(Στάδια τεχνολογίας rdna)

Transcript

1 (Στάδια τεχνολογίας rdna) Έτσιτακοσµίδια (σανπλασµίδια): Αφ ενόςµενπεριέχουνµιαθέσηγιατηδράση περιοριστικής ενδονουκλεάσης και συνεπώς εισαγωγής ξένου DNA (και µάλιστα µεγάλου µεγέθους), Αφ ετέρου δε, περιέχουν ένα γονιδιακό δείκτη αντοχής σ ένα αντιβιοτικό που κάνει εύκολη τη συλλογή βακτηριακών ξενιστών που περιέχουν τοανασυνδυα-σµένοκοσµίδιο. Μπορούν ακόµα να πακεταριστούν σε πρωτεϊνικές κάψεςτωνιών, καιναµεταφέρουνεύκολατοξένο DNA στοβακτηριακόξενιστή. Παρ όλααυτάόµωςδελύνουντοπρόβληµατης αστάθειας των πλασµιδίων.

2 Εισαγωγή ανασυνδυασµένου DNA στο κύτταρο του ξενιστή. 1 ος )Τρόπος: Πολλά βακτήρια και ευκαρυωτικά κύτταρα έχουν την ικανότητα να προσλαµβάνουν από το περιβάλλον (από το θρεπτικόµέσο) γυµνάµόρια DNA. Ηπρόσληψηαυτήείναιβέβαιαπολύµικρή (1 µόριο DNA από 10 6 µόρια DNA), αλλάσεκατάλληλεςπειραµατικές συνθήκεςγίνεταισεικανοποιητικόβαθµό. Τααποτελέσµαταείναικαλύτεραότανχρησιµοποιηθούν, όπως συνήθως συµβαίνει, κύτταρα µεταλλαγµένων βακτηρίωνπουδεναποικοδοµούνγρήγορατοξένο DNA. Πρόσληψη rdna µπορεί να γίνει και από ζωϊκά κύτταρα, τα οποία έχουν την ικανότητα να προσλαµβάνουν ξένα µόρια DNAπουέχουνκαταβυθισθείµεφωσφορικόκάλιο. Ανκαιηπρόσληψηκαιστησυνέχειαηενσωµάτωσητου ξένου DNA στοχρωµοσωµικό DNA τουκυττάρουείναιµικρή, εντούτοις η µέθοδος χρησιµοποιείται γιατί είναι πολύ απλή

3 (Εισαγωγή ανασυνδυασµένου DNA στο κύτταρο του ξενιστή.) 2 ος )Τρόπος: Μέθοδος µε καλύτερα αποτελέσµατα που χρησιµοποιείται στα ζωϊκά κύτταρα, είναι η εισαγωγή ξένου DNA µεγυάλινηµικροσύριγγα (διαµέτρου 0,1 µm) στονπυρήνατουκυττάρου. Ένα εκπαιδευµένο άτοµο µπορεί να κάνει τέτοια ένεση σε εκατοντάδες κύτταρα την ώρα και ένα ποσοστό αυτών των κυττάρων να είναι βιώσιµα και να περιέχουντοξένο DNA (νέαγονίδια). 3 ος )Τρόπος: Πρόσληψη ξένου DNA µπορεί να γίνει και από φυτικά κύτταρα στα οποία έχει αποµακρυνθεί το κυτταρικό περίβληµα, µετά από κατεργασία µε κυτταρινάση, όταν το ξένο DNA περιέχεται στο θρεπτικό υλικό µαζί µε ασβέστιο και πολυαιθυλενογλυκόλη.

4 (Εισαγωγήανασυνδυασµένου DNA στοκύτταροτουξενιστή). 4 ος ) Τρόπος: Σε µερικά είδη φυτικών κυττάρων, όπως τα δικοτυλήδονακαιµερικάείδηαπόταµονοκοτυλήδονα (όχιόµωςτα σηµαντικά από εµπορική άποψη µονοκοτυλήδονα δηµητριακά) το ξένο DNA µπορεί να εισαχθεί µε τη βοήθειατωνπαραγώγωντουτi-πλασµιδίου. Συγκεκριµένα, µερικάείδηβακτηρίωντουεδάφους (π.χ. Agrobacterium tumefaciens) µολύνουν τα φυτά και εισάγουνξέναγονίδιασ αυτά. Στοσηµείοτηςµόλυνσηςαναπτύσσεται ένας όγκος (κάλλος) από φυτικά κύτταρα, αντίστοιχα των ζωϊκών καρκινικών κυττάρων, που συνθέτουν παράγωγα αµινοξέων που είναι απαραίτητα για τα βακτήρια αυτά.

5 (Εισαγωγή ανασυνδυασµένου DNA στο κύτταρο του ξενιστή.) 4ος ) Τρόπος: Η αλλαγή του µεταβολισµού των µολυσµένων φυτικών κυττάρων για να παράγουν τα απαραίτητα συστατικά για τα βακτήρια γίνεται από την εισαγωγή του Ti-πλασµιδίου από τα βακτήρια στα φυτικά κύτταρα, οπότε ένα µικρό ποσοστό από τα Tiπλασµίδια ενσωµατώνεται στο DNA των φυτικών κυττάρων.

6 (Εισαγωγή ανασυνδυασµένου DNA στο κύτταρο του ξενιστή.) 5ος ) Τρόπος: Έναςπιοπολύπλοκοςτρόπος (electroporation) βασίζεται στο γεγονός ότι οι πλασµατικές µεµβράνες των φυτικών κυττάρων, όταν βρεθούν σε υψηλό ηλεκτρικό πεδίο, γίνονται παροδικά διαπερατές από µεγάλα µόρια. Όταν λοιπόν εφαρµοσθεί ηλεκτρικό πεδίο σε κύτταρα στα οποία έχει αποµακρυνθεί το κυτταρικό περίβληµα παρουσία ξένου DNA, το DNA αυτό µπαίνει µέσα στο κύτταρο. Στη συνέχεια αφήνονται τα κύτταρα να ξαναφτιάξουν το κυτταρικό τους περίβληµα και γίνονται πια βιώσιµα κύτταρα που περιέχουν ξένο DNA, ενσωµατωµένο στο δικό τους DNA. Η µέθοδος αυτή έχει εφαρµοστεί στα δηµητριακά.

7 (Εισαγωγήανασυνδυασµένου DNA στοκύτταροτουξενιστή). 6 ος ) Τρόπος: Άλλοςτρόποςεισαγωγήςτουξένου DNA στα κύτταραγίνεταιµετουςιούς. Ο τρόπος αυτός είναι περισσότερο αποδοτικός και παρουσιάζει πολλά πλεονεκτήµατα σε σχέση µε τις άλλεςµεθόδουςπουαναφέρθηκαν. Στα µεν βακτήρια π.χ. E.coli οι περισσότεροι γνωστοίιοίείναιολφάγοςκαιο M13. ΟΜ 13έχειτοπλεονέκτηµαναµησκοτώνειτο βακτηριακόξενιστή. Σταζωϊκάκύτταραοιπιοαποδοτικοίιοίείναι οι ρετροϊοί (συνήθως δε σκοτώνουν τον ξενιστή) οιός SV40πουείναιοπερισσότερο συνηθισµένος ιός που χρησιµοποιείται σα φορέας.

8 Κλωνοποίηση: Στα στάδια της τεχνολογίας rdna ακoλoυθεί τo στάδιo της κλωvoπoίησης, δηλαδή της απoµόvωσης εvός καθαρoύ κλώvoυ κυττάρωv τoυ ξεvιστή πoυ vα περιέχoυv τo rdna. Η κλωvoπoίηση αρχίζει µε τηv εφαρµoγή τoυ φαιvoµέvoυ τoυ µετασχηµατισµoύ τoυ ξεvιστή χρησιµoπoιώvτας τoµίγµατωvµoρίωv rdnaπoυπαρασκευάστηκε. Ταµόριαόµωςαυτά είναι λίγα, για να µπορέσουν να χρησιµοποιηθούν για οποιαδήποτε εργασία, συνυπάρχουν δε µ ένα µεγάλο αριθµό άλλων µορίων DNA πουδενέχουνανασυνδυασθεί. Ακόµη λιγότερα είναι εκείνα που έχουν εισαχθεί στον ξενιστή, ώστε τελικά να υπάρχουν στη διάθεσή µας πολύ λίγα µετασχηµατισµένα κύτταρα που να περιέχουν το rdnaκαιµάλιστασεµιαγονιδιακήβιβλιοθήκη.

9 (Κλωνοποίηση) Ένααπόταπιοδύσκολαπροβλήµαταείναιναξεχωρίσει κανείς τα κύτταρα που θέλει και να τα καλλιεργήσει. Η έκταση του προβλήµατος φαίνεται από το ακόλουθο παράδειγµα: Έστω ότι µελετάται το γονίδιο της αυξητικής ορµόνης τουανθρώπου. Ξεκινώντας, κατά τα γνωστά, από το DNA του ανθρώπουκόβεταισεκοµµάτιαµετοένζυµο EcoRI, εισάγονται όλα τα κοµµάτια σε πλασµίδια και αυτά σε κύτταρα E.coli. Αν το γονίδιο που µελετάται έχει συµπεριληφθεί σ ένατέτοιοκοµµάτικαιαφούτο DNA απότοένζυµο EcoRI έχει κοπεί σε περίπου κοµµάτια, στην πραγµατικότητα γίνεται προσπάθεια να εντοπισθεί ένα είδος κυττάρου δουλεύοντας στη γονιδιακή βιβλιοθήκη µεαναλογίακυττάρων προς 1.

10 (Κλωνοποίηση) Το πρόβληµα της πιστοποίησης των κυττάρων αυτών αντιµετωπίζεται µε διάφορους τρόπους: 1 ος ) Τρόποςπιστοποίησης Βασίζεται στις ιδιότητες του φορέα, δηλαδή την ικανότητα µερικών πλασµιδίων να κάνουν ανθεκτικό τον ξενιστή σ ένα ή δύο αντιβιοτικά, µε αποτέλεσµα η καλλιέργεια του συνόλου των κλώνων του ξενιστή παρουσία των αντιβιοτικώναυτών, παρεµποδίζει την ανάπτυξη των ανεπιθύµητων κλώνων

11 (Κλωνοποίηση) 2 ος ) Τρόπος πιστοποίησης: Βασίζεταισ αυτότο ίδιοτοξένογονίδιοκαι συνίσταται στο να ψαρέψει κανείς το ζητούµενοκλώνο, δηλαδή το επιθυµητό εκείνο κύτταρο του ξενιστή µε κάποιο ειδικό αγκίστρι, που δενείναιάλλοαπότο συµπληρωµατικό DNA (cdna) ή το αντίστοιχο mrna που έχει ιχνοθετηθείµε 32 Ρ.

12 (Κλωνοποίηση: 2ος ) Τρόπος πιστοποίησης) Ηόληπορείαέχειωςεξής: Οιαποικίεςτωνκλώνωντου ξενιστή αν έχουν χρησιµοποιηθείπλασµίδια (ήοιπλάκεςαν έχουνχρησιµοποιηθείφάγοι) αποτυπώνονται σ ένα φίλτρο νιτροκυτταρίνης. Μεαυτότοντρόπο µεταφέρονται στο φίλτρο µερικά βακτήρια από τις αποικίες, αλλά στις ακριβώς αντίστοιχες θέσεις που είχανοιαποικίες. Το φίλτρο κατεργάζεται µε NaOH για τη λύση των κυττάρωνκαιτηµετουσίωσητου DNA (ηδιπλήαλυσίδαςγίνεταιµονή).

13 (Κλωνοποίηση: 2ος ) Τρόπος πιστοποίησης) Σταθεροποιείται το DNA στο φίλτρο µε ξήρανση σε φούρνοκενού. Tοφίλτροεπωάζεταισε διάλυµα επίσης µετουσιωµένου σε θέρµανση ραδιενεργού cdna, ώστε να σχηµατισθούν οι διπλές αλυσίδες από τα DNA του ξενιστή και τα cdna. Aποµακρύνεται το αδέσµευτο cdna µε ξέπλυµα.

14 (Κλωνοποίηση: 2ος ) Τρόπος πιστοποίησης) Τοφίλτρο υποβάλλεται σε αυτοραδιογράφηση, οπότε εντοπίζεται η αποικία που περιέχει το δεσµευµένο cdna και συνεπώς περιέχει καιτογονίδιοπου αναζητάται.

15 (Κλωνοποίηση) 3 ος ) Τρόπος πιστοποίησης: Στις περιπτώσεις όµως (καιείναιοι περισσότερες) που δεν υπάρχει διαθέσιµο τοκατάλληλο cdna, χρησιµοποιούνται άλλοι τρόποι που βασίζονται στις πρωτεΐνες που παράγονται από το ξένο αυτό γονίδιο του ξενιστή. Γιαπαράδειγµα, γίνεται µεταφορά των αποικιώνσεφίλτρα.

16 (Κλωνοποίηση:3ος ) Τρόπος πιστοποίησης) Προστίθεται πλήρες mrna από τον οργανισµό κάτω από συνθήκες που ευνοούν τον υβριδισµό του DNA-mRNA. Τα µη δεσµευµένα mrna αποµακρύνονται µε πλύσιµο. Τα δεσµευµένα mrna παραλαµβάνονται µε αραιό διάλυµα αλάτων και προστίθενται σε κατάλληλο in vitro σύστηµα για πρωτεϊνοσύνθεση. Παραλαµβάνονται οι αντίστοιχες πρωτεΐνες, που πιστοποιούνται µε χηµικές ή βιολογικές ή ανοσολογικές µεθόδους.

17 (Κλωνοποίηση: 3ος ) Τρόπος πιστοποίησης) Ανµιααποικίαφέρειτο ζητούµενο rdna, αυτόθαδεσµεύσειτο αντίστοιχο mrna, µε την πρωτεϊνοσύνθεση θα συντεθεί η αντίστοιχη πρωτεΐνη και µετηνπιστοποίησητης πρωτεΐνης αυτής θαβρεθείηαποικίαµετο ξένοαυτό DNA.

18 (Κλωνοποίηση) Το cdnaµπορείνασυντεθείχηµικά, ότανείναιγνωστήησειράτωναµινοξέωνστην πρωτεΐνη ήσεµέροςτηςπρωτεΐνηςπουπαράγεταιαπό τονξενιστήµετοξένο DNA. Τοπρόβληµασ αυτήτηνπερίπτωσηείναιότιθα πρέπει να συντεθεί µίγµα νουκλεοτιδίων για µια δεδοµένησειράαµινοξέων, αφού κάθε αµινοξύ µπορεί να κωδικοποιείται µε περισσότερους του ενός τρόπους.

19 (Κλωνοποίηση) Όταv η κλωvoπoίηση γίvεται µε στόχo τηv παραγωγή µεγάλωv πoσoτήτωv ενός εvζύµoυ ή πεπτιδικής oρµόvης κ.λπ. πoυ κωδικoπoιείται από τoαvασυvδυασµέvoγovίδιo, τότεπρoκύπτoυv πρόσθετα πρoβλήµατα, επειδή κάθε κύτταρo διαθέτει ειδικoύς µηχαvισµoύς, πoυ ρυθµίζoυv πότε και αv θα αρχίσει και πότε θα σταµατήσει η έκφραση κάπoιας γεvετικής πληρoφoρίας τoυ γεvετικoύ υλικoύτoυ.

20 (Κλωνοποίηση) Έτσι, έvας από τoυς πιo σηµαvτικoύς στόχoυς της τεχvoλoγίας rdna είvαι vα δηµιoυργήσει vέoυς φoρείς, πoυ vα περιέχoυv τoυς ρυθµιστικoύς µηχαvισµoύς έκφρασης γovιδίωv τoυ ξεvιστή σε γειτovικές θέσεις µε τo σηµείo, όπoυ θα πρoστεθεί τo ξέvo DNA, ώστε vα βελτιστoπoιείται η έκφραση της επιθυµητής γεvετικής πληρoφoρίας στις συvθήκες της βιoµηχαvικής βιoδιεργασίας.

21 (Κλωνοποίηση) Επίσης, o φoρέας µπoρεί vα εξoπλισθεί µε τις ρυθµιστικές αλληλoυχίες βάσεωv πoυ vα κωδικoπoιoύvτιςπρωτεΐvεςπoυδίvoυvτoσήµα γιααπέκκρισητωvεπιθυµητώvπρωτεϊvικώv µoρίωv από τo κύτταρo-ξεvιστή, πράγµα πoυ απλoπoιεί σηµαvτικά τo στάδιo καθαρισµoύ τoυ πρoϊόvτoς στη βιoµηχαvική κλίµακα.

22 Οι τελευταίες εξελίξεις στov τoµέα της αυτoµατoπoιηµέvης αvάλυσης της αλληλoυχίας αµιvoξέωv και της χωρoταξικής δoµής τωv πρωτεϊvικώvµoρίωvµεηλεκτρovικoύςυπoλoγιστές και µε κρυσταλλoγραφικές µελέτες σκέδασης ακτίvωv Χ, δίvoυv αvεκτίµητες πληρoφoρίες για τις αλλαγές στηv αλληλoυχία αµιvoξέωv, πoυ µπoρoύv vαπρoικίσoυvέvαέvζυµoµεεπιθυµητέςιδιότητες, όπωςηθερµoαvθεκτικότητα. Η επίσης αυτoµατoπoιηµέvη σήµερα παρασκευή τωvαvτίστoιχωvσυvθετικώvµoρίωv DNAδίvoυv ακόµα πιo συvταρακτικές δυvατότητες στηv τεχvoλoγία rdna.

23 Γονιδιακή τεχνολογία Η αναζήτηση µιας συγκεκριµένης ακολουθίας βάσεωνσεέναµόριο DNA, µπορείναγίνειµετη µέθοδο Southern Blot. Ηανάλογηµεαυτήµέθοδοςγιατο RNA, είναι γνωστήσαν Nothern Blot. Κάνονταςλογοπαίγνιοµετουςόρουςαυτούς, ονοµάστηκε σαν Western blot η ανάλογη µέθοδος ανίχνευσης µιας πρωτεΐνης µε ηλεκτροφορητικό διαχωρισµό αυτής και ανοσοαποτύπωση.

24 (Γονιδιακή τεχνολογία) Κατάτηµέθοδο Southern Blot : Το εξεταζόµενο DNA κατεργάζεται µε την κατάλληλη περιοριστική ενδονουκλεάση

25 (Γονιδιακήτεχνολογία, µέθοδος Southern Blot) Τα κοµµάτια που προκύπτουν διαχωρίζονται µε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης.

26 (Γονιδιακήτεχνολογία, µέθοδος Southern Blot) ιαχωρίζονται οι δύο αλυσίδες µεταξύ τους (µετουσίωση και µεταφέρονται σε φίλτρο νιτροκυτταρίνης.

27 (Γονιδιακήτεχνολογία, µέθοδος Southern Blot) Υβριδοποιούνται µε µια µονή αλυσίδα DNA ραδιενεργά ιχνοθετηµένη, η οποία είναι συµπληρωµατική του ζητούµενου τµήµατος του DNA

28 (Γονιδιακήτεχνολογία, µέθοδος Southern Blot) Με αυτοραδιογραφία καθορίζεται η ύπαρξη ή µη, σε σχέση µεέναζητούµενοκοµµάτιτου DNA.

29 Απότησύγκριση -µετηβοήθειατης ηλεκτροφορητικής εικόνας γνωστών µοριακού βάρους κοµµατιών DNA, µπορούν να εξαχθούν συµπεράσµατα και για τα µοριακά βάρη των κοµµατιών του DNA που προκύπτουν από τη δράση τηςπεριοριστικήςενδονουκλεάσης. Μιαµετάλλαξηστο DNAµπορείνααλλάξειτις θέσεις διάσπασης αυτού από τις περιοριστικές ενδονουκλεάσες, µε αποτέλεσµα να προκύπτουν διαφορετικού µοριακού βάρους κοµµάτια από το µεταλλαγµένο DNA. ιαφορετικού µοριακού βάρους, όµως, κοµµάτια λαµβάνονται και από διαφορετικά άτοµα που δεν είναι ταυτόσηµα γενετικά.

30 Η γενετική ποικιλοµορφία σ ένα πληθυσµό λέγεται πολυµορφισµός. Τοφαινόµενοτηςδιάσπασηςτου DNA σε διαφορετικές θέσεις από τις ενδονουκλεάσες λέγεται πολυµορφισµός µήκους περιοριστικών θραυσµάτων (restriction fragment length polymorphism, RFLP). Η µέθοδος αυτή βρίσκει πολλές εφαρµογές όπως στην παρακολούθηση της κληρονοµικότητας συγκεκριµένωνγονιδίων, στην ανίχνευση µεταλλάξεων και γενετικών ασθενειών, στην ιατροδικαστική κ.λπ.

31 (Γονιδιακή τεχνολογία) Συνήθως πριν εφαρµοσθεί η µέθοδο Southern Blot, το προς µελέτη DNA πολλαπλασιάζεται µε πολλαπλή αντιγραφή, χωρίς τη χρήση περιοριστικών ενδονουκλεασών, φορέων, ξενιστώνκ.λπ. µε τη µέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης (PCR). Σύµφωναµετηµέθοδο : Ηδιπλήαλυσίδατουπρος µελέτη DNA, διαχωρίζεται µε θέρµανση σε δύο µονές αλυσίδες.

32 (Γονιδιακή τεχνολογία) Προστίθενται δύο ολιγονουκλεοτίδια, σαν εκκινητήριαµόρια, καθ ένααπότα οποία προσδένεται (λόγω των συµπληρωµατικών του βάσεων) σε κάθε µια από τις δύο αλυσίδες του DNA και µάλιστασταδύοάκρατου τµήµατος του DNA που πρόκειται να πολλαπλασιαστεί. Η πρόσδεση των εκκινητήριων µορίων γίνεται µε ψύξη µετά από θέρµανση του δείγµατος. Η κυκλική θέρµανση και ψύξη ρυθµίζεται από ηλεκτρονικόυπολογιστή.

33 (Γονιδιακή τεχνολογία) Στη συνέχεια, παρουσία των τριφωσφορικών δεοξυ-ριβονου-κλεοτιδίων και µιας ειδικής θερµοανθεκτικής πολυµεράσης του DNA, βιοσυντίθενται νέες αλυσίδες του DNA προς τιςδύοκατευθύνσεις, ξεκινώντας από τα δύο εκκινητήρια µόρια. Ηδιεργασίααυτή επαναλαµβάνεται µε το ίδιο µίγµα αντίδρασης για πολλέςφορές (20 30 φορές).

34 (Γονιδιακή τεχνολογία) Απότοντρίτοκύκλο σχηµατίζονται διπλές αλυσίδες DNA µε µήκος αντίστοιχο της απόστασης µεταξύ των δύο εκκινητήριων µορίων, των οποίων η συγκέντρωση διπλασιάζεται περίπου σε κάθε κύκλο, µέχρι πουόλασχεδόντα τµήµατα που βιοσυντίθενται να έχουν τοσωστόµήκος.

35 (Γονιδιακή τεχνολογία) Για το σχηµατισµό του ξένου DNA στην τεχνολογία του ανασυνδυασµένου DNA, έχει µεγάλη σηµασία η δυνατότητα αφ ενόςµεντηςεύρεσηςτηςακολουθίαςτων βάσεωνσεκοµµάτια DNA, αφ ετέρουδεησύνθεσηκοµµατιών DNAµε ορισµένηακολουθίαβάσεων. Ηεύρεσητηςακολουθίαςτωνβάσεωνσεκοµµάτια DNA µπορεί να γίνει µετηµέθοδοτηςχηµικήςδιάσπασηςτων Maxam και Gilbert ή µε παρεµπόδιση της δράσης της πολυµεράσης από 2,3 -διδεοξυ-ανάλογα των νουκλεοτιδίων (µέθοδος των διδεοξυ-αναλόγων του Sanger).

36 (Γονιδιακή τεχνολογία) Σύµφωναµετηµέθοδοτης χηµικής διάσπασης των Maxamκαι Gilbert: Τουπόµελέτηκοµµάτι του DNA φωσφορυλιώνεται µεραδιενεργό 32 Ρ. ιαχωρίζονται οι αλυσίδες τουµενaοη. Το διάλυµα (που περιέχει τιςαλυσίδεςτουενλόγω DNA) διαχωρίζεταισε 4 ίσα κλάσµατα.

37 (Γονιδιακή τεχνολογία) Τοκαθένααπότα κλάσµατα κατεργάζεται µε κατάλληλα αντιδραστήρια σεκατάλληλεςσυνθήκες, οπότε καταστρέφονται µερικές από τις συγκεκριµένες σε κάθε κλάσµαβάσεις. Στησυνέχειατα προϊόντα της διάσπασης διαχωρίζονται µε ηλεκτροφόρηση. Αυτοραδιογραφούνται και «ιαβάζεται» η σειρά των βάσεων.

38 (Γονιδιακή τεχνολογία) Σύµφωνα µε τη µέθοδο των διδεοξυαναλόγων του Sanger: Το διάλυµα που περιέχει το προς µελέτη µόριο του DNA (σεµονή αλυσίδα που περιέχειόµωςσαν εκκινητή ένα συµπληρωµατικό τµήµα ή δηµιουργείται ένα τέτοιο τµήµα) διαχωρίζεταισε 4 κλάσµατα.

39 (Γονιδιακή τεχνολογία) Σε κάθε κλάσµα γίνεται αντιγραφή του DNA παρουσία της πολυµεράσης Ι του DNA, των τριφωσφορικών δεοξυ-νουκλεοτιδίων (datp,dctp, dgtp και dttp) και ενός διδεοξυ-νουκλεοτιδίουσεκάθεένααπό τα 4 κλάσµατα (τα ddatp, ddttp, ddctpκαι ddgtp αντίστοιχα).

40 (Γονιδιακή τεχνολογία) Από την πολυπεπτιδική αλυσίδα της πολυµεράσης Ι χρησι- µοποιείται µόνο το τµήµα που διαθέτει τη δράση της 5-3 πολύ- µεράσης και το οποίο λαµβάνεται µε πρωτεόλυση. Αυτόγίνεταιγια αποφυγή προβλη- µάτων, αφού το άλλο τµήµα της αλυσίδας του µορίου έχει δράση 5-3 εξωνουκλεάσης.

41 (Γονιδιακή τεχνολογία) Ηενσωµάτωσητων αναλόγων περεµποδίζει τη συνέχιση της βιοσύνθεσης της αλυσίδαςτου DNA (γιατί δεν υπάρχει υδροξύλιο στη 3 θέση της ριβόζης, διδεοξυριβόζη). Οπότε σχηµατίζονται διάφορα τµήµατα που όταν διαχωριστούν µε ηλεκτροφόρηση δίνουν τη δυνατότητα (κατά τα γνωστά) να βρεθεί η σειρά των βάσεων.

42 (Γονιδιακή τεχνολογία) Η χηµική συνθετική παρασκευήτου DNA, σήµερα, είναι δυνατή και µάλιστα και µε αυτοµατοποιηµένες µεθόδους, µε τη δέσµευση της άκρης της αλυσίδας σε ακινητοποιηµένη φάση (ρητίνη), µε ρυθµούς σύνθεσης ενός νουκλεοτιδίου ανά 10 min και απόδοση περίπου 96%.

43 (Γονιδιακή τεχνολογία) Εκτός από τη χηµική σύνθεση του DNA, µπορεί επίσης να γίνεικαιβιοσύνθεσητου DNA, από το συµπληρωµατικό mrna µε τη δράση του ενζύµου αντίστροφη µεταγραφάση. Στο συµπληρωµατικό mrna προστίθεται µια ολιγονουκλεοτιδική ουρά (ολιγο-τ) που υβριδοποιείται µε την πολυνουκλεοτιδική ουρά (πολυ-α) την οποία συνήθως έχουνενωµένηστηνθέση 3, τα mrna των ευκαρυωτικών κυττάρων.

44 (Γονιδιακή τεχνολογία) Μετάτοσχηµατισµότηςδιπλής αλυσίδας από την πολυ-α ουράκαιτηνολιγο-τουρά, δρα η αντίστροφη µεταγραφάση και βιοσυνθέτει το DNA, το συµπληρωµατικό του mrna, χρησιµοποιώντας νουκλεϊνικές βάσεις καιτο mrnaσανεκµαγείο. Η βιοσύνθεση αυτή τελειώνει σεέναάγκιστροστηθέση 3. Στησυνέχειατο mrna καταστρέφεται µε αλκαλική υδρόλυση και παραµένει ελεύθερηηαλυσίδατου DNA, µε ένα µικρό τµήµα διπλής αλυσίδας, λόγω του σχηµατισµού του άγκιστρου στην 3 θέση.

45 (Γονιδιακή τεχνολογία) Γίνεται η βιοσύνθεση της συµπληρωµατικής αλυσίδας του DNA, µετηβοήθειατης πολυµεράσης Ι και νουκλεϊνικώνβάσεων, ξεκινώνταςαπότηθέση 3. Οιβάσειςτηςκαµπύληςτου άγκιστρου µπορούν να υδρολυθούν από τη νουκλεάση S1 (που αναγνωρίζει µόνο ασύζευκτες βάσεις) και να προκύψει έτσι µια διπλή αλυσίδα DNA που συµβολίζεται σαν cdna (complementary DNA), δηλαδή συµπληρωµατικό DNA.

46 (Γονιδιακή τεχνολογία) Στην πραγµατικότητα το cdna που λαµβάνεται µετονπαραπάνωτρόπο, δενείναιτοπλήρεςµόριο DNAτου επιθυµητούγονιδίου, γιατί δύσκολα αποµονώνεται πλήρες µόριο mrna. Αλλάκαιανακόµααποµονωθείτοπλήρες µόριο mrna, τοµόριοτου cdna δεν θα περιέχει τις ρυθµιστικές περιοχές του καιβέβαιαδενθαπεριέχεικαιταεσώνια. Πολλάόµωςαπόαυτάταπροβλήµατα, τελικά, αποτελούν πλεονεκτήµατα, κατά τη χρησιµοποίησή του στην τεχνολογία του rdna.