Από την εκτύπωση εγγράφων στην τρισδιάστατη εκτύπωση οργάνων

Transcript

1 Από την εκτύπωση εγγράφων στην τρισδιάστατη εκτύπωση οργάνων Καλογήρου Αλεξάνδρα, Δαρζέντα Κατερίνα, Διαµαντόγιαννη Κορίνα, Σακελλαροπούλου Λία Ελληνογαλλική Σχολή JeanneD Arc Επιβλέπων Καθηγητής: Δρ. Δηµοσθένης Καρυοφύλλης, Βιολόγος Ελληνογαλλικής ΣχολήςJeanneD Arc Περίληψη Η τρισδιάστατη εκτύπωση ιστών και οργάνων είναι µια µέθοδος προσθετικής κατασκευής, µέσω της οποίας κατασκευάζονται ιστοί ή όργανα µε διαδοχική προσθήκη επάλληλων στρώσεων κυττάρων. Αυτή η καινοτοµία στην ιατρική εµφανίστηκε κυρίως για να καλύψει το πρόβληµα έλλειψης δωρητών οργάνων και κατ επέκταση µοσχευµάτων που υπάρχει παγκοσµίως. Τα νέα όργανα δηµιουργούνται µε τη χρήση βιοϋλικών, πάνω στα οποία τοποθετούνται τα κύτταρα που θα επικαλύψουν την επιφάνεια. Ειδικά µηχανήµατα, λειτουργούν όπως οι εκτυπωτές αλλά αντί για µελάνι, χρησιµοποιούν τα κύτταρα του ασθενή και δηµιουργούν ένα προς ένα τα στρώµατα του νέου οργάνου. Γενικότερα είναι ένας τοµέας της ιατρικής µε µεγάλες προοπτικές καθώς παρουσιάζει αρκετά πλεονεκτήµατα σε σχέση µε τον συµβατικό τρόπο µεταµόσχευσης, αφού µέσω της τρισδιάστατης εκτύπωσης το µόσχευµα δηµιουργείται αποκλειστικά και µόνο για τον κάθε ασθενή µε ελάχιστες πιθανότητες απόρριψής του. Επιπλέον πλεονέκτηµα αυτής της µεθόδου είναι η ταχύτατη δηµιουργία του οργάνου, ενώ το κόστος είναι συγκριτικά χαµηλό. Κύρια πρόκληση αυτής της διαδικασίας είναι η αγγείωση, δηλαδή η παροχή αίµατος για να µπορέσει να τεθεί σε λειτουργία το «εκτυπωµένο όργανο», ώστε να είναι δυνατή σε επόµενη φάση η εκτύπωση συµπαγών οργάνων. Ένα άλλο πεδίο της τρέχουσας έρευνας είναι ο σχεδιασµός εκτυπωτή που θα µπορεί να τυπώνει κατ ευθείαν πάνω στον ασθενή. Στην παρούσα µελέτη επιχειρήσαµε να ερευνήσουµε σε βάθος την προοδευτική αυτή µέθοδο δηµιουργίας ανθρωπίνων οργάνων, να παρουσιάσουµε τις εφαρµογές της στην εποχή µας καθώς και τις προοπτικές ανάπτυξής της στο άµεσο µέλλον. ΛΕΞΕΙΣ - ΚΛΕΙΔΙΑ: τρισδιάστατη εκτύπωση, κύτταρα, βιοϋλικά, αγγείωση

2 Εισαγωγή Η µεταµόσχευση είναι συχνά η µόνη θεραπευτική λύση σε περιπτώσεις τελικού σταδίου ανεπάρκειας ενός οργάνου, όπως για παράδειγµα του νεφρού ή της καρδιάς. Τα τελευταία χρόνια έχουν βελτιωθεί οι χειρουργικές τεχνικές που εφαρµόζονται, ενώ η φαρµακευτική αγωγή που χρησιµοποιείται για τη διατήρηση του µοσχεύµατος έχει, τις περισσότερες φορές, άριστα αποτελέσµατα. Εποµένως, το βασικό πρόβληµα στην ανάπτυξη των µεταµοσχευτικών προγραµµάτων κάθε χώρας είναι ο περιορισµός των διαθέσιµων µοσχευµάτων, γιατί, ενώ έχει παρατηρηθεί αύξηση του αριθµού των δοτών, ο αριθµός των ατόµων που έχουν ανάγκη συνεχώς αυξάνεται δυσανάλογα. Εκτός από τη συµβατική προέλευση των οργάνων προς µεταµόσχευση, τους εθελοντές δότες, τα τελευταία χρόνια έχουν γίνει διάφορες προσπάθειες in vitro ανάπτυξης οργάνων. Το 1999 γίνεται η µεταµόσχευση του πρώτου οργάνου που αναπτύχθηκε µέσα σε εργαστήριο, όταν νεαροί ασθενείς υπεβλήθησαν σε επαύξηση της ουροδόχου κύστης χρησιµοποιώντας ένα τρισδιάστατο συνθετικό ικρίωµα επενδυµένο µε τα δικά τους κύτταρα. Η τεχνολογία αυτή, ξεκίνησε µία διαδικασία ανάπτυξης άλλων στρατηγικών για τη δηµιουργία οργάνων, συµπεριλαµβανοµένης της εκτύπωσης (Koo et al., 1999). Η µέθοδος αυτή εφαρµόστηκε µε επιτυχία στην περίπτωση νεαρού που η κύστη του δε λειτουργούσε σωστά, µε αποτέλεσµα τη δυσλειτουργία των νεφρών του και την άµεση ανάγκη για αντικατάστασή της. Άλλα προβλήµατα υγείας του νεαρού δεν επέτρεπαν την εφαρµογή συµβατικών θεραπειών, οπότε κατασκευάστηκε ουροδόχος κύστη µετά από in vitro καλλιέργεια κυττάρων του ίδιου του ασθενή (Atala 2004). Ακολούθησε η κατασκευή λειτουργικών νεφρών από βλαστοκύτταρα ασθενών (Dekel et al., 2002). Το 2006 ο Anthony Atala και οι συνεργάτες του στο ινστιτούτο «Wake Forest Institute for Regenerative Medicine» δηµιούργησαν νέες κύστες για επτά ασθενείς, οι οποίες εξακολουθούν να λειτουργούν αποτελεσµατικά στους οργανισµούς στους οποίους µεταµοσχεύθηκαν (Atala et al., 2006). Τα παραπάνω ενθαρρυντικά αποτελέσµατα έδειξαν ότι η προέλευση οργάνων για µεταµόσχευση δεν θα είναι πλέον αποκλειστικά από δωρητές. Το επόµενο βήµα ήταν η εφαρµογή µιας σχετικά πρόσφατης τεχνολογίας από τον τοµέα των µηχανολογικών κατασκευών και συγκεκριµένα της χρήσης εκτυπωτή που έχει τη δυνατότητα να τυπώνει αντικείµενα τριών διαστάσεων. Η λογική αυτής της εκτύπωσης είναι η διαδοχική προσθήκη στοιβάδων υλικού µέχρι να προκύψει η τελική δοµή και όλα τα στάδια της διαδικασίας ελέγχονται από ειδικό λογισµικό. Η εκτύπωση σε τρεις διαστάσεις πρωτοεµφανίστηκε στις αρχές του 1980, άλλα έγινε διαθέσιµη εµπορικά στο τέλος του Αυτή η τεχνολογία βρίσκει πλέον εφαρµογές στο βιοµηχανικό σχεδιασµό, την αυτοκινητοβιοµηχανία, την αεροναυπηγική, αλλά πολύ πρόσφατα και στην κατασκευή ιστών και οργάνων. Τρόπος δηµιουργίας εκτυπωµένου οργάνου Η διαδικασία η οποία ακολουθείται για την εκτύπωση ενός οργάνου αποτελείται από ένα σύνολο βηµάτων. Αρχικά, µια κάµερα σαρώνει εξωτερικά γύρω από την περιοχή που βρίσκεται το όργανο, ενώ ο ασθενής είναι τοποθετηµένος σε κατάλληλη θέση. Ειδικότερα, για να δηµιουργηθεί το νέο πολύπλοκης δοµής όργανο πραγµατοποιείται τρισδιάστατη φωτογράφισή του µέσω µιας αξονικής τοµογραφίας (CTscan) χρησιµοποιώντας ανάλυση µορφοµετρικής απεικόνισης και τρισδιάστατης

3 επαναδόµησης του εν λόγω ιστού ή οργάνου µε στόχο την απόκτηση µιας εικόνας της περιοχής. Η απεικόνιση αυτού γίνεται σε 360 ο για να µπορέσει να γίνει ανάλυση των ογκοµετρικών χαρακτηριστικών του. Στη συνέχεια η πληροφορία που απορρέει από την απεικόνιση δίνει τη δυνατότητα ψηφιακής ανάλυσης και σχεδιασµού του οργάνου. Η πληροφορία µεταφέρεται µέσω υπολογιστή στον εκτυπωτή για να ολοκληρωθεί το όργανο. Ο συγκεκριµένος εκτυπωτής δε χρησιµοποιεί µελάνι αλλά ζωντανά κύτταρα του ασθενή τα οποία µεταφέρονται από το ακροφύσιο της κεφαλής του τρισδιάστατου εκτυπωτή «χτίζοντας» µε αυτό τον τρόπο τη νέα δοµή (Sun et al., 2014). Με µια τέτοια διαδικασία θα µπορούσε να εκτυπωθεί σε επτά ώρες ένας νέος νεφρός. Υπάρχουν διάφορες τεχνικές βάσει των οποίων µπορούµε να δηµιουργήσουµε ένα όργανο. Ένας τρόπος είναι η δηµιουργία οργάνων µε τη χρήση αποκλειστικά και µόνο κυττάρων. Σύµφωνα µε αυτόν, χρησιµοποιούνται βλαστοκύτταρα από συγκεκριµένες πηγές, τα οποία µέσω διαφοροποίησης γίνονται, για παράδειγµα καρδιακά κύτταρα, τα οποία στη συνέχεια ενεργοποιούνται in vitro (Hribar et al., 2013). Τα παραχθέντα κύτταρα είναι έτοιµα για να µπορέσουν να εµφυτευθούν σε ασθενείς οι οποίοι πάσχουν από καρδιοπάθειες. Η µέθοδος αυτή έχει ήδη εφαρµοστεί σε αρκετούς ασθενείς. Ένας άλλος τρόπος δηµιουργίας οργάνων είναι µε τη χρήση βιοϋλικών (Guillemot et al., 2010) τα οποία ουσιαστικά χρησιµοποιούνται ως γέφυρα την οποία αρχίζουν να επενδύουν τα κύτταρα δηµιουργώντας έτσι µια ενιαία δοµή η οποία δεν είναι µόνο εξωτερικά αναγεννηµένη αλλά και εσωτερικά, όπως διαπιστώνεται µε το µικροσκόπιο. Μια άλλη τεχνική περιλαµβάνει τη χρήση κυττάρων του ασθενή ή πληθυσµό κυττάρων που καλλιεργούνται πάνω σε βιοϋλικά και ικριώµατα (Atala et al., 2006). Σε περίπτωση που ένα όργανο είναι κατεστραµµένο ή τραυµατισµένο, αφαιρείται ένα πολύ µικρό κοµµάτι (στο µέγεθος του µισού γραµµατόσηµου) και αφού αφαιρέσουν τα κύτταρα (Yagi et al., w.d.) που βρίσκονται πάνω σε αυτό τα καλλιεργούν εκτός του σώµατος µε τη βοήθεια ενός ικριώµατος ή των βιοϋλικών. Τα κύτταρα που θα προκύψουν θα επενδύσουν το βιοϋλικό (Kim et al., 2000). Στη συνέχεια, τοποθετούνται σε ειδικούς θαλάµους όπου και παίρνουν την τελική τους µορφή. Επίσης, µια άλλη µέθοδος δηµιουργίας είναι µε τη χρήση ικριώµατος από την ουροδόχο κύστη του ασθενή. Αφού αφαιρεθεί ένα µικρό κοµµάτι πάλι στο µέγεθος ενός γραµµατοσήµου από την ουροδόχο κύστη, µεγαλώνουν τα κύτταρα εκτός του σώµατος και αφού επενδύσουν το ικρίωµα µε τα κύτταρα του ίδιου του ασθενή τοποθετείται σε ειδικό θάλαµο ο οποίος του παρέχει θερµοκρασία σώµατος (37 ο ) και 95% οξυγόνο έτσι ώστε το νέο όργανο να µπορεί να προσαρµοστεί στο σώµα του ασθενή στις κατάλληλες συνθήκες θερµοκρασίας και περιεκτικότητας σε οξυγόνο (Mironov, 2008). Το όργανο κατασκευάζεται µέσα σε λίγες εβδοµάδες όπου και στη συνέχεια εµφυτεύεται και πάλι στον ασθενή. Σε ορισµένες περιπτώσεις το όργανο συρράπτεται. Τέλος οι επιστήµονες έχουν αναπτύξει ένα βελτιωµένο τρόπο δηµιουργίας συµπαγών οργάνων όπως π.χ. το ήπαρ (Bhandari et al., 2001). Σύµφωνα µε αυτή τη µέθοδο χρησιµοποιούνται όργανα που έχουν απορριφθεί και εποµένως δεν θα χρησιµοποιηθούν. Στην περίπτωση αυτή το όργανο τοποθετείται σε ειδικό διάλυµα που θα επιτρέψει στα κύτταρά του αρχικά να αποδιαφοροποιηθούν. Μετά από δυο εβδοµάδες έχουµε τη νέα δοµή που είναι ο σκελετός του οργάνου ο οποίος δεν έχει κύτταρα. Για να µετατραπεί ο σκελετός σε όργανο πρέπει να του παρέχεται αίµα. Αυτό επιτυγχάνεται µε την παροχή αγγειακών κυττάρων από τον ασθενή, ώστε να διατηρηθεί

4 το αγγειακό δένδρο και στη συνέχεια προστίθενται τα ηπατικά κύτταρα στο παρέγχυµα (Bhandari et al., 2001). Προκλήσεις για την εκτύπωση ενός λειτουργικού ιστού ή οργάνου Μια από τις κυριότερες προκλήσεις τις οποίες καλούνται να αντιµετωπίσουν οι επιστήµονες είναι αυτή της βιωσιµότητας των κυττάρων (Nair et al., 2009). Για να δηµιουργηθούν λειτουργικοί ιστοί ή όργανα που προορίζονται για µοσχεύµατα, πρέπει να εξασφαλίζεται ότι τα κύτταρα επιβιώνουν τα στάδια επεξεργασίας και εκτύπωσης. Αυτά τα κύτταρα, πριν, κατά τη διάρκεια, και µετά τα στάδια εκτύπωσης, εκτίθενται σε µια ευρεία ποικιλία συνθηκών καλλιέργειας, θερµοκρασίας, και εξωκυτταρικά περιβάλλοντα. Είναι ιδιαίτερα δύσκολο λοιπόν για τα κυτταρικούς τύπους όπως οι νευρώνες, τα ηπατοκύτταρα, και τα παγκρεατικά κύτταρα να επιβιώνουν σε αυτές τις ακραίες συνθήκες. Η βλάβη στην κυτταρική µεµβράνη που έχει ως επακόλουθο το θάνατο των κυττάρων πρέπει να περιορίζεται σε λιγότερο από 5-10% των συνολικών κυττάρων ώστε να επιτευχθεί η εκτύπωση λειτουργικών οργάνων και ιστών (Nair et al., 2009). Επόµενη πρόκληση αποτελεί η αγγείωση των εκτυπωµένων οργάνων.για την επιτυχήαξιοποίηση των τυπωµένων ανθρώπινων ιστών/οργάνων που προορίζονται για εµφυτεύµατα, θα πρέπει αυτά να έχουν µια ενσωµατωµένη αγγειακή αρχιτεκτονική που αποτελείται από ένα σύνθετο δίκτυο άκρως διακλαδισµένων αιµοφόρων αγγείων (Kaully et al., 2009). Οι τρισδιάστατες λεπτοµέρειες αποτελούν επίσης µια άλλη πρόκληση καθώς κάθε σύστηµα ιστού/οργάνου περιέχει πολλαπλούς τύπους κυττάρων, τοποθετηµένα σε ένα πολύ περίπλοκο τρισδιάστατο δίκτυο, που συντονίζουν και εξυπηρετούν ένα περίπλοκο σύνολο των λειτουργιών. Είναι σχετικά εύκολο να παραχθούν ψηφιακά µοντέλα για απλούς ιστούς/όργανα όπως ο χόνδρος, η ουροδόχος κύστη ή το δέρµα. Ωστόσο, η δοµική πολυπλοκότητα οργάνων όπως ο νεφρός, η καρδιά, το ήπαρ ή ο εγκέφαλος, καθιστά εξαιρετικά δύσκολη την αποµίµηση των βιολογικών λεπτοµερειών αυτών των οργάνων (Vincent et al, 2012). Τέλος, η δραστηριότητα του δικτύου είναι ένα επιπλέον πρόβληµα προς επίλυση. Οι αλληλεπιδράσεις των κυττάρων διαδραµατίζουν σηµαντικό ρόλο στη βιολογική λειτουργία των ιστών και των συστηµάτων οργάνων για παράδειγµα, στους νευρώνες και τον ανθρώπινο εγκέφαλο. Μόλις τα κύτταρα εκτυπώνονται και αφού λάβουν τις βέλτιστες συνθήκες ανάπτυξης, θα πρέπει να αυτό-οργανώνονται σε ένα δίκτυο για να σχηµατίσουν ένα λειτουργικό και χρησιµοποιήσιµο βιοενεργό εµφύτευµα. Τα κύτταρα µέσα σε συµπαγείς ιστούς µε αγγείωση, όπως η καρδιά, ο εγκέφαλος και τα νεφρά απαιτούν µια µεγάλη ποικιλία από αυξητικούς και σηµατοδοτικούς παράγοντες για να τους βοηθήσουν να ενσωµατωθούν σε ένα λειτουργικό δίκτυο µετά την εκτύπωση. Αυτό το τελικό βήµα, της ένταξης σε λειτουργικό δίκτυο, εξαρτάται, επίσης, από όλους τους παράγοντες που προαναφέρθηκαν, δηλαδή τη συνολική κυτταρική βιωσιµότητα, την αγγείωση και τα τρισδιάστατα στοιχεία του τυπωµένου κατασκευάσµατος (Mironov et al., 2008). Σύγκριση µε την παραδοσιακή προέλευση οργάνων προς µεταµόσχευση Είναι γεγονός ότι, σε παγκόσµιο επίπεδο, υπάρχει µικρότερη προσφορά οργάνων για µεταµόσχευση από τη ζήτηση, µε αποτέλεσµα να χάνονται πολλές ζωές

5 κάθε χρόνο εξαιτίας αυτής της έλλειψης. Σύµφωνα µε µελέτες, κάθε τριάντα δευτερόλεπτα, ένας ασθενής πεθαίνει από αρρώστιες που δύνανται να θεραπευτούν µε µεταµόσχευση οργάνου ή καλύτερα µε την τρισδιάστατη εκτύπωσή του. Με την νέα αυτή µέθοδο, της τρισδιάστατης εκτύπωσης οργάνων, δηµιουργούνται κατάλληλα µοσχεύµατα για τον ασθενή καθώς σχεδιάζονται σύµφωνα µε τις ανάγκες του και είναι πλήρως ιστοσυµβατά. Eποµένως, δεν τίθεται κανένα πρόβληµα απόρριψης του µοσχεύµατος από τον οργανισµό του ασθενούς (Devillard et al., 2014). Εντάσσεται απόλυτα και άµεσα στον οργανισµό και στη συνέχεια λειτουργεί µε ασφάλεια. Ένα επιπλέον πλεονέκτηµα της εφαρµογής αυτής είναι το γεγονός ότι ορίζεται ως η γρηγορότερη µορφή για την επίλυση ενός τέτοιου είδους προβλήµατος (Marques et al., 2013). Τα τελευταία χρόνια η διαδικασία της εύρεσης µοσχευµάτων είχε υπερβεί τα όρια της εµπορευµατοποίησης, αποτελώντας µια επιχείρηση και µάλιστα αρκετά επικερδή. Καθώς ο έλεγχος απουσίαζε, είχαν παρατηρηθεί πολλές παρανοµίες αναφορικά µε τα µοσχεύµατα, µε κυριότερο παράδειγµα την παραβίαση της σειράς προτεραιότητας των ασθενών, γεγονός που ελλοχεύει πολλούς κινδύνους για τη ζωή των ίδιων. Επίσης είχε αναπτυχθεί έντονος φόβος µεταξύ των ανθρώπων, κυρίως ανηλίκων, οι οποίοι διακινδύνευαν να γίνουν θύµατα εκµετάλλευσης. Είναι αξιοσηµείωτη η διαπίστωση ότι τα µοσχεύµατα αποτελούσαν κύριο αίτιο δολοφονιών καθώς η αξία των οργάνων είναι ανεκτίµητη και αρκετά εύκολα εκµεταλλεύσιµη. Με την τρισδιάστατη λοιπόν εκτύπωση πραγµατώνεται ανεξαρτησία από την αγορά διεθνής συνεργασίας,η οποία συχνά καταλήγει σε έλλειψη µοσχευµάτων και άλλοτε σε ανήθικες και αντιπεριβαλλοντικές στάσεις. Σε σύγκριση, λοιπόν, µε την παλαιότερη µέθοδο της µεταµόσχευσης, η τρισδιάστατη εκτύπωση αποτελεί µια ευφυή καινοτοµία στη βιοϊοατρική έρευνα µε αρκετά περιθώρια αυτοµατισµού και σηµαντικά πλεονεκτήµατα. Βέβαια, η τεχνολογία αυτή αν και εφικτή,χαρακτηρίζεται αρκετά δύσκολη στην εφαρµογή της. Μελλοντικές εφαρµογές Η εκτύπωση οργάνων είναι µια τεχνολογία αιχµής στη βιοϊατρική έρευνα, που θα συνεισφέρει σηµαντικά σε διάφορους τοµείς. Μια από τις κύριες πρακτικές προσδοκίες είναι να δηµιουργηθούν λειτουργικά όργανα, που θα µπορούν να µεταµοσχευθούν σε ασθενείς. Αυτά τα όργανα θα είναι πλήρως ιστοσυµβατά και εποµένως εντελώς ασφαλή για το δέκτη, µειώνοντας τη φαρµακευτική αγωγή για την καταστολή του ανοσοβιολογικού συστήµατος, που ακολουθείται όταν έχουµε µόσχευµα από δότη. Η διαδικασία µπορεί να αυτοµατοποιηθεί σε µεγάλο βαθµό, αλλά ταυτόχρονα να έχει ως τελικό αποτέλεσµα όργανα κατά παραγγελία για τον εκάστοτε δέκτη. Επίσης, θα είναι αποτελεσµατικότερη από τις άλλες in vitro διαδικασίες παραγωγής ιστών, γιατί θα υπάρχει ανάγκη για λήψη ελάχιστου ιστού από τον ασθενή. Ένας άλλος τοµέας στον οποίο θα συνεισφέρουν τα όργανα που θα παράγονται µε την παραπάνω διαδικασία είναι η κλινική δοκιµή φαρµάκων και διεργασιών σε ανθρώπινο βιολογικό υλικό. Κάτι τέτοιο σήµερα περιορίζεται σε κυτταροκαλλιέργειες, που δεν εµφανίζουν τη συνολική βιοχηµική και φυσιολογική συµπεριφορά του ιστού και πολύ περισσότερο του οργάνου από το οποίο προέρχονται, ενώ οι δοκιµές σε όργανα δεν είναι συνηθισµένη πρακτική, εξαιτίας της έλλειψής τους και της προτεραιότητας για χρήση τους στις µεταµοσχεύσεις.

6 Βιβλιογραφία Atala, A., Bauer, SB., Soker, S., Yoo, JJ.,&Retik, AB. (2006). Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet, 15;367(9518): Atala, A. (2004). Tissue engineering for the replacement of organ function in the genitourinary system. American Journal of Transplantation, Vol.4, Issue Supplement s6, Bhandari, RN.,Riccalton, LA., Lewis, AL., Fry, JR., Hammond, AH., Tendler, SJ., &Shakesheff, KM., (2001). Liver tissue engineering: a role for co-culture systems in modifying hepatocyte function and viability. Tissue Eng., 7(3): Dekel, B., Burakova, T., Arditti, FD., Reich-Zeliger, S., Milstein, O., Aviel-Ronen, S., Rechavi, G., Friedman, N., Kaminski, N., Passwell, JH., &Reisner, Y. (2002). Human and porcine early kidney precursors as a new source for transplantation.nat Med., 9(1): Devillard R., Pages E., Correa MM., Keriquel V., Remy M, Kalisky J., Ali M., Guillotin B., & Guillemot F. (2014). Cell patterning by laser-assisted bioprinting. Tissue Eng., 10(3-4): Guillemot, F., Souquet, A., Catros, S., Guillotin, B., Lopez, J., Faucon, M., Pippenger, B., Bareille, R., Rémy, M., Bellance, S., Chabassier, P., Fricain, JC.,&Amédée, J. (w.d.). High-throughput laser printing of cells and biomaterials for tissue engineering. Acta Biomater., 6(7):2, Hribar, KC, Soman, P, Warner, J, Chung, P, Chen S. (2013). Light-assisted direct-write of 3D functional biomaterials. Lab Chip. 21;14(2): Epub Kaully, T., Kaufman-Francis, K., Lesman, A., &Levenberg, S. (2009). Vascularization-- the conduit to viable engineered tissues. Tissue Eng. Part B: Reviews. 15(2): Kim, B.-S., Baez, C.E, Atala, A. (2000). Biomaterials for tissue engineering. World J Urol., 18(1):2-9. Koo, HP., Bunchman, TE., Flynn, JT., Punch, JD., Schwartz, AC., &Bloom, DA. (1999). Renal transplantation in children with severe lower urinary tract dysfunction. J. Urol., 161(1): Marques JM., Ortiz-Vega, NM., Sanchez, MC., Soto-Aviles, OE., & Torres, EA, (2013). Knowledge of and attitudes toward organ donation a survey of medical students in Puerto Rico. P. R. Health Sci J., 32(4): Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., &Markwald, RR. (2008). Organ printing: promises and challenges. Regen Med., 3(1): Murphy, SV.,&Atala A. (2012). Organ engineering combining stem cells, biomaterials, and bioreactors to produce bioengineered organs for transplantation. Bioessays, 35(3): Nair, K.,Gandhi, M., Khalil, S., Yan, KC., Marcolongo, M., Barbee, K., &Sun, W. (2009). Characterization of cell viability during bioprinting processes. Biotechnol J., 4(8):

7 Sun Y., Yang X., & Wang Q. (2014). In silico analysis on biofabricating vascular networks using kinetic Monte Carlo simulations. Biofabrication, 15;6(1): [Epub ahead of print].