Tαυτοποίηση ελαιολάδου σε εµπλουτισµένη ζωοτροφή µε µοριακές τεχνικές

Transcript

1 Tαυτοποίηση ελαιολάδου σε εµπλουτισµένη ζωοτροφή µε µοριακές τεχνικές Γιώργος Περράκης, Μ.Πολίτης,.Κίζης Γιώργος Σειραγάκης, Χηµικός Μ.Sc

2 Το Food Allergen Laboratory Ιδρύθηκε από τους Α. Βαρλάµο & Γ. Σειραγάκη στο ΡΕΘΥΜΝΟ τον Αύγουστο του 2005 και εκτελεί αναλύσεις για ασφάλεια τροφίµων όπως :food allergens, GMOs, PAHs, metals, Contaminants and mycotoxins analysis. Εγκαταστάσεις σε ΑΘΗΝΑ, ΚΡΗΤΗ και ΚΥΠΡΟ είγµατα έρχονται από όλα τα µέρη της Ελλάδος και 6 χώρες του εξωτερικού µε Courier και τα αποτελέσµατα στέλνονται άµεσα µέσω ιαδικτύου. Food Allergen Laboratory is certified against ISO ISO17025 for olive oil (2/7 scopes), wines, cereals, packed foods, feed and for Genetically Modified Organisms.

3 3o Πανελλήνιο Συνέδριο Bιοτεχνολογία &Τεχνολογία Τροφίµων Ρέθυµνο Οκτωβρίου Πρόεδρος Οργανωτικής Επιτροπής Γ.Σειραγάκης Ένωση Ελλήνων Χηµικών Πανελλήνιος Σύλλογος Χηµικών Μηχανικών

4 To µόνοιδιωτικόανεξάρτητοεργαστήριο στην Ελλάδα ιαπιστευµένο για την ανάλυση των Πολυκυκλικών Αρωµατικών Υδρογονανθράκων σε λίπη-έλαια, Ποσοτικό προσδιορισµό αλλεργιογόνων Εκτελεί δοκιµές προσδιορισµού νοθείας στο ελαιόλαδο µε φουντουκέλαιο χρησιµοποιώντας ανοσοχηµικές και Μοριακής Βιολογίας Τεχνικές Ήταν ένα από τα τρία εργαστήρια στην Ελλάδα µετη µεγαλύτερη συγκέντρωση δειγµάτων ηλιελαίου για ανίχνευση ορυκτελαίων.

5 Οικονοµικά Αναπτυξιακά Στοιχεία Ετος Προσωπικό Μονάδες Κύκλος Κέρδη εργ σε χιλ ευρώ (2009) 11(13)

6 FOOD ALLERGENS LAB ΤΕΑΜ Α. Βαρλάµος CHEMICAL ENGINEER M.Sc Γ. Σειραγάκης FOOD CΗΕMIST M.Sc Ε. Πολίτης Μolecular Biologist M.Sc Α. Πουρίκκου Τεχνολόγος Τροφίµων ΤΕΙ ΑΘΗΝΑΣ. Κίζης Γεωπόνος, Ph.D Βιολογία,ΤΕΙ ΑΘΗΝΑΣ Γ. Περράκης, Γεωπόνος Τεχν. τροφίµων M.Sc Σ. Τσαγράκη Food Technologist ΤΕΙ ΑΘΗΝΑΣ M. Μαργαρίτη Chemist, Ph.D Ε. Χριστοφάκης Chemist, Biotechnologist M.Sc Γ. Πραγουδάκης Φυσικός Γ. ηµάκου Chemist M.Sc M.Kαπότη Γεωπόνος Τεχν. τροφίµων Κ. Σειραγάκη Επικοινωνιολόγος

7 H επιστηµονική οµαδα του εργαστηρίου έχει πάνω από 30 δηµοσιεύσεις τα τελευταία 3 χρόνια σε Ελληνικά και ιεθνή επιστηµονικά περιοδικά ( JAOCS, Food Agricultural, BIO, Aceites y Grassas, FoodTechnology, Τρόφιµα & Ποτά, ΕΛΑΙΟΚΟΣΜΟΣ, AllPack, Ξηρός Καρπός, XHMIKA XΡONIKA, κα) Συµµετείχε µε εργασίες στα κάτωθι Συνέδρια την Τελευταία Τριετία ΑOCS (Istanbul 2006), AOAC (Limassol 2006), Greek Lipid Forum (Athens 2007), Food Biotech Congress (Athens 2007), Wellnes International Congress (Kuala Lubur 2008), WSPA Mediteranean Poultry Congress (Chalkidiki 2008) 3ο Greek Food Lipid Forum (Ιουνιος 2009 ΑΘΗΝΑ) 10ο Ελλαδας-Κύπρου Συνέδριο Χηµειας (Ιουλιος 2009 ΗΡΑΚΛΕΙΟ) 3ο Πανελλήνιο Συνέδριο Βιοτεχνολογίας Τροφίµων ( Οκτώβριος 2009 ΡΕΘΥΜΝΟ) 3ο Πανελλήνιο Συνέδριο Μετρολογίας ( Φεβρουάριος 2010 ΛΑΡΝΑΚΑ)

8 ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΑ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΑ ΠΑΒΕΤ-ΝΕ Οκτ.2005 Αλλεργιογόνα ΕΚΠΑ Transition GSL Cyprus ιακρατικό Ελλάδας- Κυπρου ιακρατικό Ελλάδας- Κυπρου Mαρ.2006 Μαρ.2007 Απρ.2007 Αναβάθµιση Υπηρεσιών Αλλεργιογόνο Σησάµι Ψωµί απόχαρούπι ελεύθερο γλουτένης Αρχιµήδης Mαρ 2008 Βιταµίνες, ιχνοστοιχεία σε Ελληνικά & Πορτογαλικά τυριά Koυπόνια Καινοτοµίας Mαρ 2009 Πολυφαινόλες κ Λιποδιαλυτές Βιταµίνες σε ελαια ΕΤΑΤ, CyproNetwork ΜΑΙΧ, GSL Cyprus ΕΘΙΑΓΕ, ΛΟΥΛΗΣ,Υγ.Υ π/σιες ΤΕΙ Αθήνας, ΓΠΑ, Catholica Portugal Γεωπονικό Πανεπιστήµιο Αθηνών,

9 ΠΙΝΑΚΑΣ ΑΝΑΛΥΣΕΩΝ 2008 ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ Α ΤΡΙΜΗΝΟ Β ΤΡΙΜΗΝΟ Γ ΤΡΙΜΗΝΟ ΤΡΙΜΗΝΟ ΦΥΤΟΦΑΡΜΑΚΑ ΜΥΚΟΤΟΞΙΝΕΣ ΜΕΤΑΛΛΑ PAH ΣΕΤ ΕΛΑΙΟΛΑ ΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΑ ΦΘΑΛΙΚΟΙ ΙΟΞΙΝΕΣ ΣΤΕΡΟΛΕΣ ΑΓΕΛ. ΚΑΖΕΙΝΗ ΑΛΛΕΡΓΙΟΓΟΝΑ ΙΣΤΑΜΙΝΕΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΙΑΦΟΡΑ MINERALS- ΟΡΥΚΤΕΛΑΙΑ ΛΙΠΑΡΑ ΟΞΕΑ

10 Ελαιοπουλάκι: Κοτόπουλο που τρέφεται µεσογειακά µε αγνό ελαιόλαδο και αντιοξειδωτικό σελήνιο. Ένας πρωτοποριακός συνδυασµός γεύσεων για ακόµη πιο υγιεινή διατροφή. Ας γνωρίσουµε το Ελαιοπουλάκι: Το Ελαιοπουλάκι είναι ένα υγιεινό κοτόπουλο που τρέφεται µε δηµητριακά, αγνό ελαιόλαδο και οργανικό αντιοξειδωτικό σελήνιο. Το αποτέλεσµα στο πιάτο µας είναι ένα κοτόπουλο πιο τρυφερό, πιο νόστιµο και ασφαλώς πιο υγιεινό χάρις στις ευεργετικές ιδιότητες τόσο του ελαιόλαδου όσο και του σεληνίου.

11 Με τι ακριβώς τρέφεται το ελαιοπουλάκι; Το Ελαιοπουλάκι τρώει 100% φυτικές τροφές, µη µεταλλαγµένες όπως: στάρι, καλαµπόκι, σόγια, ελαιόλαδο, σογιέλαιο, φοινικέλαιο, βιταµίνες και ιχνοστοιχεία. Η τροφή του εµπλουτίζεται µε το αντιοξειδωτικό σελήνιο.

12 Πως πιστοποιείται ο εµπλουτισµός των ζωοτροφών µε ελαιόλαδο; Προφίλ λιπαρών οξέων ή στερολών µε GC-FLD Αgilent 5820,6820? Όχι βέβαια

13 Αξιόπιστη λύση, οι µοριακές τεχνικές ( Real Time -PCR)

14 Στην Κρήτη λέµε : «Ο ΘΕΟΣ& Ο ΓΕΙΤΟΝΑΣ» 6886 J. Agric. Food Chem. 2008, 56, Exploitation of the Chloroplast trnl (UAA) Intron Polymorphisms for the Authentication of Plant Oils by Means of a Lab-on-a-Chip Capillary Electrophoresis System STELIOS SPANIOLAS, CHRISTOS BAZAKOS, MURAD AWAD, AND PANAGIOTIS KALAITZIS* Department of Horticultural Genetics and Biotechnology, Mediterranean Agronomic Institute of Chania (MAICh), Alsyllio Agrokepiou, P.O. Box 85, Chania 73100, Crete, Greece

15 Στο ΜΑΙΧ µας είπαν ότι η αποµόνωση DNA ελιάς από ελαιόλαδο είναι πολύ δύσκολη, δεν δίνει σταθερά αποτελέσµατα και θέλει επιµονή και υποµονή. Πολλές φορές επίσης µπορεί να υπάρξει παρεµπόδιση της PCR απόάλλεςουσίεςπουυπάρχουνστολάδι. Τέλος, η ταυτοποίηση ελαιολάδου µε αυτήτηνµέθοδο, είναι πολύ δύσκολη, χωρίς τη χρήση επιπλέον αναλυτικού εξοπλισµού (capillary electrophoresis system όπως η lab-on-a-chip technology, που διαθέτει το ΜΑΙΧ) διότι τα προϊόντα της PCR έχουν µικρές διαφορές στο µέγεθος για κάθε φυτό (στο paper του 2008 έχει ένα πίνακα µε διάφοραµεγέθη προϊόντων ανάλογα το φυτικό είδος), οπότε είναι δύσκολο να διακριθούν τόσο λεπτές διαφορές µε gel.

16 Για να πάρουµε ίζηµα (το οποίο ενδέχεται να περιέχει DNA ή και κύτταρα ελιάς) από τη λιπαρή φάση, φυγοκεντρούµε για10 λεπτά στα rpm (µέγιστη ταχύτητα) tubes των 2 ml που έχουµε γεµίσει µε λάδι. Συνολικά για να έχουµε επαρκή ποσότητα pellet για την αποµόνωση DNA πρέπει να φυγοκεντριθούν διαδοχικά συνολικά 50 ml λαδιού. Στο τέλος επαναδιαλύουµε και ενοποιούµε όλαταpellets

17 Για ποιο σίγουρα αποτελέσµατα, η εξαγωγή DNA γίνεται µε 2 kits. Για την r-biopharm το πρωτόκολλο είναι ένα, για την qiagen χρησιµοποιήσαµε ανάλογο πρωτόκολλο

18 PCR PROTOCOL FOR PLANT OILS REAGENT VOLUME (µl) Buffer 5 MgCl 2 5 dntps 1 Primer Plant A1 1,5 Primer Plant A2 1,5 DNA Polymerase 0,25 (AmpliTaq), [or 0,50 (Taq)] DNA 5 H 2 O 30,75

19 Primers A1: CGAAATCGGTAGACGCTACG A2: GGGGATAGAGGGACTTGAAC PCR program: 95 o C for 10 min 95 o C for 30 sec 50 o C for 30 sec 40 cycles 72 o C for 1 min 72 o C fro 10 min 4 o C constantly Η οπτικοποίηση γίνεται σε πυκνό (περίπου 4%), ενιαίο gel αγαρόζης για καλύτερο διαχωρισµό µπαντών. (περίπου 90 min για 1.5 µε 2h στα 120 volt).

20 Positive control 100% ελαιόλαδο 20% ελαιόλαδο 10% ελαιόλαδο 5% ελαιόλαδο 1% ελαιόλαδο Ladder Φύραµα 1 µε 20% ελαιόλαδο Φύραµα 1 µε 10% ελαιόλαδο Inhibition control για 100% ελαιόλαδο Inhibition control για Φύραµα 1 µε 20% ελαιόλαδο DNA extraction blank Amplification blank

21

22 Τι πετύχαµε Βελτιώσαµε τις εκχυλίσεις αφού χρησιµοποιήθηκαν δύο εµπορικά kits για την εξαγωγή του DNA, και µάλιστα χρησιµοποιήθηκαν όλοι οι δυνατοί συνδυασµοί: δείγµατα ζωοτροφών (ως είχαν), λιπαρή φάση των ζωοτροφών µετά από Soxhlet, άλλα δείγµατα που είχαµε εµείς επίτηδες εµπλουτίσει µε 1% ελαιόλαδο καθώς και σκέτο ελαιόλαδο

23 Συµπέρασµα εν µπορέσαµε µε την υπάρχουσα υποδοµή να ταυτοποιήσουµε ελαιόλαδο στην εµπλουτισµένηζωοτροφήπάρα µόνο σε ποσοστό πάνω από 20%. Μήπως όµως ζωοτροφή µε ποσοστό γύρω στο 1% δεν είναι εµπλουτισµένη αλλά απλά Βαπτισµένη?