Ακινητοποίηση. Ακινητοποιημένο ονομάζουμε ένα βιομόριο του οποίου η ελεύθερη κίνηση στον χώρο είτε έχει αποτραπεί εντελώς είτε έχει περιοριστεί

Transcript

1 Ακινητοποίηση Ακινητοποιημένο ονομάζουμε ένα βιομόριο του οποίου η ελεύθερη κίνηση στον χώρο είτε έχει αποτραπεί εντελώς είτε έχει περιοριστεί

2 Τι μπορεί να ακινητοποιηθεί; Ελεύθερα απομονωμένα ένζυμα, Πρωτεΐνες/ αντισώματα DNA/RNA Ενεργά ή μη ενεργά μικροβιακά κύτταρα Φυτικοί και ζωικοί ιστοί

3 Ακινητοποίηση βιοκαταλυτών Περιορισμός (καθήλωση) ενζύμων ή κυττάρων τους σε μια τεχνητή στερεά φάση στην οποία διατηρούνται οι καταλυτικές ιδιότητες και η σταθερότητά τους ώστε το βιοκαταλυτικό αυτό σύστημα να μπορεί να χρησιμοποιηθεί επαναλαμβανόμενα και συνεχώς

4 Πλεονεκτήματα ακινητοποίησης

5 Επίδραση του τύπου ακινητοποίησης στη σταθετότητα της χυμοθρυψίνης (a) ενεργότητα ελεύθερης χυμοθρυψίνης (b) ενεργότητα χυμοθρυψίνης που έχει τροποποιηθεί χημικώς με χλωρίδιο λιπαρού οξέος (c) ενεργότητα του χημικώς τροποποιημένου ενζύμου (όπως στο b) που συνδέεται με ομοιοπολικό δεμό με το φορέα, (d) ενεργότητα του ενζύμου που έχει εγκλωβιστεί σε πήκτωμα πολυμερούς.

6 Εφαρμογή σε μεγάλης κλίμακας βιοκαταλυτικές διεργασίες Παρασκευή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας (βιομηχανίες τροφίμων, φαρμάκων, καλλυντικών, χημικών κλπ ) Ανάπτυξη βιοϋλικών: βιοαισθητήρων-βιοηλεκτροδίων & βιοφίλτρων βιοϋλικών (νανοβιοτεχνολογία) Μεταφορά γονιδίων (γονιδιακή θεραπεία) Στοχευμένη μεταφορά βιομορίων (θεραπεία)

7 Ένα σύστημα ακινητοποιημένου ενζύμου ορίζεται από: το βιοκαταλυτικό σύστημα το υλικό φορέα υποστήριξης (support, matrix) τον τρόπο που αυτά συνδέονται μεταξύ τους.

8 Τι μπορει να χρησιμοποιηθεί ως φορέας ακινητοποίησης ΑΝΟΡΓΑΝΑ ΥΛΙΚΑ (π.χ γυαλί) ΟΡΓΑΝΙΚΑ ΥΛΙΚΑ ΒΙΟΠΟΛΥΜΕΡΗ ΝΑΝΟΫΛΙΚΑ

9

10 Επιθυμητές ιδιότητες υλικού υποστήριξης Μεγάλη ειδική επιφάνεια Διαπερατότητα στο υπόστρωμα Μη διαλυτότητα στο μέσο της βιοδιεργασίας Χημική, μηχανική και θερμική σταθερότητα Κατάλληλο σχήμα και μέγεθος σωματιδίων Αντίσταση σε μικροβιακή επιμόλυνση Δυνατότητα επαναχρησιμοποίησης

11 Μέθοδοι και τεχνικές ακινητοποίησης Φυσικές μέθοδοι Χημικές μέθοδοι

12 ΦΥΣΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ Εγκλωβισμός σε πολυμερές Προσρόφηση Εγκαψυλλίωση Προσρόφηση στην επιφάνεια του φορέα Εγκλωβισμός σε πλέγμα πολυμερών, ημιπερατές μεμβράνες, λιποσώματα, αντίστροφα μικκύλια

13 Χημικές τεχνικές Ομοιοπολικός δεσμός Διαμοριακό πλέγμα Ένζυμο Σχηματισμός ομοιοπολικών δεσμών μεταξύ του φορέα και του βιοκαταλύτη ή μεταξύ των μορίων του βιοκαταλύτη (ενζύμου).

14 Προσρόφηση και ιοντική σύνδεση Προσρόφηση Συγκράτηση με ασθενείς δυνάμεις (van der Waals, ηλεκτροστατικές ή υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις & δεσμοί υδρογόνου) Φορείς ακινητοποίησης: ανόργανα υλικά (αλουμίνα, silica gel ) οργανικά υλικά (φυσικά & συνθετικά πολυμερή) Πλεονέκτημα χαμηλό κόστος & διατήρηση της καταλυτικής διαμόρφωσης Μειονέκτημα: η ασθενής φύση του δεσμού μεταξύ φορέα και βιοκαταλύτη Απώλεια βιοκαταλύτη στο σύστημα αντίδρασης

15 Εγκλωβισμός σε πλέγμα πολυμερούς Εγκλωβισμός σε πολυμερές Περιορισμός των βιοκαταλυτών στο εσωτερικό της δομής πολυμερούς υλικού ( φορέα) Δεν αναπτύσσονται ισχυρές δυνάμεις σύνδεσης μεταξύ φορέα και βιοκαταλύτη P S Η καταλληλότερη τεχνική για την ακινητοποίηση κυττάρων και μεγαλομοριακών συστημάτων Κρίσιμος παράγοντας: το μέγεθος των πόρων του φορέα

16 Επιτρέπεται η αμφίδρομη μεταφορά αντιδρώντων & προϊόντων μεταξύ της βιοκαταλυτικής στερεάς φάσης και μιας κύριας υγρής φάσης S P

17 Μικροβιακά κύτταρα Μέθοδος ακινητοποίησης Εφαρμογή Εscherichia coli Eγκλωβισμός Παραγωγή L-θρυπτοφάνης από ινδόλιο και DL-σερίνη Βακτήρια και ζύμες όπως Bιοαισθητήρες για τον Saccharomyces cerivisiae Eγκλωβισμός προσδιορισμό σακχάρων, Bacillus subtilis διαλυτών, οξέων, βιταμινών κ.ά. Εscherichia coli Eγκλωβισμός Παραγωγή L-ασπαρτικού οξέος από φουμαρικό οξύ και αμμωνία Rhodococus rhodocrus Eγκλωβισμός Παραγωγή ακρυλαμιδίου από ακρυλονιτρίλιο Saccharomyces cerivisiae Σύνδεση σε επιφάνεια φορέα Υδρόλυση σακχαρόζης Zymomonas mobilis Eγκλωβισμός Παραγωγή σορβιτόλης και γλυκονικού οξέος από γλυκόζη και φρουκτόζη Saccharomyces cerivisiae Προσρόφηση σε ιοντοανταλλάκτη Παραγωγή αιθανόλης Pseudomonas AM I Eγκλωβισμός Παραγωγή L-σερίνης από γλυκίνη και μεθανόλη

18 Εγκλωβισμός σε μεμβράνες & νανοδιασπορές Εγκλωβισμός στο εσωτερικό μκροσφαιριδίων με διάμετρο < 100 μm. H ημιπερατή μεμβράνη διαθέτει πόρους με μέγεθος τέτοιο ώστε να εμποδίζεται η έξοδο των μορίων του βιοκαταλύτη επιτρέποντας τη διέλευση των υποστρωμάτων και των προϊόντων μικροσφαιρίδια 50 Ǻ Ημιπερατή μεμβράνη Λιπόσωμα Αντίστροφα μικκύλια

19 Εφαρμογή στους μεμβρανικούς αντιδραστήρες στη μετατροπή βιοπολυμερών όπως το άμυλο & κυτταρίνη Μεμβράνη με ακινητοποιημένη αμυλάση S AMYΛΟ P ΣΑΚΧΑΡΑ

20 Βιοκατάλυση σε αντίστροφα μικκύλια Οργανικός διαλύτης Επιφανειοενεργό Η 2 Ο Διαλυτοποίηση πολικών και μη πολικών υποστρωμάτων υψηλές ταχύτητες Μικροδιασπορά της υδατικής φάσης στη συνεχή οργανική φάση σταθεροποιείται από επιφανειοενεργά μόρια S P

21 Ομοιοπολική σύνδεση του βιοκαταλύτη με το φορέα Ομοιοπολικοί δεσμοί μεταξύ των υπολειμμάτων των αμινοξέων του ενζύμου με δραστικές χημικές ομάδες του φορέα (-ε ΝH 2 ) της Lys, (α-νη 2 ) του αμινοτελικού άκρου η σουλφυδρυλομάδα (-SH) της Cys, οι υδροξυλομάδες (-ΟΗ) της Tyr, Ser και Thr, οι καρβοξυλομάδες (-COOH) του Asp και Glu, η γουανιδινομάδα της Αrg

22

23

24 Η πορεία ακινητοποίησης περιλαμβάνει τρία βασικά στάδια: 1) Ενεργοποίηση της επιφάνειας του υλικού στήριξης, 2) Ομοιοπολική σύνδεση του βιομορίου 3) Απομάκρυνση της μη ακινητοποιημένης ποσότητας του βιομορίου. OH + BrCN OH ph=9-11 O O C NH Ενεργοποίηση αγαρόζη NH 2 + ΝΗ 3 ph=9-11 O C Ν O Ομοιοπολική σύνδεση ενζύμου σε ενεργοποιημένη αγαρόζη Σύνδεση βιομορίου

25

26 Πλεονέκτημα Η ισχυρή σύνδεση μεταξύ του ενζύμου και φορέα δεν έχουμε αποκόλληση του ενζύμου σε ευρύ φάσμα ph, Τ Μειονέκτημα η πολυπλοκότητα της διαδικασίας (απαιτεί την ενεργοποίηση της επιφάνειας του φορέα με υψηλής δραστικότητας αντιδραστήρια) απώλεια της ενζυμικής δραστικότητας

27 Διαμοριακή σύνδεση με δι-λειτουργικά αντιδραστήρια Σχηματισμός ομοιοπολικών δεσμών με δι- ή και πολύ-λειτουργικά αντιδραστηρίων (αλδεΰδες ή αμίνες) Πολυμερές τρισδιάστατο πλέγμα, αδιάλυτο στο νερό E E E E E E E E E NH 2 + O=CH CH3 CH 2 CH 2 + 2H 2 O E N CH CH 3 CH 2 CH 2 HC=O N H 2 E HC N E γλουταραλδεϋδη

28 Πλεονέκτημα Απλή και αποτελεσματική διαδικασία E E E E E E E E Μειονέκτημα Απώλεια της δραστικότητας αποτέλεσμα παράπλευρων αντιδράσεων με τις ομάδες της ενεργού κέντρου

29 Επίδραση της ακινητοποίησης στα καταλυτικά χαρακτηριστικά Η ακινητοποίηση είναι δυνατόν να επηρεάσει τα μοριακά και κινητικά χαρακτηριστικά των βιοκαταλυτών τροποποίηση της σταθερότητάς, της δραστικότητας και της εκλεκτικότητας Οι τροποποιήσεις αυτές είναι δυνατό να αποδοθούν: α) σε μεταβολές της δομής του ενζυμικού μορίου, β) σε στερεοχημικούς περιορισμούς, γ) σε φαινόμενα κατανομής δ) σε περιορισμούς διάχυσης.

30 1) Δομικές μεταβολές στο ενζυμικό μόριο Ανεπιθύμητες αλληλεπιδράσεις με αντιδραστήρια ακινητοποίησης Μη αντιστρεπτή σύνδεση των αντιδραστηρίων στο ενεργό κέντρο των ενζύμων Σταθεροποίηση Προσθήκη υποστρώματος

31 2) Επίδραση των στερεοχημικών περιορισμών Η μικρή απόσταση μεταξύ του βιοκαταλύτη και του στερεού φορέα περιορίζει τη μεταφορά του υποστρώματος στο ένζυμο Το ένζυμο δεσμεύεται στο φορέα με τέτοιο τρόπο ώστε η ενεργός περιοχή να είναι στραμμένη προς το φορέα παρεμποδίζεται η προσέγγιση του υποστρώματος στο ενεργό κέντρο Εισαγωγή μοριακών βραχιόνων (spacers, arms) οι οποίοι παρεμβάλλονται μεταξύ του φορέα και του ενζύμου

32 3) Επίδραση των φαινομένων κατανομής Η φύση του φορέα επιδρά στην κατανομή υποστρωμάτων/προϊόντων καθώς και Η + μεταξύ της κύριας υγρής φάσης και του μικροπεριβάλλοντος του ενζύμου Ανάπτυξη ηλεκτροστατικών (ελκτικών ή απωστικών) δυνάμεων μεταξύ των μορίων (ιόντων) και του φορέα αύξηση ή μείωση της συγκέντρωσης των υποστρωμάτων στο μικροπεριβάλλον του ενζύμου ή και μεταβολή του ph

33 Ελκτικές δυνάμεις αύξηση της κατανομής P Ρ=[S] e /[S] S S e Μετατόπιση της βέλτιστης τιμής του ph Αλλαγή της τιμής Κm Κ m =Κ m /P

34 4) Επίδραση του περιορισμού διάχυσης Περιορισμοί διάχυσης λόγω της φυσικής παρουσίας του φορέα Εξωτερικοί περιορισμοί διάχυσης αποτέλεσμα της ύπαρξης της στιβάδας του Nernst μόρια διαλύτη μειωμένης κινητικότητας

35 Εσωτερικοί περιορισμοί διάχυσης: αποτέλεσμα του περιορισμού της κίνησης των μορίων στο εσωτερικό του φορέα Εξαρτάται από τη δομή του φορέα S P

36 Ακινητοποίηση πολυενζυμικών συστημάτων και ολόκληρων κυττάρων Ακινητοποίηση με ήπιες τεχνικές όπως ο εγκλωβισμός σε μη υδατοδιαλυτά πηκτώματα πολυμερών (αλγινικό νάτριο) Η χρήση ακινητοποιημένων κυττάρων παρέχει τη δυνατότητα αναγέννησης των συνενζύμων, που θεωρείται σημαντικότατο πλεονέκτημα στην περίπτωση βιομετατροπών σε μεγάλης κλίμακας διεργασίες

37 Μικροσυστοιχίες DNA microarrays - Γονιδιακά τσιπ Για ένα γνωστό γονίδιο μπορεί να συντεθεί ένα ολιγονουκλεοτίδιο-ιχνηθέτης. Επιτυγχάνεται η κατασκευή συστοιχιών που περιέχουν μεμονωμένα ολιγονουκλεοτίδια (ΙΧΝΗΘΕΤΕΣ) ακινητοποιημένα σε επιφάνεια γυαλιού Τέτοιες συστοιχίες μπορούν να αναλύσουν ταυτόχρονα (μέσω υβριδισμού) την έκφραση από έως γονιδίων. DNA Όπου υπάρχει υβριδισμός ανιχνεύεται φθορισμός

38 ΙΧΝΗΘΕΤΗΣ μονόκλωνο DNA (σημασμένο) συμπληρωματικής αλληλουχίας με το το DNA ή RNA που θα προσδιοριστεί Μήκος από 15 έως χιλιάδες νουκλεοτίδια Σύνθεση: με κλωνοποίηση ή χημικά Σήμανση: με 32 P ή με χημική φθορίζουσα ομάδα

39 Το καθηλωμένο Ν.Ο. είναι ο ιχνηθέτης ενώ το Ν.Ο-στόχος είναι στο διάλυμα Το μέσο καθήλωσης είναι άκαμπτο υλικό (γυαλί, πλαστικό) Επιτυγχάνεται μεγάλη πυκνότητα ιχνηλατών

40 Τεχνική της φωτολιθογραφίας Οι ιχνηθέτες που χρησιμοποιούνται είναι μικρά ή μεγάλα σημασμένα τμήματα DNA που ακινητοποιούνται σε ενεργοποιημένο υλικό βραχίονας ΙΧΝΗΘΕΤΕΣ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΟΥ ΜΗΚΟΥΣ ΚΑΙ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑΣ γυαλί Έτσι ελέγχεται το μήκος η αλληλουχία και η θέση κάθε ολιγονουκλεοτιδίου

41 Εφαρμογές των DNA arrays: Μελέτη έκφρασης γονιδίων Ανάλυση αλληλουχίας DNA Ανίχνευση μεταλλάξεων Κατασκευή γονιδιακών χαρτών με βάση την έκφραση ή τη λειτουργία γονιδίων

42 Μελέτη έκφρασης γονιδίων Σύγκριση ολικού mrna σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων Μελέτη επίδρασης φαρμάκων και του μηχανισμού δράσης Σύγκριση υγιών και παθολογικών κυττάρων για τον εντοπισμό γονιδίων που σχετίζονται με ασθένειες Εντοπισμός γονιδίων ιών που ενεργοποιούνται μόνο κατά τη μόλυνση Σύγκριση διαφορετικών φάσεων ανάπτυξης ενός κυττάρου με εντοπισμό των γονιδίων που συμμετέχουν στην ανάπτυξη

43 Απομόνωση mrna από κύτταρα οργανισμού με διαφορετικό βαθμό ανάπτυξης Μετατροπή του RNA σε cdna με ανάστροφη τρανσκριπτάση + φθορίζοντα τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλοετίδια Μεταφορά των cdnas σε μικροσυστοιχίες Σύνδεση με συμπληρωματικές αλληλουχίες mrna cdna Απομάκρυνση των δειγμάτων που δεν υβριδίστηκαν Κάθε φθορίζον spot αντιστοιχεί σε γονίδιο που έχει εκφρασθεί

44 Πρωτεϊνικά chips (microarrays) Προσδιορισμός της ποσότητας των πρωτεϊνών σε ένα δείγμα

45 ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΕΣ ΔΙΕΡΓΑΣΙΕΣ Καθαρό περιβάλλον BIOKATAΛΥΣΗ ΒΙΟΜΕΤΑΡΟΠΕΣ ΖΥΜΩΣΗ

46 Ζύμωση Φυσικά ή συνθετικά υποστρώματα Πηγή C, N, O ΠΡΩΤΟΓΕΝΕΙΣ ΜΕΤΑΒΟΛΙΤΕΣ ΔΕΥΤΕΡΟΓΕΝΕΙΣ ΜΕΤΑΒΟΛΙΤΕΣ Απαραίτητοι για την ανάπτυξη μεταβολίτες Μεταβολικά τελικά προϊόντα Αντιβιοτικά Ορμόνες Χρωστικές

47 BΙΟΜΕΤΑΤΡΟΠΕΣ Bιοκαταλυόμενες αντιδράσεις ενός η περισσοτέρων σταδίων που οδηγούν στη σύνθεση νέων προϊόντων. Αντιδράσεις ενός σταδίου: ένα απομονωμένο ένζυμο. Αντιδράσεις πολλών σταδίων (καταλύονται από πολλά ένζυμα): ζωντανά ή εφησυχάζοντα κύτταρα, σπόρια ή ακόμη και νεκρά κύτταρα 2020: 30% των ενώσεων που παράγονται για φάρμακα, διατροφικά πρόσθετα, καλλυντικά, & εξειδικευμένα χημικά -βιοχημικά

48 Αριθμός άρθρων 600 Βιομετατροπή συνθετικών υποστρωμάτων με ένζυμα και ολόκληρα κύτταρα ETOΣ Πρώτες βιομηχανικές εφαρμογές με ακινητοποιημένα ένζυμα Αμινοξέα Ημισυνθετική πενικιλίνη Μετατροπή γλυκόζης σε φρουκτόζη

49 Προϊόν Βιοκαταλύτης Εφαρμογές Ασπαρτάμη Ακινητοποιημένη θερμολυσίνη από B. subtilis 6-αμινοπενικιλλνικό οξύ Ακινητοποιημένη ακυλάση της πενικιλλίνης (κεφαλοσπορίνης) από Ε.coli Ημισυνθετικές πενικιλλίνες και κεφαλοσπορίνες Ακυλάσες από Ε. coli και Pseudomonas putida Γλυκαντικό χαμηλών θερμίδων Στην παραγωγή ημισυνθετικών αντιβιοτικών Αντιβιοτικά Mη πρωτεϊνικά L-αμινοξέα Αμιδάσες από Ε. coli, Ps.putida κά. Πρόδρομοι στη σύνθεση οπτικώς ενεργών φαρμάκων Ν-Ετεροκυκλικές ενώσεις Ολόκληρα κύτταρα με δράση νιτριλάσης και υδρολάσης Πρόδρομοι εντομοκτόνων κλπ. φαρμάκων, Οπτικώς καθαρές αλκοόλες και αμίνες Ακινητοποιημένες λιπάσες Στη σύνθεση χημικών ενώσεων με βιολογική δράση L-Ασκορβικό οξύ Ακινητοποιημένα κύτταρα από Ac. xylinum Βιταμίνη Στεροειδή Κύτταρα από διάφορους Φάρμακα μικροοργανισμούς με δράση υδροξυλασών, αφυδρογονασών, Φρουκτόζη Ακινητοπ. κετοϊσομεράσης της ξυλόζης Γλυκαντικό Τροποποιμένα λίπη, εστέρες λιπαρών οξέων Ακινητοποιημένες λιπάσες και εστεράσες Τρόφιμα, φάρμακα, καλλυντικά

50 Διαφορά βιομετατροπών με τη ζύμωση: Στη ζύμωση έχουμε πλήθος μεταβολικών αντιδράσεων (κατά την ανάπτυξη του μικροοργανισμού) πρωτογενείς ή δευτερογενείς μεταβολίτες Πρωτογενείς μεταβολίτες ανάπτυξη κυττάρων Δευτερογενείς μεταβολίτες εμφανίζονται στη στατική φάση ανάπτυξης

51 Χαρακτηριστικά Βιομετατροπή Ζύμωση Βιοακαταλύτης Bιοσύστημα Τύπος αντιδράσεων Ελεύθερα ένζυμα, κύτταρα ζωντανά, εφυσηχάζοντα ή νεκρά Ενός ή περισσοτέρων σταδίων που καταλύονται από λίγα ένζυμα Ζωντανά κύτταρα σε ανάπτυξη Αντιδράσεις μεταβολισμού που καταλύονται από πλήθος ενζύμων Αρχικό υλικό Υπόστρωμα Πηγή άνθρακα και αζώτου Προϊόν Φυσικό ή μη φυσικό Φυσικό προϊόν πρωτογενούς ή δευτερογενούς μεταβολισμού Ανθεκτικότητα στη συγκέντρωση αντιδρώντων ή προϊόντων Απομόνωση προϊόντος Υψηλή Εύκολη με εφαρμογή μικρού αριθμού σταδίων Μειωμένη Απαιτεί μεγάλο αριθμό σταδίων Παραπροϊόντα Μικρός αριθμός ή και καθόλου Μεγάλος αριθμός

52 Bιοδιεργασίες σε μη (υδατο)συμβατά ή μη συμβατικά συστήματα Το νερό είναι φτωχός διαλύτης για την πλειοψηφία των οργανικών ενώσεων (υποστρωμάτων) Η τεχνολογική αξιοποίηση των ενζύμων/κυττάρων μπορεί να αυξηθεί αν διευρυνθεί η εφαρμογή τους σε μη υδατοσυμβατά συστήματα

53 Mπορούν να πραγματοποιηθούν βιοκαταλυόμενες διεργασίες που είναι αδύνατο να λάβουν χώρα σε υδατικό περιβάλλον (διαφορετικές από in vivo συνθήκες). Οι ιδιότητες των βιοκαταλυτών (σταθερότητα / εκλεκτικότητα) μπορεί να τροποποιηθεί σε μη υδατικά συστήματα -Μηχανική του μέσου (medium engineering)

54 Μη υδατοσυμβατά ή μη συμβατικά συστήματα Συστήματα χαμηλής περιεκτικότητας σε νερό στα οποία τα ένζυμα διατηρούν τις καταλυτικές τους ιδιότητες

55 Μη συμβατικά μέσα Οργανικοί διαλύτες (organic solvents) Υπερκρίσιμα ρευστά (supercritical fluids) Αέρια μέσα (gaseous media) Ιοντικά υγρά (οργανικά ιόντα) (ionic liquids)

56 Κατηγορίες μη συμβατικών συστημάτων S P 50% 0.1% 1%

57 Η επιλογή του μη συμβατικού μέσου Κριτήρια επιλογής μέσου Βιοσυμβατότητα Χημική και θερμική σταθερότητα Μειωμένη τοξικότητα Χαμηλό κόστος

58 Εφαρμογή υδρολυτικών ενζύμων για την κατάλυση αντιδράσεων σύνθεσης Χ RCOΝHR 1 + H 2 O RCOOH + R 1 NH 2 Πρωτεάση Χ RCOOR 1 + H 2 O RCOOH + R 1 OH Λιπάση

59 Πλεονεκτήματα της ενζυμικής κατάλυσης σε μη συμβατικά συστήματα 1. Αντιδράσεις με υδρόφοβα υποστρώματα. 2 Δυνατότητα μετατόπισης της χημικής ισορροπίας της αντίδρασης 3. Εύκολη ανάκτηση του βιοκαταλύτη από το μίγμα αντίδρασης 4. Δυνατότητα ελέγχου της εκλεκτικότητας Μηχανική του μέσου 5. Ελαχιστοποίηση μικροβιακής επιμόλυνσης 6. Αυξημένη διαλυτότητα αερίων υποστρωμάτων σε σχέση με τα υδατικά διαλύματα

60 Βιοκατάλυση σε άνυδρα μέσα Πώς το ένζυμο διατηρεί τις καταλυτικές του ιδιότητες σε μη υδατικό περιβάλλον; Ε Ε Ε Ε Ε Στερεός φορέας Ε Ε Ε Ε Ε Ε Ε Ε Ε Λυοφίληση Ενζύμου (στερεή κατάσταση) Ενζυμικός αντιδραστήρας Μη υδατικά μέσα

61 Βιοκατάλυση σε συστήματα πολύ μικρής περιεκτικότητας σε νερό Η δομή του πρωτεϊνικού μορίου παρουσιάζει μικρότερη ευκαμψία μικρότερη τάση για μετουσίωση Ακινητοποίηση σε στερεό φορέα Οργανικός διαλύτης Υδατική φάση Στερεός φορέας Λυοφιλημένη «σκόνη» ενζύμου

62 Αυξημένη θερμοσταθερότητα >100 ο C!! Ο βαθμός ενυδάτωσης του συστήματος επιδρά στη δραστικότητα και στη σταθερότητά των ενζύμων

63 ΥΔΡΟΦΟΒΙΚΟΤΗΤΑ (P oct = [S] οκτανόλη /[S] νερό ) συντελεστή κατανομής P του διαλύτη σε διφασικό σύστημα οκτανόλης/νερού S οκτανόλη Ρ=[S] oκτανόλη /[S] νερό [S] νερό logp<2, logp=2-4, logp>4 Σχετίζεται με την ικανότητα του διαλύτη να αλληλεπιδρά με τα απαραίτητα μόρια νερού

64 Βιοκατάλυση σε υπερκρίσιμα ρευστά Υπερκρίσμο ρευστό (supercritical fluids) ιδιότητες οι οποίες βρίσκονται μεταξύ της αέριας και της υγρής φάσης και εξαρτώνται από την πίεση Η ταχύτητα διάχυσης των υποστρωμάτων στο μέσο αυτό γίνεται χωρίς περιορισμούς ενώ η ανάκτηση του προϊόντος είναι εύκολη

65 Πίεση στερεό υγρό Υπερκρίσιμο CO 2 P C Υπερκρίσιμο ρευστό Ιδιότητες παρόμοιες με τους μη πολικούς διαλύτες αέριο Τ c = 31.1 o C P c =73 MPa. Μη τοξικός, μη εύφλεκτος Δυνατότητα διαχωρισμού προϊόντων/αντιδρώντων με ρύθμιση της P Θερμοκρασία T C

66 Βιοκατάλυση σε αντίστροφα μικκύλια Οργανικός διαλύτης Επιφανειοενεργό Η 2 Ο Διαλυτοποίηση πολικών και μη πολικών υποστρωμάτων υψηλές ταχύτητες Å S Διασπορά της υδατικής φάσης στη συνεχή οργανική φάση σταθεροποιείται από επιφανειοενεργά μόρια P

67 MOΝΟΦΑΣΙΚΑ & ΨΕΥΔΟΜΟΝΟΦΑΣΙΚΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ Μειωμένη σταθερότητα Οργανικός διαλύτης Υδατικό διάλυμα (νερό ή ρυθμιστικό) Α: Ένζυμο διαλυμένο σε μίγμα νερού/πολικού οργανικού διαλύτη Β: Ομοιοπολικά τροποποιημένο ένζυμο με PEG (πολυαιθυλενική γλυκόλη) C: Ένζυμο εγκλωβισμένο σε αντίστροφα μικκύλια

68 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΒΙΟΚΑΤΑΛΥΤΙΚΩΝ ΔΙΕΡΓΑΣΙΩΝ (βιομεταρτοπές) Υπόστρωμα/τα Ανάκτηση προϊόντων Βιοκατάλυση Μοντελοποίηση Σχεδιασμός βιοαντιδραστήρα Προϊόν/τα Επιλογή-απομόνωση Ένζυμα ενζυμικά συστήματα ή κύτταρα Σταθερότητα- Επαναχρησιμοποίηση Ακινητοποίηση Αναγέννηση συνενζύμου Ενζυμική Μηχανική Μηχανική του μέσου Μηχανική βιομορίων Χαρακτηρισμός Κινητική-Mηχανισμός Εκλεκτικότητα-Σταθερότητα Σχέση δομής-λειτουργίας Βελτίωση δραστικότητας, σταθερότητας εκλεκτικότητας

69 Τροποποίηση ενζύμων- Ενζυμική (Πρωτεϊνική) Μηχανική Σχεδιασμός πρωτεϊνών - τροποποίηση της δομής τους ώστε να μεταβληθούν οι ιδιότητές τους.

70 ΒΑΣΙΚΟΙ ΣΤΟΧΟΙ : Α) βελτίωση της καταλυτικής δράσης Β) αύξηση της σταθερότητας στις συνθήκες δράσης Γ) τροποποίηση της εξειδίκευσης Δ) κατασκευή πρωτεϊνών σύντηξης

71 ευαίσθητων σε οξειδωτικές συνθήκες Οι επιμέρους στόχοι της ενζυμικής μηχανικής είναι: 1. Η τροποποίηση της εκλεκτικότητας ως προς το υπόστρωμα. (αλλαγή στην τοπο-εκλεκτικότητα ή την εναντιο-εκλεκτικότητα). 2. Η αύξηση της θερμοανθεκτικότητας και της λειτουργικής σταθερότητας. 3. Η τροποποίηση της εξάρτησης από το ph. (μέσω της μεταβολής του ηλεκτροστατικού περιβάλλοντος στο ενεργό κέντρο του ενζύμου αποτέλεσμα της εισαγωγής/αντικατάστασης ενός ή περισσότερων αμινοξέων) 4. Η αύξηση της αντοχής σε οξειδωτικά αντιδραστήρια. (εισαγωγή μέσω κατευθυνόμενων μεταλλάξεων, αμινοξέων λιγότερο

72 5. Βελτίωση της δραστικότητας και σταθερότητας σε μη υδατικά διαλύματα 6. Η αύξηση της σταθερότητας των ενζύμων σε πρωτεολυτική υδρόλυση. 7. Ο σχεδιασμός και η εφαρμογή μίμων ενζύμων (Κατασκευή μορίων που παρουσιάζουν καταλυτική δράση μιμούμενα το ένζυμο π.χ καταλυτικά αντισώματα) 8. Η συγχώνευση ενζύμων που συμμετέχουν σε μια βιοχημική οδό σε ένα νέο βιομόριο με πολλαπλή καταλυτική δράση

73 Η τροποποίηση σε μοριακό επίπεδο της δομής μιας πρωτεΐνης μπορεί να γίνει με: -Χημικές μεθόδους -Ενζυμικές μεθόδους -Τεχνικές της τεχνολογίας ανασυνδυασμένου DNA.

74 Χημική τροποποίηση της πρωτοταγούς δομής του ενζύμου Αντιδράσεις αλκυλίωσης ή ακυλίωσης επιλεγμένων αμινοξέων (-CΟΟΗ, -SH, -ΝΗ 3 ή -ΟΗ της σερίνης) στην επιφάνεια του πρωτεϊνικού μορίου αύξηση της υδροφοβικότητας, τροποποίηση του συνολικού ηλεκτρικού φορτίου εισαγωγή υδατανθρακικών αλυσίδων στο πρωτεϊνικό μόριο Τροποποίηση στη λειτουργία της πρωτεΐνης

75

76 α) P NH 2 O + C Cl HCl P NH O C β) P NH C ΛΑΔΙ ΕΛΑΙΟ O

77 Χημική τροποποίηση αμινοξέων με PEG Τροποποίηση μέσω της σύνδεσης του πρωτεϊνικού μορίου με πολυμερή όπως η πολυαιθυλενική γλυκόλη (PEG) μειώνει ανεπιθύμητη ανοσολογική απόκριση.

78 Ομοιοπολική σύνδεση ενζύμου-συνενζύμου πρωτεάση παπαΐνη οξειδοαναγωγική δράσ Τροποποίηση μέσω της ομοιοπολικής σύνδεσης με κάποιο συνένζυμο που οδηγεί στο σχηματισμό ενός σταθερού καταλυτικού συμπλόκου Nικοτιναμιδο-αδενινo δινουκλεοτίδιο (NAD + σε οξειδοαναγωγικά ένζυμα Σύνδεση ενός φλαβο-υποκαταστάτη (π.χ NAD + )

79 Ενζυμική τροποποίηση πρωτεϊνών Στοχευμένη πρωτεολυτική διάσπαση Συνδετικό πεπτίδιο Προϊνσουλίνη Αλυσίδα Α Αλυσίδα Β

80 Το μέγεθος πολλών πρωτεϊνών περιορίζει τη δυνατότητα εφαρμογής τους π.χ στη βιομηχανία. Η απομάκρυνση ενός μη λειτουργικού τμήματος της πρωτεϊνης μπορεί να αυξήσει τη δυνατότητα εφαρμογής της

81 Μακρομοριακές τροποποιήσεις- Πρωτεΐνες σύντηξης (fusion proteins) Tροποποιήσεις της δομής μιας πρωτεΐνης σε μεγάλη έκταση Επιτυγχάνονται με την αποκοπή ολόκληρης αλληλουχίας βάσεων ή την προσθήκη τμήματος άλλου γονιδίου Π.χ. Η ένωση δύο η περισσοτέρων πρωτεϊνικών αλληλουχιών Πρωτεΐνες σύντηξης (fusion proteins)

82 Το πρόσθετο τμήμα το οποίο συχνά ονομάζεται «ουρά», μπορεί να χαρακτηρίζεται από συγκεκριμένες φυσικοχημικές ή βιοχημικές ιδιότητες οι οποίες είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν για τον καθαρισμό, αλλά και για την ανίχνευση και τον προσδιορισμό της πρωτεΐνης Π.χ η σύνδεση μιας ολιγοπεπτιδικής «ουράς», όπως μιας πολυιστιδίνης, Πως αυτό μπορεί να βοηθήσει τον καθαρισμό;

83

84 Εισαγωγή δισουλφιδικών δεσμών για αύξηση της σταθερότητας Πιο σταθερό μόριο

85

86 ENZYMIKH MHXANIKH -Τεχνικές της τεχνολογίας ανασυνδυασμένου DNA.

87 α) ο ορθολογικός ανασυνδυασμός ήδη υπαρχόντων βιοκαταλυτών κυρίως με την τεχνική της τοποκατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης β) η κατασκευή νέων βελτιωμένων βιοκαταλυτών μέσω της εφαρμογής «εξελικτικών» μεθόδων πρωτεϊνικού σχεδιασμού (κατευθυνόμενη εξέλιξη μέσω της εισαγωγής τυχαίων μεταλλάξεων και τον in vitro ανασυνδυασμό των γονιδίων.

88 Τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση Στόχος: η αντικατάσταση συγκεκριμένων αμινοξέων στο ενζυμικό μόριο. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω αντικατάστασης των αντίστοιχων βάσεων με τεχνικές της μηχανικής του DNA (ολιγονουκλεοτιδίου τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση )

89 Κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση. Η κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση χρησιμοποιείται για να μελετηθεί η λειτουργία των γονιδίων, καθώς και να τροποποιηθούν οι ιδιότητες των πρωτεϊνών που κωδικοποιούν Οι μεταλλάξεις εισάγονται στο DNA με in vitro μεθόδους (π.χ με PCR), κατόπιν αυτά τα μόρια DNA μεταφέρονται σε βακτήρια για να μελετηθεί το φαινοτυπικό αποτέλεσμα της συγκεκριμένης γενετικής αλλαγής.

90 H τεχνική προϋποθέτει την ολοκληρωμένη γνώση της σχέσης που συνδέει την πρωτοταγή δομή και τη λειτουργία του πρωτεϊνικού μορίου

91 Ενσωμάτωση του ενζύμου στη βιομηχανική διαδικασία Απομόνωση του ενζύμου για το οποίο υπάρχει ενδιαφέρον Απομονωμένο ένζυμο Προσδιορισμός των ιδιοτήτων του τροποποιημένου ενζύμου Επανασχεδιασμός αν κριθεί απαραίτητος Εφαρμογή βιοχημικών και βιοφυσικών μεθόδων για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας της τριτοταγούς δομής και της δομής του καταλυτικού κέντρου Τροποποιημένο ένζυμο Σχεδιασμός πρωτεινικού μορίου Kατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση του γονιδίου. Κλωνοποίηση και έκφραση του τροποποιημένου γονιδίου

92 MHXANIKH TOY DNA Ελεγχόμενη τροποποίηση του DNA (εισαγωγή μεταλλάξεων) - Διαγραφή εισαγωγή αντικατάσταση βάσεων - Κατασκευή πρωτεϊνών με επιθυμητές ιδιότητες Aρχικό γονίδο αντικατάσταση διαγραφή προσθήκη

93 Kλωνοποίηση με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης PCR Γρήγορη αντιγραφή αλληλουχίας νουκλεοτιδίων σε μεγάλες ποσότητες Παραγωγή χιλιάδων αντιγράφων της επιθυμητής αλληλουχίας Για τη PCR xρειάζεται: 1 ζεύγος εκκινητών (primers) συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια μεγέθους bp 4 τριφωσφορικοί δεοξυριβονουκλεοζίτες (datp, dgtp dctp, dttp) 1 DNA πολυμεράση (θερμοανθεκτική) Ιόντα μαγνησίου

94 Θέρμανση στους 95 ο C Το μίγμα της αντίδρασης ψύχεται στους ο C για την υβριδοποίηση των εκκινητών. Προσθήκη εκκινητών σε περίσσεια Η θερμοκρασία αυξάνεται στους 70 ο C Προσθήκη DNA πολυμεράσης για την 5 3 σύνθεση του DNA + datp, dgtp dctp, dttp

95

96 Κάθε κύκλος διπλασιάζει την ποσότητα DNA που είχε σχηματιστεί στον προηγούμενο κύκλο κύκλοι αυξάνουν σημαντικά την ποσότητα του DNA φορές Η PCR έχει υψηλή εξειδίκευση που ρυθμίζεται από τη θερμοκρασία και τη συγκέντρωση άλατος.

97 Η εισαγωγή της επιθυμητής μετάλλαξης πραγματοποιείται με τη χρήση συνθετικών μεταλλαξογόνων ολιγονουκλεοτιδίων. Τα ολιγονουκλεοτίδια αυτά είναι συνήθως μεγέθους βάσεων και περιέχουν τη συγκεκριμένη αλλαγμένη βάση κοντά στο κέντρο τους, είναι συμπληρωματικά με την περιοχή του γονιδίου που πρόκειται να πραγματοποιηθεί η μετάλλαξη

98 Μεγάλου μήκους ολιγονουκλεοτίδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εισαγωγή μεγάλης περιοχής, υπό την προϋπόθεση ότι υπάρχουν περίπου 10 βάσεις με την συμπληρωματική ακολουθία σε κάθε πλευρά.

99 Μετουσίωση με θέρμανση To μεθυλιωμένο πλασμίδιο περιέχει την αλληλουχία του γονιδίου την οποία επιθυμούμε να τροποποιήσουμε και να ενισχύσουμε με αντίδραση PCR. To ένζυμο DpnI πέπτει το μεθυλιωμένο DNA. To DNA που προήλθε από την αντίδραση PCR δεν πέπτεται και μπορεί να μετασχηματιστεί στα κύτταρα του ξενιστή.

100 Μετάλλαξη κασέτας Χρησιμοποιείται δίκλωνο πλασμίδιο από Ε.coli το οποίο έχει πολύ κοντά 2 σημεία δράσης περιοριστικών ενζύμων Αντικατάσταση τμήματος ανάμεσα σε δύο σημεία τομής νουκλεασών περιορισμού Εισαγωγή συνθετικού δίκλωνου τμήματος (κασέτα)

101 ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ Ισομεράση της ξυλόζης Άμυλο σιρόπι φρουκτόζης Γλυκοζυλίωση Lys 253 αποδιάταξη Αντικατάσταση της Lys με Arg

102 β-λακταμάση Σύνθεση αντιβιοτικών Ser στο καταλυτικό κέντρο Αντικατάσταση με Cys τροποποιεί την εκλεκτικότητα ως προς τη δομή του λακταμικού δακτυλίου του αντιβιοτικού Νέα αντιβιοτικά Ο H Ν Ο N - COO ακυλάση της πενικιλλίνης Η 2 Ν Ο N - COO + Ο - Ο πενικιλλίνη G 6-ΑPΑ

103 Τροποποίηση πρωτεασών Σαμπτιλυσίνη (εφαρμογή σε απορρυπαντικά) Αντικατάσταση Met 222 με Ala, Ser αυξάνει την ανθεκτικότητα σε οξειδωτικούς παράγοντες Αντικατάσταση του Asp 99 με Ser τροποποιεί την εξάρτηση από το ph

104 ΕΝΖΥΜΑ και Χαρακτηριστικά αμινοξέα Συνθετάση τυροσινυλο-trna (στην ενεργό περιοχή υπάρχει η τριάδα Cys35, His48 & Thr51) β-λακταμάση (στο ενεργό κέντρο περιλαμβάνει τα αμινοξέα Ser70, Thr71) Αλκοολική αφυδρογονάση (στην ενεργό περιοχή υπάρχουν τα αμινοξέα Thr48, Thr54, Trp57 & Trp93) Iσομεράση γλυκόζης H Lys253 γλυκοζυλιώνεται παρουσία υψηλής συγκέντρωσης γλυκόζης και μειώνει τη δραστικότητα και τη σταθερότητα του ενζύμου Μεταλλαγή και τροποποίηση Η μεταλλαγή Thr51Ala αυξάνει τη σταθερά εξειδίκευσης k cat /K M Oι μεταλλαγές His48Gly & Cys35Gly δεν άλλαξαν την ενέργεια αλληλεπίδρασης με το ΑΤΡ αλλά σταθεροποίησαν τη μεταβατική κατάσταση προάγοντας την κατάλυση. Η μεταλλαγή στην Ser70 τροποποιεί την εξειδίκευση και ταυτόχρονα αυξάνει τη θερμοσταθερότητα και την αντοχή σε πρωτεολυτική διάσπαση Η αντικατάσταση της Thr71 με 19 άλλα αμινοξέα δεν έδωσε κάποια μεταβολή στη δραστικότητα Η μεταλλαγή Trp54Leu αυξάνει τη δραστικότητα για διακλαδιζόμενες αλκοόλες Η μεταλλαγή Trp54Ala αντιστρέφει την εκλεκτικότητα ως προς το μέγεθος των αλκοολών Η μεταλλαγή Lys253Arg αυξάνει σημαντικά τη σταθερότητα

105 «Εξελικτικές» μέθοδοι σχεδιασμού νέων βιοκαταλυτών Οι μέθοδοι αυτές βασίζονται στη δημιουργία κλώνων η οποία επιτυγχάνεται: 1. Με την εφαρμογή μη ανασυνδυαστικών τεχνικών με την εισαγωγή τυχαίων μεταλλάξεων στο γονίδιο που κωδικεύει την πρωτεΐνη-στόχο, Μέσω τεχνικών όπως η error-prone PCR η οποία σε κατάλληλες συνθήκες οδηγεί στην εισαγωγή περίπου μιας μετάλλαξης ανά 1000 ζεύγη βάσεων

106

107 2. Με την εφαρμογή ανασυνδυαστικών τεχνικών κατευθυνόμενης εξέλιξης που βασίζονται στον ανασυνδυασμό γονιδίων όπως η τεχνική ανασυνδυασμού ή «ανακατέματος» του DNA (DNA shuffling),

108 Τεχνική ανασυνδυασμού ή «ανακατέματος» του DNA (DNA shuffling). (1). Υδρόλυση των γονιδίων με DNA-αση, (2) Αποδιάταξη και αναδιάταξη (υβριδισμός) του DNA. (3) Επιμήκυνση με PCR. (4) Η διαδικασία επαναλαμβάνεται οδηγώντας στη δημιουργία βιβλιοθήκης νέων ανασυνδυασμένων γονιδίων.

109 Αρχέγονο γονίδιο Φυσική εξέλιξη Είδος 1 Είδος 2 Είδος 3 Ιn vitro aνασυνδυασμός (shuffling) DNA Υβριδικά γονίδια

110 Οι τεχνικές αυτές δεν προϋποθέτουν τη γνώση της σχέσης που συνδέει τη δομή με τη λειτουργία του πρωτεϊνικού μορίου

111 1. Απομόνωση του γονιδίου στόχου 2. Εισαγωγή μεταλλάξεων/ανασυνδυασμός 3. Δημιουργία βιβλιοθηκών μεταλλαγμένων γονιδίων 4. Έκφραση στον κατάλληλο βακτηριακό φορέα 5. Με τεχνικές επιλογής και διαλογής (screening), ανιχνεύονται οι πρωτεΐνες (ένζυμα) με τις βελτιωμένες ιδιότητες

112 Τυχαίες μεταλλάξεις Επόμενη γενιά Aρχικά γονίδια Ανασυνδυασμός Γονίδιο με τις καλύτερες ιδιότητες Μετασχηματισμός σε Ε. coli ή ζύμες ΔΙΑΛΟΓΗ Μεταφορά σε πλακίδια τύπου Εlisa (96 φρεατίων)

113 Προσδιορισμοί υψηλής ρυθμοαπόδοσης (high-throughput screening) Οι μέθοδοι αυτοί εφαρμόζονται για την ανάλυση της ενζυμικής δραστικότητας από βιβλιοθήκες μεταλλαγμάτων (που περιέχουν μεταλλάγματα). Με αυτόματα μηχανήματα ρομποτικής λειτουργία, οι προσδιορισμοί μπορούν να γίνουν εύκολα κάτω από τις ίδιες συνθήκες του πειράματος.

114 Επιλογή με βάση την: -Εξειδίκευση -Σταθερότητα στις συνθήκες αντίδρασης -Δραστικότητα

115

116 Ένζυμα Tροποποίηση Αλδολάση από E. coli Τροποποίηση της στερεοεκλεκτικότητας Εστεράση από Pseudomonas fluorescence Λιπάση από Pseudomonas aeruginosa Εστεράση από Bacillus subtilis Κυττόχρωμα P450 με δράση μονοξυγονάσης από Pseudomonas putida Υπεροξειδάση από Coprinus cinereus Τροποποίηση της εξειδίκευσης ως προς το υπόστρωμα Aύξηση 26 φορές της εναντιοεκλεκτικότητας Aύξηση της δραστικότητας έως 150 φορές παρουσία οργανικών διαλυτών. Αύξηση της θερμοσταθερότητας κατά 14 ο C Aύξηση της δραστικότητας κατά 20 φορές. Αύξηση 170 φορές της θερμοσταθερότητας και 100 φορές της δραστικότητας

117 Τεχνολογίες ομικές (-οmics) Γονιδίωμα Μεταγράφωμα Πρωτέωμα Μεταβόλωμα

118

119 Γονιδιωματική ή γενωμική (genomics), οδήγησε σε πλήρεις DNA χάρτες πολλών ειδών, συμπεριλαμβανομένου του ανθρώπου

120 Πρωτεoμική (proteomics) ανάπτυξη εργαλείων για τη μελέτη του οργανισμού σε επίπεδο πρωτεϊνών και πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων Το πρωτέωμα δίνει την δυνατότητα να προσδιοριστούν τα ρυθμιστικά στοιχεία έκφρασης των γονιδίων, αλλά και να προσδιοριστεί ο τρόπος απόκρισης ενός οργανισμού στα περιβαλλοντολογικά ερεθίσματα. Το Ε. coli κωδικοποιεί περίπου 4400 πρωτεΐνες. Μέχρι σήμερα είναι γνωστή η λειτουργία περίπου του 60% αυτών των πρωτεϊνών. Ο βιολογικός ρόλος των υπόλοιπων πρωτεϊνών, περίπου 1800 πρωτεΐνες, είναι υπό διερεύνηση

121 Μεταβολoμική (metabolomics), (χημικός χαρακτηρισμός του φαινότυπου) προσδιορισμός μεταβολιτών Το μεταβόλωμα (metabolome) αποτελεί το τελικό προϊόν του γονιδιώματος και ορίζεται ως το σύνολο των μικρού μοριακού βάρους ενώσεων (μεταβολιτών), που απαντώνται σ ένα κύτταρο ή οργανισμό και το οποίο συμμετέχει σε μεταβολικές αντιδράσεις, που απαιτούνται για την ανάπτυξη, τη διατήρηση και τη φυσιολογική λειτουργία Το εκτιμώμενο μέγεθος του μεταβολώματος είναι πολύ μεγάλο. Ο μύκητας S. cerevisiae έχει περίπου 600 μεταβολίτες, το φυτικό βασίλειο πάνω από μεταβολίτες, ενώ η ανάλυση του ανθρώπινου μεταβολώματος αποκαλύπτει πολύ μεγαλύτερη πολυπλοκότητα και αριθμούς μεταβολιτών

122 Synthetic Biology Η συνθετική βιολογία αφορά στο σχεδιασμό και την κατασκευή των νέων βιολογικών εργαλείων, διατάξεων και συστημάτων, όπως ένζυμα, γενετικά κυκλώματα, και κύτταρα ή τον ανασχεδιασμό των υφιστάμενων βιολογικών συστημάτων για χρήσιμες εφαρμογές.

123 Η συνθετική βιολογία επιδιώκει να αποτελέσει για τη βιολογία ότι αποτέλεσε η ανάπτυξη της δυνατότητας σύνθεσης ενώσεων στη χημεία αλλά και ο σχεδιασμός ολοκληρωμένων κυκλωμάτων στους υπολογιστές.

124 Υπάρχει σαφής διαφορά μεταξύ γενετικής μηχανικής και συνθετικής βιολογίας. Στη γενετική μηχανική γίνεται μεταφορά γονιδίων από έναν οργανισμό σε έναν άλλο. Η συνθετική βιολογία βασίζεται στο σχεδιασμό ενός γενετικού δικτύου, το οποίο σχηματίζεται από συστατικά μέρη που προέρχονται από διάφορα είδη και τα οποία μπορούν να συναρμολογηθούν ως επιμέρους συστατικά σε μεγαλύτερα ολοκληρωμένα συστήματα.

125 Nέα βιολογικά εργαλεία (ένζυμα), διατάξεις (γενετικά κυκλώματα) και συστήματα (κύτταρα) New unit, new function

126 Σασί Η έννοια περιλαμβάνει τη χρησιμοποίηση ενός κυττάρου-ξενιστή στον οποίο εισάγεται συνθετικό DNA. Οι συνηθέστεροι οργανισμοί που χρησιμοποιούνται ως ξενιστές είναι τα βακτήρια E. coli, B. subtilis, Mycoplasma και P. putida και η ευκαρυωτική Ζύμη. Ο ξενιστής προσφέρει το βασικό κυτταρικό περιβάλλον το οποίο εμπλουτίζεται με νέες ιδιότητες που εισάγονται μέσω του τροποποιημένου DNA.

127 Παραγωγή της αρτεμισινίνης από τους Keasling et al που μελέτησαν τα μεταβολικά μονοπάτια του Artemisia annua και παρήγαγαν αρτεμινισιακό οξύ (πρόδρομο φαρμάκου για την αντιμετώπιση της ελονοσίας) χρησιμοποιώντας τη Ζύμη ως κυτταρικό εργοστάσιο (Metab Eng Mar;9(2):160-8

128 Η κύρια δυσκολία της προσέγγισης αυτής είναι ο έλεγχος της συμπεριφοράς του ξενιστή. Οταν εισαχθεί το νέο DNA, το σύστημα ενδέχεται να μην συμπεριφερθεί με τον αναμενόμενο και επιθυμητό τρόπο. Για τον λόγο αυτόν, ένας αριθμός ερευνητικών ομάδων εργάζεται πάνω στα αποκαλούμενα «ελάχιστα κύτταρα», δηλαδή κύτταρα-ξενιστές τα οποία διατηρούν μόνο τις ελάχιστες απαραίτητες βιολογικές λειτουργίες για την επιβίωσή τους. 2006;2:45). (Mol Syst Biol.

129 Εφαρμογές της Συνθετικής Βιολογίας Υγεία: (α) Ένας μεγάλος αριθμός φαρμάκων αναμένεται να έχουν σχεδιαστεί ως εφαρμογές Συνθετικής Βιολογίας Η ΣΒ μπορεί να χρησιμοποιηθεί είτε για την παραγωγή συνθετικών ή φυσικών ουσιών είτε για την βελτιστοποίησή τους, μειώνοντας τις παρενέργειες.

130 Ενέργεια: (α) κατασκευή βιολογικών μηχανισμών που επιτελούν την παραγωγή βιοκαυσίμων με τη βέλτιστη απόδοση αλλά και ειδικότερα με τη χρησιμοποίηση πρώτων υλών μη αξιοποιήσιμων με τη σημερινή τεχνολογία. Γεωργία/Βιομηχανία: ανάπτυξη εφαρμογών με βάση τη γενετική τροποποίηση των καλλιεργειών ως βιολογικά συστήματα/κυτταρικά εργοστάσια Διατροφή (παραγωγή τροφών με βέλτιστες ιδιότητες), Βιομηχανία(παραγωγή χημικών υψηλής προστιθέμενης αξίας) Ανάπτυξη βιοϋλικών. Π.χ η παραγωγή συνθετικού μεταξιού από αράχνη (μεγάλη ανθεκτικότητά σε συνδυασμό με το πολύ χαμηλό βάρος του).

131 Ανάλυση πρωτεώματος Το πρωτέωμα δίνει την δυνατότητα να προσδιοριστούν τα ρυθμιστικά στοιχεία έκφρασης των γονιδίων, αλλά και να προσδιοριστεί ο τρόπος απόκρισης ενός οργανισμού στα περιβαλλοντολογικά ερεθίσματα.

132 Η μέθοδος Western blot (protein immunoblot) χρησιμοποιείται ευρέως στην μελέτη των πρωτεϊνών. Οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται σε SDS-PAGE, κατόπιν μεταφέρονται σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης ή πλαστική μεμβράνη και ακολούθως ταυτοποιούνται, αφού υβριδιστούν με ένα αντιγόνο, το οποίο στη συνέχεια ανιχνεύεται με ένα άλλο αντιγόνο ή ιχνηθέτη.

133 Η αλκαλική φωσφατάση αφαιρεί φωσφορικές ομάδες από το μόριο του υποστρώματος Χ-Phos. Το εναπομείναν τμήμα του υποστρώματος αντιδρά με το οξυγόνο σχηματίζοντας ιζημα μπλέ χρώματος στη θέση της πρωτεΐνης

134 Ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών σε δύο διαστάσεις Aρχικά o διαχωρισμός γίνεται με βάση το ισοηλεκτρικό σημείο σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου με βαθμίδωση του ph και κατόπιν στο ίδιο πήκτωμα, αλλά στη δεύτερη διάστασή του ο διαχωρσμός γίνεται βάσει του μοριακού τους βάρους (2-DPAG: two-dimensional polyacrylamide gel).

135

136 Aπό τα πηκτώματα του πολυακρυλαμιδίου μπορούν να απομονωθούν οι πρωτεΐνες,, ακολούθως αυτές να υδρολυθούν με θρυψίνη και να μελετηθούν με φασματοφωτομετρία μάζας (matrix-assisted laser desorption/ionization- MALDI) ή την τεχνική electrospray ionization (ESI).

137

138 Στη φασματομετρία MALDI δημιουργούνται ιόντα πρωτεΐνης που επιταχύνονται μέσω ενός ηλεκτρικού πεδίου. Τα ιόντα αυτά ταξιδεύουν μέσα από έναν σωλήνα επιτάχυνσης, όπου τα μικρά ιόντα ταξιδεύουν γρηγορότερα και φθάνουν πρώτα στον ανιχνευτή. Επομένως, ο χρόνος πτήσης (time of flight, TOF) στο ηλεκτρικό πεδίο είναι παράμετρος εξαρτώμενη από το λόγο μάζα/φορτίο. -Ανάλυση των δεδομένων από πρωτεϊνικές βάσεις δεδομένων αποκαλύπτει την εν λόγω πρωτεΐνη.

139 ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ

140

141 ΠΡΟΪΟΝ ΕΝΔΕΙΞΗ ΕΤΑΙΡΙΑ ΠΩΛΗΣΕΙΣ (εκ US$) Aranesp & Epogen, (Ερυθροποιητίνη) Πωλήσεις βιοφαρμακευτικών προϊόντων το 2015 (εκτίμηση). Aναιμία ΑΜGEN >5000 Neulasta & Neupogen, (Ερυθροποιητίνη) Procrit/Eprix (Ερυθροποιητίνη) Aναιμία ΑΜGEN >4000 Aναιμία Johnson & Johnson >6000 Avonex (Iντερφερόνη-β) Σκλήρυνση κατά πλάκας Βiogen >2000 Rituxan Herceptin (Μονοκλωνικά αντισώματα) Λέμφωμα Καρκίνος του στήθους Genentech >1000 Humulin Humalog (Ινσουλίνη) Διαβήτης Lilly >2000

142

143 ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΑ Produkte 6 PHARMAWIRKSTOFFE ΕΝΕΡΓΑ ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ - ΣΗΜΕΡΑ HEUTE UND ΚΑΙ ΑΥΡΙΟ MORGEN Προτερήματα 6-1 Vorteile των rekombinanter ανασυνδιασμένων Medikamente φαρμάκων Νέες στρατηγικές αντιμετώπισης ασθενειών (π.χ. μονοκλωνικά αντισώματα) Bελτιωμένη βιοδιαθεσιμότητα (π.χ. ερυθροποιητίνη) Μειωμένη πιθανότητα μόλυνσης (π.χ. παράγοντας VIII) Υψηλή δραστικότητα και μειωμένες παρενέργειες (π. χ. Ιστικός ενεργοποιητής πλασμινογόνου) Περιβαλλοντολογική συμβατότητα και οικονομική παραγωγή (π.χ. ινσουλίνη) Informationsserie Biotechnologie

144 Θεραπευτικές πρωτεΐνες

145 Approved biologicals (enzymes)

146 Approved biologicals (vaccines and liposomes)

147 Approved biologicals (tissue and cell engineering)

148 Approved biologicals (blood derivatives and natural extracts)

149 Enzyme as drugs 2 practises (Enzyme Therapy and Enzyme Replacement Therapy) Plant-based enzymes are preferred over animal derived enzymes

150 First therapeutic enzyme approved in 1990 under Orphan Drug Act (Vellard 2003).

151 Πίνακας 8.8α. Θεραπευτική αντικατάσταση ενζύμων. ΕΝΖΥΜΑ ΔΡΑΣΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ α-αντιθρυψίνη τροποποιημένη Μet358Val ώστε να είναι ανθεκτική σε οξειδωτικό περιβάλλον (π.χ σε καπνιστές) Το ένζυμο υδρολύει την ελαστάση και έτσι ελέγχει τα επίπεδά της Πνευμονικά νοσήματα (Κυστική ίνωση, βρογχίτιδα, εμφύσημα) Υδρολάση της Έλλειψη του ενζύμου οδηγεί σε αδυναμία μεταβολισμού της Φαινυλκετονούρια φαινυλαλανίνης φαινυλαλανίνης Παγκρεατικά ένζυμα (λιπάση πρωτεάση, Ενζυμα πέψης πρωτεϊνών, Ασθένειες του παγκρέατος αμυλάση, νουκλεάση) Παγκρεατίνη από χοίρο λιπών, πολυσακχαριτών Λακτάση Υδρόλυση της λακτόζης Δυσανεξία σε γαλακτοκομικά Απαμινάση αδενοσίνης Γύκοκερεβροζιδάση Τροποποιημένο ένζυμο Ηis495Arg με τροποιημένη υδατανθρακική περιοχή Η έλλειψη του ενζύμου οδηγεί σε μη λειτουργικά Τ- και Β- κύτταρα Το ένζυμο υδρολύει το γλυκοκερεραμίδιο η συσσώρευση του οποίου στα λυσοσώματα οδηγεί σε σοβαρές ασθένειες Νόσος SCID Γενετικά κληρονομούμενη ανοσοανεπάρκεια Νόσος του Gaucher (γενετική ασθένεια)

152 DNAάση (Κλωνοποιημένη ανθρώπινη δεοξυρυβονουκλεάση Ι) σε εισπνεόμενη μορφή Πίνακας 8.8β. Τα ένζυμα ως θεραπευτικά μέσα. ΕΝΖΥΜΑ ΔΡΑΣΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ Κυστική ίνωση Υδρολύει το DNA της βλέννας στους (συσσώρευση πνεύμονες πηκτής βλέννας στους πνεύμονες) L-ασπαραγινάση Εξωγενής χορήγηση Θρομβολυτικά ένζυμα Μη πρωτεολυτικές πρωτεΐνες όπως η στρεπτοκινάση και σταφυλοκινάση. Πρωτεολυτικά ένζυμα όπως η ουροκινάση και ο ιστικός ενεργοποιητής του πλασμινογόνου Η σερονοπρωτεάση ancord Δισμουτάση του σουπεροξειδίου (SOD) Καταλάση Το ένζυμο μετατρέπει την L-ασπαραγίνη σε L-ασπαραγινικό και έτσι μειώνει την L-ασπαραγίνη που είναι απαραίτητο αμινοξύ για τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων τα οποία, σε αντίθεση με τα υγιή, δεν μπορούν να συνθέσουν το αμινοξύ αυτό Θρομβόλυση (Τα ένζυμα μετατρέπουν το πλασμινογόνο σε πλασμίνη η οποία λύει το ινώδες των θρόμβων) Η SOD καταλύει τη μετατροπή σουπεροξειδικών ριζών (Ο 2 - ) σε Η 2 Ο 2 Οι ρίζες σουπεροξειδίου προξενούν κυτταρικές βλάβες καθώς προσβάλουν τα ακόρεστα λιπαρά των μεμβρανών. Η καταλάση μετατρέπει το Η 2 Ο 2 σ ε Η 2 Ο Λεμφοκυτταρική λευχαιμία Θρομβολυτική θεραπεία Πρόληψη καταστροφής ιστών από οξειδωτικής καταπόνηση

153 Topical Applications There are enzymes in skin care products Rosecea Face Wash

154 ΕΜΒΟΛΙΑ Με τα εμβόλια εισάγουμε στον οργανισμό τον ίδιο τον μικροοργανισμό (ιό ή μικρόβιο) νεκρό ή εξασθενημένο, ή αντιγόνο (π.χ μια πρωτεΐνη) από τον μικροοργανισμό. Με τον τρόπο αυτό διεγείρουμε τον οργανισμό να παράγει δικά του αντισώματα τα οποία κατευθύνονται εναντίον του συγκεκριμένου μικροοργανισμού

155 Φάσεις της ανάπτυξης εμβολίων Βασική έρευνα και ανάπτυξη (2-4 χρόνια) Produkte 6 PHARMAWIRKSTOFFE HEUTE UND MORGEN 6-7 Phasen der Impfstoffentwicklung Κλινικές έρευνες (5-7 χρόνια) Ταυτοποίηση ουσίας με αξιοποιήσιμη δράση Ασφάλεια Ασφάλεια και ανοσοαπόκριση Ασφάλεια και ανοσοαπόκριση και δράση Επίσημη εγγραφή και άδεια (1,5 χρόνια) Προκλινικά Φάση I Φάση II Φάση III Πειραματικά συστήματα, Έρευνα σε πειραματόζωα <100 εθελοντές >100 εθελοντές >1.000 εθελοντές Informationsserie Biotechnologie

156 Eμβόλια Παραγωγή με : α) Εμπειρικές μεθόδους Β) Τεχνικές τεχνολογίας ανασυνδυασμένου DNA Ηπατίτιδα Β, Ερπης, Ελονοσία, AIDS κ.ά

157 Τα εμβόλια αποτελούνται από νεκρές ή από εξασθενημένες μορφές ενός παθογόνου μικροοργανισμού. Για το σκοπό αυτό, ο παθογόνος μικροοργανισμός αναπτύσσεται σε κυτταροκαλλιέργεια, απομονώνεται και είτε νεκρώνεται είτε απενεργοποιείται (γίνεται μη μολυσματικός), χωρίς βέβαια να χάνει την ικανότητά του να προκαλεί ενεργητική ανοσία

158 Eξασθενημένα Βακτήρια ή ιοί εξασθενημένοι Αδρανοποιημένα Βακτήρια ή ιοί αδρανοποιημένοι θερμικά ή χημικά Τα περισσότερα εμβόλια (χολέρας, τύφου κλπ) είναι εκχυλίσματα νεκρών βακτηρίων Το εμβόλιο της φυματίωσης χρησιμοποιεί εξασθενημένα ζωντανά κύτταρα (αραιωμένο στέλεχος Mycobacterium bovis) Υπομονάδων Εκχυλίσματα παθογόνων απομονωμένες πρωτεΐνες και συστατικά

159 Μειονεκτήματα: Δεν μπορούν όλοι οι μολυσματικοί παράγοντες να αναπτυχθούν σε κυτταροκαλλιέργεια και έτσι δεν έχουν αναπτυχθεί εμβόλια για πολλές ασθένειες. Ορισμένοι ιοί των ζώων αναπτύσσονται με αργό ρυθμό σε κυτταροκαλλιέργειες χαμηλή απόδοσή υψηλό κόστος. Κίνδυνος έκθεσης του προσωπικού στον παθογόνο παράγοντα. Δεν είναι όλα τα εμβόλια αποτελεσματικά για μια ασθένεια π.χ. για τον ιό του AIDS γίνονται συνεχείς ανεπιτυχείς προσπάθειες κατασκευής εμβολίου.

160 H παραγωγή εμβολίων με βιοτεχνολογικές μεθόδους: Εμβόλια από γενετικώς αποτοξινωμένες πρωτεΐνες, ετερόλογες πρωτεΐνες και συνθετικά πεπετίδια Εμβόλια από ζωντανούς γενετικά τροποποιημένους ιούς Εμβόλια γυμνού DNA

161 Γονίδια από επικίνδυνο ιό ή άλλο μικροοργανισμό ενσωματώνονται σε άλλο ιό, που είναι αβλαβής για τον άνθρωπο, όπως ο ιός της δαμαλίτιδας. Ο γενετικά τροποποιημένος ιός που προκύπτει εξακολουθεί να είναι αβλαβής, αλλά επειδή παράγει την αντιγονική πρωτεΐνη του ιού ή του μικροοργανισμού, εισάγεται στο σώμα και προκαλεί έντονη ανοσολογική αντίδραση

162 Ένας τύπος εμβολίου μπορεί να είναι το ίδιο το DNA. Στη συγκεκριμένη περίπτωση το γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη με αντιγονική δράση εισάγεται κατευθείαν στον οργανισμό που πρόκειται να ανοσοποιηθεί. Το γονίδιο ενσωματώνεται στο γονιδίωμα και παράγει το αντιγόνο, το οποίο με τη σειρά του προκαλεί ενεργητική ανοσία στον οργανισμό

163 Γενετικώς τροποποιημένο στέλεχος του Salmonella typhimurium (τοξικός μικροοργανισμός στα τρόφιμα) χρησιμοποιείται για την παραγωγή ετερόλογων αντιγόνων Η τροποποίηση αφορά στα γονίδια των ενζύμων που συμμετέχουν στα μεταβολικά μονοπάτια παραγωγής αρωματικών αμινοξέων Η τροποποίηση αυτή ελαχιστοποιεί την τοξικότητα του στελέχους

164 Εμβόλια από αδρανοποιημένες ενδοτοξίνες Αδρανοποίηση απομονωμένων ενδοτοξινών με θέρμανση, χημική ή ενζυμική επεξεργασία Τοξίνη τετάνου υδρόλυση με παπαϊνη απομάκρυνση πεπτιδίου C To πεπτίδιο C είναι ικανό να προκαλέσει ανοσοποίηση To πεπτίδιο C σήμερα παράγεται σε E. coli ως ετερόλογο προϊόν

165

166

167 Παραγωγή Βιταμινών Μερικές βιταμίνες παράγονται σε βιομηχανική κλίμακα από μικροοργανισμούς Η βιταμίνη Β12 (κοβαλαμίνη) παράγεται από ακτινομύκητες του γένους Streptomyces ή παράγεται ως κύριο προϊόν ζύμωσης από καλλιέργειες προπιονικών βακτηρίων (π.χ. Propionibacterium shermanii) που αναπτύσσονται, αρχικά, σε αναερόβιες συνθήκες για διάστημα 3 ημερών Η βιταμίνη Β2 (ριβοφλαβίνη) παράγεται ως παραπροϊόν της ζύμωσης παραγωγής οργανικών διαλυτών (ακετόνης, βουτανόλης) από διάφορα είδη του γένους Clostridium

168

169 ΒΙΟΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΙΜΟΙ ΚΑΤΑΛΥΤΕΣ ΦΙΛΙΚΕΣ ΣΤΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ ΒΙΟΔΙΕΡΓΑΣΙΕΣ Βιομετατροπές

170 Ausblick 9 BIOTECHNOLOGIE UND MEER MΠΛΕ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ 9-1 Anwendungen der marinen Biotechnologie Aντιβιοτικά π.χ. Ενεργά συστατικά από το κυανοβακτήριο Lyngbya majuscula Αντικαρκινικά π.χ. αντι-λευκαιμικά παρασκευάσματα από το σφουγγάρι της Μεσογείου Ircinia fasciculata Πρόσθετα σε καλλυντικά Π.χ Κολλαγόνο από σφουγγάρια Ιο-στατικά π.χ. φάρμακα εναντίον του έρπητα Πρόσθετα σε τροφές π.χ. β-καροτίνη από το Αυστραλιανό θαλάσσιο φύκος Dunaliella salina Σταθερά βιομηχανικά ένζυμα π.χ από θερμοσταθερά βακτήρια

171 Παραγωγή Φαρμακευτικών Προϊόντων Ένα μεγάλο μέρος των φαρμακευτικών προϊόντων (αντιβιοτικών, στεροειδών, βιταμινών) παράγεται από μικροοργανισμούς ή μέσω ενζυμικά καταλυόμενων διεργασιών. Πολλές ενώσεις που χρησιμοποιούνται στην ανάπτυξη νέων φαρμάκων (αμινοξέα, οπτικώς ενεργά μόρια) παράγονται με βιοτεχνολογικές μεθόδους

172 Εφαρμογές ενζύμων στη βιομηχανία φαρμάκων ΕΝΖΥΜΑ ΔΡΑΣΗ ΦΑΡΜΑΚΑ Ακυλάση της πενικιλλίνης Σύνθεση πενικιλλινικών αντιβιοτικών Αντιβιοτικά Ακυλάση κεφαλοσπορίνης Σύνθεση κεφαλοσπορινών Υδροξυλάσες (Ρ450 μονοξυγονάση) Υδροξυλίωση στεροειδών για την παρασκευή κορτικοστεροειδών Αφυδρογονάση 20β-υδροξυστεροειδών Αφυδρογόνωση στεροειδών Ρεδουκτάση 3-υδροξυ-5- μεθυλογλουταρυλο CoA Αλκοολική αφυδρογονάση Νιτριλάση Οξειδάση γλουταμινικού οξέος ε-αμινοτρανσφεράση L- λυσίνης Διοξυγονάση Αφυδρογονάση διυδροδιόλης Γλυκοαμυλάση Οξειδάσης της γλυκόζης Λακτοϋπεροξειδάση Σύνθεση στατιτών Σύνθεση πρόδρομων ενώσεων για την παρασκευή ΒΜS (αναστολέας ενδοπεπτιδάσης/αce) Σύνθεση αναστολέα αντίστροφης τρανσκριπτάσης και της όξινης πρωτεάσης, ένζυμα που εμπλέκονται στη δράση του ιού ΗΙV Πρόσθετα σε οδοντόπαστες για αντιμικροβιακή δράση Στεροειδή Αδρενοκορτικοειδών ορμονών (κορτιζόλη, κορτιζόνη και παράγωγα αυτών) Φάρμακα κατά της υπερχοληστερολαιμίας Φάρμακα κατά της υπέρτασης Φάρμακα κατά του HIV Προϊόντα υγιεινής στόματος

173

174 Η βιοσύνθεση των αμινοξέων ελέγχεται από ρυθμιστικούς μηχανισμούς, για την αντιμετώπιση των οποίων απαραίτητη είναι η γενετική τροποποίηση στελεχών

175

176

177

178

179 Tα βασικά στάδια στην ανάπτυξη νέων υποψήφιων φαρμάκων

180

181 Aντιβιοτικά Ο τζίρος από την εμπορία των αντιβιοτικών στην παγκόσμια αγορά πλησιάζει τα 10 δις $ ετησίως. Κεφαλοσπορίνες Πενικιλλίνες Μακρολίδια Αμινογλυκοζίδια Τετρακυκλίνες Οι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούνται στη βιομηχανία είναι ακτινομύκητες του γένους Streptomyces και μύκητες του γένους Penicillium.

182

183 Τα αντιβιοτικά είναι τυπικά προϊόντα δευτερογενών μεταβολικών μονοπατιών των μικροοργανισμών.

184 Βιοτεχνολογική παραγωγή αντιβιοτικών Η σύνθεση και η έκκρισή τους από τα φυσικά στελέχη των μικροοργανισμών που τα παράγουν γίνεται σε πολύ μικρά ποσά, τα οποία δεν είναι βιομηχανικά εκμεταλλεύσιμα. Μέσω της γενετικής επιλογής, τροποποιήσεις στις συνθήκες ανάπτυξης των μικροοργανισμών, καθώς και με πρόγραμμα μεταλλάξεων σε επιλεγμένα στελέχη μικροοργανισμών επιτυγχάνεται σημαντική αύξηση της παραγωγής τους.

185 ΣΤΟΧΟΙ Η κλωνοποίηση όλων των γονιδίων που κωδικοποιούν ένζυμα απαραίτητα για τη βιοσύνθεση ενός αντιβιοτικού. Η ανάπτυξη αντιβιοτικών με ισχυρότερη δράση εναντίον ορισμένων μικροβίων και με λιγότερες παρενέργειες. Η κατασκευή γενετικά τροποποιημένων μικροοργανισμών με στόχο τη μεγαλύτερη απόδοση στην παραγωγή αντιβιοτικών.

186 Πενικιλλίνες Δακτύλιος λακτάμης R N H O H H N S CH 3 CH 3 COOH Πλευρική ομάδα (R) Η O Αντιβιοτικό 6-Αμινοπενικιλλινικό οξύ (6-ΑΠΟ) Πενικιλλίνη G Πενικιλλίνη V O Παρεμπόδιση της δημιουργίας πεπτιδικών δεσμών κατά τα τελευταία στάδια της σύνθεσης του κυτταρικού τοιχώματος HO NH 2 O Αμπισιλλίνη Αμοξισιλλίνη NH 2

187 Πενικιλλίνες Οι πρώτες πενικιλλίνες (πενικιλλίνη G & V) ανακαλύφθηκαν από τον Fleming το 1929 (μύκητας Penicillium chrysogenum ) Μέσα από προγράμματα μετάλλαξης δημιουργήθηκαν νέα στελέχη με πολλαπλάσια απόδοση (>400 φορές) Η μικροβιακή παραγωγή αντιβιοτικών πραγματοποιείται σε βιοαντιδραστήρες ημιδιαλείποντος έργου πλήρους ανάδευσης

188 16 14 Νηματοειδείς μύκητες του είδους Penicillium χρησιμοποιούνται για την παραγωγή της πενικιλίνης γλυκόζη βιομάζα πενικιλίνη Η σύνθεση του αντιβιοτικού δεν συνδέεται με την ανάπτυξη του μικροοργανισμού, και για τον λόγο αυτό η διαδικασία που ακολουθείται είναι αρχικά η ανάπτυξη του μικροοργανισμού μέσω μίας διεργασίας διαλείποντος έργου (batch process) και στη συνέχεια η εφαρμογή μίας διεργασίας ημιδιαλείποντος έργου (fed-batch process), η οποία επάγει την παραγωγή του αντιβιοτικού.

189 Τα μαθηματικά μοντέλα σχετικά με την παραγωγή του αντιβιοτικού περιλαμβάνουν διάφορες μεταβλητές δεδομένων (input variables), για παράδειγμα συγκέντρωση υποστρώματος, ph, θερμοκρασία κ.α., οι οποίες συσχετίζονται με διάφορες μεταβλητές εξόδου (βιομάζα, παραγόμενη συγκέντρωση αντιβιοτικού κ.α.) Τα μοντέλα αυτά συμβάλλουν στην κατανόηση της επίδρασης των διαφόρων παραμέτρων (μεταβλητών), στον έλεγχο καθώς και στη βελτιστοποίηση της διεργασίας παραγωγής των αντιβιοτικών.

190 Τα μαθηματικά μοντέλα μπορούν να διακριθούν σε δύο κύριες κατηγορίες, τα δομημένα και τα μη-δομημένα μοντέλα. Τα δομημένα μοντέλα λαμβάνουν υπόψη την επίδραση της φυσιολογίας και διαφοροποίησης των κυττάρων κατά τη διάρκεια της ζύμωσης. Αντίθετα στα μη δομημένα μοντέλα, όλες οι πληροφορίες σχετικά με τη φυσιολογία των κυττάρων αποδίδονται μέσω μίας μοναδικής παραμέτρου, της βιομάζας, με αποτέλεσμα το μοντέλο να απλοποιείται σημαντικά.

191 Παρασκευή τροποποιημένων πενικιλλινών Η πλειοψηφία των αντιβιοτικών υπόκειται σε τροποποίηση της δομής τους τόσο με χημικές, όσο και με ενζυμικές μεθόδους Ενζυμικά καταλυόμενη τροποποίηση της δομής τους H Ν Ο Ο πενικιλλίνη G N - COO ακυλάση της πενικιλλίνης Η 2 Ν Ο Δακτύλιος λακτάμης N 6-ΑPΑ 6-αμινοπενικιλλινικό οξύ - COO + Ο - Ο Φαινυλοξικό οξύ Ημισυνθετικές πενικιλλίνες & κεφαλοσπορίνες

192 R 1 Δακτύλιος λακτάμης N H O H H N S COOH R 2 Κεφαλοσπορίνες Δράση όμοια με αυτή που έχουν οι πενικιλλίνες Πλευρική ομάδα (R 1 ) Πλευρική ομάδα (R 2 ) Αντιβιοτικό HOOC NH O 2 O CH 3 O Η H O CH 3 O CΗ 3 Κεφαλοσπορίνη C 7-Αμινοκεφαλοσπορανικό οξύ (7-ΑCΑ) 7-Αμινοδεσακετοξυκεφαλοσπορανικό οξύ (7-ΑDCΑ) NH 2 O Cl Cefaclor

193 Παραγωγή κεφαλοσπορινών Εναλλακτική λύση στα αλλεργικά συμπτώματα της πενικιλλίνης Η κεφαλοσπορίνη C παράγεται από το μύκητα Acremonium chrysogenum H παραγωγή συνθετικών κεφαλοσπορινών πραγματοποιείται με απομάκρυνση της παράπλευρης αλυσίδας (R 1 ) προς παραγωγή του 7-ACA (Αμινοκεφαλοσπορανικό οξύ) και ενζυμική τροποποίηση του δακτυλίου

194 Αμινογλυκοζίδια Παράγονται από ακτινομύκητες Το πρώτο αντιβιοτικό της κατηγορίας (στρεπτομυκίνη) ενεργό έναντι της φυματίωσης Νέες ενώσεις έχουν παραχθεί με τροποποίηση των φυσικών βιομορίων H 2 N H 3 C HO HO R HO NH O CHO O R' Στρεπτομυκίνη NH O OH O HN OH NH OH R = R' = NH 2 Streptobiosamine R 1 Παρεμπόδιση της σύνθεσης πρωτεϊνών μέσω πρόσδεσης στη ριβοσωμική μονάδα 30S HN H 2 N O R 2 O H O Γενταμυκίνη purpurosam ine H 2 N Gentam icin C 1 Gentam icin C 2 Gentam icin C 1 a HO O O H 3 C NH 2 NH OH C H 3 R 1 = R 2 = CH 3 R 1 = C H 3, R 2 = H R 1 = R 2 = H 2 -deoxystreptam ine garosam ine

195 Τετρακυκλίνες Τετρακυκλίνη HO CH 3 H H 3 C H N CH 3 OH NH 2 Παρεμπόδιση της σύνθεσης πρωτεϊνών κατά την αλληλεπίδραση της ριβοσωμικής μονάδας 30S με το t-rna OH O OH OH O O Παράγονται κυρίως από ακτινομύκητες Ευρύ αντιμικροβιακό φάσμα Βελτίωση στελεχών μέσω εισαγωγής γονιδίων ανθεκτικότητας στις παραγόμενες τετρακυκλίνες

196 Μακρολίδια Κοινό χαρακτηριστικό ο ανθρακικός μακροκυκλικός δακτύλιος Παρεμπόδιση της σύνθεσης πρωτεϊνών μέσω αντιστρεπτής πρόσδεσης στη ριβοσωμική μονάδα 50S 1η Κατηγορία δακτύλιος ατόμων C 2η Κατηγορία δακτύλιος ατόμων C H 3 C OH OH H 3 C CH 3 OH CH 3O O H 3 C O CH 3 O O HO OCH 3 2' H 3 C O N CH 3 CH 3 HO H 3 C H 3 C O CH 3 O OH OH OH OH OH OH O O OH COOH CH 3 Ερυθρομυκίνη O CH 3 CH 3 OH Νυστατίνη O CH 3 OH OH NH 2

197 Παραγωγή στεροειδών Oι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούνται για την τροποποίηση στεροειδών ενώσεων είναι ικανοί να προκαλούν εξειδικευμένες υδροξυλιώσεις, υδρογονώσεις, αφυδρογονώσεις και εποξειδώσεις επί των στεροειδών δακτυλίων, καθώς επίσης και μεταφορές ομάδων από και προς διάφορες πλευρικές θέσεις των στεροειδών δακτυλίων. Τα προϊόντα που παράγονται χρησιμοποιούνται ως έχουν στη φαρμακευτική

198 ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΑ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΟΥΣ Τα νανοσωματίδια, έχουν μέγεθος (οργανικές ή ανόργανες δομές). διάσταση μικρότερη από 100 nm σε Τα νανοσωματίδια είναι συνήθως σφαιρικά, αλλά μερικές φορές χρησιμοποιούνται και άλλα σχήματα, όπως ράβδοι, δίσκοι, κ.ά.

199

200

201 Τμήμα Βιολογικών Εφαρμογών & Τεχνολογιών Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ Περιβαλλοντική Βιοτεχνολογία (Environmental Biotechnology)

202 Bιοαποδόμηση ρύπων, Bιοεκχύλιση μετάλλων, Bιοέλεγχος Bιοαποκατάσταση BIOKAΥΣΙΜΑ ΒΙΟΠΛΑΣΤΙΚΑ

203

204

205

206

207

208

209 Μικροβιακή παραγωγή υδρογόνου Ορισμένοι φωτοσυνθέτοντες μικροοργανισμοί (άλγη), αλλά και βακτήρια όπως Bacillus licheniformis, Clostridium butyricum, κ.ά, παράγουν σημαντικές ποσότητες H 2, χρησιμοποιώντας την ηλιακή ενέργεια ή αναπτυσσόμενα σε βιομηχανικά υποστρώματα υδρογονάσες

210

211 Βιοπλαστικά / βιοπολυμερή Παρά τα σημαντικά πλεονεκτήματα που απορρέουν από τις ιδιότητες των πολυμερών ουσιών (φυσική και χημική αντοχή, ελαστικότητα, πλαστικότητα δηλ. διαμόρφωση σε διάφορα σχήματα) η δυσχέρεια αποικοδόμησής τους έχει οδηγήσει στην αναζήτηση νέων πολυμερών υλών: Φωτοαποικοδομήσιμα πολυμερή (UV ακτινοβολία) Βιοαποικοδομήσιμα πολυμερή

212 ΒΙΟΠΛΑΣΤΙΚΑ

213 Εφαρμογές βιοπολυμερών Υλικά συσκευασίας και αδιάβροχα υλικά επικάλυψης (εγκεκριμένα για επαφή με τρόφιμα) Ιατρικά υλικά που εισέρχονται στο ανθρώπινο σώμα (κάψουλες φαρμάκων, τεχνητά οστά, συνθετικά αιμοφόρα αγγεία, ράμματα, συνδετήρες) Χειρουργικά εργαλεία Βιοαποικοδομήσιμα υλικά ελεγχόμενης απελευθέρωσης λιπασμάτων και φυτοφαρμάκων Βρεφικές πάνες

214 Βιοαποικοδομήσιμα πολυμερή Η έρευνα για την παραγωγή βιοαποικοδομήσιμων πολυμερών έχει εστιαστεί στη μικροβιακή παραγωγή πολυϋδροξυαλκανοϊκών οξέων (PHA) [ R O ] O CH CH 2 C n Μονομερή με μικρό μήκος αλυσίδας (4-5 άτομα C) Μονομερή με μεσαίο μήκος αλυσίδας (6-12 άτομα C) Μονομερή με μεγάλο μήκος αλυσίδας (>12 άτομα C)

215 Ιδιότητες βιοπολυμερών Εξάρτηση από το είδος των μονομερών CH 3 CH 3 O ] O CΗ CH 2 C [ n Βιοαποικοδομησιμότητα Υψηλός βαθμός πολυμερισμού Κρυσταλλικότητα Θερμοπλαστικότητα Μη τοξικότητα Βιοσυμβατότητα Παραγωγή από ανανεώσιμες πηγές [ CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 O ] O CΗ CH 2 C n

216 Γιατί οι μικροοργανισμοί παράγουν βιοπολυμερή; Η βιοσύνθεση των πολυμερών ουσιών : ενεργοποιείται σε συνθήκες περιορισμένης διαθεσιμότητας θρεπτικών στοιχείων όπως N, P, S, Ο, αλλά σε περίσσεια πηγής C ( Τροφικό stress) πραγματοποιείται με στόχο την αποθήκευση ενέργειας και άνθρακα

217 Το πολυμερές μετά την παραγωγή του εγκλωβίζεται στο εσωκυτταρικό συσσωματωμάτων, που περιβάλλονται από μεμβράνη λιπιδικής και πρωτεϊνικής φύσης και περιέχουν μεγάλες ποσότητες μορίων του βιοπολυμερούς (μέχρι 80% του ξηρού βάρους των κυττάρων)

218 Πηγή άνθρακα: Λιπαρά οξέα, αλκένια, σάκχαρα, Η σύνθεση αρχίζει με τη μετατροπή τους σε ακυλ-συνένζυμο Α και την εισαγωγή στον κύκλο της β-οξείδωσης

219 Λιπαρά οξέα, αλκένια, σάκχαρα

220 Βιοδιάσπαση σε ένα συγκεκριμένο περιβάλλον για ένα πλαστικό σημαίνει πως το πλαστικό αυτό μπορεί να αποτελέσει υπόστρωμα μεταβολισμού για μικροοργανισμούς που ζουν στο περιβάλλον αυτό.

221 Αποδόμηση βιοπολυμερούς 1) Ενδοκυττάρια αποδόμηση (βακτηριακές αποπολυμεράσες) χρησιμοποίηση πολυμερούς ως πηγή άνθρακα 2) Εξωκυττάρια αποδόμηση (εξωκυττάριες αποπολυμεράσες που εκκρίνουν πολλοί ευκαρυωτικοί και προκαρυωτικοί οργανισμοί σε αερόβιο περιβάλλον) Τα ένζυμα μπορεί να είναι είτε ενδοένζυμα, που σπάζουν εσωτερικούς δεσμούς μέσα στην αλυσίδα, είτε εξωένζυμα που διασπούν τις τελικές μονάδες των μονομερών διαδοχικά.

222 Άλλα μεταβολικά προϊόντα Παραγωγή εξωκυτταρικών ενζύμων Τα ένζυμα διασπούν τις αλυσίδες των πολυμερών Εξωκυτταρικά ένζυμα Προϊόντα διάσπασης Παράγωγα που αφομοιώνονται από τα κύτταρα Παράγωγα που δεν διαλυτοποιούνται στο μέσο ανάπτυξης Υδατοδιαλυτά παράγωγα Πλαστικά

223

224 Η ανθρωπογενής δραστηριότητα επιβαρύνει το περιβάλλον και την ατμόσφαιρα (αέρια CO 2, SO 2, ΝΟ x, χημικοί & βιολογικοί ρύποι, μη-βιοδιασπώμενα υλικά, τοξικές ενώσεις, υγρά και στερεά απόβλητα

225 Στερεά απόβλητα Τα αστικά (οικιακά) απορρίμματα στην Ελλάδα Υλικό Ποσοστό (%) Χαρτί 20.0 Μέταλλα 4.5 Γυαλί 4.5 Πλαστικό 8.5 Ύφασμα, Ξύλο, Δέρμα 5.0 Αδρανή 3.0 Ζυμώσιμα 49.0 Λοιπά 5.5

226 Μονάδες βιολογικού καθαρισμού

227 ΒΙΟΑΠΟΔΟΜΗΣΗ ΥΓΡΩΝ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ Ο απαιτούμενος βαθμός επεξεργασίας εξαρτάται από τον τελικό αποδέκτη του επεξεργασμένου αποβλήτου (λίμνη, ποτάμι, έδαφος, θάλασσα, αποχετευτικό δίκτυο) και τα αντίστοιχα αποδεκτά όρια για τελική διάθεση

228 Bιολογικός καθαρισμός-πρωτογενής επεξεργασία Απομάκρυνση στερεών υλικών (πέτρες, χαλίκια, άμμος και άλλα μεγάλα σωματίδια) Πρωτοβάθμια επεξεργασία (καθίζηση): καταβύθιση υπόλοιπων σωματιδίων σε ένα λασποειδές ίζημα που ονομάζεται ενεργός ιλύς Απομάκρυνση 30-40% των ρύπων

229 Δευτερογενής επεξεργασία (βιολογική) Βιολογική επεξεργασία: είσοδος του νερού σε αεριζόμενες δεξαμενές όπου αερόβια βακτήρια αποδομούν την οργανική ύλη Αναερόβια χώνευση: μεταφορά ενεργού ιλύος σε βιοαντιδραστήρα όπου αναερόβια βακτήρια αποδομούν την οργανική ύλη Χλωρίωση: απομάκρυνση μικροοργανισμών (εναλλακτικά με όζον) Απομάκρυνση 90% των ρύπων Δεν απομακρύνονται τα βαριά μέταλλα και κάποιοι οργανικοί ρύποι

230 Αερόβια βιολογική επεξεργασία Με κατάλληλη ρύθμιση του ph και προσθήκη απαιτούμενων θρεπτικών, επιτυγχάνεται η δημιουργία πληθυσμού μικροοργανισμών που θα διασπούν το οργανικό φορτίο των αποβλήτων. Τα βιοαποδομήσιμα οργανικά μετατρέπονται σε συστατικά, που καθιζάνουν ή μετατρέπονται σε αέρια προϊόντα. Συμπληρωματικά, μπορεί να απομακρυνθούν και μέταλλα (Fe, Mg, κ.ά.)

231 β) Αναερόβια βιολογική επεξεργασία Βασίζεται στην παρουσία μικροοργανισμών, οι οποίοι αναπτύσσονται απουσία οξυγόνου μετατρέποντας το οργανικό φορτίο κυρίως σε CH 4, CO 2 και άλλα προϊόντα μεταβολισμού. Oι αναερόβιες επεξεργασίες είναι κατάλληλες για την επεξεργασία αποβλήτων που έχουν υψηλό ρυπαντικό φορτίο.

232 Βιοαποικοδόμηση επικίνδυνων αποβλήτων Επικίνδυνο είναι τα απόβλητο που περιέχει μια τουλάχιστον ουσία που χαρακτηρίζεται ως επικίνδυνη ή είναι εύφλεκτο, διαβρωτικό ή τοξικό υλικό Οι πιο κοινές ουσίες που απαντώνται σε επικίνδυνα απόβλητα είναι: Μέταλλα και ενώσεις μετάλλων Ετεροκυκλικές οργανικές ενώσεις Υδρογονάνθρακες και παράγωγά τους Αλογονωμένες οργανικές ενώσεις Η βιοαποδόμηση των επικίνδυνων αποβλήτων πραγματοποιείται συνήθως σε αναερόβιες συνθήκες

233 Βιοαποκατάσταση μολυσμένων περιοχών Αξιοποίηση βιολογικών συστημάτων (συνήθως μικροοργανισμών) για την αποδόμηση ή τη μείωση της τοξικότητας των ρύπων μιας μολυσμένης περιοχής Συνήθεις τοξικές ουσίες: αργό πετρέλαιο ή κλάσματά του, οργανικοί διαλύτες, πολυαρωματικοί υδρογονάνθρακες PAHs χλωριωμένες-αρωματικές ενώσεις (PCB) Παραδείγματα εφαρμογής βιοαποκατάστασης: Αλάσκα - Δεξαμενόπλοιο Exxon Valdez (1989) Περσικός κόλπος - Πόλεμος (1991)

234 Βιοκοινότητες θαλάσσιων βακτηρίων, όμοιων με τα μικρόβια του εδάφους που αποικοδομούν τη βενζίνη, μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον καθαρισμό των πετρελαιοκηλίδων από τους ωκεανούς.

235 Ανάκτηση μετάλλων με τη βοήθεια μικροοργανισμών H ανάκτηση μετάλλων από υδατικά διαλύματα με τη χρήση μικροοργανισμών ονομάζεται βιορόφηση (biosorption). Βιοσυσσώρευση: ενεργή δέσμευση μετάλλων μέσω μεταβολισμού κυττάρων Βιοπροσρόφηση: παθητική δέσμευση μετάλλων μέσω φυσικοχημικών δράσεων (φύκη, βακτήρια, ζύμες, μύκητες)

236 ΧΡΗΣΗ ΤΗΣ ΒΙΟΜΑΖΑΣ ΜΙΚΡΟΦΥΚΩΝ ΣΤΗΝ ΑΠΟΜΑΚΡΥΝΣΗ ΜΕΤΑΛΛΩΝ

237