Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ RGD ΚΑΙ ΑΝΑΛΟΓΩΝ ΤΟΥ ΜΕ ΕΝΣΩΜΑΤΩΜΕΝΑ ΠΑΡΑΓΩΓΑ ΣΑΛΙΚΥΛΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΠΗΚΤΙΚΗΣ ΤΟΥΣ ΡΑΣΗΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑΤΑ ΧΗΜΕΙΑΣ & ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ «ΙΑΤΡΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ: Σχεδιασµός και Ανάπτυξη Φαρµακευτικών Προϊόντων» Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ RGD ΚΑΙ ΑΝΑΛΟΓΩΝ ΤΟΥ ΜΕ ΕΝΣΩΜΑΤΩΜΕΝΑ ΠΑΡΑΓΩΓΑ ΣΑΛΙΚΥΛΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΠΗΚΤΙΚΗΣ ΤΟΥΣ ΡΑΣΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΣΑΡΗΓΙΑΝΝΗΣ ΧΗΜΙΚΟΣ ΠΑΤΡΑ 2005

2 Τριµελής Συµβουλευτική Επιτροπή Σταυρόπουλος Γεώργιος (Επιβλέπων) Καθηγητής Τµήµατος Χηµείας Πανεπιστηµίου Πατρών Ματσούκας Ιωάννης Καθηγητής Τµήµατος Χηµείας Πανεπιστηµίου Πατρών Λιακοπούλου Κυριακίδου Μαρία Καθηγήτρια Τµήµατος Χηµικών Μηχανικών Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης Λοιπά Μέλη Επταµελούς Εξεταστικής Επιτροπής Πούλος Κωνσταντίνος Καθηγητής Τµήµατος Χηµείας Πανεπιστηµίου Πατρών Τσεγενίδης Θεόδωρος Καθηγητής Τµήµατος Χηµείας Πανεπιστηµίου Πατρών Μακρής Παντελής Αναπληρωτής Καθηγητής Τµήµατος Ιατρικής Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης Μαγκαφά Βασιλική Επίκουρη Καθηγήτρια Τµήµατος Φαρµακευτικής Πανεπιστηµίου Πατρών

3 Αντί προλόγου Ξεκίνησα να γράφω τη διδακτορική µου διατριβή το ζεστό καλοκαίρι του 2004, λίγο πριν το µεγάλο αθλητικό γεγονός της γενιάς µας, τους Ολυµπιακούς Αγώνες της Αθήνας. Ήξερα ήδη ότι το φθινόπωρο θα ντυνόµουν στο χακί και το είχα πάρει απόφαση πως έπρεπε να χρησιµοποιήσω το χρόνο της θητείας µου για τη συγγραφή της διατριβής. εν ήξερα βέβαια πόσα εµπόδια µπορεί να προκύψουν µέχρι το τέλος Ένα χρόνο µετά, και πολίτης ξανά, έφτασε η ώρα για την υποστήριξή της. Στην πορεία µέχρι εδώ δεν ήµουν µόνος. Υπήρχαν θεσµοί, πρόσωπα που στήριξαν την προσπάθειά µου όλα αυτά τα χρόνια. Σε όλους αυτούς χρωστώ πολλά και µεγάλα ευχαριστώ. Ιδιαίτερα, την Επιτροπή Ερευνών η οποία µε στήριξε οικονοµικά µε την υποτροφία Κ. Καραθεοδωρή για 3 ολόκληρα χρόνια. Χωρίς αυτήν την υποτροφία δεν ξέρω ακόµα αν θα είχα ολοκληρώσει τις σπουδές µου. Επίσης, οφείλω ένα µεγάλο ευχαριστώ στο Ίδρυµα Λεωνίδας Ζέρβας το οποίο µε τίµησε το 2002 µε το Ετήσιο Βραβείο του Ιδρύµατος. Για τον καθηγητή µου κ. Σταυρόπουλο Γεώργιο τι να πω, µε τιµά ιδιαίτερα η ένταξή µου στην ερευνητική του οµάδα. Κοντά του έµαθα πολλά για την χηµεία των πεπτιδίων αλλά πιο πολλά για το τι σηµαίνει ακαδηµαϊκός δάσκαλος. Είµαι πραγµατικά υπερήφανος που είναι ο επιβλέπων µου. Ευχαριστώ ακόµα τα µέλη της τριµελούς συµβουλευτικής επιτροπής, τον καθηγητή κ. Ματσούκα Ιωάννη (Τµήµα Χηµείας Πανεπιστηµίου Πατρών) και την καθηγήτρια κ. Λιακοπούλου Κυριακίδου Μαρία (Τµήµα Χηµικών Μηχανικών ΑΠΘ) για την βοήθειά τους και τις πολύτιµες συµβουλές τους στα πλαίσια της διδακτορικής µου διατριβής. Ευχαριστώ τα µέλη της επταµελούς εξεταστικής επιτροπής τα οποία µε τιµούν µε την παρουσία τους. Είµαι σίγουρος πως ο καθένας τους µε τις παρατηρήσεις του έχει να προσφέρει κάτι ξεχωριστό στη βελτίωση της διατριβής αυτής. Ειδικά ευχαριστώ τον αναπληρωτή καθηγητή αιµατολογίας κ. Μακρή Παντελή (Τµήµα Ιατρικής ΑΠΘ, νοσοκοµείο ΑΧΕΠΑ) ο οποίος έδειξε το αµέριστο ενδιαφέρον του από την πρώτη στιγµή της συνεργασίας µας. Χωρίς αυτόν και την επιστηµονική του οµάδα δεν θα µπορούσε να ολοκληρωθεί η διατριβή αυτή. Στο σηµείο αυτό, πρέπει να ευχαριστήσω τις κυρίες Πιθαρά Ελευθερία, Σπάρταλη Κατερίνα και Τσαβδαρίδου Βάσω

4 για την πολύτιµη βοήθειά τους και το χρόνο που αφιέρωσαν κατά τη διάρκεια των βιολογικών δοκιµών. Θέλω επίσης να ευχαριστήσω τον επίκουρο καθηγητή του Τµήµατος Φαρµακευτικής κ. Γεώργιο Σπυρούλια και τον υποψήφιο διδάκτορα Γαλανάκη Πέτρο για την βοήθειά τους στη λήψη και στην ανάλυση των φασµατοσκοπικών δεδοµένων MR. Σε όλους τους συνεργάτες του εργαστηρίου αλλά και του λοιπού ορόφου (πρώην και νυν) τους ευχαριστώ για την άψογη συνεργασία τους όλο αυτό το χρονικό διάστηµα. Και εάν έγινα κακός ορισµένες φορές µε κάποιους ελπίζω να µε έχουν ήδη συγχωρέσει. Οι τελευταίες λέξεις όπως πάντα είναι για τους δικούς µου ανθρώπους. Ευχαριστώ τους γονείς µου και την αδερφή µου για όλες τις θυσίες που έχουν κάνει όλα αυτά τα χρόνια για µένα. Τέλος, ευχαριστώ την ήµητρα η οποία στέκεται δίπλα µου όλα αυτά τα χρόνια στηρίζοντάς µε σε κάθε όµορφη και δύσκολη στιγµή που έζησα εντός και εκτός του εργαστηρίου. Σίγουρα της οφείλω παρά πολλά. Οδοιπόρε δεν υπάρχουν δρόµοι, τους δρόµους εσύ θα τους ανοίξεις µε το περπάτηµά σου. Ισπανική παροιµία

5 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ

6 Οι συντµήσεις που χρησιµοποιούνται στην παρούσα διατριβή έχουν προταθεί από την Επιτροπή Βιοχηµικής Ονοµατολογίας της ιεθνούς Ένωσης Καθαρής και Εφαρµοσµένης Χηµείας (IUPAC) [IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical omeclature (JCB), omeclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides, Recommendations, J.Peptide Science 12 (2006) και J.Pep Res 6s (2005). Συντµήσεις Αµινοξέων ΑΑ - Αµινοξύ Arg R Αργινίνη Asn Ασπαραγίνη Asp D Ασπαραγινικό Cys C Κυστεΐνη Gly G Γλυκίνη Leu L Λευκίνη Lys K Λυσίνη Pro P Προλίνη β-ala - β-αλανίνη Συντµήσεις Προστατευτικών Οµάδων Ac Acm Boc Bzl Bu t Clt DCA Et Fmoc Me Mmt Mob Mtt Ακέτυλο Αµεταµιδοµέθυλο Τριτοταγής βουτυλοξυκαρβονυλο Βένζυλο Τριτοταγής βούτυλο Χλωροτριφαινυλoµέθυλο (χλωροτρίτυλo) ικυκλοεξυλαµµώνιο άλας Αίθυλο 9-Φλουορενυλoµεθοξυκαρβόνυλo Μέθυλο 4-Μεθοξυτρίτυλο 4-Μεθοξυβένζυλo 4-Μεθυλοτρίτυλο

7 Bt p Pbf Pmc t-bu Tos Trt Z 1-Βενζοτριαζολύλ εστέρας 4-Νιτροφαινύλ εστέρας 2,2,4,6,7-Πενταµεθυλοδϊυδροφουρανο-5-σουλφονυλοµάδα 2,2,5,7,8-Πενταµεθυλο-χρωµανο-6-σουλφονυλο Τριτοταγής βουτυλο Τολουολοσουλφόνυλο Τριφαινυλοµέθυλο (τρίτυλο) Βενζυλοξυκαρβόνυλο Αντιδραστήρια ιαλύτες Abz ΑcC AcEt Ac 5-ASA Boc 2 BP 2-CLTR DCC DCM DCU DIC DIPEA DMF DMS DTT EDT Et 2 Fmoc-Su BTU FIP 2-Αµινοβενζοϊκό οξύ Ακετονιτρίλιο Οξικός αιθυλεστέρας Οξικό οξύ 5-Αµινοσαλικυλικό οξύ Τριτοταγής βουτυλοξυκαρβονυλο ανυδρίτης Εξαφθοροφωσφορικό άλας του βενζοτριαζολυλοξυ τρις - (διµεθυλαµινο) - φωσφονίου Χλωροτριτυλοχλωρίδιο ρητίνη Ν,Ν - ικυκλοεξυλοκαρβοδιϊµίδιο ιχλωροµεθάνιο Ν,Ν - ικυκλοεξυλουρία ιϊσοπροπυλοκαρβοδιϊµίδιο ιϊσοπροπυλαιθυλαµίνη Ν,Ν -διµεθυλοφορµαµίδιο ιµεθυλοσουλφοξείδιο ιθειοθρεϊτόλη Αιθανοδιθειόλη ιαιθυλαιθέρας Ηλεκτριµιδικός εστέρας της 9-φλουορενυλοµεθανόλης Εξαφθοροφωσφωρικό άλας της 2- βενζοτριαζολυλο-1,1,3,3- τετραµεθυλουρίας 1,1,1,3,3,3-Εξαφθορο-2-προπανόλη

8 At Bt MeC Me Et 3 MM i-pr ή 2- Pr PyBP TBTU ΤΕΑ TES TFA TFE TFMSA TF Tol 1-Υδροξυ-7-αζαβενζοτριαζόλιο 1-Υδροξυβενζοτριαζόλιο Ακετονιτρίλιο Μεθανόλη Τριαιθυλαµίνη Ν-Μεθυλοµορφολίνη 2-Προπανόλη Εξαφθοροφωσφορικό άλας του βενζοτριαζολυλοξυ-τριςπυρρολιδινο φωσφονίου Τετραφθοροβορικό άλας της 2-(1Η-βενζοτριαζολυλ)-1,1,3,3- τετραµεθυλουρίας Τριαιθυλαµίνη Τριαιθυλοσιλάνιο Τριφθοροξικό οξύ Τριφθοροαιθανόλη Τριφθοροµεθανοσουλφονικό οξύ Τετραϋδροφουράνιο Τολουόλιο Άλλες Συντµήσεις ASA Ακετυλοσαλικυλικό οξύ (Ασπιρίνη) CSY Correlated Spectroscopy (Φασµατοσκοπία Συσχέτισης) CX - 1 Κυκλοξυγενάση 1 CX - 2 Κυκλοξυγενάση 2 CVDs Cardiovascular Diseases (Καρδιοαγγειακές Ασθένειες) ESI Εlectron spray ionization (Ιονισµός µέσω ψεκασµού ηλεκτρονίων) FCC Flash Column Chromatography (Χρωµατογραφία Στήλης Ταχείας Ανάπτυξης) 5-G- ή 2-G- Γουανιδινοµάδα στην 5- ή στην 2- θέση του βενζοϊκού οξέος PLC igh Perfomance Liquid Chromatography

9 IR LDL LMW M.B. ΜS M.T. M.W. MR SAIDS RP-PLC RT SPPS TLC TCSY TRAP TXA2 UV vwf Σ.Τ. (Υγρή Χρωµατογραφία Υψηλής Επίδοσης) Infra Red (Φασµατοσκοπία Υπερύθρου) Low Density Lipoprotein (Χαµηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη) Low Molecular Weight eparins (Ηπαρίνες Χαµηλού Μοριακού Βάρους) Μοριακό Βάρος Mass Spectrometry (Φασµατοµετρία Μάζας) Μοριακό Τύπος Μοριακό Βάρος uclear Molecular Resonance (Φασµατοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισµού) on Steroidal Anti Inflammation Drugs Μη Στεροειδή Αναλγητικά Φάρµακα Reversed Phase PLC (Υγρή Χρωµατογραφία Υψηλής Επίδοσης Ανάστροφης Φάσης) Συνθήκες δωµατίου Solid Phase Peptide Synthesis (Σύνθεση Πεπτιδίων σε Στερεή Φάση) Thin Layer Chromatography (Χρωµατογραφία λεπτής στοιβάδας) Total Correlation Spectroscopy (Συνολική Φασµατοσκοπία Συσχέτισης) Thrombin Receptor Activation Peptide (Πεπτίδιο Ενεργοποίησης του Υποδοχέα της Θροµβίνης) Θροµβοξάνη Α2 Ultra Violet (Υπεριώδης ακτινοβολία) von Willebrand Factor Παράγοντας von Willebrand Σηµείο Τήξης

10 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ

11 ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ... 1 Βασικές Αρχές - Α Μέρος... 1 Α1 Γενικά για τις καρδιοαγγειακές ασθένειες (Cardio Vascular Diseases)... 1 A2 Αιµοπετάλια... 4 Α2.1 Προέλευση των αιµοπεταλίων και σχηµατισµός τους... 4 Α2.2 οµή των αιµοπεταλίων... 5 A3 Υποδοχείς των αιµοπεταλίων... 8 Α3.1 Ιντεγκρίνες (Integrins)... 9 Α3.2 Το σύµπλοκο GPIb-IX-V Α3.3 Ιντεγκρίνη α ΙΙb β A4 Αντιθροµβωτική Αγωγή Α4.1 Ανταγωνιστές του υποδοχέα α IIb β Α4.2 Αντιθροµβωτική θεραπεία και ασπιρίνη Βασικές Αρχές Β Μέρος Β1 Εισαγωγή Β2 Προστατευτικές Οµάδες Β2.1 Προστατευτικές οµάδες της α-αµινοµάδας Β2.2 Προστατευτικές οµάδες της α-καρβοξυλοµάδας Β2.3 Προστασία των πλευρικών δραστικών οµάδων των αµινοξέων Β2.3.1 Προστασία της α- και β- καρβοξυλοµάδας του Asp και γ- του Glu Β2.3.2 Προστασία της γουανιδινοµάδας της Arg Β2.3.3 Προστασία της ε-αµινοµάδας της Lys Β2.3.4 Προστασία της σουλφυδρυλοµάδας της Cys Β3 Μέθοδοι σχηµατισµού πεπτιδικού δεσµού Β3.1 Μέθοδος των καρβοδιϊµιδίων Β3.2 Μέθοδος των ανυδριτών B3.3 Μέθοδος των ενεργών εστέρων B3.4 Φωσφονικά και ουρονικά παράγωγα B4 Ρακεµίωση B5 Στρατηγικές πεπτιδικής σύνθεσης B6 Τεχνικές πεπτιδικής σύνθεσης Β6.1 Σύνθεση σε υγρή φάση Β6.2 Σύνθεση σε στερεή φάση (Solid Phase Peptide Synthesis) B7 Κυκλικά πεπτίδια... 48

12 Β7.1 Εισαγωγή Β7.2 Παραδείγµατα συνθετικών head to tail κυκλικών πεπτιδίων Β7.3 Μέθοδοι σύνθεσης ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Γ1 Συσκευές Όργανα Υλικά Γ2 Γενικές Μέθοδοι Γ2.1 Μέθοδος Σύνθεσης Fmoc-Ν α -αµινοξέων Γ2.2 Μέθοδος Σύνθεσης Boc-Ν α -αµινοξέων Γ2.3 Μέθοδος Αποµάκρυνσης της Boc-Ν α -οµάδας Γ2.4 Σύνθεση σε στερεή φάση Γ2.4.1 Εστεροποίηση Fmoc-Ν α -αµινοξέων επί της 2-CLTR Γ2.4.2 Αποµάκρυνση της Fmoc-Ν α προστατευτικής οµάδας Γ2.4.3 Ενεργοποίηση και σύζευξη των Fmoc-Ν α -αµινοξέων Γ2.4.4 ιαδικασία πλύσεων Γ2.4.5 Έλεγχος της πορείας µε Kaiser test Γ2.4.6 Έλεγχος της πορείας µε χρωµατογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC) Γ2.4.7 Εστεροποίηση του Rink-Bernatowicz Linker επί της 2-CLTR Γ2.4.8 Αποµάκρυνση πεπτιδίου από την ρητίνη Γ2.4.9 Σύζευξη του Σαλικυλικού οξέος ή παραγώγων του επί της 2-CLTR Γ Γενική µέθοδος ακετυλίωσης επί της 2-CLTR Γ Γενική µέθοδος γουανιδιλίωσης επί της 2-CLTR Γ2.5 Σύνθεση σε υγρή φάση Γ2.5.1 Μέθοδος σύζευξης µε µικτούς καρβοξυλικούς καρβονικούς ανυδρίτες Γ2.5.2 Σύνθεση κυκλικών πεπτιδίων µε πεπτιδικό δεσµό Γ2.5.3 Σύνθεση κυκλικών πεπτιδίων µε δισουλφιδικό δεσµό Γ3 Συνθέσεις Γ3.1 Συνθέσεις παραγώγων αµινοξέων Γ3.1.1 Σύνθεση της Fmoc-Gly Γ3.1.2 Σύνθεση της Fmoc-Leu Γ3.1.3 Σύνθεση της Fmoc-βAla Γ3.1.4 Σύνθεση της Fmoc-Pro Γ3.1.5 Σύνθεση της Fmoc-Arg( 2 ) Γ3.1.6 Σύνθεση της Fmoc-Asp(Bzl) Γ3.1.7 Σύνθεση του Cl Η-Asp(Me)

13 Γ3.1.8 Σύνθεση του Fmoc-Asp(Me) Γ3.1.9 Σύνθεση του Boc-Asn-Bzl Γ Σύνθεση του TFA Η-Asn-Bzl Γ3.2 Συνθέσεις παραγώγων σαλικυλικού οξέος Γ3.2.1 Σύνθεση του Fmoc-2-Amino Benzoic Acid Γ3.2.2 Σύνθεση του Fmoc-5-Αmino Salicylic Acid Γ3.2.3 Σύνθεση του Trt-thiosalicylic acid Γ3.3 Συνθέσεις Λοιπών Αντιδραστηρίων Γ3.3.1 Σύνθεση της, -bis Boc-thiourea Γ3.4 Συνθέσεις Πεπτιδίων Οξέων σε Στερεή Φάση Γ3.4.1 Σύνθεση του Ac-Arg-Gly-Asp Γ3.4.2 Σύνθεση του Ac-Arg-Gly-Asp(Bzl) Γ3.4.3 Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp Γ3.4.4 Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Me) Γ3.4.5 Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Βzl) Γ3.4.6 Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-Leu-Asp Γ3.4.7 Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-Leu-Asp(Me) Γ3.4.8 Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-Leu-Asp(Βzl) Γ3.5 Συνθέσεις Πεπτιδίων Αµιδίων σε στερεή φάση Γ3.5.1 Σύνθεση του Ac-Arg-Gly-Asp Γ3.5.2 Σύνθεση του Ac-Arg-Gly-Asp(Bzl) Γ3.5.3 Σύνθεση του Ac-Lys-Gly-Asp Γ3.5.4 Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp Γ3.5.5 Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) Γ3.5.6 Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Me) Γ3.5.7 Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-Leu-Asp Γ3.5.8 Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-Leu-Asp(Bzl) Γ3.5.9 Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-Leu-Asp(Me) Γ Σύνθεση του TFA -Arg-Leu-Asn Γ Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-Leu-Asn Γ Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-Gly-Asn Γ Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Lys-Gly-Asp(ΟBzl) Γ Σύνθεση του 5-Br-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp Γ Σύνθεση του 5-Br-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl)

14 Γ Σύνθεση του 5-Br-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Me) Γ Σύνθεση του 5-Cl-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp Γ Σύνθεση του 5-Cl-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) Γ Σύνθεση του 5-Cl-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Me) Γ Σύνθεση του C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp Γ Σύνθεση του 5-Ν 2-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) Γ Σύνθεση του 5-C 3-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) Γ Σύνθεση του 5-Η 2-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) Γ Σύνθεση του 2-Me-C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) Γ Σύνθεση του 2-S-C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) Γ Σύνθεση του 2-Η 2 -C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) Γ Σύνθεση του 2-Αc-C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) Γ Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-β-Ala-Asp(Bzl) Γ Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-Gly-Asn-Bzl Γ Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg(ΝΟ 2 )-Gly-Asp(Bzl) Γ Σύνθεση του 2-Ac-C 6 4 -C-Arg(ΝΟ 2 )-Gly-Asp(Bzl) Γ3.6 Συνθέσεις Πεπτιδίων Αµιδίων σε στερεή φάση Γ3.6.1 Σύνθεση του 5-G-2--C 6 3 -C-Gly-Asp(Bzl) Γ3.6.2 Σύνθεση του 5-G-2--C 6 3 -C-βAla-Asp(Bzl) Γ3.6.3 Σύνθεση του 2-G-C 6 4 -C-Gly-Asp(Bzl) Γ3.6.4 Σύνθεση του 2-G-C 6 4 -C-βΑla-Asp(Bzl) Γ3.7 Συνθέσεις κυκλικών πεπτιδίων Γ3.7.1 Σύνθεση του 5-Η-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp Γ3.7.2 Σύνθεση του 5-Η-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) Γ3.7.3 Σύνθεση του 2-S-C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp-Cys Γ3.7.4 Σύνθεση του 2-S-C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl)-Cys Γ4 Βιολογικές οκιµές Γ4.1 Προετοιµασία των αιµοπεταλίων Γ4.2 Μέτρηση της συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων Γ4.3 Έκφραση της βιολογικής δραστικότητας σε τιµές IC Γ4.4 Η Κυτταροµετρία ροής σε ενεργοποιηµένα αιµοπετάλια

15 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ - ΣΚΟΠΟΣ ΕΚΠΟΝΗΣΗΣ ΤΗΣ ΙΑΤΡΙΒΗΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γενικά Συνθέσεις Πεπτιδίων σε Στερεή Φάση Πεπτίδια - Οξέα Πεπτίδια Αµίδια Πεπτίδια Αµίδια µε ενσωµατωµένο γουανιδινο σαλικυλικό οξύ Κυκλικά Πεπτίδια Κυκλικά Ανάλογα RGD Πεπτίδια µέσω σχηµατισµού αµιδικού δεσµού Κυκλικά RGD Πεπτίδια µέσω σχηµατισµού δισουλφιδικού δεσµού Βιολογική Αξιολόγηση των συντεθέντων αναλόγων Έλεγχος της συσσωµάτωσης ανθρωπίνων αιµοπεταλίων Έλεγχος της συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων για τις ενώσεις Έλεγχος της συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων για τις ενώσεις Έλεγχος της συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων για τις ενώσεις Έλεγχος της συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων για τις ενώσεις Έλεγχος της συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων για τις ενώσεις Έλεγχος της συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων για τις ενώσεις Έλεγχος της συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων για τις ενώσεις Έλεγχος της συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων για τις ενώσεις Αποτελέσµατα της Κυτταροµετρίας ροής Αποτελέσµατα της Κυτταροµετρίας ροής για το ανάλογο Αποτελέσµατα της Κυτταροµετρίας ροής για το ανάλογο Αποτελέσµατα της Κυτταροµετρίας ροής για το ανάλογο Αποτελέσµατα της Κυτταροµετρίας ροής για το ανάλογο Αποτελέσµατα της Κυτταροµετρίας ροής για το ανάλογο Αποτελέσµατα της Κυτταροµετρίας ροής για το ανάλογο Αποτελέσµατα της Κυτταροµετρίας ροής για το ανάλογο Αποτελέσµατα της Κυτταροµετρίας ροής για το ανάλογο Συζήτηση Συµπεράσµατα Συµπεράσµατα από τη βιολογική µελέτη των συντεθέντων αναλόγων..191 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 194 SUMMARY

16 εν υπάρχει κατηγορία επιστήµης που να µπορεί να ονοµαστεί "εφαρµοσµένη επιστήµη". Υπάρχει επιστήµη και οι εφαρµογές της Επιστήµης, συνδεδεµένες όπως "ο καρπός µε το δένδρο που το καρποφορεί". Louis Pasteur

17 ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ

18 Βασικές Αρχές - Α Μέρος Α1 Γενικά για τις καρδιοαγγειακές ασθένειες (Cardio Vascular Diseases) Τις τελευταίες δεκαετίες αυξάνονται παγκοσµίως οι χρόνιες εκφυλιστικές (degenerative) ασθένειες, όπως τα καρδιακά νοσήµατα και ο καρκίνος. Οι καρδιοαγγειακές ασθένειες (CVDs) είναι ασθένειες οι οποίες επηρεάζουν την οµαλή λειτουργία της καρδιάς και των αγγείων. ι πιο σηµαντικές είναι η υπέρταση (Ηypertension), το έµφραγµα του µυοκαρδίου (Μyocardial Ιnfarction), οι εγκεφαλοαγγειακές παθήσεις (Cerebrovascular Diseases), τα αιφνίδια ισχαιµικά επεισόδια (Transient Ischemic Attacks), η καρδιακή ανεπάρκεια και η ρευµατική καρδιακή ασθένεια (Rheumatic eart Disease). Περίπου δεκαεπτά εκατοµµύρια άνθρωποι το ένα τρίτο των θανάτων παγκοσµίως- πεθαίνουν ετησίως από καρδιοαγγειακές ασθένειες, κυρίως καρδιακά εµφράγµατα και εγκεφαλικά επεισόδια 1. Επτά εκατοµµύρια θάνατοι οφείλονται σε έµφραγµα του µυοκαρδίου, ενώ έξι εκατοµµύρια σε εγκεφαλοαγγειακές βλάβες και περίπου τέσσερα εκατοµµύρια σε άλλου είδους καρδιακές παθήσεις. Επιπλέον είκοσι εκατοµµύρια άνθρωποι επιζούν ενός εµφράγµατος ή ενός ισχαιµικού εγκεφαλικού επεισοδίου, απαιτείται όµως αυξηµένο κόστος κλινικής παρακολούθησης, το οποίο δυσχεραίνει την ήδη δύσκολη οικονοµική κατάσταση των ασφαλιστικών ταµείων και των ταµείων υγείας. Ένας ουσιώδης αριθµός των θανάτων αυτών σχετίζεται µε το κάπνισµα, το οποίο τριπλασιάζει τον κίνδυνο θανάτου από έµφραγµα της στεφανιαίας αρτηρίας ή εγκεφαλοαγγειακό επεισόδιο. Επίσης η έλλειψη φυσικής άσκησης και η κακή διατροφή αποτελούν σηµαντικούς παράγοντες για θάνατο από καρδιοαγγειακές παθήσεις. Αντιθέτως τα καρδιακά νοσήµατα µειώνονται ως και 50% σε ανθρώπους οι οποίοι σταµάτησαν το κάπνισµα και ελαττώνεται σηµαντικά η συχνότητα εµφάνισης καρδιοαγγειακών παθήσεων δύο χρόνια µετά τη διακοπή του. Οι καρδιοαγγειακές ασθένειες δεν αφορούν µόνο τον ανεπτυγµένο κόσµο αλλά και τον αναπτυσσόµενο και τρίτο κόσµο. Περίπου το 80% όλων των θανάτων από τέτοιου είδους ασθένειες παρατηρούνται στις αναπτυσσόµενες και στις χαµηλού και µεσαίου εισοδήµατος χώρες. Υπολογίζεται ότι το 2010 στις αναπτυσσόµενες χώρες οι καρδιοαγγειακές ασθένειες θα αποτελούν την κύρια αιτία θανάτου. 1 World ealth rganization, Global Strategy on Diet, Physical Activity and ealth, W 2003

19 ιεθνώς γίνεται µια µεγάλη σε έκταση έρευνα σχετική µε τους παράγοντες δηµιουργίας καρδιοαγγειακών παθήσεων, µε την πρόληψή τους και τη φαρµακευτική αντιµετώπισή τους. Η αυξηµένη χρήση των αντιθροµβωτικών αντανακλάται στις διεθνείς πωλήσεις τέτοιων προϊόντων - US $ 9,1 δισεκατοµµύρια για το 2001 και πρόβλεψη να φτάσει στα US $ 22 δισεκατοµµύρια µέχρι το Στο γράφηµα που ακολουθεί φαίνονται οι πωλήσεις αντιαιµοπεταλιακών φαρµάκων για την τριετία και ο ετήσιος ρυθµός αύξησής τους για την ίδια τριετία. Εικόνα Α1. Γράφηµα πωλήσεων αντιαιµοπεταλιακών φαρµάκων για την τριετία Η αύξηση της ηλικίας του πληθυσµού, οι αλλαγές στις διατροφικές συνήθειες, η αναγνώριση της σηµασίας της αντιθροµβωτικής θεραπείας στην πρόληψη των καρδιοαγγειακών παθήσεων φαίνεται να συντελούν στην περαιτέρω ανάπτυξη της αγοράς αντιθροµβωτικών φαρµάκων. Καθώς η γνώση της βιολογίας του αιµοπεταλίου (κοινή παραδοχή πλέον ότι είναι ο κυρίαρχος παράγοντας στην αιµόσταση και στην θρόµβωση) αυξάνεται, νέες θεραπείες µε βάση αυτή τη γνώση αναπτύσσονται για την αναστολή των κυτταρικών του λειτουργιών. Ο χαρακτηρισµός νέων υποδοχέων στην επιφάνεια των αιµοπεταλίων 2 Birch, S. The Cardiovascular utlook to 2007 (DataMonitor, PLC, Reuters Business Insight, London, UK, 2002). 3 Jackson, S. & Schoenwaelder, S. ature Reviews Drug Discovery, 2 (2003) 775

20 οδηγεί συνεχώς στην ανάπτυξη νέων µέσων για την αντιµετώπιση της συγκόλλησης των αιµοπεταλίων 4. 4 Bhatt, D. & Topol, E. ature Reviews Drug Discovery, 2 (2003) 15

21 A2 Αιµοπετάλια Στις προηγούµενες δεκαετίες τα αιµοπετάλια αναδείχθηκαν ως η κρίσιµη οντότητα η οποία ήταν υπεύθυνη για τις καρδιοαγγειακές ασθένειες. Αν και αρχικά είχε θεωρηθεί ως ένας απλός συµπαράγοντας στην αιµόσταση, πλέον είναι ξεκάθαρο ότι αποτελεί τον παράγοντα «κλειδί» τόσο για την θρόµβωση όσο και την φλεγµονή. Κανένας άλλος τύπος απλού κυττάρου δεν είναι υπεύθυνος για τόσο µεγάλο αριθµό θανάτων των ανθρώπων, όπως είναι το αιµοπετάλιο. Κατά συνέπεια αποτελεί κύριο στόχο των ερευνητών η πλήρης εξακρίβωση όλων των κυτταρικών του λειτουργιών. Α2.1 Προέλευση των αιµοπεταλίων και σχηµατισµός τους Αν και είναι παγκοσµίως αποδεκτό ότι τα αιµοπετάλια προέρχονται από τα µεγακαρυοκύτταρα, οι µηχανισµοί µε τους οποίους αυτά σχηµατίζονται και ελευθερώνονται από τα πρόδροµα αυτά κύτταρα παραµένουν αδιευκρίνιστοι. Οι µηχανισµοί αυτοί αποτέλεσαν πόλο έλξης για τους ερευνητές αιµατολόγους για πάνω από ένα αιώνα. Κατά τη διάρκεια του αιώνα αυτού έχουν προταθεί ποικίλα µοντέλα (εικόνα Α2.1). Τρία είναι τα κυρίαρχα 5. Εικόνα Α2.1 Προτεινόµενα µοντέλα για την παραγωγή των αιµοπεταλίων 5 5 Italiano, J. & artwig, J. in Platelets (ed. Michelson, A.D.) (Academic, San Diego, USA, 2002)

22 Το πρώτο προτείνει τον κυτταροπλασµατικό θρυµµατισµό διαµέσου του οροθετικού µεµβρανικού συστήµατος (Demarcation Membrane System). Στο µοντέλο αυτό το DMS οριοθετεί προκαθορισµένες περιοχές για τα αιµοπετάλια µέσα στο µεγακαρυοκυτταρικό κυτταρόπλασµα. Τα αιµοπετάλια σχηµατίζονται όταν το κυτταρόπλασµα τεµαχίζει τις γραµµές του DMS. Το δεύτερο µοντέλο προτείνει την ανάπτυξη των αιµοπεταλίων. Στο µοντέλο αυτό τα αιµοπετάλια αποκόβονται από κοιλότητες που προεξέχουν στην περιφέρεια του µεγακαρυοκυττάρου. Το τρίτο µοντέλο προτείνει το σχηµατισµό πρόδροµων αιµοπεταλίων. Το µοντέλο αυτό προτείνει το σχηµατισµό των αιµοπεταλίων µέσω ενδιαµέσων πρόδροµων δοµών, οι οποίες είναι µακριές κυτταροπλασµατικές προεκτάσεις προσδεµένες στο µεγακαρυοκύτταρο µε λεπτές κυτταροπλασµατικές λωρίδες. Στο µοντέλο αυτό το DMS λειτουργεί πρωτίστως ως δεξαµενή για την προέκταση των πρόδροµων αιµοπεταλίων. Αν και τα µεγακαρυοκύτταρα είναι αυξηµένα στο µυελό των οστών µπορούν να µεταναστεύουν µέσω της κυκλοφορίας του αίµατος και κατά συνέπεια ο σχηµατισµός των αιµοπεταλίων µπορεί να γίνει και εκτός του µυελού των οστών. Έτσι µπορούν να σχηµατισθούν σε διάφορους ιστούς, συµπεριλαµβανοµένου και του µυελού των οστών, στους πνεύµονες και στο αίµα. Συγκεκριµένες φάσεις της ανάπτυξης των αιµοπεταλίων έχουν παρατηρηθεί και στις τρεις περιπτώσεις 5. Α2.2 οµή των αιµοπεταλίων οµή του αιµοπεταλίου σε κατάσταση ηρεµίας (Resting Platelet) Τα αιµοπετάλια ελευθερώνονται από τα µεγακαρυοκύτταρα έχοντας επίπεδο δισκοειδές σχήµα µε διαστάσεις ~ 3.0 µε 0.5 µm και συνήθως κυκλοφορούν στο αίµα ~ 7 µέρες. Η επιφάνεια του δίσκου είναι χωρίς ιδιαίτερα χαρακτηριστικά, χωρίς προεξοχές εκτός από τις κοιλότητες της µεµβράνης, οι οποίες είναι οι είσοδοι ενός εσωτερικού συστήµατος µικροσωληνίσκων το επονοµαζόµενο «ανοικτό διαµήκες σύστηµα», (pen Canalicular System) 6. Οι σωληνίσκοι αυτοί είναι ηµιεκλεκτικοί, επιτρέποντας σε µικρά µόρια να εισέλθουν στο εσωτερικό του αιµοπεταλίου αλλά παρεµποδίζουν την είσοδο µεγαλύτερων πρωτεϊνών, όπως τα αντισώµατα. Γύρω από την αιµοπεταλιακή µεµβράνη βρίσκεται ο «γλυκοκάλυκας». Αυτός περιέχει γλυκοπρωτεΐνες, γλυκολιπίδια και προσροφηµένες πρωτεΐνες του πλάσµατος. Είναι λεπτός (15-20 nm) και αρνητικά φορτισµένος. Το επιφανειακό αυτό φορτίο οφείλεται σε 6 arwig, J. in Platelets (ed. Michelson, A.D.) (Academic, San Diego, USA, 2002)

23 µόρια του σιαλικού οξέος και είναι εκείνος ο παράγοντας που δεν επιτρέπει στα αιµοπετάλια να έρθουν σε επαφή µεταξύ τους. Αλληλεπιδρά µε διάφορους ενεργοποιητές των αιµοπεταλίων προκειµένου να επιτευχθεί η συσσωµάτωση και η συγκόλλησή τους. Μέσα στο κυτταρόπλασµα βρίσκονται µικρά ειδικά κοκκία και κανονικά κυτταρικά οργανίδια όπως µιτοχόνδρια, λυσοσωµάτια, µικροϋπεροξυσωµάτια και υπολείµµατα του πυκνού ενδοπλασµατικού δικτύου. Τα κοκκία είναι δύο τύπων: τα α-κοκκία και τα πυκνά σωµάτια. Τα α-κοκκία είναι τα µεγαλύτερα από τους δύο τύπους (0,2 0,4 µm διάµετρος), αποθηκεύουν συγκολλητικές πρωτεΐνες και έχουν γλυκοπρωτεϊνικούς υποδοχείς βυθισµένους στις περιοριστικές µεµβράνες τους, οι οποίοι προάγουν την προσκόλληση των αιµοπεταλίων και του επιθηλιακού ιστού. Ειδικότερα οι P-σελεκτίνες (P-selectins), οι οποίες δεν εκφράζονται στην επιφάνεια του αιµοπεταλίου σε ηρεµία, αποθηκεύονται στις µεµβράνες των α-κοκκίων ως ένα µέρος των κυρίων συγκολλητικών υποδοχέων, της γλυκοπρωτεΐνης GP Ib-IX-V (υποδοχέας του παράγοντα Von Willebrand, VWf) και της ιντεγκρίνης (integrin) α IIb β 3 (υποδοχέας για το ινωδογόνο). Τα πυκνά σωµάτια είναι ο δεύτερος τύπος κοκκίων. Κάθε αιµοπετάλιο περιέχει µικρό αριθµό από αυτά, τα οποία έχουν διάµετρο ~ 0,15 µm. Τα πυκνά σωµάτια έχουν την µεγαλύτερη ηλεκτρονική πυκνότητα από όλα τα σωµατίδια των αιµοπεταλίων. Μεταφέρουν διαλυτές µορφές της διφωσφορικής αδενοσίνης ADP και σεροτονίνης καθώς και µια µικρή ποσότητα P-σελεκτίνες. Ο αιµοπεταλιακός κυτταροσκελετός του αιµοπεταλίου σε ηρεµία αποτελείται από τρία κύρια δοµικά στοιχεία: ένα δίκτυο από νηµάτια ακτίνης, η οποία βρίσκεται σε όλη την έκταση του κυτταροπλάσµατος, ένα σπείραµα από µικροσωληνίσκους στην επιφάνεια των αιµοπεταλίων και ένα µεµβρανικό σκελετό, ο οποίος περιλαµβάνει µικρά νηµάτια ακτίνης τα οποία βρίσκονται κάτω από την επιφάνεια της πλασµατικής µεµβράνης. οµή του ενεργοποιηµένου αιµοπεταλίου (Activated Platelet) Η φυσιολογική λειτουργία των αιµοπεταλίων είναι να ανιχνεύουν την ύπαρξη του κατεστραµµένου κυτταρικού τοιχώµατος του αγγείου του αίµατος. Αυτό επιτυγχάνεται µε την έκφραση επιφανειακών υποδοχέων οι οποίοι αναγνωρίζουν εκλυόµενα συστατικά του συνδετικού ιστού ή / και εκλυόµενους από ενδοθηλιακά και άλλα κύτταρα του συνδετικού ιστού διαλυτούς παράγοντες. Όταν το αγγείο καταστραφεί, τα αιµοπετάλια ανταποκρίνονται ακαριαία. Προσκολλώνται, αλλάζουν σχήµα και απλώνονται σε όλη την κατεστραµµένη περιοχή. Η ενεργοποίηση περιλαµβάνει προκαθορισµένες

24 αποκρίσεις του αιµοπεταλίου: α) έκκριση ουσιών και παραγόντων, εµφάνιση των υποδοχέων συγκόλλησης στην επιφάνεια του αιµοπεταλίου και έκκριση ουσιών υπευθύνων για την ενεργοποίηση και προσέλκυση και άλλων αιµοπεταλίων και λευκοκυττάρων από το αίµα, β) ενεργοποίηση του βιοχηµικού µονοπατιού της βιοσύνθεσης της Θροµβοξάνης Α2 και γ) ενεργοποίηση των ιντεγκρινών (integrins) 7 και κυρίως της σπουδαιότερης ίσως ιντεγκρίνης, του υποδοχέα α IΙb β 8 3. Ο υποδοχέας α IΙb β 3 βρίσκεται σε µεγαλύτερη αφθονία στην επιφάνεια των αιµοπεταλίων αλλά διατηρείται σε ανενεργή κατάσταση κατά τη διάρκεια της κυκλοφορίας των αιµοπεταλίων στο αίµα. Με την ενεργοποίηση των αιµοπεταλίων εκκρινόµενες ουσίες από το εσωτερικό του αιµοπεταλίου αλλάζουν την διαµόρφωση του α IΙb β 3 επιτρέποντας την δέσµευση του προσδέτη (ligand). Η αλλαγή του σχήµατος των αιµοπεταλίων είναι µια πολυσύνθετη διαδικασία η οποία εξαρτάται από τις κυτταροπλασµατικές δυναµικές του πολυµερούς της ακτίνης 9. Το µη ενεργό αιµοπετάλιο για να απλωθεί πρέπει να αναδιατάξει τον κυτταροσκελετό του και να σχηµατίσει νέα νήµατα ακτίνης. Έτσι οι πρωτεΐνες οι οποίες κανονίζουν την αρχιτεκτονική της ακτίνης είναι αυτές που ελέγχουν πλέον την αλλαγή του σχήµατος των αιµοπεταλίων. Στην εικόνα Α2.2 φαίνεται η ενεργοποίηση και το άπλωµα ενός αιµοπεταλίου. Εικόνα Α2.2 οµικές αλλαγές οι οποίες συµβαίνουν στην επιφάνεια του αιµοπεταλίου 5 Το πρώτο γεγονός το οποίο παρατηρείται είναι η αλλαγή του δισκοειδούς σχήµατος σε σφαιρικό. Αµέσως µετά, από την επιφάνεια του αιµοπεταλίου αρχίζουν να 7 Ginsberg, M.., Du, X., and Plow, E. Curr. pin. Cell Biol., 4 (1992) Shattil, S., oxie, J., Cunningham, M., and Brass, L. J. Biol. Chem., 260 (1985) Fox, J. and Phillips, D., ature, 292 (1981) 650

25 αναπτύσσονται προεκτάσεις (φιλοπόδια) και τελικά το αιµοπετάλιο αποκτά µια επίπεδη µορφή. Καθώς το αιµοπετάλιο αποκτά αυτή τη µορφή τα κοκκία και άλλα µικροοργανίδια συµπιέζονται στο κέντρο του αιµοπεταλίου παίρνοντας τη µορφή του «τηγανητού αυγού». A3 Υποδοχείς των αιµοπεταλίων Σε αντίθεση µε την πλειοψηφία των κυττάρων, τα αιµοπετάλια δεν έχουν πυρήνα και για το λόγο αυτό δεν µπορούν να προσαρµοστούν σε διάφορες καταστάσεις µε de novo σύνθεση πρωτεϊνών. Αναγκάζονται λοιπόν να µοιράζονται µε άλλα κύτταρα πολλούς βιολογικούς µηχανισµούς, π.χ. κυτταροπλασµατικά ένζυµα, µόρια µεταγωγής σήµατος, συστατικά του κυτταροσκελετού, κτλ. Έτσι τα αιµοπετάλια είναι εφοδιασµένα µε ένα ευρύ φάσµα ετοίµων µορίων, ικανών να συµµετάσχουν σε ποικίλες φυσιολογικές λειτουργίες και να εµπλακούν σε παθολογικά φαινόµενα. Ένας τρόπος να συµβεί αυτό είναι µέσω των υποδοχέων οι οποίοι βρίσκονται ή εκφράζονται στην επιφάνεια των αιµοπεταλίων. Επιπλέον εξαιτίας του σχετικά µικρού µεγέθους των αιµοπεταλίων, οι µεµβρανικές πρωτεΐνες τους απαντούν σε µεγαλύτερο ποσοστό στην κυτταρική µάζα σε σχέση µε τις πρωτεΐνες άλλων κυττάρων. Οι υποδοχείς των αιµοπεταλίων συνδέτες των αιµοπεταλίων µε τον εξωκυττάριο χώρο καθορίζουν την ενεργοποίηση των αιµοπεταλίων από ένα ευρύ φάσµα αγωνιστών και συγκολλητικών πρωτεϊνών. Επειδή η κύρια λειτουργία των αιµοπεταλίων είναι η αιµόσταση, δεν εκπλήσσει το γεγονός ότι οι περισσότεροι υποδοχείς εµπλέκονται άµεσα στην ενεργοποίηση των αιµοπεταλίων ή αλληλεπιδρούν µε το κατεστραµµένο κυτταρικό τοίχωµα ή µε άλλα αιµοπετάλια για να σχηµατίσουν θρόµβο. Η ποικιλία των διαφορετικών υποδοχέων, οι οποίοι εµπλέκονται στην διαδικασία της αιµόστασης, δείχνει την σηµασία που διαδραµατίζουν στις λειτουργίες του αιµοπεταλίου και τους τρόπους που διαθέτουν τα αιµοπετάλια προκειµένου να λειτουργήσουν ικανοποιητικά σε διάφορες καταστάσεις. Η διαφορά µεταξύ φυσιολογικής αιµόστασης και παθολογικής θρόµβωσης είναι πολύ µικρή και επιπλέον συνεχώς αναγνωρίζεται η εµπλοκή των αιµοπεταλίων σε άλλες λειτουργίες, πχ στην φλεγµονή, στο ανοσοποιητικό σύστηµα, στην ανάπτυξη καρκινικών όγκων και στην µετάστασή τους, κτλ. Το γεγονός ότι υπάρχουν περίπου /µL αιµοπετάλια ενώ για την αποφυγή αιµορραγίας επαρκούν µόλις 10000/µL πιθανόν να υποδηλώνει την συµµετοχή των αιµοπεταλίων και σε άλλες λειτουργίες.

26 Τα τελευταία χρόνια γίνονται εντατικές έρευνες στην κατανόηση της λειτουργία των υποδοχέων και στην συµµετοχή τους σε διάφορες κυτταρικές διεργασίες. Οι κυριότεροι υποδοχείς των αιµοπεταλίων είναι οι ιντεγκρίνες (integrins), οι υποδοχείς της Θροµβίνης, οι P-σελεκτίνες (P-selectins) και υποδοχείς για τους παράγοντες συγκόλλησης. Α3.1 Ιντεγκρίνες (Integrins) Οι ιντεγκρίνες είναι η κύρια τάξη συγκολλητικών πρωτεϊνών οι οποίες είναι παρούσες σε πολλούς τύπους κυττάρων. Είναι µέλη της µεγάλης οικογένειας των γλυκοπρωτεϊνών, οι οποίες βρίσκονται στην επιφάνεια των κυττάρων, απαραίτητες για την συγκόλληση µεταξύ κυττάρου κυττάρου και κυττάρου εξωκυττάριου ιστού. Στην πραγµατικότητα το όνοµα «ιντεγκρίνες» επινοήθηκε για να εκφράσει το ρόλο αυτών των υποδοχέων στην ένωση (integration) εξωκυττάριων συγκολλητικών ουσιών µε κυτταροσκελετικά δοµικά υλικά του αιµοπεταλίου και των κυττάρων γενικότερα. Συνήθως βρίσκονται σε δύο καταστάσεις, χαµηλής και υψηλής ενέργειας, οι οποίες εναλλάσσονται είτε από την επίδραση αγωνιστών είτε από τη φωσφορυλίωση των κυτταροπλασµατικών τους περιοχών. Σαν ετεροδιµερείς πρωτεΐνες αποτελούνται από δύο υποµονάδες α και β. Έχουν αναφερθεί και ταυτοποιηθεί δεκαεννέα α και οκτώ β υποµονάδες, αν και µόνο ένας µικρός αριθµός συνδυασµών υψηλής σηµασίας έχει παρατηρηθεί 10. Τα αιµοπετάλια έχουν τρεις οικογένειες ιντεγκρινών (β 1, β 2 και β 3 ) και συνολικά έξι διαφορετικές ιντεγκρίνες: α 2 β 1, α 5 β 1, α 6 β 1, α L β 2, α ΙΙb β 3 και α v β Clemetson, K. in Platelets (ed. Michelson, A.D.) (Academic, San Diego, USA, 2002) 11 Breton,., Plow, E., Topol, E., JACC, 28 (1996) 1643

27 Εικόνα Α3.1α Σχηµατική αναπαράσταση των κυρίων υποδοχέων που εµπλέκονται στην προσκόλληση και συγκόλληση των αιµοπεταλίων 11 β 1 οικογένεια ιντεγκρινών Περιλαµβάνει τις ιντεγκρίνες α 2 β 1, α 5 β 1 και α 6 β 1. Η α 2 β 1 είναι η δεύτερη πιο σπουδαία ιντεγκρίνη του αιµοπεταλίου. Είναι γνωστή και ως GP Ia-IIa και στα λεµφοκύτταρα σαν VLA2 12. Η α 2 β 1 είναι χαρακτηρισµένη ως η «ιντεγκρίνη του κολλαγόνου». Υπάρχουν µόνο αντίγραφά της στο αιµοπετάλιο ενώ εµφανίζεται σε ένα ευρύ πεδίο άλλων κυττάρων. Εικόνα Α3.1β Μοντέλο της α 2 β 1 ιντεγκρίνης 10 Οι α 5 β 1 και α 6 β 1 ιντεγκρίνες πιστεύεται ότι είναι οι υποδοχείς της ινοσυνδετίνης (fibronectin) και της λαµινίνης (laminin) αντίστοιχα και ο ρόλος τους είναι επικουρικός στα σηµεία στα οποία έχει διαρραγεί το κυτταρικό τοίχωµα 13,14. β 2 οικογένεια ιντεγκρινών Για ένα µεγάλο χρονικό διάστηµα οι ερευνητές θεωρούσαν ότι τα αιµοπετάλια δεν εκφράζουν τις β 2 ιντεγκρίνες. Αργότερα η α L β 2 ιντεγκρίνη ανιχνεύθηκε στην επιφάνεια 12 Staatz, W., Rajpara, S., Wayner, E., Carter, W., Santoro, S., J. Cell. Biol., 108 (1989) Piotrowicz, S., rchekowski, R., ugent, D., Yamada, K., Kunicki, T., J. Cell. Biol., 106 (1988) Sonnenberg, A., Moddermann, P., ogervorst, F., ature, 336 (1988) 487

28 ενεργοποιηµένων αιµοπεταλίων. Αντίθετα στην επιφάνεια ανενεργών αιµοπεταλίων δεν παρατηρήθηκε κάτι αντίστοιχο. Έτσι προτάθηκε η θεωρία ότι εκφράζεται στην επιφάνεια των κοκκίων 15. β 3 οικογένεια ιντεγκρινών Περιλαµβάνει δυο από τις πιο σπουδαίες ιντεγκρίνες. Τις α ΙΙb β 3 και α v β 3. Η α ΙΙb β 3 αναλύεται παρακάτω. Αξίζει όµως να αναφερθεί ότι είναι η µοναδική ιντεγκρίνη η οποία εµφανίζεται αποκλειστικά στα αιµοπετάλια. Αποτελεί την κύρια ιντεγκρίνη των αιµοπεταλίων και υπάρχει στην επιφάνεια των αιµοπεταλίων σε αντίγραφα. Όταν είναι απούσα ή υπολειτουργεί οδηγεί στην θροµβοασθένεια Glanzmann. άλλη ιντεγκρίνη της οικογένειας αυτής, η α v β 3, είναι παρούσα στα αιµοπετάλια σε πολύ µικρά ποσά (µερικές εκατοντάδες) και ο ρόλος της µέχρι τώρα δεν έχει πλήρως διευκρινιστεί. Σε άλλα κύτταρα είναι ο υποδοχέας της υαλοσυνδετίνης (vitronectin) 16. Μόλις πριν τρία χρόνια βρέθηκε η κρυσταλλική δοµή της εξωκυττάριας περιοχής της ιντεγκρίνης αυτής 17. Α3.2 Το σύµπλοκο GPIb-IX-V Τα αιµοπετάλια και ο παράγοντας Von Willebrand (VWF) κυκλοφορούν στο αίµα χωρίς να αλληλεπιδρούν µεταξύ τους. Η κατάσταση αυτή αλλάζει δραµατικά όταν ένα αγγείο τραυµατιστεί και η αιµοστατική απόκριση ενεργοποιηθεί. Στις συνθήκες αυτές τα αιµοπετάλια προσδένονται στο πληγέν αγγείο µέσω της αλληλεπίδρασης του συµπλόκου GPIb-IX-V και του VWF 18. Ο µηχανισµός της προσκόλλησης δεν είναι πλήρως διευκρινισµένος ενώ υπάρχουν ενδείξεις ότι κατά την προσκόλληση αυτή πιθανόν να αλλάζουν διαµορφώσεις τόσο το σύµπλοκο GPIb-IX-V όσο και ο VWF ή ένας από τους δυο παράγοντες της προσκόλλησης ώστε να επιτευχθεί η µέγιστη δυνατή πρόσδεση 19. Μελέτες µε µεταλλαγµένα κύτταρα, τα οποία εκφράζουν το σύµπλοκο GPIb-IX-V και την ιντεγκρίνη α ΙΙb β 3, επιπλέον έδειξαν ότι η αλληλεπίδραση GP Ibα-VWF δηµιουργεί διαµεµβρανικά σήµατα επαρκή να ενεργοποιήσουν τον α ΙΙb β 3 υποδοχέα και µε τον τρόπο αυτό τα αιµοπετάλια είναι ικανά να συγκολληθούν και να 15 Philippeaux, M., Vesin, C., Tacchini-Cottier, F., Piguet, P., Eur. J. aematol., 56 (1996) Pytela, R., Pierschbacher, M., Ruoslahti, E., Proc. atl. Acad. Sci. USA, 82 (1985) Xiong, J., Stehle, T., Diefenbach, B., Zhang, R., Dunker, R., Scott, D., Joachimiak, A., Goodman, S., Arnaout, M., Science, 294 (2001) Lopez, J. and Berndt, M., in Platelets (ed. Michelson, A.D.) (Academic, San Diego, USA, 2002) 19 Siedlecki, A., Lestini, B., Kottke-Marchant, K., Eppell, S., Wilson, D., Marchant, R., Blood, 88 (1996) 2939

29 προσκολληθούν σταθερά στο τραυµατισµένο κυτταρικό τοίχωµα 20. Πρόσφατες επίσης µελέτες έδειξαν ότι η αλληλεπίδραση GPIb-IX-V-VWF παίζει σηµαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των θρόµβων, ειδικότερα στην ανάπτυξη των αιµοπεταλίων στην αρχική επιφάνεια προσκόλλησης 21. οµή του συµπλόκου GP Ib-IX-V Το σύµπλοκο GP Ib-IX-V περιέχει τέσσερις διακριτές υποµονάδες, κάθε µια από τις οποίες εκτείνεται στην διφασική λιπιδική επιφάνεια του πλάσµατος. Οι δύο υποµονάδες της GP Ib συνδέονται µεταξύ τους µε δισουλφιδικό δεσµό (GP Ibα και GP Ibβ) και συµπλέκονται µη οµοιοπολικά µε τις υποµονάδες GP IX και GP V σε αναλογία 2:2:2:1 22. Οι υποµονάδες GP Ibα (610 αµινοξέα), GP Ibβ (181 αµινοξέα), GP IΧ (160 αµινοξέα) και GP V (544 αµινοξέα) είναι µέλη της οικογένειας των επαναλαµβανόµενων λευκινών (Leucine Rich Repeat Family). Αν και η τοποθέτηση των υποµονάδων στο χώρο δεν είναι πλήρως ξεκάθαρη, έχει προταθεί µια χωροδιάταξη βασιζόµενη στις µέχρι στιγµής σχέσεις µεταξύ των υποµονάδων. Εικόνα Α3.2 Πρόσδεση του vwf στο σύµπλοκο GP Ib-IX-V και έναρξη της ενεργοποίησης του GP IIb- IIIa 22 CaM, calmodulin; LRRs, leucine-rich repeats (open boxes); S, sulfated tyrosine sequence. 20 Yap, C., ughan, S., Cranmer, S., esbitt, W., Rooney, M., Giuliano, S., Kulkarni, S., Dopheide, M., Yuan, Y., Salem,., Jackson, S., J. Biol. Chem., 275 (2000) Wu, P., Vink, T., Schiphorst, M., Van Zanten, G., Ijsseldijk, M., De Groot, P., Sixma, J., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 20 (2000) Andrews, K., Lopez, J., & Berndt, M., IJBCB, 29 (1997) 91

30 Περίπου αντίγραφα των υποµονάδων GP Ibα, GP Ibβ και GP IΧ βρίσκονται στην επιφάνεια των αιµοπεταλίων µε περίπου τα µισά των περισσοτέρων αντιγράφων να είναι της GP V υποµονάδας 23. Ο αριθµός αυτός µπορεί να διαφέρει ανάλογα µε τον γoνότυπο του κάθε ανθρώπου εξαιτίας του πολυµορφισµού για το γονίδιο του GP Ibα. Κάθε υποµονάδα του συµπλόκου αυτού χαρακτηρίζεται από την ύπαρξη επαναλαµβανόµενων περιοχών πλουσίων σε λευκίνη (LRR) µε περίπου 24 αµινοξέα η κάθε µια. Η GP Ibα έχει επτά τέτοιες περιοχές, η GP Ibβ και η GP IX µία η κάθε µια τους και η GP V περιέχει Η παρουσία των αλληλουχιών αυτών προσδιορίζει ότι κάθε πολυπεπτίδιο του συµπλόκου ανήκει σε µια προσκολλητική υποοµάδα της οικογένειας των πλουσίων σε λευκίνη πρωτεϊνών (LRRF). Επιπλέον στα τέσσερα υδρόφοβα τµήµατα, οι GP Ibβ και GP IX υποµονάδες συγκρατώνται στην µεµβράνη του αιµοπεταλίου µε παλµιτιλίωση στα κατάλοιπα κυστεΐνης στο κέντρο της επιφάνειας του αιµοπεταλίου 18. Α3.3 Ιντεγκρίνη α ΙΙb β 3 Μια από τις πιο αξιοσηµείωτες ιδιότητες των αιµοπεταλίων είναι ότι µέσα σε λίγα δευτερόλεπτα από την διέγερσή τους από έναν αγωνιστή αποκτούν την ικανότητα να προσκολλώνται και να συσσωρεύονται. Η ικανότητα αυτή οφείλεται σε ένα ειδικό υποδοχέα στην επιφάνεια των αιµοπεταλίων, τον GP IIb/IIIa. Τα «ήρεµα» αιµοπετάλια περιέχουν περίπου αντίγραφα του υποδοχέα αυτού. Αποτελείται από δύο υποµονάδες συνδεµένες µεταξύ τους. Η GP IIb (α ΙΙb ) υποµονάδα περιέχει 1008 αµινοξέα και η GP IIIa (β 3 ) 762 αµινοξέα αντίστοιχα. Το κύριο µέρος κάθε υποµονάδας είναι εξωκυττάριο, µε µια µεµβρανική περιοχή να συνδέεται µε µια µικρή κυτταροπλασµατική ουρά αποτελούµενη από 20 και 47 αµινοξέα για την α IIb και β 3 αντίστοιχα 25. Μελέτες µε ηλεκτρονική µικροσκοπία έχουν προτείνει ότι το ετεροδιµερές α ΙΙb β 3 αποτελείται από µια σφαιρική κεφαλή στο Ν-τελικό του άκρο συνδεδεµένη σε 2 ραβδοειδείς ουρές στο C-τελικό 23 Modderman, P., Admiraal, L., Sonnenberg, A., Von de Borne, A., J. Biol. Chem., 267 (1992) Lopez, J., Blood Coagul. Fibrinolysis, 5 (1994) Takaaki,., Ginsberg, M., Shattil, J., in Platelets (ed. Michelson, A.D.) (Academic, San Diego, USA, 2002)

31 άκρο. Η σφαιρική κεφαλή περιέχει την θέση πρόσδεσης ενώ η ουρά περιέχει την κυτταροπλασµατική περιοχή. Εικόνα Α3.3α Σχηµατική απεικόνιση της ιντεγκρίνης α ΙΙb β 3 28 Υποµονάδα GP IIb (α ΙΙb ) Η υποµονάδα GP IIb έχει µοριακή µάζα ~136 kda και αποτελείται από δύο αλυσίδες συνδεδεµένες µε δισουλφιδικό δεσµό, την GP IΙbα (Μ r ~125 kda) και την GP IΙbβ (Μ r ~25 kda). -τελική πλευρά της υποµονάδας περιέχει ~440 αµινοξέα και αποτελείται από 7 επαναλαµβανόµενες περιοχές των 60 περίπου αµινοξέων. Η κυτταροπλασµατική ουρά της α IIb υποµονάδας έχει µια αλληλουχία GFFKR στην µεµβρανική της περιοχή και η αλληλουχία αυτή απαντάται σε όλες τις υποµονάδες α στις ιντεγκρίνες. Αποµάκρυνση της αλληλουχίας αυτής ή σηµειακή µετάλλαξη της αλληλουχίας «κλειδώνει» την ιντεγκρίνη α ΙΙb β 3 σε µια υψηλής συγγένειας κατάσταση, η οποία δεν απαιτεί µεταβολική ενέργεια 26. Επιπλέον, ένα τροποποιηµένο λιποπεπτίδιο, το οποίο περιλαµβάνει την αλληλουχία GFFKR εισχωρεί στην αιµοπεταλιακή µεµβράνη και κινητοποιεί την ενεργοποίηση του α ΙΙb β Η GP IIb υποµονάδα προσδένεται στην µεµβράνη του αιµοπεταλίου µε την β-αλυσίδα, η οποία περιέχει µια αλυσίδα 26 Toole, T., Mandelman, J., Forsyth, J., Shattil, J., Plow, E., Ginsberg, M., Science, 254 (1991) Vinogradova,., aas, T., Plow, E., Qin, J., Proc. atl. Acad. Sci. USA, 97 (2000) 1450

32 20 αµινοξέων. Η GP IΙbα έχει τέσσερις µη γειτονικές θέσεις πρόσδεσης ιόντων Ca 2+ (12 αµινοξέων η κάθε αλληλουχία), µία από τις οποίες τουλάχιστον παίζει κεντρικό ρόλο στην πρόσδεση του ινωδογόνου. Επίσης οι κυτταροπλασµατικές ουρές των υποµονάδων πιθανόν να εµπλέκονται και να σχηµατίζουν µια δεύτερη θέση δέσµευσης η οποία να αναγνωρίζει ενδοκυττάρια µηνύµατα και µόρια του κυτταροσκελετού 28. Υποµονάδα GP IIΙα (β 3 ) β 3 υποµονάδα (95 kda), σε αντίθεση µε την α IIb υποµονάδα, αποτελείται από 762 αµινοξέα µε µια εξωκυττάρια περιοχή ~692 αµινοξέων, ~25 αµινοξέα να αποτελούν την διαµεµβρανική περιοχή και 45 αµινοξέα να βρίσκονται στο κυτταρόπλασµα. Η εξωκυττάρια περιοχή της β 3 υποµονάδας αποτελείται από τρεις κύριες περιοχές. Μια PSI περιοχή, µια I-like περιοχή και µια EGF-like περιοχή. Η PSI περιοχή περιέχει µια υποµονάδα 90 αµινοξέων άγνωστης µέχρι στιγµής λειτουργίας, η οποία έχει βρεθεί και σε άλλες οικογένειες πρωτεϊνών (plexins, semaphorins). Αυτή η περιοχή εντοπίζεται στο Ν-τελικό άκρο της πλούσιας σε κυστεΐνες περιοχή στην β 3 υποµονάδα και φαίνεται να έχει δοµή α-έλικας 29. Η PSI περιοχή και η ΕGF-like περιοχή στο χώρο βρίσκονται πάρα πολύ κοντά εξαιτίας ενός δισουλφιδικού δεσµού ανάµεσα στον C5 και στον C435. ιάσπαση του δεσµού αυτού οδηγεί στην ενεργοποίηση του α ΙΙb β Στην Ι-like περιοχή εντοπίζεται και η περιοχή δέσµευσης του κατιόντος, πιθανή περιοχή πρόσδεσης του δεσµευτή, και αναφέρεται ως MIDAS (Metal Ion Dependent Adhesion Site). Η περιοχή Ι-like ακολουθείται από µια σειρά πλούσια σε κυστεΐνη περιοχή, την EGF-like περιοχή. Αυτή η περιοχή δεν είναι απαραίτητη για την έκφραση του α ΙΙb β 3 και δεν περιέχει θέσεις δέσµευσης. Πιθανόν αυτή η περιοχή να παίζει ένα ρυθµιστικό ρόλο στην πρόσδεση των δεσµευτών. 28 Topol, E., Byzova, T., Plow, E., The Lancet, 353 (1999) Liu, C., Sun, Q., Wang, R., Paddock, C., ewman, P., Blood, 90 (1997) 573

33 Η κεντρική περιοχή της ουράς της β 3 υποµονάδας περιέχει µια αλληλουχία (LLITID) η οποία παρατηρείται και στις άλλες β υποµονάδες ενώ απουσία ή σηµειακή µετάλλαξη της αλληλουχίας αυτής µετατρέπει την ενεργή α ΙΙb β 3 σε µια ανεξαρτήτου ενέργειας συµπεριφορά. Αυτή η περιοχή φαίνεται να αλληλεπιδρά µε την αλληλουχία GFFKR της α IIb β 3 µέσω ενός ιοντικού δεσµού σχηµατίζοντας µια περιοριστική δοµή η οποία διατηρεί την α IIb β 3 σε µια χαµηλής συγγένειας διαµόρφωση 30. Λειτουργία του α IIb β 3 υποδοχέα Ο α IIb β 3 υποδοχέας µπορεί να δεσµεύει διάφορες συγκολλητικές γλυκοπρωτεΐνες, όπως το ινωδογόνο, το κολλαγόνο, ο παράγοντας von Willebrand (VWF), η ινοσυνδετίνη, η υαλοσυνδετίνη κ.α. Κοινό χαρακτηριστικό γνώρισµα όλων αυτών των πρωτεϊνών είναι η αλληλουχία αργινίνη-γλυκίνη-ασπαραγινικό (Arg-Gly-Asp). Την αλληλουχία αυτή την αναγνωρίζουν και άλλες ιντεγκρίνες όπως η α v β 3. Το ινωδογόνο περιέχει τέσσερις αλληλουχίες RGD, µία στο Ν-τελικό άκρο (Αα ) και µία στο C-τελικό άκρο (Αα ) κάθε µιας από τις α-αλυσίδες. Η ιντεγκρίνη α IIb β 3 αναγνωρίζει επίσης στο C-τελικό άκρο της γ-αλυσίδας του ινωδογόνου ένα δωδεκαπεπτίδιο 31, LGGAKQAGDV, g , το οποίο ανταγωνίζεται µε το RGD για την πρόσδεση στον α IIb β 3. Ο VWF περιέχει την RGD αλληλουχία στο C-τελικό άκρο ( ), η οποία είναι και υπεύθυνη 32 για την πρόσδεση στον α IIb β 3. Υπάρχουν δύο κύριες περιοχές οι οποίες έχουν ταυτοποιηθεί σαν περιοχές δέσµευσης: α) η θεωρούµενη β-έλικα στην α IIb υποµονάδα και β) η I-like περιοχή στην β 3 υποµονάδα. Νεότερες έρευνες δεικνύουν πως οι δύο αυτές περιοχές πιθανόν να δρουν αλλοστερικά µε την περιοχή εκείνη η οποία αναγνωρίζει το δωδεκαπεπτίδιο του ινωδογόνου 33. Στην ανενεργή κατάστασή του τα αιµοπετάλια δεν µπορούν να δεσµεύσουν το ινωδογόνο από το πλάσµα ή τον VWF, ακόµα και αν αυτοί οι παράγοντες βρίσκονται σε υψηλή συγκέντρωση. Η ενεργοποίηση των αιµοπεταλίων προάγει την υψηλή συγγένεια του υποδοχέα για τους δεσµευτές. Επίσης η δέσµευση του VWF απαιτεί πρωταρχική διέγερση η οποία προέρχεται από την αλληλεπίδραση µεταξύ του VWF και του GP Ib-IX ή από άλλους διαλυτούς αγωνιστές 34. Ο υποδοχέας α IIb β 3 προάγει την προσκόλληση 30 ughes, P., Toole, T., Ylane, J., Shattil, S., Ginsberg, M., J. Biol. Chem., 270 (1995) Kloczewiak, M., Timmons, S., awiger, J., Biochem. Biophys. Res. Commun., 107 (1982) Lam, S., Plow, E., Smith, M., J. Biol. Chem., 262 (1987) McKay, B., Annis, D., onda, S., Christie, D., Kunicki, T., J. Biol. Chem., 271 (1996) Savage, B., Saldivar, E., Ruggeri, Z., Cell, 84 (1996) 289

34 των αιµοπεταλίων σε ακινητοποιηµένο ινωδογόνο και ινώδες χωρίς πρωταρχική ενεργοποίηση. Η ειδική πρόσδεση των αγωνιστών στους υποδοχείς των αιµοπεταλίων προάγει την ενδοµοριακή δηµιουργία µηνυµάτων. Τέτοια σήµατα µεταφέρονται στην κυτταροπλασµατική περιοχή του α IIb β 3 και ενεργοποιούν τον υποδοχέα στην εξωκυττάρια περιοχή. Ένας «καταρράκτης» δευτερογενών µηνυµάτων οδηγεί στην δηµιουργία αυτού που ονοµάζεται σηµατοδότηση «inside-out», το τελικό βήµα του οποίου δεν είναι πλήρως διευκρινισµένο. Η κατάληψη του υποδοχέα από αγωνιστές δεν οδηγεί µόνο στην συγκόλληση των αιµοπεταλίων αλλά δηµιουργεί και µια νέα σηµατοδότηση «outside-in». Εικόνα Α3.3β Μεταβατικές καταστάσεις της ιντεγκρίνης α ΙΙb β 3 στα αιµοπετάλια 28 Συµπερασµατικά, οι λειτουργίες του «inside-out» και «outside-in» οδηγούν στην ταχεία ανάπτυξη των θρόµβων, οι οποίοι αντιστέκονται στην απόσπασή τους από το τραυµατισµένο κυτταρικό τοίχωµα. Σίγουρα, περαιτέρω διερεύνηση των βιοχηµικών µονοπατιών που εµπλέκονται στο φαινόµενο της θρόµβωσης θα οδηγήσει στην πλήρη κατανόηση του φαινοµένου και στην φαρµακευτική του αντιµετώπιση της παθολογικής του µορφής.

35 A4 Αντιθροµβωτική Αγωγή Η αντιθροµβωτική αγωγή που ακολουθείται στις µέρες µας περιλαµβάνει δυο κύριες κατηγορίες αντιθροµβωτικών σκευασµάτων. Τα αντιαιµοπεταλιακά και τα αντιθροµβινικά σκευάσµατα. Τα πρώτα αναστέλλουν τη συγκόλληση των αιµοπεταλίων, ενώ τα δεύτερα τη δηµιουργία θροµβίνης και το σχηµατισµό ινώδους. Εικόνα Α4α ράση καθιερωµένων γνωστών αντιθροµβωτικών φαρµάκων 35 Τα καθιερωµένα αντιθροµβωτικά σκευάσµατα, ασπιρίνη, κουµαρίνες, χαµηλού µοριακού βάρους ηπαρίνες (LMW), αν και χρησιµοποιούνται ακόµη και σήµερα έχουν αρκετές παρενέργειες. Οι παρενέργειες αυτές αποτέλεσαν την ώθηση για την παρασκευή και ανάπτυξη νέων αντιθροµβωτικών σκευασµάτων. Στην ανάπτυξη των νέων αυτών σκευασµάτων οι ερευνητές χρησιµοποίησαν πλειάδα νέων τεχνικών, µεταξύ αυτών την τεχνολογία ανασυνδυασµένου DA, άντλησαν πληροφορίες µε MR µελέτες και οδηγήθηκαν στη σύνθεση µορίων µε βάση το λογικό σχεδιασµό, και κυρίως κατόρθωσαν να περιορίσουν τις κυριότερες παρενέργειες, τις αιµορραγίες και την θροµβοκυτταροπενία. Τα κυριότερα νέας γενιάς ή υπό εξέλιξη αντιθροµβωτικά σκευάσµατα είναι: Ανταγωνιστές του υποδοχέα α IIb β 3 Θειενοπυριδίνες (ανταγωνιστές του υποδοχέα της διφωσφορικής αδενοσίνης, ADP) Αναστολείς της δράσης της Θροµβίνης Αναστολείς του παράγοντα Xa 35 irsh, J., Weitz, J., The Lancet, 353 (1999) 1431

36 Αναστολείς του παράγοντα ΙXa Αναστολείς του µονοπατιού της πρωτεΐνης C Αναστολείς του µονοπατιού του παράγοντα VIIa (ιστικός παράγοντας) Γενικότερα, το µεγαλύτερο πρόβληµα που έχουν να αντιµετωπίσουν οι ερευνητές είναι το πολυσύνθετο πρόβληµα της δηµιουργίας των θρόµβων. Για το λόγο αυτό µέχρι σήµερα σε πάρα πολλές κλινικές δοκιµές νέων φαρµακευτικών σκευασµάτων δεν δοκιµάζονται µόνο οι νεοσυντιθέµενες ουσίες αλλά και ο συνδυασµός τους µε παλαιότερες ουσίες περιορισµένης αντιθροµβωτικής δράσης 36,37. Α4.1 Ανταγωνιστές του υποδοχέα α IIb β 3 Ο υποδοχέας α IIb β 3 αναγνωρίζει δυο πεπτιδικές αλληλουχίες του ινωδογόνου: α) το τριπεπτίδιο RGD (Arg-Gly-Asp), το οποίο αναγνωρίζεται και από άλλες ιντεγκρίνες 38, και β) η αλληλουχία KQAGDV η οποία είναι τµήµα του δωδεκαπεπτιδίου της γ-αλυσίδας του ινωδογόνου. Πρέπει να σηµειωθεί εδώ ότι το δωδεκαπεπτίδιο αυτό είναι απαραίτητο για την πρόσδεση του ινωδογόνου στον υποδοχέα 39. Αν και ο VWF και η ινοσυνδετίνη (fibronectin) δεν έχουν αυτή την αλληλουχία, πεπτιδικές αλληλουχίες οι οποίες διαθέτουν το RGD τριπεπτίδιο ανταγωνίζονται µε µικρότερα πεπτίδια, τα οποία περιέχουν και αυτά την αλληλουχία RGD για την πρόσδεσή τους στον υποδοχέα 40,41. Μέχρι σήµερα, τρεις ανταγωνιστές του α IIb β 3 έχουν εγκριθεί από τον FDA (Food and Drug Administration) για κλινική χρήση. Αυτοί είναι ένα χιµαιρικό αντίσωµα (Abxicimab), ένα κυκλικό επταπεπτίδιο (Integrillin) και ένα µη πεπτιδικό µόριο (Tirofiban). 42 Πίνακας Α4.1 Φαρµακολογικά Χαρακτηριστικά των Ανταγωνιστών του α IIb β 3 Χαρακτηριστικά Abxicimab Tirofiban Eptifibatide Χηµικά Αντίσωµα Οργανικό µόριο Πεπτίδιο Πρόσδεση στον υποδοχέα Μη αναστρέψιµη Αναστρέψιµη Αναστρέψιµη Μοριακή Μάζα ~45000 Da 495 Da 832 Da Χρόνος ηµιζωής στο πλάσµα 10 min 2h 2h Χρόνος ηµιζωής στο σώµα 6-12h <4h <4h 36 Fareed, J., oppensteadt, D., Walenga, J., Bick, R., Medical Clinics of orth America, 78 (1994) Fareed, J., Callas, D., oppensteadt, D., Walenga, J., Bick, R., Medical Clinics of orth America, 82 (1998) Pierschbacher, M., Ruoslahti, E., ature, 309 (1984) 39 Plow, E., Srouji, A., Meyer, D., Marguerie, G., Ginsberg, M., J. Biol. Chem., 259 (1984) Santoro, S., Lawing, W., Cell, 48 (1987) Farrell, D., Thiagarajan, P., J. Biol. Chem., 269 (1994) Agah, R., Plow, E., Topol, E., in Platelets (ed. Michelson, A.D.) (Academic, San Diego, USA, 2002)

37 Εδώ θα πρέπει να τονιστεί ότι και οι τρεις αυτοί ανταγωνιστές είναι σε ενέσιµη µορφή και αποτελούν µερικά από τα πιο σύγχρονα όπλα στην προληπτική αντιθροµβωτική αγωγή. Το Abxicimab είναι ένα χιµαιρικό µονοκλωνικό αντίσωµα το οποίο αναπτύχθηκε από τον Coller και τους συνεργάτες του και αποτελεί το πρώτο σκεύασµα αυτού του είδους 43. Προέρχεται από την ένωση των Fab τµηµάτων του µονοκλωνικού αντισώµατος από ποντικό, 7Ε3, µε το Fc τµήµα ανθρώπινης ανοσοσφαιρίνης. Η συγγένειά του και η εξειδίκευσή του για τον υποδοχέα α IIb β 3 είναι πολύ υψηλή και εξαιτίας αυτής µπορεί να προκαλεί διάλυση του θρόµβου αποσπώντας το ινωδογόνο από τον υποδοχέα α IIb β 3. Εικόνα Α4.1α Χαρακτηριστικές δοµές του µονοκλωνικού αντισώµατος του Coller 43 To tirofiban είναι µια συνθετική ουσία η οποία σχεδιάστηκε στα ερευνητικά εργαστήρια της Merck ώστε να µιµείται την δοµή του RGD πεπτιδίου 44. Έχει µοριακή µάζα µόλις 495 Da και προσδένεται στον υποδοχέα αντιστρεπτά σε µια αναλογία ~250:1. Tirofiban MK383 S 2 Bu Εξαιτίας της αντιστρεπτής αυτής πρόσδεσης, η αντιαιµοπεταλιακή του δράση σταµατά λίγες ώρες µετά την χορήγησή του. Αυτό αποτελεί ένα ισχυρό πλεονέκτηµα έναντι των αιµορραγικών επεισοδίων. Η Eptifibatide (Integrillin) είναι ένα συνθετικό πεπτίδιο, το οποίο σχεδιάστηκε και συντέθηκε από την CR Therapeutics µε βάση τη βαρβουρίνη (barbourin), µια ντισιντεγκρίνη (disintegrin) η οποία βρίσκεται στο δηλητήριο των εχιδνών Coller, B., J. Clin. Invest., 99 (1997) artman, G., Egbertson, M., alczenko, W., Laswell, W., Duggan, M., Smith, R., aylor, A., Manno, P., Lynch, R., Zhang, G., Chang, C., Gould, R., J. Med. Chem., 35 (1992) Scarborough, R., Rose, J., su, M., Phillips, D., Fried,V., Campbell, A., annizzi, L., Charo, I., J. Biol. Chem., 266 (1991) 9359

38 2 S S 2 Eptifibatide (Integrillin) Χαρακτηριστικό του πεπτιδίου αυτού είναι ότι περιέχει την αλληλουχία KGD αντί της RGD και πιθανόν γι αυτό να µη δεσµεύεται σε άλλες ιντεγκρίνες. Η πρόσδεση στον υποδοχέα είναι αναστρέψιµη µέσα σε 4h µετά την χορήγησή του. Αποβάλλεται από τον οργανισµό µέσω της νεφρικής οδού, όπως και το tirofiban. Η ταυτοποίηση της RGD αλληλουχίας ως φαρµακοφόρου οµάδας αποτέλεσε το πρώτο βήµα της ανάπτυξης πεπτιδικού µοντέλου για λογικό σχεδιασµό. Έτσι λοιπόν διάφοροι ερευνητές οδηγήθηκαν στο συµπέρασµα ότι η εισαγωγή µιας υδρόφοβης οµάδας στο C-τελικό άκρο της αλληλουχίας αυξάνει την ανασταλτική δράση 46,47,. Το γεγονός ότι τα γραµµικά πεπτίδια είναι γενικά ευαίσθητα στις ενδοπεπτιδάσες αλλά και ότι τα κυκλικά πεπτίδια αποκτούν µικρότερη ευκινησία λόγω των περιοριστικών διαµορφώσεων που αποκτούν, οδήγησε αρκετούς ερευνητές στη σύνθεση κυκλικών πεπτιδίων, τα οποία περιέχουν στην αλληλουχία τους την τριπλέτα RGD 48,49. Όλα σχεδόν τα κυκλικά πεπτίδια τα οποία συντέθηκαν είχαν αρκετά υψηλότερη αντισυγκολλητική δράση σε σχέση µε τα αντίστοιχα γραµµικά. Άλλοι ερευνητές προκειµένου να δώσουν στα πεπτίδιά τους µεγαλύτερη βιοδιαθεσιµότητα τα προσκόλλησαν πάνω σε βιολογικές εξέδρες, συνήθως κάποιο σάκχαρο 50,51. Από όλα όµως τα συντεθέντα πεπτίδια µόνο η Eptifibatide έχει περάσει όλες τις κλινικές δοκιµές και διατίθεται εµπορικά στην αγορά. 46 jima, I., Chakravarty, S., Dong, Q., Bioorg. Med. Chem., 3 (1995) Scarborough, R., aughton, M., Teng, W., Rose, J., Phillips, D., annizzi, L., Arfsten, A., Campbell, A., Charo, I., J. Biol. Chem., 268 (1993) Annis, Α., elluin, Ο., Jacobsen, Ε, Angew. Chem. Int. Ed. 37 (1998) Bogdanowich-Knipp, S., Chakrabarti, S., Williams, T., Dillman, R., Siahaan, T., J. Peptide Res, 53 (1999) Scarborough, R., Gretler, D., J. Med. Chem., 43 (2000) Van Well, R, verkleeft,., Van der Marel, G., Bruss, D., Thibault, G., De Groot, P., Van Boom, J., verhand, M., Bioorg. Med. Chem. Lett., 13 (2003) 331

39 Α4.2 Αντιθροµβωτική θεραπεία και ασπιρίνη Το Ακετυλοσαλικυλικό Οξύ (ασπιρίνη) είναι µια συνθετική ουσία µε αντιπυρετική, αναλγητική, αντιφλεγµονώδη και αντιαιµοπεταλιακή δράση. Αποτελεί ίσως το πιο ευρέως χρησιµοποιούµενο φαρµακευτικό σκεύασµα µε ποικίλες φαρµακευτικές εφαρµογές. Τα σαλικυλικά χρησιµοποιούνται θεραπευτικά για πάνω από 2400 χρόνια. Ο Ιπποκράτης πρώτος κατέγραψε την ευεγερτική δράση των φύλλων της ιτιάς έναντι του πόνου και του πυρετού, ενώ ο Γαληνός ανακάλυψε τις αντιπυρετικές και αντιφλεγµονώδεις ιδιότητές τους 52. Για τις δυο επόµενες χιλιετίες διάφορες φυσικές πηγές σαλικυλικών χρησιµοποιήθηκαν για την θεραπεία ποικίλων ασθενειών. Το 1763, ο αιδεσιµότατος Edward Stone ανέφερε σε ένα γράµµα του στον κόµη του Macclesfield την επιτυχία του να θεραπεύσει 50 ασθενείς από πυρετό χρησιµοποιώντας σκόνη από φλοιό ιτιάς 53. Τον επόµενο αιώνα, διάφορα παράγωγα συνθετικών σαλικυλικών ενώσεων χρησιµοποιήθηκαν σαν αναλγητικά ή αντιπυρετικά, αν και η συχνή τους χρήση προκαλούσε πολλές παρενέργειες, κυρίως γαστρικού είδους. Το Ακετυλοσαλικυλικό Οξύ αφού συντέθηκε από διάφορους ερευνητές µεταξύ 1850 και 1860, επανασχεδιάστηκε η σύνθεσή του από τον Felix offman το 1897 και διατέθηκε προς πώληση από την Bayer το Η δηµιουργία της ασπιρίνης άλλαξε τα δεδοµένα της Salicylic Acid C CC 3 C Acetylosalicylic Acid ιατρικής και οδήγησε στη δηµιουργία ενός φαρµάκου που µπήκε σε όλα σχεδόν τα ανθρώπινα σπίτια σε παγκόσµια κλίµακα. Οι ευεγερτικές δράσεις της ασπιρίνης ως αντιθροµβωτικό σκεύασµα αναγνωρίστηκαν περίπου στα µέσα του εικοστού αιώνα, όταν ο Gibson ανέφερε ότι χρησιµοποιώντας ασπιρίνη κατάφερε να θεραπεύσει µια µικρή οµάδα ασθενών του, οι οποίοι υπέφεραν από αγγειακές ασθένειες 54. Την ίδια εποχή ο Craven ανέφερε ότι η ασπιρίνη προστατεύει τους ασθενείς έναντι του εµφράγµατος του µυοκαρδίου και της καρδιακής προσβολής 55. Το 1971 ο John Vane δηµοσίευσε την ανακάλυψη του µηχανισµού δράσης της ασπιρίνης στις προσταγλανδίνες 56. Η ανασταλτική δράση της ασπιρίνης στη βιοσύνθεση των προσταγλανδινών και της Θροµβοξάνης Α2 (ΤΧΑ 2 ) από αραχιδονικό οξύ βασίζεται στην µη αντιστρεπτή ακετυλίωση µιας σερίνης (Ser 530 ) στο ενεργό κέντρο του ενζύµου κυκλοοξυγενάση-1 52 Gross, M., Greenberg, L., ew aven (1945), Conn: illhouse Press 53 Stone, E., Philo. Trans. R. Soc. Lond. 53 (1763) Gibson, P., Lancet 2 (1949) Craven, L., Miss. Valley Med. J. 78 (1956) Vane, J., at ew Biol 231 (1971) 232

40 (CX-1) και την σερίνη (Ser 516 ) στην κυκλοοξυγενάση-2 (CX-2) 57,58, ~170 φορές είναι πιο ισχυρή η αναστολή της CX-1 από την αναστολή της CX-2 59, ενώ παρουσία ασπιρίνης η CX-1 είναι τελείως ανενεργή και η CX-2 µετατρέπει το αραχιδονικό οξύ σε 15-R-εικοσιτετραενοϊκό οξύ (15-R-ETE). Είναι πλέον βέβαιο ότι οι αντιφλεγµονώδεις ιδιότητες της ασπιρίνης οφείλονται στην αναστολή της CX-2 ενώ η αναστολή της CX-1 οδηγεί στην εµφάνιση της αντιθροµβωτικής δράσης της 60. Επίσης, η αναστολή της CX-1 σχετίζεται µε την δηµιουργία βλαβών στα νεφρά, έλκος στο βλενογόνο του στοµάχου ενώ µειώνει την αιµόσταση και οδηγεί σε αιµορραγικά επεισόδια. Παράλληλα µε την αναστολή της βιοσύνθεσης της ΤΧΑ2 και άλλοι µηχανισµοί συνεισφέρουν στην αντιθροµβωτική δράση της ασπιρίνης. Τα ουδετερόφιλα αναστέλλουν την ενεργοποίηση των αιµοπεταλίων µέσω µιας διαδικασίας η οποία φαίνεται να εξαρτάται από τον µηχανισµό του µονοξειδίου του αζώτου ()/cgmp. Με την αναστολή της σύνθεσης προστακυκλινών στα κύτταρα του ενδοθηλίου, ένα γεγονός το οποίο αυξάνει την παραγωγή ΝΟ, πιθανόν να ενισχύεται η αντιθροµβωτική δράση της ασπιρίνης 61. Επιπλέον, σε υψηλές δόσεις, η ασπιρίνη µειώνει την δηµιουργία θροµβίνης και προάγει την ινωδόλυση, όµως στις συνήθεις κλινικές δόσεις τέτοια φαινόµενα δεν έχουν παρατηρηθεί 62. Πέρα των αντιθροµβωτικών της ιδιοτήτων, η ασπιρίνη φαίνεται να εµπλέκεται και στην θεραπεία καρδιοαγγειακών δυσλειτουργιών. Φαίνεται να επηρεάζει την παθογένεση της αθηρωσκλήρωσης προστατεύοντας την λιποπρωτεΐνη LDL από την οξείδωση και βελτιώνει την δυσλειτουργία του ενδοθηλίου στα αθηρωσκληρωτικά αγγεία. Ο σαφής µηχανισµός για τα παραπάνω δεν έχει εξακριβωθεί αλλά όλοι οι ερευνητές συγκλίνουν στη θεωρία της αντιοξειδωτικής δράσης της 63. Η ασπιρίνη όµως έχει και αρκετά µειονεκτήµατα και φυσικά δεν είναι ικανή από µόνη της να αναστείλει τη δηµιουργία θρόµβου και αυτό διότι η δηµιουργία του θρόµβου είναι ένα πολυδιάστατο πρόβληµα. Επίσης έχουν παρατηρηθεί σε όλες τις κλινικές µελέτες 57 Roth G., Majerus, P. J Clin Invest. 56 (1975) Loll, P., Picot, D., Garavito, R. at Struct Biol. 2 (1995) Vane, J., Bakhle, Y., Botting, R. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 38 (1998) Amann, R., Peskar, B. European Journal of Pharmacology 447 (2002) 1 61 Lopez-Farre, A., Caramelo, C., Esteban, A., Alberola, M., Millas, I., Monton, M., Casado, S. Circulation 91 (1995) Bjornsson, T., Schneider, D., Berger,. J. Pharm. Exper. Ther. 250 (1989) Betts, W., Whitehouse, M., Clelend, L., Vernon-Roberts, B. Free Radic Biol Med. 1 (1985) 273

41 αιµορραγικά επεισόδια 64,65, έλκος στοµάχου 66, αιµατουρία 67, παρενέργειες κατά την ταυτόχρονη λήψη αναστολέων του ACE 68, κ.α. Γενικότερα µπορούµε να πούµε ότι η χορήγηση προληπτικά ασπιρίνης σε ασθενείς µε καρδιοαγγειακά προβλήµατα µειώνει τον κίνδυνο σχηµατισµού θρόµβου αλλά δεν είναι εκείνο το σκεύασµα το οποίο θα αποτελούσε την ιδανική λύση στην αναστολή της θροµβογένεσης. Με την σύνθεση και την ανάπτυξη νέων ισχυροτέρων αντιαιµοπεταλιακών σκευασµάτων ο ρόλος της ασπιρίνης φαίνεται να γίνεται επικουρικός για την αποτελεσµατικότερη αντιµετώπιση των καρδιοαγγειακών παθήσεων. Επιπλέον, όταν επινοηθούν ασφαλέστεροι τρόποι λήψης της ασπιρίνης και οι κίνδυνοι για αιµορραγικά επεισόδια µειωθούν, η χρήση της ασπιρίνης θα γίνει ακόµα πιο µεγάλη για την πρωταρχική προστασία από καρδιοαγγειακές παθήσεις και σε χαµηλότερου ρίσκου ασθενείς. 64 UK-TIA Study Group BMJ. 296 (1988) e, J., Whelton, P., Vu, B., Klag, M. JAMA. 280 (1998) Antithrombotic Trialists Collaboration. BMJ 324 (2002) ansson, L., Zanchetti, A., Carruthers, S., Dahlöf, B., Elmfeldt, D., Julius, S., Ménard, J., Rahn, K., Wedel,., Westerling, S. Lancet. 351 (1998) awarskas, J., Spinler, S. Pharmacotherapy 18 (1998) 1041

42 Βασικές Αρχές Β Μέρος Β1 Εισαγωγή Ένα ευρύ φάσµα βιολογικών λειτουργιών (µεταβολισµός, ανοσοαπόκριση, πέψη, αναπνοή, αναπαραγωγή, κ.α.) ρυθµίζεται από πρωτεΐνες. Οι πρωτεΐνες είναι µεγάλες πολυπεπτιδικές αλυσίδες στις οποίες τα αµινοξέα συνδέονται µεταξύ τους µε πεπτιδικούς δεσµούς. Ακόµη τα ένζυµα είναι µόρια πρωτεϊνικής φύσης, τα οποία καταλύουν και κατευθύνουν τις χηµικές αντιδράσεις που συµβαίνουν µέσα στο κύτταρο. Επίσης, σε µακρές περιόδους ασιτίας οι πρωτεΐνες χρησιµοποιούνται από τον οργανισµό ως καύσιµα. Γενικότερα, οι πρωτεΐνες σε όλα τα κύτταρα λειτουργούν ως αισθητήρες που ρυθµίζουν τη ροή της ενέργειας και της ύλης. Για το λόγο αυτό και παρά τις µεγάλες προόδους που έχουν γίνει, η χηµεία των πεπτιδίων και των πρωτεϊνών, εξακολουθεί να αποτελεί αντικείµενο εκτεταµένης έρευνας. Συνεχώς διερευνάται η σχέση πρωτοταγούς, δευτεροταγούς και τριτοταγούς δοµής των πεπτιδίων και των πρωτεϊνών αφ ενός, και της ειδικής βιολογικής τους δράσης αφ ετέρου. Γενικότερα τα αντικείµενα της πεπτιδικής χηµείας είναι τα ακόλουθα: Αναγνώριση και µελέτη της δοµής βιολογικά δραστικών µορίων Σύνθεση αναλόγων του δραστικού φυσικού πεπτιδίου και συσχέτιση της δοµής και της βιολογικής δραστικότητάς τους Παρασκευή πεπτιδίων για φαρµακευτικούς σκοπούς Πεπτιδικός δεσµός ονοµάζεται ο δεσµός που σχηµατίζεται µεταξύ της α- καρβοξυλοµάδα του ενός αµινοξέος και της α-αµινοµάδας του άλλου αµινοξεός µε ταυτόχρονη αποµάκρυνση ενός µορίου νερού. Για το σκοπό αυτό εφαρµόζονται ειδικές συνθετικές µέθοδοι κατά τις οποίες εξαφανίζεται παροδικά ο αµφολυτικός χαρακτήρας των αµινοξέων. Αυτό συµβαίνει όταν η α-αµινοµάδας του ενός αµινοξέος στερείται παροδικά των βασικών της ιδιοτήτων και η β-καρβοξυλοµάδα του άλλου αµινοξέος στερηθεί των όξινων ιδιοτήτων της. Εκτός από αυτά, στις περισσότερες περιπτώσεις πρέπει να προστατευτούν οι δραστικές οµάδες των πλευρικών αλυσίδων των αµινοξέων (π.χ. καρβοξυλοµάδες, αµινοµάδες, γουανιδινοµάδα, σουλφυδρυλοµάδα, κ.λ.π.) και αυτό επειδή οι δραστικές αυτές οµάδες µπορούν να εµπλακούν στη διαδικασία σχηµατισµού του πεπτιδικού δεσµού και συνεπώς να προκαλέσουν τον σχηµατισµό ανεπιθύµητων παραπροϊόντων. Καταλήγουµε λοιπόν στο συµπέρασµα, ότι µας χρειάζονται τέτοια παράγωγα των αµινοξέων ώστε να σχηµατίζεται µόνο ο πεπτιδικός

43 δεσµός που σχεδιάζουµε. Επειδή η δηµιουργία πεπτιδικού δεσµού µεταξύ δύο αµινοξέων δεν είναι αυθόρµητη αντίδραση σε κανονικές συνθήκες, πρέπει να ενεργοποιείται η ελεύθερη καρβοξυλοµάδα ενός αµινοξέος προκειµένου να συζευχθεί µε την ελεύθερη αµινοµάδα ενός άλλου αµινοξέος. Επιπλέον, oι συνθήκες της αντίδρασης να καθορίζονται έτσι ώστε να αποκλείουν κατά το δυνατόν τη ρακεµίωση, η οποία πιθανόν να προκληθεί από εµπλοκή σε παράπλευρη αντίδραση του α-ατόµου υδρογόνου του C α άνθρακα. Τέλος, η αποµάκρυνση των προστατευτικών οµάδων θα πρέπει να είναι εκλεκτική και φυσικά να µην επηρεάζει το πεπτίδιο που παρασκευάστηκε. Β2 Προστατευτικές Οµάδες Η προστασία των δραστικών οµάδων των αµινοξέων γίνεται µε µια πληθώρα προστατευτικών οµάδων, οι οποίες διακρίνονται σε αµινοπροστατευτικές (Ν α - προστατευτικές), καρβοξυπροστατευτικές και σε εκείνες οι οποίες χρησιµοποιούνται για την προστασία των πλευρικών δραστικών οµάδων των αµινοξέων. Μία προστατευτική οµάδα θα πρέπει: (α) να εισάγεται εύκολα (β) να είναι σταθερή στις συνθήκες της πεπτιδικής σύνθεσης (γ) να προστατεύει αποτελεσµατικά την δραστική οµάδα (δ) να µην ευνοεί τη ρακεµίωση του χειρόµορφου κέντρου του αµινοξέος (ε) να αποµακρύνεται εύκολα (στο τέλος ή σε ενδιάµεσα στάδια της σύνθεσης), γρήγορα και ποσοτικά χωρίς τη δηµιουργία παραπροϊόντων και (στ) να έχει χαµηλό κόστος. Η επιλογή των προστατευτικών οµάδων εξαρτάται από τον τρόπο οικοδόµησης της πεπτιδικής αλυσίδας και είναι πρωταρχικής σηµασίας για την επιτυχία της σύνθεσης. Β2.1 Προστατευτικές οµάδες της α-αµινοµάδας Η προστασία των α-αµινοµάδων συνίσταται στην µείωση του πυρηνόφιλου χαρακτήρα του α-ατόµου αζώτου έτσι ώστε να παρεµποδίζεται η δράση του έναντι ακυλιωτικών µέσων, όπως είναι τα ενεργοποιηµένα καρβόξυ παράγωγα. Αυτό µπορεί να επιτευχθεί, είτε µε έλξη ηλεκτρονίων µέσω µεσοµέρειας (π.χ. ουρεθανικού τύπου οµάδες) ή επαγωγικού φαινοµένου (π.χ. ο-νιτροφαινυλσουλφενυλοµάδα), είτε µε στερεοχηµική παρεµπόδιση (π.χ. τριφαινυλµεθυλοµάδα). Η προστασία της α-αµινοµάδας πρέπει να

44 είναι παροδική και η αποπροστασία της εύκολη, γρήγορη και εκλεκτική. Μέχρι σήµερα έχει αναπτυχθεί ένας µεγάλος αριθµός αµινοπροστατευτικών οµάδων, µερικές από τις οποίες δίνονται στον επόµενο πίνακα. Πίνακας Β2.1 Μερικές Ν α -προστατευτικές οµάδες και οι συνθήκες αποµάκρυνσής τους Όνοµα Σύντµηση Χηµικός Τύπος Συνθήκες Αποµάκρυνσης Βενζυλοξυκαρβονυλ- Ζ 2/Pd, α/υγ. 3, F ή Br/Ac, TFA µε βρασµό Τριτοταγής Βουτυλοξυκαρβονυλ- Boc 3 C C 3 Cl/Ac, TFA/δεσµευτές C 3 Τριφαινυλµεθυλ- (τριτυλ-) Trt TFA/δεσµευτές, 2/Pd, Ac 9-Φλουορενυλοµεθοξυκαρβονυλ- Fmoc ευτεροταγείς βάσεις (π.χ. πιπεριδίνη σε DMF) Οι ουρεθανικού τύπου οµάδες είναι οι σηµαντικότερες και από αυτές οι πλέον χρησιµοποιούµενες είναι οι Boc και Fmoc, ενώ από τις µη ουρεθανικού τύπου οµάδες σηµαντικότερη είναι η Trt. Η βενζυλοξυκαρβονυλοµάδα ή καρβοβενζοξυοµάδα (Ζ) χρησιµοποιήθηκε για πρώτη φορά από τους Bergmann και Ζέρβα (1932) και αποτέλεσε το καθοριστικό σηµείο στην σύγχρονη πεπτιδική σύνθεση 69,70. Εισάγεται εύκολα, µε επίδραση βενζυλοξυκαρβονυλοχλωριδίου (Ζ-Cl) στο αµινοξύ σε αλκαλικές συνθήκες (Αντίδραση Schotten-Baumann). αποµάκρυνσή της επιτυγχάνεται µε καταλυτική υδρογονόλυση ή επίδραση ισχυρών οξέων όπως Br/Ac, F, κτλ. Η καταλυτική υδρογόνωση δεν µπορεί να εφαρµοστεί στις περιπτώσεις που υπάρχει δισθενές θείο S στα πεπτίδια (Met, Cys, κ.λ.π.) λόγω δηλητηρίασης του καταλύτη από την οµάδα αυτή. Στις περιπτώσεις αυτές προτιµάται κάποια από τις άλλες µεθόδους απόσπασης της Ζ-οµάδας. Ως 69 Bergmann, M., Zervas, L., Ber. Dtsch. Chem. Ges. 65B (1932) Ishai, B., Berger, A., J. rg. Chem. 17 (1952) 1564

45 πλεονεκτήµατα της προστασίας της α-αµινοµάδας των αµινοξέων µε καρβοβενζοξυοµάδα µπορεί να αναφερθούν τα ακόλουθα: εν παρουσιάζονται τάσεις ρακεµίωσης κατά τις συζεύξεις µε τα καρβοβενζοξυαµινοξέα. Η καρβοβενζοξυοµάδα είναι σταθερή σε συνθήκες αλκαλικής υδρόλυσης εστερικών οµάδων, µε αποτέλεσµα να απελευθερώνονται προσωρινά προστατευµένα καρβοξύλια, προς επέκταση της πεπτιδικής αλυσίδας. Η καρβοβενζοξυοµάδα µπορεί να αποσπαστεί υπό ήπιες συνθήκες χωρίς διάσπαση του σχηµατισθέντος πεπτιδικού δεσµού. Συνήθως τα καρβοβενζοξυπαράγωγα αµινοξέων και µικρών πεπτιδίων έχουν κρυσταλλική µορφή. Η εισαγωγή της καρβοβενζοξυλικής µεθόδου έκανε δυνατή την εξέλιξη της σύγχρονης πεπτιδικής χηµείας. Παρά την ανάπτυξη και πολλών άλλων µεθόδων προστασίας της Ν α -αµινοµάδας η σηµασία της καρβοβενζοξυλικής µεθόδου δεν µειώθηκε καθόλου. Η τριτοταγής βουτυλοξυκαρβονυλοµάδα (Boc) παρουσιάστηκε για πρώτη φορά το 1957 από τους Mc Kay και Albertson και αντικατέστησε σε σηµαντικό βαθµό την Ζ-οµάδα 71. Για την εισαγωγή της χρησιµοποιείται συνήθως ο τριτοταγής βουτυλοξυκαρβονυλο ανυδρίτης (Boc 2 ) γιατί αποτελεί ασφαλές αντιδραστήριο, δίνει καλές αποδόσεις και διατηρείται στο ψυγείο ως στερεό για µεγάλο χρονικό διάστηµα 72. Για την αποµάκρυνσή της χρησιµοποιείται συνήθως TFA ή Cl σε οργανικούς διαλύτες (οξικό οξύ, διοξάνη, διαιθυλαιθέρας, κ.α.). Η Boc-οµάδα προστατεύει αποτελεσµατικά το πεπτίδιο έναντι ακυλίωσης και ρακεµίωσης, είναι σταθερή σε βασικές συνθήκες και σε συνθήκες καταλυτικής υδρογονόλυσης, γι αυτό και συνδυάζεται µε Bzl-τύπου πλάγιες προστατευτικές οµάδες. Το µειονέκτηµα της οµάδας αυτής είναι ότι ο τριτοταγής βουτυλεστέρας ή τα τριτοταγή βουτυλοκατιόντα που δηµιουργούνται κατά την αποµάκρυνσή της προσβάλλουν τυχόν πυρηνόφιλες θέσεις του πεπτιδίου, όπως είναι οι πλευρικές οµάδες της Tyr, Trp και Met. Σε αυτές τις περιπτώσεις προστίθενται κατάλληλοι δεσµευτές (scavengers) που δεσµεύουν τα δραστικά κατιόντα. Ο µηχανισµός διάσπασης της Boc-οµάδας φαίνεται στο επόµενο σχήµα. 71 Mc Kay, F., Albertson,., J. Am. Chem. Soc. 79 (1957) Morroder, L., allet, A., Wunsch, E., Keller,., Wersin, G., Z. Physiol. Chem. 357 (1976) 1651

46 3 C C 3 C 3 CC CC R 2 R R C C 3 C 3 CC CC R 2 R R 1 3 C + (C 3 ) C CC CC R 2 R R 1 3 C C 2 isobutene Εικόνα Β2.1α Μηχανισµός αποµάκρυνσης της Boc-οµάδας σε όξινο περιβάλλον Το 1970 ο Carpino και οι συνεργάτες του παρουσίασαν µια νέα ουρεθανικού τύπου προστατευτική οµάδα, την 9-φλουορενυλοµεθοξυκαρβονυλοµάδα (Fmoc). Η οµάδα αυτή διαφέρει σε σχέση µε τις προηγούµενες στο γεγονός ότι η αποµάκρυνσή της γίνεται σε συγκεκριµένο βασικό περιβάλλον, ενώ είναι απόλυτα σταθερή σε επίδραση οξέων. Η εισαγωγή της Fmoc-οµάδας µπορεί να πραγµατοποιηθεί µε επίδραση Fmoc- Cl στο αµινοξύ σε µίγµα αλκαλικού διαλύµατος/διοξάνης 73,74, όµως µε τον τρόπο αυτό παίρνουµε παραπροϊόντα τα οποία δύσκολα διαχωρίζονται από το κύριο προϊόν 75. Γι αυτό το λόγο συνήθως χρησιµοποιείται ο ηλεκτριµιδικός εστέρας της 9- φλουορενυλοµεθοξυ-καρβονυλοµάδας (FmocSu) 76. Η αποµάκρυνση της Fmocοµάδας πραγµατοποιείται γρήγορα µε επίδραση πρωτοταγών ή δευτεροταγών αµινών (κυρίως πιπεριδίνη) και σπανιότερα µε τριτοταγείς αµίνες (αργή αντίδραση). Η αποµάκρυνση γίνεται µε απόσπαση πρωτονίου µέσω Ε2 µηχανισµού (Εικόνα Β2.1β), ενώ αξίζει να σηµειωθεί ότι η αµινοµάδα που απελευθερώνεται µετά την αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας, είναι ελεύθερη και όχι πρωτονιοµένη όπως συµβαίνει µε την επίδραση οξέων. Ακόµα η οµάδα αυτή συγκεντρώνει τα πλεονεκτήµατα των ουρεθανικού τύπου οµάδων και µπορεί να συνδυαστεί µε πλάγιες προστατευτικές οµάδες, οι οποίες αποµακρύνονται σε όξινες συνθήκες (Z-, Boc, Bu t ). 73 Carpino, L., an, G., J. Am. Chem. Soc. 92 (1970) Carpino, L., an, G., J. rg. Chem. 37 (1972) Sigler, G., Biopolymers 22 (1983) Packet, Α., Can. J. Chem. 60 (1982) 976

47 2 C 2 - C C 2 Εικόνα Β2.1β Μηχανισµός αποµάκρυνσης της Fmoc-οµάδας σε βασικό περιβάλλον Η τριφαινυλοµεθυλοµάδα ή τριτυλοµάδα (Trt) είναι η σηµαντικότερη αµινοπροστατευτική οµάδα µη ουρεθανικού τύπου, η χρήση της οποίας εισήχθηκε από τους Ζέρβα και Θεοδωρόπουλο 77. Η εύκολη εισαγωγή της και η εκλεκτική της αποµάκρυνση, παρουσία άλλων προστατευτικών οµάδων είναι τα σπουδαιότερα πλεονεκτήµατά της. Τα Ν α - τριτυλ-αµινοξέα παρασκευάζονται µε την σιλυλ-µέθοδο κατά την οποία δηµιουργείται ο σιλυλ-εστέρας του αµινοξέος, ο οποίος µετά από αντίδραση µε το τριτυλοχλωρίδιο υδρολύεται εύκολα για να δώσει το επιθυµητό προϊόν 78. οµάδα αυτή αποµακρύνεται σε πολύ ήπιες όξινες συνθήκες όπως 1% TFA ή 80% Ac, ενώ είναι σταθερή σε αλκαλικές συνθήκες. Μετά την τριτυλίωση η αµινοµάδα διατηρεί ασθενείς βασικές ιδιότητες σαν δευτεροταγής αµίνη αλλά δε δείχνει πυρηνόφιλες ιδιότητες γιατί η ογκώδης τριτυλοµάδα παρεµποδίζει στερεοχηµικά τη δραστικότητά της. Εξαιτίας της παρεµπόδισης αυτής η ταχύτητα σύζευξης των Trt-αµινοξέων είναι πολύ µικρή. Σηµαντικό πλεονέκτηµα της οµάδας αυτής είναι ότι ελαχιστοποιεί τη ρακεµίωση ακόµη και σε συνθήκες στις οποίες οι ουρεθανικού τύπου οµάδες δίνουν ιδιαίτερα υψηλό ποσοστό ρακεµίωσης 79. Επιπλέον δεν έχουν αναφερθεί παραπροΐόντα κατά τη διάρκεια αποµάκρυνσής της. 77 Zervas, L., Theodoropoulos, D., J. Am. Chem. Soc. 78 (1956) Βarlos, K., Papaioannou, D., Theodoropoulos, D., J. rg. Chem. 47 (1982) Βarlos, K., Papaioannou, D., Patrianakou, S., Tsegenidis, T., Liebigs Ann. Chem. (1986) 1950

48 Β2.2 Προστατευτικές οµάδες της α-καρβοξυλοµάδας Η προστασία των καρβοξυλοµάδων κρίνεται αναγκαία για λόγους αύξησης της διαλυτότητας, ευκολότερης αποµόνωσης των προϊόντων, ελαχιστοποίησης της ρακεµίωσης καθώς και επειδή η ενεργοποίηση του καρβοξυσυστατικού γίνεται in situ. συνηθέστερος τρόπος προστασίας είναι η εστεροποίηση. Σηµαντική είναι η προστασία των πλευρικών καρβοξυλοµάδων στα αµινοξέα Glu και Asp προς αποφυγή διακλαδισµένων πεπτιδίων-παραπροϊόντων. Οι πιο χρησιµοποιούµενοι εστέρες είναι οι µεθυλ-, αιθυλ-, βενζυλ-, τριτοταγείς βουτυλεστέρες και οι π-νιτροβενζυλ- ή φαινυλεστέρες. Πίνακας Β2.2 Μερικές καρβοξυπροστατευτικές οµάδες και οι συνθήκες αποµάκρυνσής τους Όνοµα Σύντµηση Χηµικός Τύπος Συνθήκες Αποµάκρυνσης Βενζύλ- Bzl C 2 2/Pd, F ή Br/Ac Τριτοταγής Βουτύλ- t-bu 3 C C 3 Cl/Ac, TFA/δεσµευτές C 3 Mεθύλ- Me 3 C Σαπωνοποίηση, αµµωνόλυση, υδραζινόλυση Αιθύλ- Et 3 C 2 C Σαπωνοποίηση, αµµωνόλυση, υδραζινόλυση Οι µεθυλεστέρες και οι αιθυλεστέρες παρασκευάζονται παρουσία της αντίστοιχης αλκοόλης (σε περίσσεια) και του οξέος σαν καταλύτη. Σύµφωνα µε νεότερη µέθοδο 80 σε ψυχρή µεθανόλη ή αιθανόλη προστίθεται στάγδην θειονυλοχλωρίδιο και στη συνέχεια το προς εστεροποίηση οξύ. Η αντίδραση ολοκληρώνεται µε παραµονή στη συνήθη θερµοκρασία. Η αποµάκρυνση της µεθοξυ- ή αιθοξυ- οµάδας από το C-τελικό τµήµα ενός πεπτιδίου επιτελείται µε ήπια αλκαλική υδρόλυση 81 σε ακετόνη, µεθανόλη ή διοξάνη σε συνήθη ή χαµηλότερη θερµοκρασία. Το πλεονέκτηµα των εστέρων αυτών είναι ότι επιτρέπουν την επιµήκυνση της πεπτιδικής αλυσίδας, ανεξάρτητα από την µέθοδο που χρησιµοποιείται για την προστασία της α-αµινοµάδας. Οι βενζυλεστέρες µπορούν να παρασκευαστούν µε διάφορους τρόπους, πχ µε επίδραση στο αµινοξύ άνυδρης βενζυλικής αλκοόλης παρουσία π- τολουολοσουλφονικού οξέος σαν καταλύτη και βενζολίου για την αζεοτροπική 80 Brenner, M., uber, W., elv. Chim. Acta., 36 (1953) aslam, E., Tetrahedron, 36 (1980) 2409

49 αποµάκρυνση του νερού, µέσα στην ειδική συσκευή (Dean and Stark) 82 οπότε αποµονώνονται τα αντίστοιχα π-τολουολοσουλφονικά άλατα. Η αποµάκρυνσή τους συνήθως πραγµατοποιείται µε καταλυτική υδρογονόλυση ή χρήση ισχυρών οξέων όπως F και Br/Ac. Υπερτερούν των µεθυλεστέρων και των αιθυλεστέρων αφού κατά τις συνθήκες αποµάκρυνσης ενός βενζυλεστέρα ο κίνδυνος ρακεµίωσης είναι αµελητέος. Οι τριτοταγείς βουτυλεστέρες είναι εστέρες ιδιαίτερα ευπρόσβλητοι από οξέα και αποµακρύνονται µε µονοµοριακή αντίδραση διάσπασης µεταξύ άνθρακα αλκυλοµάδας και οξυγόνου µε παρουσία οξέων, µηχανισµός που ευνοείται λόγω σταθεροποίησης του τριτοταγούς καρβονιόντος που σχηµατίζεται. Επίσης δείχνουν µεγάλη σταθερότητα και µπορούν να φυλάγονται ελεύθεροι, γιατί η τριτοταγής βουτυλοµάδα ασκεί στερεοχηµική παρεµπόδιση στην προσβολή του καρβονυλίου από πυρηνόφιλη αντίδραση αµινόλυσης ή αλκαλικής υδρόλυσης. Παρασκευάζονται από Ν α -ακυλιωµένα αµινοξέα µε ισοβουτένιο ή οξικό τριτοταγή βουτυλεστέρα 83. Μερικοί έχουν παρασκευασθεί από ελεύθερα αµινοξέα µε οξικό τριτοταγή βουτυλεστέρα και υπερχλωρικό οξύ. Η αντίδραση γίνεται µέσα σε ένα µίγµα διοξάνης - θειϊκού οξέος. Το 2 S 4 είναι σε µικρή ποσότητα και παίζει ρόλο καταλύτη και όχι διαλύτη. Η απόδοση εξαρτάται από τη διαλυτότητα του αµινοξέος στο µίγµα των διαλυτών. Άλλο µίγµα διαλυτών για την αντίδραση είναι το µίγµα διαιθυλενογλυκόλης - θειϊκού οξέος. Η αποµάκρυνσή των t-βουτυλεστέρων πραγµατοποιείται σε σχετικά ήπιες συνθήκες µε επίδραση Cl/Ac ή TFA. Β2.3 Προστασία των πλευρικών δραστικών οµάδων των αµινοξέων Όταν οι πλευρικές οµάδες δεν είναι δραστικές στις συνθήκες της πεπτιδικής σύνθεσης, τότε η προστασία τους δεν είναι αναγκαία. Έτσι πολλές φορές στην πεπτιδική σύνθεση χρησιµοποιούνται παράγωγα σερίνης ή ιστιδίνης µε απροστάτευτη την πλευρική οµάδα. Άλλες όµως δραστικότερες οµάδες σαν την ω- 2 της αργινίνης ή το β-καρβοξύλιο του ασπαραγινικού οξέος πρέπει οπωσδήποτε να προστατεύονται. Στις περιπτώσεις των αµινοµάδων ή των καρβοξυλοµάδων που βρίσκονται στις πλευρικές αλυσίδες των αµινοξέων χρησιµοποιούνται συνήθως οι ίδιες µέθοδοι που εφαρµόζονται για προστασία της α-αµινοµάδας και της α-καρβοξυλοµάδας. Σ αυτές τις περιπτώσεις κάνουµε τέτοιους συνδυασµούς, ώστε η προστασία των πλευρικών οµάδων ν αποµακρύνεται µόνο στο στάδιο της πεπτιδικής σύνθεσης που εµείς επιθυµούµε. 82 Cipera, J., ichols, R., Chem. Ind.(London), 16 (1955) 83 Roeske, R., J. rg. Chem., 28 (1963) 1251

50 Β2.3.1 Προστασία της α- και β- καρβοξυλοµάδας του Asp και γ- του Glu Η προστασία των β- και γ- αντίστοιχα, καρβοξυλοµάδων των Asp και Glu κρίνεται αναγκαία, αφενός για να µην αντιδρά ανταγωνιστικά µε την α-καρβοξυλοµάδα, αφετέρου για να αποφεύγονται αντιδράσεις που οδηγούν στον σχηµατισµό ιµιδίου που περαιτέρω υδρολύεται και σχηµατίζεται έτσι µίγµα α- και β- ή γ- πεπτιδίου. Η προστασία της οµάδας αυτής επιτυγχάνεται µε εστεροποίησή της µε τις γνωστές οµάδες προστασίας της α- καρβοξυλοµάδας. Σε συνδυασµό µε την Ν α -Fmoc προστατευτική οµάδα χρησιµοποιείται συνήθως η t-bu οµάδα ενώ σε συνδυασµό µε την Ν α -Boc προστατευτική οµάδα χρησιµοποιείται συνήθως η Bzl οµάδα. Β2.3.2 Προστασία της γουανιδινοµάδας της Arg Η προστασία της γουανιδινοµάδας της Arg κατά την διάρκεια της πεπτιδικής σύνθεσης κρίνεται επίσης απαραίτητη, καθώς η γουανιδινοµάδα παρουσιάζει ισχυρό βασικό και πυρηνόφιλο χαρακτήρα, εποµένως µπορεί εύκολα να ακυλιωθεί διαµοριακά από ενεργοποιηµένα καρβοξυπαράγωγα ή ενδοµοριακά προς λακτάµες. Συνήθως προστατεύεται το ένα άτοµο αζώτου και σε ορισµένες µόνο περιπτώσεις και τα δύο. Έχουν αναπτυχθεί διάφορες προστατευτικές οµάδες, ορισµένες από αυτές φαίνονται στον Πίνακα B Πιο συχνά χρησιµοποιούµενες είναι οι αρυλοσουλφονυλοµάδες όπως οι Tos-, Mtr-, Pmc- και Pbf-. Η Tos-οµάδα αποµακρύνεται µε επίδραση ισχυρών οξέων και µπορεί να συνδυαστεί µε Ν α -Boc προστατευτική οµάδα 84,85. Η Mtr-οµάδα αποµακρύνεται µε επίδραση TFA για 6h 86,87 ενώ η Pmc- και η Pbf- αποµακρύνονται µε επίδραση διαλύµατος TFA σε DCM (50-90 %) για 2h και χρησιµοποιούνται κυρίως στην Fmoc-χηµεία 88,89. Το µειονέκτηµα των οµάδων αυτών είναι ότι τα κατιόντα που σχηµατίζονται κατά την αποµάκρυνσή τους προσβάλλουν τις πλευρικές οµάδες των αµινοξέων της Trp, Tyr και Met. Για το λόγο αυτό χρησιµοποιούνται στο µίγµα αποπροστασίας κατάλληλες ενώσεις οι οποίες δεσµεύουν τα ηλεκτρόφιλα είδη που παράγονται (scavengers ή δεσµευτές). 84 Mazur, R., Plume, G., Experimentia, 24 (1968) Kiso, Y., Satomi, M., Ukawa, K., Akita, T., J. Chem. Soc. Commun., (1980) Atherton, E., Benoiton,., Brown, E., Sheppard, R., Williams, B., J. Chem. Soc. Commun., (1981) Fugina, M., Wakimasu, M., Kitada, C., Chem. Pharm. Bull., 29 (1981) Ramage, R., Green, J., Tetrahedron Lett., 28 (1987) Carpino, L., J. Am. Chem. Soc., 115 (1993) 4397

51 Πίνακας Β2.3.2 Προστατευτικές οµάδες της γουανιδινοµάδας της Arg και οι συνθήκες αποµάκρυνσής τους Όνοµα Σύντµηση Χηµικός Τύπος Συνθήκες Αποµάκρυνσης 4-τολουολοσουλφονυλ- Tos 3 C S 3 C C 3 4-µεθοξυ-2,3,6-τριµεθυλβενζοσουλφονυλ Mtr 3 C S C 3 F/ανισόλη, TFMSA / TFA / θειοανισόλη TFA / θειοανισόλη 3 C C 3 2,2,5,7,8-πενταµεθυλ-χρωµαν-6- σουλφονυλ- Pmc 3 C TFA / DCM / δεσµευτές 3 C C 3 S C 3C3 2,2,4,6,7-πεντα- µεθυλδιϋδροβενζοφουραν-5-σουλφονυλ- Pbf 3 C TFA / DCM / δεσµευτές 3 C C 3 S Β2.3.3 Προστασία της ε-αµινοµάδας της Lys ε-αµινοµάδα της λυσίνης, όταν η α-αµινοµάδα είναι προστατευµένη µε την Βοcοµάδα, προστατεύεται κυρίως µε την 2-χλωρο-βενζυλοξυκαρβονυλ-οµάδα (2-Cl-Z) 90, η οποία στην υγρή φάση αποµακρύνεται µε καταλυτική υδρογόνωση, ενώ στη στερεά µε F. Σε συνδυασµό µε την Ν α -Fmoc-οµάδα χρησιµοποιείται η Boc-οµάδα 91, που αποµακρύνεται µε %TFA. Τέλος, χρησιµοποιείται η τριτυλ-(trt) ή µεθυλ-τριτυλ- (Mtt) οµάδα 92, που αποµακρύνονται σε πολύ ήπιες όξινες συνθήκες. 90 Erickson, B., Merrifield, R., J. Am. Chem. Soc., 95 (1973) Chang, D., Waki, M., Ahmad, M., Meienhofer, J., Lundell, E., auy, J., Int. J. Pept. Prot. Res., 15 (1980) Aletras, A., Barlos, K., Gatos, D., Koutsogianni, S., Mamos, P., Int. J. Pept. Prot. Res., 45 (1995) 488

52 Β2.3.4 Προστασία της σουλφυδρυλοµάδας της Cys Cys διαθέτει στην πλευρική της αλυσίδα µια σουλφυδρυλοµάδα η οποία έχει όξινο χαρακτήρα, οξειδώνεται εύκολα και είναι ισχυρά πυρηνόφιλη. Κατά συνέπεια η προστασία αυτής της οµάδας κρίνεται απαραίτητη και οι πιο σηµαντικές προστατευτικές οµάδες που χρησιµοποιούνται για τον σκοπό αυτό φαίνονται στον πίνακα Β Πίνακας Β2.3.4 Προστατευτικές οµάδες της σουλφυδρυλοµάδας της Cys Όνοµα Σύντµηση Χηµικός Τύπος Συνθήκες Αποµάκρυνσης Τριτοταγής βουτυλ- t-bu 3 C C 3 F, g 2+, (CF 3C) 3Tl C 3 Ακεταµιδοµεθυλ- Acm 3 C 2 C g 2+ (p=4), (CF 3C) 3Tl, I 2 Τριφαινυλµεθυλ- Trt C TFA / scavengers, Ag +, g 2+, (CF 3C) 3Tl, I 2, α υγρή 3 4-µεθοξυτριφαινυλµεθυλ- Mmt 3 C C 1% TFA / scavengers Βενζυλ- Bzl C 2 α υγρή 3, F 4-µεθοξυβενζυλ- Mob 3 C C 2 F, g 2+, (CF 3C) 3Tl, TFA σε βρασµό, Ag +, g 2+, (CF 3C) 3Tl, α υγρή 3 Ιστορικά η πρώτη προστατευτική οµάδα της κυστεΐνης είναι η βενζυλοµάδα 93. Για µεγάλο διάστηµα η αποµάκρυνση της οµάδας αυτής γινόταν µε νάτριο σε υγρή αµµωνία, σήµερα όµως προτιµάται η χρήση του F. Επειδή και οι δυο µέθοδοι είναι πολύ δραστικές έναντι πολυπλόκων πεπτιδίων αναπτύχθηκαν προστατευτικές οµάδες περισσότερο ευαίσθητες έναντι των οξέων. ακεταµιδοµεθυλ- (Acm) είναι σταθερή έναντι των οξέων και βάσεων και αποµακρύνεται µε ιόντα υδραργύρου (ΙΙ) 94 σε p=4 και Η 2 S, β-µερκαπτοαιθανόλη ή διθειοθρεϊτόλη (DTT) για την αποµάκρυνση του µετάλλου και το σχηµατισµό ελεύθερης 93 Du Vigneaud, V., Audrieth, L., Loring,., J. Am. Chem. Soc., 52 (1930) Veber, B., Milkowski, J., Varga, S., Denkewalter, R., irschmann, R, J. Am. Chem. Soc. 94 (1972) 5456

53 θειόλης. Η µέθοδος αυτή έχει ένα σηµαντικό πλεονέκτηµα, την αποµάκρυνση των βλαβερών αντιδραστηρίων και των παραπροϊόντων µε απλές διηθήσεις και πλύσεις 95. Οι t-bu θειοαιθέρες διασπώνται αργά µε F 96 ενώ είναι αξιοσηµείωτη η σταθερότητά τους έναντι των διαλυµάτων Ι 2, γεγονός το οποίο επιτρέπει την εκλεκτική δηµιουργία δισουλφιδικών δεσµών όταν χρησιµοποιούνται σε συνδυασµό µε άλλες οµάδες που οξειδώνονται εύκολα µε Ι 2 (Acm, Trt). Οι προστατευτικές οµάδες Trt 97 και Μmt 98 χρησιµοποιούνται κυρίως στην σύνθεση σε στερεή φάση µε την Fmoc/ t-bu µεθοδολογία. Trt οµάδα απαιτεί κατεργασία για 2h µε 90% TFA και την παρουσία δεσµευτών για την πλήρη διάσπασή της. Η διάσπαση της Trt οµάδας είναι µια αντίδραση ισορροπίας, έτσι προσθήκη δεσµευτών σιλανίου οδηγούν την αντίδραση προς τη διάσπαση της τριτυλοµάδας µε αναγωγή του τριτυλοκατιόντος 99. Ωστόσο η χρήση δεσµευτών σιλανίου οδηγεί σε αναγωγή του ινδολικού δακτυλίου της Trp. Έτσι σε πεπτίδια στα οποία συνυπάρχει µε την Cys και η Τrp απαιτείται η χρήση περισσότερο ευαίσθητων οµάδων. Αυτό πετυχαίνεται µε την χρήση της Mmt οµάδας η οποία διασπάται πλήρως σε 40min σε θερµοκρασία δωµατίου µε 0,5% TFA παρουσία τριαιθυλοσιλανίου (TES) 98. Β3 Μέθοδοι σχηµατισµού πεπτιδικού δεσµού Ο σχηµατισµός πεπτιδικού δεσµού είναι µια αντίδραση η οποία απαιτεί υψηλή ενέργεια για να πραγµατοποιηθεί. Όµως επειδή δεν είναι ασφαλές να αυξηθεί κατά πολύ η θερµοκρασία της αντίδρασης, έχουν αναπτυχθεί τρόποι έτσι ώστε οι αντιδράσεις να πραγµατοποιούνται εύκολα σε χαµηλές θερµοκρασίες. Πρέπει λοιπόν να ενεργοποιηθεί η καρβοξυλοµάδα του Ν α -προστατευµένου αµινοξέος ή του πεπτιδικού τµήµατος και να διευκολυνθεί έτσι η πυρηνόφιλη προσβολή της από την αµινοµάδα του αµινοσυστατικού. Η επιλογή της µεθόδου σύζευξης γίνεται έτσι ώστε ο πεπτιδικός δεσµός να δηµιουργείται γρήγορα, µε υψηλή απόδοση, χωρίς παράπλευρες αντιδράσεις και φυσικά να αποφεύγεται η ρακεµίωση του ενεργοποιηµένου αµινοξέος ή πεπτιδικού τµήµατος. Στις επόµενες παραγράφους αναπτύσσονται µερικές από τις πιο γνωστές µεθόδους σύζευξης. 95 Kamber, B., artmann, A., Eisler, K., Riniker, B., Rink,., Sieber, P., Rittel, W., elv. Chim. Acta 63 (1980) Pastuszak, J., Chimiak, A., J. rg. Chem. 46 (1981) Zervas, L., Theodoropoulos, D., J. Am. Chem. Soc., 78 (1956) Barlos, K., Gatos, D., atzi,., Koch,., Koutsogianni, S., Int. J. Pept. Prot. Res., 47 (1996) Pearson, D., Blanchette, M., Baker, M., Guindon, C., Tetrahedron Lett., 30 (1989) 2739

54 Β3.1 Μέθοδος των καρβοδιϊµιδίων Η χρήση τους ως αντιδραστηρίων σύζευξης αναφέρθηκε για πρώτη φορά το 1955 από τους Sheehan και ess 100. Το Ν,Ν δικυκλοεξυλοκαρβοδιϊµίδιο (DCC) αποτελεί το πρώτο αντιδραστήριο αυτής της κατηγορίας που χρησιµοποιήθηκε µε επιτυχία στη σύνθεση πεπτιδίων σε στερεή φάση. Η δράση του DCC περιλαµβάνει τον ενδιάµεσο σχηµατισµό της Ο-ακυλισοουρίας, η οποία αποτελεί ένα πολύ ισχυρό ακυλιωτικό µέσο και µπορεί να υποστεί απευθείας πυρηνόφιλη προσβολή από το αµινοσυστατικό ή να δηµιουργήσει ενεργοποιηµένα καρβοξυπαράγωγα, όπως συµµετρικούς ανυδρίτες ή ενεργούς εστέρες. Ακόµη η Ο- ακυλισοουρία είναι δυνατόν να µετασχηµατιστεί ενδοµοριακά προς Ν-ακυλουρία, κάτι το οποίο και αποτελεί µειονέκτηµα της µεθόδου αφού µειώνει κατά πολύ την απόδοση, ενώ σε πολλές περιπτώσεις ο διαχωρισµός της Ν-ακυλουρίας από το κύριο προϊόν είναι δύσκολος. Ένα δεύτερο σηµαντικό µειονέκτηµα της µεθόδου είναι η ρακεµίωση του καρβοξυσυστατικού, κάτι όµως που περιορίζεται σηµαντικά µε τη χρήση προσθέτων Bt C DCC πυρηνοφίλων αντιδραστηρίων. Ένα τέτοιο αντιδραστήριο είναι το Bt 101, το οποίο προσβάλλει την Ο-ακυλισοουρία σχηµατίζοντας έτσι έναν ενεργό εστέρα, ο οποίος αποτελεί ισχυρό ακυλιωτικό µέσο. Το Bt µειώνει την έκταση της ρακεµίωσης και του σχηµατισµού Ν-ακυλουρίας. Επίσης εµποδίζει την απόσπαση πρωτονίου από το ασύµµετρο άτοµο άνθρακα του καρβοξυσυστατικού περιορίζοντας ακόµη περισσότερο τη ρακεµίωση. Προβλήµατα τα οποία δηµιουργούνται από τη χρήση του DCC είναι η τοξικότητα του αντιδραστηρίου και ο σχηµατισµός, κατά τη σύζευξη, της δυσδιάλυτης Ν,Ν -δικυκλοεξυλουρίας (DCU), η οποία διαχωρίζεται δύσκολα από το κύριο προϊόν, ιδιαίτερα στην υγρή φάση. Αυτά τα προβλήµατα περιορίζονται µε τη χρήση καρβοδιϊµιδίων των οποίων η ουρία είναι περισσότερο ευδιάλυτη στους οργανικούς διαλύτες. Ένα τέτοιο αντιδραστήριο, ευρέως 3 C C 3 C DIC C 3 C 3 χρησιµοποιούµενο, είναι το Ν,Ν -διισοπροπυλοκαρβοδιϊµίδιο (DIC) 102, Sheehan, J., ess, G., J. Am. Chem. Soc. 77 (1955) Konig, W., Geiger, R., Chem. Ber. 103 (1970) Sheehan, J., Ann.. Y. Acad. Sci. 88 (1960) Sarantakis, D., Teichnan, J., Lien, E., Fenichel, R., Biochem. Biophys. Res. Communn. 73 (1976) 336

55 R C R C R DCC -ακυλοισοουρία Ν-ακυλουρία RC Bt DCU R R R' 2 R' 2 R'2 R Bt DCU R R' C DCU Εικόνα Β3.1 Αντιδράσεις δικυκλοεξυλοκαρβοδϊιµιδίου (DCC) Β3.2 Μέθοδος των ανυδριτών Μία µέθοδος η οποία χρησιµοποιείται ευρύτατα στην πεπτιδική σύνθεση είναι αυτή των ανυδριτών, συµµετρικών ή µικτών ανυδριτών. Οι συµµετρικοί ανυδρίτες παρασκευάζονται συνήθως. Με επίδραση DCC σε διάλυµα του αντίστοιχου αµινοξέος και αποτελούν ισχυρά ακυλιωτικά µέσα. 104 Η µέθοδος παρουσιάζει µειονεκτήµατα καθώς προκύπτουν προβλήµατα από τη χρήση και τη δράση του DCC και επιπλέον µόνο η µισή ποσότητα του Ν α -προστατευµένου αµινοξέος αξιοποιείται στην περίπτωση αυτή. Αυτό το µειονέκτηµα οδήγησε στη χρησιµοποίηση µικτών ανυδριτών. Οι µικτοί ανυδρίτες παρασκευάζονται εύκολα από αλάτι του Ν α -προστατευµένου αµινοξέος µε τριτοταγή βάση, π.χ. τριαιθυλαµίνη και το χλωρίδιο του βοηθητικού οξέος 105. Οι µικτοί ανυδρίτες είναι πολύ ασταθείς, γι αυτό παρασκευάζονται σε χαµηλές θερµοκρασίες (- 15 C ως 0 C) σε διάλυµα, χωρίς να αποµονωθούν και χρησιµοποιούνται αµέσως. Όµως και η µέθοδος αυτή παρουσιάζει πρόβληµα, αφού θα πρέπει το βοηθητικό οξύ που ελευθερώνεται να δεσµεύεται από ισοδύναµη ποσότητα βάσης, γιατί διαφορετικά θα σχηµατίσει αλάτι µε την ελεύθερη αµινοµάδα του άλλου αµινοσυστατικού και θα την αδρανοποιήσει. Όπως είναι γνωστό σήµερα, περίσσεια βάσης κατά τη διάρκεια της 104 Weyand, F., uber, P., Weiss, K., aturforsch B22 (1967) Ζaoral, M., Coll. Czech. Chem. Commun. 27 (1962) 1273

56 σύζευξης προκαλεί µερικές φορές ρακεµίωση. Για τους παραπάνω λόγους αναπτύχθηκε η εισαγωγή µικτών ανυδριτών µε παράγωγα του ανθρακικού οξέος. R' + R Cl R' R R' + R'' 2 R'' + C 2 + R Εικόνα Β3.2 Μηχανισµός της αντίδρασης σύζευξης µε µικτούς καρβονικούς ανυδρίτες Αυτοί παρασκευάζονται εύκολα από χλωροµυρµηκικούς εστέρες (RCCl), µε συνηθέστερο τον χλωροµυρµηκικό ισοβουτυλεστέρα 106. Κατά την σύζευξη αυτή ελευθερώνεται ανθρακικός µονοεστέρας που αµέσως διασπάται σε διοξείδιο του άνθρακα και αλκοόλη. Έτσι δεν χρειάζεται βάση για την εξουδετέρωση του βοηθητικού οξέος και η αποµάκρυνση των παραπροϊόντων γίνεται χωρίς ιδιαίτερη φροντίδα. B3.3 Μέθοδος των ενεργών εστέρων Οι ενεργοί εστέρες παρασκευάζονται συνήθως, µε επίδραση DCC σε µίγµα του Ν α - προστατευµένου αµινοξέος και κατάλληλης αλκοόλης. Οι αλκοόλες οι οποίες χρησιµοποιούνται για το σκοπό αυτό περιέχουν οµάδες, οι οποίες έλκουν ηλεκτρόνια και ταυτόχρονα αποµακρύνονται εύκολα από τους εστέρες. Έτσι δηµιουργούνται ενεργοποιηµένα καρβοξυπαράγωγα στα οποία η πυρηνόφιλη προσβολή από το αµινοσυστατικό µπορεί να πραγµατοποιηθεί εύκολα και χωρίς τη δηµιουργία παράπλευρων αντιδράσεων. Οι σηµαντικότεροι από τους ενεργούς εστέρες είναι οι π- νιτροφαινυλεστέρες (p) 107, οι 1-υδροξυ-ηλεκτριµιδικοί εστέρες (Su) 108, οι 2,4,5- τριχλωροφαινυλεστέρες (Tcp) 109, οι 1-υδροξυ-βενζοτριαζολυλεστέρες (ΟBt) 110 και οι 1-υδροξυ-7-αζα-βενζοτριαζολυλεστέρες (ΟΑt) 111. R Bt R At R Cl Cl R Cl R Su Tcp p Anderson, G., Zimmerman, J., Callahan, F., J. Am. Chem. Soc. 89 (1967) Bodanszky, M., ature (London), 175 (1955) Anderson, G., Zimmerman, J., Callahan, F., J. Am. Chem. Soc. 85 (1963) Pless, J., Boissonnas, R., elv. Chim. Acta 46 (1963) König, W., Geiger, R., Chem. Ber. 103 (1970) Carpino, L., J. Am. Chem. Soc. 115 (1993) 4397

57 B3.4 Φωσφονικά και ουρονικά παράγωγα Τα τελευταία έτη χρησιµοποιούνται ορισµένα αντιδραστήρια, για in situ αντιδράσεις, µέσω Bt εστέρων. Τα αντιδραστήρια αυτά παρουσιάζουν σηµαντικά πλεονεκτήµατα όπως η ευκολία χρήσης, η εφαρµογή τους σε υγρή και στερεή φάση και η ολοκλήρωση των αντιδράσεων σε µικρό χρονικό διάστηµα σε σχετικά υψηλές αποδόσεις. Τα αντιδραστήρια αυτά αντιδρούν µόνο µε καρβοξυλικά ανιόντα γι αυτό είναι απαραίτητη η προσθήκη µιας βάσης στο µίγµα της αντίδρασης, π.χ. η δϊισοπροπυλαιθυλαµίνη (DIPEA) 112 και η κολλιδίνη 113, ώστε να περιορίζονται τα ποσοστά ρακεµίωσης. Μερικά από τα αντιδραστήρια αυτά φαίνονται παρακάτω. P [(C 3) 2 ] 3 PF 6 BP P PyBP PF 6 C [(C 2) 3 ] 2 PF 6 BTU C [(C 2) 3 ] 2 PF 6 ATU C [(C 2) 3 ] 2 BF 4 TBTU B4 Ρακεµίωση Η ρακεµίωση αποτελεί ένα σηµαντικό πρόβληµα της πεπτιδικής σύνθεσης όχι µόνο γιατί οδηγεί στην απώλεια της οπτικής καθαρότητας των συντιθεµένων πεπτιδίων αλλά και γιατί ο διαχωρισµός µίγµατος διαστερεοµερών είναι δύσκολος και πολλές φορές αδύνατος. Η έκταση της ρακεµίωσης εξαρτάται από πολλούς παράγοντες, όπως τη φύση του διαλύτη, τη θερµοκρασία, τη συγκέντρωση των αντιδρώντων, τη φύση της πλευρικής αλυσίδας, την Ν α -προστατευτική οµάδα και το είδος και την ποσότητα της χρησιµοποιούµενης βάσης, µε την κατάλληλη ρύθµιση των οποίων είναι δυνατή η σύνθεση οπτικώς καθαρών ενώσεων. Η ρακεµίωση πραγµατοποιείται κυρίως στα στάδια σύζευξης των ενεργοποιηµένων παραγώγων των αµινοξέων ή πεπτιδίων και λαµβάνει χώρα µε τρεις µηχανισµούς: 112 Steinauer, R., Chen, F., Benoiton,., Int. J. Pept. Prot. Res. 34 (1989) Carpino, L., Ayman, E., J. rg Chem. 59 (1994) 4

58 Με απόσπαση α-πρωτονίου Ο µηχανισµός της απόσπασης α-πρωτονίου συναντάται σε σπάνιες περιπτώσεις, όπως στη γρήγορη ρακεµίωση παραγώγων της φαινυλογλυκίνης, ενός αµινοξέος το οποίο δεν είναι συστατικό των πρωτεϊνών. R A R C X - + R C A X + + A + C X R Με αντιστρεπτή β-απόσπαση A Εικόνα Β4α Μηχανισµός ρακεµίωσης µε απόσπαση α-πρωτονίου Ο µηχανισµός της ρακεµίωσης µέσω αντιστρεπτής β-απόσπασης είναι αρχικά ο ίδιος µε τον προηγούµενο. Τα πιο γνωστά παραδείγµατα ρακεµίωσης µε αυτό τον τρόπο αποτελούν τα παράγωγα της S-βενζυλοκυστεΐνης και της β-κυανοαλανίνης. Με ενδιάµεσο σχηµατισµό 5-(4Η)-οξαζολακτόνης Ο πιο σηµαντικός και καλύτερα µελετηµένος µηχανισµός ρακεµίωσης είναι αυτός που περιλαµβάνει το σχηµατισµό αζλακτόνης. Η εξήγηση για τάση των αζλακτονών προς ρακεµίωση είναι εύκολη αφού το όξινο πρωτόνιο µπορεί να αποσπασθεί µε βάσεις από το χειρόµορφο κέντρο παρέχοντας το σταθερό, λόγω συντονισµού, καρβανιόν όπως φαίνεται παρακάτω (εικόνα Β4β). Οι αζλακτόνες αποτελούν καλά ακυλιωτικά αντιδραστήρια και µπορούν να χρησιµοποιηθούν για την ενεργοποίηση του καρβοξυλικού συστατικού. Αξίζει να σηµειωθεί ότι αυτός ο σχηµατισµός της αζλακτόνης δεν επαρκεί για την εξήγηση της ρακεµίωσης, αλλά πρέπει να λαµβάνεται υπόψη και η σταθερότητα του κυκλικού ενδιαµέσου απέναντι στις βάσεις. Ο σχηµατισµός των αζλακτονών περιορίζεται από τις Ν α -ουρεθανικού τύπου προστατευτικές οµάδες ενώ ευνοείται από τα Ν α -ακετυλοαµινοξέα. C X R 1 R 2 X -X R 1 R R 1 - R R 1 R 2 -peptide 2 -peptide R 1 R 2 Εικόνα Β4β Μηχανισµός ρακεµίωσης µέσω σχηµατισµού οξαζολόνης

59 B5 Στρατηγικές πεπτιδικής σύνθεσης Η ανοικοδόµηση της πεπτιδικής αλυσίδας µπορεί να γίνει µε δύο διαφορετικούς τρόπους: Ο πρώτος περιλαµβάνει την προσθήκη ενός κατάλληλα Ν α -προστατευµένου αµινοξέος κάθε φορά στο πεπτίδιο και την αποµάκρυνση της προστατευτικής οµάδας µετά από κάθε στάδιο επιµήκυνσης της αλυσίδας (step by step). Η επιµήκυνση θεωρητικά γίνεται και προς τις δύο κατευθύνσεις, από το Ν-τελικό άκρο ή από το C-τελικό άκρο. Στο εργαστήριο όµως, σε αντίθεση µε την πρωτεϊνική σύνθεση στους ζώντες οργανισµούς, η επιµήκυνση ξεκινά από το C-τελικό άκρο, ώστε να περιορίζονται τα ποσοστά ρακεµίωσης και οι πιθανές παράπλευρες αντιδράσεις. Ο δεύτερος τρόπος περιλαµβάνει τη σύζευξη µεταξύ τους µικροτέρων τµηµάτων πεπτιδικής αλυσίδας προς µεγαλύτερα τµήµατα, ώστε να δηµιουργηθεί το τελικό επιθυµητό πεπτίδιο (fragment condensation). Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται ο καθαρισµός των ενδιαµέσων τµηµάτων της πεπτιδικής αλυσίδας και µειώνεται ο χρόνος ο οποίος απαιτείται για την σύνθεση. Η στρατηγική αυτή βρίσκει ευρύτατες εφαρµογές, ιδίως στη σύνθεση µεγάλων πεπτιδικών µορίων ή πρωτεϊνών. B6 Τεχνικές πεπτιδικής σύνθεσης Η πεπτιδική σύνθεση µπορεί να πραγµατοποιηθεί σε υγρή φάση, σε στερεή ή και µε συνδυασµό των δύο αυτών τεχνικών. Β6.1 Σύνθεση σε υγρή φάση Στην υγρή φάση, η επέκταση της πεπτιδικής αλυσίδας πραγµατοποιείται σε διάλυµα. Σε κάθε στάδιο τα ενδιάµεσα προϊόντα καθαρίζονται ώστε να χρησιµοποιηθούν στο επόµενο στάδιο της σύνθεσης, κάτι το οποίο είναι πολύ επίπονο και χρονοβόρο για τη σύνθεση µεγάλων πεπτιδίων, ενώ αρκετές φορές προκύπτουν προβλήµατα διαλυτότητας των ενδιαµέσων αυτών προϊόντων. Β6.2 Σύνθεση σε στερεή φάση (Solid Phase Peptide Synthesis) Η µέθοδος της σύνθεσης σε στερεά φάση αποτελεί σταθµό στην πεπτιδική χηµεία. Πρώτη φορά εφαρµόστηκε από τον Merrifield το 1963 για την σύνθεση του

60 εννεαπεπτιδίου βραδυκινίνη 114. Αρχικά έχουµε οµοιοπολική δέσµευση του C-τελικού αµινοξέος σε µια χαρακτηριστική οµάδα ενός αδιάλυτου στερεού υποστρώµατος (πολυµερές). Οι δραστικές οµάδες των αµινοξέων είναι προστατευµένες µε προστατευτικές οµάδες, οι οποίες δεν επηρεάζονται από τις συνθήκες της αντίδρασης. Η προσωρινή προστατευτική οµάδα της α-αµινοµάδας αποµακρύνεται πριν την σύνδεση του επόµενου αµινοξέος. Στη συνέχεια έχουµε επαναλαµβανόµενες διεργασίες σύζευξης µε το επόµενο αµινοξύ και αποµάκρυνσης της Ν α -προστατευτικής οµάδας. Οι πλύσεις σε κάθε κύκλο είναι αρκετές, ώστε να αποµακρυνθούν, µε κατάλληλους διαλύτες, οι περίσσειες αντιδρώντων και τυχόν παραπροϊόντα και για να προετοιµαστεί η ρητίνη για το επόµενο στάδιο. Στο τέλος της σύνθεσης, το προϊόν αποδεσµεύεται από τη ρητίνη και όλες τις προστατευτικές οµάδες και µπορεί να ταυτοποιηθεί. X LIKER R 1 Y Αποπροστασία της α-αµινοµάδας επανάληψη 2 R 1 Y LIKER Σύζευξη X R 2 A X Y 2 R 2 R 1 Y Y 2 LIKER i) Αποπροστασία της α-αµινοµάδας ιι) ιάσπαση από τη ρητίνη 2 R 2 R 1 Χ = Ν α -Προστατευτική οµάδα Υ =Πλευρική προστατευτική οµάδα Α = ενεργοποιητής καρβοξυοµάδας Εικόνα Β6.2α Αρχή πεπτιδικής σύνθεσης σε στερεή φάση Στερεό υπόστρωµα Το στερεό υπόστρωµα παίζει σπουδαίο ρόλο στην επιτυχία της µεθόδου σύζευξης σε στερεά φάση. Βασικά κριτήρια που καθορίζουν την καταλληλότητα του υποστρώµατος, όπως η µηχανική αντοχή, η καλή διόγκωση σε διαλύτες που χρησιµοποιούνται ευρέως 114 Merrifield, R., J. Am. Chem. Soc., 85 (1963) 2149

61 στην πεπτιδική σύνθεση και η εύκολη προσιτότητα των ενεργών κέντρων του πολυµερούς στα αντιδραστήρια, πρέπει να πληρούνται. Ο όρος στερεό δεν αρµόζει απόλυτα στα πολυµερή που χρησιµοποιούνται στην πεπτιδική σύνθεση. Μπορούν να χαρακτηριστούν καλύτερα ως πηκτώµατα που διογκώνονται και αποδιογκώνονται σε µεγάλο βαθµό µε διάφορους διαλύτες. Σε ένα καλά διογκωµένο πολυµερές τα αντιδραστήρια διαχέονται στο εσωτερικό του, επιτυγχάνοντας τοπικά υψηλές συγκεντρώσεις που εξασφαλίζουν την πρόοδο των αντιδράσεων και µάλιστα µε µεγάλες ταχύτητες. Οι απαιτήσεις αυτές περιγράφηκαν το και είναι οι παρακάτω: Η φυσική και χηµική σταθερότητα σε όλη τη διάρκεια της σύνθεσης, Η ύπαρξη ικανοποιητικού αριθµού ενεργών οµάδων (ανά µονάδα όγκου του πολυµερούς) Η δυνατότητα της άµεσης αλληλεπίδρασης της πεπτιδικής αλυσίδας µε τα αντιδραστήρια, Η ελαχιστοποίηση της αλληλεπίδρασης των πεπτιδικών αλυσίδων µεταξύ τους. Το επικρατέστερο πολυµερές που χρησιµοποιείται στην πεπτιδική σύνθεση είναι ένα συµπολυµερές πολυστυρολίου και διβινυλοβενζολίου (PS-DVB). Το ποσοστό του διβινυλοβενζολίου (DVB) κυµαίνεται µεταξύ 1-2%. Καλύτερο δε είναι αυτό µε ποσοστό 1% DVB. Μικρότερα ποσοστά DVB δεν προσδίδουν στο πολυµερές την απαιτούµενη µηχανική σταθερότητα ενώ πολυµερή µε ποσοστό DVB 2% δίνουν πολυµερή µε ιδιαίτερα αυξηµένη σκληρότητα και κατά συνέπεια δεν είναι ικανοποιητική η διόγκωσή τους µε τους συνήθεις διαλύτες της SPPS (DMF, DCM). Ο συνδέτης είναι αυτός που µεσολαβεί για την συγκράτηση της επιθυµητής πεπτιδικής αλυσίδας πάνω στο στερεό υπόστρωµα. Το στερεό υπόστρωµα έχει επικρατήσει να ονοµάζεται ρητίνη, αν και πολλοί ονοµάζουν ρητίνη το πολυµερές, ενώ ρητίνη-συνδέτης το στερεό υπόστρωµα. ι περισσότερες ρητίνες οι οποίες χρησιµοποιούνται στην SPPS διαθέτουν ως δραστική οµάδα υδροξύλιο ή αλογόνο (συχνότερα Cl) και η δέσµευση του C-τελικού αµινοξέος γίνεται µέσω εστεροποίησης της α-καρβοξυλοµάδας του. Πολυµερή υποστρώµατα Μερικές από τις πιο σηµαντικές ρητίνες που χρησιµοποιούνται για την σύνθεση πεπτιδίων οξέων φαίνονται στον πίνακα 6.2α. Η πιο σηµαντική από τις ρητίνες αυτές 115 Erickson, B., Merrifield, R., in: The Proteins (3 rd edn), Academic Press, ew York 2 (1976), 255

62 είναι η 2-χλωροτριτυλοχλωρίδιο ρητίνη (2-CLTR) 116,117 η οποία συνδυάζεται µε την Fmoc-Bu t µεθοδολογία. Η χρήση της ρητίνης αυτής έχει δώσει εξαιρετικά αποτελέσµατα τόσο στην απόδοση όσο και στην καθαρότητα των τελικών προϊόντων και είναι ιδανική για την σύνθεση τόσο ελευθέρων πεπτιδίων όσο και προστατευµένων πεπτιδικών τµηµάτων. Πίνακας 6.2α Μερικές από τις ρητίνες που χρησιµοποιούνται στην σύνθεση πεπτιδίων στην στερεά φάση Ρητίνη Συµβατή προστασία Συνθήκες ιάσπασης Cl Merrifield resin Boc F 4-alkoxybenzyl alcohol resin (Wang resin) Bpoc, Fmoc TFA (50-100%) 3 C 2-Methoxy-4-alkoxybenzyl alcohol resin (SASRI TM ) Fmoc TFA (0.5-1%) PAM resin Boc F, TFMSA Cl Cl Fmoc Ac/TFE/DCM (1:2:7, v/v) 2-Chlorotrityl chloride resin (Barlos resin) Στα πολυµερή τριτυλοχλωρίδια η εστεροποίηση των Ν α -Fmoc-αµινοξέων 118 πολύ εύκολα µε επίδραση DIPEA. γίνεται 116 Barlos, K., Gatos, D., Kallitsis, J., Papaphotiou, G., Sotiriou, P., Wenqing, Y., Schafer, W., Tetrahedron Lett., 30 (1989) Barlos, K., Gatos, D., Kapolos, S., Papaphotiou, G., Schafer, W., Wenqing, Y., Tetrahedron Lett., 30 (1989) Barlos, K., Chatzi,., Gatos, D., Stavropoulos, G., Int. J. Pept. Prot.Res. 37 (1991) 513

63 Cl Cl Cl Cl Fmoc-AA- DCM DIPEA Fmoc R Cl Εικόνα Β6.2β Εστεροποίηση επί της 2-CLTR Η αντίδραση είναι πολύ γρήγορη (30 λεπτά), σε θερµοκρασία δωµατίου ενώ η ρακεµίωση αποφεύγεται, αφού δεν χρειάζεται ενεργοποίηση του αµινοξέος για να συζευχθεί µε την ρητίνη. Η αντίδραση υποκατάστασης είναι ανάλογη της περίσσειας του Fmoc-αµινοξέος που χρησιµοποιείται. Για µικρά πεπτίδια επιλέγονται µεγάλες υποκαταστάσεις (οδηγούν σε υψηλή απόδοση), ενώ το αντίθετο συµβαίνει για µεγάλα πεπτίδια (> 15 αµινοξέα). Επίσης, µετά την αντίδραση του πρώτου αµινοξέος µε το πολυµερές, πρέπει να αδρανοποιηθούν οι ελεύθερες δραστικές οµάδες του πολυµερούς οι οποίες δεν συζεύτηκαν µε το Fmoc- αµινοξύ. Συνδέτες (Linkers) Για τη σύνθεση πεπτιδίων που είναι αµίδια στο C-τελικό άκρο τους, χρησιµοποιούνται ρητίνες τροποποιηµένες ειδικά για το σκοπό αυτό. Μεταξύ του πολυµερούς και του αναπτυσσόµενου πεπτιδίου παρεµβάλλονται συνδέτες (linkers) οι οποίοι διαθέτουν µια αµινοµάδα. Έτσι το C-τελικό αµινοξύ συνδέεται µε το πολυµερές µε αµιδικό δεσµό και στο τέλος πραγµατοποιείται εκλεκτική αποµάκρυνση του πεπτιδίου linker. Έτσι πραγµατοποιείται εκλεκτική αποµάκρυνση του πεπτιδίου-linker από το πολυµερές και έπειτα ακολουθεί διάσπαση του δεσµού πεπτιδίου-linker για να ληφθεί το πεπτίδιο ως C-τελικό αµίδιο. Το σταθερό καρβανιόν του linker που δηµιουργείται µπορεί να προσβάλλει πλευρικές οµάδες ευαίσθητων αµινοξέων, πχ ο ινδολικός δακτύλιος της Trp. Στον πίνακα 6.2β φαίνονται µερικοί linkers και οι συνθήκες διάσπασής τους από το πεπτίδιο.

64 Πίνακας 6.2β ιάφοροι linkers που χρησιµοποιούνται στην στερεή φάση Linker Συµβατή Ν α -προστασία Συνθήκες ιάσπασης Fmoc Xanthenyl Linker Fmoc 2% TFA C 3 3 C Fmoc 50-95% TFA Fmoc Linker Rink-Bernatowicz Επιµήκυνση της πεπτιδικής αλυσίδας Η επιµήκυνση της πεπτιδικής αλυσίδας γίνεται, αφού πρώτα αποµακρυνθεί η Ν α - προστατευτική οµάδα του C-τελικού αµινοξέος και στη συνέχεια εφαρµοστούν επαναλαµβανόµενα στάδια σύζευξης-αποπροστασίας µέχρι να ολοκληρωθεί η σύνθεση του επιθυµητού πεπτιδίου. Μία σηµαντική παράπλευρη αντίδραση που συµβαίνει στο στάδιο της αποπροστασίας του διπεπτιδίου είναι η προσβολή της καρβονυλοµάδας του εστερικού δεσµού από την αµινοµάδα που απελευθερώνεται προς σχηµατισµό δικετοπιπεραζίνης (DKP) µε αποτέλεσµα την αποµάκρυνση διπεπτιδίου από την ρητίνη. R 1 2 R 2 Εικόνα Β6.2γ Σχηµατισµός ικετοπιπεραζίνης (DKP) Γενικότερα, έχει βρεθεί ότι η ενδοµοριακή αυτή κυκλοποίηση ευνοείται από την παρουσία Gly, Pro, D-αµινοξέων ή Ν-µεθυλαµινοξέων στην αλληλουχία του διπεπτιδίου 119. Έχει βρεθεί ότι ο σχηµατισµός δικετοπιπεραζίνης δεν ευνοείται στην 2- CLTR 120 ρητίνη σε αντίθεση µε άλλα πολυµερή υποστρώµατα όπως στις ρητίνες Wang και Sasrin. R 1 DKP R Pedroso, E., Grandas, A., De la eras, X., Eritja, R., Giralt, E., Tetrahedron Lett., 27 (1986) Stavropoulos, G., Karagiannis, K., Vynios, D., Papaioannou, D., Aksnes, D., Froystein,., Francis., G., Acta Chemica Scandinavica 45 (1991) 1047

65 Αποµάκρυνση του πεπτιδίου από το πολυµερές Όταν ολοκληρωθεί η σύνθεση του πεπτιδίου ακολουθεί η αποµάκρυνσή του από τη ρητίνη. Οι συνθήκες αποµάκρυνσης εξαρτώνται από το είδος του δεσµού µεταξύ πολυµερούς-πεπτιδίου και από τη µορφή του πεπτιδίου στο C-τελικό του άκρο. Έτσι το πεπτίδιο µπορεί να απελευθερωθεί ως οξύ, αµίδιο ή εστέρας. Σήµερα, χρησιµοποιούνται σχεδόν αποκλειστικά ρητίνες από τις οποίες το πεπτίδιο αποδεσµεύεται µε επίδραση οξέων. Αν στις συνθήκες αποµάκρυνσης του πεπτιδίου από το πολυµερές αποµακρύνονται ταυτόχρονα και πλάγιες προστατευτικές οµάδες του πεπτιδίου τότε απαιτείται η προσθήκη στο µίγµα διάσπασης καταλλήλων δεσµευτών κατιόντων (scavengers) για την αποφυγή παραπλεύρων αντιδράσεων µε ευαίσθητα αµινοξέα όπως η Cys, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr και Arg. Το νερό είναι ένας µέτρια αποτελεσµατικός δεσµευτής κατιόντων αλλά πρέπει να αποφεύγεται όταν τα προς σύνθεση πεπτίδια περιέχουν Cys, Met και Trp. Οι EDT και DTE είναι οι πιο κοινοί και αποτελεσµατικοί δεσµευτές για τα πεπτίδια τα οποία περιέχουν ευαίσθητα αµινοξέα. Επίσης τα παράγωγα του σιλανίου (TIS, TES) µπορούν επιτυχώς να αντικαταστήσουν την δύσοσµη EDT 121,122. Προκειµένου να µειώνονται οι παράπλευρες αντιδράσεις από την µακρά έκθεση στο όξινο περιβάλλον θα πρέπει η όλη διεργασία να ολοκληρώνεται σε 2-3 ώρες σε θερµοκρασία δωµατίου ενώ η παρακολούθησή της µπορεί να γίνεται µε χρωµατογραφία PLC. Στη 2-CLTR, η αποµάκρυνση του προστατευµένου πεπτιδίου πραγµατοποιείται εύκολα σε ελαφρά όξινες συνθήκες µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7/2/1, v/v) σε θερµοκρασία δωµατίου ή απουσία οξέος µε διάλυµα TFE ή εξαφθοροϊσοπροπανόλης (FIP) 123, ενώ το πολυµερές τριτυλοκατιόν που δηµιουργείται δεν προσβάλλει ευαίσθητες πλευρικές οµάδες αµινοξέων λόγω στερεοχηµικής παρεµπόδισης. Η µέθοδος αυτή παρασκευής προστατευµένων πεπτιδίων βρίσκει εφαρµογή τόσο στη σύνθεση κυκλικών πεπτιδίων, όσο και στην συµπύκνωση πεπτιδικών τµηµάτων. 121 Pearson, D., Blanchette, M., Baker, M., Guidon, C., Tetrahedron Lett., 30 (1989) Fields, C., Fields, G., Tetrahedron Lett., 34 (1993) Bollhagen, R, Schmiedberger, M., Barlos, K., Grell, E., J. Chem. Soc., Chem. Comm. (1994) 2559

66 Β7 Κυκλικά πεπτίδια Β7.1 Εισαγωγή Συχνά στη φύση απαντώνται πεπτίδια τα οποία υπάρχουν σε κυκλική, δικυκλική ή πολυκυκλική µορφή 124. Στις περισσότερες περιπτώσεις, οι κυκλικές αυτές δοµές σχηµατίζονται µε οξείδωση καταλοίπων κυστεΐνης προς κυστίνη µέσω της δηµιουργίας δισουλφιδικών δεσµών. Επίσης υπάρχουν κυκλικά πεπτίδια στα οποία ο δακτύλιος σχηµατίζεται µέσω της δηµιουργίας αµιδικού δεσµού ή άλλων ποικίλων συνδυασµών. Μια κοινή µέθοδος κατάταξης των κυκλικών πεπτιδίων είναι η κατάταξή τους µε βάση τον τρόπο σχηµατισµού του δακτυλίου. Έτσι ο δακτύλιος µπορεί να σχηµατίζεται : α) ως ένωση των δύο τελικών άκρων του πεπτιδίου (head to tail), β) ως ένωση δύο πλευρικών οµάδων (side chain to side chain), γ) µια πλευρική µε το Ν ή το C-τελικό άκρο (head to side chain, side chain to tail) και δ) ως ένωση του ενός άκρου µε τον σκελετό του πεπτιδίου (head to backbone, backbone to tail). 2 C C head to tail C C side chain to side chain 2 C C head to side chain side chain to tail C C 2 C C C head to backbone backbone to tail Εικόνα Β7.1α ιάφοροι τύποι κυκλικών πεπτιδίων Β7.2 Παραδείγµατα συνθετικών head to tail κυκλικών πεπτιδίων Τα πεπτίδια head to tail είναι ο πιο συχνός τύπος κυκλικών πεπτιδίων, τα οποία σχηµατίζονται δια µέσω σχηµατισµού αµιδικού δεσµού µεταξύ της Ν-τελικής αµινοµάδας και της C-τελικής καρβοξυλοµάδας. Μέχρι σήµερα δεν έχουν γίνει γνωστά κυκλικά πεπτίδια της µορφής head to tail στα θηλαστικά. Απεναντίας, συχνά 124 vchinnikov, A., Ivanov, T., In the Proteins, Acad. Press, ew York, (1982) 307

67 απαντώνται σε βακτήρια, µύκητες ή και χαµηλότερους οργανισµούς, πολλά δε από αυτά εµφανίζουν φαρµακευτική δράση. Σε αντίθεση µε τα γραµµικά πεπτίδια, τα head to tail κυκλικά πεπτίδια είναι ανθεκτικά στις εξωπεπτιδάσες (αµινο- και καρβοξυ-πεπτιδάσες). Επιπλέον, αποκτούν δοµή µε αρκετούς περιοριστικούς όρους στη διαµορφωτική τους ελευθερία γεγονός, το οποίο προσδίδει στα πεπτίδια την ιδιότητα να µοιάζουν µε µιµητές (peptidomimetics), συνήθως δε έχουν ισχυρότερη δράση και υψηλότερη συγγένεια για ένα υποδοχέα από τα αντίστοιχα γραµµικά πεπτίδια. Αποτέλεσµα αυτής της συµπεριφοράς τους είναι να υπάρχει συνεχές ερευνητικό ενδιαφέρον για την αποµόνωση, σύνθεση και τη βιολογική αξιολόγηση κυκλικών πεπτιδίων. Τα περισσότερα head to tail κυκλικά πεπτίδια είναι προϊόντα αποµόνωσης από κατώτερους οργανισµούς και φυτά. Στο παρακάτω σχήµα (εικόνα Β7.2α) παρουσιάζονται µερικά κυκλικά πεπτίδια. Ένα κυκλικό πεπτίδιο, η στυλοστατίνη (Stylostatin), cyclo(ala-ile-pro-phe-asp-ser-leu), το οποίο έχει αποµονωθεί από θαλάσσιους σπόγγους έχει ισχυρή δράση έναντι της λευχαιµίας 125. Από κατώτερους οργανισµούς έχουν αποµονώσει κυκλικά πεπτίδια µε σηµαντικές βιολογικές δράσεις, όπως η Gramicidin S 126, η οποία έχει ισχυρή αντιµικροβιακή δράση και αποµονώθηκε από τον Bacillus brevis. Η κυκλοσπορίνη 127 είναι ένα κυκλικό εντεκαπεπτίδιο µε ισχυρή ανοσοκατασταλτική δράση, το οποίο περιέχει 7 Ν-µεθυλιωµένα αµινοξέα. Αξιοσηµείωτο είναι ό,τι αν και µεγάλο σχετικά πεπτίδιο διατηρεί σηµαντική δράση ακόµα και όταν χορηγείται από το στόµα. Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι η έλλειψη πολικών πλευρικών οµάδων εµποδίζει τη διάλυσή του στο νερό κατά τη βιολογική του µεταφορά, ενώ ο υδρόφοβος χαρακτήρας του διευκολύνει τη µεταφορά του µέσω των µη πολικών κυτταρικών µεµβρανών. Ένα κυκλικό πενταπεπτίδιο, το BQ-123, αποµονώθηκε από τον Streptomyces και έχει ανταγωνιστική δράση σε πεπτίδια της ενδοθηλίνης µε ισχυρή αντιυπερτασική δράση Pettit, R., Srirangam, K., erald, L., Erickson, L., Doubek, L., Schidt, M., Tackett, P., Bakus, J., J. rg. Chem. 57 (1992) Gause, F., Brazhnikova, G., Lancet 147 (1994) assan, A., Al-Yahya, A. In Analytical Profiles of Drugs Substances, Acad. Press, ew York, 16 (1987) Ihara, M., oguchi, K., Saeki, T., Fukuroda, T., Tsuchida, S., Kimura, S., Fukami, T., Ishikawa, K., ishikibe, M., Yano, Mol. Life Sci. 50 (1992) 247

68 Ala Pro Ile Phe Asp Leu Ser Trp Val BQ-123 Leu Ser Pro Stylostatin Val Pro 2 rn Phe Leu Leu 2 rn Val Pro Phe Gramicidin Εικόνα Β7.2α ιάφοροι τύποι κυκλικών πεπτιδίων Οι σύγχρονες ερευνητικές προσπάθειες σχετικά µε τα κυκλικά πεπτίδια στοχεύουν στην σύνθεση ισχυρών φαρµακευτικών παρασκευασµάτων ή στη σύνθεση ενώσεων οδηγών µε στόχο την τελική σύνθεση πεπτιδοµιµητών. Β7.3 Μέθοδοι σύνθεσης Μέχρι τα τέλη της δεκαετίας του 1960 η κυκλοποίηση των πεπτιδίων γινόταν σε διάλυµα 129 µε χρήση της µεθόδου των αζιδίων ή θέρµανση γραµµικών ενεργών εστέρων των πεπτιδίων (π.χ. π-νιτροφαινυλεστέρων) για αρκετές ώρες µέχρι να ολοκληρωθεί η κυκλοποίηση. Βέβαια οι αποδόσεις ήταν πολύ µικρές και επιπλέον υπήρχαν προβλήµατα διµερισµού και επιµερισµού. Για τη σύνθεση των κυκλικών πεπτιδίων έχουν αναπτυχθεί πολλές στρατηγικές τόσο στην υγρή όσο και στην στερεή φάση. Η χρήση καταλλήλων αντιδραστηρίων κυκλοποίησης κάνει πολλές φορές την κλασική µέθοδο σε υγρή φάση πιο ελκυστική σε σχέση µε αυτή σε στερεά. Καταρχήν, στην υγρή φάση έχουµε µεγαλύτερες αποδόσεις 129 Schroder, E., Lubke, K. In the Peptides (1966) II

69 και επιπλέον, ο µόνος περιορισµός είναι η χρησιµοποίηση αραιών διαλυµάτων προς αποφυγή των διαµοριακών αντιδράσεων. Ακόµα, πολλές φορές ο χρόνος ολοκλήρωσης της κυκλοποίησης είναι αρκετά πιο µικρός σε σχέση µε την στερεά φάση. Στις επόµενες παραγράφους παρουσιάζονται συνοπτικά οι βασικές αρχές σύνθεσης κυκλικών πεπτιδίων τόσο στην υγρή όσο και στην στερεά φάση. Αναφέρονται όλοι εκείνοι οι απαραίτητοι παράγοντες (προστατευτικές οµάδες, αντιδραστήρια κυκλοποίησης, παράπλευρες αντιδράσεις, κ.α.) οι οποίοι πρέπει να ληφθούν υπόψη ώστε να επιτύχουµε την σύνθεση του επιθυµητού κυκλικού πεπτιδίου και µάλιστα σε ικανοποιητική απόδοση. Κυκλοποίηση head to tail στην στερεά φάση και στην υγρή φάση Η κυκλοποίηση head to tail στην υγρή και στερεά φάση σε ρητίνη προϋποθέτει την πρόσδεση του πρώτου αµινοξέος στην ρητίνη από την πλευρική του οµάδα και χαρακτηρίζεται από τα ακόλουθα στάδια: Πρωταρχική πρόσδεση του προστατευµένου αµινοξέος από την πλευρική του οµάδα στο πολυµερές υπόστρωµα Επιµήκυνση της πεπτιδικής αλληλουχίας Εκλεκτική ορθογωνική αποπροστασία των ζητούµενων ελευθέρων C- και Ν- τελικών άκρων Αποτελεσµατική ενεργοποίηση του α-καρβοξυλίου του C-τελικού αµινοξέος και συµπύκνωσή του µε την ελεύθερη αµινοµάδα του Ν-τελικού αµινοξέος ώστε να επιτευχθεί ο επιθυµητός head to tail δακτύλιος Τελική αποµάκρυνση των προστατευτικών οµάδων και παραλαβή του ελεύθερου κυκλικού πεπτιδίου σε διάλυµα. A B C D E A B C D E Cleavage Pr = protecting group A B C D E 1) Remove protecting group 2) Cyclization on-resin (pseudodilution) Cyclization in solution (high dilution) B C D A B C A E E D 3) Cleavage from the resin (α) B C D A E (β) Εικόνα Β7.3α Γραφική αναπαράσταση της σύνθεσης head to tail κυκλικών πεπτιδίων σε διάλυµα (α) και σε στερεή φάση (β)

70 τα καλοκαίρια µας µικρά κι ατέλειωτοι οι χειµώνες..

71 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

72 Γ1 Συσκευές Όργανα Υλικά Η πεπτιδική σύνθεση σε στερεή φάση (Solid Phase Peptide Synthesis) πραγµατοποιήθηκε επί της 2-χλωροτριτυλοχλωριδίου ρητίνης (2-CLTR), η οποία συνδυάζεται µε την Fmoc/t-Bu µεθοδολογία και προµηθεύτηκε από την CBL Patras. Η σύνθεση πεπτιδίων αµιδίων σε στερεή φάση πραγµατοποιήθηκε µε τη χρήση συνδέτη (linker), και συγκεκριµένα του Rink Bernatowicz linker, εστεροποιηµένου στο πολυµερές (εικόνα Γ1). Cl Me Fmoc Me Εικόνα Γ1. Ο Linker των Rink - Bernatowicz εστεροποιηµένος στη 2-CLTR Όλα τα αµινοξέα και τα παράγωγά τους τα οποία χρησιµοποιήθηκαν στη σύνθεση έχουν την L-στερεοχηµική διάταξη και είτε αγοράστηκαν από τις εταιρίες CBL Patras, ovabiochem, Aldrich, Sigma, Merck, Fluka, είτε συντέθηκαν στο εργαστήριο µας. Οι διαλύτες οι οποίοι χρησιµοποιήθηκαν ήταν υψηλής καθαρότητας (analytical grade) της SDS και Merck. Ο έλεγχος της καθαρότητας των ενώσεων οι οποίες συντέθηκαν, καθώς και της πορείας των αντιδράσεων έγινε µε χρωµατογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC) σε προεπιστρωµένες πλάκες αλουµινίου µε Silica gel (60 F 254, Merck) σε κάποια από τα επόµενα συστήµατα διαλυτών: 1. Bu/Ac/ 2 (4:1:1, v/v) 2. Bu/Ac/Pyr/ 2 (4:1:1:2, v/v) 3. CCl 3 /Me/Ac (90:5:5, v/v) 4. Tol/Me/Ac (7:1.5:1.5, v/v) 5. AcC/ 2 (5:1, v/v) 6. AcEt/Me (8:2, v/v) εµφάνιση των χρωµατογραφηµάτων έγινε: α) µε υπεριώδη ακτινοβολία (UV) στα 254nm, β) µε ψεκασµό διαλύµατος νινυδρίνης 0.3% σε n-βουτανόλη και θέρµανση στους 100 C για 3-5 λεπτά γ) µε έκθεση σε ατµούς χλωρίου Cl 2 και ψεκασµό µε µίγµα διαλύµατος 1% αµύλου 1% ΚΙ (1:1, v/v).

73 Για το test Kaiser χρησιµοποιήθηκαν τα διαλύµατα: Kaiser 1: 500mg νυνιδρίνη / 10mL Et Kaiser 2: 40g φαινόλη / 10mL Et Kaiser 3: 1mL 0.001M KC / 49 ml πυριδίνη Τα σηµεία τήξης µετρήθηκαν µε συσκευή προσδιορισµού σηµείου τήξης του οίκου Electrothermal και είναι µη κανονικοποιηµένα. Για τα φάσµατα υπερύθρου χρησιµοποιήθηκε φασµατόµετρο του οίκου Perkin-Elmer (FT-IR 16 PC). Τα 1 Η και 13 C MR φάσµατα των ενώσεων ελήφθησαν σε φασµατόµετρο 400 Mz Bruker (Avance) χρησιµοποιώντας σαν διαλύτη CDCl 3 ή DMS-d 6 και TMS σαν εσωτερικό πρότυπο. Το Μ.W. των συντεθεισών ενώσεων υπολογίστηκε µε βάση το σχεδιαστικό πρόγραµµα ChemDraw Ultra 8.0 ενώ τα φάσµατα MS-ESI ελήφθησαν µε φασµατογράφο µάζας του οίκου Micromass (Platform LC). Οι συµπυκνώσεις των διαλυµάτων έγιναν υπό ελαττωµένη πίεση σε λουτρό θερµοκρασίας C, µε τη βοήθεια συσκευής του οίκου Buchi (Rotavapor R/A), ενώ η λυοφιλοποίηση των ενώσεων έγινε σε συσκευή του οίκου Labconco (Freeze Dryer 4.5). Για τη χρωµατογραφία στήλης ταχείας ανάπτυξης χρησιµοποιήθηκε silica gel 60 ( mesh) της Μerck, ενώ η συλλογή των κλασµάτων έγινε ηµιαυτόµατα. Η καθαρότητα των πεπτιδίων ελέγχθηκε µε χρωµατογραφία υψηλής επίδοσης ανάστροφης φάσης (RP-PLC) σε σύστηµα PLC (Μarathon IV, Rigas Labs) και ανιχνευτή (Fasma 500 UV/Vis, Rigas Labs). Ως διαλύτες έκλουσης (mobile phase) χρησιµοποιήθηκαν µίγµατα MeC/ 2 περιεκτικότητας 0.05% σε TFA: A : διάλυµα TFA σε MeC 0.05% (v/v) B : διάλυµα TFA σε % (v/v) Για την ανίχνευση των προϊόντων µετρήθηκε η απορρόφηση στα 214nm, 235nm και στα 254nm. Χρησιµοποιήθηκαν οι στήλες: C1 : ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) C2 : ucleosil C8, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Η µεταβολή της σύστασης του διαλύτη έκλουσης ήταν γραµµική και χρησιµοποιήθηκαν διάφορες συνθήκες, µερικές εκ των οποίων φαίνονται παρακάτω: E1 : 20% (A), 80% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min E2 : 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min E3 : 50% (A), 50% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min Ε4 : 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min

74 Ο τελικός καθαρισµός ορισµένων πεπτιδίων έγινε µε τη βοήθεια ηµιπαρασκευαστικής στήλης (Macherey-agel SP 250/10 ucleosil C18), ταχύτητα ροής 3 ml/min, και ανίχνευση των προϊόντων στα 226nm, 235nm ή στα 254nm. Η µεταβολή της σύστασης του διαλύτη έκλουσης πραγµατοποιήθηκε σε χρονικό διάστηµα 70min. Για τα συντεθέντα ανάλογα αντί του χρόνου έκλουσης µπορεί να υπολογιστεί µια άλλη σταθερά που χαρακτηρίζει τις ενώσεις, ο παράγοντας χωρητικότητας (capacity factor). Το DCM αποστάχθηκε πάνω από Ca 2 πριν χρησιµοποιηθεί, ενώ το TF πάνω από µεταλλικό a. Η MM και η Et 3 αποστάχθηκαν πάνω από a και διατηρήθηκαν υπεράνω αυτού. Ο διαιθυλαιθέρας και ο πετρελαϊκός αιθέρας (40-60 C) ξηράνθηκαν µε την προσθήκη σύρµατος µεταλλικού νατρίου και διατηρήθηκαν υπεράνω αυτού. Όλα τα προϊόντα ξηράνθηκαν σε υψηλό κενό πάνω από P 2 5 ή/και στερεό a, σε θερµοκρασία δωµατίου. Ο έλεγχος της βιολογικής δράσης των αναλόγων in vitro έγινε στη Μονάδα Θρόµβωσης και Αιµόστασης του νοσοκοµείου ΑΧΕΠΑ, του Αριστοτέλειου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης υπό την επίβλεψη του Αναπληρωτή Καθηγητή Αιµατολογίας του Τµήµατος Ιατρικής του Α.Π.Θ. κ. Παντελή Μακρή. αριθµός των αιµοπεταλίων µετρήθηκε µε αυτόµατο αναλυτή αίµατος ο οποίος ανήκει στον εξοπλισµό του εργαστηρίου. Η συγκόλληση των αιµοπεταλίων µελετήθηκε µε φωτοµετρική µέθοδο στους 37 C µε ειδικό όργανο (Chronolog Platelet Ionized Calcium Aggregometer) και συνεχή καταγραφή της διερχόµενης ακτινοβολίας, ενώ τo λογισµικό που χρησιµοποιήθηκε είναι το AggroLink. Σαν αντιδραστήρια συγκόλλησης χρησιµοποιήθηκαν κολλαγόνο, ADP, και ριστοσετίνη της εταιρείας Chronolog. Επίσης για την προετοιµασία των δειγµάτων χρησιµοποιήθηκαν µικροφυγόκεντρος, σύριγγες συλλογής αίµατος, φιαλίδια διατήρησής του µε αντιπηκτικό, κιτρικό νάτριο 3.8%. Ακόµα, οι βιολογικές δοκιµές της κυτταροµετρία ροής (Flow Cytometry) πραγµατοποιήθηκαν σε κυτταροµετρητή ροής (Coulter EPICS XL-MCL cytometer) και χρησιµοποιήθηκε το διαγνωστικό κιτ CYTQUAT PLATELET της εταιρείας Diagnostica Stago.

75 Γ2 Γενικές Μέθοδοι Γ2.1 Μέθοδος Σύνθεσης Fmoc-Ν α -αµινοξέων Ποσότητα του αµινοξέος (10mmol) διαλύεται σε υδατικό διάλυµα 10% a 2 C 3. Στο υπό ανάδευση διάλυµα προστίθεται µέσα σε χρονικό διάστηµα 30min, ισοµοριακή ποσότητα FmocSu, η οποία έχει διαλυθεί σε διοξάνη ίσου όγκου µε το διάλυµα a 2 C 3. Κατά τη διάρκεια της αντίδρασης το p διατηρείται στην περιοχή 8-9 µε προσθήκη διαλύµατος 10% a 2 C 3. Το µίγµα της αντίδρασης αφήνεται υπό ανάδευση για ακόµη 30min και στη συνέχεια µεταφέρεται σε διαχωριστική χοάνη όπου εκχυλίζεται δύο φορές µε Et 2. Οι υδατικές φάσεις ενώνονται και οξινίζονται µε υδατικό διάλυµα (10%) κιτρικού οξέος µέχρι p 2-3. Ακολούθως το µίγµα µεταφέρεται σε διαχωριστική χοάνη όπου εκχυλίζεται δύο φορές µε AcEt. ι οργανικές φάσεις ενώνονται και πλένονται διαδοχικά, µε 3x 2 και 1x υδατικό διάλυµα 10% acl, 1x 2. Ακολουθεί ξήρανση της οργανικής φάσης µε άνυδρο a 2 S 4, διήθηση µε πτυχωτό ηθµό και συµπύκνωση του AcEt σε ελαττωµένη πίεση. Το λαµβανόµενο ελαιώδες υπόλειµµα κρυσταλλώνεται από κατάλληλο σύστηµα διαλυτών. Γ2.2 Μέθοδος Σύνθεσης Boc-Ν α -αµινοξέων ιάλυµα του αµινοξέος (10mmol) σε µίγµα διοξάνης (20mL), 2 (10mL) και υδατικού διαλύµατος ΝaΟΗ 1Μ (10mL) αναδεύεται και ψύχεται σε παγόλουτρο (0 C). Κατόπιν προστίθεται τριτοταγής βουτυλοξυκαρβονυλο-ανυδρίτης (11mmol) και η ανάδευση συνεχίζεται για 0.5h σε θερµοκρασία δωµατίου. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό ελαττωµένη πίεση, ψύχεται και προστίθεται διπλάσιος όγκος AcEt. Ακολουθεί οξίνιση µε διάλυµα 5% KS 4 µέχρι p 2-3. Η υδατική φάση εκχυλίζεται µε 2x AcEt. Οι οργανικές φάσεις ενώνονται και πλένονται µε 2x Η 2 Ο. Ακολουθεί ξήρανση µε άνυδρο a 2 S 4, διήθηση και συµπύκνωση του AcEt υπό ελαττωµένη πίεση. Το ελαιώδες υπόλειµµα κρυσταλλώνεται από κατάλληλο σύστηµα διαλυτών.

76 Γ2.3 Μέθοδος Αποµάκρυνσης της Boc-Ν α -οµάδας Ποσότητα του Ν α -Boc αµινοξέος ή πεπτιδίου τοποθετείται σε σφαιρική φιάλη και προστίθεται διάλυµα TFA/DCM/anisole (75:20:5) ή διάλυµα 1.2Μ Cl/C 3 C. Η φιάλη πωµατίζεται προσεκτικά και αφήνεται για 1h σε θερµοκρασία δωµατίου. Ακολούθως συµπυκνώνεται υπό ελαττωµένη πίεση. Το ελαιώδες υπόλειµµα στερεοποιείται µε την προσθήκη άνυδρου αιθέρα. Το λαµβανόµενο άλας διηθείται γρήγορα, πλένεται µε άνυδρο αιθέρα πάνω στον ηθµό και ξηραίνεται υπό κενό πάνω από Νa. Γ2.4 Σύνθεση σε στερεή φάση Γ2.4.1 Εστεροποίηση Fmoc-Ν α -αµινοξέων επί της 2-CLTR Ποσότητα 2-CLTR (1g, 1.6mmol Cl - /g ρητίνης) διογκώνεται σε 10mL DCM για περίπου 5min και ακολούθως προστίθεται η κατάλληλη ποσότητα Fmoc- α -αµινοξέος, η οποία προηγουµένως έχει διαλυθεί στον ελάχιστο όγκο DCM ή / και DMF και ακολουθεί στάγδην προσθήκη DIPEA (2.5mmol, 0.44mL) εντός 5min. Το διάλυµα αυτό αναδεύεται για 30min σε θερµοκρασία δωµατίου. Στη συνέχεια προστίθεται Me (3-5mL), η ρητίνη διηθείται και πλένεται (3x 10mL) µε µίγµα DCM/Me/DIPEA (85:10:5, v/v). Κάθε έκπλυση διαρκεί 10min. Έπειτα η ρητίνη πλένεται διαδοχικά, µε DCM (3x 10mL), DMF (2x 10mL), 2-propanol (2x 10mL), DMF(2x 10mL), 2-propanol (2x 10mL) και Et 2 (2x 10mL) και στεγνώνεται στον ηθµό. Αµέσως µετά την εστεροποίηση ακολουθεί το στάδιο αποµάκρυνσης της Fmoc-οµάδας και µετά από αυτό υπολογίζεται η υποκατάσταση του αµινοξέος στη ρητίνη, η οποία ποικίλει ανάλογα µε το αµινοξύ. (m (g) ρητίνης µετά την εστεροποίηση-m (g) ρητίνης πριν την εστεροποίηση) x 1000 Μ.W. (g) Fmoc- α αµινοξέος / m (g) ρητίνης πριν την εστεροποίηση Τύπος υπολογισµού της υποκατάστασης του Fmoc-αµινοξέος στη 2-CLTR

77 Γ2.4.2 Αποµάκρυνση της Fmoc-Ν α προστατευτικής οµάδας Η αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας επιτυγχάνεται µε κατεργασία του επί της ρητίνης εστεροποιηµένου αµινοξέος ή πεπτιδίου µε διάλυµα 20% (v/v) πιπεριδίνης σε DMF (10mL/g ρητίνης) για 5 min σε θερµοκρασία δωµατίου. Ακολουθεί µία δεύτερη κατεργασία από το ίδιο διάλυµα για ακόµα 25min, σε θερµοκρασία δωµατίου. Μετά το πέρας των 25min ακολουθεί η διαδικασία των πλύσεων που περιγράφηκε στην προηγούµενη παράγραφο, καθώς και ο έλεγχος ολοκλήρωσης της αντίδρασης µε Kaiser- test και χρωµατογραφία TLC. Γ2.4.3 Ενεργοποίηση και σύζευξη των Fmoc-Ν α -αµινοξέων Η σύζευξη των Fmoc-Ν α αµινοξέων πραγµατοποιείται µε τη µέθοδο των ενεργών εστέρων. Η ενεργοποίηση γίνεται µε DIC/Bt. Για το σκοπό αυτό, ποσότητα του Fmoc-αµινοξέος (3 ισοδύναµα σε σχέση µε τις ελεύθερες αµινοµάδες που υπάρχουν στο επί της ρητίνης παράγωγο) και Bt (4.5 ισοδύναµα) διαλύονται σε DMF (4mL) και στη συνέχεια προστίθεται DIC (3.3 ισοδύναµα). Το διάλυµα αυτό προστίθεται αµέσως στη ρητίνη µε το αµινοξύ ή το υπόλοιπο πεπτίδιο, όπου ο ενεργός εστέρας σχηµατίζεται in situ. Η αντίδραση σύζευξης ολοκληρώνεται σε ~3h σε θερµοκρασία δωµατίου. Ο έλεγχος της πορείας της αντίδρασης γίνεται µε Kaiser test (Γ2.8) και χρωµατογραφία TLC (Γ2.9). Μετά την ολοκλήρωση της σύζευξης ακολουθεί η διαδικασία των πλύσεων, η οποία περιγράφεται στην επόµενη παράγραφο (Γ2.7). Γ2.4.4 ιαδικασία πλύσεων Μετά από κάθε σύζευξη ή αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας, ακολουθούν πλύσεις της ρητίνης µε DMF (3x 10mL/g ρητίνης), 2-propanol (2x 10mL/g ρητίνης), DMF (2x 10mL/g ρητίνης), 2-propanol (3x 10mL/g ρητίνης) και Εt 2 (1x 10mL/g ρητίνης).

78 Γ2.4.5 Έλεγχος της πορείας µε Kaiser test Για τον έλεγχο της ολοκλήρωσης κάθε σύζευξης µεταφέρεται µικρή ποσότητα ρητίνης σε δοκιµαστικό σωλήνα και προστίθονται δύο σταγόνες από τα επόµενα διαλύµατα µε την σειρά που αναφέρονται: Kaiser 1: 500mg νινυδρίνης σε 10mL Et Kaiser 2: 40g Ph σε 10mL Et Kaiser 3: 1mL υδ. διαλύµατος 0.001Μ KC σε 49 ml πυριδίνης Ο δοκιµαστικός σωλήνας θερµαίνεται για 5min στους 100 C και ακολούθως εξετάζεται το χρώµα του µίγµατος. Αν αυτό είναι αµετάβλητο, τότε η αντίδραση έχει ολοκληρωθεί. Αν το χρώµα αλλάξει προς το µπλε ή το µωβ τότε η αντίδραση δεν έχει ολοκληρωθεί και είτε παρατείνεται η διάρκειά της, είτε ακολουθεί επανασύζευξη. Γ2.4.6 Έλεγχος της πορείας µε χρωµατογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC) Μικρή ποσότητα ρητίνης µεταφέρεται σε δοκιµαστικό σωλήνα και προστίθονται 4-6 σταγόνες από το διάλυµα διάσπασης του πεπτιδίου από τη ρητίνη DCM/TFE/Ac (7:2:1, v/v). Μετά από 10min ελευθερώνεται στο διάλυµα ικανοποιητική ποσότητα πεπτιδίου. Από το διάλυµα αυτό τοποθετείται κηλίδα σε χρωµατογραφική πλάκα και αναπτύσσεται στα συστήµατα διαλυτών Tol/Me/Ac (7:1.5:1.5, v/v) και MeC/ 2 (5:1, v/v) ή άλλο και ακολουθεί εµφάνιση του χρωµατογραφήµατος. Με τη χρωµατογραφία TLC µπορεί να παρακολουθείται η πορεία της αντίδρασης εύκολα, γρήγορα και µε χαµηλό κόστος. Γ2.4.7 Εστεροποίηση του Rink-Bernatowicz Linker επί της 2-CLTR Η εστεροποίηση του Fmoc-linker επί της 2-CLTR ρητίνης πραγµατοποιείται µε την ίδια µέθοδο µε την οποία πραγµατοποιείται και η εστεροποίηση των Fmoc- α -αµινοξέων. Ακολουθεί όπως και στη σύζευξη των αµινοξέων, αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας. Οι ποσότητες των αντιδραστηρίων που χρησιµοποιούνται στην εστεροποίηση αυτή παραθέτονται στον επόµενο πίνακα.

79 Αντιδραστήρια ΜΒ mmol Μάζα (g) όγκος (ml) πυκνότητα (g/ml) 2-CLTR Fmoc-linker DIPEA Me Me Fmoc + Cl Cl Linker Rink-Bernatowicz 2-Chlorotrityl chloride resin DCM/DIPEA Me Cl Fmoc Me Γ2.4.8 Αποµάκρυνση πεπτιδίου από την ρητίνη Μετά την ολοκλήρωση της σύνθεσης της επιθυµητής πεπτιδικής αλυσίδας ακολουθεί η αποµάκρυνση του πεπτιδίου ή του πεπτιδίου-linker από το πολυµερές. Για το σκοπό αυτό, η υποκατεστηµένη ρητίνη µεταφέρεται σε σφαιρική φιάλη, όπου προστίθεται το διάλυµα διάσπασης του πεπτιδίου DCM/TFE/Ac (7:2:1, v/v). Το µίγµα αφήνεται υπό ήπια ανάδευση για περίπου 2h σε θερµοκρασία δωµατίου. Έπειτα η ρητίνη διηθείται και πλένεται µε το διάλυµα διάσπασης πάνω στον ηθµό. Ακολουθεί συµπύκνωση του διηθήµατος υπό ελαττωµένη πίεση και το ελαιώδες υπόλειµµα που σχηµατίζεται στερεοποιείται µε άνυδρο αιθέρα. Το λαµβανόµενο στερεό διηθείται και ξηραίνεται υπό κενό πάνω από P 2 5 και a.

80 Γ2.4.9 Σύζευξη του Σαλικυλικού οξέος ή παραγώγων του επί της 2-CLTR Ποσότητα του σαλικυλικού οξέος ή του παραγώγου του (1 ισοδύναµο) διαλύεται µαζί µε PyBP (1.1 ισοδύναµα) σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (2 ισοδύναµα). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3-5h. Αφού η αντίδραση ολοκληρωθεί ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς, όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Με το test Kaiser και µε χρωµατογραφία TLC σε κατάλληλο σύστηµα διαλυτών ελέγχεται το τέλος της αντίδρασης. Σε περίπτωση µη ολοκλήρωσής της επαναλαµβάνεται η σύζευξη µε τις µισές ποσότητες αντιδραστηρίων. Γ Γενική µέθοδος ακετυλίωσης επί της 2-CLTR Σε DMF (5mL/g ρητίνης) προστίθεται Ac 2 (10 ισοδύναµα) και DIPEA (10 ισοδύναµα) σε σχέση µε της ελεύθερες αµινοµάδες ή υδροξυλοµάδες του πεπτιδίου που έχει συντεθεί επί της ρητίνης. Το διάλυµα αυτό προστίθεται στην ρητίνη που φέρει το πεπτίδιο µε τις ελεύθερες αµινοµάδες ή υδροξυλοµάδες (1 ισοδύναµο), αφήνεται για 1h και ακολουθεί διαδικασία πλύσεων. Γ Γενική µέθοδος γουανιδιλίωσης επί της 2-CLTR Σε DCM (5mL/g ρητίνης) προστίθεται Ν,Ν bis-boc-thiourea (1.2 ισοδύναµα), Et 3 (1.2 ισοδύναµα) και DIC (1.2 ισοδύναµα) σε σχέση µε της ελεύθερες αµινοµάδες του πεπτιδίου που έχει συντεθεί επί της ρητίνης. Στη συνέχεια το διάλυµα αυτό προστίθεται στην ρητίνη που φέρει το πεπτίδιο µε τις ελεύθερες αµινοµάδες (1 ισοδύναµο), αφήνεται για 24h και ακολουθεί διαδικασία πλύσεων.

81 Γ2.5 Σύνθεση σε υγρή φάση Γ2.5.1 Μέθοδος σύζευξης µε µικτούς καρβοξυλικούς καρβονικούς ανυδρίτες Ποσότητα του καρβοξυ-συστατικού (1.2 ισοδύναµα) διαλύεται σε άνυδρο DMF ή TF (0.5mL/mmol καρβοξυ-συστατικού). Στο διάλυµα προστίθεται MM (1.2 ισοδύναµα) και ψύχεται στους -15 C. Στη συνέχεια προστίθεται χλωροµυρµηκικός ισοβουτυλεστέρας (1.2 ισοδύναµα), ενώ το διάλυµα αναδεύεται µε µαγνητικό αναδευτήρα και αποκλεισµό υγρασίας για 2-3 min. Ακολουθεί η προσθήκη του προψυχθέντος στους -15 C, εξουδετερωµένου µε ΝΜΜ, διαλύµατος του υδροχλωρικού ή του τριφθοροξικού άλατος του αµινο-συστατικού (1 ισοδύναµο) σε DMF ή TF (1mL/mmol). Το µίγµα που προκύπτει αφήνεται να αντιδράσει µε συνεχή ανάδευση στους -15 C για 2-3h. Μετά το τέλος της αντίδρασης ο διαλύτης συµπυκνώνεται υπό ελαττωµένη πίεση και το λαµβανόµενο ελαιώδες υπόλειµµα µεταφέρεται σε διαχωριστική χoάνη µε AcEt. οργανική φάση πλένεται διαδοχικά µε διάλυµα 5% ac 3, 2, διάλυµα 10% κιτρικού οξέος, 2, ξηραίνεται µε άνυδρο a 2 S 4, διηθείται µε πτυχωτό ηθµό και συµπυκνώνεται, υπό κενό, µέχρι ξηρού. Το λαµβανόµενο προϊόν, στερεό ή ελαιώδες υπόλειµµα, κρυσταλλώνεται ή ανακρυσταλλώνεται από κατάλληλο σύστηµα διαλυτών. Γ2.5.2 Σύνθεση κυκλικών πεπτιδίων µε πεπτιδικό δεσµό Η κυκλοποίηση λαµβάνει χώρα σε υγρή φάση. Ποσότητα του προστατευµένου γραµµικού αναλόγου διαλύεται σε DMF (20mL) και κατόπιν προστίθεται ΗΟΒt (3 ισοδύναµα) και κολλιδίνη (6 ισοδύναµα). Σε µια δεύτερη φιάλη, η οποία περιέχει DMF (80-100mL), διαλύονται (3 ισοδύναµα) του αντιδραστηρίου σύζευξης TBTU. Ακολουθεί προσθήκη στάγδην για 3h του πρώτου διαλύµατος στο δεύτερο και αφήνεται προς ανάδευση για ακόµη 6h. Μετά το πέρας των 6h συµπυκνώνεται ο διαλύτης και το κυκλοποιήµενο πλέον ανάλογο καταβυθίζεται µε Η 2 Ο. ιηθείται, ξηραίνεται υπό κενό στον ξηραντήρα πάνω από P 2 5 και ακολουθεί η αποµάκρυνση των πλευρικών προστατευτικών οµάδων µε το κατάλληλο µίγµα διαλυτών. Με προσθήκη άνυδρου αιθέρα καταβυθίζεται το επιθυµητό προϊόν. Η πορεία κυκλοποίησης, η αποµάκρυνση των προστατευτικών οµάδων και η καθαρότητα του τελικού προϊόντος ελέγχονται µε χρωµατογραφία TLC, PLC ανάλυση και φασµατοµετρία µάζας.

82 Γ2.5.3 Σύνθεση κυκλικών πεπτιδίων µε δισουλφιδικό δεσµό Ποσότητα του προστατευµένου γραµµικού αναλόγου, του οποίου προηγουµένως έχουν εκλεκτικά ελευθερωθεί (διάλυµα DCM/TFA/scavengers) οι προς αντίδραση σουλφυδρυλοµάδες, διαλύεται σε διάλυµα DMS/ 2 (1:4, v/v) και αναδεύεται για τουλάχιστον 6h σε θερµοκρασία δωµατίου. Το τέλος της κυκλοποίησης ελέγχεται µε PLC ανάλυση. Μετά το πέρας της αντίδρασης το δείγµα λυοφιλοποιείται και το κυκλοποιήµενο πλέον ανάλογο διαλύεται στο κατάλληλο µίγµα διαλυτών για την αποµάκρυνση των πλευρικών προστατευτικών οµάδων. Με την προσθήκη άνυδρου αιθέρα καταβυθίζεται το επιθυµητό προϊόν. Η πορεία κυκλοποίησης, η αποµάκρυνση των προστατευτικών οµάδων και η καθαρότητα του τελικού προϊόντος ελέγχονται µε χρωµατογραφία TLC, PLC ανάλυση και φασµατοµετρία µάζας.

83 Γ3 Συνθέσεις Γ3.1 Συνθέσεις παραγώγων αµινοξέων Στην πρώτη φάση του έργου συντέθηκαν τα παράγωγα αµινοξέων, τα οποία στη συνέχεια χρησιµοποιήθηκαν για την παρασκευή των πεπτιδίων. Τα παράγωγα αυτά ταυτοποιήθηκαν µε χρωµατογραφία TLC, PLC ανάλυση, ελήφθησαν τα σηµεία τήξης τους και τα φάσµατα µάζας τους. Τέτοια παράγωγα αµινοξέων είναι η Fmoc-Gly-, Fmoc-Leu-, Fmoc-Arg( 2 )-, Fmoc-βΑla-, Fmoc-Pro-, Fmoc-Asp(Me)-, Boc-Asp(Bzl)-, Boc-Arg( 2 )-, Boc-Gly-, κ.α. Τα παράγωγα αµινοξέων Fmoc-Asp(-tBu)-, Fmoc-Arg(Pbf)-, Fmoc-Asn(Trt)- αγοράστηκαν από την εταιρεία CBL Patras και χρησιµοποιήθηκαν ως είχαν. Τα παράγωγα του σαλικυλικού οξέος αγοράσθηκαν από τις εταιρίες Sigma, Aldrich και Across. Γ3.1.1 Σύνθεση της Fmoc-Gly- 1 σύνθεση γίνεται σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης Fmoc- α αµινοξέων όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ2.1. Χρησιµοποιήθηκαν οι εξής ποσότητες: -Gly-: 3g (40mmol) FmocSu: 14g (42mmol) ιάλυµα 10% a 2 C 3 : 50mL (40mmol) ιοξάνη: 50mL Το ελαιώδες υπόλειµµα µετά τη συµπύκνωση υπό κενό κρυσταλλώνεται από µίγµα ΑcEt/ πετρελαϊκού αιθέρα. Ελήφθησαν 9.36g προϊόντος. M.T. M.W. Απόδοση Σ.Τ. TLC C % C Rf 1 : 0.71, Rf 5 : 0.54

84 Γ3.1.2 Σύνθεση της Fmoc-Leu- 2 σύνθεση γίνεται σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης Fmoc- α αµινοξέων όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ2.1. Χρησιµοποιήθηκαν οι εξής ποσότητες: -Leu-: 2g (15mmol) FmocSu: 5.33g (16mmol) ιάλυµα 10% a 2 C 3 : 19mL (15mmol) ιοξάνη: 19mL Το ελαιώδες υπόλειµµα µετά τη συµπύκνωση υπό κενό κρυσταλλώνεται από µίγµα ΑcEt/ πετρελαϊκού αιθέρα. Ελήφθησαν 4,134g προϊόντος. M.T. M.W. Απόδοση Σ.Τ. TLC C % C Rf 1 : 0.79, Rf 5 : 0.57 Γ3.1.3 Σύνθεση της Fmoc-βAla- 3 σύνθεση γίνεται σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης Fmoc- α αµινοξέων όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ2.1. Χρησιµοποιήθηκαν οι εξής ποσότητες: -βala-: 1.34g (15mmol) FmocSu: 5.33g (16mmol) ιάλυµα 10% a 2 C 3 : 19mL (15mmol) ιοξάνη: 19mL Το ελαιώδες υπόλειµµα µετά τη συµπύκνωση υπό κενό κρυσταλλώνεται από µίγµα ΑcEt/ πετρελαϊκού αιθέρα. Ελήφθησαν 3,548g προϊόντος. M.T. M.W. Απόδοση Σ.Τ. TLC C % C Rf 1 : 0.87, Rf 5 : 0.65

85 Γ3.1.4 Σύνθεση της Fmoc-Pro- 4 σύνθεση γίνεται σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης Fmoc- α αµινοξέων όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ 2.1. Χρησιµοποιήθηκαν οι εξής ποσότητες: -Pro-: 1.72g (15mmol) FmocSu: 5.33g (16mmol) ιάλυµα 10% a 2 C 3 : 19mL (15mmol) ιοξάνη: 19mL Το ελαιώδες υπόλειµµα µετά τη συµπύκνωση υπό κενό κρυσταλλώνεται από µίγµα ΑcEt/ πετρελαϊκού αιθέρα. Ελήφθησαν 4,134g προϊόντος. M.T. M.W. Απόδοση Σ.Τ. TLC C % C Rf 1 : 0.66, Rf 5 : 0.55 Γ3.1.5 Σύνθεση της Fmoc-Arg( 2 )- 5 2 σύνθεση γίνεται σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης Fmoc- α αµινοξέων όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ 2.1. Χρησιµοποιήθηκαν οι εξής ποσότητες: -Arg( 2 )-: 4.38g (20mmol) FmocSu: 7.9g (22mmol) ιάλυµα 10% a 2 C 3 : 21mL (20mmol) ιοξάνη: 21mL Το ελαιώδες υπόλειµµα µετά τη συµπύκνωση υπό κενό κρυσταλλώνεται από µίγµα ΑcEt/ πετρελαϊκού αιθέρα. Ελήφθησαν 6.79g προϊόντος. M.T. M.W. Απόδοση Σ.Τ. ESI-MS (m/z) TLC C % C (M+a + ) (M+ + +a + ) Rf 1 : 0.59

86 Γ3.1.6 Σύνθεση της Fmoc-Asp(Bzl)- 6 σύνθεση γίνεται σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης Fmoc- α αµινοξέων όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ 2.1. Χρησιµοποιήθηκαν οι εξής ποσότητες: -Asp(Bzl)-: 2.23g (10mmol) FmocSu: 4g (11mmol) ιάλυµα 10% a 2 C 3 : 11mL (10mmol) ιοξάνη: 11mL Το ελαιώδες υπόλειµµα µετά τη συµπύκνωση υπό κενό κρυσταλλώνεται από µίγµα ΑcEt - πετρελαϊκού αιθέρα. Ελήφθησαν 3.117g προϊόντος. M.T. M.W. Απόδοση Σ.Τ. ESI-MS (m/z) TLC C % C (M+a + ) (M+ + +a + ) Rf 1 : 0.77, Rf 5 : 0.71 Γ3.1.7 Σύνθεση του Cl Η-Asp(Me)- 7 Cl 2 3 C Σε 60mL µεθανόλης προψυγµένα στους 0 C προστίθεται στάγδην θειονυλοχλωρίδιο (5mL) και κατόπιν L-ασπαραγινικό οξύ (6.65g, 50mmol) µε ταυτόχρονη ανάδευση. Μετά τη διάλυση του L-ασπαραγινικού οξέος συνεχίζεται η ανάδευση για ακόµη 20min σε θερµοκρασία δωµατίου. Αµέσως µετά το πέρας των 20min προστίθεται άφθονη ποσότητα άνυδρου αιθέρα µέχρι να καταβυθιστεί το αλάτι. Το µίγµα αφήνεται για 24h στο ψυγείο να ολοκληρωθεί η καταβύθιση και την επόµενη διηθείται υπό κενό και ξηραίνεται πάνω από K. Ελήφθησαν 6.24g προϊόντος. M.T. M.W. Απόδοση Σ.Τ. TLC C Cl % 188 C Rf 1 : 0.17

87 Γ3.1.8 Σύνθεση του Fmoc-Asp(Me)- 8 3 C Σε DMF (5mL) διαλύεται ποσότητα της ουσίας 7 (10mmol, 1.84g). To διάλυµα αυτό παγώνεται στους 0 C και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (20mmol, 3.5mL). Επίσης σε DMF (8mL) διαλύεται FmocSu (10.5mmol, 3.78g). Το διάλυµα αυτό προστίθεται εντός 10 min στο πρώτο και το µίγµα αναδεύεται για άλλα 50 min, ενώ το p διατηρείται στην τιµή Τότε προστίθεται περίσσεια FmocSu 10% (378mg) και συνεχίζεται η ανάδευση για άλλα 60min. Έπειτα το µίγµα της αντίδρασης ψύχεται στους 0 C παγώνεται και προστίθεται 5% διάλυµα κιτρικού οξέος. Ακολουθεί προσθήκη κορεσµένου διαλύµατος acl και η υδατική φάση εκχυλίζεται δύο φορές µε AcEt. ι οργανικές φάσεις ενώνονται, πλένονται 2x 2 και ακολουθεί ξήρανση µε άνυδρο a 2 S 4, διήθηση, συµπύκνωση και το ελαιώδες υπόλειµµα στερεοποιείται µε µίγµα Et 2 και πετρελαϊκού αιθέρα. Ελήφθησαν 2,4g προϊόντος. M.T. M.W. Απόδοση Σ.Τ. ESI-MS (m/z) TLC C % C (M+a + ) (M+ + +a + ) Rf 1 : 0.70, Rf 5 : 0.65 Γ3.1.9 Σύνθεση του Boc-Asn-Bzl 9 Boc 2 2 Br Cs 2 C 3 Boc CsBr Σε ένα διάλυµα Boc-Asn- (2g, 8.62mmol) σε µεθανόλη (30mL) προστίθεται 2 (3mL). Το διάλυµα αυτό εξουδετερώνεται µε υδατικό διάλυµα 20% Cs 2 C 3 και συµπυκνώνεται υπό κενό στο rotary evaporator µέχρι ξηρού. TF (15mL) προστίθεται και συµπυκνώνεται υπό κενό σε υδατόλουτρο στους 45 C. Η προσθήκη TF και η συµπύκνωση επαναλαµβάνονται άλλες δύο φορές. Στο ελαιώδες υπόλειµµα προστίθεται TF (15mL) και βενζυλοβρωµίδιο (9.46mmol, d=1.44g/ml, 1.123mL). To διάλυµα αφήνεται προς ανάδευση 12h και την επόµενη εργαστηριακή µέρα συµπυκνώνεται ο διαλύτης υπό κενό. Το ελαιώδες υπόλειµµα αραιώνεται µε διάλυµα

88 κορ. acl και εκχυλίζεται µε AcEt. Η οργανική φάση πλένεται µε 2, ξηραίνεται µε άνυδρο στερεό a 2 S 4 και συµπυκνώνεται υπό κενό. Το προϊόν ανακρυσταλλώνεται µε διάλυµα AcEt - εξανίου. Ελήφθησαν 2.36g προϊόντος. M.T. M.W. Απόδοση Σ.Τ. TLC C % C Rf 1 : 0.77, Rf 5 : 0.45 Γ Σύνθεση του TFA Η-Asn-Bzl 10 2 TFA 2 Ποσότητα της ουσίας 9 (2g, 6.20mmol) διαλύεται σε TFA/DCM/anisole (90:5:5) και το διάλυµα παραµένει για 1h σε RT. Ακολουθεί συµπύκνωση υπό κενό και το ελαιώδες υπόλειµµα καταβυθίζεται µε αιθέρα. Προέκυψαν 1.97g προϊόντος.

89 Γ3.2 Συνθέσεις παραγώγων σαλικυλικού οξέος Γ3.2.1 Σύνθεση του Fmoc-2-Amino Benzoic Acid 11 Για την σύνθεση του Fmoc-2-Abz χρησιµοποιήθηκαν οι εξής ποσότητες: 2-Αbz: 1.37g (10mmol) FmocSu: 4g (11mmol) ιάλυµα 10% a 2 C 3 : 11mL (10mmol) ιοξάνη: 11mL 2-Abz διαλύεται σε υδατικό διάλυµα 10% a 2 C 3. Στο υπό ανάδευση διάλυµα προστίθεται, εντός 30min, η ποσότητα του FmocSu, η οποία έχει διαλυθεί σε διοξάνη ίσου όγκου µε το a 2 C 3. Κατά τη διάρκεια της αντίδρασης το p διατηρείται στην περιοχή 8-9 µε προσθήκη διαλύµατος a 2 C 3. Το µίγµα της αντίδρασης αφήνεται υπό ανάδευση overnight και στη συνέχεια µεταφέρεται σε διαχωριστική χοάνη όπου εκχυλίζεται τρεις φορές µε Et 2. Οι υδατικές φάσεις ενώνονται και οξινίζονται µε υδατικό διάλυµα κιτρικού οξέος (10%) µέχρι p 2-3. Ακολούθως το µίγµα µεταφέρεται σε διαχωριστική χοάνη και εκχυλίζεται 2x AcEt. ι οργανικές φάσεις ενώνονται και πλένονται διαδοχικά, µε 3x 2 και 1x διάλυµα acl (10%), 1x 2. Ακολουθεί ξήρανση της οργανικής φάσης µε άνυδρο a 2 S 4, διήθηση µε πτυχωτό ηθµό και συµπύκνωση του AcEt υπό κενό. Το λαµβανόµενο ελαιώδες υπόλειµµα καταβυθίζεται µε το µίγµα διαλυτών Et 2 - πετρελαϊκού αιθέρα. Μετά την κρυστάλλωση ελήφθησαν 2.58g προϊόντος. M.T. M.W. Απόδοση Σ.Τ. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C % C Rf 4 : (Μ+Η + ) (M+a + ) 27.2 (Ε2, C1)* *Ε2: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=265nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

90 Γ3.2.2 Σύνθεση του Fmoc-5-Αmino Salicylic Acid 12 Για την σύνθεση του Fmoc-5-ASA χρησιµοποιήθηκαν οι εξής ποσότητες: 5-ASA: 1.53g (10mmol) FmocSu: 4g (11mmol) ιάλυµα 10% a 2 C 3 : 11mL (10mmol) ιοξάνη: 11mL 5-ASA διαλύεται σε υδατικό διάλυµα a 2 C 3 (10%). Στο υπό ανάδευση διάλυµα προστίθεται, εντός 30min, η ποσότητα του FmocSu, η οποία έχει διαλυθεί σε διοξάνη ίσου όγκου µε το a 2 C 3. Κατά τη διάρκεια της αντίδρασης το p διατηρείται στην περιοχή 8-9 µε προσθήκη διαλύµατος a 2 C 3. Το µίγµα της αντίδρασης αφήνεται υπό ανάδευση overnight και στη συνέχεια µεταφέρεται σε διαχωριστική χοάνη όπου εκχυλίζεται τρεις φορές µε Et 2. Οι υδατικές φάσεις ενώνονται και οξινίζονται µε υδατικό διάλυµα κιτρικού οξέος (10%) µέχρι p 2-3. Ακολούθως το µίγµα µεταφέρεται σε διαχωριστική χοάνη όπου εκχυλίζεται 2x AcEt. ι οργανικές φάσεις ενώνονται και πλένονται διαδοχικά, µε 3x 2 και 1x διάλυµα acl (10%), 1x 2. Ακολουθεί ξήρανση της οργανικής φάσης µε άνυδρο a 2 S 4, διήθηση µε πτυχωτό ηθµό και συµπύκνωση του AcEt υπό κενό. Το λαµβανόµενο ελαιώδες υπόλειµµα καταβυθίζεται µε το µίγµα διαλυτών Et 2 - πετρελαϊκού αιθέρα. Μετά την κρυστάλλωση ελήφθησαν 2.92g προϊόντος. M.T. M.W. Απόδοση Σ.Τ. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C % C Rf 1 : (Μ+Η + ) (Ε2, C1)* *Ε2: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=265nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

91 Γ3.2.3 Σύνθεση του Trt-thiosalicylic acid 13 S Για την σύνθεση του τριτυλοθειοσαλικυλικό οξέος χρησιµοποιήθηκαν οι εξής ποσότητες: Θειοσαλικυλικό οξύ: 1.540g (10mmol) Trt-Cl: 3.058g (11mmol) DCM: 9mL DMF: 1mL Σε σφαιρική φιάλη που περιέχει προσθέτω DCM/DMF (10mL, 9:1, v/v), προστίθεται µε ανάδευση Trt-Cl και θειοσαλικυλικό οξύ. Το µίγµα της αντίδρασης αναδεύεται για 24h, συµπυκνώνεται και το λευκό στερεό που προκύπτει ανακρυσταλλώνεται µε DCM/ άνυδρο Et 2. Μετά την ανακρυστάλλωση προέκυψαν 2.97g προϊόντος. M.T. M.W. Απόδοση Σ.Τ. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C S % C (dec) Rf 1 : (Μ+Η + ) (Ε2, C1)* *Ε2: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=254nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

92 Γ3.3 Συνθέσεις Λοιπών Αντιδραστηρίων Γ3.3.1 Σύνθεση της, -bis Boc-thiourea 14 S 2 t-bu t-bu S 2 2 thiourea TF, a Boc Boc, '-bis-boc-thiourea Για την σύνθεση της Ν,Ν -bis Boc-θειουρίας χρησιµοποιήθηκαν οι εξής ποσότητες: Θειουρία: 0.571g (7.5mmol) a: 1.35g (33.8mmol) TF: 150mL Boc 2 : 3.6g (16.5mmol) Ποσότητα θειουρίας διαλύεται σε TF υπό ανάδευση και ψύχεται στους 0 ο C. Eνώ διαβιβάζεται αέριο άζωτο στο διάλυµα προστίθεται a (αφού ξεπλυθεί µε εξάνιο από το λάδι προστασίας του). Μετά από 5min το παγόλουτρο αφαιρείται και το µίγµα της αντίδρασης αφήνεται σε RT για 10min. Έπειτα επαναψύχεται στους 0 ο C και προστίθεται Boc 2. Μετά από 40min το παγόλουτρο αφαιρείται και η αντίδραση αφήνεται σε RT για 4h. Μετά το πέρας των 4h ακολουθεί προσθήκη διαλύµατος ac 3 (10mL). Το µίγµα της αντίδρασης µεταφέρεται µε 2 σε διαχωριστική χοάνη και εκχυλίζεται 3x AcEt. Ακολουθεί ξήρανση της οργανικής φάσης µε άνυδρο a 2 S 4, διήθηση µε πτυχωτό ηθµό και συµπύκνωση του διαλύτη υπό ελαττωµένη πίεση. Το λαµβανόµενο ελαιώδες υπόλειµµα κρυσταλλώνεται µε την παραµονή του στο ψυγείο. Προκύπτει ένα λευκό στερεό µάζας 18,6g. M.T. M.W. Απόδοση Σ.Τ. TLC C S % C Rf 1 : 0.90

93 Γ3.4 Συνθέσεις Πεπτιδίων Οξέων σε Στερεή Φάση Γ3.4.1 Σύνθεση του Ac-Arg-Gly-Asp C 2 Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoc- Asp(t-Bu)- στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-Asp(t-Bu)- 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-Asp(t-Bu)- (411.5mg, 1mmol) και DIPEA (0.44mL, 2.5mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το -Arg(Pbf)-Gly-Asp(t-Bu)--CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση, όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ ακετυλίωση της Ν α -αµινοµάδας της αργινίνης γίνεται σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο ακετυλίωσης, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνονται οι πλευρικές προστατευτικές οµάδες (Bu-t) και (Pbf) µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 140mg προϊόντος. M.W. TLC ESI-MS (m/z) M.T. t R (min) C Rf 1 : (Μ+Η + ) 5.56 (E4, C1)* *Ε4: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

94 Γ3.4.2 Σύνθεση του Ac-Arg-Gly-Asp(Bzl) C 2 Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoc- Asp(Bzl)- στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-Asp(Bzl)- 0.55mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-Asp(Bzl)- (444.4mg, 1mmol) και DIPEA (0.44mL, 2.5mmol). Ακολουθεί αµέσως αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το -Arg(Pbf)-Gly-Asp(Bzl)--CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Η ακετυλίωση της Ν α -αµινοµάδας της αργινίνης σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο ακετυλίωσης όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνεται η πλευρική προστατευτική οµάδα (Pbf) µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 145mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ+Η + ) 6.13 (E4, C1)* *Ε: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

95 Γ3.4.3 Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoc- Asp(t-Bu)- στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-Asp(t-Bu)- 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-Asp(t-Bu)- (411.5mg, 1mmol) και DIPEA (0.44mL, 2.5mmol). Ακολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το -Arg(Pbf)-Gly-Asp(t-Bu)--CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του σαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Σαλικυλικό οξύ (138mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3.5h. Ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνονται οι πλευρικές προστατευτικές οµάδες (t-bu) και (Pbf) µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 110mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ+Η + ) (E4, C1)* *Ε4: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

96 Γ3.4.4 Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Me)- 18 Me 2 Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoc- Asp(Me)- στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-Asp(Me)- 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-Asp(Me)- (368.5mg, 1mmol) και DIPEA (0.44mL, 2.5mmol). Ακολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το -Arg(Pbf)-Gly-Asp(Me)--CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του σαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Σαλικυλικό οξύ (138mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3h. Ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνεται η πλευρική προστατευτική οµάδα (Pbf) µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 120mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ+Η + ) (Μ+2Η + ) (E4, C1)* *Ε4: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

97 Γ3.4.5 Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Βzl) Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoc- Asp(Bzl)- στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-Asp(Bzl)- 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-Asp(Bzl)- (444.4mg, 1mmol) και DIPEA (0.44mL, 2.5mmol). Ακολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το -Arg(Pbf)-Gly-Asp(Bzl)--CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του σαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Σαλικυλικό οξύ (138mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3.5h. Ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνεται η πλευρική προστατευτική οµάδα (Pbf) µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 170mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ+Η + ) 8.81 (E2, C1)* *Ε2: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

98 Γ3.4.6 Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-Leu-Asp Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoc- Asp(t-Bu)- στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-Asp(t-Bu)- 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-Asp(t-Bu)- (411.5mg, 1mmol) και DIPEA (0.44mL, 2.5mmol). Ακολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το -Arg(Pbf)-Leu-Asp(t-Bu)--CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4 Γ2.9. Ακολουθεί η σύζευξη του σαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Σαλικυλικό οξύ (138mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3h. Ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ2.4.8.Στη συνέχεια αποµακρύνονται οι πλευρικές προστατευτικές οµάδες (t-bu) και (Pbf) µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 156mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ+Η + ) (E4, C1)* *Ε: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

99 Γ3.4.7 Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-Leu-Asp(Me)- 21 Me 2 Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoc- Asp(Me)- στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-Asp(Me)- 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-Asp(Me)- (368.5mg, 1mmol) και DIPEA (0.44mL, 2.5mmol). Ακολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το -Arg(Pbf)-Leu-Asp(Me)--CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του σαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Σαλικυλικό οξύ (138mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3h. Ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνεται η πλευρική προστατευτική οµάδα (Pbf) µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 187mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ + ) (Μ+Η + ) (E4, C1)* *E4: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

100 Γ3.4.8 Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-Leu-Asp(Βzl) Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoc- Asp(Bzl)- στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-Asp(Bzl)- 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-Asp(Bzl)- (444.4mg, 1mmol) και DIPEA (0.44mL, 2.5mmol). Ακολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το -Arg(Pbf)-Leu-Asp(Bzl)--CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του σαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Σαλικυλικό οξύ (138mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3.5h. Ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνεται η πλευρική προστατευτική οµάδα (Pbf) µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 213mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ + ) (E2, C1)* *E2: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

101 Γ3.5 Συνθέσεις Πεπτιδίων Αµιδίων σε στερεή φάση Γ3.5.1 Σύνθεση του Ac-Arg-Gly-Asp C 2 2 Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το - Arg(Pbf)-Gly-Asp(t-Bu)--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η ακετυλίωση της Ν α -αµινοµάδας της αργινίνης σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο ακετυλίωσης όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνονται οι πλευρικές προστατευτικές οµάδες (Bu-t) και (Pbf) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 100mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ+ + ) (M+2 + ) 6.38 (E4, C1)* *Ε4: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

102 Γ3.5.2 Σύνθεση του Ac-Arg-Gly-Asp(Bzl) C 2 2 Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker περίπου 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το -Arg(Pbf)-Gly-Asp(Bzl)--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η ακετυλίωση της Ν α -αµινοµάδας της αργινίνης σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο ακετυλίωσης όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ2.4.8.Στη συνέχεια αποµακρύνεται η πλευρική προστατευτική οµάδα (Pbf) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 145mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ+ + ) 8.62 (E2, C1)* *Ε2: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

103 Γ3.5.3 Σύνθεση του Ac-Lys-Gly-Asp C 2 2 Ac-Lys-Gly-Asp- 2 Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker περίπου 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το -Lys(Boc)-Gly-Asp(t-Bu)--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η ακετυλίωση της Ν α -αµινοµάδας της αργινίνης σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο ακετυλίωσης όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνονται οι πλευρικές προστατευτικές οµάδες (Bu-t) και (Boc) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 120mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 4 : (Μ+ + ) (M+2 + ) 8.72 (E2, C1)* (M+3 + ) *E2: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

104 Γ3.5.4 Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το - Arg(Pbf)-Gly-Asp(t-Bu)--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του σαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Σαλικυλικό οξύ (138mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3.5h. Ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνονται οι πλευρικές προστατευτικές οµάδες (t-bu) και (Pbf) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 100mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ+ + ) (E4, C1)* *E4: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

105 Γ3.5.5 Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το - Arg(Pbf)-Gly-Asp(Bzl)--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του σαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Σαλικυλικό οξύ (138mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 4h. Ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνονται η πλευρική προστατευτική οµάδα (Pbf) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 143mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ+ + ) (E4, C1)* *Ε4: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

106 Γ3.5.6 Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Me) Me 2 2 Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το - Arg(Pbf)-Gly-Asp(Me)--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του σαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Σαλικυλικό οξύ (138mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3h. Ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνονται η πλευρική προστατευτική οµάδα (Pbf) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 142mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ+ + ) (E4,C1)* *Ε4: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

107 Γ3.5.7 Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-Leu-Asp Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το - Arg(Pbf)-Leu-Asp(t-Bu)--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του σαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Σαλικυλικό οξύ (138mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3.5h. Ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνονται οι πλευρικές προστατευτικές οµάδες (t-bu) και (Pbf) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h.Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 110mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ+ + ) (E4,C1)* *Ε4: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

108 Γ3.5.8 Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-Leu-Asp(Bzl) Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το - Arg(Pbf)-Leu-Asp(Bzl)--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του σαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Σαλικυλικό οξύ (138mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3h. Ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνονται η πλευρική προστατευτική οµάδα (Pbf) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h.Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 138mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ+ + ) (E4, C2)* *Ε4: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C2 : ucleosil C8, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

109 Γ3.5.9 Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-Leu-Asp(Me) Me 2 2 Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το - Arg(Pbf)-Leu-Asp(Me)--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του σαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Σαλικυλικό οξύ (138mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3h. Ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνεται η πλευρική προστατευτική οµάδα (Pbf) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 152mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ+Η + ) (E4, C1)* *Ε4: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

110 Γ Σύνθεση του TFA -Arg-Leu-Asn TFA. 2 Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το - Arg(Pbf)-Leu-Asn--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή 2 2 φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνεται η πλευρική προστατευτική οµάδα (Pbf) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 98mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 4 : (Μ+Η + ) 10.6 (Ε4, C1)* *Ε4: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

111 Γ Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-Leu-Asn Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το - Arg(Pbf)-Leu-Asn--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του σαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Σαλικυλικό οξύ (138mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3.5h. Ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνεται η πλευρική προστατευτική οµάδα (Pbf) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 137mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ+ + ) (E4, C1)* *Ε4: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

112 Γ Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-Gly-Asn Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το - Arg(Pbf)-Gly-Asn--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του σαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Σαλικυλικό οξύ (138mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3.5h. Ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνεται η πλευρική προστατευτική οµάδα (Pbf) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 148mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ+ + ) (E4, C1)* *Ε4: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

113 Γ Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Lys-Gly-Asp(ΟBzl) Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το - Lys(Boc)-Gly-Asp(Bzl)--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του σαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Σαλικυλικό οξύ (138mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3h. Ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνεται οι πλευρικές προστατευτικές οµάδες (Boc) και (Pbf) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 98mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ+ + ) (E4, C1)* *Ε4: 20% (A), 80% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

114 Γ Σύνθεση του 5-Br-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp Br 2 Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το - Arg(Pbf)-Gly-Asp(t-Bu)--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του 5-Βρωµοσαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. 5-Βρωµοσαλικυλικό οξύ (217mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3h. Αφού η αντίδραση ολοκληρωθεί ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνονται οι πλευρικές προστατευτικές οµάδες (t-bu) και (Pbf) µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 143mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Br Rf 1 : (Μ+ + ) 9.23 (E2, C1)* *Ε2: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

115 Γ Σύνθεση του 5-Br-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) Br 2 Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το - Arg(Pbf)-Gly-Asp(Bzl)--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του 5-Βρωµοσαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. 5-Βρωµοσαλικυλικό οξύ (217mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3h. Αφού η αντίδραση ολοκληρωθεί ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνεται η πλευρική προστατευτική οµάδα (Pbf) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 158mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Br Rf 1 : (Μ+ + ) (E2, C1)* *Ε2: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

116 Γ Σύνθεση του 5-Br-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Me) Me Br 2 Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το - Arg(Pbf)-Gly-Asp(Me)--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του 5-Βρωµοσαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. 5-Βρωµοσαλικυλικό οξύ (217mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3.5h. Αφού η αντίδραση ολοκληρωθεί ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνεται η πλευρική προστατευτική οµάδα (Pbf) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 162mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Br Rf 1 : (Μ + ) (E2, C1)* *Ε2: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

117 Γ Σύνθεση του 5-Cl-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp Cl 2 Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το - Arg(Pbf)-Gly-Asp(t-Bu)--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του 5-Χλωροσαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. 5-Χλωροσαλικυλικό οξύ (173mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3h. Αφού η αντίδραση ολοκληρωθεί ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνονται οι πλευρικές προστατευτικές οµάδες (t-bu) και (Pbf) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 112mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Cl Rf 1 : (Μ + ) 9.48 (E2, C1)* *Ε2: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

118 Γ Σύνθεση του 5-Cl-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) Cl 2 Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το - Arg(Pbf)-Gly-Asp(Bzl)--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του 5-Χλωροσαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. 5-Χλωροσαλικυλικό οξύ (173mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3h. Αφού η αντίδραση ολοκληρωθεί ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνονται η πλευρική προστατευτική οµάδα (Pbf) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 148mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Cl 590 Rf 1 : (Μ + ) (M+ + ) (E2, C1)* *Ε2: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

119 Γ Σύνθεση του 5-Cl-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Me) Me Cl 2 Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το - Arg(Pbf)-Gly-Asp(Me)--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του 5-Χλωροσαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. 5-Χλωροσαλικυλικό οξύ (173mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3h. Αφού η αντίδραση ολοκληρωθεί ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνεται η πλευρική προστατευτική οµάδα (Pbf) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 152mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Cl Rf 1 : (Μ+ + ) 9.88 (E2, C1)* *Ε2: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

120 Γ Σύνθεση του C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το - Arg(Pbf)-Gly-Asp(t-Bu)--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του 5-ιτροσαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. 5-Νιτροσαλικυλικό οξύ (183mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3h. Αφού η αντίδραση ολοκληρωθεί ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνονται οι πλευρικές προστατευτικές οµάδες (t-bu) και (Pbf) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 116mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 4 : (Μ+2 + ) 8.92 (E2, C1)* *Ε2: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

121 Γ Σύνθεση του 5-Ν 2-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το - Arg(Pbf)-Gly-Asp(Bzl)--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του 5-ιτροσαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. 5-Νιτροσαλικυλικό οξύ (183mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3h. Αφού η αντίδραση ολοκληρωθεί ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνονται η πλευρική προστατευτική οµάδα (Pbf) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 148mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 4 : (Μ+ + ) (E2, C1)* *Ε2: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

122 Γ Σύνθεση του 5-C 3-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) C 3 2 Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το - Arg(Pbf)-Gly-Asp(Bzl)--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του 5-Μεθυλοσαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. 5-Μεθυλοσαλικυλικό οξύ (152mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3h. Αφού η αντίδραση ολοκληρωθεί ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνονται η πλευρική προστατευτική οµάδα (Pbf) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 133mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ+ + ) (E2, C1)* *Ε2: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

123 Γ Σύνθεση του 5-Η 2-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το - Arg(Pbf)-Gly-Asp(Bzl)--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του Fmoc-5-Αµινοσαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Fmoc-5-Αµινοσαλικυλικό οξύ (375.4mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3h. Αφού η αντίδραση ολοκληρωθεί ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Αφού αποµακρυνθεί η προστατευτική οµάδα Fmoc, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνονται η πλευρική προστατευτική οµάδα (Pbf) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 110mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ+ + ) (E2, C1)* *Ε2: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

124 Γ Σύνθεση του 2-Me-C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) Me 2 2 Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το - Arg(Pbf)-Gly-Asp(Bzl)--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του 2-Μεθοξυβενζοϊκού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. 2-Μεθοξυβενζοϊκό οξύ (152mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3h. Αφού η αντίδραση ολοκληρωθεί ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνεται η πλευρική προστατευτική οµάδα (Pbf) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 115mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ + ) (M+ + ) (E2, C1)* *Ε2: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

125 Γ Σύνθεση του 2-S-C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) S 2 2 Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το - Arg(Pbf)-Gly-Asp(Bzl)--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του Τριτυλοθειοσαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Τριτυλοθειοσαλικυλικό οξύ (396.5mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3h. Αφού η αντίδραση ολοκληρωθεί ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνεται οι πλευρικές προστατευτικές οµάδες (Pbf, Trt) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 129mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C S Rf 1 : (Μ + ) (E2, C1)* *Ε2: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=244nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

126 Γ Σύνθεση του 2-Η 2 -C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το - Arg(Pbf)-Gly-Asp(Bzl)--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του Fmoc-2-Αµινοβενζοϊκού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Fmoc-2-Αµινοβενζοϊκό οξύ (359.4mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύoνται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3h. Αφού η αντίδραση ολοκληρωθεί ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Αφού αποµακρυνθεί η προστατευτική οµάδα Fmoc, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνεται η πλευρική προστατευτική οµάδα (Pbf) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 123mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ + ) (E2, C1)* *Ε2: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

127 Γ Σύνθεση του 2-Αc-C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) C 2 2 Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το - Arg(Pbf)-Gly-Asp(Bzl)--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του Fmoc-2-Αµινοβενζοϊκού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Αφού αποµακρυνθεί η προστατευτική οµάδα Fmoc ακολουθεί η ακετυλίωση της αµινοµάδας επί του πολυµερούς όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Κατόπιν, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνεται η πλευρική προστατευτική οµάδα (Pbf) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 126mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ + ) (E2, C1)* * Ε2: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

128 Γ Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-β-Ala-Asp(Bzl) Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το - Arg(Pbf)-β-Ala-Asp(Bzl)--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του σαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Σαλικυλικό οξύ (138mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3h. Ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνεται η πλευρική προστατευτική οµάδα (Pbf) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 162mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ+ + ) (E2, C2)* *Ε4: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=235nm C2 : ucleosil C8, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

129 Γ Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg-Gly-Asn-Bzl C 6 4 -C-Arg-Gly-Asn-Bzl Για τη σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η σύνθεση της TFA Asn-Bzl όπως περιγράφεται στις παραγράφους Γ3.1.9 Γ Έπειτα συντίθεται στην στερεά φάση το 2--C 6 4 -C-Arg(Pbf)-Gly-, πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση της Fmoc-Gly- στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-Gly- περίπου 0.7mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-Gly- (297.3mg, 1mmol) και DIPEA (0.44mL, 2.5mmol) και ακολουθεί αµέσως αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το -Arg(Pbf)-Gly--CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του σαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Σαλικυλικό οξύ (138mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3h. Αφού η αντίδραση ολοκληρωθεί ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ To προστατευµένο πεπτίδιο (2--C 6 4 -C- Arg(Pbf)-Gly-) αντιδρά µε την TFA Asn-Bzl µε τη µέθοδο των µικτών καρβονικώνκαρβοξυλικών ανυδριτών όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Ποσότητα πεπτιδίου (307mg, 0.5mmol) διαλύεται σε άνυδρο DMF/TF (1mL, 50:50, v/v) και στο διάλυµα αυτό προστίθεται MM (0.055mL, 0.5mmol) και ψύχεται στους -15 C. Στη συνέχεια προστίθεται χλωροµυρµηκικός ισοβουτυλεστέρας (0.064mL, 0.5mmol), ενώ το διάλυµα αναδεύεται µε µαγνητικό αναδευτήρα και αποκλεισµό υγρασίας για 5 min.

130 Ακολουθεί η προσθήκη του προψυχθέντος στους -15 C, εξουδετερωµένου µε ΝΜΜ, διαλύµατος (128mg, 0.4mmol) TFA Asn-Bzl σε DMF (0.4mL). Το µίγµα που προκύπτει αφήνεται να αντιδράσει µε συνεχή ανάδευση στους -15 C για 5h. Μετά το τέλος της αντίδρασης ο διαλύτης συµπυκνώνεται υπό ελαττωµένη πίεση και το λαµβανόµενο ελαιώδες υπόλειµµα µεταφέρεται σε διαχωριστική χoάνη µε AcEt. οργανική φάση πλένεται διαδοχικά µε διάλυµα 5% ac 3, 2, διάλυµα 10% κιτρικού οξέος, 2, ξηραίνεται µε άνυδρο a 2 S 4, διηθείται µε πτυχωτό ηθµό και συµπυκνώνεται, υπό κενό, µέχρι ξηρού. Το λαµβανόµενο ελαιώδες υπόλειµµα κρυσταλλώνεται από µίγµα διαλυτών AcEt/ πετρ. αιθέρα. Το προϊόν φυλάσσεται στον ξηραντήρα υπό κενό πάνω από P 2 5. Στη συνέχεια αποµακρύνεται η πλευρική προστατευτική οµάδα (Pbf) µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 118mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ+ + ) (E4, C1)* *Ε4: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Γ Σύνθεση του 2--C 6 4 -C-Arg(ΝΟ 2 )-Gly-Asp(Bzl) Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το - Arg(ΝΟ 2 )-Gly-Asp(Bzl)--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε

131 στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του σαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Σαλικυλικό οξύ (138mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύoνται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3h. Αφού η αντίδραση ολοκληρωθεί ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνεται ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 137mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) (Μ+ + ) C Rf 1 : (Μ (E1, C1)* ) *Ε1: 20% (A), 80% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=235nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Γ Σύνθεση του 2-Ac-C 6 4 -C-Arg(ΝΟ 2 )-Gly-Asp(Bzl) Ac 2 2 Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η σύνθεση του αναλόγου 52 όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνεται ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 145mg προϊόντος. Ακολουθεί ακετυλίωση του σαλικυλικού οξέος σε διάλυµα ως εξής:

132 Σε ένα διάλυµα πεπτιδίου (100mg, 0.16mmol) σε DCM (1.5mL) προστίθεται ΝΜΜ (0.017 ml, 0.16mmol). Μετά από 3min ενεργοποίησης προστίθεται Ac 2 (0.015 ml, 0.16mmol) και ισοµοριακή ποσότητα ΝΜΜ (0.017 ml, 0.16mmol). Η ολοκλήρωση της αντίδρασης ελέγχεται µε PLC. Μετά το τέλος της αντίδρασης το µίγµα µεταφέρεται µε DCM σε διαχωριστική χοάνη και πλένεται µε 5% ac 3 και νερό. Η οργανική φάση ξηραίνεται µε άνυδρο a 2 S 4, διηθείται µε από πτυχωτό ηθµό και συµπυκνώνεται µέχρι ξηρού, υπό ελαττωµένη πίεση. Το λαµβανόµενο προϊόν κρυσταλλώνεται µε σύστηµα AcEt/Et 2. Ελήφθησαν 93mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ+ + ) (E1, C1)* *Ε1: 20% (A), 80% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=235nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

133 Γ3.6 Συνθέσεις Πεπτιδίων Αµιδίων σε στερεή φάση Γ3.6.1 Σύνθεση του 5-G-2--C 6 3 -C-Gly-Asp(Bzl) Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το -Gly- Asp(Bzl)--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του Fmoc-5-Αµινοσαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Fmoc-5- Αµινοσαλικυλικό οξύ (375.4mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3h. Αφού η αντίδραση ολοκληρωθεί ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Αφού αποµακρυνθεί η Fmoc προστατευτική οµάδα ακολουθεί η γουανιδιλίωση της ελεύθερης αµινοµάδας του 5-αµινοσαλικυλικού οξέος, όπως περιγράφηκε στην παράγραφο Γ Αναλυτικότερα, σε DCM (5mL) διαλύονται, -bis Boc θειουρία (166mg, 0.6mmol), Et 3 (0.083mL, 0.6mmol), DIC (0.093mL, 0.6mmol) και το διάλυµα αυτό προστίθεται στην ρητίνη για 24h. Αφού η αντίδραση ολοκληρωθεί ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνονται οι προστατευτικές οµάδες (Boc) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 102mg προϊόντος.

134 M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ+ + ) (E4, C1)* *Ε4: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Γ3.6.2 Σύνθεση του 5-G-2--C 6 3 -C-βAla-Asp(Bzl) Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το -β- Ala-Asp(Bzl)--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του Fmoc-5-Αµινοσαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Fmoc-5- Αµινοσαλικυλικό οξύ (375.4mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3h. Αφού η αντίδραση ολοκληρωθεί ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Αφού αποµακρυνθεί η Fmoc προστατευτική οµάδα ακολουθεί η γουανιδιλίωση της ελεύθερης αµινοµάδας του 5-αµινοσαλικυλικού οξέος, όπως περιγράφηκε στην παράγραφο Γ Αναλυτικότερα, σε DCM (5mL) διαλύονται, -bis Boc θειουρία (166mg, 0.6mmol), Et 3 (0.083mL, 0.6mmol), DIC (0.093mL, 0.6mmol) και το διάλυµα αυτό προστίθεται στην ρητίνη για 24h. Αφού η αντίδραση ολοκληρωθεί ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνονται οι προστατευτικές οµάδες (Boc) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 92mg προϊόντος.

135 M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ+ + ) (E4, C1)* *Ε4: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL Γ3.6.3 Σύνθεση του 2-G-C 6 4 -C-Gly-Asp(Bzl) Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το -Gly- Asp(Bzl)--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του Fmoc-2-Αµινοβενζοϊκού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Fmoc-2- Αµινοβενζοϊκό οξύ (359.4mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύεται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3h. Αφού η αντίδραση ολοκληρωθεί ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Αφού αποµακρυνθεί η Fmoc προστατευτική οµάδα ακολουθεί η γουανιδιλίωση της ελεύθερης αµινοµάδας του 5-αµινοσαλικυλικού οξέος, όπως περιγράφηκε στην παράγραφο Γ Αναλυτικότερα, σε DCM (5mL) διαλύονται, -bis Boc θειουρία (166mg, 0.6mmol), Et 3 (0.083mL, 0.6mmol), DIC (0.093mL, 0.6mmol) και το διάλυµα αυτό προστίθεται στην ρητίνη για 24h. Αφού η αντίδραση ολοκληρωθεί ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνονται οι προστατευτικές

136 οµάδες (Boc) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 89mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ+ + ) (E4, C1)* *Ε4: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Γ3.6.4 Σύνθεση του 2-G-C 6 4 -C-βΑla-Asp(Bzl) Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoclinker στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Γ2.4.7 και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-linker 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-linker (700mg, 1mmol) και DIPEA (0.68mL, 4mmol). Aκολουθεί αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το -β- Ala-Asp(Bzl)--linker-CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του Fmoc-2-Αµινοβενζοϊκού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Fmoc-2- Αµινοβενζοϊκό οξύ (359.4mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύεται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3h. Αφού η αντίδραση ολοκληρωθεί ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Αφού αποµακρυνθεί η Fmoc προστατευτική οµάδα ακολουθεί η γουανιδιλίωση της ελεύθερης αµινοµάδας του 5-αµινοσαλικυλικού οξέος, όπως περιγράφηκε στην παράγραφο Γ Αναλυτικότερα, σε DCM (5mL) διαλύονται, -bis Boc θειουρία (166mg, 0.6mmol), Et 3 (0.083mL, 0.6mmol), DIC (0.093mL, 0.6mmol) και το διάλυµα αυτό προστίθεται στην ρητίνη για 24h. Αφού η αντίδραση ολοκληρωθεί ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4).

137 Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο-linker αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Στη συνέχεια αποµακρύνονται οι προστατευτικές οµάδες (Boc) και ο linker µετά από κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h.Ακολουθεί συµπύκνωση του διαλύµατος υπό κενό και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείµµατος µε άνυδρο αιθέρα, διήθηση και ξήρανση πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 95mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ+ + ) (E4, C1)* *Ε4: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

138 Γ3.7 Συνθέσεις κυκλικών πεπτιδίων Γ3.7.1 Σύνθεση του 5-Η-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp 58 2 Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoc- Asp(t-Bu)- στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-Asp(t-Bu)- 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-Asp(t-Bu)- (411.5mg, 1mmol) και DIPEA (0.44mL, 2.5mmol) και ακολουθεί αµέσως αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το -Arg(Pbf)-Gly-Asp(t-Bu)--CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση, όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του Fmoc-5-Αµινοσαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Fmoc-5-Αµινοσαλικυλικό οξύ (375.4mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύoνται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3h. Αφού η αντίδραση ολοκληρωθεί ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Αφού αποµακρυνθεί η Fmoc προστατευτική οµάδα ακολουθεί η απόσπαση του πεπτιδίου από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Το προστατευµένο πεπτίδιο (250mg, 0.32mmol) διαλύεται σε DMF (10ml) και ακολούθως προστίθεται κολλιδίνη (0.252mL, 1.92mmol). Το µίγµα αναδεύεται για 5min και στη συνέχεια προστίθεται Bt (148mg, 0.96mmol). Ακολούθως και για 3h το µίγµα µεταφέρεται στάγδην σε διάλυµα TBTU (308mg, 0.96mmol) σε DMF (80mL). Η αντίδραση αφήνεται άλλες 3h υπό ανάδευση. Ο έλεγχος της πορείας έγινε µε χρωµατογραφία TLC και PLC. Ακολουθεί συµπύκνωση υπό κενό και καταβύθιση µε 2. ιηθείται, ξηραίνεται υπό κενό στον ξηραντήρα πάνω από P 2 5 και ακολουθεί η αποµάκρυνση των πλευρικών προστατευτικών οµάδων µε το κατάλληλο µίγµα

139 διαλυτών TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Με προσθήκη άνυδρου αιθέρα καταβυθίζεται το επιθυµητό προϊόν. Ελήφθησαν 86mg. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ+ + ) (E2, C1) *Ε2: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Γ3.7.2 Σύνθεση του 5-Η-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) 59 2 Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoc- Asp(Bzl)- στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-Asp(Bzl)- 0.5mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-Asp(Bzl)- (444.4mg, 1mmol) και DIPEA (0.44mL, 2.5mmol) και ακολουθεί αµέσως αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το -Arg(Pbf)-Gly-Asp(Bzl)--CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση, όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του Fmoc-5-Αµινοσαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Fmoc-5-Αµινοσαλικυλικό οξύ (375.4mg, 1mmol) και PyBP (572.4mg, 1.1mmol) διαλύoνται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.435mL, 2.5mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3h. Αφού η αντίδραση ολοκληρωθεί ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Αφού αποµακρυνθεί η Fmoc προστατευτική οµάδα ακολουθεί η απόσπαση του πεπτιδίου από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Το προστατευµένο πεπτίδιο (250mg, 0.30mmol) διαλύεται σε DMF (10ml) και ακολούθως προστίθεται κολλιδίνη (0.236mL, 1.80mmol). Το µίγµα αναδεύεται για 5min και στη συνέχεια προστίθεται Bt (138mg, 0.90mmol). Ακολούθως και για 3h το µίγµα

140 µεταφέρεται στάγδην σε διάλυµα TBTU (289mg, 0.90mmol) σε DMF (80mL). Η αντίδραση αφήνεται άλλες 3h και γίνεται υπό ανάδευση. Ο έλεγχος της πορείας έγινε µε χρωµατογραφία TLC και PLC. Ακολουθεί συµπύκνωση υπό κενό και καταβύθιση µε 2. ιηθείται, ξηραίνεται υπό κενό στον ξηραντήρα πάνω από P 2 5 και ακολουθεί η αποµάκρυνση των πλευρικών προστατευτικών οµάδων µε το κατάλληλο µίγµα διαλυτών TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Με προσθήκη άνυδρου αιθέρα καταβυθίζεται το επιθυµητό προϊόν. Ελήφθησαν 98mg. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C Rf 1 : (Μ+ + ) (E2, C1) *Ε2: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Γ3.7.3 Σύνθεση του 2-S-C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp-Cys S S Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoc- Cys(Mmt)- στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-Cys(Mmt)- 0.6mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-Cys(Mmt)- (631.8mg, 1mmol) και DIPEA (0.44mL, 2.5mmol) και ακολουθεί αµέσως αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το -Arg(Pbf)-Gly-Asp(t-Bu)-Cys(Mmt)--CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του Τριτυλοθειοσαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Τριτυλοθειοσαλικυλικό οξύ (475.8mg, 1.2mmol) και PyBP (686mg, 1.32mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.522mL, 3mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3h. Αφού η αντίδραση ολοκληρωθεί ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο αποµακρύνεται από

141 την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Με το µίγµα DCM/TFA/TES (7:2:1,v/v) αποµακρύνoνται οι οµάδες Τrt και Mmt, συµπυκνώνεται υπό κενό και καταβυθίζεται µε αιθέρα. Στη συνέχεια το πεπτίδιο διαλύεται σε 5mL διάλυµα 2 Ο/DMS (4:1,v/v) για 24h προς κυκλοποίηση, λυοφιλοποιείται για αποµάκρυνση των διαλυτών και αποµακρύνονται η Pbf και η t-bu µε το µίγµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v), συµπυκνώνεται υπό κενό και το ελαιώδες υπόλειµµα καταβυθίζεται µε αιθέρα και ξηραίνεται πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 175mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C S Rf 1 : (Μ + ) (E2, C1) *Ε2: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Γ3.7.4 Σύνθεση του 2-S-C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl)-Cys S S Για την σύνθεση του πεπτιδίου πραγµατοποιείται αρχικά η εστεροποίηση του Fmoc- Cys(Mmt)- στην 2-CLTR, όπως έχει ήδη περιγραφεί και προκύπτει υποκατάσταση σε Fmoc-Cys(Mmt)- 0.6mmol/g ρητίνης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται Fmoc-Cys(Mmt)- (631.8mg, 1mmol) και DIPEA (0.44mL, 2.5mmol) και ακολουθεί αµέσως αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας µε διάλυµα 20% πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια συντίθεται το -Arg(Pbf)-Gly-Asp(Bzl)-Cys(Mmt)--CLTR σύµφωνα µε τη γενική µέθοδο σύνθεσης σε στερεή φάση όπως έχει ήδη περιγραφεί στις παραγράφους Γ2.4.1 Γ Ακολουθεί η σύζευξη του Τριτυλοθειοσαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Τριτυλοθειοσαλικυλικό οξύ (475.8mg, 1.2mmol) και PyBP (686mg, 1.32mmol) διαλύονται σε DMF και ακολουθεί η προσθήκη DIPEA (0.522mL, 3mmol). Το µίγµα αυτό προστίθεται στο πολυµερές και η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3h. Αφού η αντίδραση

142 ολοκληρωθεί ακολουθούν οι πλύσεις του πολυµερούς όπως και προηγουµένως (Γ2.4.4). Μετά το τέλος της σύνθεσης, το προστατευµένο πεπτίδιο αποµακρύνεται από την ρητίνη µετά από κατεργασία µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1,v/v) για 1h, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ Με το µίγµα DCM/TFA/TES (7:2:1,v/v) αποµακρύνoνται οι οµάδες Τrt και Mmt, συµπυκνώνεται υπό κενό και καταβυθίζεται µε αιθέρα. Στη συνέχεια το πεπτίδιο διαλύεται σε 5mL διάλυµα 2 Ο/DMS (4:1,v/v) για 24h προς κυκλοποίηση, λυοφιλοποιείται για αποµάκρυνση των διαλυτών και αποµακρύνεται η Pbf µε το µίγµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v), συµπυκνώνεται υπό κενό και το ελαιώδες υπόλειµµα καταβυθίζεται µε αιθέρα και ξηραίνεται πάνω από P 2 5. Ελήφθησαν 176mg προϊόντος. M.T. M.W. TLC ESI-MS (m/z) t R (min) C S Rf 1 : (Μ + ) (E2, C1)* *Ε2: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm C1: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

143 Γ4 Βιολογικές οκιµές Γ4.1 Προετοιµασία των αιµοπεταλίων Αρχικά λαµβάνεται µικρή ποσότητα αίµατος από υγιείς δότες οι οποίοι δεν έχουν λάβει ασπιρίνη ή κάποιο άλλο αντιφλεγµονώδες σκεύασµα για τουλάχιστον δύο εβδοµάδες πριν την αιµοληψία. Για τη συλλογή του αίµατος χρησιµοποιείται συνήθως βελόνα πεταλούδα, ενώ ο δότης θα πρέπει να είναι σε κατάσταση ηρεµίας τουλάχιστον µισή ώρα πριν την αιµοληψία. Σαν αντιπηκτικό για τα συλλεγόµενα δείγµατα χρησιµοποιείται 3.8% διαλύµατος κιτρικού νατρίου (9:1, αίµατος/κιτρικού νατρίου) σε τελική συγκέντρωση 10mM. Στη συνέχεια και αµέσως µετά την αιµοληψία τα δείγµατα φυγοκεντρούνται σε θερµοκρασία δωµατίου, σε 1000rpm για 8-10min. Με αυτόν τον τρόπο λαµβάνεται το υπερκείµενο πλούσιο σε αιµοπετάλια πλάσµα (Platelet Rich Plasma, PRP). To υποκείµενο υγρό, υφίσταται περαιτέρω φυγοκέντρηση σε 4000rpm για 10min, ώστε τελικά να συλλεχθεί το φτωχό σε αιµοπετάλια πλάσµα (Platelet Poor Plasma, PPP). Η περιεκτικότητα του πλούσιου σε αιµοπετάλια πλάσµατος, µετράται µε αυτόµατο αναλυτή αίµατος, ο οποίος ανήκει στον εξοπλισµό του εργαστηρίου. Η τελική συγκέντρωση των αιµοπεταλίων ρυθµίζεται στην επιθυµητή τιµή των plt/mL, µετά από ανάλογη κάθε φορά αραίωση µε φτωχό σε αιµοπετάλια πλάσµα. Γ4.2 Μέτρηση της συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων Για την ανίχνευση της συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων εφαρµόζεται η οπτική µέθοδος σε ένα aggregometer τεσσάρων καναλιών (Four Channel Platelet Aggregometer). Το αιώρηµα των αιµοπεταλίων προεπωάζεται στους 37 C για 15-30min ώστε να επιτύχουµε τη µέγιστη δυνατή ενεργοποίηση και να επιβεβαιωθεί η λειτουργικότητα των αιµοπεταλίων. Σαν συγκολλητικές ουσίες αναφοράς χρησιµοποιούνται κολλαγόνο (2µg/mL), διφωσφορική αδενοσίνη (ADP) (10µM) ή ριστοσετίνη (1,25 mg/ml). ι προς εξέταση ενώσεις προεπωάζονται µε το PRP για τουλάχιστον 15min. Ακολουθεί η προσθήκη του αιµοπεταλιακού διεγέρτη. Το προς ανάλυση δείγµα παρασκευάζεται µε προσθήκη 450µL από το PRP, 50µL Luciferase, 30µL πιθανό αναστολέα και 10µL από τον

144 αιµοπεταλιακό διεγέρτη. Η οπτική απορρόφηση καταγράφεται για τουλάχιστον 4 min, χρονικό διάστηµα στο οποίο τα αιµοπετάλια επιτυγχάνουν µέγιστη απόκριση στον διεγέρτη. Οι αραιώσεις γίνονται µε 20, 10, 5µL για την δοσοεξαρτώµενη δράση της πιθανής αναστολής. Γ4.3 Έκφραση της βιολογικής δραστικότητας σε τιµές IC 50 Για την ποσοτική σύγκριση των αποτελεσµάτων της δραστικότητας των ενώσεων που µελετήθηκαν η βιολογική τους δράση εκφράζεται σε τιµές IC 50. Σαν τιµή IC 50 χαρακτηρίζεται η συγκέντρωση της ουσίας σε mm που µπορεί να προκαλέσει το 50% της συγκεκριµένης δράσης, στην περίπτωση µας, της αναστολής της συσσωµάτωσης. Στην τιµή IC 50 λαµβάνεται υπόψη και ο χρόνος. Έτσι όλες οι τιµές αναφέρονται στον ίδιο χρόνο, από την αρχή του φαινοµένου. Συνήθως το διάλυµα είναι αρκετά πυκνό, ενώ σταδιακά µε συνεχείς αραιώσεις προχωρούµε σε µικροτερες συγκεντρώσεις. Τα αποτελέσµατα εκφράζονται σε εκατοστιαίο ποσοστό οπτικής απορρόφησης, όπου σαν οπτική απορρόφηση 100% λαµβάνεται η απορρόφηση του πλούσιου σε αιµοπετάλια πλάσµατος χωρίς αναστολέα (που χρησιµοποιήθηκε ως τυφλό) ενώ ως οπτική απορρόφηση 0% λαµβάνεται αυτή του πλάσµατος µε τα αιµοπετάλια σε αιώρηµα. Κατά τη διάρκεια της µέτρησης της οπτικής απορρόφησης τα αιωρήµατα των αιµοπεταλίων βρίσκονταν υπό συνεχή ανάδευση µε µικρό µεταλλικό µαγνήτη, προκειµένου να παραµένουν στην µορφή αιωρήµατος. Κάθε πείραµα επαναλαµβάνεται 3 φορές. Ο απαιτούµενος χρόνος ολοκλήρωσης των πειραµάτων πρέπει να γίνεται µέσα σε σύντοµο χρονικό διάστηµα από το χρόνο της αιµοληψίας (3h). Γ4.4 Η Κυτταροµετρία ροής σε ενεργοποιηµένα αιµοπετάλια Η κυτταροµετρία ροής, παρά το υψηλό κόστος αγοράς των οργάνων και των διαγνωστικών kit, αποτελεί ένα πολύτιµο εργαλείο στα χέρια των ερευνητών για την µελέτη της λειτουργίας των αιµοπεταλίων 130. Κύριο πλεονέκτηµά της είναι η γρήγορη µέτρηση ειδικών χαρακτηριστικών µεγάλου αριθµού κυττάρων. Πριν την κυτταροµετρική 130 Michelson, A., Blood, 87 (1996) 4925

145 ανάλυση, τα κύτταρα φωτοσηµαίνονται συνήθως µε ένα φθορίζον µονοκλωνικό αντίσωµα (MoAb). Στη συνέχεια, στο κυτταρόµετρο τα αιωρούµενα κύτταρα περνούν διαµέσου µιας κυψελίδας µε ρυθµό 1000 έως το λεπτό και από την εστιασµένη ακτίνα ενός laser. Μετά την ενεργοποίηση της φθορίζουσας χρωµοφόρας σε συγκεκριµένο µήκος κύµατος, ένας ανιχνευτής επεξεργάζεται το εκπεµπόµενο σήµα κάθε κυττάρου. Τα πλεονεκτήµατα της µεθόδου συνοψίζονται στον επόµενο πίνακα: Πίνακας Πλεονεκτήµατα της Κυτταροµετρίας Ροής για τη Μελέτη Ενεργοποιηµένων Αιµοπεταλίων Η ενεργοποίηση των αιµοπεταλίων µελετάται στις πιο φυσιολογικές συνθήκες µέτρησης που µπορεί να 1. υπάρξουν Ελάχιστη παρέµβαση στα δείγµατα προλαµβάνει ψευδή αποτελέσµατα στην in vitro ενεργοποίηση των 2. αποτελεσµάτων και ισχυρή µείωση σε υποπληθυσµούς των αιµοπεταλίων Μπορούν να προσδιοριστούν τόσο η ενεργοποίηση όσο και η αντιδραστικότητα των αιωρούµενων 3. αιµοπεταλίων Μπορούν να ανιχνευθούν αλλαγές σχετιζόµενες µε την ενεργοποίηση ταυτόχρονα σε πολλούς επιφανειακούς 4. υποδοχείς Νέα µονοκλωνικά αντισώµατα ειδικά για νέους λειτουργικούς επιτόπους µπορούν να ενσωµατωθούν στην 5. ανάλυση 6. Ανίχνευση υποπληθυσµών των αιµοπεταλίων µε υψηλή ευαισθησία 7. Απαιτείται µικρή ποσότητα αίµατος (~2µL) 8. Τα αιµοπετάλια ασθενών µε θροµβοκυτταροπενία µπορούν να αναλυθούν µε υψηλή ακρίβεια Η ενεργοποίηση των αιµοπεταλίων από τη θροµβίνη µπορεί να µετρηθεί απευθείας στο αίµα µε τη χρήση του 9. πεπτιδίου Gly-Pro-Arg-Pro ή του πεπτιδίου TRAP 10. Καθόλου ραδιενέργεια Μειονεκτήµατα της µεθόδου αυτής είναι ότι τα κυτταρόµετρα ροής είναι όργανα µε υψηλό κόστος αγοράς και συντήρησης. Επίσης, για την κλινική τους χρήση απαιτείται η λειτουργία τους από αφοσιωµένο και εξειδικευµένο προσωπικό ενώ, για την αποφυγή ex vivo ενεργοποίησης των αιµοπεταλίων τα δείγµατα πρέπει να αναλύονται µέσα σε µια ώρα από την αιµοληψία. Ο χρόνος αυτός µεγαλώνει όταν πρόκειται για πλάσµα πλούσιο σε αιµοπετάλια (PRP).

146 Ο Χρίστος Παπαδηµητρίου, Καθηγητής Πληροφορικής στο Berkley University, σε µια συνέντευξή του είχε δηλώσει προ καιρού: Κανείς δεν είναι ταπεινός. Όλοι ξέρουµε ποιοι και τι είµαστε. Απλώς οι πιο τυχεροί από µας δεν χάνουν την αληθινή σηµασία των πραγµάτων. εν ξεχνούν ότι πρόκειται για ένα παιχνίδι. Η επιστηµονική δηµιουργία σε ορισµένες περιοχές σε κρατά παιδί. Σίγουρα η επιστήµη των µαθηµατικών. Και η επιστήµη της χηµείας συµπληρώνω.

147 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ

148 1 ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ - ΣΚΟΠΟΣ ΕΚΠΟΝΗΣΗΣ ΤΗΣ ΙΑΤΡΙΒΗΣ Όπως αναφέρθηκε στην εισαγωγή περίπου δεκαεπτά εκατοµµύρια άνθρωποι πεθαίνουν ετησίως από καρδιοαγγειακές ασθένειες. Οι καρδιοαγγειακές ασθένειες δεν αφορούν µόνο τον ανεπτυγµένο δυτικό κόσµο αλλά τον αναπτυσσόµενο και τον τρίτο κόσµο. ιεθνώς γίνεται µια µεγάλη σε έκταση έρευνα σχετική µε τους παράγοντες δηµιουργίας καρδιοαγγειακών παθήσεων, µε την πρόληψή τους και τη φαρµακευτική αντιµετώπισή τους. Καθώς η γνώση της βιολογίας του αιµοπεταλίου (κοινή παραδοχή πλέον ότι είναι ο κυρίαρχος παράγοντας στην αιµόσταση και στην θρόµβωση) αυξάνεται, νέες θεραπείες µε βάση αυτή τη γνώση αναπτύσσονται για την αναστολή των κυτταρικών του λειτουργιών. Επειδή η κύρια λειτουργία των αιµοπεταλίων είναι η αιµόσταση, δεν εκπλήσσει το γεγονός ότι οι περισσότεροι υποδοχείς εµπλέκονται άµεσα στην ενεργοποίηση των αιµοπεταλίων ή αλληλεπιδρούν µε το κατεστραµµένο κυτταρικό τοίχωµα ή µε άλλα αιµοπετάλια για να σχηµατίσουν θρόµβο. Η ποικιλία των διαφορετικών υποδοχέων, οι οποίοι εµπλέκονται στη διαδικασία της αιµόστασης, δείχνει τη σηµασία που διαδραµατίζουν στις λειτουργίες του αιµοπεταλίου και τους τρόπους που διαθέτουν τα αιµοπετάλια προκειµένου να λειτουργήσουν ικανοποιητικά σε διάφορες καταστάσεις. Η διαφορά µεταξύ φυσιολογικής αιµόστασης και παθολογικής θρόµβωσης είναι πολύ µικρή και επιπλέον συνεχώς αναγνωρίζεται η εµπλοκή των αιµοπεταλίων σε άλλες λειτουργίες, πχ στη φλεγµονή, στο ανοσοποιητικό σύστηµα, στην ανάπτυξη καρκινικών όγκων και στη µετάστασή τους, κτλ. Μια από τις πιο αξιοσηµείωτες ιδιότητες των αιµοπεταλίων είναι ότι µέσα σε λίγα δευτερόλεπτα από τη διέγερσή τους από έναν αγωνιστή αποκτούν την ικανότητα να προσκολλώνται και να συσσωµατώνονται. Η ικανότητα αυτή οφείλεται σε ένα ειδικό υποδοχέα στην επιφάνεια των αιµοπεταλίων, τον GP IIb/IIIa. Ο α IIb β 3 υποδοχέας µπορεί να δεσµεύει διάφορες συγκολλητικές γλυκοπρωτεΐνες, όπως το ινωδογόνο, το κολλαγόνο, ο παράγοντας von Willebrand (VWF), η ινοσυνδετίνη, η υαλοσυνδετίνη κ.α. Κοινό χαρακτηριστικό γνώρισµα όλων αυτών των πρωτεϊνών είναι η αλληλουχία αργινίνη γλυκίνη - ασπαραγινικό (Arg-Gly- Asp ή RGD). Η δράση της ασπιρίνης (ακετυλοσαλικυλικό οξύ) ως αντιθροµβωτικό σκεύασµα διαπιστώθηκε στα µέσα του εικοστού αιώνα, ενώ το 1971 ο John Vane ανακάλυψε το

149 µηχανισµό δράσης της στις προσταγλανδίνες. Αν και οι παρενέργειες που δηµιουργούνται από τη συνεχή χρήση της (έλκος στοµάχου, αιµορραγίες, βλάβες στα νεφρά, κτλ) είναι εξαιρετικά σοβαρές, συνεχίζει να αποτελεί ένα από τα πρώτα συνιστώµενα φαρµακευτικά σκευάσµατα τα οποία χρησιµοποιούνται στην αντιθροµβωτική αγωγή των ασθενών. Ο ρόλος της βέβαια έχει γίνει πιο επικουρικός αφού στη διάθεση των γιατρών έχουν προστεθεί νέα αντιθροµβωτικά φάρµακα µε λιγότερες παρενέργειες. Κατά την εκπόνηση της παρούσας διατριβής έγινε η σύνθεση και η µελέτη πεπτιδίων, αναλόγων του RGD, τα οποία συνδυάζουν στο ίδιο µόριο και το σαλικυλικό οξύ ή/και παράγωγά του µε στόχο να προκύψουν ισχυροί αναστολείς της συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων του ανθρώπου. Η µελέτη εστιάστηκε στα εξής: Σύνθεση γραµµικών πεπτιδίων, αναλόγων του RGD, τα οποία φέρουν παράγωγα του σαλικυλικού οξέος. Σύνθεση κυκλικών πεπτιδίων, τα οποία περιέχουν το τριπεπτίδιο RGD και παράγωγα του σαλικυλικού οξέος. Η σύνθεση των πεπτιδίων αυτών έγινε διότι: α) γενικώς τα κυκλικά πεπτίδια παρουσιάζουν αυξηµένη αντοχή έναντι των ενδοπεπτιδασών σε σχέση µε τα αντίστοιχα γραµµικά. β) τα κυκλικά πεπτίδια γενικότερα, λόγω των περιοριστικών διαµορφώσεων που αποκτούν οι δοµές τους, εµφανίζουν υψηλότερη βιολογική δραστικότητα από τα αντίστοιχα γραµµικά. Σύνθεση πεπτιδίων-αµιδίων τα οποία περιέχουν την οµάδα της αργινίνης, τη γουανιδινοµάδα, ενσωµατωµένη στο 5-αµινοσαλικυλικό οξύ. Έλεγχος και µελέτη της ανασταλτικής δράσης των γραµµικών και κυκλικών πεπτιδίων στη συσσωµάτωση των αιµοπεταλίων τ in vitro Έλεγχος και µελέτη των δραστικών αναλόγων για την πρόσδεσή τους µε συγκεκριµένες ιντεγκρίνες µε κυτταροµετρία ροής.

150 2 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 2.1 Γενικά Κατά την εκπόνηση της παρούσας διατριβής συντέθηκαν γραµµικά ανάλογα του πεπτιδίου RGD, πεπτίδια µε ενσωµατωµένη τη γουανιδινοµάδα στα παράγωγα του σαλικυλικού οξέος και τέλος κυκλικά πεπτίδια τα οποία περιείχαν το τριπεπτίδιο RGD και παράγωγα του σαλικυλικού οξέος. Όλα τα συντεθέντα ανάλογα φαίνονται στον παρακάτω πίνακα. Πίνακας 2.1 Πίνακας συντεθέντων αναλόγων οµή Αναλόγου Αριθµός Αναλόγου Ac-Arg-Gly-Asp- 15 Ac-Arg-Gly-Asp(Bzl) C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Me) C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Βzl) C 6 4 -C-Arg-Leu-Asp C 6 4 -C-Arg-Leu-Asp(Me) C 6 4 -C-Arg-Leu-Asp(Βzl)- 22 Ac-Arg-Gly-Asp Ac-Arg-Gly-Asp(Bzl) Ac-Lys-Gly-Asp C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Me) C 6 4 -C-Arg-Leu-Asp C 6 4 -C-Arg-Leu-Asp(Bzl) C 6 4 -C-Arg-Leu-Asp(Me) TFA Arg-Leu-Asn C 6 4 -C-Arg-Leu-Asn C 6 4 -C-Arg-Gly-Asn C 6 4 -C-Lys-Gly-Asp(ΟBzl) Br-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp Br-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) Br-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Me) Cl-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp Cl-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) Cl-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Me)- 2 41

151 C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) C 3-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) Η 2-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) Me-C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) S-C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) Η 2 -C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) Ac-C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) C 6 4 -C-Arg-β-Ala-Asp(Bzl) C 6 4 -C-Arg-Gly-Asn-Bzl C 6 4 -C-Arg(ΝΟ 2 )-Gly-Asp(Bzl) Ac-C 6 4 -C-Arg(ΝΟ 2 )-Gly-Asp(Bzl) G-2--C 6 3 -C-Gly-Asp(Bzl) G-2--C 6 3 -C-βAla-Asp(Bzl) G-C 6 4 -C-Gly-Asp(Bzl) G-C 6 4 -C-Gly-Asp(Bzl) C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) 2-S-C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp-Cys 2-S-C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl)-Cys Συνθέσεις Πεπτιδίων σε Στερεή Φάση Πεπτίδια - Οξέα Η σύνθεση των RGD πεπτιδίων οξέων πραγµατοποιήθηκε µε κλασσικές µεθόδους πεπτιδικής σύνθεσης σε στερεή φάση. Η µέθοδος η οποία ακολουθήθηκε ήταν τέτοια, ώστε να αποκλείεται ή να περιορίζεται στο ελάχιστο δυνατό η ρακεµίωση. Οι συνθήκες των αντιδράσεων είναι ίδιες µε εκείνες οι οποίες περιγράφηκαν στο θεωρητικό µέρος µε στόχο την αντιµετώπιση των γνωστών προβληµάτων της πεπτιδικής σύνθεσης, δηλαδή της παροδικής προστασίας των α-αµινοµάδων και α-καρβοξυλοµάδων, των πλευρικών δραστικών οµάδων και του σχηµατισµού πεπτιδικού δεσµού. Για την προστασία της α-αµινοµάδας των αµινοξέων χρησιµοποιήθηκε η Fmoc-οµάδα. Η αποµάκρυνση της Fmoc-οµάδας σε όλες τις περιπτώσεις έγινε µε την επίδραση διαλύµατος 20% πιπεριδίνης σε DMF. Η παροδική προστασία της β-καρβοξυλοµάδας επιτεύχθηκε µε την µετατροπή της στους κατάλληλους εστέρες. Για το σκοπό αυτό

152 χρησιµοποιήθηκαν οι µεθυλεστέρες, οι τριτοταγείς βουτυλεστέρες και οι βενζυλεστέρες, ενώ για την προστασία της γουανιδινοµάδας της αργινίνης χρησιµοποιήθηκε η Pbfοµάδα. Επειδή η πεπτιδική αλυσίδα στα ανάλογα που συντέθηκαν είναι µικρή χρησιµοποιήθηκε η τεχνική της σταδιακής επέκτασης της πεπτιδικής αλυσίδας (step by step). Η σύνθεση όλων των αναλόγων έγινε στη στερεή φάση επί της 2-CLTR ρητίνης συνδυάζοντας την µε τη µέθοδο του DIC/Bt. Η εστεροποίηση του πρώτου αµινοξέος στη ρητίνη πραγµατοποιήθηκε σε DCM παρουσία DIPEA, ενώ η εξουδετέρωση των δραστικών οµάδων του πολυµερούς έγινε µε προσθήκη διαλύµατος Μe/DIPEA σε DCM, όπως αναφέρεται στο πειραµατικό µέρος της διατριβής. Η υποκατάσταση στη ρητίνη υπολογίστηκε, µετά την εστεροποίηση του πρώτου αµινοξέος, από την µεταβολή του βάρους της ρητίνης πριν και µετά την αντίδραση εστεροποίησης. Η ακετυλίωση της α-αµινοµάδας της αργινίνης έγινε επί του πολυµερούς 2-CLTR. Ως µέσο ακετυλίωσης χρησιµοποιήθηκε Ac 2 και βάση DIPEA σε διαλύτη DMF. Fmoc-Asp(X)- Cl 1. DIPEA / DCM 2. 20% piperidine/dmf 2 -Asp(X)- 2 -Arg(Pbf)-Gly-Asp(X)- 1. Fmoc-AA- DIC/Bt 2. 20% piperidine/dmf Ac 2, DIPEA Ac-Arg(Pbf)-Gly-Asp(X)- 1. DCM / TFE / Ac 7 : 2 : 1 2. TFA / DCM / scavengers 70 : 20 : 10 Ac-Arg-Gly-Asp- Ac-Arg-Gly-Asp(Bzl)- X= t-bu X= Bzl Εικόνα Πορεία σύνθεσης των αναλόγων 15 και 16

153 Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του αναλόγου 15 PLC: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)) Για τη σύζευξη του σαλικυλικού οξέος µε το προστατευµένο πεπτίδιο επί της 2-CLTR ρητίνης αρχικά χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος των καρβοδιϊµιδίων και µε αντιδραστήρια σύζευξης τα DIC/Bt. Η δηµιουργία παραπροϊόντων κατά τη σύζευξη του σαλικυλικού οξέος µε το προστατευµένο πεπτίδιο επί του πολυµερούς οδήγησε σε πολύ µικρή απόδοση στο επιθυµητό προϊόν. Με τη βοήθεια της PLC ανάλυσης, µετά την αποµάκρυνση των προστατευτικών οµάδων, και της φασµατοµετρίας µάζας φτάσαµε σε µια ερµηνεία για τη δοµή των παραπροϊόντων. Αυτό φαίνεται χαρακτηριστικά στο επόµενο PLC χρωµατογράφηµα και στα αντίστοιχα φάσµατα µάζας. Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα του αναλόγου 17 όταν η σύνθεση έγινε µε τη µέθοδο των DIC/Bt PLC: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL))

154 2 Mol. Wt.: 466,4 Εικόνα i Φάσµα µάζας για την κορυφή 1 του χρωµατογραφήµατος της Εικόνας Mol. Wt.: 586,6 Εικόνα ii Φάσµα µάζας για την κορυφή 2 του χρωµατογραφήµατος της Εικόνας Mol. Wt.: 706,7 Εικόνα iii Φάσµα µάζας για την κορυφή 3 του χρωµατογραφήµατος της Εικόνας Όπως φαίνεται και από τα φάσµατα µάζας των κορυφών 1, 2 και 3 του χρωµατογραφήµατος της εικόνας οι τρεις κορυφές διαφέρουν κατά 120, µάζα που αντιστοιχεί στο σαλικυλικό οξύ όταν αυτό σχηµατίζει πεπτιδικό δεσµό (ΜW sal -18). Πολύ πιθανό λοιπόν, κατά την ενεργοποίηση του σαλικυλικού οξέος µε DIC/Bt να σχηµατίζονται εστερικοί δεσµοί µεταξύ του υδροξυλίου ενός µορίου σαλικυλικού οξέος και του καρβοξυλίου ενός δεύτερου µορίου σαλικυλικού οξέος και όλο αυτό το νέο µόριο να αντιδρά προς σύζευξη µε την ελεύθερη αµινοµάδα της Arg.

155 Ίδιας µορφής χρωµατογραφήµατα είχαµε σε όλες τις περιπτώσεις σύζευξης του σαλικυλικού οξέος µε το προστατευµένο πεπτίδιο επί του πολυµερούς µε τη µέθοδο του DIC/Bt (εικόνες και ). Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα του αναλόγου 18 όταν η σύνθεση έγινε µε τη µέθοδο των DIC/Bt (PLC: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)) Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα του αναλόγου 21 όταν η σύνθεση έγινε µε τη µέθοδο των DIC/Bt (PLC: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)) Όταν η µέθοδος σύζευξης του σαλικυλικού οξέος µε το προστατευµένο πεπτίδιο αντικαταστάθηκε από τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων (PyBP/DIPEA) µοναδικό προϊόν της σύζευξης ήταν το επιθυµητό προϊόν και µάλιστα σε πολύ µικρότερο χρόνο αντίδρασης (2-3h). Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα του αναλόγου 17 όταν η σύνθεση έγινε µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων PLC: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

156 Στην Εικόνα φαίνεται το χρωµατογράφηµα PLC του αποπροστατευµένου αναλόγου 17 µετά τη σύζευξη του σαλικυλικού οξέος µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Στην Εικόνα φαίνεται η πορεία σύνθεσης των αναλόγων Fmoc-Asp(X)- Cl DIPEA, DCM Fmoc-Asp(X)- X= t-bu, Me, Bzl 20% piperidine/dmf 30min 2 -Asp(X)- 1. Fmoc-Gly- 2. Fmoc-Arg(Pbf)- DIC/Bt Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Asp(X)- 20% piperidine/dmf 30min 2 -Arg(Pbf)-Gly-Asp(X)- C PyBP, DIPEA -Arg(Pbf)-Gly-Asp(X)- 1. DCM / TFE / Ac 7 : 2 : 1 2. TFA / DCM / scavengers 70 : 20 : 10 Me C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp- 2--C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Me)- 2--C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) Εικόνα Πορεία σύνθεσης των αναλόγων 17-19

157 Στην περίπτωση του αναλόγου 17 η παροδική προστασία του β-καρβοξυλίου του Asp έγινε µε την t-bu οµάδα έτσι ώστε να αποµακρυνθεί µε την κατεργασία της ρητίνης µε το διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v). Αντίθετα στις περιπτώσεις των αναλόγων 18 και 19 οι προστατευτικές οµάδες του β- καρβοξυλίου Me και Bzl αντίστοιχα, παραµένουν ανεπηρέαστες από την κατεργασία µε το διάλυµα αυτό, όπως άλλωστε είχε σχεδιαστεί. Με παρόµοιο τρόπο συντέθηκαν και τα ανάλογα τα οποία αντί για Gly εµπεριέχουν Leu. Στην επόµενη εικόνα παρουσιάζεται η πορεία σύνθεσής τους. Fmoc-Asp(X)- Cl DIPEA, DCM Fmoc-Asp(X)- X= t-bu, Me, Bzl 20% piperidine/dmf 30min 2 -Asp(X)- 1. Fmoc-Leu- 2. Fmoc-Arg(Pbf)- DIC/Bt Fmoc-Arg(Pbf)-Leu-Asp(X)- 20% piperidine/dmf 30min 2 -Arg(Pbf)-Leu-Asp(X)- C PyBP, DIPEA -Arg(Pbf)-Leu-Asp(X)- 1. DCM / TFE / Ac 7 : 2 : 1 2. TFA / DCM / scavengers 70 : 20 : 10 Me C 6 4 -C-Arg-Leu-Asp- 2--C 6 4 -C-Arg-Leu-Asp(Me)- 2--C 6 4 -C-Arg-Leu-Asp(Bzl) Εικόνα Πορεία σύνθεσης των αναλόγων 20-22

158 Στις επόµενες εικόνες ( i και ii) φαίνεται το PLC χρωµατογράφηµα του αναλόγου 20 και το φάσµα µάζας του αντίστοιχα. Εικόνα i PLC χρωµατογράφηµα του αναλόγου 20 PLC: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)) Εικόνα ii Φάσµα µάζας του αναλόγου Πεπτίδια Αµίδια Για τη σύνθεση των RGD πεπτιδίων αµιδίων χρησιµοποιήθηκε η 2-CLTR ρητίνη, όπως και στη σύνθεση πεπτιδίων οξέων, και ως συνδέτης ο Rink Amide Linker. Στην περίπτωση αυτή εστεροποιήθηκε αρχικά ο linker επί του πολυµερούς και έπειτα ακολούθησε η σταδιακή επιµήκυνση της πεπτιδικής αλυσίδας (step by step). Για τη σύζευξη των προστατευµένων αµινοξέων χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος του DIC/Bt. Η υποκατάσταση του linker στη ρητίνη υπολογίστηκε, µετά την εστεροποίησή του, από την µεταβολή του βάρους της ρητίνης πριν και µετά την αντίδραση εστεροποίησης. Η συνήθης υποκατάσταση ήταν mmol/g ρητίνης. Η σύζευξη του σαλικυλικού οξέος και των παραγώγων του µε το προστατευµένο πεπτίδιο έγινε επί του πολυµερούς µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων ώστε:

159 α) να αποφύγουµε τη δηµιουργία παραπροϊόντων και β) να µειώσουµε το χρόνο αντίδρασης. Μετά την ολοκλήρωση της επιµήκυνσης της επιθυµητής πεπτιδικής αλυσίδας το πολυµερές υφίσταται κατεργασία αρχικά µε διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1, v/v) για 1h σε RT υπό ανάδευση, ώστε το προστατευµένο πεπτίδιο linker να αποµακρυνθεί από το πολυµερές και έπειτα ο linker αποµακρύνεται από το πεπτίδιο µε κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5-3h. Fmoc-Linker- Cl 1. DIPEA / DCM 2. 20% piperidine/dmf 2 -Arg(Pbf)-Gly-Asp(X) 1. Fmoc-AA- DIC/Bt 2. 20% piperidine/dmf X= t-bu, Bzl Ac 2, DIPEA Ac-Arg(Pbf)-Gly-Asp(X) 1. DCM / TFE / Ac 7 : 2 : 1 2. TFA / DCM / scavengers 70 : 20 : 10 Ac-Arg-Gly-Asp- 2 Ac-Arg-Gly-Asp(Bzl) =Linker Εικόνα Πορεία σύνθεσης των αναλόγων Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του αναλόγου 23 PLC: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL))

160 Στην Εικόνα φαίνεται το PLC χρωµατογράφηµα και το φάσµα µάζας του αναλόγου 23 ενώ στην Εικόνα φαίνεται το χρωµατογράφηµα και το φάσµα µάζας του αναλόγου 24. Στην περίπτωση του αναλόγου 23 το β-καρβοξύλιο του Asp προστατεύθηκε µε την t-bu οµάδα η οποία και αποµακρύνθηκε κατά την αποµάκρυνση του linker. Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του αναλόγου 24 PLC: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)) Η µόνιµη προστασία του β-καρβοξυλίου του ασπαραγινικού µε τις οµάδες µεθυλοµάδα (ανάλογο 27) και βενζυλοµάδα (ανάλογο 28) έγινε µε στόχο την διερεύνηση της αύξησης της δραστικότητας του πεπτιδίου από την ύπαρξη ή µη λιπόφιλου κέντρου στο άκρο του πεπτιδίου. Για τον ίδιο λόγο αντικαταστάθηκε το ασπαραγινικό µε την ασπαραγίνη (ανάλογο 34). 2 2 Me 2 2--C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Me) C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) C 6 4 -C-Arg-Gly-Asn- 2 34

161 Σε επόµενες παραγράφους γίνεται λόγος για τα βιολογικά αποτελέσµατα και τη σχέση δοµής δραστικότητας. Στην Εικόνα παρουσιάζεται η σύνθεση των αναλόγων και 34. =Linker Fmoc-Linker- Cl Fmoc-Linker- Cl 1. DIPEA / DCM 2. 20% piperidine/dmf 1. DIPEA / DCM 2. 20% piperidine/dmf 1. Fmoc-AA- DIC/Bt 2. 20% piperidine/dmf 1. Fmoc-AA- DIC/Bt 2. 20% piperidine/dmf 2 -Arg(Pbf)-Gly-Asp(X) 2 -Arg(Pbf)-Gly-Asn C C PyBP, DIPEA PyBP, DIPEA -Arg(Pbf)-Gly-Asp(X) -Arg(Pbf)-Gly-Asn 1. DCM / TFE / Ac 7 : 2 : 1 2. TFA / DCM / scavengers 70 : 20 : DCM / TFE / Ac 7 : 2 : 1 2. TFA / DCM / scavengers 70 : 20 : C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp C 6 4 -C-Arg-Gly-Asn C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Me) Εικόνα Πορεία σύνθεσης των αναλόγων και 34 Ακολουθούν τα PLC χρωµατογραφήµατα και τα αντίστοιχα φάσµατα µάζας των ανωτέρω αναλόγων. Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του αναλόγου 26 PLC: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

162 Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του αναλόγου 27 PLC: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του αναλόγου 34 PLC 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Στη συνέχεια συντέθηκαν τα πεπτίδια και 33 στα οποία η Gly έχει αντικατασταθεί από Leu C 6 4 -C-Arg-Leu-Asp C 6 4 -C-Arg-Leu-Asp(Bzl) Me C 6 4 -C-Arg-Leu-Asp(Me) C 6 4 -C-Arg-Leu-Asn- 2 33

163 συνθετική πορεία είναι παρόµοια µε αυτή που αναφέρθηκε στην Εικόνα Τα PLC χρωµατογραφήµατα και τα φάσµατα µάζας των αναλόγων φαίνονται στις επόµενες εικόνες. Εικόνα PLC χρωµατογραφήµατα των αναλόγων 29 (αριστερά) και 30 (δεξιά) PLC: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του αναλόγου 33 PLC 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Παρατηρώντας τα PLC χρωµατογραφήµατα των αναλόγων (26, 29), (27, 30) και (33, 34) φαίνεται καθαρά η αύξηση του χρόνου έκλουσης (t R ) εξαιτίας της αντικατάστασης της Gly από την Leu, η οποία προσδίδει στο πεπτίδιο περισσότερο λιπόφιλο χαρακτήρα. Στη συνέχεια συντέθηκαν ανάλογα τα οποία περιέχουν αλογόνο (Χ= Cl, Br) ή άλλο υποκαταστάτη (Χ= ΝΟ 2, Me, 2 ) στη θέση 5 του δακτυλίου του σαλικυλικού οξέος. Η 5-θέση είναι αποµακρυσµένη τόσο από το υδροξύλιο (θέση 2) όσο και από το καρβοξύλιο (θέση 1) το οποίο συµµετέχει στην δηµιουργία πεπτιδικού δεσµού µε την α-αµινοµάδα της Arg. Επιπλέον, υπάρχουν εµπορικά διαθέσιµα παράγωγα του 2 1 X 5

164 σαλικυλικού οξέος µε ποικίλους υποκαταστάτες στη θέση 5 (ΝΟ 2, ΝΗ 2, Μe, κτλ) Me Br 2 Br 2 Br 2 5-Br-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp Br-2--C6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl)- 2 5-Br-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Me) Me Cl 2 5-Cl-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp Cl 2 Cl 2 5-Cl-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl)- 2 5-Cl-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Me) Εικόνα Πεπτίδια µε υποκαταστάτη αλογόνο (Χ= Br, Cl) στη θέση 5 του σαλικυλικού οξέος Fmoc-Linker- Cl 1. DIPEA / DCM 2. 20% piperidine/dmf 2 -Arg(Pbf)-Gly-Asp(X) 1. Fmoc-AA- DIC/Bt 2. 20% piperidine/dmf C X 1 =Br, Cl PyBP, DIPEA -Arg(Pbf)-Gly-Asp(X) X 1 5-Br-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp Br-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl)- 2 5-Br-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Me) DCM / TFE / Ac 7 : 2 : 1 2. TFA / DCM / scavengers 70 : 20 : Cl-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp- 2 5-Cl-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) Cl-2--C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Me) =Linker Εικόνα Πορεία σύνθεσης των αναλόγων 36 41

165 Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του αναλόγου 36 PLC: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του αναλόγου 37 PLC: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Όπως και σε προηγούµενες εικόνες οι οποίες εµφανίζουν PLC χρωµατογραφήµατα αναλόγων, τα οποία έχουν προστατευµένο το β-καρβοξύλιο του Asp µε την βενζυλοµάδα, έτσι και στις εικόνες και φαίνεται η µετατόπιση του χρόνου έκλουσης (t R ) εξαιτίας της αύξησης της λιποφιλικότητας του µορίου. Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του αναλόγου 38 PLC: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

166 Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του αναλόγου 39 PLC: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του αναλόγου 40 PLC: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Τα ανάλογα συντέθηκαν ακολουθώντας παρόµοια συνθετική πορεία, όπως αυτή παρουσιάζεται στην Εικόνα Στις επόµενες εικόνες φαίνονται τα PLC χρωµατογραφήµατα και τα αντίστοιχα φάσµατα µάζας των αναλόγων Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του αναλόγου 42 PLC: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

167 Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του αναλόγου 43 PLC: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του αναλόγου 44 PLC: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Στην Εικόνα παρουσιάζεται η σύνθεση του αναλόγου 45 το οποίο περιέχει το τροποποιηµένο πετπίδιο Arg-Gly-Asp(Bzl)- 2 και το 5-αµινοσαλικυλικό οξύ. Η σύνθεση του πεπτιδίου αυτού έγινε µε παρόµοιο τρόπο, όπως αναφέρθηκε προηγούµενα. Στην Εικόνα παρουσιάζεται το PLC χρωµατογράφηµα και το φάσµα µάζας του αναλόγου 45.

168 Fmoc-Linker- Cl 1. DIPEA / DCM 2. 20% piperidine/dmf 2 -Arg(Pbf)-Gly-Asp(Bzl) 1. Fmoc-AA- DIC/Bt 2. 20% piperidine/dmf C Fmoc PyBP, DIPEA -Arg(Pbf)-Gly-Asp(Bzl) Fmoc 1. 20% piperidine/dmf 2. DCM / TFE / Ac 7 : 2 : 1 3. TFA / DCM / scavengers 70 : 20 : C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) =Linker Εικόνα Πορεία σύνθεσης του αναλόγου 45 Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του αναλόγου 45 PLC: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Στη συνέχεια συντέθηκαν ανάλογα στα οποία το υδροξύλιο του σαλικυλικού οξέος έχει αντικατασταθεί από Me- (ανάλογο 46), S- (ανάλογο 47), Η 2 Ν- (ανάλογο 48) και Ac- (ανάλογο 49).

169 Me 2 2 S Ac Εικόνα Πεπτίδια-αµίδια µε αντικατάσταση του υδροξυλίου του σαλικυλικού οξέος Fmoc-Linker- Cl 1. DIPEA / DCM 2. 20% piperidine/dmf 2 -Arg(Pbf)-Gly-Asp(Bzl) 1. Fmoc-AA- DIC/Bt 2. 20% piperidine/dmf Me C PyBP, DIPEA Me -Arg(Pbf)-Gly-Asp(Bzl) 1. DCM / TFE / Ac 7 : 2 : 1 2. TFA / DCM / scavengers 70 : 20 : 10 2-Me-C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) =Linker Εικόνα Πορεία σύνθεσης του αναλόγου 46

170 Fmoc-Linker- Cl Fmoc-Linker- Cl 1. DIPEA / DCM 2. 20% piperidine/dmf 1. DIPEA / DCM 2. 20% piperidine/dmf 2 -Arg(Pbf)-Gly-Asp(Bzl) 1. Fmoc-AA- DIC/Bt 2. 20% piperidine/dmf 2 -Arg(Pbf)-Gly-Asp(Bzl) 1. Fmoc-AA- DIC/Bt 2. 20% piperidine/dmf STrt C Fmoc C PyBP, DIPEA STrt -Arg(Pbf)-Gly-Asp(Bzl) 1. DCM / TFE / Ac 7 : 2 : 1 2. TFA / DCM / scavengers 70 : 20 : 10 2-S-C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) =Linker PyBP, DIPEA -Arg(Pbf)-Gly-Asp(Bzl) Fmoc 1. 20% piperidine/dmf 2. DCM / TFE / Ac 7 : 2 : 1 3. TFA / DCM / scavengers 70 : 20 : C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) =Linker Εικόνα Πορεία σύνθεσης των αναλόγων 47 και 48 Fmoc-Linker- Cl 1. DIPEA / DCM 2. 20% piperidine/dmf 2 -Arg(Pbf)-Gly-Asp(Bzl) 1. Fmoc-AA- DIC/Bt 2. 20% piperidine/dmf Fmoc C PyBP, DIPEA -Arg(Pbf)-Gly-Asp(Bzl) Fmoc 1. 20% piperidine/dmf 2. Ac 2 / DIPEA -Arg(Pbf)-Gly-Asp(Bzl) Ac 1. DCM / TFE / Ac 7 : 2 : 1 2. TFA / DCM / scavengers 70 : 20 : 10 2-Ac-C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) =Linker Εικόνα Πορεία σύνθεσης του αναλόγου 49

171 Στις επόµενες εικόνες εµφανίζονται τα PLC χρωµατογραφήµατα και τα φάσµατα µάζας των αναλόγων Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του αναλόγου 46 PLC: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του αναλόγου 47 PLC: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=244nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του αναλόγου 48 PLC: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

172 Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του αναλόγου 49 PLC: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Επίσης, συντέθηκαν τα ανάλογα 50 και 51 στα οποία έγιναν οι παρακάτω τροποποιήσεις: α) στο ανάλογο 50 η Gly έχει αντικατασταθεί από τη β-αla και β) στο ανάλογο 51 το Asp έχει αντικατασταθεί από την AsnΟBzl Εικόνα Τα ανάλογα 50 και 51

173 Gly- 2 -Arg(Pbf)-Gly- 1. Fmoc-Arg(Pbf)- DIC/Bt 2. 20% piperidine/dmf C PyBP, DIPEA -Arg(Pbf)-Gly- DCM / TFE / Ac 7 : 2 : 1 -Arg(Pbf)-Gly- TFA.AsnBzl isobuccl MM -15 o C -Arg(Pbf)-Gly-AsnBzl TFA / DCM / scavengers 70 : 20 : 10 -Arg-Gly-AsnBzl Εικόνα Πορεία σύνθεσης του αναλόγου Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα του ενδιαµέσου πεπτιδίου 2-ΗΟ-C 6 4 -C-Arg(Pbf)-Gly- PLC: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

174 Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του αναλόγου 51 PLC: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Επίσης συντέθηκαν τα ανάλογα 52 και 53 τα οποία αποτελούν τα πρόδροµα µόρια για την σύνθεση του 2-Ac-C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl)- 2, η οποία τελικά δεν υλοποιήθηκε για τους λόγους που αναφέρονται στις επόµενες σελίδες C C 6 4 -C-Arg( 2 )-Gly-Asp(Bzl)- 2 2-Ac-C 6 4 -C-Arg( 2 )-Gly-Asp(Bzl) Ac 2 2-Ac-C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl)- 2 Εικόνα Τα ανάλογα 52 και 53 και το ανάλογο το οποίο τελικά δεν σχηµατίστηκε

175 Fmoc-Linker- Cl 1. DIPEA / DCM 2. 20% piperidine/dmf 1. Fmoc-AA- DIC/Bt 2. 20% piperidine/dmf 2 -Arg( 2 )-Gly-Asp(Bzl) C PyBP, DIPEA -Arg( 2 )-Gly-Asp(Bzl) 2 1. DCM / TFE / Ac 7 : 2 : 1 2. TFA / DCM / scavengers 70 : 20 : C 6 4 -C-Arg( 2 )-Gly-Asp(Bzl) Ac 2 / DIPEA C Ac-C 6 4 -C-Arg( 2 )-Gly-Asp(Bzl) X 2 / Pd-C, min 2 53a Ac 2 Εικόνα Πορεία σύνθεσης των αναλόγων 52 και 53 Στις επόµενες εικόνες παρουσιάζονται τα PLC χρωµατογραφήµατα και τα φάσµατα µάζας των αναλόγων 52 και 53.

176 Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του αναλόγου 52 PLC: 20% (A), 80% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=235nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του αναλόγου 53 PLC: 20% (A), 80% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=235nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Μετά την σύνθεση του αναλόγου 53 προσπαθήσαµε να συνθέσουµε χωρίς επιτυχία την ενώση 53a µέσω µιας καταλυτικής (Pd/C) υδρογονόλυσης. Στην αντίδρασή µας χρησιµοποιήθηκε ως διαλύτης η Me και ως δότης υδρογόνου το 2, ενώ ως καταλύτης χρησιµοποιήθηκε τόσο Pd/C όσο και Pd 2 /C. Η καταλυτική υδρογονόλυση είναι η πιο παραδεκτή και εφαρµόσιµη µέθοδος αποµάκρυνσης της νιτροµάδας 131. αναγωγή µε µέταλλα ή άλατα αυτών, π.χ. Zn και Cl 132, SnCl 133 2, TiCl έχει βρει περιορισµένες εφαρµογές, ενώ η αναγωγή µε a σε υγρή 3 είναι µη εφαρµόσιµη εξαιτίας πολλών παραπροϊόντων Bergmann, M., Zervas., L., Rinke,., oppe-seyler s Z Physiol Chem, 224 (1932) Pless, J., Guttmann, S., in: Peptides 1966, Beyerman C & Maasen van den Brink W (eds) orth olland, Amsterdam, p ayakawa, T., Fujiwara, Y., oguchi, J., Bull Chem Soc Jpn, 40 (1967) Freidinger, RM., irsschmann, R., Veber, DF., J rg Chem, 43 (1978) Tritsch, GL., Wooley, DW., J. Amer Chem. Soc., 82 (1960) 2787

177 Η σύνθεση του αναλόγου 53a απέτυχε διότι όπως φαίνεται και στα επόµενα φάσµατα µάζας σε καµία χρονική στιγµή της αντίδρασης, ακόµα και στα πρώτα 10min δεν σχηµατίζεται το Μ + του αναµενόµενου προϊόντος. Αντίθετα αποµακρύνονται ταυτόχρονα τόσο η νιτροµάδα όσο και η βενζυλοµάδα. + - C 3 Mol. Wt.: 642,6 2 2-Ac-C 6 4 -C-Arg( 2 )-Gly-Asp(Bzl) Ac Mol. Wt.: 597,6 2 2-Ac-C 6 4 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl)- 2 53a 2 C 3 Mol. Wt.: 507,5 2 Εικόνα Η αρχική ουσία (53), το επιθυµητό προϊόν (53a) και το προϊόν που σχηµατιζόταν τελικά µετά την καταλυτική υδρογονόλυση Εικόνα Φάσµα µάζας από το διάλυµα της αντίδρασης µετά από 60min Όπως φαίνεται και στην Εικόνα µετά από 60min αντίδρασης υπάρχει ακόµα στη φιάλη της αντίδρασης η ουσία 53, η οποία δεν έχει αντιδράσει, ενώ σε µεγαλύτερο

178 ποσοστό βρίσκεται το ανάλογο από το οποίο έχουν αποµακρυνθεί και η νιτροµάδα και η βενζυλοµάδα, το σηµαντικότερο όµως είναι ότι δεν υπάρχει κανένα θραύσµα του επιθυµητού προϊόντος 53a. Θεωρώντας ότι το επιθυµητό προϊόν µας µπορεί να σχηµατιζόταν αρχικά και µετά να αποµακρυνόταν η βενζυλοµάδα ελήφθησαν δείγµατα από το διάλυµα της αντίδρασης σε χρόνο t= 10 και 30min. Εικόνα Φάσµα µάζας από το διάλυµα της αντίδρασης µετά από 10min Εικόνα Φάσµα µάζας από το διάλυµα της αντίδρασης µετά από 30min

179 Σε καµία περίπτωση δεν διαπιστώνεται ο σχηµατισµός του επιθυµητού προϊόντος 53a (Μ + : 597.3). Αντίθετα από τα πρώτα λεπτά της αντίδρασης φαίνεται πως αποµακρυνόταν η βενζυλοµάδα και όχι η νιτροµάδα (Μ+Η ) Πεπτίδια Αµίδια µε ενσωµατωµένο γουανιδινο σαλικυλικό οξύ Τα ανάλογα αυτά συντέθηκαν σε µια προσπάθεια σύνθεσης οργανικών µορίων µιµητών, αναστολέων της συσσώρευσης των αιµοπεταλίων που φέρουν τις φαρµακοφόρες οµάδες των γραµµικών πεπτιδίων. Για τη σύνθεση των αναλόγων χρησιµοποιήθηκε η 2-CLTR ρητίνη, όπως και στη σύνθεση πεπτιδίων αµιδίων, και ως συνδέτης ο Rink Amide Linker. Η τροποποίηση από τα γραµµικά συντεθέντα πεπτίδια ήταν η πρόσδεση της γουανιδινοµάδας στην ελεύθερη αµινοµάδα του ενσωµατωµένου 5-αµινοσαλικυλικού και 2-αµινοβενζοϊκού οξέος. Η προσθήκη της γουανιδινοµάδας έγινε επί του προσδεδεµένου στη στερεά φάση αναλόγου, µε τη βοήθεια της Βoc-θειουρίας, η οποία συντέθηκε στο εργαστήριο σύµφωνα µε τη βιβλιογραφία Εικόνα Συντεθέντα ανάλογα µε ενσωµατωµένο το γουανιδινοσαλικυλικό οξύ 136 Iwanowicz, E., Poss, M. and Lin, J., Synthetic Communications, 23 (1995) 1443

180 1. Fmoc-AA- DIC/Bt 2. 20% piperidine/dmf 2 -Gly-Asp(Bzl) 1. Fmoc C ή C PyBP, DIPEA 2. 20% piperidine/dmf Fmoc 2 -Gly-Asp(Bzl) -Gly-Asp(Bzl) 2 S Boc Boc Boc Boc DIC, Et 3 -Gly-Asp(Bzl) -Gly-Asp(Bzl) Boc Boc 1. DCM / TFE / Ac 7 : 2 : 1 2. TFA / DCM / scavengers 70 : 20 : Εικόνα Συνθετική πορεία των αναλόγων 54 και 56 Με παρόµοιο τρόπο συντέθηκαν και τα ανάλογα 55 και 57, στα οποία η Gly έχει αντικατασταθεί από β-ala. Στις επόµενες εικόνες φαίνονται τα χρωµατογραφήµατα και τα φάσµατα µάζας των συντεθέντων αναλόγων. Όπως φαίνεται και από τα PLC χρωµατογραφήµατα η µέθοδος γουανιδιλίωσης µε το αντιδραστήριο της Boc-θειουρίας δίνει προϊόντα µε υψηλή καθαρότητα, σε σχέση µε άλλα συνήθη αντιδραστήρια γουανιδιλίωσης.

181 Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του αναλόγου 54 PLC: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του αναλόγου 55 PLC: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

182 Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του αναλόγου 56 PLC: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του αναλόγου 57 PLC: 5% (A), 95% (B) 50% (A), 50% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

183 2.2.4 Κυκλικά Πεπτίδια Τα κυκλικά RGD πεπτίδια εµφανίζουν µεγαλύτερη αντοχή έναντι των ενδοπεπτιδασών σε σχέση µε τα αντίστοιχα γραµµικά, όπως όλα σχεδόν τα κυκλικά πεπτίδια, και έχει παρατηρηθεί ότι έχουν ιδιαίτερα αυξηµένη βιολογική δραστικότητα έναντι της συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων 137,138. Για το λόγο αυτό θεωρήσαµε σκόπιµο να προχωρήσουµε στη σύνθεση κυκλικών αναλόγων του RGD πεπτιδίων, στα οποία έχει ενσωµατωθεί σε δυο από αυτά το 5-αµινοσαλικυλικό οξύ και σε άλλα δυο το θειοσαλικυλικό οξύ S S 2 S S Εικόνα Συντεθέντα κυκλικά RGD πεπτίδια Κυκλικά Ανάλογα RGD Πεπτίδια µέσω σχηµατισµού αµιδικού δεσµού Η σύνθεση των κυκλικών RGD πεπτιδίων µε ενσωµατωµένο το 5-αµινοσαλικυλικό οξύ έγινε µε συνδυασµό τεχνικών πεπτιδικής σύνθεσης σε στερεή και υγρή φάση. Τα προστατευµένα γραµµικά πεπτίδια συντέθηκαν στην στερεά φάση επί της 2-CLTR ρητίνης και ως αντιδραστήρια σύζευξης χρησιµοποιήθηκαν τα DIC/Bt. Όταν ολοκληρώθηκε η επέκταση των προστατευµένων γραµµικών πεπτιδίων το 5-Fmocαµινοσαλικυλικό οξύ προστέθηκε στα πεπτίδια επί του πολυµερούς µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Μετά την αποπροστασία της αµινοµάδας του Pfaff, M., Tangemann, K., Muller, B., Gurrathn, M., Muller, G.,er, Kessler,., Timpl, R., and Jurgen Engel, J. Biol. Chem 269 (1994) Kang, Y., Jhon, J., J. Peptide Res. 56 (2000) 360

184 αµινοσαλικυλικού οξέος τα προστατευµένα γραµµικά πεπτίδια αποµακρύνθηκαν από το πολυµερές µε τη χρήση του διαλύµατος TFE/DCM (3:7, v/v) και όχι µε το σύνηθες διάλυµα αποµάκρυνσης πεπτιδίου από τη 2-CLTR TFE/DCM/Ac (2:7:1, v/v), λόγω του γεγονότος ό,τι τα σχηµατιζόµενα άλατα του οξικού οξέος οδηγούν σε χαµηλές αποδόσεις τις αντιδράσεις κυκλοποίησης. Fmoc-Asp(X)- Cl 1. DIPEA / DCM 2. 20% piperidine/dmf 2 -Asp(X)- X=t-Bu, Bzl 1. Fmoc-AA- DIC/Bt 2. 20% piperidine/dmf 2 -Arg(Pbf)-Gly-Asp(X)- 1. C PyBP, DIPEA Fmoc 2. 20% piperidine/dmf 3. DCM / TFE 7 : C 6 3 -C-Arg(Pbf)-Gly-Asp(X)- TBTU, Bt, collidine cyclization C 6 3 -C-Arg(Pbf)-Gly-Asp(X) TFA / DCM / scavengers 70 : 20 : C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp C 6 3 -C-Arg-Gly-Asp(Bzl) 59 Εικόνα Πορεία σύνθεσης των κυκλικών RGD πεπτιδίων 58 και 59 Για την κυκλοποίηση των προστατευµένων γραµµικών πεπτιδίων χρησιµοποιήθηκαν τα αντιδραστήρια TBTU και Bt 111 ενώ ως βάση η κολλιδίνη 113. Το TBTU σε συνδυασµό µε το At ή το Bt οδηγεί σε πιο γρήγορες και υψηλότερης απόδοσης αντιδράσεις, ενώ εµφανίζονται µειωµένα ποσοστά ρακεµίωσης σε σχέση µε άλλα αντιδραστήρια, όπως BP και Bt. Επίσης ελαττωµένα ποσοστά ρακεµίωσης επιτυγχάνονται µε τη χρησιµοποίηση κολλιδίνης για βάση αντί για DIPEA. Ο διαλύτης στον οποίο έγιναν οι αντιδράσεις ήταν το DMF, σε µεγάλη αραίωση για την αποφυγή διαµοριακών

185 αντιδράσεων, και αποµακρύνθηκε υπό κενό µε αντλία ελαίου. Η καταβύθιση των προστατευµένων κυκλικών πεπτιδίων έγινε µε προσθήκη 2 στο ελαιώδες υπόλειµµα της συµπύκνωσης διότι η περίσσεια των TBTU και Bt διαλύεται στο νερό και έτσι αποµακρύνονται εύκολα. Η πιστοποίηση της αντίδρασης κυκλοποίησης έγινε µε χρωµατογραφία TLC και PLC. Πρέπει να τονιστεί εδώ ότι η επιτυχία και το ποσοστό απόδοσης των κυκλοποιήσεων εξαρτάται και από το µέγεθος και το είδος των προστατευτικών οµάδων των πλευρικών αλυσίδων της αλληλουχίας. Στην περίπτωση του αναλόγου 58 είχαµε τα παρακάτω δεδοµένα. Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα του γραµµικού προστατευµένου αναλόγου 58 PLC: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα του κυκλικού προστατευµένου αναλόγου 58 PLC: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Από τα PLC χρωµατογραφήµατα είναι φανερή η διαφορά του χρόνου συγκράτησης µεταξύ του γραµµικού προστατευµένου και του προστατευµένου κυκλικού (t R = 22.25min για το προστατευµένο γραµµικό και 30.55min για το προστατευµένο κυκλικό ανάλογο).

186 Η αποπροστασία των πλευρικών προστατευτικών οµάδων Pbf και t-bu έγινε µε κατεργασία του πεπτιδίου µε το µείγµα διαλυτών TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v) για 2.5h. Για το ανάλογο 59 είχαµε τα επόµενα αποτελέσµατα Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα του κυκλικού προστατευµένου αναλόγου 59 PLC: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Στην περίπτωση του αναλόγου 59 η κυκλοποίηση έγινε σε ποσοστό περίπου 60%. Πιθανόν, η βενζυλοµάδα στο β-καρβοξύλιο του Asp να ευθύνεται για τη σχετικά µικρή απόδοση της κυκλοποίησης. Και εδώ βέβαια είναι εµφανής η διαφορά στο χρόνο έκλουσης για το γραµµικό και το κυκλικό προστατευµένο ανάλογο. Ακολουθούν τα PLC χρωµατογραφήµατα και τα φάσµατα µάζας των κυκλικών αναλόγων 58 και 59 µετά την αποµάκρυνση των πλευρικών προστατευτικών οµάδων. Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του κυκλικού αναλόγου 58 PLC: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

187 Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του κυκλικού αναλόγου 59 PLC: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Τα ανάλογα 58 και 59 διαφέρουν κατά τη βενζυλοµάδα του β-καρβοξυλίου του Asp (οµάδα που ενισχύει το λιπόφιλο χαρακτήρα του µορίου) και θα έπρεπε ο χρόνος συγκράτησης τους στη στήλη PLC να διαφέρει κάτι που δεν παρατηρείται στα χρωµατογραφήµατα Κυκλικά RGD Πεπτίδια µέσω σχηµατισµού δισουλφιδικού δεσµού Εκτός από τη σύνθεση κυκλικών πεπτιδίων µέσω σχηµατισµού πεπτιδικού δεσµού πολλοί ερευνητές οδηγήθηκαν στη σύνθεση κυκλικών πεπτιδίων µέσω σχηµατισµού δισουλφιδικού δεσµού 139. Μερικοί ενσωµάτωσαν στην πεπτιδική αλληλουχία δύο Cys 140 ενώ άλλοι θειολοξέα 141. Στην περίπτωσή µας, ο σχηµατισµός δισουλφιδικού δεσµού 139 Scarborough, R., Gretler, D., J. Med. Chem. 43 (2000) Stavrakoudis, A., Bizos, G., Eleftheriadis, D., Kouki, A., Panou-Pomonis, E., Sakarellos-Daitsiotis, M., Sakarellos, C., Tsoukatos, D., Tsikaris, V., Biopolymers 56 (2001) ichols, A., Vasko, J., Koster, P., Valocik, R., Rhodes, G., Miller-Stein, C., Boppana, V., Samanen, J., J. Pharm. Exp. Ther. 270 (1994) 614

188 επιτυγχάνεται µε την ενσωµάτωση στην πεπτιδική αλυσίδα του θειοσαλικυλικού οξέος στο Ν-τελικό άκρο και µιας κυστεΐνης στο C-τελικό άκρο αντίστοιχα. Τα προστατευµένα γραµµικά πεπτίδια συντέθηκαν στην στερεή φάση επί της 2-CLTR ρητίνης και ως αντιδραστήρια σύζευξης χρησιµοποιήθηκαν τα DIC/Bt. Όταν ολοκληρώθηκε η επέκταση των προστατευµένων γραµµικών πεπτιδίων το τριτυλοθειοσαλικυλικό οξύ προστέθηκε στα πεπτίδια επί του πολυµερούς µε τη µέθοδο των φωσφονικών παραγώγων. Ακολούθησε η αποµάκρυνσή τους από τη ρητίνη µε το διάλυµα DCM/TFE/Ac (7:2:1, v/v) και ακολούθησε η εκλεκτική αποπροστασία της σουλφυδρυλοµάδας του θειοσαλικυλικού οξέος και της κυστεΐνης µε κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/TES (2:7:1, v/v) για 2h. Η καταβύθιση των γραµµικών, µερικώς προστατευµένων πεπτιδίων, έγινε µε άνυδρο αιθέρα. Στη συνέχεια τα προστατευµένα ανάλογα διαλύονται σε διάλυµα 2 /DMS (1:4) και αναδεύονται ήπια για 24h. Αφού ελεγχθεί η ολοκλήρωση της κυκλοποίησης µε χρωµατογραφία PLC και φασµατοµετρία µάζας τα διαλύµατα λυοφιλοποιούνται προς αποµάκρυνση των διαλυτών και ακολουθεί αποµάκρυνση των λοιπών προστατευτικών οµάδων µε το διάλυµα TFA/DCM/scavengers (70:20:10, v/v). Αξιοσηµείωτο είναι ότι η αντίδραση κυκλοποίησης ολοκληρώθηκε εντός 24h χωρίς να παρατηρηθεί, όπως φαίνεται και στα αντίστοιχα χρωµατογραφήµατα PLC, δηµιουργία διαµοριακών δισουλφιδικών δεσµών.

189 Fmoc-Cys(Mmt) 1. Fmoc-Asp(X)- 2. Fmoc-Gly- DIC/Bt 3. Fmoc-Arg(Pbf)- STrt 4. C PyBP / DIPEA Pbf MmtS STrt X 1. DCM : TFE: Ac 70 : 20 : 10 Pbf 2. DCM : TFA: TES 70 : 20 : 10 S S X 1. DMS: 2 20 : 80 (24h) 2. TFA:DCM:scavengers 75 : 15 : 10 2 S S S S Εικόνα Πορεία σύνθεσης των κυκλικών RGD πεπτιδίων 60 και 61 Για το γραµµικό προστατευµένο ανάλογο 60 έχουµε: Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα του γραµµικού πλήρως προστατευµένου αναλόγου 60 PLC: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

190 Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα του γραµµικού µερικώς προστατευµένου αναλόγου 60 (αποµάκρυνση Trt και Mmt οµάδων µε κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/TES (2:7:1, v/v) για 2h) PLC: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Και στην περίπτωση αυτή, είναι φανερή η διαφορά του χρόνου έκλουσης πριν (t R = 26.15min) και µετά (t R =22.64min) την αποµάκρυνση των προστατευτικών οµάδων Trt και Mmt. Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα του κυκλικού προστατευµένου αναλόγου 60 PLC: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

191 Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του κυκλικού RGD αναλόγου 60 PLC: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Παρατηρώντας τις προηγούµενες εικόνες φαίνεται καθαρά η µετατόπιση του χρόνου έκλουσης του πεπτιδίου ανάλογα µε την ύπαρξη ή µη λιπόφιλων οµάδων και ανάλογα µε το αν είναι κυκλικό ή γραµµικό. Αντίστοιχα για το ανάλογο 61 έχουµε: Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα του γραµµικού πλήρως προστατευµένου αναλόγου 61 PLC: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

192 Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα του γραµµικού µερικώς προστατευµένου αναλόγου 61 (αποµάκρυνση Trt και Mmt οµάδων µε κατεργασία µε διάλυµα TFA/DCM/TES (2:7:1, v/v) για 2h) PLC: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Παρόµοια µε προηγούµενα χρωµατογραφήµατα, είναι φανερή η διαφορά του χρόνου έκλουσης πριν (t R = 32.22min) και µετά (t R =28.78min) την αποµάκρυνση των προστατευτικών οµάδων Trt και Mmt. Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα του κυκλικού προστατευµένου αναλόγου 61 PLC: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL)

193 Εικόνα PLC χρωµατογράφηµα και φάσµα µάζας του κυκλικού RGD αναλόγου 61 PLC: 5% (A), 95% (B) 100% (A), 0% (B) σε 30min, A: TFA σε MeC 0.05% (v/v), B: TFA σε % (v/v), λ=214nm, Στήλη: ucleosil 100 C18, 250 x 4.6mm, 5µm (MACEREY-AGEL) Και σε αυτή την περίπτωση είναι φανερή η διαφορά του χρόνου έκλουσης πριν (t R = 31.19min) και µετά (t R =22.33min) την κυκλοποίηση και την αποµάκρυνση των προστατευτικών οµάδων. Γενικά µπορούµε να συµπεράνουµε ότι η σύνθεση - κυκλοποίηση των αναλόγων 60 και 61 δεν παρουσίασε κάποιο ιδιαίτερο πρόβληµα (ατελής κυκλοποίηση, δηµιουργία διαµοριακών δεσµών, κτλ). Η ολοκλήρωση της οξείδωσης και του σχηµατισµού δισουλφιδικού δεσµού πιστοποιείται τόσο από την µετατόπιση του χρόνου έκλουσης του προστατευµένου πεπτιδίου πριν και µετά την κυκλοποίηση όσο και από τα φάσµατα µάζας, στα οποία τα Μ + αντιστοιχούν µε µεγάλη ακρίβεια στις υπολογιζόµενες τιµές των µοριακών βαρών των αντιστοίχων ενώσεων.

194 2.3 Βιολογική Αξιολόγηση των συντεθέντων αναλόγων Σκοπός της σύνθεσης των γραµµικών και κυκλικών αναλόγων του RGD ήταν να µελετηθεί η επίδρασή τους ως αναστολέων της συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων. Έτσι για τη βιολογική αξιολόγηση των συντεθέντων αναλόγων χρησιµοποιήθηκαν δύο τεχνικές: α) ο έλεγχος της συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων (Platelet Aggregation) και β) η κυτταροµετρία ροής σε ενεργοποιηµένα αιµοπετάλια (Flow Cytometry Analysis of Platelet Activation). Η κυτταροµετρία ροής χρησιµοποιήθηκε µόνο για τα ανάλογα τα οποία έδειξαν ισχυρή αναστολή της συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων. Με την κυτταροµετρία ροής βρίσκουµε τη συγγένεια των συντεθέντων αναλόγων για συγκεκριµένους γλυκοπρωτεϊνικούς υποδοχείς, καθώς τα RGD ανάλογα ανταγωνίζονται µονοκλωνικά αντισώµατα για κάθε υποδοχέα Έλεγχος της συσσωµάτωσης ανθρωπίνων αιµοπεταλίων παρουσία των συντεθέντων αναλόγων Η αναστολή της συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων του ανθρώπου από τις ενώσεις που συντέθηκαν µελετήθηκε in vitro µε κλασική φωτοµετρική τεχνική στους 37 ο C και µε συνεχή καταγραφή του διερχόµενου από το δείγµα φωτός 142. Για τις µετρήσεις χρησιµοποιήθηκε ειδικό όργανο για το σκοπό αυτό, (Chronolog Platelet Ionized Calcium Aggregometer). Το όργανο αυτό µετράει το ποσοστό της ακτινοβολίας που διέρχεται από εναιώρηµα αιµοπεταλίων, η δε ένταση της διερχόµενης ακτινοβολίας είναι αντιστρόφως ανάλογη του ποσοστού συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων. Η εικόνα που λαµβάνουµε από το aggregometer κατά τη διάρκεια µιας µέτρησης έχει την επόµενη µορφή. 142 Born, G., ature (London), 194 (1962) 927

195 Εικόνα Εικόνα την οποία µας δίνει το aggregometer Η εικόνα παρουσιάζει µια µέτρηση που έχει γίνει σε aggregometer τεσσάρων καναλιών. Η µπλε καµπύλη δείχνει τη συµπεριφορά του µάρτυρα ως προς την συσσώρευση των αιµοπεταλίων ενώ η κόκκινη καµπύλη δείχνει την συµπεριφορά της προς ανάλυση ένωσης. Η διαφορά µεταξύ µπλε και κόκκινης καµπύλης ισούται µε το ποσοστό της αναστολής (για την συγκεκριµένη περίπτωση είναι ~30%). Στο επάνω µέρος του γραφήµατος φαίνονται δυο ακόµα καµπύλες οι οποίες δείχνουν την έκλυση του ATP στο PRP. Το εκλυόµενο ATP προσδένεται σε ένα ένζυµο τη Λουσιφεράση (Louciferase), και από το φως το οποίο παράγεται υπολογίζεται η ποσότητα του ATP η οποία ελευθερώνεται στο δείγµα. Αυτό σηµαίνει ότι πέρα από την καταγραφή της διερχόµενης ακτινοβολίας από την κυψελίδα (cuvette) µετράται και η έκλυση ATP το οποίο απελευθερώνεται στο πλάσµα κατά την ενεργοποίηση των αιµοπεταλίων. Σαν συγκολλητικές ουσίες αναφοράς χρησιµοποιήθηκαν κολλαγόνο (2µg/mL), διφωσφορική αδενοσίνη (ADP) (10µM) και ριστοσετίνη (1.25mg/mL) σε καθορισµένες συγκεντρώσεις. Η ριστοσετίνη είναι ένα αντιβιοτικό το οποίο προάγει την πρόσδεση του παράγοντα von Willebrand (vwf) στον γλυκοπρωτεϊνικό υποδοχέα GPIb, ενώ όλοι οι άλλοι διεγέρτες προκαλούν την προσκόλληση του vwf στον υποδοχέα GPIIb/IIIa. Η οπτική απορρόφηση καταγράφεται για περίπου 4min, χρονικό διάστηµα στο οποίο τα αιµοπετάλια επιτυγχάνουν µέγιστη απόκριση στο διεγέρτη.

196 Για την ποσοτική σύγκριση των αποτελεσµάτων της δραστικότητας των ενώσεων που µελετώνται η βιολογική τους δράση εκφράζεται σε τιµές IC 50. Σαν τιµή IC 50 χαρακτηρίζεται η συγκέντρωση της ουσίας που µπορεί να προκαλέσει το 50% της συγκεκριµένης δράσης, στην περίπτωση µας, της αναστολής της συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων. Στην τιµή IC 50 λαµβάνεται υπόψη και ο χρόνος. Έτσι όλες οι τιµές αναφέρονται στον ίδιο χρόνο, από την αρχή του φαινοµένου και φυσικά χρησιµοποιώντας τον ίδιο διεγέρτη (κολλαγόνο, ADP ή ριστοσετίνη) για την διέγερση των αιµοπεταλίων Έλεγχος της συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων για τις ενώσεις Τα ανάλογα περιέχουν στο C-τελικό άκρο τους το α-καρβοξύλιο του Asp. Τα ανάλογα αυτά δεν προκάλεσαν καµιά αναστολή στην συσσωµάτωση των αιµοπεταλίων ακόµα και σε σχετικά µεγάλες συγκεντρώσεις της τάξης των 10mM. Είναι ολοφάνερο από την εικόνα ότι τα ανάλογα αυτά (15 16) δεν ασκούν καµιά ανασταλτική δράση στη συσσωµάτωση των αιµοπεταλίων. Στην συγκεκριµένη περίπτωση διεγέρτης είναι το κολλαγόνο. Το ίδιο βιολογικό αποτέλεσµα έχουµε και στην περίπτωση άλλων διεγερτών. Εικόνα Καµπύλες συσσώρευσης για τα ανάλογα 15 και 16 µε διεγέρτη το κολλαγόνο

197 Μελετώντας εξαντλητικά τη διεθνή βιβλιογραφία 143,144 διαπιστώθηκε ότι κανένα γραµµικό RGD πεπτίδιο µε ισχυρή ανασταλτική δράση στη συγκόλληση των αιµοπεταλίων δεν έφερε και δεν φέρει στο C-τελικό άκρο του το Asp µε ελεύθερη την α- καρβοξυλοµάδα του. Όλα τα ανάλογα έχουν µετατραπεί στο C-τελικό τους άκρο σε πεπτίδια - αµίδια. Για το σκοπό αυτό σχεδιάστηκαν RGD πεπτίδια-αµίδια, τα οποία φέρουν στο Ν-τελικό τους άκρο το σαλικυλικό οξύ ή παράγωγα του σαλικυλικού οξέος (26 53). Επιπλέον, σε µερικά από αυτά το β-καρβοξύλιο του Asp έχει µετατραπεί σε µεθυλεστέρα (28, 31) ή βενζυλεστέρα (27, 30, 35) ενώ σε άλλα αντί για Asp υπάρχει Asn (33, 34) Έλεγχος της συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων για τις ενώσεις Το ανάλογο 23 γνωρίζουµε από την βιβλιογραφία 145 ότι έχει IC 50 = 500µΜ µε διεγέρτη συγκόλλησης το κολλαγόνο. Η τιµή IC 50 που υπολογίστηκε µε βάση τα δικά µας πειραµατικά δεδοµένα είναι 540µΜ. Αντιθέτως το ανάλογο 24 δεν εµφάνισε καµιά δράση σε συγκεντρώσεις µέχρι 5mM, ενώ το ανάλογο 25 στο οποίο έχει αντικατασταθεί η Arg από τη Lys εµφάνισε αντισυσσωρευτική δράση µε IC 50 = 850µΜ. Η ενσωµάτωση του σαλικυλικού οξέος στο Ν-τελικό άκρο του τριπεπτιδίου RGD (26) προκάλεσε µια εντυπωσιακή αύξηση της αναστολής της συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων (IC 50 = 50µΜ) αλλά εξίσου εντυπωσιακή ήταν η αναστολή την οποία προκάλεσε το ανάλογο 27 (IC 50 = 38µΜ), στο οποίο η β-καρβοξυλοµάδα του Asp έχει προστατευθεί µε τη βενζυλοµάδα. Αντίστοιχα αποτελέσµατα είχαν παρατηρηθεί σε διπεπτίδια µε ενσωµατωµένο το σαλικυλικό οξύ 146. Επίσης, το ανάλογο 28 (IC 50 = 53µΜ), στο οποίο το β-καρβοξύλιο έχει προστατευθεί µε την µεθυλοµάδα εµφάνισε εξίσου σηµαντική δράση µε το 26 (IC 50 = 50µΜ). Αντικατάσταση της Gly από τη Leu (29-31) είχε ως αποτέλεσµα την µέτρια αναστολή της συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων. Οι τιµές IC 50 για το ανάλογα αυτά ήταν 170, 182 και 196µΜ αντίστοιχα. Tο ανάλογο 32, το οποίο αντί της Gly έχει Leu και αντί του Αsp έχει Asn, είχε επίσης µέτρια ανασταλτική δράση (IC 50 = 155µΜ). Αξίζει να σηµειωθεί ότι για το διπεπτίδιο Leu-Asn- 2 είχε βρεθεί ανασταλτική 143 jima, I., Chakravarty, S., Dong, Q., Bioorg Med Chem 3 (1995) Tsikaris, V., J. Peptide Sci. 10 (2004) Pierschbacher Μ. and Ruoslahti, Ε., J. Biol. Chem., 262 (1987) Stavropoulos, G., Magafa, V., Liakopoulou-Kyriakides, M., Sinakos, Z., & Aaberg, A., Amino Acids, 13 (1997) 171

198 δράση µε IC 50 = 400µΜ 147. Παρατηρούµε λοιπόν, ότι η ενσωµάτωση της Arg στην αλληλουχία Leu-Asn- 2 αύξησε την ανασταλτική δράση του πεπτιδίου περίπου τρεις φορές. Έτσι λοιπόν συντέθηκαν και τα ανάλογα 33 και 34 µε το ανάλογο 33 (Leu αντί για Gly) να εµφανίζει ελαφρά µεγαλύτερη αναστολή από το 34 έναντι της συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων (IC 50 = 143 και 150µΜ αντίστοιχα). Παρατηρούµε λοιπόν, ότι η ενσωµάτωση του σαλικυλικού οξέος στο τριπεπτίδιο Arg-Leu-Asn- 2 δεν προκαλεί ιδιαιτερη αύξηση της ανασταλτικής δράσης στη συσσωµάτωση των αιµοπεταλίων. Επίσης, το ανάλογο 35 (Lys αντί για Arg) είχε ασήµαντη ανασταλτική δράση (IC 50 = 754µΜ) Έλεγχος της συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων για τις ενώσεις Στα ανάλογα έχει ενσωµατωθεί το 5-βρωµοσαλικυλικό (36-38) ή το 5- χλωροσαλικυλικό οξύ (39 41). Τα ανάλογα αυτά έδειξαν µέτρια αντισυγκολλητική δράση και ιδιαίτερα τα 37 (IC 50 = 300µΜ) και 40 (IC 50 = 260µΜ), εκείνα δηλαδή τα οποία φέρουν εκτός από το σαλικυλο-παράγωγο και τη βενζυλοµάδα στο β-καρβοξύλιο του Asp. Αντίθετα τα ανάλογα 36 (IC 50 = 400µΜ) και 39 (IC 50 = 350µΜ) έδειξαν πολύ µικρή δράση ενώ τα ανάλογα 38 και 41 δεν έδειξαν καµία απολύτως δράση. Εικόνα Καµπύλες συσσωµάτωσης για τα ανάλογα 37 και 40 σε συγκέντρωση 750µΜ µε διεγέρτη το κολλαγόνο 147 Liakopoulou-Kyriakides, M., Stavropoulos, G., Karagiannis, C., Calogridis, P. and Sinakos, Z., Biochem. Intern., 22 (1990) 617

199 Παρατηρούµε λοιπόν, πως η ενσωµάτωση στο τριπεπτίδιο RGD αλογονοπαραγώγων του σαλικυλικού οξέος, όπως το 5-χλωροσαλικυλικό και το 5-βρωµοσαλικυλικό οξύ, δεν αυξάνει ιδιαίτερα την ανασταλτική δράση του τριπεπτιδίου όπως συµβαίνει µε την ενσωµάτωση του σαλικυλικού οξέος (26, 27 και 28) Έλεγχος της συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων για τις ενώσεις Οι ενώσεις αυτές περιέχουν ενσωµατωµένο το 5-νιτροσαλικυλικό οξύ (42, 43), το 5- µεθυλοσαλικυλικό οξύ (44) και το 5-αµινοσαλικυλικό οξύ (45). Από τα ανάλογα αυτά, τα 42 και 43 έδειξαν µέτρια αντισυγκολλητική δράση µε IC 50 = 370µΜ και 320µΜ αντίστοιχα. ηλαδή, το ανάλογο µε τον β-βενζυλεστέρα στο Asp (43) έδειξε ελαφρά ισχυρότερη ανασταλτική δράση της συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων. Η δράση των αναλόγων 44 και 45 ήταν επίσης µέτρια µε IC 50 = 318µΜ και 294µΜ αντίστοιχα. Παρατηρούµε και στα ανάλογα αυτά, ότι η ύπαρξη υποκαταστάτη στη θέση 5 του σαλικυλικού οξέος δεν αυξάνει την ανασταλτική δράση έναντι της συσσώρευσης των αιµοπεταλίων Έλεγχος της συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων για τις ενώσεις Κοινό γνώρισµα των ενώσεων αυτών είναι η τροποποίηση η οποία έχει γίνει στο υδροξύλιο του σαλικυλικού οξέος. Το ανάλογο 46 έδειξε ισχυρή ανασταλτική δράση µε IC 50 = 38µΜ, ενώ τα υπόλοιπα ανάλογα έδειξαν µέτρια έως ελάχιστη αντισυγκολλητική δράση έναντι της συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων, και συγκεκριµένα το ανάλογο 47 είχε IC 50 = 270µΜ, το ανάλογο 48 IC 50 = 290µΜ, το 49 IC 50 = 285µΜ, το 51 IC 50 = 300µΜ ενώ το 50 δεν είχε δράση.

200 Εικόνα Καµπύλες συσσωµάτωσης για τo ανάλογο 46 σε συγκέντρωση 111µΜ µε διεγέρτες: α) κολλαγόνο, β) ADP και γ) ριστοσετίνη Στην παραπάνω εικόνα φαίνεται η διαφορετική ανασταλτική δράση της ίδιας ένωσης (46), στην ίδια συγκέντρωση αλλά µε διαφορετικό διεγέρτη συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων. Για το κολλαγόνο η αναστολή είναι 80%, για το ADP 32% ενώ για τη ριστοσετίνη µόλις 18%. ηλαδή η ένωση 46 αναστέλλει την συσσωµάτωση που προάγεται από το κολλαγόνο και το ADP, σε µικρότερο βαθµό, αλλά δεν µπορεί να αναστείλει την συσσωµάτωση που προκαλείται από την ριστοσετίνη. Το ανάλογο 46 διαφέρει από το ανάλογο 27 σε µια µεθυλοµάδα η οποία υπάρχει στο υδροξύλιο του σαλικυλικού οξέος. Φαίνεται λοιπόν, ότι η ύπαρξη της οµάδας αυτής δεν επηρεάζει καθόλου την ανασταλτική δράση του πεπτιδίου αφού τα δύο ανάλογα έχουν την ίδια ανασταλτική δράση (IC 50 = 38µΜ). Αντικατάσταση του υδροξυλίου του σαλικυλικού (27) από την σουλφυδρυλοµάδα (47) ή την αµινοµάδα (48) ή το ακετυλιωµένο παράγωγο αυτής (49) έχει σαν αποτέλεσµα την µείωση της ανασταλτικής δράσης έναντι της συσσωµάτωσης των αιµοπεταλίων, ενώ η αντικατάσταση της Gly από β-ala (ανάλογο 50) δεν προκαλεί ανασταλτική δράση στη συσσωµάτωση των αιµοπεταλίων. Επίσης παρατηρούµε, ότι το ανάλογο 51 δεν προκαλεί αντίστοιχη δράση µε το ανάλογο 27 αν και διαφέρουν στη θέση της βενζυλοµάδας και του αµιδίου στο C- τελικό άκρο του πεπτιδίου.