αποτελέσματα της CRP πολλαπλασιάστηκαν επί 10 για λόγους ευκρίνειας) Τo ποσοστό των CD4CD26 Τ λεμφοκυττάρων στο σύνολο των Τ λεμφοκυττάρων στους ασθενείς με ΡΑ ήταν στατιστικά σημαντικά αυξημένο (60,71±9,71%) σε σχέση με των μαρτύρων (55,14±7,57%) για 0.05>p>0,01 (p=0.021) (γράφημα 2). Τα ποσοστά των CD4CD45RA, των CD4CD45RO και των CD8CD26 Τ λεμφοκυττάρων δεν διέφεραν στις δύο ομάδων. Τα CD8CD45RA και τα CD8CD45RO λεμφοκύτταρα όμως ήταν στατιστικά σημαντικά ελαττωμένα στην ομάδα των ασθενών με ΡΑ (γράφημα 4). Τα CD8CD45RA ήταν 20,24±7,26% στη ΡΑ και 23,8±5,69% στην ομάδα των μαρτύρων με διαφορά στατιστικά σημαντική για 0,05>p>0,01 (p=0,032) και το CD8CD45RO ήταν 12,85±6,73% στην ομάδα της ΡΑ και 18,76±7,06% στην ομάδα των μαρτύρων με διαφορά στατιστικά σημαντική για 0,01>p>0,001 (p=0,003). Το ποσοστό των CD4CD26 λεμφοκυττάρων στο σύνολο των CD4 Τ λεμφοκυττάρων ήταν στατιστικά σημαντικά αυξημένο στην ομάδα της ΡΑ σε σύγκριση με την ομάδα της ΟΑ (84,78±8,85% και 81,67±7,2% αντίστοιχα) για 0,05>p>0,01 (p=0,031) (γράφημα 3) ενώ το ποσοστό των CD8CD26 Τ λεμφοκυττάρων στο σύνολο των CD8 Τ λεμφοκυττάρων δεν διέφερε στις δύο ομάδες.

123 115 Γράφημα 2 (δεξιά): O μέσος όρος του ποσοστού των CD4CD26 λεμφοκυττάρων στις ομάδες ΡΑ και ΟΑ. Γράφημα 3 (αριστερά): Ο μέσος όρος του ποσοστού των CD4CD26 λεμφοκυττάρων στο σύνολο των CD4 θετικών λεμφοκυττάρων στις ίδιες ομάδες Στην στατιστική μελέτη της έκφρασης των μορίων σε απόλυτο αριθμό Τ λεμφοκυττάρων τα αποτελέσματα είναι διαφορετικά. Στατιστικά σημαντική διαφορά προέκυψε μόνο στα CD8CD45RO λεμφοκύτταρα τα οποία στους ασθενείς με ΡΑ ήταν μειωμένα, (198,78±136,86) σε σχέση με τους ασθενείς της ομάδας ελέγχου (275,93±108,79) για 0,05>p>0,01 (p=0,014). Γράφημα 4: Τα ποσοστά των CD8CD45RA και CD8CD45RO λεμφοκυττάρων στη ΡΑ και στην ΟΑ Η ενζυμική ενεργότητα της ολικής δεαμινάσης της αδενοσίνης (tada) και του ισοενζύμου ADA2 δεν είχε στατιστικά σημαντική διαφορά όταν συγκρίθηκαν οι ομάδες των ασθενών με ΡΑ και των ασθενών με ΟΑ. Το ποσοστό της ενζυμικής ενεργότητας του ισοενζύμου ADA2 ως προς την ενζυμική ενεργότητα της ολικής ADA (ADA2/tADA), ήταν αυξημένο στην ομάδα ασθενών με ΡΑ (87,95±11,81%) σε σχέση με την ομάδα ασθενών με ΟΑ (74,78±16,01%) και η διαφορά ήταν στατιστικά σημαντική για 0,05>p>0,01, p=0,014 (γράφημα 5). Το ισοένζυμο ADA1 ήταν μειωμένο στην ομάδα

124 116 των ασθενών με ΡΑ (3,9±4,55U/L) σε σχέση με την ομάδα των ασθενών με ΟΑ (8,15±7,25U/L) και η διαφορά είναι στατιστικά σημαντική για 0,05>p>0,01, p=0,034. Γράφημα 5: Σύγκριση του ποσοστού ADA2/tADA στις ομάδες ΡΑ και ΟΑ Σύγκριση των υποομάδων της ΡΑ με βάση την ενεργότητα της νόσου Η ηλικία δεν έχει στατιστικά σημαντική διαφορά ανάμεσα στις υποομάδες οι ο- ποίες σχηματίστηκαν με βάση την ενεργότητα της νόσου (DAS28 και CRP). Η ΤΚΕ είχε στατιστικά σημαντική διαφορά ανάμεσα στις υποομάδες (ύφεση 22,5±9,92mm/h, μικρή ενεργότητα 25,89±17,22mm/h, μέτρια ενεργότητα 41,42±18,49mm/h και υψηλή ενεργότητα 49±1,41mm/h ) για 0,05>p>0,01 (p=0,36) σε αντίθεση με τη CRP η οποία δεν διέφερε στατιστικά ανάμεσα στις ομάδες (γράφημα 1). Γράφημα 1: Η ΤΚΕ και η CRP στις ομάδες της ΡΑ με βάση την ενεργότητα της νόσου

125 117 Η στατιστική ανάλυση δεν ανέδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά στο ποσοστό των Τ λεμφοκυττάρων τα οποία εκφράζουν τα μόρια αλλά ούτε και στους απόλυτους α- ριθμούς Τ λεμφοκυττάρων όταν έγινε έλεγχος σε όλες τις ομάδες ταυτόχρονα (ANOVA). Στην σύγκριση όμως των υποομάδων σε ζεύγη προέκυψαν κάποιες διαφορές. Το ποσοστό των CD4CD26 λεμφοκυττάρων στο σύνολο των CD4 λεμφοκυττάρων ήταν στατιστικά σημαντικά αυξημένο στους ασθενείς με υψηλή ενεργότητα (91%), σε σχέση με τους ασθενείς με μικρή (80,78±13,6%) για 0,05>p>0,01 (p=0,033) και σε σχέση με την ομάδα των ασθενών με μέτρια (83,92±6,26%) για 0,05>p>0,01 (p=0,026). Στους ασθενείς με μέτρια ενεργότητα το ποσοστό των CD4CD26 λεμφοκυττάρων στο σύνολο των CD4 λεμφοκυττάρων ήταν στατιστικά σημαντικά μειωμένο (83,92±6,26%) σε σχέση με τους ασθενείς σε ύφεση (89,3±4,83) για 0.05>p>0,01 (p=0,039) (γράφημα 2). Το ποσοστό των CD8CD26 λεμφοκυττάρων στο σύνολο των CD8 λεμφοκυττάρων ήταν στατιστικά σημαντικά αυξημένο στους ασθενείς με υψηλή ενεργότητα (78,5±0,71%) σε σχέση με τους ασθενείς με μικρή (56,11±13,08%) για 0,05>p>0,01 (p=0,044) (γράφημα 3). Γράφημα 2: Ο μέσος όρος του ποσοστού των CD4CD26 λεμφοκυττάρων στο σύνολο των CD4 λεμφοκυττάρων (αριστερά) και Γράφημα 3: των CD8CD26 λεμφοκυττάρων στο σύνολο των CD8 λεμφοκυττάρων (δεξιά) στις υποομάδες της ΡΑ με βάση την ενεργότητα της νόσου Ο απόλυτος αριθμός των CD4CD45RA Τ λεμφοκυττάρων ήταν στατιστικά σημαντικά ελαττωμένος στην υποομάδα των ασθενών με μικρή ενεργότητα (479,11±158,87) σε σχέση με τους ασθενείς σε ύφεση (690,3±260,91), για 0,05>p>0,01 (p=0,041) και με τους ασθενείς με υψηλή ενεργότητα (867±120,2) για 0,05>p>0,01 (p=0,033) (γράφημα 4). Το ποσοστό των CD4CD45RO λεμφοκυττάρων ήταν ελαττωμένο στους ασθενείς με υψηλή ενεργότητα (29,93±0,99%) σε σχέση με τους ασθενείς σε ύφεση (49,18±10,09%), με στατιστικά σημαντική διαφορά για 0,05>p>0,01 (p=0,032), με τους ασθενείς με μικρή ενεργότητα (46,52±11,55%) για 0,05>p>0,01 (p=0,034) και με τους ασθενείς με μέτρια ενεργότητα (45,1±7,48%) για 0,05>p>0,01 (p=0,028) (γράφημα 5).

126 118 Η ενζυμική ενεργότητα της tada, της ADA2, της ADA1 και το ποσοστό της ADA2/tADA δεν είχε στατιστικά σημαντική διαφορά ανάμεσα στις υποομάδες των α- σθενών με ΡΑ με βάση την ενεργότητα της νόσου. Γράφημα 4: Ο αριθμός των CD4CD45RA λεμφοκυττάρων στις υποομάδες της ΡΑ με βάση την ενεργότητα της νόσου. Γράφημα 5: Το ποσοστό των CD4CD45RO θετικών λεμφοκυττάρων στις υποομάδες της ΡΑ με βάση την ενεργότητα της νόσου Σύγκριση των υποομάδων της ΡΑ με βάση τη φαρμακευτική αγωγή Από τη στατιστική ανάλυση των τεσσάρων ομάδων της φαρμακευτικής αγωγής (κορτικοειδή, DMARDs, βιολογικοί παράγοντες και χωρίς αγωγή) με μη παραμετρική μέθοδο (Kruskal-Wallis 1-way ANOVA) προέκυψε στατιστικά σημαντική διαφορά μόνο στον αριθμό των CD8CD45RO Τ λεμφοκυττάρων ανάμεσα στις υποομάδες με 0,05>p>0,01 (p=0,045). Η περαιτέρω στατιστική ανάλυση των ομάδων ανά δύο ανέδειξε διαφορές στην έκφραση των μορίων στα Τ λεμφοκύτταρα. Συγκεκριμένα, τα CD8CD26 Τ λεμφοκύτταρα ήταν στατιστικά σημαντικά αυξημένα στην ομάδα των ασθενών σε βιολογικό παράγοντα (278,21±158,96) σε σχέση με την ομάδα των ασθενών χωρίς αγωγή (129±41,87) για 0,05>p>0,01 (p=0,027) (γράφημα 1). Ο απόλυτος αριθμός των CD8CD45RA Τ λεμφοκυττάρων ήταν στατιστικά σημαντικά αυξημένος στην ομάδα των βιολογικών παραγόντων (367,21±162,35) σε σχέση με την ομάδα των DMARDs, (233,83±92,76) για 0,05>p>0,01 (p=0,045) (γράφημα 2). Το ποσοστό των CD8CD45RO Τ λεμφοκυττάρων ήταν στατιστικά σημαντικά αυξημένο στην ομάδα των βιολογικών παραγόντων (14,26±5,09%) σε σχέση με την ομάδα των γλυκοκορτικοειδών (7,58±2,34%), για 0,05>p>0,01 (p=0,019) (γράφημα 3). Τέλος τα CD8CD45RO Τ λεμφοκύτταρα ήταν επίσης στατιστικά σημαντικά αυξημένα στην ομάδα των βιολογικών παραγόντων (251,14±136,55) σε σχέση με αυτήν των DMARDs (138,5±65,99) για 0,01>p>0,001 (p=0,007).

127 119 Γράφημα 1: Ο αριθμός των CD8CD26 λεμφοκυττάρων στις υποομάδες της ΡΑ (βιολογικοί παράγοντες και χωρίς αγωγή) με βάση την αγωγή Γράφημα 2: Ο αριθμός των CD8CD45RA λεμφοκυττάρων στις υποομάδες της ΡΑ (DMARDs και βιολογικοί παράγονες) με βάση την αγωγή(αριστερά). Γράφημα 3: Το ποσοστό των CD8CD45RO στις υποομάδες της ΡΑ (κορτικοειδή και βιολογικοί παράγοντες) με βάση την αγωγή(δεξιά) Από τη σύγκριση της ενζυμικής ενεργότητας της tada,της ADA1, της ADA2 και του ποσοστού της ΕΕ της ADA2/tADA στις υποομάδες της ΡΑ με βάση τη φαρμακευτική αγωγή δεν προέκυψε στατιστικά σημαντική διαφορά.

128 Σύγκριση των υποομάδων της ΡΑ με βάση το ρευματοειδή παράγοντα Οι οροθετικοί, με θετικό ρευματοειδή παράγοντα, ασθενείς (n=21) δεν διέφεραν από τους οροαρνητικούς ασθενείς (n=10) στην έκφραση των περισσοτέρων μορίων στα Τ λεμφοκύτταρα με εξαίρεση τα CD8CD26 θετικά λεμφοκύτταρα. Στην υποομάδα των οροαρνητικών ασθενών παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση στον αριθμό των CD8CD26 λεμφοκυττάρων (273±98,9) σε σχέση με την ομάδα των οροθετικών (212,52±183,44), για 0,05>p>0,01, p=0,031 (γράφημα 1). Γράφημα 1: Ο αριθμός των CD8CD26 λεμφοκυττάρων σε οροθετικούς και οροαρνητικούς ασθενείς με ΡΑ Η ενζυμική ενεργότητα της tada, της ADA1και της ADA2 δεν διέφερε στις υ- ποομάδες οι οποίες σχηματίστηκαν με βάση το ρευματοειδή παράγοντα Σύγκριση της ομάδας του Συστηματικού Ερυθηματώδους Λύκου με την ομάδα ελέγχου Η στατιστική ανάλυση της ηλικίας και των δεικτών φλεγμονής στην ομάδα του ΣΕΛ και των μαρτύρων δεν ανάδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά. Από την στατιστική ανάλυση του ποσοστού συνέκφρασης των μορίων στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων στο σύνολο των Τ λεμφοκυττάρων προέκυψε στατιστικά σημαντική μείωση στην έκφραση του CD4CD45RO στην ομάδα του ΣΕΛ (35,46±11,17%) σε σχέση με την ομάδα των μαρτύρων (45,06±8,97%) για 0,05>p>0,01 (p=0,03) (γράφημα 1). Η συνέκφραση των μορίων CD4CD26, CD4CD45RA, CD8CD26, CD8CD45RA και CD8CD45RO στα Τ λεμφοκύτταρα δεν είχε στατιστικά σημαντική διαφορά. Το ίδιο παρατηρήθηκε και στην έκφραση των μορίων CD4CD45RO στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων σε απόλυτο αριθμό, όπου στην ομάδα του ΣΕΛ παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική μείωση (462,8±211,74) σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (670±187,52) για 0,05>p>0,01 (p=0,035) (γράφημα 2). Στην έκφραση των υπόλοιπων μορίων δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά.

129 121 Γράφημα 1: Σύγκριση του ποσοστού των CD4CD45RO θετικών λεμφοκυττάρων στις ομάδες ΣΕΛ και ΟΑ (αριστερά). Γράφημα 2: Σύγκριση του αριθμού ποσοστού των CD4CD45RO θετικών λεμφοκυττάρων στις ομάδες ΣΕΛ και ΟΑ (δεξιά) Το ποσοστό των CD4CD26 Τ λεμφοκυττάρων στο σύνολο των CD4 λεμφοκυττάρων και το ποσοστό των CD8CD26 Τ λεμφοκυττάρων στο σύνολο των CD8 λεμφοκυττάρων, δεν διέφερα στατιστικά ανάμεσα στις δύο ομάδες. Η ενζυμική ενεργότητα της tada και της ADA2 δεν είχε στατιστικά σημαντική διαφορά στη σύγκριση της ομάδας των ασθενών με ΣΕΛ με την ομάδα των ασθενών με ΟΑ. Το ποσοστό της ADA2/tADA όμως ήταν αυξημένο στην ομάδα των ασθενών με ΣΕΛ (91,59±8,67%) σε σύγκριση με την ομάδα των ασθενών με ΟΑ (74,78±16,01%) και η διαφορά ήταν στατιστικά σημαντική για 0,05>p>0,01, p=0,015 (γράφημα 3). Η ενζυμική ενεργότητα του ισοενζύμου ADA1 ήταν μειωμένη στην ομάδα των ασθενών με ΣΕΛ (2,2±2,4U/L) σε σχέση με την ομάδα των ασθενών με ΟΑ (8,15±7,25U/L) και η διαφορά ήταν στατιστικά σημαντική για 0,05>p>0,01, p=0,022. Γράφημα 3: Σύγκριση του ποσοστού της ADA2/tADA στις ομάδες της ΣΕΛ και της ΟΑ Η έκφραση των υπό μελέτη μορίων δεν διέφερε στατιστικά σημαντικά στις υποομάδες οι οποίες σχηματίστηκαν με βάση το δείκτη ενεργότητας SLEDAI αλλά ούτε και στη σύγκριση των ασθενών με νεφρίτιδα και των ασθενών χωρίς.

130 Σύγκριση αποτελεσμάτων στις τρεις κύριες ομάδες (ΡΑ, ΣΕΛ, Μάρτυρες) Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων και στις τρεις κύριες ομάδες ασθενών έδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά στο ποσοστό των CD4CD26 λεμφοκυττάρων για 0,01>p>0,001 (p=0,003), των CD8CD26 για 0,05>p>0,01 (p=0,025), των CD8CD45RA για 0,01>p>0,001 (p=0,002) και στο ποσοστό αλλά και τον απόλυτο αριθμό των CD8CD45RO λεμφοκυττάρων για 0,01>p>0,001 (p=0,004) και 0,05>p>0,01 (p=0,026) αντίστοιχα (γράφημα 1). Οι στατιστικά σημαντικές διαφορές οι οποίες προκύπτουν από την κατά ζεύγη στατιστική ανάλυση των ομάδων των ασθενών με την ομάδα των μαρτύρων δεν δικαιολογούν τα πιο πάνω αποτελέσματα πλήρως, οπότε έγινε στατιστική σύγκριση των μέσων όρων μεταξύ της ομάδας της ΡΑ και της ομάδας του ΣΕΛ. Γράφημα 1: Σύγκριση του ποσοστού των CD4CD26, CD8CD26, CD8CD45RA και CD8CD45RO θετικών λεμφοκυττάρων στις τρεις κύριες ομάδες (ΡΑ, ΣΕΛ και ΟΑ) Σύγκριση της ομάδας των ασθενών με ΡΑ με την ομάδα των ασθενών με ΣΕΛ Η έκφραση του ποσοστού των CD4CD26 Τ λεμφοκυττάρων ήταν στατιστικά σημαντικά αυξημένη στην ομάδα της ΡΑ (61,20±9,96%) σε σχέση με την ομάδα του ΣΕΛ (43,69±18,33%) για 0,01>p>0,001, p=0,004, ενώ το ποσοστό των CD8CD26 Τ λεμφοκυττάρων ήταν στατιστικά σημαντικά μειωμένο στην ομάδα της ΡΑ (13,79±6,32%) σε σχέση με του ΣΕΛ (21,7±10,66%) για 0,05>p>0,01, p=0,017. Το ποσοστό των CD8CD45RA και CD8CD45RO λεμφοκυττάρων ήταν στατιστικά σημαντικά μειωμένο στην ομάδα της ΡΑ (19,88±7,42% και 12,7±6,68% αντίστοιχα), σε σχέση με την ομάδα του ΣΕΛ (30,85±11,26% και 19,82±10,51% αντίστοιχα) για p=0,001 και για 0,05>p>0,01, p=0,023 αντίστοιχα. Η ενζυμική ενεργότητα της ολικής ADA και των ισοενζύμων ADA1 και ADA2 δεν είχε στατιστικά σημαντική διαφορά στη σύγκριση της ομάδας των ασθενών με ΡΑ και της ομάδας των ασθενών με ΣΕΛ.

131 Αποτελέσματα συσχέτισης στην ομάδα των ασθενών με Ρευματοειδή Αρθρίτιδα Στην ομάδα των ασθενών με ΡΑ η ηλικία έχει αρνητική συσχέτιση με τον απόλυτο αριθμό των CD4CD45RA Τ λεμφοκυττάρων με r=-0,416 για 0,05>p>0,01 (p=0,01), με το ποσοστό και τον απόλυτο αριθμό των CD8CD26 Τ λεμφοκυττάρων με r=-0,633 και r=-0,642 αντίστοιχα, για p<0,001 (γράφημα 1 και 2) και το ποσοστό των CD8CD26 Τ λεμφοκυττάρων στο σύνολο των CD8 λεμφοκυττάρων με r=-0,711 για p<0,001. Θετική συσχέτιση βρέθηκε μεταξύ της ηλικίας και του ποσοστού των CD4CD45RO Τ λεμφοκυττάρων στο σύνολο των Τ λεμφοκυττάρων με r=0,348 για 0,05>p>0,01 (p=0,047) (γράφημα 3). Γράφημα 1 και 2: Αρνητική συσχέτιση ηλικίας με το ποσοστό (αριστερά) και τον αριθμό (δεξιά) των CD8CD26 λεμφοκυττάρων στους ασθενείς με ΡΑ Γράφημα 3: Θετική συσχέτηση ηλικίας με το ποσοστού των CD4CD45RO λεμφοκυττάρων στους ασθενείς με ΡΑ Το ποσοστό των CD4CD26 λεμφοκυττάρων έχει στατιστικά σημαντική θετική συσχέτιση με το ποσοστό των CD4CD45RA Τ λεμφοκυττάρων με r=0,68 για p<0,001

132 124 (γράφημα 4). Ο απόλυτος αριθμός των CD4CD26 λεμφοκυττάρων έχει στατιστικά σημαντική θετική συσχέτιση με τους απόλυτους αριθμούς των CD4CD45RA με r=0,895 για p<0,001 και CD4CD45RO λεμφοκυττάρων με r=0,690 για p<0,001. Θετική συσχέτιση διαπιστώθηκε επίσης με τον απόλυτο αριθμό των CD8CD26 με r=0,576 για p<0,001 (γράφημα 5). Γράφημα 4: Θετική συσχέτιση μεταξύ των ποσοστών των CD4CD26 και των CD4CD45RA λεμφοκυττάρων Γράφημα 5: Θετική συσχέτιση μεταξύ του αριθμού των CD4CD26 και CD4CD45RA λεμφοκυττάρων και των CD4CD26 και CD4CD45RO θετικών λεμφοκυττάρων στους ασθενείς με ΡΑ Ο απόλυτος αριθμός των CD8CD26 Τ λεμφοκυττάρων έχει στατιστικά σημαντική θετική συσχέτιση με τους απόλυτους αριθμούς των CD8CD45RA με r=0,713 για p<0,001 και των CD8CD45RO λεμφοκυττάρων με r=0,602 για p<0,001 (γράφημα 6).

133 125 Γράφημα 6: Θετική συσχέτιση του αριθμού των CD8CD26 με τον αριθμό των CD8CD45RA και των CD8CD45RO θετικών λεμφοκυττάρων Το ποσοστό των CD4CD26 λεμφοκυττάρων στο σύνολο των CD4 λεμφοκυττάρων είχε στατιστικά σημαντική θετική συσχέτιση με το ποσοστό των CD4CD45RA λεμφοκυττάρων με r=0,531 για p=0,001 και στατιστικά σημαντική αρνητική συσχέτιση με το ποσοστό των CD4CD45RO λεμφοκυττάρων με r=-0,364 για 0,05>p>0,01 (p=0,037). Επιπλέον παρουσιάστηκε στατιστικά σημαντική θετική συσχέτιση με το ποσοστό των CD8CD26 θετικών λεμφοκυττάρων στο σύνολο των CD8 θετικών λεμφοκυττάρων με r=0,412 για 0,05>p>0,01 (p=0,017) (γράφημα 7). Γράφημα 7: Θετική συσχέτιση των CD4CD26 θετικών λεμφοκυττάρων στο σύνολο των CD4 λεμφοκυττάρων με το ποσοστό των CD8CD26 θετικών λεμφοκυττάρων στο σύνολο των CD8 λεμφοκυττάρων Ο δείκτης ενεργότητας DAS28CRP και ο δείκτης ενεργότητας DAS28ΤΚΕ είχαν θετική συσχέτιση με τη CRP και με τη ΤΚΕ. Η μεταξύ των δύο δεικτών συσχέτιση ήταν ισχυρά θετική με r=0,948 για p<0,001 (γράφημα 8). Οι δύο δείκτες ενεργότητας δεν παρουσίασαν συσχέτιση με τα υπό μελέτη βιομόρια.

134 126 Γράφημα 8: Θετική συσχέτιση μεταξύ του DAS28CRP και του DAS28TKE Η ενζυμική ενεργότητα της tada και της ADA1 στους ασθενείς με ΡΑ είχαν θετική συσχέτιση με την ΤΚΕ με r=0,556 για 0,05>p>0,01 (p=0,014) και r=0,514 για 0,05>p>0,01 (p=0,02) αντίστοιχα (γράφημα 9). Ο απόλυτος αριθμός και το ποσοστό των CD8CD26 T λεμφοκυττάρων είχε αρνητική συσχέτιση με την ενζυμική ενεργότητα της ADA2 με r=-0,479 για 0,05>p>0,01 (p=0,038) και με r=-0,481 για 0,05>p>0,01 (p=0,037) αντίστοιχα (γράφημα 10). Η ενζυμική ενεργότητα της tada είχε θετική συσχέτιση με την ενζυμική ενεργότητα της ADA1 με r=0,569 για 0,05>p>0,01 (p=0,011) και της ADA2 με r=0,871 για p<0,001 (γράφημα 11). Γράφημα 9 (αριστερά): Θετική συσχέτιση της ΤΚΕ με την ενζυμική ενεργότητα της tada και της ADA1. Γράφημα 10 (δεξιά): Αρνητική συσχέτιση της ενζυμικής ενεργότητας της tada με τον απόλυτο αριθμό των CD8CD26.

135 127 Γράφημα 11: Θετική συσχέτιση της ενζυμικής ενεργότητας της tada με την ενζυμική ενεργότητα της ADA1 και της ADA Αποτελέσματα συσχέτισης στην ομάδα των ασθενών με Συστηματικό Ερυθημάτωδη Λύκο Στην ομάδα των ασθενών με ΣΕΛ η ηλικία είχε στατιστικά σημαντική αρνητική συσχέτιση με το ποσοστό και τον απόλυτο αριθμό των CD8CD26 Τ λεμφοκυττάρων με r=-0,754 για 0,05>p>0,01 (p=0,012) και r=-0,657 για 0,05>p>0,01 (p=0,039) αντίστοιχα (γράφημα 1 και 2). Γράφημα 1: Αρνητική συσχέτιση του ποσοστού (αριστερά) και Γράφημα 2: του αριθμού (δεξιά) των CD8CD26 θετικών λεμφοκυττάρων με την ηλικία στους ασθενείς με ΣΕΛ Η C αντιδρώσα πρωτεΐνη (CRP), είχε στατιστικά σημαντική αρνητική συσχέτιση με το ποσοστό των CD4CD26 Τ λεμφοκυττάρων με r=-0,640 για 0,05>p>0,01 (p=0,046). Ο απόλυτος αριθμός των CD4CD26 Τ λεμφοκυττάρων είχε στατιστικά σημαντική θετική συσχέτιση με τους απόλυτους αριθμούς των CD4CD45RA και CD4CD45RO Τ λεμφοκυττάρων με r=0,782 για 0,01>p>0,001 (p=0,008) και r=0,770 για 0,01>p>0,001 (p=0,009) αντίστοιχα (γράφημα 3).

136 128 Γράφημα 3: Θετική συσχέτιση του αριθμού των CD4CD26 λεμφοκυττάρων με τον αριθμό των CD4CD45RA και CD4CD45RO θετικών λεμφοκυττάρων Τέλος το ποσοστό των CD4CD26 Τ λεμφοκυττάρων στο σύνολο των CD4 λεμφοκυττάρων είχε στατιστικά σημαντική θετική συσχέτιση με το ποσοστό των CD8CD26 Τ λεμφοκυττάρων στο σύνολο των CD8 λεμφοκυττάρων με r=0,661 για 0,05>p>0,01 (p=0,038) (γράφημα 4). Γράφημα 4: Θετική συσχέτιση του ποσοστού των CD4CD26 θετικών λεμφοκυττάρων στο σύνολο των CD4 λεμφοκυττάρων με το ποσοστό των CD8CD26 θετικών λεμφοκυττάρων στο σύνολο των CD8 λεμφοκυττάρων Στην ομάδα των ασθενών με ΣΕΛ παρατηρήθηκε αρνητική συσχέτιση της ενζυμικής ενεργότητας της ADA2 με το ποσοστό και τον απόλυτο αριθμό των CD8CD26 Τ λεμφοκυττάρων με r=-0,781 για 0,05>p>0,01 (p=0,022) (γράφημα 5). Η ενζυμική ενεργότητα της ADA2 είχε θετική συσχέτιση με την ενζυμική ενεργότητα της tada με r=0,906 για 0,01>p>0,001 (p=0,002) (γράφημα 6).

137 129 Γράφημα 5: Αρνητική συσχέτιση της ενζυμικής ενεργότητας της ADA2 με τον απόλυτο αριθμό των CD8CD26 λεμφοκυττάρων (αριστερά). Γράφημα 6: Θετική συσχέτιση της ενζυμικής ενεργότητας της ADA2 με της tada (δεξιά) Αποτελέσματα συσχέτισης στην ομάδα ελέγχου (ασθενείς με Οστεοαρθρίτιδα) Στους ασθενείς της ομάδας ελέγχου παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική αρνητική συσχέτιση της ηλικίας με τους απόλυτους αριθμούς των CD8CD26 και CD8CD45RA Τ λεμφοκυττάρων με r=-0,582 για 0,05>p>0,01 (p=0,023) και r=-0,748 για p=0,001 (γράφημα 1). Γράφημα 1: αρνητική συσχέτιση της ηλικίας με τον αριθμό των CD8CD26 και CD8CD45RA λεμφοκυττάρων Το ποσοστό των CD4CD26 Τ λεμφοκυττάρων είχε στατιστικά σημαντική θετική συσχέτιση με το ποσοστό των CD4CD45RA Τ λεμφοκυττάρων με r=0,546 για 0,05>p>0,01 (p=0,035) (γράφημα 2). Θετική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ του απόλυτου αριθμού των CD4CD26 και των CD4CD45RA και CD4CD45RO Τ λεμφοκυττάρων με r=0,921 για p<0,001 και με r=0,557 για 0,05>p>0,01 (p=0,031) αντίστοιχα.

138 130 Γράφημα 2: Θετική συσχέτηση μεταξύ του αριθμού των CD4CD26 και των CD4CD45RA θετικών λεμφοκυττάρων Το ποσοστό των CD8CD26 Τ λεμφοκυττάρων παρουσίασε θετική συσχέτιση με το ποσοστό των CD8CD45RA με r=0,593 για 0,05>p>0,01 (p=0,02). Παρομοίως και οι απόλυτοι τους αριθμοί με r=0,691 για 0,01>p>0,001 (p=0,004) (γράφημα 3). Τέλος, το ποσοστό των CD4CD26 Τ λεμφοκυττάρων στο σύνολο των CD4 λεμφοκυττάρων είχε θετική συσχέτιση με το ποσοστό των CD4CD45RA με r=0,563 για 0,05>p>0,01 (p=0,029) και αρνητική με το ποσοστό των CD4CD45RO με r=-0,755 για p=0,001 (γράφημα 4). Γράφημα 3: Θετική συσχέτιση του αριθμού των CD8CD26 με τον αριθμό των CD8CD45RA θετικών Τ λεμφοκυττάρων (αριστερά). Γράφημα 4: Θετική συσχέτιση του ποσοστού των CD4CD26 θετικών Τ λεμφοκυττάρων στο σύνολο των CD4 λεμφοκυττάρων με το ποσοστό των CD4CD45RA και αρνητική με το ποσοστό των CD4CD45RO θετικών λεμφοκυττάρων (δεξιά) Στην ομάδα ελέγχου η ενζυμική ενεργότητα της tada είχε θετική συσχέτιση με την ενζυμική ενεργότητα της ADA1 με r=0,644 για 0,05>p>0,01 (p=0,024) και της ADA2 με r=0,745 για 0,01>p>0.001 (p=0,005) (γράφημα 5).