Γενετική Ποικιλότητα και Φυλογενετικές Σχέσεις «Λιμναίων» και «Θαλάσσιων» Πληθυσμών της Atherina boyeri

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Γενετική Ποικιλότητα και Φυλογενετικές Σχέσεις «Λιμναίων» και «Θαλάσσιων» Πληθυσμών της Atherina boyeri ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΚΡΑΪΤΣΕΚ ΣΠΥΡΙΔΟΥΛΑ ΠΑΤΡΑ, 2006

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Γενετική Ποικιλότητα και Φυλογενετικές Σχέσεις «Λιμναίων» και «Θαλάσσιων» Πληθυσμών της Atherina boyeri Διατριβή Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης Κράιτσεκ Σπυριδούλα ΠΑΤΡΑ, 2006

3 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα Διατριβή Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Γενετικής, του τομέα Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών, με τριμελή συμβουλευτική επιτροπή τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Γιώργο Κίλια, τον Καθηγητή κ. Σταμάτη Αλαχιώτη και την Λέκτορα κα. Έλενα Κλώσσα-Κίλια. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλέποντα καθηγητή μου, κ. Γιώργο Κίλια, καθώς και την κα. Έλενα Κλώσσα-Κίλια που με την καθοδήγηση και τις υποδείξεις τους κατόρθωσα να διεκπεραιώσω αυτή την εργασία, αλλά και να αντεπεξέλθω σε διάφορα ζητήματα που σχετίζονται με το Μεταπτυχιακό Πρόγραμμα. Η βοήθειά τους είναι πολύτιμη. Πιστεύω ότι έχω αποκομίσει πάρα πολλά από τη συνεργασία αυτή και εύχομαι να συνεχιστεί με το ίδιο καλό κλίμα και διάθεση. Επιπλέον, οφείλω να ευχαριστήσω τον Καθηγητή κ. Σταμάτη Αλαχιώτη για την τιμή που μου έκανε να συμμετέχει στην Τριμελή Συμβουλευτική Επιτροπή. Δεν θα πρέπει να παραλείψω να ευχαριστήσω τον συνάδελφο μου Στέφανο Μαρτιμιανάκη για τη βοήθειά του σε διάφορα πειραματικά ζητήματα. Ωστόσο, θεωρώ πιο σημαντική την πολύ καλή συνεννόηση που έχουμε γεγονός που κάνει τη δουλειά στο εργαστήριο πιο ευχάριστη και εύκολη. Τέλος, πρέπει να αναφέρω ότι χωρίς την συνεχή στήριξη των γονιών μου, του αδερφού μου και των φίλων μου δεν θα είχα καταφέρει να ολοκληρώσω το Μεταπτυχιακό Πρόγραμμα Σπουδών. Σας ευχαριστώ θερμά όλους. Νοέμβριος 2006 Σπυριδούλα Κράιτσεκ

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Εισαγωγή Κεφάλαιο 1 ο. 1.1 Γενικά Ειδογενετική πορεία Η κλασική σχολή και η σχολή του ισοζυγίου της γενετικής των πληθυσμών Το κόστος της φυσικής επιλογής, η ανάπτυξη της θεωρίας της ουδετερότητας και η θεωρία της επιλογικότητας Καταγωγή της μοριακής φυλογενετικής Μοριακοί μάρτυρες στη μελέτη της φυλογένειας Ιστορία των μοριακών μεθόδων Μιτοχόνδρια και μιτοχονδριακό DNA (mtdna) Βιολογία και Προέλευση Το μιτοχονδριακό DNA είναι ένα μικρό μόριο με μοναδική βιολογία Χρήση του mtdna στις φυλογενετικές μελέτες Το mtdna ως φυλογενετικός δείκτης Εξελικτική γενετική έρευνα στους ιχθυοπληθυσμούς Atherina boyeri Πιο αναλυτικά για την Atherina boyeri Στοιχεία από μελέτες για την διάκριση των πληθυσμών της Atherina boyeri Σκοπός της παρούσας εργασίας...45 Υλικά και Μέθοδοι Κεφάλαιο 2 ο. 2.1 Συλλογή υλικού Μελέτη πολυμορφισμών στο μιτοχονδριακό DNA (mtdna) Απομόνωση του DNA Ηλεκτροφόρηση Γενικά Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης...49

5 Ηλεκτοφόρηση ολικού DNA Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράση (PCR) Γενικά Συνθήκες και αντιδραστήρια PCR στην συγκεκριμένη μελέτη Πέψεις με ένζυμα περιορισμού Αρχή της ανάλυσης RFLP Πέψεις που έγιναν στη συγκεκριμένη μελέτη Ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός των προϊόντων της πέψης Στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων Εκτίμηση αποστάσεων νουκλεοτιδικών αλληλουχιών Μελέτη της ποικιλότητας του μιτοχονδριακού DNA Εκτίμηση της νουκλεοτιδικής ποικιλότητας και της νουκλεοτιδικής απόκλισης Κατασκευή φυλογενετικών δένδρα που βασίζονται σε ανάλυση του DNA Πώς μπορούμε να συγκρίνουμε τις διάφορες μεθόδους κατασκευής δένδρων; Μέθοδοι φυλογενετικής ανάλυσης Μέθοδος UPGMA Μέθοδος Neighbor-Joining Μέθοδος Μέγιστης Φειδωλότητας (Maximum Parsimony) Μέθοδος Μέγιστης Πιθανοφάνειας (Maximum Likelihood) Μειονεκτήματα και πλεονεκτήματα των διαφόρων μεθόδων φυλογενετικής ανάλυσης Στατιστικός έλεγχος των φυλογενετικών δένδρων Μέθοδοι φυλογενετικής ανάλυσης της συγκεκριμένης μελέτης και έλεγχος της αξιοπιστίας τους...79 Αποτελέσματα Κεφάλαιο 3 ο. 3.1 Ανάλυση του mtdna Οι πέψεις και τα περιοριστικά ένζυμα Σύνθεση των απλοτύπων...87

6 3.1.3 Υπολογισμός της νουκλεοτιδικής και απλοτυπικής απόκλισης Κατασκευή των φυλογενετικών δένδρων...95 Κεφάλαιο 4 ο. Συζήτηση...97 Κεφάλαιο 5 ο. Συμπεράσματα Κεφάλαιο 6 ο. Περίληψη Κεφάλαιο 7 ο. Βιβλιογραφία...109

7 Εισαγωγή

8 Κεφάλαιο 1 ο. Εισαγωγή Κεφάλαιο 1 ο. Εισαγωγή 1.1 Γενικά Όλα σχεδόν τα είδη των οργανισμών ζουν στη φύση οργανωμένα σε πληθυσμούς. Ένας πληθυσμός χαρακτηρίζεται από συνεργατικές ή ανταγωνιστικές αντιδράσεις μεταξύ των μελών του, από αντιδράσεις με άλλα συμπατρικά είδη, καθώς και από αντιδράσεις με το οικολογικό περιβάλλον του. Επίσης, ο πληθυσμός αντανακλά ένα βιολογικό σύνολο που οι ιδιότητές του και τα χαρακτηριστικά του διαφέρουν από αυτές που χαρακτηρίζουν καθένα από τα μέλη. Βάσει αυτής της οπτικής, η τύχη ενός γονιδίου σ έναν πληθυσμό δεν εξαρτάται μόνο από το άτομο (μέλος) που το φέρει, αλλά και από τη συμπεριφορά ολόκληρου του πληθυσμού. Στην εξέλιξη, η σχετική μονάδα δεν είναι το άτομο αλλά ο πληθυσμός. Ορίζοντας λεπτομερέστερα τον πληθυσμό, μπορούμε να πούμε ότι είναι μια κοινότητα ατόμων, που συνδέονται με τους δεσμούς της διασταύρωσης και της γονικότητας. Μ άλλα λόγια, πληθυσμός είναι μια κοινότητα ατόμων του ίδιου είδους, τα οποία συμμετέχουν σε ένα κοινό γονιδιακό απόθεμα. Ο δεσμός της διασταύρωσης δεν ισχύει πάντα στον ορισμό του πληθυσμού (π.χ. για οργανισμούς που δεν αναπαράγονται φυλετικά), αλλά ο δεσμός της γονικότητας ισχύει πάντα. Η Γενετική Πληθυσμών είναι ένας κλάδος της γενετικής, που μελετά την κληρονομικότητα σε ομάδες ατόμων, δηλαδή σε πληθυσμούς, και η οποία μπορεί να θεωρηθεί και ως Εξελικτική Γενετική. Ωστόσο, αυτές οι δύο ορολογίες μπορούν να διακριθούν. Πιο συγκεκριμένα, η Πληθυσμιακή Γενετική αναφέρεται σε πληθυσμούς του ίδιου είδους, ενώ η Εξελικτική Γενετική αναφέρεται σε πληθυσμούς του ίδιου ή διαφορετικού είδους. Σκοπός της Γενετικής Πληθυσμών είναι η μελέτη της γενετικής δομής των πληθυσμών καθώς και των μηχανισμών που ελέγχουν τις αλλαγές της γενετικής δομής. Με τον όρο γενετική δομή εννοούμε τους τύπους και τις συχνότητες των γονιδίων ή των γενοτύπων που αντιπροσωπεύουν ένα πληθυσμό. Η εξέλιξη ξεκινά από μια διαδικασία συνεχών αλλαγών της γενετικής δομής του πληθυσμού και συνεπώς, είναι φανερό ότι η Γενετική των Πληθυσμών παίζει μεγάλο ρόλο στην κατανόηση των μηχανισμών της εξέλιξης. Οι βασικοί παράγοντες της εξέλιξης είναι: οι μεταλλάξεις, μετανάστευση, ο ανασυνδυασμός, η φυσική επιλογή - 5 -

9 Κεφάλαιο 1 ο. Εισαγωγή και η τυχαία γενετική εκτροπή. Η εξέλιξη μπορεί να θεωρηθεί ως μία δισδιάστατη πορεία. Η μία διάσταση αναφέρεται στις μεταλλάξεις και τον ανασυνδυασμό που δημιουργούν γενετική ποικιλότητα, ενώ η δεύτερη διάσταση, στις δυνάμεις και τις διαδικασίες εκείνες που επηρεάζουν τη διαφορική μεταβίβαση της γενετικής ποικιλότητας από γενιά σε γενιά. Στη δεύτερη κατηγορία κατατάσσονται οι υπόλοιποι παράγοντες και οι οποίοι είναι η μετανάστευση (γονιδιακή ροή), η τυχαία γενετική εκτροπή και η φυσική επιλογή. Μεταλλάξεις : αποτελούν τη βασική πηγή της γενετικής ποικιλότητας. Κύριος ρόλος των μεταλλάξεων στην εξέλιξη είναι η δημιουργία ποικιλότητας και όχι η τροποποίηση των προτύπων της ποικιλότητας. Γενετικός ανασυνδυασμός : αποτελεί έναν άλλο βασικό παράγοντα ποικιλότητας. Οι φαινότυποι που υπόκεινται στην επιλογική πίεση αντανακλούν γενότυπους. Έτσι, η άμεση πηγή ποικιλότητας στο γενοτυπικό επίπεδο δεν είναι οι μεταλλάξεις, αλλά ο γενετικός ανασυνδυασμός (διασκελισμός) των μεταλλαγμένων αλληλομόρφων που είχαν ενσωματωθεί προηγούμενα μέσα στους πληθυσμούς. Μέσω των γονιδιακών συνδυασμών που προκύπτουν από το διασκελισμό μπορεί να δημιουργηθεί ένας τεράστιος αριθμός διαφορετικών γενοτύπων. Γονιδιακή ροή (μετανάστευση) : είναι ένας άλλος παράγοντας που μπορεί να προσθέσει καινούργια αλληλόμορφα στους πληθυσμούς. Η γονιδιακή ροή (gene flow) είναι αποτέλεσμα της μετανάστευσης ατόμων από τον ένα πληθυσμό στον άλλο. Η αποτελεσματικότητα της γονιδιακής μετανάστευσης (ή ροής) εξαρτάται από τις διαφορές της γενετικής δομής των πληθυσμών (διαφορές γονιδιακών συχνοτήτων) και από το ποσό της μετανάστευσης. Τυχαία γενετική εκτροπή : τυχαίες αλλαγές στις γονιδιακές συχνότητες σε πληθυσμούς με περιορισμένο μέγεθος αποτελούν το φαινόμενο της γενετικής εκτροπής (genetic drift). Η τελική τύχη ενός αλληλόμορφου μπορεί να είναι είτε η σταθεροποίησή του είτε η εξαφάνισή του. Ο πληθυσμός γίνεται ομοαλληλικός (ομοζυγωτικός) εκτός και αν το αλληλόμορφο που εξαφανίστηκε αντικατασταθεί με μετάλλαξη ή μετανάστευση. Συνεπώς, σε μικρούς πληθυσμούς όλα τα γονίδια τείνουν προς τον ομοαλληλισμό, με αποτέλεσμα να μειώνεται η ετεροζυγωτία και η ποικιλότητα. Φυσική επιλογή : ο μεγάλος αριθμός μηχανισμών που τροποποιούν την αναπαραγωγική επιτυχία ενός γενότυπου αναφέρονται μονολεκτικά με τον όρο επιλογή. Οργανισμοί που η επιτυχία αναπαραγωγής τους δεν καθορίζεται από τον - 6 -

10 Κεφάλαιο 1 ο. Εισαγωγή άνθρωπο λέμε ότι υπόκεινται στη δράση της φυσικής επιλογής. Στην αντίθετη περίπτωση, μιλάμε για τεχνητή επιλογή. Η φυσική επιλογή μπορεί να οριστεί ως η διαφορική αναπαραγωγή εναλλακτικών γενετικών ποικιλιών (γενοτύπων) που καθορίζεται από το γεγονός ότι μερικές ποικιλίες αυξάνουν τις πιθανότητες επιβίωσης και αναπαραγωγής των φορέων τους σε σχέση με τους φορείς άλλων ποικιλιών. Η παράμετρος που χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό της φυσικής επιλογής είναι η Δαρβινική προσαρμοστικότητα ή απλά προσαρμοστικότητα. Η προσαρμοστικότητα ή καταλληλότητα (fitness), με τη στενή γενετική έννοια, σημαίνει σχετική αναπαραγωγική ικανότητα. Αν ένας γενότυπος μπορεί να αφήσει περισσότερους απογόνους σε σχέση με έναν άλλο στο ίδιο περιβάλλον η προσαρμοστικότητά του συνεπώς θα είναι ανώτερη. Ωστόσο, ο τρόπος που αντιδρούν οι παράγοντες αυτοί, έτσι ώστε να προκληθούν σοβαρές μορφολογικές και φυσιολογικές αλλαγές που καταλήγουν σε νέο είδος, δεν είναι απόλυτα γνωστός. Τα άτομα ενός πληθυσμού μπορεί να αλλάζουν κατά τη διάρκεια της ζωής τους, αλλά η γενετική τους σύσταση παραμένει σταθερή. Αντίθετα, η γενετική σύσταση των πληθυσμών μπορεί να αλλάξει από γενιά σε γενιά. Συνεπώς, η εξέλιξη δεν είναι τίποτα άλλο από αλλαγές της γενετικής δομής των πληθυσμών. Το εξελικτικό δυναμικό ενός πληθυσμού καθορίζεται από τη γενετική ποικιλότητα του πληθυσμού. Η φυσική επιλογή και η τυχαία γενετική εκτροπή δεν μπορούν να δράσουν αν δεν υπάρχει ποικιλότητα. Όσο πιο μεγάλη είναι η ποικιλότητα σε έναν πληθυσμό, τόσο μεγαλύτερη είναι η δυνατότητα δράσης της φυσικής επιλογής. Ένα μέτρο για να υπολογιστεί η γενετική διαφοροποίηση μεταξύ διαφορετικών ειδών ή πληθυσμών του ίδιου είδους είναι η γενετική απόσταση (D). Υπάρχουν διάφοροι μέθοδοι για να προσδιοριστεί η γενετική απόσταση ανάλογα με ποιούς δείκτες χρησιμοποιούμε για να υπολογίσουμε τη διαφοροποίηση του γενετικού υλικού. Για παράδειγμα, ο Nei όρισε ως γενετική απόσταση τη γενετική διαφορά μεταξύ πληθυσμών η οποία αντανακλά τις διαφορές των γονιδιακών συχνοτήτων στους πληθυσμούς. Από την καθαρά γενετική πλευρά, ο καλύτερος τρόπος υπολογισμού της γενετικής απόστασης είναι η μέτρηση της διαφοράς του αριθμού των νουκλεοτιδίων ή κωδικών ανά μονάδα μήκους του DNA. Ένας άλλος τρόπος υπολογισμού αυτού του μέτρου σύγκρισης των πληθυσμών είναι βάσει της παρουσίας ή απουσίας των θέσεων περιορισμού διαφόρων περιοριστικών ενζύμων (βλ. και «εκτίμηση αποστάσεων νουκλεοτιδικών αλληλουχιών»)

11 Κεφάλαιο 1 ο. Εισαγωγή Τελικός σκοπός της μελέτης της εξελικτικής θεωρίας είναι η κατανόηση στο ποιοτικό και ποσοτικό επίπεδο όλων των διαδικασιών που οδηγούν στη δημιουργία νέου είδους (νέου taxon). Η ειδογενετική πορεία μπορεί να θεωρηθεί κάτω από δύο πρίσματα που είναι γνωστά ως αναγένεση και κλαδογένεση. Η αναγένεση (ή φυλετική εξέλιξη) συνίσταται σε αλλαγές που γίνονται μέσα σε μια φυλογενετική γραμμή με τη ροή του χρόνου. Η εμφάνιση νέων οργάνων και η ανάπτυξη νέων τρόπων αντιμετώπισης του περιβάλλοντος είναι χαρακτηριστικά της αναγένεσης. Η κλαδογένεση (ή πρωταρχική ειδογένεση ή διχοτομική ειδογένεση) συμβαίνει όταν μια φυλογενετική γραμμή διασπάται σε δύο ή περισσότερες που εξελίσσονται ανεξάρτητα. Ωστόσο, ορισμένα είδη ή γενεαλογικές γραμμές δεν παρουσιάζουν σπουδαίες αλλαγές για μεγάλα χρονικά διαστήματα αλλά παραμένουν σταθερά από εξελικτικής πλευράς και δεν παρουσιάζουν προοδευτική αλλαγή. Σε αυτή την περίπτωση έχουμε στασιγένεση. Υπάρχουν διάφοροι τρόποι για να οριστεί το είδος. Σύμφωνα με τον βιολογικό ορισμό του είδους που ανήκει στον Mayr, το είδος είναι ομάδες φυλετικά αναπαραγόμενων φυσικών πληθυσμών, που είναι αναπαραγωγικά απομονωμένοι από άλλες τέτοιες ομάδες. Αυτή η κατάσταση σχετίζεται μόνο με τους φυλετικά αναπαραγόμενους πληθυσμούς και δεν ισχύει για τους αφυλετικά αναπαραγόμενους. Οι οργανισμοί της δεύτερης κατηγορίας κατατάσσονται με βάση άλλα κριτήρια όπως γενετικές, φυσιολογικές και μορφολογικές διαφορές. Σύμφωνα με έναν δεύτερο ορισμό του είδους, τον μορφολογικό, τα είδη ξεχωρίζουν μεταξύ τους με βάση μερικά δομικά χαρακτηριστικά. Το αρνητικό στοιχείο αυτού του ορισμού είναι ότι παρεμβάλλεται η υποκειμενικότητα του ερευνητή. Τέλος, έχει προταθεί η έννοια του εξελικτικού είδους που αναφέρεται στα είδη που ζουν σε διαφορετικές χρονικές περιόδους και τα οποία δεν μπορούμε να τα ελέγξουμε γενετικά σύμφωνα με το βιολογικό ορισμό. Σύμφωνα με αυτό τον ορισμό, ως είδος μπορεί να οριστεί η εξελικτική γραμμή/-ές του/ων πληθυσμού/-ών. Ο ορισμός αυτός παρακάμπτει την ατέλεια του βιολογικού είδους, όσον αφορά τους οργανισμούς που αναπαράγονται φυλετικά, αλλά δεν μπορεί να εξηγήσει πώς θα διακριθεί μια εξελικτική γραμμή από μια άλλη. Για τη διάκριση και κατάταξη τέτοιων ειδών χρησιμοποιείται το εξής κριτήριο: όταν οι μορφολογικές διαφορές μεταξύ οργανισμών του παρελθόντος είναι τόσο μεγάλες όσο και μεταξύ των ζωντανών ειδών, τότε κατατάσσονται σε διαφορετικά είδη. Τέτοια είδη που έχουν διαφορετικά ονόματα, αλλά ανήκουν στην - 8 -

12 Κεφάλαιο 1 ο. Εισαγωγή ίδια εξελικτική γραμμή και έχουν ζήσει σε διαφορετικούς χρόνους αναφέρονται συχνά ως χρονοείδη. Στο σημείο αυτό, αξίζει να αποσαφηνιστούν ορισμένοι όροι που χρησιμοποιούνται σχετικά με το είδος. Πιο συγκεκριμένα, με τον όρο αδελφά είδη αναφερόμαστε σε εκείνα τα είδη που παρουσιάζουν όλα τα χαρακτηριστικά του είδους, αλλά δε διακρίνονται μορφολογικά. Μη αδελφά είδη είναι τα κλασικά είδη, ενώ υποείδη είναι αλλοπατρικοί πληθυσμοί που βρίσκονται στο πρώτο στάδιο ειδογένεσης (βλ. παρακάτω). Ως ημιείδη χαρακτηρίζονται οι αλλοπατρικοί πληθυσμοί που βρίσκονται στο δεύτερο στάδιο ειδογένεσης. Δύο πληθυσμοί, για να διαφοροποιηθούν γενετικά, πρέπει να είναι πλήρως απομονωμένοι μεταξύ τους. Η απομόνωση αυτή μπορεί να είναι γεωγραφική ή αναπαραγωγική. Με τον όρο αναπαραγωγική απομόνωση εννοούμε όλους εκείνους τους μηχανισμούς που εμποδίζουν την αναπαραγωγή μεταξύ δύο συμπατρικών πληθυσμών. Τους μηχανισμούς της αναπαραγωγικής απομόνωσης, ο Dobzhansky τους κατατάσσει σε δύο κατηγορίες : α) τους προσυζευκτικούς ή προζυγωτικούς και β) στους μετασυζευκτικούς ή ζυγωτικούς. Στην πρώτη κατηγορία, αυτό που συμβαίνει είναι να εμποδίζεται ο σχηματισμός ζυγωτικών υβριδίων. Αυτό επιτυγχάνεται με απομόνωση α) οικολογική, β) εποχιακή ή χρονική, γ) φυλετική ή ηθολογική, δ) που οφείλεται σε διαφορετικούς επικονιαστές, ε) μηχανική και ζ) γαμετική. Στην δεύτερη κατηγορία απομονωτικών μηχανισμών μειώνεται η βιωσιμότητα ή η γονιμότητα των ζυγωτικών υβριδίων μέσω α) αβιωσιμότητας των υβριδίων, β) στειρότητα των υβριδίων και γ) κατάρρευση των υβριδίων Ειδογενετική πορεία Το ερώτημα του πώς δημιουργείται ένα είδος ισοδυναμεί με το ερώτημα του πώς αναπτύσσεται η αναπαραγωγική απομόνωση. Υπάρχουν δύο θεωρίες για να εξηγήσουν αυτό το φαινόμενο. Σύμφωνα με τη μία θεωρία, η απομόνωση είναι ένα τυχαίο υποπροϊόν της γενετικής απόκλισης δύο πληθυσμών, οι οποίοι διαφοροποιούνται γενετικά όλο και περισσότερο, λόγω προσαρμογής σε διαφορετικά περιβάλλοντα, με αποτέλεσμα να δημιουργηθεί δυσαρμονία στις γονιδιακές τους δεξαμενές, και ως εκ τούτου είναι αδύνατη η αναπαραγωγή τους. Η άλλη θεωρία υποστηρίζει ότι η απομόνωση είναι προϊόν της φυσικής επιλογής. Σε οποιαδήποτε - 9 -

13 Κεφάλαιο 1 ο. Εισαγωγή περίπτωση που τα υβρίδια (μεταξύ δύο πληθυσμών) έχουν χαμηλότερη προσαρμοστικότητα από τα μη υβρίδια, η φυσική επιλογή επάγει την ανάπτυξη των αναπαραγωγικών απομονωτικών μηχανισμών (ΑΑΜ). Αυτό συμβαίνει γιατί τα γονίδια που παρεμποδίζουν την υβριδοποίηση έχουν μεγαλύτερη καταλληλότητα από τα γονίδια που ευνοούν την υβριδοποίηση (γιατί τα τελευταία εγκλωβίζονται σε άτομα-υβρίδια που έχουν χαμηλή προσαρμοστικότητα). Οι δύο αυτές θεωρίες δεν αποκλείονται αμοιβαία. Ουσιαστικά, η ειδογενετική πορεία περιλαμβάνει και τα δύο είδη φαινομένων. Σχετικά με τα στάδια από τα οποία μπορεί να χαρακτηριστεί η ειδογενετική πορεία, αυτά είναι δύο. Τα κύρια χαρακτηριστικά του πρώτου σταδίου είναι ότι α) η αναπαραγωγική απομόνωση εμφανίζεται πρωταρχικά με μορφή μετασυζευκτικών αναπαραγωγικών απομονωτικών μηχανισμών (ΑΑΜ) και β) ότι οι ΑΑΜ είναι παραπροϊόν της γενετικής διαφοροποίησης. Η αναπαραγωγική απομόνωση δεν επάγεται άμεσα από τη φυσική επιλογή σε αυτό το στάδιο. Στο δεύτερο στάδιο αναπτύσσεται προσυζευκτική αναπαραγωγική απομόνωση. Σε αυτό το σημείο, η απομόνωση επάγεται από τη φυσική επιλογή (Αλαχιώτης, 1992) Η κλασική σχολή και η σχολή του ισοζυγίου της γενετικής των πληθυσμών Για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα ήταν σε αμφισβήτηση το ποσό της γενετικής ποικιλότητας που υπάρχει στα γονιδιώματα των φυτών και των ζώων. Μία μόνιμη πρόκληση των εμπειρικών πληθυσμιακών γενετιστών είναι ο υπολογισμός της γενετικής ποικιλότητας, με το σκεπτικό ότι αυτή η ποσοτικοποίηση θα οδηγήσει σε κατανόηση των λειτουργιών της φυσικής επιλογής, της τυχαίας γενετικής εκτροπής και των άλλων εξελικτικών δυνάμεων. Δυστυχώς, σπάνια η ποικιλότητα που παρατηρείται στο φαινοτυπικό επίπεδο μπορεί να χαρακτηριστεί και με όρους πληθυσμιακής γενετικής, όπως για παράδειγμα ο αριθμός των γενετικών τόπων που διαφέρουν ή τα αλληλόμορφα που ευθύνονται για αυτή την ποικιλομορφία. Αυτό το πρόβλημα απασχολούσε το πρώτο μισό του προηγούμενου αιώνα τους πληθυσμιακούς γενετιστές και για να το λύσουν είχαν προταθεί δύο αντιδιαμετρικά αντίθετες απόψεις σχετικά με το ποσό της ποικιλότητας στη φύση. Αυτές οι δύο

14 Κεφάλαιο 1 ο. Εισαγωγή απόψεις είναι γνωστές ως το κλασικό μοντέλο (classical model) και το μοντέλο του ισοζυγίου (balanced model). Η κλασική σχολή πίστευε ότι η φυσική επιλογή ήταν κυρίως μία αρνητική δύναμη ή μια δύναμη που απομάκρυνε τα επιβλαβή αλληλόμορφα έτσι ώστε να υπάρχει μικρή γενετική ποικιλότητα στους πληθυσμούς. Συνεπώς, τα περισσότερα άτομα θεωρούνταν ομοζυγώτες για κάποιο κοινό άγριου τύπου αλληλόμορφο για την πλειοψηφία των γενετικών τόπων. Για παράδειγμα, ο βραβευμένος με Nobel, H.J. Muller προέβλεψε ότι στον άνθρωπο 1 σε κάθε 1000 γενετικούς τόπους θα είναι ετεροζυγωτικός. Κεντρικό στοιχείο της θεωρίας αυτής ήταν και η άποψη για το γενετικό φορτίο. Σύμφωνα με αυτό, η γενετική ποικιλότητα «παράγει» ένα φορτίο το οποίο μειώνει την προσαρμοστικότητα και τελικά μπορεί να οδηγήσει στην εξαφάνιση του πληθυσμού. Αντίθετα, η σχολή του ισοζυγίου υποστήριζε ότι τα επίπεδα της γενετικής ποικιλότητας των πληθυσμών είναι τόσο υψηλά που οι περισσότεροι γενετικοί τόποι είναι πολυμορφικοί και ότι τα άτομα ήταν ετεροζυγωτικά για μεγάλο αριθμό γενετικών τόπων. Σύμφωνα με τη σχολή αυτή, η φυσική επιλογή ευνοεί τους πολυμορφισμούς μέσω διαφόρων ισορροπηστικών μηχανισμών όπως η προσαρμοστική υπεροχή των ετεροζυγωτών, η διαφοροποίηση στην προσαρμοστικότητα ανάλογα με τους οικότοπους ή το πλεονέκτημα της εξαρτώμενης από τη συχνότητα επιλογής. Τα επιβλαβή αλληλόμορφα δεν εξαλείφονταν αλλά κάτω από τον έλεγχο της φυσικής επιλογής συμμετείχαν με ένα μικρό ποσοστό στην ετεροζυγωτία. Εξαιτίας του μεγάλου ποσοστού ετεροζυγωτίας που προβλέπονταν για τα φυλετικά αναπαραγόμενα είδη δεν μπορούσε να οριστεί κάποιο αλληλόμορφο ως άγριου τύπου. Παρόλο που και οι δύο σχολές συμφωνούσαν ότι η φυσική επιλογή ήταν η δύναμη που ωθούσε στην εξέλιξη, δεν υπήρχε απόδειξη για το κύριο ζήτημα που χώριζε τις δύο αυτές σχολές και αυτό είναι το ποιό είναι το ποσοστό της γενετικής ποικιλότητας που υπάρχει τόσο μέσα όσο και μεταξύ των ειδών. Στο ερώτημα αυτό δόθηκε τελικά απάντηση κατά τη διάρκεια των δεκαετιών 1950 και 1960, οπότε και η καινούργια τεχνική της αλληλούχισης των πρωτεϊνών αποκάλυψε ουσιαστική ποικιλία στην πολυπεπτιδική αλυσίδα διαφόρων πρωτεϊνών. Σε παρόμοιο αποτέλεσμα, ότι υπάρχει δηλαδή μεγάλη γενετική ποικιλότητα μέσα στα είδη, κατέληξαν και διάφορες εργασίες από το 1966 που έκαναν χρήση μιας καινούργιας τεχνικής τότε, της ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών. Σύμφωνα με τις

15 Κεφάλαιο 1 ο. Εισαγωγή εργασίες αυτές, οι φυσικοί πληθυσμοί περιείχαν μεγαλύτερο ποσοστό γενετικής ποικιλότητας σε σχέση με αυτό που αναμένονταν Το κόστος της φυσικής επιλογής, η ανάπτυξη της θεωρίας της ουδετερότητας και η θεωρία της επιλογικότητας Από όσα αναφέρθηκαν προηγουμένως φαίνεται ότι η σχολή του ισοζυγίου προσέγγιζε καλύτερα την πραγματικότητα. Αυτό όμως δημιουργούσε ένα πρόβλημα. Αν υποθέσουμε ότι η φυσική επιλογή διατηρούσε όλη αυτή την ποικιλία, δεν θα ήταν εξίσου σωστό να υποθέσουμε ότι και τα άτομα που φέρουν «κατώτερα» αλληλόμορφα θα απομακρύνονταν επιλεκτικά από τον πληθυσμό; Θα μπορούσε ο πληθυσμός να συνεχίσει να υπάρχει ακόμα και μετά από όλον αυτόν τον «επιλεκτικό θάνατο»; Αυτή η άποψη συνοψίζεται στον όρο κόστος της φυσικής επιλογής. Το κόστος της φυσικής επιλογής θεωρείται ότι συμμετέχει ως ένα σημείο στο γενετικό φορτίο που φέρει ένας πληθυσμός. Το γενετικό φορτίο αναφέρεται στην κατάσταση αυτή όπου η προσαρμοστικότητα ενός ατόμου είναι χαμηλότερη από την ιδανική για τον πληθυσμό ως σύνολο. Αυτό συμβαίνει εξαιτίας των επιβλαβών αλληλομόρφων που φέρει. Τη δεκαετία του 1950 και 1960, το γενετικό φορτίο θεωρούνταν σοβαρό πρόβλημα και αποτελεί έναν από τους κύριους λόγους που η κλασική σχολή υποστήριζε πως η ποικιλότητα είναι περιορισμένη. Ωστόσο, υπήρχε ένας τρόπος για να ερμηνευθεί το μεγάλο ποσοστό της γενετικής ποικιλότητας χωρίς να παρουσιαστεί το πρόβλημα του επιλεκτικού θανάτου. Σύμφωνα με αυτή την ερμηνεία, οι περισσότερες μεταλλάξεις που είχαν προστεθεί στο γενότυπο ενός ατόμου δεν είχαν καμία επίδραση στην προσαρμοστικότητα. Τέτοιου είδους μεταλλάξεις που δεν θα επέφεραν κανένα επιλεκτικό κόστος και δεν υπόκεινται στη φυσική επιλογή, ονομάζονται ουδέτερες μεταλλάξεις και είτε χάνονται (συνήθως) είτε σταθεροποιούνται (πολύ σπάνια) μέσω της γενετικής εκτροπής, που προκαλείται από τον τυχαίο συνδυασμό των γαμετών στη φυλετική αναπαραγωγή. Αυτή η θεωρίας της ουδετερότητας της μοριακής εξέλιξης προτάθηκε για πρώτη φορά από τους Motoo Kimura το 1968 και τον Jack King και Tom Jukes το 1969 και έκτοτε είναι μια από τις σημαντικότερες και αμφιλεγόμενες θεωρίες της εξελικτικής βιολογίας

16 Κεφάλαιο 1 ο. Εισαγωγή Σύμφωνα με τους ουδετεριστές, η φυσική επιλογή είναι μια αρνητική δύναμη που απομακρύνει από τον πληθυσμό τις επιβλαβείς μεταλλάξεις και παίζει μικρό ρόλο στην σταθεροποίησης των υπόλοιπων μεταλλάξεων. Ως εκ τούτου, μπορούμε να υποθέσουμε ότι στη θεωρία της ουδετερότητας οι μεταλλάξεις και η τυχαία γενετική εκτροπή παίζουν σηματνικότερο ρόλο από ότι η φυσική επιλογή. Από την άλλη πλευρά, οι επιλογιστές υποστηρίζουν ότι οι νουκλεοτιδικές υποκαταστάσεις σταθεροποιούνται επειδή έχουν κάποιο επιλογικό πλεονέκτημα καθώς και ότι οι ουδέτερες μεταλλάξεις είναι σπάνιες, ενώ η πλειοψηφία των μεταλλάξεων είναι επιβλαβείς και συνεπώς να απομακρύνονται από τους πληθυσμούς. Επομένως, αυτές οι δύο σχολές έχουν πολύ διαφορετικές απόψεις σχετικά με την εξελικτική διαδικασία. Στους ουδετεριστές επικρατεί η τύχη ενώ στους επιλογιστές η αναγκαιότητα (Avise, 1994, Page & Holmes, 1998). 1.2 Καταγωγή της μοριακής φυλογενετικής Αν τα γονιδιώματα εξελίσσονται με τη σταδιακή συσσώρευση μεταλλάξεων, τότε οι διαφορές στην νουκλεοτιδική αλληλουχία ενός ζεύγους γονιδιωμάτων θα υποδεικνύει το πόσο πρόσφατα αυτά τα δύο γονιδιώματα μοιράζονταν έναν κοινό πρόγονο. Δύο γονιδιώματα που διαχωρίστηκαν στο πρόσφατο παρελθόν θα αναμένεται να έχουν λιγότερες διαφορές από δύο γονιδιώματα που ο κοινός τους πρόγονος είναι πιο παλιός. Αυτό σημαίνει ότι συγκρίνοντας τρία ή περισσότερα γονιδιώματα είναι εφικτό να αποσαφηνιστούν οι εξελικτικές σχέσεις μεταξύ τους. Αυτό είναι το αντικείμενο με το οποίο ασχολείται η μοριακή φυλογενετική. Η μοριακή φυλογενετική προέρχεται κατά κάποιον τρόπο από την παραδοσιακή μέθοδο ταξινόμησης των πληθυσμών σύμφωνα με τις ομοιότητες και τις διαφορές τους, όπως έκανε ο Linnaeus τον 18 ο αιώνα. Ο Linnaeus ήταν συστηματικός όχι εξελικτικός, και στόχος του ήταν να τοποθετήσει όλους τους οργανισμούς σε μία λογική ταξινόμηση, η οποία, όπως πίστευε θα αντικατόπτριζε το Systema Naturae. Ωστόσο, χωρίς να το γνωρίζει έθετε τα θεμέλια για τα διάφορα θέματα που μετέπειτα θα απασχολούσαν τους εξελικτικούς, με το να διαχωρίζει ιεραρχικά τους διάφορους οργανισμούς σε ταξινομικές κατηγορίες. Οι φυσικοί του 18 ου και 19 ου αι. προτίμησαν να αναφέρονται σε αυτή την ιεραρχική κατηγοριοποίηση με την ονομασία «δένδρο

17 Κεφάλαιο 1 ο. Εισαγωγή της ζωής» (Tree of life), ένας χαρακτηρισμός που είχε υιοθετηθεί από το Δαρβίνο (1859) στο βιβλίο του Καταγωγή των Ειδών (Origin of Species), προσπαθώντας να περιγράψει τις αλληλοσυνδεόμενες εξελικτικές ιστορίες των ζώντων οργανισμών. Η κατηγοριοποίηση συνεπώς που είχε γίνει από τον Linnaeus ερμηνευόταν αργότερα ως φυλογένεια, υποδεικνύοντας έτσι όχι μόνο τις ομοιότητες μεταξύ των ειδών αλλά και τις εξελικτικές τους σχέσεις (Brown, 2002). Μια πλήρη εικόνα της φυλογένειας απαιτεί τη γνώση τόσο του κλαδογενετικού χωρισμού των εξελικτικών γραμμών (αυτό είναι εμφανές στο φυλογενετικό δένδρο με την κατάταξη των κλάδων) όσο και των διάφορων αλλαγών αναγένεσης που συμβαίνουν με το πέρασμα του χρόνου στις γραμμές αυτές (μήκος κλάδων του δένδρου) (Avise, 1994). Ανεξάρτητα αν ο στόχος σε μια μελέτη είναι να γίνει απλή κατηγοριοποίηση των οργανισμών ή να βρεθεί η φυλογένεια, τα στοιχεία που συλλέγονται προς μελέτη προκύπτουν από την εξέταση διάφορων χαρακτήρων των οργανισμών. Πρωταρχικά αυτοί οι χαρακτήρες ήταν μορφολογικά χαρακτηριστικά, αλλά και τα μοριακά δεδομένα άρχισαν να χρησιμοποιούνται από σχετικά νωρίς. Μόλις από το 1904, ο Nuttall χρησιμοποίησε ανοσολογικά τεστ για να εξακριβώσει τις σχέσεις μιας ποικιλίας οργανισμών, με απώτερο στόχο να τοποθετήσει τον άνθρωπο στη σωστή εξελικτική θέση ανάμεσα στα υπόλοιπα πρωτεύοντα. Η εργασία του Nuttall έδειξε ότι τα μοριακά δεδομένα μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε φυλογενετικές μελέτες, αλλά η προσέγγιση αυτή υιοθετήθηκε ευρέως τα τέλη της δεκαετίας του Η καθυστέρηση οφείλεται κυρίως σε τεχνικούς περιορισμούς αλλά και στο ότι η κατηγοριοποίηση (classification) και η φυλογενετική έπρεπε να υποστούν τις δικές τους «εξελικτικές αλλαγές» προτού η αξία των μοριακών δεδομένων εκτιμηθεί πλήρως. Αυτές οι αλλαγές έγιναν περίπου την εποχή που εισάχθηκαν η φαινετική (phenetics) (Sneath & Sockal 1973) και η φυλογενετική ή κλαδιστική (cladistics) μέθοδος. Σύμφωνα με την φαινετική μέθοδο, η κατάταξη των οργανισμών θα πρέπει να γίνεται μόνο βάσει της μορφολογικής ομοιότητας των οργανισμών χωρίς να λαμβάνονται υπόψη οι εξελικτικές σχέσεις μεταξύ τους. Αντίθετα, όπως υπονοεί το πρώτο όνομα της δεύτερης μεθόδου, αυτή δίνει έμφαση στο κριτήριο της κοινής καταγωγής και, όπως υπονοεί το δεύτερο όνομα της, βασίζεται στο κλαδόγραμμα της ομάδας που ταξινομείται. Αυτή η προσέγγιση για ταξινόμηση προτάθηκε για πρώτη φορά το 1950 από τον Γερμανό εντομολόγο Willi Henning, και ως εκ τούτου μερικές φορές αναφέρεται ως «χενίγγεια συστηματική»

18 Κεφάλαιο 1 ο. Εισαγωγή Οι δύο αυτές καινούργιες φυλογενετικές μέθοδοι, παρόλο που διαφέρουν λίγο στην προσέγγιση, δίνουν έμφαση στο ότι πλήθος δεδομένων μπορεί να αναλυθεί με μαθηματικές διαδικασίες. Η δυσκολία στην παρατήρηση πλήθους μαθηματικών δεδομένων όταν χρησιμοποιούνται μορφολογικοί χαρακτήρες ήταν ένας από τους σημαντικότερους λόγους που οδήγησε στη χρήση μοριακών δεδομένων. Τα μοριακά δεδομένα έχουν εξάλλου αρκετά πλεονεκτήματα σε σύγκριση με άλλους τύπους φυλογενετικής πληροφορίας, και τα οποία θα αναφερθούν στις επόμενες παραγράφους Μοριακοί μάρτυρες στη μελέτη της φυλογένειας Τα παλαιότερα χρόνια, για να περιγραφούν οι σχέσεις μεταξύ των οργανισμών, χρησιμοποιούνταν μέθοδοι που είχαν δεδομένα τα οποία στηρίζονταν στην συγκριτική μορφολογία, τη φυσιολογία και άλλα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά. Οι μοριακοί συστηματιστές χρησιμοποιούν επίσης τη συγκριτική μέθοδο, αλλά οι συγκρίσεις περιέχουν άμεση ή έμμεση πληροφορία για τις πρωτεΐνες και τα νουκλεϊκά οξέα. Με τις μελέτες που χρησιμοποιούν μοριακούς μάρτυρες γίνεται προσπάθεια να ερευνηθεί η φυλογένεια σε διάφορα στάδια της εξελικτικής απόκλισης. Συνεπώς, οι φυλογενετικές σχέσεις μπορούν να μελετηθούν από το επίπεδο της μικρό-εξέλιξης έως το επίπεδο της μακρο-εξέλιξης και να χρησιμοποιηθούν για: α) την εύρεση της γενετικής ταυτότητας έναντι της μη ύπαρξης ταυτότητας στους κλωνοποιημένους οργανισμούς, β) τη μελέτη της γενεαλογίας (μητρότητα, πατρότητα), γ) την εύρεση της συγγένειας μεταξύ τοπικών ομάδων ή πληθυσμών, δ) τον προσδιορισμός της διαφοροποίησης μεταξύ γεωγραφικά απομονωμένων πληθυσμών και ειδών ή ε) τον προσδιορισμό της διαφοροποίησης μεταξύ αναπαραγωγικά απομονωμένων ειδών. Διαφορετικοί τύποι μελετών παρέχουν πληροφορίες για καθένα από τα παραπάνω επίπεδα μελέτης της φυλογένειας, ενώ αποτελεί μόνιμη πρόκληση η ανάπτυξη και η χρήση μοριακών μεθόδων κατάλληλων για ένα συγκεκριμένο βιολογικό πρόβλημα. Γιατί όμως είναι οι μοριακοί μάρτυρες ιδιαίτερης σημασίας στον προσδιορισμό της φυλογένειας;

19 Κεφάλαιο 1 ο. Εισαγωγή α) Οι μοριακοί μάρτυρες είναι γενετικοί Εξαιτίας του ότι η φυλογένεια ερμηνεύει τη «ροή της κληρονομικότητας» μόνο γενετικά κληρονομούμενοι χαρακτήρες θα παρέχουν πληροφορίες για τον υπολογισμό της. Εκτός του ότι οι πρωτεΐνες και το DNA είναι κληρονομούμενα χαρακτηριστικά, είναι σημαντικό ότι συναντώνται σε διάφορες μεταβλητές καταστάσεις οι οποίες εύκολα μπορούν να προσδιοριστούν επακριβώς. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με την επισφαλή γνώση που αποκτούσαν οι οργανισμικοί συστηματικιστές από τις μορφολογικές μελέτες. Με τις παλιές μεθόδους μπορούν να προσδιοριστούν τα γονίδια και τα αλληλόμορφα που ελέγχουν συγκεκριμένα μορφολογικά, φυσιολογικά ή χαρακτηριστικά συμπεριφοράς σε σπάνιες μόνο περιπτώσεις, ενώ είναι αρκετές και οι φορές που αυτά τα χαρακτηριστικά επηρεάζονται από μη γενετικούς παράγοντες. β) Οι μοριακές μέθοδοι ανοίγουν έναν ολόκληρο κόσμο για την κατανόηση της γενετικής Πριν την εισαγωγή των μοριακών μεθόδων, οι γενετικές μελέτες γίνονταν κυρίως μέσω διασταυρώσεων ορισμένων ειδών που μπορούσαν να ελεγχθούν σε εργαστηριακές συνθήκες, όπως για παράδειγμα τα μοσχομπίζελα του Mendel, το βακτήριο Escherichia coli, το καλαμπόκι Zea mays, η φρουτόμυγα Drosophila melanogaster και το ποντίκι Mus musculus. Τέτοιου είδους μελέτες ήταν αδύνατο να αποκαλύψουν το υψηλό ποσοστό ποικιλότητας που έχει η πληθώρα των ζώντων οργανισμών του πλανήτη. Αυτό το πρόβλημα λύθηκε με τις μοριακές μεθόδους που μπορούν να έχουν εφαρμογή σε κάθε γονίδιο ή πρωτεϊνικό προϊόν του, από τα μικρόβια έως τις φάλαινες. γ) Οι μοριακές μέθοδοι χρησιμοποιούν μια σχεδόν αστέρευτη πηγή γενετικής ποικιλότητας Τα γονιδιώματα έχουν τεράστιο πληροφοριακό περιεχόμενο. Για παράδειγμα, ένα τυπικό γονιδίωμα θηλαστικού αποτελείται από περίπου τρία δισεκατομμύρια νουκλεοτιδικά ζεύγη βάσεων, τα οποία σε ευθεία γραμμή είναι σχεδόν 100 φορές πιο μακριά από όλους τους γραφικούς χαρακτήρες μιας παγκόσμιας εγκυκλοπαίδειας 18 τόμων. Όπως μια εγκυκλοπαίδεια, το γονιδίωμα αποτελεί πηγή πληροφοριών, κωδικοποιεί όχι μόνο τις πρωτεΐνες αλλά και άλλα στοιχεία του κυτταρικού μηχανισμού αλλά επίσης φέρει ως αρχείο στη νουκλεοτιδική του αλληλουχία τις εξελικτικές σχέσεις του με άλλα γονιδιώματα

20 Κεφάλαιο 1 ο. Εισαγωγή δ) Τα μοριακά δεδομένα μπορούν να διακρίνουν την ομολογία από την αναλογία Το κεντρικό πρόβλημα των φυλογενετιστών πάντα ήταν να διακρίνουν αν η ομοιότητα ενός χαρακτηριστικού σε δύο οργανισμούς οφείλονταν σε καταγωγή από έναν κοινό πρόγονο (ομολογία) ή προέκυψε από τη σύγκλιση δύο διαφορετικών προγόνων (αναλογία). Η εξελικτική κατάταξη θα πρέπει να περιέχει μόνο πραγματικές ομολογίες. Οι κοινές μορφολογίες και συμπεριφορές ωστόσο, που μέχρι πρόσφατα αποτελούσαν τα βασικά στοιχεία βάσει των οποίων γίνονταν η κατάταξη, μπορούν ορισμένες φορές να εξελιχθούν ανεξάρτητα σε άσχετα είδη, ως απάντηση σε παρόμοιες περιβαλλοντικές προκλήσεις. Και στη λύση αυτού του προβλήματος συνέβαλαν οι μοριακές μέθοδοι. Ωστόσο, δεν θα πρέπει να παραβλεφθεί το γεγονός ότι και οι μοριακοί μάρτυρες μπορεί να υποδείξουν την ύπαρξη ομολογίας ενώ πραγματικά δεν υπάρχει. Πράγματι, αυτό συμβαίνει αν ορισμένα μοριακά χαρακτηριστικά τα εξετάσουμε απομονωμένα και οφείλεται στο ότι υπάρχει ένας μικρός αριθμός μεταβλητών καταστάσεων αυτών των χαρακτηριστικών αλλά και στο γρήγορο ρυθμό μεταβολής αυτών των καταστάσεων. Κάτι τέτοιο χαρακτηρίζει για παράδειγμα κάθε νουκλεοτιδική θέση όπου μπορούν να εμφανίζεται μόνο ένας από τους τέσσερις χαρακτήρες (Α, Τ, C, G). Ωστόσο, άλλα μοριακά χαρακτηριστικά, όπως οι διπλασιασμοί, τα ελλείμματα ή οι μετατοπίσεις του γενετικού υλικού είναι πιο σπάνια γεγονότα και ως εκ τούτου μπορεί να τεκμηριωθεί η μονοφυλετικότητα. ε) Τα μοριακά δεδομένα παρέχουν ένα κοινό μέτρο υπολογισμού της απόκλισης Ένα άλλο προσόν που έχουν τα μοριακά δεδομένα είναι ότι παρέχουν την δυνατότητα στον ερευνητή να κάνει άμεσες συγκρίσεις της γενετικής διαφοροποίησης σε κάθε ομάδα οργανισμών (Wheelis et al., 1992). Αν υποθέσουμε για παράδειγμα ότι κάποιος επιθυμεί να ποσοτικοποιήσει την εξελικτική διαφοροποίηση ανάμεσα σε μια ταξινομική οικογένεια ή σε ένα είδος ψαριών σε σύγκριση με τη διαφοροποίηση που υπάρχει ανάμεσα σε μια ομάδα πουλιών. Στη συγκεκριμένη περίπτωση, οι μορφολογικοί χαρακτήρες που χρησιμοποιούνται παραδοσιακά στη συστηματική των ψαριών (π.χ. ακτίνες πτερυγίων, αριθμός των λεπιών της πλάγιας γραμμής) δεν θα είχαν καμία χρησιμότητα στη άμεση σύγκριση με τους χαρακτήρες που χρησιμοποιούνται στη συστηματική των πτηνών (π.χ. χαρακτηριστικά πτερώματος). Ωστόσο, τα πουλιά και τα ψάρια, καθώς επίσης και άλλα ζώα, φυτά και μικρόβια, έχουν αρκετά κοινά μοριακά χαρακτηριστικά, όπως για παράδειγμα γονίδια και ένζυμα που εμπλέκονται σε κεντρικά μεταβολικά μονοπάτια, και ως εκ τούτου

21 Κεφάλαιο 1 ο. Εισαγωγή μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως κοινοί μάρτυρες για τη παράλληλη μελέτη αυτών των ομάδων (Avise, 1994) Ιστορία των μοριακών μεθόδων Η πρώτη μοριακή προσέγγιση που χρησιμοποιήθηκε ευρύτατα στη μελέτη της φυλογένειας ήταν η ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών. Αρχικά, έκαναν ηλεκτροφόρηση κυρίως σε ένζυμα. Οι ενζυμικές μέθοδοι εισήχθησαν στα μέσα της δεκαετίας του 1960 και για τα επόμενα δέκα χρόνια κυριαρχούσαν τη μοριακή συστηματική. Σήμερα, η ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών παραμένει μια δημοφιλής μέθοδος για την παραγωγή μοριακών μαρτύρων. Στο τέλος της δεκαετίας του 1960, αυτές οι έμμεσες μέθοδοι είχαν αντικατασταθεί από πλήθος μελετών που στηρίζονταν στην αλληλούχιση των πρωτεϊνών και γύρω στη δεκαετία του 1980, η φυλογενετική που στηρίζονταν στο DNA άρχισε να εφαρμόζεται σε μεγάλη κλίμακα. Η αλληλούχιση των πρωτεϊνών χρησιμοποιείται ακόμα σήμερα αλλά το DNA έχει γίνει πλέον το κυρίαρχο μόριο. Αυτό συμβαίνει κυρίως γιατί το DNA «φέρει» μεγαλύτερο ποσοστό φυλογενετικής πληροφορίας σε σχέση με τις πρωτεΐνες. Οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες ενός ζεύγους ομόλογων γονιδίων περιέχουν περισσότερες πληροφορίες από ότι η αμινοξική αλληλουχία των αντίστοιχων πρωτεϊνών, γιατί οι μεταλλάξεις που οδηγούν σε μη-συνώνυμες αλλαγές μεταβάλλουν μεν την αλληλουχία του DNA αλλά δεν επηρεάζουν την αμινοξική αλληλουχία. Επιπλέον, με την ανάλυση της αλληλουχίας του DNA τόσο σε κωδικοποιούσες όσο και σε μη κωδικοποιούσες περιοχές μπορεί να διαπιστωθούν αλλαγές που αποτελούν καινούργια πληροφορία. Τέλος, η κυριαρχία του DNA στις φυλογενετικές μελέτες οφείλεται σε σημαντικό βαθμό και στην ευκολία με την οποία μπορούμε να πάρουμε μεγάλες ποσότητες των δειγμάτων DNA μέσω της PCR (βλ.συνέχεια). Η επόμενη τεχνική που χρησιμοποιήθηκε ευρέως στη μοριακή συστηματική ήταν η ανάλυση «ποικίλου μήκους περιοριστικών θραυσμάτων» (RFLP) στο DNA (αναλύεται σε επόμενη παράγραφο). Από πολύ νωρίς δόθηκε μεγάλη προσοχή και στο μιτοχονδριακό DNA (mtdna). Οι μοριακές προσεγγίσεις κυριαρχούσαν στη μοριακή συστηματική στο τέλος της δεκαετίας 1970 και κατά τη διάρκεια της δεκαετίας 1980 (Avise et al., 1979a, 1979b; Brown&Wright, 1979; Brown et al., 1979; Avise&Lansman, 1983; Harrison, 1989). Μεγάλο ενδιαφέρον για τους

22 Κεφάλαιο 1 ο. Εισαγωγή μάρτυρες του mtdna εξακολουθεί να υπάρχει και σήμερα. Στα μέσα της δεκαετίας του 1980, ένα άλλο κύμα ενθουσιασμού ακολούθησε την RFLP ανάλυση. Αυτή η τεχνική, που στηρίζεται στη μελέτη των υπερμεταβλητών πυρηνικών περιοχών του DNA (μικροδορυφορικού και δορυφορικού DNA), έγινε γνωστή, εξαιτίας και των διαγνωστικών δυνατοτήτων που παρείχε, με την ονομασία «δακτυλικό αποτύπωμα του DNA» ( DNA fingerprinting ) (Burke, 1989; Hill, 1987; Kirby, 1990). Λόγω του υψηλού μεταλλακτικού ρυθμού, οι VNTR-τόποι (variable numbers tandem repeats) εμφανίζουν μεγάλη γενετική ποικιλότητα και υψηλό ποσοστό ετεροζυγωτίας, με αποτέλεσμα να αποδεικνύονται ιδιαίτερα χρήσιμοι μάρτυρες στη διάκριση πληθυσμών τόσο του ίδιου είδους όσο και συγγενών ειδών (Ward&Grewe, 1994; Park&Moran, 1994). Το παρόν κύμα ενθουσιασμού στη μοριακή φυλογενετική ξεκίνησε με την εισαγωγή της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) για τον in vitro πολλαπλασιασμό συγκεκριμένων τμημάτων DNA (Mullis, 1990; Mullis et al., 1986; Saiki et al., 1988;White et al., 1989). Όταν η μέθοδος αυτή συνδυάζεται με πιο εξειδικευμένα ολιγονουκλεοτίδια έναρξης (Kocher et al., 1989), με πιο εξελιγμένες μεθόδους προσδιορισμού της αλληλουχίας ενός τμήματος (Innis et al., 1988; Ruano et al., 1990) και την ανάπτυξη κατάλληλων μεθόδων για την επεξεργασία των απλοτυπικών δεδομένων (Clark, 1990; Stephens et al., 1990b), μπορεί να δώσει άμεσες πληροφορίες για τη σύσταση των DNA αλληλουχιών τόσο των πυρηνικών όσο και των κυτταροπλασματικών γονιδίων. Επιπλέον, επειδή η PCR μπορεί να πολλαπλασιάζει συγκεκριμένα τμήματα DNA από μικρές ποσότητες αρχικού ιστού, ή ακόμα και από καλά διατηρημένα απολιθώματα, βρίσκει πολλές εφαρμογές σε ένα ευρύ φάσμα βιολογικών προβλημάτων (Arnheim et al., 1990). Άλλη μια μέθοδος που βρίσκει εφαρμογή στην γενετική ανάλυση πληθυσμών είναι και η μέθοδος RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) (Williams et al.1990). Η μέθοδος αυτή βασίζεται στον πολλαπλασιασμό νουκλεοτιδικών αλληλουχιών με PCR και κάνοντας χρήση τυχαία επιλεγμένων ολιγονουκλετοτιδικών αλληλουχιών έναρξης (primers). Η ύπαρξη γενετικού πολυμορφισμού στη μέθοδο RAPD απεικονίζεται με την παρουσία ή απουσία θραυσμάτων DNA. Εκτός από τις κύριες προαναφερθείσες τεχνικές που χρησιμοποιούνται στη μοριακή συστηματική χρησιμοποιούνται και άλλες οι οποίες όμως δεν είναι ευρέως διαδεδομένες. Μία από αυτές είναι η ανοσολογική ανάλυση των πρωτεϊνών, μέσω των οποίων δόθηκαν οι πρώτες αποδείξεις για την ύπαρξη των μοριακών ρολογιών

23 Κεφάλαιο 1 ο. Εισαγωγή (Benjamin et al., 1984; Goodman, 1963; Wilson et al., 1977). Οι ανοσολογικές μέθοδοι χρησιμοποιούνται ακόμα και σήμερα (Maxson&Maxson, 1986,1990). Επιπλέον, σημαντική είναι και η συμβολή της DNA-DNA υβριδοποίησης στη συστηματική διαφόρων ομάδων οργανισμών όπως πτηνά (Sibley&Ahlquist, 1990), έντομα (Caccone&Powell, 1987) και ανθρωποειδή πρωτεύοντα (Caccone&Powell, 1989;Sibley&Ahlquist, 1987). Ακολουθεί ένας πίνακας όπου φαίνεται η αποτελεσματικότητα των διαφόρων μοριακών μεθόδων σε σχέση με την ιεραρχική ταξινόμηση των οργανισμών (Πίνακας 1). Πίνακας 1: Αποτελεσματικότητα των μοριακών μεθόδων σε σχέση με την ιεραρχική ταξινόμηση των οργανισμών. Όπου (**) πολύ αποτελεσματική, (*) οριακά αποτελεσματική, ( ) ακατάλληλη μέθοδος (Hills&Moritz, 1990). Ιεραρχικό επίπεδο Γενετική ομοιότητα Γενεαλογία (parentage) Πληθυσμοί ίδιου είδους Συγγενικά είδη Ενδιάμεσες ταξινομικές μονάδες Μεγάλοι διαχωρισμοί >50 mya Ανοσολογία πρωτεϊνών Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών DNA-DNA υβριδοποίηση mtdna RFLP scndna VNTRloci Αλληλούχιση DNA * * * ** * * * ** ** * ** ** ** * * * ** * * * * ** * ** ** * * ** 1.3 Μιτοχόνδρια και μιτοχονδριακό DNA (mtdna) Βιολογία και Προέλευση Τα μιτοχόνδρια κατέχουν κεντρική θέση στη βιολογία των κυττάρων και είναι απαραίτητα για την ύπαρξη ζωής. Τα περισσότερα ευκαρυωτικά κύτταρα έχουν πολλά μιτοχόνδρια, τα οποία περιέχουν πολλά αντίγραφα mtdna μορίων. Τα μιτοχόνδρια είναι ικανά να συντήκονται, να χωρίζονται και να μετακινούνται μέσα

24 Κεφάλαιο 1 ο. Εισαγωγή στο κύτταρο (Bereiter-Hann&Voth, 1994). Συνολικά, μπορούν να αντιστοιχούν στο 25% του όγκου του κυτταροπλάσματος. Το μιτοχονδριακό γονιδίωμα των θηλαστικών αποτελείται από ένα κυκλικό, δίκλωνο μόριο DNA που έχει μήκος ζεύγη βάσεων, ένα μέγεθος που αντιστοιχεί περίπου στο 1/ του μικρότερου ζωικού πυρηνικού γονιδιώματος. Σχετικά με την προέλευση του μιτοχονδρίου έχουν διατυπωθεί δύο θεωρίες. Σύμφωνα με την πρώτη, το γονιδίωμα των οργανιδίων (μιτοχόνδρια και χλωροπλάστες) έχουν αυτογενή καταγωγή μέσα στα ευκαρυωτικά κύτταρα και προέρχονται από θραύσματα του πυρηνικού γονιδιώματος που εγκολπώθηκαν σε μεμβράνες και σχημάτισαν τα μιτοχόνδρια και τους χλωροπλάστες (Cavalier-Smith, 1975; Uzell & Spolsky, 1981). Η δεύτερη θεωρία υποστηρίζει ότι το γονιδίωμα των οργανιδίων αυτών έχει εξωγενή προέλευση, και συγκεκριμένα προέρχονται από βακτηριακούς προγόνους οι οποίοι εισέβαλαν (ή εγκολπώθηκαν) σε πρώτο-ευκαρυωτικά κύτταρα (Margulis, 1981). Η δεύτερη θεωρία που καλείται «θεωρία ενδοσυμβίωσης» υποστηρίζεται από διάφορες μοριακές αποδείξεις (Gray, 1992). Μία από τις μοριακές αποδείξεις που συνηγορούν υπέρ της ενδοσυμβιωτικής θεωρίας προέρχεται από την αλληλούχιση των rrna γονιδίων. Διαπιστώθηκε ότι οι rrna αλληλουχίες τόσο των χλωροπλαστών όσο και των μιτοχονδρίων έχουν μεγαλύτερη συγγένεια με τις βακτηριακές αλληλουχίες παρά με τις πυρηνικές αλληλουχίες των ευκαρυωτικών. Σήμερα πιστεύεται ότι τα ευκαρυωτικά κύτταρα είναι γενετικές χίμαιρες που περιέχουν ένα μίγμα από διακριτές εξελικτικές γραμμές (Avise, 1994). Μέχρι πρόσφατα, επικρατούσε η αντίληψη ότι υπάρχει συγκεκριμένη διάταξη των γονιδίων στο μιτοχονδριακό DNA. Ο λόγος που πιστεύονταν κάτι τέτοιο ήταν ότι οι πρώτες ολοκληρωμένες αλληλουχίες μιτοχονδριακού γονιδιώματος που καθορίστηκαν σε taxa σπονδυλωτών δεν είχαν καμία διαφοροποίηση στη θέση των γονιδίων κατά μήκος του μορίου. Ωστόσο, πρέπει να αναφερθεί ότι έχουν βρεθεί διάφορες ανακατατάξεις και διαφοροποιήσεις από την επικρατούσα τυπική δομή που αναφέρεται για το μιτοχονδριακό γονιδίωμα σε διάφορες κατηγορίες οργανισμών (π.χ. Mindell et al., 1998). Το τυπικό μιτοχονδριακό γονιδίωμα των σπονδυλωτών υποστηρίζεται ότι αποτελείται από μία μη κωδικοποιούσα ρυθμιστική περιοχή, 13 γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, δύο ριβοσωμικά RNA (rrna) και 22 μεταφορικά RNA (trna) κατανεμημένα στο κυκλικό μόριο DNA (Anderson et al., 1981;Bibb et al., 1981; Johansen et al., 1990) (εικόνα 1)

25 Κεφάλαιο 1 ο. Εισαγωγή Εικόνα 1: Δομή ανθρώπινου μιτοχονδριακού DNA όπου φαίνονται οι θέσεις των γονιδίων 12S rrna, 16S rrna καθώς και η περιοχή του βρόγχου εκτόπισης (D-loop). Όπως είναι φανερό, από το mtdna κωδικοποιούνται τριάντα-επτά γονίδια, τα είκοσιτέσσερα από τα οποία κωδικοποιούν τη μεταφραστική μηχανή του ίδιου του mtdna (22 trnas, 2 rrnas). Τα δύο rrnas που κωδικοποιούνται είναι τα μοναδικά που υπάρχουν στο μιτοχονδριακό ριβόσωμα (12S rrna-μικρή υπομονάδα, 16S rrnaμεγάλη υπομονάδα). Όσον αφορά τα trnas, μπορούν να διακριθούν τρεις ομάδες, οι οποίες ονομάζονται βάσει του κώδικα για τα αμινοξέα : η ομάδα IQM αντιστοιχεί στα trna για την ισολευκίνη (Ι), τη γλουταμίνη (Q) και τη μεθειονίνη (Μ) αντίστοιχα, η WANCY για την τρυπτοφάνη (W), την αλανίνη (Α), το ασπαρτικό οξύ (Ν), την κυστεΐνη (C) και την τυροσίνη (Υ), και τέλος η HSL, για την ιστιδίνη (Η), τη σερίνη (S) και τη λευκίνη (L). Κάθε αλυσίδα του mtdna έχει το δικό της σημείο έναρξη της αντιγραφής. Το σημείο έναρξης της αντιγραφής για την Η-αλυσίδα (Ο Η ) (βλ. συνέχεια) βρίσκεται εντός της loop περιοχής (D-loop) της περιοχής ελέγχου και το σημείο για την L- αλυσίδα (Ο L ) (βλ. συνέχεια) βρίσκεται εντός της ομάδας WANCY, ανάμεσα στο trna για την ασπαραγίνη και την κυστεΐνη. Τα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες διακόπτονται τουλάχιστον από ένα γονίδιο υπεύθυνο για την παραγωγή trna, στο 5 ή στο 3 άκρο τους, και αυτό μπορεί να αποτελεί σημείο αναγνώρισης για την παραγωγή RNA (Ojala et al., 1981). Αυτό έχει μεγάλη μοριακή σημασία για το μόριο του μιτοχονδριακού DNA καθώς κάποια γονίδια επικαλύπτονται από ορισμένα νουκλεοτίδια και κάποια από τα επικαλυπτόμενα γονίδια μεταγράφονται από την αντίθετη αλυσίδα. Εκτός των trnas για το γλουταμινικό οξύ, την αλανίνη, το

26 Κεφάλαιο 1 ο. Εισαγωγή ασπαρτικό οξύ, την κυστεΐνη, την τυροσίνη, τη σερίνη, τη γλουταμίνη, την προλίνη και το ΝD6 γονίδιο, όλες οι άλλες αλληλουχίες μεταγράφονται από την Η-αλυσίδα (σύμφωνα πάντα με την τυπική δομή του μιτοχονδρακού DNA). Η μελέτη της αλληλουχίας των αμινοξέων των μιτοχονδριακών πρωτεϊνών σε σχέση με τα γονίδιά τους έδειξε ότι στα μιτοχόνδρια υπάρχουν αποκλίσεις από το γνωστό γενετικό κώδικα. Το γεγονός ότι τα t-rnas είναι 22 στον αριθμό σε σχέση με εκείνα της κυτταροπλασματικής πρωτεϊνο-συνθετικής μηχανής που είναι 32, επιβεβαιώνει την προηγούμενη παρατήρηση. Τα συμπεράσματα αυτά αποδεικνύουν ότ ι το ζευγάρωμα κωδικών t-rnas αντικωδικών είναι πιο χαλαρό κατά την πρωτεϊνοσύνθεση στο μιτοχόνδριο. Συνεπώς, τα περισσότερα αντικωδικόνια μπορούν να αναγνωρίζουν κωδικόνια ανεξάρτητα με το αν η τρίτη βάση είναι πουρίνη ή πυριμιδίνη (Saccone et al., 1999; Taanman, 1999). Τα υπόλοιπα 13 γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, κωδικοποιούν τις υπομονάδες για την αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων, όπου οι υδατάνθρακες και τα λίπη οξειδώνονται για να παράγουν διοξείδιο του άνθρακα, νερό και ΑΤΡ. Τα γονίδια αυτά είναι οι τρεις υπομονάδες της οξειδάσης του κυτοχρώματος C (COI, COII, COIII) οι επτά υπομονάδες της αφυδρογονάσης του NADH (ND1, ND2, ND3, ND4, ND4LN, ND5, ND6), το κυτόχρωμα b και οι δύο υπομονάδες της FoATPse (ATPse 6 και ATPse 8 / De La Cruz et al. 1984, Meyer 1993). Τα πυρηνικά και μιτοχονδριακά γονιδιώματα είναι λειτουργικά αλληλοεξαρτώμενα. Οι περισσότερες μιτοχονδριακές πρωτεΐνες κωδικοποιούνται από πυρηνικά γονίδια. Επομένως, οι υπόλοιπες υπομονάδες των μιτοχονδριακών συμπλεγμάτων (οι περίπου δηλαδή 90 πρωτεΐνες που απαιτούνται για τη συναρμολόγηση των μιτοχονδριακών ριβοσωμάτων, 20 διαφορετικές αμινο-άκυλο-συνθετάσες και όλα τα ένζυμα που χρειάζονται για την αντιγραφή και μετάφραση του mtdna) κωδικοποιούνται από γονίδια του πυρήνα. Έχουμε συνολικά δηλαδή το μιτοχονδριακό σύμπλεγμα της ΑΤΡ συνθετάσης, την κυτοχρωμική οξειδάση c και την NADH αφυδρογονάση b-c 1 που έχουν υπομονάδες που κωδικοποιούνται τόσο από μιτοχονδριακά όσο και από πυρηνικά γονίδια. Στην πραγματικότητα, τα μιτοχόνδρια είναι υπεύθυνα για το μεγαλύτερο μέρος της παραγωγής ΑΤΡ. Η ενέργεια που ελευθερώνεται από την οξειδωτική φωσφορυλίωση κατά την αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων χρησιμοποιείται σε τέτοιο βαθμό ώστε παράγονται περίπου 30 μόρια ΑΤΡ για κάθε μόριο γλυκόζης που οξειδώνεται, ενώ παράγονται μόνο 2 μόρια ΑΤΡ όταν η γλυκοζυλίωση ελέγχεται μόνο από τον πυρήνα. Ως παραπροϊόν της οξειδωτικής φωφσφορυλίωσης, παράγονται στα μιτοχόνδρια

27 Κεφάλαιο 1 ο. Εισαγωγή δραστικές τοξικές ρίζες οξυγόνου όπως το υπεροξείδιο του υδρογόνου. Αυτές οι δραστικές ρίζες μπορούν να βλάψουν το DNA, τα λιπίδια και τις πρωτεΐνες, και η παραγωγή τους αυξάνεται με την ηλικία. Ανάμεσα στα γονίδια για το trna για την προλίνη και τη φαιυλαλανίνη υπάρχει μια περιοχή γνωστή ως βρόγχος εκτόπισης (Displacement loop/d-loop)ή περιοχή ελέγχου (control region) που στα έντομα είναι πλούσια σε αδενίνη και θυμίνη και για αυτό λέγεται AT-rich region. Η περιοχή αυτή είναι μη κωδικοποιούσα. Η μη κωδικοποιούσα ρυθμιστική περιοχή είναι υπεύθυνη για την ποικιλία στο μέγεθος των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων εξαιτίας διαφορών στον αριθμό επαναλήψεων ορισμένων αλληλουχιών (Brown et al., 1996). Ως εκ τούτου, το μιτοχονδριακό DNA έχει ποικίλο μέγεθος. Ορισμένα παραδείγματα είναι : Μετάζωα : Ascaris suum 14,5 kb, Drosophila subobscura15,8 kb / Μύκητες : Saccharomyces cerevisiae 78kb / Φύκι: Neurospora crassa 60 kb /Φυτά: Zea mays 570 kb. Στον άνθρωπο, το mtdna είναι δίκλωνο, κυκλικό μόριο, μεγέθους bp και έχει αλληλουχηθεί πλήρως. Η περιοχή της D-loop, εξαιτίας του μικρού της μεγέθους ( bp), της εκτεταμένης γνώσης για τα χαρακτηριστικά αντιγραφής και μεταγραφής του mtdna και της μεγάλης επάρκειας γνώσης αλληλουχιών σε διάφορα είδη, αποτελεί ένα πολύ καλό πρότυπο μελέτης της εξέλιξης της μη κωδικοποιούσας ρυθμιστικής περιοχής στα θηλαστικά κατά τα τελευταία 150 εκατομμύρια χρόνια. Παρά τη λειτουργική της σπουδαιότητα αποτελεί την ταχύτερα εξελισσόμενη περιοχή του mtdna, αν και μελέτες έχουν δείξει ότι τα ρυθμιστικά στοιχεία που υπάρχουν εντός της και είναι υπεύθυνα για την αντιγραφή και τη μεταγραφή είναι αυστηρώς συντηρημένα (Hoelzel, 1993; Lee et al., 1995). Η κύρια κωδικοποιούσα αλυσίδα του mtdna είναι η βαριά αλυσίδα (Heavy strand), οπότε τα περισσότερα μετάγραφα έχουν την αλληλουχία της ελαφριάς αλυσίδας (Light strand) και είναι συμπληρωματική της Η αλυσίδας (Bibb et al., 1981). Οι χαρακτηρισμοί των δύο τύπων αλυσίδων οφείλονται στο περιεχόμενο τους σε ζεύγη βάσεων G+C, το οποίο τους δίνει διαφορετικές πυκνότητες σε διαβαθμίσεις αποδιάταξης CsCl. Στον άνθρωπο, στην αλυσίδα L κωδικοποιούνται μόνο 8t-RNA και ένα πρωτεϊνικό γονίδιο. Αυτή η κατάσταση είναι περισσότερο έντονη στα σπονδυλωτά ενώ στα ασπόνδυλα, αρκετά μιτοχονδριακά γονίδια κωδικοποιούνται στην αλυσίδα L (Taanman, 1999). Για ποιο λόγο ορισμένα γονίδια παρέμειναν έως σήμερα στα μιτοχόνδρια και δεν χάθηκαν ή μεταφέρθηκαν στο πυρήνα;