ΕΡΓΑΣΙΑ 3 η. Θέμα 1. Α. Αντιστοιχίσεις. α 2. β 1, 3, 5. γ 2, 4. δ 2. ε 2, 4

Transcript

1 ΕΡΓΑΣΙΑ 3 η Θέμα 1 Α. Να γίνει αντιστοίχιση. α. Χρονικά διαχωριζόμενος φθορισμός 1. Διμερή εκκινητών β. Ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο 2. Ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεϊνών γ. Νεφελομετρία 3. Taqman δ. IRMA 4. Σκέδαση φωτός ε. ELISA 5. Tm Β. Να αναλυθούν οι έννοιες ώστε να αιτιολογούνται οι παραπάνω αντιστοιχίσεις. Α. Αντιστοιχίσεις α 2 β 1, 3, 5 γ 2, 4 δ 2 ε 2, 4 Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 1

2 Β. Ανάλυση τεχνικών Χρονικά διαχωριζόμενος φθορισμός Φθορισμός (fluorescence): Αποδιέγερση μορίου (σπανιότερα ιόντος) με εκπομπή φωτονίου 10 8 έως 10 4 s μετά την απορρόφηση ενός άλλου φωτονίου, ως αποτέλεσμα μετάπτωσης μεταξύ καταστάσεων της ίδιας πολλαπλότητας spin (η διάρκεια του φθορισμού κυμαίνεται συνήθως από 1-10 nsec). Τα μήκη κύματος της ακτινοβολίας που εκπέμπεται από μια φθορίζουσα ουσία είναι πάντοτε μεγαλύτερα από τα μήκη κύματος της διεγείρουσας ακτινοβολίας. Χρονικά διαχωριζόμενος φθορισμός (time resolved fluorescence TRF): Τεχνική βασιζόμενη στο ότι ορισμένες ουσίες, κυρίως σύμπλοκα λανθανιδών, διατηρούν τον φθορισμό τους για χρονικό διάστημα πολύ μεγαλύτερο των 100 μs μετά τη διέγερση, γεγονός που επιτρέπει τον ευαίσθητο προσδιορισμό τους παρουσία άλλων φθοριζουσών ουσιών, των οποίων η διάρκεια φθορισμού είναι κατά πολύ συντομότερη. Το φαινόμενο αξιοποιείται σε ανοσοπροσδιορισμούς μεγάλης ευαισθησίας. Η τεχνική δίνει περισσότερες πληροφορίες για το μοριακό περιβάλλον της φθορίζουσας ουσίας σε σχέση με άλλες τεχνικές φθορισμού. Το όργανο μέτρησης του χρονικά διαχωριζόμενου φθορισμού είναι το ίδιο με τα άλλα φθορισμόμετρα. Μια ακτίνα διέγερσης με στενό μήκος κύματος κατευθύνεται στο δείγμα και προκαλεί τη διέγερση του. Η εκπομπή φθορισμού του δείγματος συλλέγεται σε γωνία 90º σε σχέση με τη διέγερση, για να αποτρέπεται η παρεμβολή της ακτινοβολίας διέγερσης με την ανίχνευση ασθενούς φθορισμού εκπομπής. Ο φθορισμός που εκπέμπεται από το δείγμα αναλύεται σε ένα φασματογράφο. Η βασική διαφορά στη φασματοσκοπία χρονικού διαχωρισμού είναι η αντικατάσταση της συνεχούς ακτινοβολίας με παλμική και στην ανίχνευση του εκπεμπόμενου φθορισμού. (Εικόνα 1) [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8] Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 2

3 Εικόνα 1: Σχηματική παρουσίαση φθορισμόμετρου. Η διέγερση προκαλείται με παλμική ακτινοβολία στα 532 nm και ο φθορισμός ανιχνεύεται στις 90 μοίρες. MASSACHUSETTS INSTITUTE of TECHNOLOGY Department of Chemistry. Ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο Η τεχνική του PCR (Polymerase Chain Reaction, αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης), επινοήθηκε από τον Kary Mullis στα μέσα της δεκαετίας του 1980 και έφερε επανάσταση στη μοριακή γενετική. Στη PCR χρησιμοποιείται μια DNA πολυμεράση για τη σύνθεση μεγάλου αριθμού αντιγράφων μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA που βρίσκεται ανάμεσα σε δύο εκκινητές (primers). Η DNA πολυμεράση χρησιμοποιεί μονόκλωνο DNA ως καλούπι για τη σύνθεση του συμπληρωματικού κλώνου. Η αποδιάταξη του DNA (βήμα 1) επιτυγχάνεται με την υψηλή θερμοκρασία στους 94 ο C. Η DNA πολυμεράση απαιτεί ένα πρωταρχικό τμήμα το οποίο μπορεί και επιμηκύνει, γιαυτό προστίθενται δύο ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές σε θερμοκρασίες 30 ο -65 ο C (βήμα 2). Οι εκκινητές επιλέγονται έτσι ώστε να υβριδοποιούν εκατέρωθεν την αλληλουχία στόχο. Στη συνέχεια η DNA πολυμεράση επιμηκύνει τους εκκινητές σε θερμοκρασίες 65 ο -75 ο C (βήμα 3). Η DNA πολυμεράση προέρχεται από το βακτήριο Thermus aquaticus το οποίο ζει σε θερμοκρασία 75 ο C, η βέλτιστη θερμοκρασία είναι οι 72 ο C, ενώ είναι σταθερή και στους 94 ο C. [9, 10] (εικόνες 2, 3, 4, 5) Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 3

4 Εικόνα 2: Ο κύκλος της PCR. Το δείγμα αποδιατάσσεται αρχικά και το μείγμα της αντίδρασης διέρχεται από επανειλημμένους κύκλους υβριδοποίησης εκκινητών, σύνθεσης DNA και αποδιάταξης. Σε κάθε κύκλο PCR διπλασιάζεται η αλληλουχία στόχος. Εικόνα 3: Αριθμός δίκλωνων μορίων στόχων. (στον 3 Ο κύκλο θα έχουμε 2 επιθυμητά μόρια DNA) Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 4

5 Εικόνα 4: Λειτουργία PCR (παρουσιάζονται πέντε κύκλοι). Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 5

6 Εικόνα 5: Μηχανισμός PCR. [11] Οι εκκινητές μήκους νουκλεοτίδια παρουσιάζουν μεγάλη εξειδίκευση. Οι εκκινητές πρέπει να έχουν παραπλήσιες Tm (melting temperature), ώστε να υβριδοποιούνται ικανοποιητικά και οι δύο στην ίδια θερμοκρασία. Tm: θερμοκρασία τήξης είναι αυτή στην οποία τα μισά μόρια του εκκινητή ζευγαρώνουν με την αλληλουχία στόχο, ενώ τα άλλα μισά παραμένουν ελεύθερα. Σε υψηλότερες θερμοκρασίες το ποσοστό των μορίων του εκκινητή που υβριδοποιούνται μειώνεται και ενδέχεται να αποτύχει ο πολλαπλασιασμός του επιθυμητού τμήματος. Σε χαμηλότερες θερμοκρασίες ο εκκινητής συνδέεται και σε μη επιθυμητές αλληλουχίες και πιθανόν να προκύψουν και παραπροϊόντα. Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 6

7 Σχεδίαση εκκινητών Α) οι αλληλουχίες των εκκινητών δεν πρέπει να είναι συμπληρωματικές μεταξύ τους, ιδιαίτερα το 3 άκρο δεν πρέπει να είναι συμπληρωματικό με περισσότερες από 3-4 βάσεις σε οποιαδήποτε περιοχή του άλλου εκκινητή (ή ακόμα και του ίδιου εκκινητή). Β) Η GC-περιεκτικότητα πρέπει να είναι μεταξύ 40-60%. Γ) Να αποφεύγονται οι επαναλήψεις νουκλεοτιδίων. Δ) Η υπολογισμένη Tm και για τους δύο χρησιμοποιούμενους εκκινητές στην αντίδραση δεν πρέπει να διαφέρει περισσότερο από 5 C, και η Tm από το προϊόν ενίσχυσης δεν πρέπει να διαφέρει από τους primers περισσότερο από 10 C. Ε) Θερμοκρασία επαναδιάταξης συνήθως είναι 5 C κάτω από την υπολογισμένη χαμηλότερη Tm. Η κλασική PCR αποτελεί μια ευαίσθητη και γρήγορη μέθοδο πολλαπλασιασμού των νουκλεϊκών οξέων, αλλά απαιτεί ηλεκτροφορητική ανάλυση μετά την αντίδραση και δεν είναι ποσοτική (εκτός από την χρήση ανταγωνιστικής ή άλλης μεθόδου). [12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20] Η PCR πραγματικού χρόνου (Real Time / Q PCR) βασίζεται στην ανίχνευση και ποσοτικοποίηση ενός φθορίζοντος μορίου αναφοράς (ειδικού ή μη για συγκεκριμένη αλληλουχία) σε κάθε κύκλο της αντίδρασης PCR. Δεν απαιτείται ανάλυση με ηλεκτροφόρηση. Η πρώτη σημαντική αύξηση στην ποσότητα του προϊόντος της PCR σχετίζεται με την αρχική ποσότητα της μήτρας (ποσοτικοποίηση). Επιτρέπει την αδιάλειπτη παρακολούθηση των προϊόντων της PCR κατά την ενίσχυση μέσω της μέτρησης του εκπεμπόμενου φθορισμού των προϊόντων σε κάθε κύκλο (σε πραγματικό χρόνο). Δεν απαιτείται καμία πειραματική διαδικασία μετά την αντίδραση. Τα προϊόντα του πολλαπλασιασμού αναλύονται σε πραγματικό χρόνο όπως συντίθενται σε κάθε κύκλο. Απόλυτη ποσοτικοποίηση σύμφωνα είτε με ένα εσωτερικό μάρτυρα που πολλαπλασιάζεται μαζί με το στόχο, ή μέσω της χρήσης μιας πρότυπης καμπύλης που σχεδιάζεται μέσω παράλληλου πολλαπλασιασμού μιας σειράς γνωστών συγκεντρώσεων μιας αλληλουχίας αναφοράς. (εικόνα 6) Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 7

8 1. Ιχνηθέτες υδρόλυσης (TaqMan, Beacons,) 2. Ιχνηθέτες υβριδοποίησης FRET (HybProbes, Simple Probes) 3. Φθορίζουσες χρωστικές που δεσμεύονται σε δίκλωνο (ds) DNA (SYBR Green, Eva Green, LC Green). (εικόνες 7,8) Εικόνα 6: Στοιχεία τεχνικής Real time PCR. Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 8

9 Εικόνα 7: Μέθοδοι ανίχνευσης φθορισμού στη PCR πραγματικού χρόνου. Πλεονεκτήματα Real-time PCR 1. Δεν επηρεάζεται από ενίσχυση μη ειδικών προϊόντων 2. Η ενίσχυση παρακολουθείται συνεχώς σε κάθε κύκλο 3. Δεν υφίσταται καμία διαδικασία μετά το τέλος της αντίδρασης, (χαμηλός κίνδυνος επιμολύνσεων) 4. Πιο σύντομοι κύκλοι (30 λεπτά έως 2 ώρες) 5. Μέτρηση δειγμάτων με μεγάλες διαφορές αρχικού νουκλεϊκού φορτίου 6. Στις περιπτώσεις RTReal time PCR απαιτούνται 1000 φορές λιγότερα μόρια αρχικού RNA 7. Αυξημένη ειδικότητα, ευαισθησία και επαναληψιμότητα 8. Μικρή αύξηση του κόστους σε σχέση με την συμβατική PCR (εκτός του εξοπλισμού) 1. Απαιτεί εξειδικευμένο προσωπικό 2. Υψηλό κόστος εξοπλισμού Μειονεκτήματα Real-time PCR Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 9

10 Εικόνα 8: PCR πραγματικού χρόνου με τη χρήση μοριακού φάρου. [21, 22, 23] Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 10

11 Η τεχνολογία ιχνηθετών τύπου Taqman Χρησιμοποιούνται ειδικά ολιγονουκλεοτίδια ιχνηθέτες σημασμένα με ένα φθορίζον μόριο αναφοράς και ένα μόριο που απορροφά το φθορισμό που εκπέμπει το μόριο αναφοράς (quencher). Κατά την PCR οι συνθήκες ευνοούν την υβριδοποίηση του ιχνηθέτη με την αλληλουχία-στόχο πριν από τους εκκινητές και την έναρξη του πολυμερισμού από την πολυμεράσηtaq. Κατά τον πολυμερισμό η 5'-3' εξωνουκλεολυτική ενεργότητα της πολυμεράσης Taq αποικοδομεί τον ιχνηθέτη και έτσι η χρωστική αναφοράς απελευθερώνεται από τον ιχνηθέτη και ανιχνεύεται. Η ένταση του σήματος στο τέλος κάθε κύκλου εξαρτάται από την συγκέντρωση του παραγόμενου προϊόντος. (εικόνες 9, 10, 11) πλεονεκτήματα Η ενίσχυση (πολλαπλασιασμός) μελετάται σε πραγματικό χρόνο. Δεν απαιτούνται χειρισμοί μετά την PCR ->δυνατότητα χειρισμού πολλών δειγμάτων, μικρή πιθανότητα επιμόλυνσης. Δυνατότητα μεγάλης ταχύτητας (ακόμη και 25 λεπτά). Απαίτηση για μικρές ποσότητες μήτρας ως 1000 φορές λιγότερο σε σχέση με τις κλασικές μεθόδους (ελάχιστο 6 picogram = ισοδύναμο ενός διπλοειδούς γονιδιώματος). Η ανάλυση με την καμπύλη τήξης επιβεβαιώνει την ειδικότητα. Πιο ειδικά, πιο ευαίσθητα και επαναλήψιμα αποτελέσματα. Λίγο μόνο πιο ακριβή από τη συμβατική PCR (εκτός από το κόστος εξοπλισμού). Εφαρμογές της Q-PCR γονιδιακή έκφραση - μελέτη του προτύπου γονιδιακής έκφρασης (mrna profiling) Έλεγχος μεταλλάξεων Ανάλυση με καμπύλη τήξης, SNPs, Γονοτύπηση μελέτη του προτύπου έκφρασης μορίων mirna Μελέτη προτύπων μεθυλίωσης (επιγενετική) [24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40] Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 11

12 Εικόνα 9: Ιχνηθέτης Taqman. Ο πράσινος κύκλος είναι το φθορίζον μόριο αναφοράς και ο κόκκινος ένα μόριο που απορροφά το φθορισμό που εκπέμπει το μόριο αναφοράς (quencher). Image created by Dan Pierce. Εικόνα 10: Ο ιχνηθέτης TaqMan συνδέεται στην αλληλουχία στόχο καθώς και οι εκκινητές. Η Taq polymerase επιμηκύνει τους εκκινητές. Image created by Dan Pierce. Εικόνα 11: Η χρωστική αναφοράς απελευθερώνεται καθώς η Taq polymerase επιμηκύνει τους εκκινητές. Μακριά από τη χρωστική απόσβεσης, το φως που εκπέμπεται από τη χρωστική αναφοράς ανιχνεύεται. Image created by Dan Pierce. Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 12

13 ΝΕΦΕΛΟΜΕΤΡΙΑ Η Νεφελομετρία είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται στην ανοσοβιολογία για τον καθορισμό των επιπέδων πρωτεϊνών στο πλάσμα του αίματος, όπως στη μέτρηση των επιπέδων των ανοσοσφαιρινών Μ, G, A. Είναι σημαντικός ο προσδιορισμός των ελεύθερων ελαφριών αλυσίδων των ανοσοσφαιρινών στο πολλαπλό μυέλωμα. Στη τεχνική γίνεται μέτρηση της ποσότητας του φωτός που διέρχεται από ένα δείγμα. Βασίζεται στην αρχή ότι μικρά σωματίδια σε ένα διάλυμα σκεδάζουν το φως που διέρχεται από αυτά. Η ποσότητα του φωτός που σκεδάζεται ανιχνεύεται υπό γωνία 30 ο ή 90 ο συνήθως. Συγκρίνεται με το σκεδασμό γνωστών ουσιών και η ποσότητα καθορίζεται από μια πρότυπη καμπύλη. Με τη νεφελομετρία μπορεί να γίνει ανίχνευση και αντιγόνων και αντισωμάτων, συνήθως ανιχνεύονται οι ανοσοσφαιρίνες IgM, IgG, and IgA. Φυσιολογικές τιμές IgG: 560 to 1800 mg/dl IgM: 45 to 250 mg/dl IgA: 100 to 400 mg/dl Μπορούν να προσδιοριστούν και οι συγκεντρώσεις της αιμοσφαιρίνης, τρανσφερίνης, α1 αντιθρυψίνη, αλβουμίνη και c-reactive protein Μπορούν να ανιχνευθούν διάφορες ασθένειες όπως: ηπατικές βλάβες, ρευματοειδή αρθρίτιδα, λευχαιμία, μυέλωμα, χρόνιες λοιμώξεις. Το νεφελόμετρο μοιάζει με το φασματοφωτόμετρο με τη μόνη διαφορά ότι ο ανιχνευτής του φωτός που σκεδάζεται βρίσκεται υπό γωνία. (εικόνες 12, 13) Η ποσότητα του σκεδασμού εξαρτάται από την ποσότητα και το μέγεθος των σωματιδίων στο διάλυμα. [41, 42, 43, 44, 45, 46] Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 13

14 Εικόνα 12: Σχηματικό διάγραμμα νεφελόμετρου. Μέτρηση του ποσού του φωτός που σκεδάζεται υπό γωνία προς το προσπίπτον φως, όταν αυτό διέρχεται μέσα από εναιώρημα. Εικόνα 13: Λειτουργία νεφελόμετρου. Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 14

15 Ανοσομετρικές Μέθοδοι IRMA ELISA Τεχνικές Ραδιοανοσοχημικές (RIA) Ενζυμοανοσοχημικές (EIA) Ανοσοχημειοφωταύγεια (CHIA) Ανοσοφθορισμομετρικές (FIA) Ανοσομετρικές μέθοδοι (χρήση σημασμένου Ab) αποτέλεσμα ανάλογο της C Ανοσοραδιομετρικές (IRMA) Ανοσοενζυμομετρικές (ELISA) Ανοσοφωταυγειομετρικές (ICHMA) Εικόνα 14: Αρχή λειτουργίας τεχνικών RIA, EIA, CHIA, FIA Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 15

16 Εικόνα 15: Αρχή λειτουργίας IRMA Στη μέθοδο IRMA μονοκλωνικά αντισώματα συνδέονται άμεσα ή έμμεσα σε σωλήνα πολυστυρενίου. Κατά τη διάρκεια της πρώτης επώασης, ο ορός του ασθενή επωάζεται με μονοκλωνικό αντίσωμα επισημασμένο με I 125 στο σωλήνα που υπάρχει το συνδεδεμένο αντίσωμα. Το αντιγόνο συνδέεται στα ακινητοποιημένα αντισώματα και στα ραδιενεργά σημασμένα αντισώματα. Δημιουργείται μια δομή sandwich. Το μη συνδεδεμένο ραδιενεργό αντίσωμα απομακρύνεται με πλύση. Η ένταση της ραδιενέργειας είναι ανάλογη με τη συγκέντρωση του αντιγόνου που εξετάζεται στον ορό του ασθενή. Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης γίνεται με πρότυπη καμπύλη. [47, 48, 49, 50, 51, 52, 53] Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 16

17 ELISA Η ένζυμο συνδεδεμένη ανοσολογική ανάλυση (enzyme-linked immunosorbent assay ELISA) αναπτύχθηκε από τον Peter Perlmann, και την Eva Engvall στο πανεπιστήμιο της Στοκχόλμης. [54, 55, 56, 57] Η βιοχημική μέθοδος ELISA μπορεί να χρησιμοποιηθεί και για ποιοτική και ποσοτική ανάλυση αντιγόνων και αντισωμάτων. Χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό αντισωμάτων όπως στην περίπτωση του ιού HIV, στη βιομηχανία τροφίμων και στην τοξικολογία. [58, 59, 60] Η μέθοδος βασίζεται στην σύνδεση αντιγόνου αντισώματος και διακρίνεται στην ανταγωνιστική και μη ανταγωνιστική. Στην ανταγωνιστική μέθοδο το εξεταζόμενο αντιγόνο ανταγωνίζεται με επισημασμένο αντιγόνο για τη σύνδεση τους σε περιορισμένη ποσότητα του ίδιου αντισώματος. Το αποτέλεσμα της αντίδρασης είναι αντιστρόφως ανάλογο με τη συγκέντρωση του μετρούμενου αντιγόνου. Στη μη ανταγωνιστική χρησιμοποιείται επισημασμένο αντίσωμα. Το αντιγόνο συνδέεται σε ένα μη επισημασμένο αντίσωμα που είναι καθηλωμένο σε στερεή επιφάνεια και μετά προστίθεται το ίδιο επισημασμένο αντίσωμα. Το αποτέλεσμα της αντίδρασης είναι ανάλογο προς τη συγκέντρωση της ουσίας. (εικόνες 16, 17) [61, 62, 63] ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ELISA Πιο ευαίσθητη Μπορεί να αυτοματοποιηθεί Δεν απαιτεί τόσο εξειδικευμένο προσωπικό Δίνει αντικειμενικά αποτελέσματα Δίνει ποσοτικές και όχι ημιποσοτικές μετρήσεις Μπορούν να ανιχνευτούν και τάξεις των ανοσοσφαιρινών Ευελιξία Προσδιορισμό ουσιών από μίγματα Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 17

18 Εικόνα 16: Στάδια της ELISA. Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 18

19 Εικόνα 17: Ανταγωνιστική και μη ανταγωνιστική ELISA. Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 19

20 Βιβλιογραφία 1. J. R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd edition, Kluwer Academic / Plenum Publishers, New York (1999). 2. Photochem CAD by J.S. Lindsay, available at 3. Petrich, J. W., Chang, M.C., McDonald, D.B., and Fleming, R. (1983). On the origin of nonexponential fluorescence decay in tryptophan and its derivatives, JACS 105, Kiefer, D., and Kuhn A. (1999) Hydrophobic forces drive spontaneous membrane insertion of the bacteriophage Pf3 coat protein without topological control, EMBO J. 18, Winterfeld, S., Imhof, N., Roos, T., Bär, G., Kuhn, A., and Gerken, U. (2009) Substrate induced conformational change of the Escherichia coli insertase YidC, Biochemistry 48, Longworth, J.W. in Time Resolved Fluorescence Spectroscopy in Biochemistry and Biology, , edited by R.E. Cundall and R.E. Dale, Plenum Press, New York (1983). 7. Valeur B., and Weber G. (1977), Resolution of the fluorescence excitation spectrum of indole into the 1La and 1Lb excitation bands, Photochem. Photobiol. 25, Th. Förster, Transfer Mechanisms of Electronic Excitation, Discussions Faraday Soc. 27, 7 (1959). 9. Mullis K.B The unusual origin of the polymerase chain reaction. Sci. Am. 262: Mullis K. and Faloona F Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 55: Lilit Garibyan and Nidhi Avashia. Polymerase Chain Reaction. Journal of Investigative Dermatology (2013) Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Scharf S.J., Higuchi R., et al Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239: Higuchi R., von Beroldingen C.H., Sensabaugh G.F., and Erlich H.A DNA typing from single hairs. Nature 332: Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 20

21 14. Kwok S. and Higuchi R Avoiding false positives with PCR (review). Nature 339: Longo M.C., Berringer M.S., and Hartley J.L Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene 93: Bartlett, J. M. S.; Stirling, D. "A Short History of the Polymerase Chain Reaction". PCR Protocols 2003; 226. pp Pohl G, Shih IeM. Principle and applications of digital PCR. Expert Rev Mol Diagn Jan;4(1): Chien A., Edgar D.B., and Trela J.M Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus. J. Bacteriol. 127: Keohavong P. and Thilly W.G Fidelity of DNA polymerases in DNA amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. 86: Eckert K.A. and Kunkel T.A High fidelity DNA synthesis by the Thermus aquaticus DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 18: Vet J.A. and Marras S.A Design and optimization of molecular beacon real-time polymerase chain reaction assays. Methods Mol. Biol. 288: Kramer R. and Tyagi S Molecular beacons: Probes that fluoresce upon hybridization. Nat. Biotechnol. 14: Vet J.A.M., Majitha A.R., Marras S.A., Tyagi S., Dube S., Poiesz B.J., and Kramer F.R Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons. Proc. Natl. Acad. Sci. 96: Smith C, Osborn M (2009) Advantages and limitations of quantitative PCR (qpcr)- based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol 67: Stahlberg A, Thomsen C, Ruff D et al. (2012) Quantitative PCR analysis of DNA, RNAs, and proteins in the same single cell. Clin Chem 58: Valasek MA, Repa JJ (2005). The power of real-time PCR. Adv Physiol Educ 29: VanGuilder HD, Vrana KE, Freeman WM (2008) Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis. BioTechniques 44: Vogel J, Yee C, Darling J (2012) Molecular biology. In: Bolognia J, Jorizzo J, Rapini R (eds) Dermatology, 3rd edn. Elsevier: Philadelphia, PA, Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 21

22 29. Weier HU, Gray JW (1988) A programmable system to perform the polymerase chain reaction. DNA 7: Bustin, S. A. (2002). "Quantification of mrna using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems." J of Molec Endocrin 29: Lijun Wang, Haitong Gu, Xinxin Lu. A rapid low-cost real-time PCR for the detection of klebsiella pneumonia carbapenemase genes. Ann Clin Microbiol Antimicrob 2012; 11: Damodar Paudel, Richard Jarman, Kriengsak Limkittikul, et al. Comparison of real-time SYBR green dengue assay with real-time taqman RT-PCR dengue assay and the conventional nested PCR for diagnosis of primary and secondary dengue infection. N Am J Med Sci October; 3(10): Stephen J. Hadfield, Guy Robinson, Kristin Elwin, et al. Detection and Differentiation of Cryptosporidium spp. in Human Clinical Samples by Use of Real-Time PCR. J Clin Microbiol March; 49(3): P. Lewis White, Carlo Mengoli, Stéphane Bretagne, et al. Evaluation of Aspergillus PCR Protocols for Testing Serum Specimens. J Clin Microbiol November; 49(11): Abigail M. Frye, Catherine A. Baker, D. Leif Rustvold, et al. Clinical Impact of a Real- Time PCR Assay for Rapid Identification of Staphylococcal Bacteremia. J Clin Microbiol January; 50(1): Tanya A. Halse, Vincent E. Escuyer, Kimberlee A. Musser Evaluation of a Single-Tube Multiplex Real-Time PCR for Differentiation of Members of the Mycobacterium tuberculosis Complex in Clinical Specimens. J Clin Microbiol July; 49(7): Chiabchalard R, Wiengeharoen JT, Sukthana Y. Sensitivity and specicificity of PCR for detection of Toxoplasma Gondii DNA added to laboratyory samples. South east Asian J Trop.Med.Marech 2005; 36(2): N. Pusterla, J.E. Madigan, and C.M. Leutenegger. Real-Time Polymerase Chain Reaction: A Novel Molecular Diagnostic Tool for Equine Infectious Diseases. J Vet Intern Med 2006;20: Bustin SA Absolute quantification of mrna using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 22

23 40. Bustin SA Quantification of mrna using real-time reverse transcription PCR (RT- PCR): trends and problems. Journal of Molecular Endocrinology Ashihara Y, Kasahara Y, Nakamura RM. Immunoassays and immunochemistry. In: McPherson RA, Pincus MR, eds.henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 22nd ed. Philadelphia, PA: Elsevier Saunders; 2011:chap McPherson RA, Massey HD. Laboratory evaluation of immunoglobulin function and humoral immunity. In: McPherson RA, Pincus MR, eds. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 22nd ed. Philadelphia, PA: Elsevier Saunders; 2011:chap L. Chapon. NEPHELOMETRY AS A METHOD FOR STUDYING THE RELATIONS BETWEEN POLYPHENOLS AND PROTEINS. J. Inst. Brew., January-February, 1993, Vol. 99, pp Clinical Immunology and Seriology 3rd Ed., Stevens, pg 127, F.A. Davis Company. 45. C D Deaton, K W Maxwell, R S Smith and R L Creveling. Quality of Commercially Available Controls in Laser Immunonephelometry Ann Clin Biochem 1980; v. 17, p Keefe CC, Goldman MM, Zhang K, Clarke N, Reitz RE, Welt CK. N Evaluation of the Hyland Laser Nephelometer PDQ System for the Measurement of ImmunoglobulinsAnn Clin Biochem 1978; v. 15, p R.S. Chapman. IMMUNOASSAYS IN CLINICAL CHEMISTRY PRINCIPLES OF IMMUNORADIOMETRIC ASSAYS Chapter Bast, R. C., Jr., Feeney, M., Lazarus, H., Nadter, L. M., Colvin, R. B., and Knapp, R. C. Reactivity of a monoclonal antibody with human ovarian carcinoma. J. Clin. Invest., 68: , Bolton, A. E., and Hunter, W. M. The labeling of proteins to high specific radioactivities by conjugation to a I25l-containingacylating agent. Application to the radioimmunoassay with an appendix on the preparation method by J. Rudingerand U. Ruegg. Biochem.J., 33: , Del Villano, B. C., Brennan, S., Brock, P., Bucher, C., Liu, V., McCIure, M., Rake, B., Space. S., Westrick, B., Schoemaker, H., and Zurawski, V., Jr. Radioimmunometric assay for a monoclonal antibody-defined tumor marker, CA Clin. Chem., 29: ,1983. Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 23

24 51. Knauf, S., and Urbach, G. I. OCA, ovarian tumor-associated antigen. In: R. B.Herberman (ed.), Compendium of Assays for Immunodiagnosis of Human Cancer, pp Amsterdam: Elsevier/North-HollandBiomà dicaplress, Rodbard, D. Statistical quality control and routine data processing for radioimmunoassays and mmunoradiometric assays. Clin. Chem., 20: , Ziola, B. R., Matikainen, M. T., and Salmi, A. Polystyrene balls as the solid phase of a double antibody radioimmunoassay for human serum albumin. J. Immunol. Methods, , Engvall E, Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry 1971;8: Engvall E. Quantitative enzyme immunoassay (ELISA) in microbiology. Med Biol1977;55: Van Weemen BK, Schuurs AH (1971). "Immunoassay using antigen-enzyme conjugates".febs Letters 15 (3): Avrameas S. Coupling of enzymes to proteins with glutaraldehyde. Immunochemistry 1969;6: MedLinePlus. "HIV ELISA/western blot." U.S. National Library of Medicine. Last accessed April 16, U. S. Food and Drug Administration. "Food Allergen Partnership." Last accessed April 16, Sblattero D, Berti I, Trevisiol C, Marzari R, Tommasini A, Bradbury A, Fasano A, Ventura A, Not T (2000). "Human recombinant tissue transglutaminase ELISA: an innovative diagnostic assay for celiac disease". Am. J. Gastroenterol. 95 (5): Lequin R (2005). "Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)". Clin. Chem. 51 (12): Schuurs AHWM, van Weemen BK. Enzyme-immunoassay: a powerful analytical tool [Review]. J Immunoassay 1980;1: De La Rica, R.; Stevens, M. M. (2012). "Plasmonic ELISA for the ultrasensitive detection of disease biomarkers with the naked eye". Nature Nanotechnology. Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 24

25 Θέμα 2 Μέθοδοι προσδιορισμού ορμονών: Ιστορικά δεδομένα, αρχή μεθόδων, εργαστηριακά πρωτόκολλα, διδακτικά σχήματα. ΠΕΡΙΛΗΨΗ Οι ορμόνες είναι χημικά μόρια που δρουν ως μηνύματα για το συντονισμό της βιοχημικής δραστηριότητας των κυττάρων και των πολυκύτταρων οργανισμών. Η λέξη ορμόνη είναι διεθνής και προέρχεται από το Ελληνικό ρήμα «ορμώ». Όταν οι ορμόνες απελευθερώνονται στο αίμα ασκούν τις βιολογικές τους δράσεις σε κύτταρα στόχους. Ως χημικά μόρια μπορούν να καταταγούν με βάση τη χημική τους φύση, οπότε υποδιαιρούνται στις εξής κατηγορίες: Στεροειδείς ορμόνες. Οι ορμόνες αυτής της κατηγορίας συνθέτονται με μητρική ουσία τη χοληστερόλη, όπως η αλδοστερόνη, η κορτιζόλη, η τεστοστερόνη, η οιστραδιόλη, η προγεστερόνη κ.α. Πεπτίδια και πρωτεΐνες. Είναι ουσίες πρωτεϊνικής φύσεως, γλυκαγόνη, ινσουλίνη κ.α. Αμίνες ή παράγωγα αμινοξέων, όπως η αδρεναλίνη και η θυροξίνη. Ο πρώτος προσδιορισμός ορμόνης πραγματοποιήθηκε το 1960 από τους Yalov και Berson και αφορούσε την ινσουλίνη η οποία προσδιορίστηκε ραδιοανοσολογικά. Ο επόμενος προσδιορισμός αφορούσε τη θυροξίνη και έγινε από τον Ekins. Μέθοδοι ανάλυσης ορμονών Βιολογικές μέθοδοι Ανοσοχημικές μέθοδοι ή ανοσοπροσδιορισμοί (Immunoassay techniques) HPLC (High performance liquid chromatography) GC-MS (Gas chromatography-mass spectrometry) Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 25

26 Οι ορμόνες είναι χημικά μόρια που δρουν ως μηνύματα για το συντονισμό της βιοχημικής δραστηριότητας των κυττάρων και των πολυκύτταρων οργανισμών. Η λέξη ορμόνη είναι διεθνής και προέρχεται από το Ελληνικό ρήμα «ορμώ». Οι ορμόνες: Παράγονται από ειδικούς ιστούς ή αδένες. Εκκρίνονται στο αίμα, το οποίο και τις μεταφέρει στα σημεία όπου επενεργούν. Προκαλούν ορισμένες βιοχημικές τροποποιήσεις στη δραστηριότητα των οργάνων ή των κυττάρων όπου δρουν (όργανα - στόχοι ή κύτταρα - στόχοι). Όταν οι ορμόνες απελευθερώνονται στο αίμα ασκούν τις βιολογικές τους δράσεις σε κύτταρα στόχους, μακριά από τη θέση παραγωγής τους. Αυτή είναι η κλασσική ενδοκρινική δράση. Σήμερα όμως γνωρίζουμε πως οι ορμόνες δεν είναι αναγκαίο να μεταφερθούν με το αίμα για να δράσουν. Μπορούν να ασκήσουν τις βιολογικές τους δράσεις κοντά στον τόπο παραγωγής τους και η δράση αυτή ονομάζεται παρακρινική. Η Σωματοστατίνη π.χ. που παράγεται από τα δ κύτταρα των νησιδίων του παγκρέατος αναστέλλει την απελευθέρωση της ινσουλίνης και της γλυκαγόνης από τα β και α κύτταρα των νησιδίων αντίστοιχα. Οι ορμόνες μπορούν επίσης να δράσουν στα ίδια τα κύτταρα που τις παράγουν και η δράση αυτή καλείται αυτοκρινική. Η ινσουλίνη π.χ. αναστέλλει την ίδια την έκκρισή της από τα β κύτταρα των νησιδίων του παγκρέατος, ανεξάρτητα από τις τιμές γλυκόζης στο αίμα. Μερικές επηρεάζουν μόνο ένα ιστό, άλλες ολόκληρο το σώμα. Διαφορετικές ορμόνες ενεργοποιούν διαφορετικούς κυτταρικούς μηχανισμούς Δεν αποκρίνονται όλα τα κύτταρα σε κάθε ορμόνη. Δύο διαφορετικά κύτταρα μπορούν να αποκριθούν διαφορετικά στην ίδια ορμόνη Οι ορμόνες δρουν σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις ( M) Οι ορμόνες επηρεάζουν τις μεταβολικές δραστηριότητες του κυττάρου: 1. Μεταβάλλοντας τη μεμβρανική διαπερατότητα 2. επάγοντας τη παραγωγή πρωτεϊνών ή ρυθμιστικών μορίων στα κύτταρα 3. ενεργοποιώντας ή απενεργοποιώντας ένζυμα στα κύτταρα 4. διεγείροντας τα κύτταρα-στόχους να εκκρίνουν ορμόνες Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 26

27 Κατάταξη των ορμονών. Οι ορμόνες κατατάσσονται σε κατηγορίες με βάση τον τόπο παραγωγής, τον τρόπο δράσης και τη φυσιολογική τους λειτουργία. Ως χημικά μόρια μπορούν επίσης να καταταγούν με βάση τη χημική τους φύση, οπότε υποδιαιρούνται στις εξής κατηγορίες: Στεροειδείς ορμόνες. Οι ορμόνες αυτής της κατηγορίας συνθέτονται με μητρική ουσία τη χοληστερόλη, δεν εναποθηκεύονται, αλλά απελευθερώνονται μόλις συντεθούν. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν οι ορμόνες του φλοιού των επινεφριδίων (σπουδαιότερες είναι η αλδοστερόνη και η κορτιζόλη), καθώς και οι ορμόνες των γεννητικών αδένων. Οι τελευταίες διαφοροποιούνται ανάλογα με το φύλο και είναι υπεύθυνες για τη δημιουργία των γαμετικών κυττάρων αλλά και για την εμφάνιση των δευτερογενών χαρακτηριστικών που παρατηρούνται ανάμεσα στους άνδρες και τις γυναίκες. Οι κυριότερες ορμόνες των γεννητικών αδένων είναι η τεστοστερόνη (παράγεται στους όρχεις), η οιστραδιόλη (παράγεται στα ωοθυλάκια) και η προγεστερόνη (παράγεται από το ωχρό σωμάτιο). Πεπτίδια και πρωτεΐνες. Είναι ουσίες πρωτεϊνικής φύσεως, οι οποίες συνθέτονται στη μορφή πρόδρομων ουσιών (προορμόνες) κα οι οποίες εναποθηκεύονται και αποδίδονται στην κυκλοφορία του αίματος μετά την διέγερση του ενδοκρινούς αδένα. Π.χ. γλυκαγόνη, ινσουλίνη κ.α. Αμίνες ή παράγωγα αμινοξέων, όπως η αδρεναλίνη και η θυροξίνη. Είναι γνωστό ότι οι ορμόνες δρουν μόνο σε ορισμένα όργανα, τα οποία ονομάζονται όργανα - στόχοι. Έτσι, για παράδειγμα, η οιστραδιόλη, η οποία αποτελεί γυναικεία γεννητική ορμόνη, δρα στα γυναικεία γεννητικά όργανα, στο μαζικό αδένα και σε ορισμένα κέντρα του εγκεφάλου. Η αιτία για αυτή την εξειδίκευση είναι στο ότι τα κύτταρα του οργάνου - στόχου περιέχουν υποδοχείς για την οιστραδιόλη. Οι ορμονοϋποδοχείς είναι ειδικές πρωτεΐνες που βρίσκονται στην κυτταρική μεμβράνη ή στο εσωτερικό του κυττάρου. Κάθε υποδοχέας αναγνωρίζει και συνδέεται με μία μόνο ορμόνη, δηλαδή η αλληλεπίδραση ορμόνης-υποδοχέα χαρακτηρίζεται από απόλυτη εξειδίκευση. Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 27

28 Η πρόσδεση της ορμόνης στον υποδοχέα προκαλεί μία σημαντική αλλαγή στη δομή της πρωτεΐνης και μέσω αυτής πυροδοτείται μία σειρά χημικών μεταβολών με τελικό αποτέλεσμα την ανταπόκριση του κυττάρου - στόχου σε μία συγκεκριμένη ρύθμιση της λειτουργικότητάς του. Σήμερα γνωρίζουμε δύο διαφορετικούς τρόπους πρωτογενούς δράσης των ορμονών: Οι στεροειδείς ορμόνες και η θυροξίνη δρουν ενδοκυτταρικά. Ενώνονται στο κυτταρόπλασμα με τους υποδοχείς τους και μετά εισέρχονται στον κυτταρικό πυρήνα, όπου ρυθμίζουν τη μεταγραφή συγκεκριμένων γονιδίων. Οι πεπτιδικές ορμόνες δρουν μέσω υποδοχέων που βρίσκονται στην επιφάνεια των κυττάρων. Με την αλληλεπίδραση ορμόνης-υποδοχέα ενεργοποιείται το ένζυμο αδενυλική κυκλάση. Με τη δράση αυτού του ενζύμου παράγεται το κυκλικό AMP (camp), το οποίο δρα ενδοκυτταρικά ως δεύτερο μήνυμα, ενεργοποιώντας μία σειρά ενζύμων που ρυθμίζουν το μεταβολισμό. (εικόνες 1, 2, 3, 4, 5) [1] Εικόνα 1: Μηχανισμοί δράσης ορμονών. 1. Είσοδο στον πυρήνα, 2. Σύνδεση στη μεμβράνη. Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 28

29 Εικόνα 2: Δράση στεροειδών ορμονών, σύνδεση με ενδοκυτταρικό υποδοχέα, το σύμπλοκο ορμόνης υποδοχέα ενεργοποιεί την έκφραση γονιδίων. Εικόνα 3: Σύνδεση ορμόνης σε μεμβρανικό υποδοχέα και ενεργοποίηση ενζύμων. Εικόνα 4: Σύνδεση ορμόνης σε μεμβρανικό υποδοχέα Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 29

30 Εικόνα 5: Μεμβρανικός υποδοχέας ινσουλίνης. Προσδιορισμοί ορμονών Ο πρώτος προσδιορισμός ορμόνης πραγματοποιήθηκε το 1960 από τους Yalov και Berson και αφορούσε την ινσουλίνη η οποία προσδιορίστηκε ραδιοανοσολογικά. Ο επόμενος προσδιορισμός αφορούσε τη θυροξίνη και έγινε από τον Ekins. [2, 3] Από τότε μέχρι σήμερα αν και δεν έχουν αλλάξει οι βασικές αρχές των μεθόδων, οι μέθοδοι έγιναν πιο απλές και αυξήθηκε η ευαισθησία τους. Μέθοδοι ανάλυσης ορμονών Βιολογικές μέθοδοι Ανοσοχημικές μέθοδοι ή ανοσοπροσδιορισμοί (Immunoassay techniques) HPLC (High performance liquid chromatography) GC-MS (Gas chromatography-mass spectrometry) [4, 5, 6, 7, 8, 9, 10] Βιολογικές Μέθοδοι Οι μέθοδοι αυτοί δεν χρησιμοποιούνται ως ρουτίνα. Προσπαθούν να αναπαράγουν τις βιοχημικές δράσεις των ορμονών, συγκρίνοντας το άγνωστο δείγμα με αυξανόμενες δόσεις καθαρής ορμόνης που χρησιμοποιείται ως πρότυπο. Ραδιοανοσολογικές Μέθοδοι Χρησιμοποιούνται από το 1960 έως σήμερα. Αξιοποίησαν τις αντιγονικές ιδιότητες των πρωτεϊνικών ορμονών. Εξαιτίας της επισήμανσης των ορμονών με ραδιοϊσότοπα έδωσαν τη δυνατότητα μέτρησης μικρών ποσοτήτων ορμονών. [10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18] Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 30

31 Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στον ανταγωνισμό μεταξύ της επισημασμένης ορμόνης με ραδιοϊσότοπο και της μη επισημασμένης για τη σύνδεση τους σε ένα ειδικό αντίσωμα. Όσο μεγαλύτερη είναι η συγκέντρωση της ορμόνης που θέλουμε να μετρήσουμε τόσο λιγότερη επισημασμένη ορμόνη θα συνδεθεί στο αντίσωμα. Διαχωρίζεται στη συνέχεια η επισημασμένη και η ελεύθερη ορμόνη και υπολογίζεται η αρχική ποσότητα της ορμόνης σε μετρητή ακτινοβολίας. Ο υπολογισμός γίνεται με την κατασκευή καμπύλης αναφοράς χρησιμοποιώντας πρότυπα διαλύματα με γνωστή συγκέντρωση ορμόνης. Σε μια RIA (Radio Immunoassay) χρειάζονται: Η ορμόνη καθαρή (ως αντιγόνο) για τα πρότυπα διαλύματα αλλά και για την παραγωγή αντισωμάτων. Αντισώματα που παράγονται σε ζώα μετά από χορήγηση της ορμόνης (εξειδικευμένα για τη συγκεκριμένη ορμόνη). Ραδιοϊσότοπα για την επισήμανση της ορμόνης (I 125 ). Στάδια: 1. Ανάμειξη του δείγματος (ορός ή πλάσμα) με την επισημασμένη ορμόνη και το αντίσωμα. 2. Επώαση. 3. Διαχωρισμός της ελεύθερης από την συνδεδεμένη ορμόνη: α. καταβύθιση με διπλό αντίσωμα β. προσρόφηση σε ενεργό άνθρακα γ. καταβύθιση με θειικό αμμώνιο δ. ιονανταλλακτικές ρητίνες ε. αντίσωμα σε στερεή φάση 4. Μέτρηση ακτινοβολίας 5. Καμπύλη αναφοράς και υπολογισμός αποτελεσμάτων. [19-33] Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 31

32 Παραλλαγές των μεθόδων RIA 1. IRMA (Immuno Radiometric Assay), στη μέθοδο αυτή επισημαίνεται το αντίσωμα αντί για το αντιγόνο. 2. IRMA Sandwich, δύο μονοκλωνικά αντισώματα, ένα σε στερεή φάση και το άλλο επισημασμένο στο διάλυμα, αντιδρούν με διαφορετικά σημεία του μορίου της ορμόνης και το παγιδεύουν. 3. Radio Receptor assays, αντί για αντίσωμα χρησιμοποιείται επισημασμένη η πρωτεΐνη υποδοχέας της ορμόνης. 4. Competitive Binding protein assays, αντί του αντισώματος χρησιμοποιείται η ειδική δεσμευτική πρωτεΐνη. Εικόνες 6, 7, 8, 9, 10. [34-40] Μη ισοτοπικές ανοσολογικές μέθοδοι Προβλήματα από τη χρήση των ραδιοϊσοτόπων οδήγησαν στην ανάπτυξη μη ισοτοπικών ανοσολογικών μεθόδων. 1. Για την επισήμανση χρησιμοποιούνται ένζυμα, όπως υπεροξειδάση ή αλκαλική φωσφατάση, ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ή EIA (Enzyme Immunoassay), εικόνα 11 [41, 42] 2. Φθορίζουσες ουσίες (λανθανίδες), όταν διεγερθούν εκπέμπουν φωτόνια με μεγαλύτερο μήκος κύματος, FIA (Fluoro Immuno Assay) 3. Χημειοφωταύγεια (Chemiluminescence), είναι το φυσικό φαινόμενο παραγωγής φωτεινής ακτινοβολίας από ένα μόριο που έχει διεγερθεί. Η αντίδραση: A + B C * C + hv, όπου Α, Β αντιδρώντα, C το διεγειρόμενο μόριο. Η ακτινοβολία μετριέται με ένα φωτόμετρο ή λουμινόμετρο. Η μέθοδος άρχισε να χρησιμοποιείται από τις αρχές τις δεκαετίας του 80 και συνεχίζονται οι έρευνες για νέα μόρια χημειοφωταύγειας. Χρησιμοποιούνται οι κυκλικές υδραζίδες και οι εστέρες της ακριδίνης. Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 32

33 4. HPLC, Υγρή Χρωματογραφία υψηλής πίεσης, High performance liquid chromatography Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στις διαφορετικές φυσικοχημικές ιδιότητες των στοιχείων ενός μείγματος, όπως το μέγεθος, το μοριακό βάρος, το ηλεκτρικό φορτίο κ.α. Χρησιμοποιείται στον προσδιορισμό κατεχολαμινών και σε συνδυασμό με τη φασματοσκοπία μάζας στη μέτρηση κορτικοστεροειδών και ενδιάμεσων προϊόντων της στερεοειδογένεσης. Τεχνική διαχωρισμού υψηλής ευαισθησίας. Χρησιμοποιείται και ως 1ο στάδιο «καθαρισμού» του δείγματος πριν από μια ανοσοχημική μέθοδο. Μελέτη προϊόντων μεταβολισμού, κυρίως χρησιμοποιείται για ερευνητικούς σκοπούς. [43-48] Εικόνα 6: Επισημασμένα αντισώματα επιτρέπουν την ανίχνευση του συμπλόκου αντιγόνου- αντισώματος. Εικόνα 7: Επισημασμένα αντιγόνα επιτρέπουν την ανίχνευση του συμπλόκου αντιγόνουαντισώματος. Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 33

34 Εικόνα 8: One step competitive assay, το επισημασμένο αντιγόνο και το αντιγόνο του δείγματος ανταγωνίζονται για περιορισμένη ποσότητα αντισώματος. Εικόνα 9: Two step competitive format, η συγκέντρωση του αντισώματος στο διάλυμα βρίσκεται σε περίσσεια σε σχέση με τη συγκέντρωση του αντιγόνου. Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 34

35 Εικόνα 10: Μέθοδος RIA. Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 35

36 Εικόνα 11: Η τεχνική ELISA. Οι ορμόνες που παράγονται από την υπόφυση, το πάγκρεας και τον παραθυρεοειδή αδένα είναι πρωτεΐνες. Στις μη πρωτεϊνικές ορμόνες υπάρχουν διακριτές χημικές ομάδες (στεροειδείς) και διευκολύνεται η ανάλυση τους, ενώ στις πρωτεϊνικές ορμόνες δεν υπάρχει κάτι τέτοιο. Ενδεικτικά η αυξητική ορμόνη (GH) παράγεται από την υπόφυση και είναι υπεύθυνη για την ανάπτυξη πολλών ιστών (αποτελείται από 191 αμινοξέα). Η ανάλυση της ορμόνης μπορεί να γίνει με ραδιοανίχνευση, χρησιμοποιώντας επισημασμένη I 125 GH που ανταγωνίζεται την αυξητική ορμόνη που ελέγχεται για τη σύνδεση σε περιορισμένη ποσότητα πολυκλωνικού GH αντιορού. [49-52] Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 36

37 Ενδεικτικά πρωτόκολλα ανίχνευσης ορμονών Πρωτόκολλο Α: Glucose suppression of growth hormone Στα φυσιολογικά άτομα μειώνονται τα επίπεδα της αυξητικής ορμόνης μετά από χορήγηση γλυκόζης, ενώ στα άτομα με ακρομεγαλία δεν συμβαίνει. Χορήγηση 100g γλυκόζης και το αίμα αναλύεται μετά από 1 και 2 ώρες και τα επίπεδα πρέπει να πέσουν στα 2 ng/ml. Πρωτόκολλο Β: Exercise test for growth hormone Η άσκηση αυξάνει την αυξητική ορμόνη. Μετά από 20 λεπτά άσκησης μέτρηση αυξητικής ορμόνης, αν είναι πάνω από 7 ng/ml, είναι φυσιολογικό. Πρωτόκολλο Γ: Gonadotropin-releasing hormone for LH, FSH Η ορμόνη GnRH διεγείρει την απελευθέρωση LH/FSH. Χορηγούνται 100μg GnRH και γίνεται μέτρηση Tτης LH (ωχρινοτρόπος) η οποία πρέπει να αυξηθεί 3-10 φορές και της FSH (θυλακιοτρόπος) η οποία πρέπει να αυξηθεί 1,5-3 φορές. Πρωτόκολλο Δ: TRH test Χορήγηση 500μg TRH και μέτρηση TSH (θυρεοτροπίνη). Αν αυξηθεί 5-10 φορές η TSH είναι φυσιολογικά τα ευρήματα, καθόλου αύξηση υποδηλώνει υπερθυρεοειδισμό, ενώ μεγάλη αύξηση υποθυρεοειδισμό. Πρωτόκολλο Ε: Clonidine test Η κλονιδίνη είναι φάρμακο που αναστέλλει την απελευθέρωση κατεχολαμινών φυσιολογικά άλλα όχι σε άτομα με φαιοχρωμοκύτωμα. Χορήγηση 4,3 μg/kg κλονιδίνη και μέτρηση μετά από 3 ώρες την νοραδρεναλίνη. Πρωτόκολλο ΣΤ: Τεστ κορτιζόλης Χαμηλή δόση dexamethasone 0,5 mg, σε φυσιολογικά άτομα προκαλεί μείωση κορτιζόλης. [53-61] Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 37

38 ΣΤΟΧΟΙ ΓΙΑ ΤΟ ΦΥΛΛΟ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΣΤΟΥΣ ΕΝΔΟΚΡΙΝΕΙΣ ΑΔΕΝΕΣ-ΟΡΜΟΝΕΣ Στο τέλος του μαθήματος ο μαθητής να: 1. Να γνωρίζει τις διαφορές μεταξύ εξωκρινών και ενδοκρινών αδένων. (δραστηριότητα 1) 2. Να γνωρίζει τη φύση των ορμονών και τους τρόπους δράσης τους. (δραστηριότητα 2) 3. Να περιγράφει τους τρόπους δράσης των ορμονών. (δραστηριότητα 2) 4. Να ανακαλύψει τη σύνδεση ανάμεσα στη σωστή λειτουργία του ενδοκρινικού και την ασθένεια. (δραστηριότητα 3) Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 38

39 ΦΥΛΛΟ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΣΤΟΥΣ ΕΝΔΟΚΡΙΝΕΙΣ ΑΔΕΝΕΣ-ΟΡΜΟΝΕΣ Δραστηριότητα 1 η Εικόνα 1 Εικόνα 2: έξω ακουστικός πόρος κυψελίδα Εικόνα 3 Εικόνα 4 Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 39

40 α) Σε ποια ή ποιες από τις παραπάνω εικόνες παρατηρείται τη δράση εξωκρινών αδένων και που ενδοκρινών αδένων. β) Ποιο κριτήριο χρησιμοποιήσατε για να εντοπίστε το είδος του αδένα. γ) Αν στην παρακάτω εικόνα οι κίτρινες σφαίρες και τα μπλε τετράγωνα είναι ορμόνες, πως φτάνουν στα διάφορά κύτταρα του οργανισμού, πως ονομάζονται τα κύτταρα αυτά και τι τους προκαλούν; Δραστηριότητα 2 η Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 40

41 Εικόνα 1 Εικόνα 2 Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 41

42 Στις εικόνες 1 και 2 παρατηρείται τους τρόπους δράσης των ορμονών. α) Σε ποια από τις παραπάνω εικόνες η ορμόνη εισέρχεται στο κύτταρο; Εξηγήστε. β) Που συνδέεται η ορμόνη σε κάθε περίπτωση; γ) Μετά τη σύνδεση της ορμόνης με τον υποδοχέα, πως θα δράσει το σύμπλοκο και με τι ταχύτητα ; Δραστηριότητα 3 η Συνδεθείτε στο διαδίκτυο στη διεύθυνση: και παρακολουθήστε το βίντεο. α) Ποια ορμόνη αναφέρει το βίντεο και σε ποια κατηγορία ορμονών ανήκει; β) Από πού παράγεται η ορμόνη και τι ρυθμίζει; γ) Εξηγήστε τη σχέση της ορμόνης με συγκεκριμένες ασθένειες. Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 42

43 Πρωτόκολλο μέτρησης β χοριακής γοναδοτροπίνης (β-hcg) Η β χοριακή γοναδοτροπίνη αποτελείται από 145 αμινοξέα και κωδικοποιείται από γονίδια στο χρωμόσωμα 19. Βρίσκεται στο αίμα και τα ούρα και χρησιμοποιείται ως τεστ εγκυμοσύνης, αλλά και ως καρκινικός δείκτης. Τα περισσότερα τεστ χρησιμοποιούν μονοκλωνικά αντισώματα, ειδικά για την β υπομονάδα της χοριακής γοναδοτροπίνης, έτσι αποφεύγονται τα ψευδώς θετικά αποτελέσματα από τη FSH και LH. Η μέθοδοι ανοσοανίχνευσης χρησιμοποιούν αντισώματα συνδεδεμένα με ένα ένζυμο ή χρωστική. Η ανάλυση στο αίμα απαιτεί 2-4 ml και χρησιμοποιείται η χημειοφωταύγεια και επιτρέπει την ανίχνευση έως 5 miu/ml. 1. Ορός του αίματος συλλέγεται σε δοκιμαστικούς σωλήνες με αντιπηκτικό. 2. Φυγοκέντρηση. 3. Διατήρηση του δείγματος για 48 ώρες στους -20 ο C. 4. Μέτρηση του δείγματος 5. Υπολογισμός συγκέντρωσης με καμπύλη αναφοράς. Πίνακας συγκεντρώσεων της ορμόνης κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης. [62-68] weeks since LMP last menstrual period miu/ml , ,080 56, , ,000 Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 43

44 , , , , , , , ,000 Non-pregnant females <5.0 Postmenopausal females <9.5 Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 44

45 Βιβλιογραφία 1. Seeley Stephens Tate: Anatomy and Physiology, Sixth Edition The McGraw Hill Companies, Rosalyn S. Yalow and Solomon A. Berson. IMMUNOLOGICAL SPECIFICITY OF HUMAN INSULIN: APPLICATION TO IMMUNOASSAY OF INSULIN. J Clin Invest. Dec 1961; 40(12): R. Ekins, The estimation of thyroxine in human plasma by an electrophoretic technique. Clin Chim Acta 1960:5, Rubenstein N.M. (1986). In Handbook of Clinical Laboratory management, Aspen Publishers, Inc, Rockville, Maryland. 5. J.S. Woodhead, Journal of Clinical Immunoassay, 1984, 7, G. Messari, European Clinical Laboratory, 1998, L.J. Kricka, Analytical Chemistry, 1999, 71, 12: 305 R. 8. Grotjan, H.E., and Keel, B.A., in Immunoassay, ed Diamandis, E.P. and Christopoulos, T.K., Academic press Inc., New York, 1996, ch. 4, pps. 9. Ashwood, ER, Burtis CA, Tietz Textbook of Clin Chen 3rd Ed: 1563, Wb Saundrers Co. Phila: Tietz NW (ed): Fundamentals of Clinical chemistry, 3rd ed. W.B. Saundrers Co, Philadelphia Boscato LM, Stuart MC. Heterophilic antibodies: a problem for all immunoassays. Clin Chem 1988;34: Larry Kricka: Human Anti-Animal Antibody Intereferences in Immunological Assay. Clin Chemistry 1999, 45: 7, National Committee for Clinical Laboratory Standards. Procedures for handling and processing of blood specimens; approved guideline. NCCLS Document H18-A. Wayne (PA): NCCLS; 1990 Dec. 34p. 14. National Committee for Clinical Laboratory Standards. How to define, determine, and utilize Reference intervals in the clinical laboratory; approved guideline. Wayne (PA): NCCLS; 1995 June 59p. 15. Rappaport EB, Olander CR, Steffes MW, Kubasik N, Ferry D. Radioimmunoassay of human somatotropin. Clin Chem May;25(5): Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 45

46 16. Nieves A. Andino. A radioimmunological method of determining prolactin in human blood plasma. Statistical substantiation of the method and determination of the content of the hormone in healthy persons of both sexes and in infertile patient. Neuroscience and Behavioral Physiology. 1982, Volume 12, Issue 6, pp Rayah S. Baban, Yahya Y.Farid. Comparison between Serum Prolactin Levels Determined byvidas and RIA Techniques. Iraqi Journal of Medical Sciences Sapin R, Gasser F, Grucker D. Free prolactindeterminations in hyperprolactinemic men with suspicion of macroprolactinemia. Clin ChimActa 2002; 316(1-2): Murphy, B.E.P., Pattee, Ci. and Gold, A. clinical evaluation of a new method for the determination of serum thyroxine. J.Clin.Endocrinol. Metab., 1966;26: Abraham, G.E. snd Grover, P.K. Covalent linkage of hormonal haptens to protein carriers for use in radioimmuno assay. In Odell, W.D. and Daughadsy, W.H. editors: Principles of competitive protein binding assays. Philadelphia, J.B. Lippincott Co., Rodbsrd, D., Rayford, P.L, Cooper, i.a. snd Ross, G.T. Statistical quality control and routine data processing for radioimmunossssys (RIA) and immunoradiometric asssys (IRMA). din. Chem., 1974;20: Rodbsrd, D., Bridson, W. and Rayford, P.L Rapid calculation of radioirnmuno assay results. 3. Lab.dIm. Med., 1969;74: Garcia, E.J. and Fiori, A. Radioimmunoassay and competitive binding analysis. In text book Of nuclear medicine: Basic Sciences (Eds. A. Fernando snd.1.c. Harbert): Lea and Febiger Publishers, 1978; pp Hunter, W.M. and Greenwood, P.C. Preparation of labeled growth hormone of high specificsctivity. Nature (London), 1962;194: Odell, W.D. and Daughadsy, W.H. (eds). Principles of competitive protein binding assays. Philadelphia,i.B. Lippincott Co., Rosa, U. Protein radioiodination by an electrolyte technique. Strahlentherapie (Sonderb)., 1965;60: Von Schenck, H., Larason, I. andthorell, 3.1. Improved radioiodinstionofglucagonwith the lsctoperoxidase method; influence of ph on iodine substitution. Clin.Chim. Acts., 1976;69: Thorell, 3.1. and Larsson, I. Lactoperoxidase coupled to polyacrylamide for radioiodinstion of proteins to high specific activity. Immunochemistry, 1974;11: Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 46

47 29. Bolton, A.E. and Hunter, W.M. The labelling of proteins to high specific radioactivities by conjugation to a conuining acylating agent Biochem. 3., 1973;133: Samols, E. and Williams, H.S. Trace labelling of insulin with iodine. Nature, 1961;190: Nielson, M.D., iorgensen, M. and Giese, labelling of αngiotensin land II. Acts. Endocrinol., 1971;67: Desbuquois, B. and Aurbsch, G.D. Use of polyethylene glycol to separate free and antibodybound peptide hormones in radioimmunoassay. J.Clin.Endocrinol.Metab., 1971;33:732-3& 33. Heding, L.Ci. A simplified insulin radioimmunoatsay method. In L., Dansta G. Sirchis editors: Labelled proteins in tracer studies (proceedings of the conference held at Pita, Jan. 1749, A Al-Shawi, A Dawnay, and J Landon. A novel immunoradiometric assay for human liver ferritin. J Clin Pathol. Apr 1983; 36(4): Miles LE, Hales CN. Labelled antibodies and immunological assay systems. Nature Jul 13;219(5150): Miles LE. Properties, variants, and applications of the immunoradiometric assay method. Ric Clin Lab Jan-Mar;5(1): LOWRY OH, ROSEBROUGH NJ, FARR AL, RANDALL RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem Nov;193(1): Marcus DM, Zinberg N. Isolation of ferritin from human mammary and pancreatic carcinomas by means of antibody immunoadsorbents. Arch Biochem Biophys Jun;162(2): Avrameas S, Ternynck T. The cross-linking of proteins with glutaraldehyde and its use for the preparation of immunoadsorbents. Immunochemistry Jan;6(1): Dandliker WB, Alonso R, de Saussure VA, Kierszenbaum F, Levison SA, Schapiro HC. The effect of chaotropic ions on the dissociation of antigen-antibody complexes. Biochemistry May;6(5): Voller, A.; Bidwell, D. E.; Bartlett, A. The enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). A guide with abstracts of microplate applications pp. 125pp. 42. McCarpa, Journal of Bioluminescence and chemiluminescence 1989, 4, Soares CR1, Camargo IM, Morganti L, Gimbo E, Ezequiel de Oliveira J, Legoux R, Ferrara P, Bartolini P Reversed-phase high-performance liquid chromatography method for the determination of prolactin in bacterial extracts and in its purified form. J Chromatogr A May 10;955(2): Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 47

48 44. Gerber, F.; Krummen, M.; Potgeter, H.; Roth, A.; Siffrin, C.; Spoendlin, C. (2004). "Practical aspects of fast reversed-phase high-performance liquid chromatography using 3μm particle packed columns and monolithic columns in pharmaceutical development and production working under current good manufacturing practice". Journal of Chromatography A 1036 (2): Lindsay, S. ; Kealey, D. (1987). High performance liquid chromatography. Wiley. from review Hung, L. B.; Parcher, J. F.; Shores, J. C.; Ward, E. H. (1988). "Theoretical and experimental foundation for surface-coverage programming in gas solid chromatography with an adsorbable carrier gas". J. Am. Chem. Soc. 110 (11): Snyder, Lloyd R. and Dolan, John W. (2006). High-Performance Gradient Elution: The Practical Application of the Linear-Solvent-Strength Model. Wiley Interscience. 47. Xiang, Y.; Liu Y. and Lee M.L. (2006). "Ultrahigh pressure liquid chromatography using elevated temperature". Journal of Chromatography A 1104 (1 2): Horváth, Cs.; Preiss B.A. and Lipsky S.R. (1967). "Fast liquid chromatography. Investigation of operating parameters and the separation of nucleotides on pellicular ion exchangers". Analytical Chemistry 39 (12): P Brostedt, M Luthman, L Wide, S Werner, P Roos. Characterization of dimeric forms of human pituitary growth hormone by bioassay, radioreceptor assay, and radioimmunoassay. Acta endocrinologica 03/1990; 122(2): Vieira JG1, Lombardi MT, Nishida SK. Monoclonal antibody-based immunoenzymometric assay for serum human growth hormone. Braz J Med Biol Res. 1990;23(3-4): Demers, L.M., Pituitary Function in Tietz Fundamentals in clinical chemistry, 5th Edition, 2001, 39, , Greenwood, F.C., Hunter, W.M. and Glover, is. The preparation of labeled human growth hormone of high specific radioactivity. Biochem. 3., 1963;89: Pudek MR. Adrenal hormones. In: Kaplan LA, Pesce AJ, editors. Clinical chemistry: therapy, analysis, and correlation. St. Louis: CV Mosby, p Whitley RJ, Meikle AW, Watts NB. Endocrinology, part VI: adrenocortical steroids. In: Burtis CA, Ashwood ER, editors. Textbook of clinical chemistry, 2nd ed. Philadelphia: WB Saunders, p Miller J, Crapo L. The biochemical diagnosis of hypercortisolism. Endocrinologist 1994;4(1):7-16. Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 48

49 56. Morris DJ: The Metabolism and mechanism of action of Aldosferone. Endocrin Rev. 2: , Chopra, Li., Nelson, J.C., Solomon, D.H. and Beall, G.N. Production of antibodies specifically binding triiodothyronin and thyroxine. J.Clin.Endocrinol. Metab., 1971; 32: Cheung. M.d. snd Slaunwhite, W.R. Use of polyethylene glycol in separating bound from unbound ligand in radioimmunoassay of thyroxine. Clin.Chem., 1976;22: Erlsnger. B.F., Borek, F., Beiser, S.M. and Lieberman, S. Steroid-protein conjugates. II. Preparstion and characterization of conjugates of bovine serum albumin with progesterone, deoxycorticoaterone and estrone.i.biol. Chem., 1959;234: Erlsnger, B.F., Borek, F., Beiser, SM. snd Liebermsn, S. Steroid-proteinconjugates. L reparation and characterization of conjugates of bovine serum albumin with testosterone sandwith cortisone. J.Biol.Chem., 1957;228: Dean, P.D., Edey, D. and iohnason, M.W. Preparation of 17 B oestradiol-6-(o-car hoxymethyl)- oxime-bovine serum albumin conjugates. Steroids, 1971;18: Kayisli U, Selam B, Guzeloglu-Kayisli O, Demir R, Arici A (2003). "Human chorionic gonadotropin contributes to maternal immunotolerance and endometrial apoptosis by regulating Fas-Fas ligand system". J. Immunol. 171 (5): Askling J, Erlandsson G, Kaijser M, Akre O, Ekbom A (December 1999). "Sickness in pregnancy and sex of child". Lancet 354 (9195): Michels KB, Xue F, Colditz GA, Willett WC (April 2007). "Induced and spontaneous abortion and incidence of breast cancer among young women: a prospective cohort study". Arch. Intern. Med. 167 (8): "WHO Reference Reagent Human Chorionic Gonadotrophin (Purified) NIBSC code: 99/688 Instructions for use (Version 3.0, Dated 05/11/2007)". 66. Canfield RE, Ross GT (1976). "A new reference preparation of human chorionic gonadotrophin and its subunits". Bulletin of the World Health Organization 54 (4): Richard A. McPherson, Matthew R. Pincus, (2006). Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods (21st ed.). Philadelphia: Saunders. ISBN Waddell, Rebecca Smith (2006). "FertilityPlus.org". Home Pregnancy Test hcg Levels and FAQ. Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 49

50 Θέμα 3 Αντισώματα: Δομή, είδη, τρόποι εργαστηριακής παρασκευής, χρήσεις τους σε εργαστηριακές τεχνικές και στη θεραπεία ασθενειών. ΠΕΡΙΛΗΨΗ Ο όρος αντίσωμα αναφέρθηκε πρώτη φορά από το Γερμανό γιατρό Ehrlich. Τα αντισώματα είναι γλυκοπρωτείνες που αποτελούνται από μία ή περισσότερες υπομονάδες, κάθε μία από αυτές αποτελείται από τέσσερις πολυπεπτιδικές αλυσίδες ανά δύο όμοιες: δύο μεγάλες τις βαριές (H) και δύο μικρές τις ελαφριές (L). Το αμινοτελικό άκρο των αλυσίδων παρουσιάζει μεγάλη ποικιλία στην αλληλουχία των αμινοξέων και ονομάζεται μεταβλητή (V) περιοχή, ενώ το υπόλοιπο τμήμα του αντισώματος είναι σχετικά σταθερό και ονομάζεται σταθερή περιοχή (C). Οι πέντε κλάσεις των ανοσοσφαιρινών είναι οι IgG, IgM, IgA, IgD and IgE. Τα αντισώματα χρησιμοποιούνται στη διάγνωση με μεθόδους, όπως ανοσοαποτύπωση και ανοσοκαθίζηση είναι δύο μέθοδοι όπου χρησιμοποιούνται αντισώματα για τον εντοπισμό αντιγόνων (κυρίως πρωτεϊνών), στη μέθοδο Western Blot, στην ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), στην κυτταρομετρία ροής (fluorescence-activated cell scanning), στον ανοσοφθορισμό και στην ανοσοιστοχημεία. Χρησιμοποιούνται στη θεραπεία ασθενειών, όπως ανοσοανεπάρκειες, αυτοάνοσες ασθένειες και διάφορες μορφές καρκίνου, καθώς και στην τυποποίηση ομάδων αίματος, εντοπισμό μιας πιθανής κύησης, έλεγχο συμβατότητας στις μεταμοσχεύσεις. Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 50

51 Αντισώματα Δομή Είδη Η αναγνώριση των ξένων αντιγόνων είναι ένα βασικό στοιχείο στην ειδική άμυνα. Δύο ξεχωριστά μόρια εμπλέκονται στη διαδικασία αυτή: οι ανοσοσφαιρίνες (αντισώματα) και οι υποδοχείς αντιγόνων των Τ λεμφοκυττάρων (TCRs). Τα μόρια αυτά χαρακτηρίζονται από μεγάλη εξειδίκευση και παρουσιάζουν τεράστια ποικιλία. Αυτό προκύπτει από την ανακατάταξη που συμβαίνει στα γονίδια που τα κωδικοποιούν και οδηγεί σε μεγάλο αριθμό διαφορετικών ανοσοσφαιρινών και TCRs, ώστε να αναγνωρίζονται πολλά διαφορετικά αντιγόνα. Οι ανοσοσφαιρίνες είναι ομάδα γλυκοπρωτεινών στον ορό του αίματος και στο υγρό των ιστών σε όλα τα θηλαστικά. Μια ομάδα λευκών αιμοσφαιρίων τα πρόδρομα Β λεμφοκύτταρα διαθέτουν στην επιφάνεια τους ειδικά αντισώματα υποδοχείς. Η σύνδεση των αντισωμάτων με το αντιγόνο οδηγεί στην ενεργοποίηση των Β λεμφοκυττάρων τα οποία διαφοροποιούνται σε πλασματοκύτταρα τα οποία εκκρίνουν μεγάλο αριθμό αντισωμάτων στο αίμα και τη λέμφο. Ο όρος αντίσωμα αναφέρθηκε πρώτη φορά από το Γερμανό γιατρό Ehrlich. [1, 2] Η μελέτη των αντισωμάτων και η ανάπτυξη της θεωρίας της χυμικής ανοσίας ξεκίνησε το 1890 από τον Kitasato Shibasaburō. [3] Ο Linus Pauling επιβεβαίωσε τη θεωρία κλειδιού κλειδαριάς που είχε προταθεί από τον Ehrlich. [4] Τα αντισώματα είναι γλυκοπρωτείνες που αποτελούνται από μία ή περισσότερες υπομονάδες, κάθε μία από αυτές αποτελείται από τέσσερις πολυπεπτιδικές αλυσίδες ανά δύο όμοιες: δύο μεγάλες τις βαριές (H) και δύο μικρές τις ελαφριές (L). Το αμινοτελικό άκρο των αλυσίδων παρουσιάζει μεγάλη ποικιλία στην αλληλουχία των αμινοξέων και ονομάζεται μεταβλητή (V) περιοχή, ενώ το υπόλοιπο τμήμα του αντισώματος είναι σχετικά σταθερό και ονομάζεται σταθερή περιοχή (C). Κάθε ελαφριά αλυσίδα αποτελείται από μια μεταβλητή VL και μια σταθερή περιοχή CL. Οι βαριές αλυσίδες έχουν μια μεταβλητή περιοχή VH και τρεις σταθερές CH1, CH2, CH3. Κάθε βαριά αλυσίδα έχει περίπου διπλάσιο αριθμό αμινοξέων από την ελαφριά αλυσίδα. Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 51

52 Οι πέντε κλάσεις των ανοσοσφαιρινών είναι οι IgG, IgM, IgA, IgD and IgE. Διακρίνονται από τον τύπο της βαριάς αλυσίδας. IgG έχουν γ αλυσίδες, IgM έχουν μ αλυσίδες, IgA έχουν α αλυσίδες, IgE ε αλυσίδες, and IgD έχουν δ αλυσίδες. Οι διαφορετικές βαριές αλυσίδες επιτρέπουν στις ανοσοσφαιρίνες να λειτουργούν σε διαφορετικά στάδια της ανοσοβιολογικής απόκρισης. Ενώ υπάρχουν πέντε τύποι βαριών αλυσίδων, υπάρχουν μόνο δύο τύποι ελαφριάς αλυσίδας: kappa (κ) και lambda (λ). Εικόνες 1, 2, 3, 4, 5. Εικόνα 1: Δομή αντισώματος. [5] Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 52

53 Εικόνα 2: Δομή αντισώματος, διακρίνονται οι ελαφριές και οι βαριές αλυσίδες, οι δισουλφιδικοί δεσμοί που τις συγκρατούν και το σημείο σύνδεσης του αντιγόνου. Εικόνα 3: Δράσεις αντισωμάτων, ενεργοποίηση συμπληρώματος, ενίσχυση φαγοκυττάρωσης. Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 53

54 Εικόνα 4: Φυσικοχημικές ιδιότητες των ανοσοσφαιρινών. Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 54

55 Εικόνα 5: Κλάσεις ανοσοσφαιρινών. [6, 7] Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 55

56 IgG Οι ελαφριές και οι βαριές αλυσίδες συνδέονται με ένα συνδυασμό μη ομοιοπολικών και ομοιοπολικών δεσμών (δισουλφιδικοί). Κάθε ανοσοσφαιρίνη Ig περιέχει δύο θέσεις σύνδεσης του αντιγόνου. Η ανοσοσφαιρίνη IgG, είναι η κυρίαρχη Ig στον ανθρώπινο ορό και αποτελεί το 75%. Παράγεται ως μέρος της δευτερογενούς ανοσοβιολογικής απόκρισης σε ένα αντιγόνο. Διέρχεται τον ανθρώπινο πλακούντα και είναι υπεύθυνη για την προστασία του νεογνού στους πρώτους μήνες της ζωής. Ιδιότητες IgG: Μοριακό βάρος: 150,000 H-chain type (MW): gamma (53,000) Συγκέντρωση ορού: 10 έως 16mg/mL Ποσοστό επί του συνόλου των ανοσοσφαιρινών: 75% Αποτελείται από τέσσερις υποομάδες IgG1, 2, 3, και 4, ανάλογα με τη συγκέντρωση τους στον ορό. [8] Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 56

57 IgA Η IgA υπάρχει σε μονομερή και διμερή μορφή και αποτελεί το 15% των ανοσοσφαιρινών στον ορό του αίματος. Βρίσκεται στο σάλιο, στα δάκρυα και ο βασικός ρόλος είναι να εμποδίζει την είσοδο των αντιγόνων στην κυκλοφορία. Ιδιότητες IgA: Μοριακό βάρος: 320,000 (secretory) H-chain type (MW): alpha (55,000) Συγκέντρωση ορού: 1 to 4mg/mL Ποσοστό επί του συνόλου των ανοσοσφαιρινών: 15% IgM Η IgM υπάρχει ως πενταμερές στα θηλαστικά, κυριαρχεί στην πρωτογενή ανοσοβιολογική απόκριση. Η ανοσοσφαιρίνη μπορεί να προκαλέσει συγκόλληση κυττάρων μικροοργανισμών, οι οποίοι στη συνέχεια καταστρέφονται από τις πρωτεΐνες του συμπληρώματος ή τα μακροφάγα. Είναι η πρώτη ανοσοσφαιρίνη που συνθέτεται από το νεογνό και παίζει ρόλο σε κάποιες αυτοάνοσες ασθένειες. Ιδιότητες IgM: Μοριακό βάρος: 900,000 H-chain type (MW): mu (65,000) Συγκέντρωση ορού: 0.5 to 2mg/mL Ποσοστό επί του συνόλου των ανοσοσφαιρινών: 10% Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 57

58 IgD και IgE IgD και IgE βρίσκονται σε μικρές συγκεντρώσεις. IgD βρίσκεται ως μεμβρανικός υποδοχέας αντιγόνων στα ώριμα Β λεμφοκύτταρα. IgE λειτουργούν έναντι των παρασίτων και είναι υπεύθυνες στις αλλεργικές αντιδράσεις. Ιδιότητες IgD: Μοριακό βάρος: 180,000 H-chain type (MW): delta (70,000) Συγκέντρωση ορού: 0 to 0.4mg/mL Ποσοστό επί του συνόλου των ανοσοσφαιρινών: 0.2% Ιδιότητες IgE: Μοριακό βάρος: 200,000 H-chain type (MW): epsilon (73,000) Συγκέντρωση ορού: 10 to 400ng/mL Ποσοστό επί του συνόλου των ανοσοσφαιρινών: 0.002% Ο αριθμός των διαφορετικών αντισωμάτων που μπορούν να παραχθούν είναι πολύ μεγάλος, θα έπρεπε να υπάρχει και αντίστοιχα μεγάλος αριθμός γονιδίων που θα τα κωδικοποιεί. Στην πραγματικότητα τα αντισώματα κωδικοποιούνται από μικρό αριθμό γονιδίων τα οποία υφίστανται διαδικασία σωματικής ανακατάταξης και ανασυνδυασμού κατά το σχηματισμό των Β λεμφοκυττάρων. Τα γονίδια για την ελαφρά αλυσίδα κ βρίσκονται στη ζώνη 2p13 του χρωμοσώματος 2, τα γονίδια για την ελαφρά αλυσίδα λ στη ζώνη 22q11 του χρωμοσώματος 22 και τα γονίδια για τους πέντε ισοτύπους της βαριάς αλυσίδας στη ζώνη 14q32 του χρωμοσώματος 14. Εικόνες 6, 7, 8 Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 58

59 Η μεταβλητή περιοχή της ελαφριάς αλυσίδας κωδικοποιείται από δύο τμήματα γονιδίων το μεταβλητό V και το συνδετικό J, ενώ η μεταβλητή της βαριάς αλυσίδας κωδικοποιείται από το μεταβλητό τμήμα V, το συνδετικό τμήμα J και το τμήμα D. [9-21] Εικόνα 6: Γενετική βάση σύνθεσης κ αλυσίδων στον άνθρωπο. [22, 23] Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 59

60 Εικόνα 7: Γονιδιακοί τόποι των ανθρώπινων ανοσοσφαιρινών. Χρωμόσωμα 14, γονίδια μεταβλητής περιοχής, 27 γονίδια D περιοχής και 6 γονίδια J. Χρωμόσωμα 22, 30 γονίδια μεταβλητής και 5 γονίδια J. Χρωμόσωμα 2, γονίδια μεταβλητής και 5 J. Εικόνα 8: Σωματικός ανασυνδυασμός γονιδίων ανοσοσφαιρινών. Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 60

61 Εργαστηριακή παρασκευή αντισωμάτων Το 1976, οι Georges Kohler και Cesar Milstein, στο Cambridge, ανέπτυξαν τεχνική παραγωγής και απομόνωσης αντισωμάτων έναντι συγκεκριμένου αντιγόνου. Ένα επιλεγμένο αντιγόνο χορηγείται με ένεση σε ποντίκι και προκαλεί ανοσολογική αντίδραση με αποτέλεσμα να αρχίσει η παραγωγή αντισωμάτων από εξειδικευμένα Β-λεμφοκύτταρα. Ύστερα από δύο εβδομάδες αφαιρείται ο σπλήνας και απομονώνονται τα Β-λεμφοκύτταρα. Τα κύτταρα αυτά συντήκονται με καρκινικά κύτταρα (μυέλωμα, καρκινικά κύτταρα Β λεμφοκυττάρων) και παράγονται τα υβριδώματα που παράγουν μονοκλωνικά αντισώματα. Η σύντηξη γινόταν με αναλογία 1 κύτταρο μυελώματος και 10 Β λεμφοκύτταρα. Τα υβριδώματα μπορούν να φυλάσσονται για μεγάλα χρονικά διαστήματα στην κατάψυξη (-80 C) και να παράγουν οποιαδήποτε στιγμή το συγκεκριμένο μονοκλωνικά αντίσωμα σε μεγάλες ποσότητες. [24] Εικόνα 9 Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 61

62 Εικόνα 9: Παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων. [25] Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 62

63 Πολυκλωνικά αντισώματα (Polyclonal Antibodies) Τα πολυκλωνικά αντισώματα είναι ένα ετερογενές μείγμα αντισωμάτων έναντι διαφορετικών αντιγονικών καθοριστών του ίδιου αντιγόνου. Τα αντισώματα αυτά παράγονται από διαφορετικούς κλώνους Β λεμφοκυττάρων. Συνήθως παράγονται σε κουνέλια αλλά και σε άλλα θηλαστικά (αίγες, αγελάδες, κ.α.) Μονοκλωνικά αντισώματα (Monoclonal Antibodies) Τα μονοκλωνικά αντισώματα αναγνωρίζουν έναν αντιγονικό καθοριστή και παράγονται από μια ομάδα όμοιων Β λεμφοκυττάρων. Εικόνα 12 Συνήθως παράγονται σε ποντικούς και το ανοσογόνο χορηγείται κάθε δύο εβδομάδες για μια περίοδο δύο μηνών. Η ανοσοαπόκριση του ζώου παρακολουθείται και όταν είναι ικανοποιητική απομονώνονται Β λεμφοκύτταρα από τον σπλήνα και συντήκονται με αθάνατες κυτταρικές σειρές (κύτταρα μυελώματος). Προκύπτουν τα υβριδώματα τα οποία καλλιεργούνται και παράγουν τα επιθυμητά αντισώματα. Τα αντισώματα καθαρίζονται με χρωματογραφία. Εικόνες 10, 11 Εικόνα 10: Παραγωγή πολυκλωνικών αντισωμάτων. Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 63

64 Εικόνα 11: Παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων. Εικόνα 12: Σύνδεση μονοκλωνικών αντισωμάτων σε έναν αντιγονικό καθοριστή Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 64