Γονιδιωματική ανάλυση της επίδρασης αντιψωριασικών φαρμάκων σε καλλιέργειες ανθρώπινων κερατινοκυττάρων με τη χρήση μικροσυστοιχιών DNA

Μέγεθος: px
Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "Γονιδιωματική ανάλυση της επίδρασης αντιψωριασικών φαρμάκων σε καλλιέργειες ανθρώπινων κερατινοκυττάρων με τη χρήση μικροσυστοιχιών DNA"

Transcript

1 Πανεπιστήμιο Πατρών Σχολή Επιστημών Υγείας Τμήμα Ιατρικής Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών «Εφαρμογές στις Βασικές Ιατρικές Επιστήμες» Κατεύθυνση Παθοβιοχημείας Γονιδιωματική ανάλυση της επίδρασης αντιψωριασικών φαρμάκων σε καλλιέργειες ανθρώπινων κερατινοκυττάρων με τη χρήση μικροσυστοιχιών DNA Φακιολάς Στέφανος Βιοχημικός & Βιοτεχνολόγος Μεταπτυχιακή Διατριβή Πάτρα 2012

2 Τριμελής συμβουλευτική επιτροπή Σταθόπουλος Κωνσταντίνος Αναπληρωτής Καθηγητής Ιατρική σχολή, Πανεπιστήμιο Πατρών Δραΐνας Διονύσιος Καθηγητής Ιατρική σχολή, Πανεπιστήμιο Πατρών Σακελλαρόπουλος Γεώργιος Επίκουρος Καθηγητής Ιατρική σχολή, Πανεπιστήμιο Πατρών 2

3 Στην Ρούλα που με στήριξε παρά τις ατέλειωτες ώρες μοναξιάς της. Στους γονείς της και στους γονείς μου. Στους δασκάλους μου. Και σε όσους με εμπιστεύθηκαν ΣΦ Δεν θα μπορούσα να είχα πραγματοποιήσει αυτήν τη μελέτη αν δεν υπήρχαν κάποιοι άνθρωποι να με εμπιστευθούν, να με στηρίξουν, να με συμβουλεύσουν, να με βοηθήσουν. Άτομα στα οποία οφείλω τις ευχαριστίες μου και το λιγότερο που μπορώ να κάνω είναι να τους μνημονεύσω Κατ αρχήν, θα ήθελα να ευχαριστήσω την επιτροπή επιλογής υποψήφιων μεταπτυχιακών φοιτητών που με εμπιστεύθηκε και με επέλεξε. Τον δάσκαλο μου από τα προπτυχιακά χρόνια και τώρα, επιβλέποντα στη μεταπτυχιακή μου μελέτη κ. Κων/νο Σταθόπουλο. Δάσκαλος που με ενέπνευσε, με έκανε να δω την ε- πιστήμη από διαφορετική όψη και στάθηκε αφορμή για να επιλέξω το συγκεκριμένο ΠΜΣ. Στάθηκε ταυτόχρονα αρωγός και συνοδοιπόρος στην παρούσα μελέτη αλλά και σε ζητήματα που συμπλήρωναν τον μεταπτυχιακό μου βίο. Θα ήθελα να ευχαρίστησω τους καθηγητές μου στην τριμελή επιτροπή, κ. Διονύσιο Δραΐνα ο οποίος με επέλεξε για το ΠΜΣ και με υπομονή και εμπιστοσύνη με βοήθησε όχι μόνο στην μεταπτυχιακή μελέτη αλλά και σε πιο πρακτικά ζητήματα. Τον κ. Γεώργιο Σακελλαρόπουλο ο οποίος με κατεύθυνε σε πιο εξειδικευμένα θέματα στην επεξεργασία των αποτελεσμάτων, με πολύ υπομονή και αφοσίωση. Πολλές ευχαριστίες οφείλω, στην Κατερίνα Γραφανάκη που μοιραστήκαμε προβληματισμούς, ιδέες και προσπαθήσαμε από κοινού για την υλοποίηση αυτής της μελέτης. Ο Δημήτρης Αναστασάκης με βοήθησε σε πολλά επίπεδα και με στήριξε εξωακαδημαϊκά. Η Μαρία Αποστολίδη μου δίδαξε τις μικροσυστοιχίες και με βοήθησε με την υλοποίηση εξειδικευμένων τεχνικών και μοιράστηκε τις ανησυχίες μου. Πολλές ευχαριστίες στους καθηγήτες του Εργαστηρίου Βιολογικής Χημείας κ.κ. Δ.Καλπαξή, Δ.Συνετό, Γ.Ντίνο, Π.Μάμο, Σ.Κάλλια-Ραυτοπούλου που με περιέβαλλαν με εμπιστοσύνη και διδaσκαλική αγάπη. Επίσης στους φοιτητές του εργαστηρίου Χ. Τουμπέκη, Μ. Μπίκου, Μ. Κροκίδη, Σ. Πυθαροπούλου, Ρ. Κωστοπούλου, Γ. Κουρνούτου για τις συζητήσεις που είχαμε πάνω στα ερευνητικά εμπόδια που προέκυπταν, τις ανησυχίες μας, την παρέα που κάναμε. Οφείλω πολλές ευχαριστίες επίσης στον κ Ι. Χαμπαίο για τη χρήση του εξοπλισμού του εργαστηρίου του καθώς και τους φοιτητές του Δ. Χαρτουμπέκη και την G. Οnjaro. Στην κ. Α. Μουζάκη που επίσης μας βοήθησε στη δοκιμασία του ΜΤΤ και στην φοιτήτρια της Μ. Ρόδη. Στην κ. Ζ. Λυγερού για την βοήθεια της σε ζητήματα μεθοδολογίας. Στους προϊσταμένους μου στο Γ. Ν. Πρέβεζας που μου επέτρεψαν να πραγματοποιήσω αυτό το μεταπτυχιακό και στους συναδέλφους μου που έδειξαν υπομονή. Για το τέλος άφησα τα άτομα στα οποία οφείλω τη μεγαλύτερη ευγνωμοσύνη. Τη σύντροφό μου στη ζωή Ρούλα για την στήριξη που μου παρείχε αν και πέρασε ατέλειωτες ώ- ρες μοναξιάς, χιλιόμετρα μακριά σαν άλλη Πηνελόπη. Στους γονείς της που και εκείνοι με στήριξαν με κάθε τρόπο και τέλος στους γονείς μου. 3

4 Πίνακας περιεχομένων ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 7 SUMMARY... 8 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα ρετινοειδή Υποδοχείς Ρετινοειδών Πρωτεΐνες που δεσμεύουν ρετινοειδή All-trans ρετινοϊκό οξύ (ATRA) Ασιτρετίνη (Acitretin) Σηματοδοτικά μονοπάτια Δράση ρετινοειδών Απόπτωση διαμεσολαβούμενη από το ATRA Η σηματοδότηση του ρετινοϊκού οξέος στα κύτταρα του εγκεφάλου Η ψωρίαση Ιστολογικά χαρακτηριστικά Επιδημιολογικά χαρακτηριστικά Γενετικοί παράγοντες που σχετίζονται με εμφάνιση ψωρίασης Ανοσολογικοί παράγοντες που σχετίζονται με εμφάνιση ψωρίασης Θεραπευτική αγωγή Τοπική αγωγή Συστηματική αγωγή Βιολογικοί παράγοντες Γονιδιωματική ανάλυση και ο ρόλος της στη μελέτη πολυπαραγοντικών νόσων αγνώστου αιτιολογίας Ανθρώπινο γονιδίωμα Μικροσυστοιχίες (Microarrays) ΣΚΟΠΟΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Κυτταροκαλλιέργειες Δοκιμασία επίδρασης του DMSO στα κύτταρα Καταμέτρηση κυττάρων με αιμοκυττόμετρο και χρώση με Trypan blue Παρασκευή πρότυπων διαλυμάτων των φαρμακευτικών ουσιών και των διαλυμάτων εργασίας

5 Καμπύλη επίδρασης των φαρμάκων σε κυτταροκαλλιέργειες Δοκιμασία βιωσιμότητας ΜΤΤ Συλλογή και φύλαξη κυττάρων HaCaT Απομόνωση RNA από τα κύτταρα με τη χρήση προτυποποιημένων στηλών της Ambion Έλεγχος ποιότητας του απομονωμένου RNA Προετοιμασία δειγμάτων για τον υβριδισμό στις μικροσυστοιχίες Α. Σύνθεση της πρώτης αλυσίδας του cdna με αντίστροφη μεταγραφή Β. Σύνθεση δεύτερης αλυσίδας του cdna Γ. Καθαρισμός cdna Δ. In Vitro μεταγραφή για τη σύνθεση τροποποιημένου Άμινο-άλλυλ-aRNA Ε. Καθαρισμός arna ΣΤ. Σύζευξη της χρωστικής Ζ. καθαρισμός του σημασμένου arna Η. Φωτομετρική ανάλυση της ενσωμάτωσης των μορίων χρωστικής Θ. Προ-υβριδοποίηση της μικροσυστοιχίας Ι. Προετοιμασία υβριδοποίησης ΙΑ. Πλήρωση διαμερίσματος υβριδοποίησης της μικροσυστοιχίας ΙΒ. Πλύσιμο υβριδοποιημένης μικροσυστοιχίας Σάρωση πλακιδίων μικροσυστοιχιών Ποσοτικοποίηση του σήματος (Quantitation) Επεξεργασία των δεδομένων με την ομάδα προγραμμάτων της ΤΜ Αλλαγή του τύπου αρχείου σε συμβατή μορφή Επεξεργασία δεδομένων με το TIGR MIDAS Ανάλυση επεξεργασμένων δεδομένων με το πρόγραμμα MeV-Multi Experiment Viewer Επιλογή γονιδίων για επιβεβαίωση αποτελεσμάτων και βασικών βιολογικών διεργασιών Σχεδιασμός εκκινητών και προετοιμασία των διαλυμάτων εργασίας Real-time PCR Προετοιμασία συσκευής Πρωτόκολλο (βάσει του ηλεκτρονικού εγχειριδίου της Agilent) Προγραμματισμός MxPro ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Επίδραση του DMSO στις κυτταροκαλλιέργειες

6 Επίδραση των φαρμακευτικών ουσιών all-trans-retinoic Acid (ATRA), Acitretin στα κύτταρα Δοκιμασία βιωσιμότητας ΜΤΤ Έλεγχος ποιότητας του RNA που απομονώθηκε Αποτελέσματα ποσοτικοποίησης του σήματος Αποτελέσματα κανονικοποίησης των αρχικών δεδομένων Αποτελέσματα ανάλυσης δεδομένων με το πρόγραμμα MeV Επιβεβαίωση αποτελεσμάτων με qrt-pcr ΣΥΖΗΤΗΣΗ Πρωτεϊνοσύνθεση Μεταγωγή σήματος Απόπτωση Κυτταρική λειτουργία Ρετινοειδή Συμπερασματικά Βιβλιογραφία Παράρτημα

7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε γονιδιωματική ανάλυση της επίδρασης αντιψωριασικών φαρμάκων σε καλλιέργειες ανθρώπινων κερατινοκυττάρων με τη χρήση μικροσυστοιχιών DNA. Σε καλλιέργειες κυττάρων HaCaT χορηγήθηκαν τα παράγωγα του ρετινοϊκού οξέος all-trans retinoic acid (ATRA) και acitretin, σε διαβαθμισμένες δόσεις, προκειμένου να διαπιστωθεί η επίδραση τους στα κύτταρα. Μελετήθηκε η βιωσιμότητα των κυττάρων με τις δοκιμασίες της χρωστικής Trypan Blue και ΜΤΤ. Επιλέχθηκαν δύο συγκεντρώσεις (10-6 και 10-8 Μ) των φαρμάκων που αντιστοιχούσαν σε βιωσιμότητα κυττάρων περίπου 80%, οι οποίες χορηγήθηκαν εκ νέου σε καλλιέργειες κυττάρων HaCaT. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, έγινε εκχύλιση του RNA και έλεγχος της ποιότητας του με ηλεκτροφόρηση (Bioanalyzer). Το RNA χρησιμοποιήθηκε για την in vitro μεταγραφή cdna που σημάνθηκε με φθοριοχρώματα και άμεσα ακολούθησε υβριδισμός σε πλακίδιο μικροσυστοιχιών (OneArray) το οποίο περιείχε ανιχνευτές για όλο το ανθρώπινο γονιδίωμα μαζί με τους κατάλληλους μάρτυρες. Σε κάθε πλακίδιο υβριδίστηκαν ταυτόχρονα cdna από κύτταρα στα οποία είχε χορηγηθεί ρετινοειδές και κύτταρα στα οποία δεν είχε χορηγηθεί. Η επεξεργασία των δεδομένων της σαρώσεως με ειδικό λογισμικό ανέδειξε 700 περίπου γονίδια που ρυθμίζονται θετικά ή αρνητικά σε στατιστικά σημαντικό βαθμό. Για την επαλήθευση των αποτελεσμάτων που προέκυψαν από τις μικροσυστοιχίες, επιλέχθηκαν 34 γονίδια τα οποία συμμετέχουν σε βασικές βιολογικές διεργασίες όπως πρωτεϊνοσύνθεση, κυτταρική σηματοδότηση, πολλαπλασιασμός, κυτταρική διαφοροποίηση, κυτταρικός θάνατος, φλεγμονή. Επιπρόσθετα, επιλέχθηκαν 22 γονίδια τα οποία έχουν επίσης κομβικό ρόλο σε σηματοδοτικά μονοπάτια και κυτταρικές λειτουργίες. Η επιλογή αυτή έγινε για να μελετηθεί πιο σφαιρικά η επίδραση των φαρμάκων σε βασικούς κυτταρικούς μοριακούς μηχανισμούς. Στο σύνολο των επιλεγμένων γονιδίων έγινε ποσοτική Real-Time PCR και για το σκοπό αυτό έγινε σχεδιασμός ειδικών εκκινητών. Η qrt-pcr εν τέλει, επιβεβαίωσε τα αρχικά αποτελέσματα από τα microarrays. Διαπιστώθηκε ότι η κυτταρική απόκριση στη χορήγηση των ρετινοειδών, εξειδικευμένα για κάθε δραστική ουσία και για κάθε δόση δεν είναι μονοσήμαντη, αλλά ότι ταυτόχρονα επάγονται λειτουργικά μονοπάτια με διαφορετικούς ρόλους. Επίσης διαπιστώθηκε ότι η μεταβολή κατά δύο τάξεις μεγέθους της δόσης που προσλαμβάνουν τα κύτταρα επάγει αντίρροπες κυττα- 7

8 ρικές αποκρίσεις. Συγκεκριμένα, η ολιστική προσέγγιση της μεταβολής της γονιδιακής έκφρασης ανέδειξε ότι η χορήγηση ATRA σε συγκέντρωση 10-6 Μ στις κυτταροκαλλιέργειες ευνοεί την πρωτεϊνοσύνθεση και την διαφοροποίηση των κυττάρων ενώ ασκεί αντιφλεγμονώδη δράση. Η χορήγηση της δραστικής ουσίας ATRA στη δόση 10-8 Μ ευνοεί τη διαφοροποίηση των κυττάρων HaCaT σε μεγαλύτερο βαθμό από τον πολλαπλασιασμό τους. Επιπλέον, φαίνεται ότι σε αντίθεση με τη μεγαλύτερη δόση, ευνοείται η σύνθεση μορίων που επάγουν την φλεγμονή. Παρόμοια, η ασιτρετίνη στη δόση 10-6 Μ ευνοεί τη διαφοροποίηση των κυττάρων και την σύνθεση μορίων που επάγουν τη φλεγμονή. Η ασιτρετίνη στην μικρότερη δόση (10-8 Μ) ευνοεί κύρια την διαφοροποίηση, λιγότερο τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και φαίνεται ότι προάγει σε σημαντικό βαθμό την απόπτωση. Οι μεγαλύτερες δόσεις των ρετινοειδών που μελετήθηκαν φαίνεται ότι είναι απαγορευτικές για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε αντίθεση με τις μικρότερες δόσεις. Επισημαίνεται ότι για τη θεραπεία της ψωρίασης όπου χρησιμοποιούνται, επιθυμητές δράσεις είναι η παραγωγή μορίων με αντιφλεγμονώδη δράση, ο περιορισμός του αυξημένου κυτταρικού πολλαπλασιασμού, αύξηση της κυτταρικής απόπτωσης και τέλος πολύ σημαντικό είναι η επιτυχής περάτωση της διαφοροποίησης των κυττάρων. Συμπερασματικά, η χρήση τεχνικών υψηλής απόδοσης, κύρια των μικροσυστοιχιών cdna που επιτρέπουν την εκτεταμένη μελέτη του γονιδιώματος και της qrt-pcr για πιο στοχευμένη μελέτη, μπορούν να διαδραματίσουν σημαντικό ρόλο στην εξακρίβωση μοριακών μηχανισμών. SUMMARY In the current project we performed gene expression profiling, using cdna microarrays, when specific doses of derivatives of retinoic acid were applied in HaCaT cell culture. These specific drugs are used in the treatment of psoriasis but their exact effect in molecular level remains elusive. All-trans retinoic acid and acitretin were applied in gradient doses. Cell viability was monitored using MTT and Trypan blue assays. Two specific doses (10-6 & 10-8 M), in which cell viability was approximately 80%, were chosen for the treatment of HaCaT cells. Subsequently, the treated cells were collected and RNA was extracted using standard methods. At a 8

9 next step, RNA quality was examined by electrophoresis (Bioanalyzer) and spectrometry. High quality RNA showing no traces of degradation was used as template for in vitro transcription. Finally, synthesis of fluoro-labeled cdna was performed from RNA derived from both treated and untreated samples and was immediately hybridized to DNA microarray slides (OneArray). Analysis of the hybridization data was performed using specific software. As a result, 700 genes (both up-regulated and down-regulated) were chosen for further analysis. Among them, 34 genes were chosen to validate the microarrays results by the use of quantitative Real-Time PCR. These genes appeared to play crucial role in basic cellular functions like protein synthesis, signal transduction, cell death, cell differentiation and proliferation. Furthermore, 22 additional essential genes that are related to the above processes were chosen in aim to examine drugs effects. The data processing revealed that the 10-6 M dose of ATRA has a positive effect in protein synthesis, cell differentiation and anti-inflammatory action. Moreover ATRA at a concentration of 10-8 M promotes differentiation more than proliferation and it has inflammatory effect as well as acitretin has in 10-6 M dose. On the other, hand acitretin in 10-8 M dose facilitates differentiation more than proliferation but mainly induces cell death. Generally, high doses (10-6 M) of the drugs inhibit cell proliferation more efficient than low doses (10-8 M). In fact, during psoriasis treatment, the anti-inflammatory action, inhibition of cell proliferation, induction of cell differentiation and cell death are considered desirable drug effects. Our study shows that cdna microarray analysis represents a powerful tool that can be used for extended genomic studies and the results that are obtained can be validated and used for the elucidation of several molecular mechanisms. 9

10 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα ρετινοειδή Τα ρετινοειδή είναι φυσικά ή συνθετικά παράγωγα της βιταμίνης Α. Η τελευταία βρίσκεται στη μορφή μορίων από διαφορετικές χημικές σειρές όπως αλκοόλη (ρετινόλη) που αποτελεί τη κύρια μορφή αποθήκευσης, αλδεΰδη (ρετινάλη) που είναι η δραστική μορφή της και η οξειδωμένη μορφή τους το ρετινοϊκό οξύ το οποίο έχει ρόλο αυξητικής ορμόνης. Προσλαμβάνεται με την τροφή, εστεροποιημένη με λιπαρά οξέα (κυρίως οξικό ή παλμιτικό) και στο λεπτό έντερο μετατρέπεται σε ρετινόλη. Η λιποδιαλυτή βιταμίνη Α είναι απαραίτητο συστατικό του ανθρώπινου οργανισμού με σημαντικό ρόλο στην όραση, στην ανάπτυξη, στην αναπαραγωγή, στην ομοιόσταση και διαφοροποίηση των επιθηλιακών κυττάρων, στη λειτουργία του ανοσοποιητικού, καθώς και στην καρκινογένεση. Η βιταμίνη Α επίσης προέρχεται από τα καροτένια (α-, β- και γ- καροτένιο) που είναι πρόδρομες μορφές της, με τη δράση του ενζύμου 15,15 -μονοοξυγενάση. [1] Τα ρετινοειδή μπορούν να ταξινομηθούν σε τρείς κατηγορίες ανάλογα με το χρόνο που μπήκαν στη φαρμακολογική φαρέτρα. Στην πρώτη γενεά ανήκουν η ρετινόλη, η ρετινάλη, το all-trans ρετινοϊκό οξύ (τρετινοΐνη), η ισοτρετινοΐνη και η αλιτρετινοΐνη. Η δεύτερη γενιά περιλαμβάνει την ετρετινάτη και την ασιτρετίνη. Τέλος στη τρίτη γενιά βρίσκονται η ταζαροτένη, μπεξαροτένη και η ανταπαλένη. Στη χημική δομή τους περιλαμβάνονται τέσσερεις ισοπρενοειδείς ομάδες. Στο ένα άκρο του μορίου βρίσκεται στους τριμεθυλιωμένος δακτύλιος κυκλοεξανίου που συνδέεται με μια πλευρική αλυσίδα με 4 συζυγείς διπλούς δεσμούς και στο άλλο άκρο του μορίου βρίσκεται μια πολική ομάδα άνθρακα-οξυγόνου. Εξαιτίας των συζυγιακών δεσμών τα ρετινοειδή απορροφούν ακτινοβολία και εμφανίζουν χαρακτηριστικό χρώμα πορτοκαλο-κίτρινο, στους για παράδειγμα τα καρότα και η [2] [3] λέκιθος του αυγού. Τα ρετινοειδή έχουν ενοχοποιηθεί για μια σειρά επιβλαβών δράσεων στον οργανισμών. Αυτές οι ανεπιθύμητες δράσεις μπορεί να είναι συνήθεις και απλές στους ερεθισμός του δέρματος, διαβαθμίζονται στους σε επικινδυνότερες στους είναι τοξικότητα και τερατογένεση. Ο μηχανισμός δράσης στους δεν είναι εξακριβωμένος ακόμα και σήμερα. Αναμφισβήτητα μέρος στους βιολογικής στους δράσης 10

11 επιτυγχάνεται μέσω των υποδοχέων στους. Παρόλα αυτά φαίνεται ότι ασκείται βιολογική δράση παράλληλα και ανεξάρτητα στους πρόσδεσης στους υποδοχείς των ρετινοειδών. [2] Α. (1) R = CH 2 OH (2) R = CHO (3) R = CO 2 H (4) R = CH 3 (5) R = CH 2 OCOCH 3 (6) R = CH 2 NH 2 (7) R = CH=NOH (8) R = CH=N[CH 2 ] 4 CHNH 2 CO 2 H (9) R = CO 2 C 2 H 5 (10) R- Β. Γ. Εικόνα 1 Α. Η ομάδα του ισοπρενίου που είναι η δομική μονάδα των ρετινοειδών. 4 ομάδες ισοπρενίου περιέχονται στη χημική δομή τους. Β. Η δομή των ρετινοειδών. Επάνω φαίνονται οι υποκαταστάτες της ομάδας R. Η ένωση που έχει ως πλάγια ομάδα την (1) είναι η ρετινόλη. Η ρετινάλη έχει πλάγια ομάδα την (2) και το ρετινοϊκό οξύ έχει την ομάδα (3). Γ. Οι χημικοί τύποι των ρετινοειδών πρώτης και δεύτερης γενιάς. Σε επόμενη παράγραφο αυτής της ενότητας θα περιγραφούν οι ενώσεις τρετινοΐνη (ATRA) και ασιτρετίνη, οι οποίες συμπεριλαμβάνονται στη παρούσα μελέτη. 11

12 Υποδοχείς Ρετινοειδών Οι υποδοχείς των ρετινοειδών διακρίνονται στους υποδοχείς του ρετινοϊκού οξέος RAR (Retinoic Acid Receptor) και στους υποδοχείς Χ των ρετινοειδών RXR (Retinoid X Receptor). Τόσο οι RAR όσο και οι RXR έχουν από τρείς υποτύπους που διακρίνονται με τα γράμματα του ελληνικού αλφαβήτου α-, β-, και γ- καθώς και διάφορες ισομορφές ως αποτέλεσμα εναλλακτικού ματίσματος. Με εξαίρεση τον υποδοχέα RARβ που έχει τέσσερεις ισομορφές, όλοι οι υπόλοιποι έχουν από δύο που χαρακτηρίζονται με αριθμούς. Πρόκειται για πυρηνικούς υποδοχείς που για να δράσουν ετεροδιμερίζονται ή κατά περίπτωση ομοδιμερίζονται. Συγκεκριμένα οι RAR ετεροδιμερίζονται με τους RXR, ενώ οι τελευταίοι μπορούν να ομοδιμεριστούν. Επιπλέον οι RXR ετεροδιμερίζονται με πολλούς διαφορετικούς υποδοχείς όπως τους υποδοχείς της βιταμίνης D (VDR), των θυρεοειδικών ορμονών (TR-β), των φαρνεσυλίων (FXR) καθώς επίσης αλληλεπιδρούν με πλήθος άλλων μορίων όπως τα BCL3 (B cell lymphoma), [4] IGFBP3 (Insulin-like growth factor-binding protein 3), [5] MyoD (myogenic regulatory factor), [6] NFKBIB (NF-kappa-B inhibitor beta), [7] TBP (TATAbinding protein). [8] Η συγγένεια των υποδοχέων δεν είναι η ίδια για όλα τα ρετινοειδή. Το alltrans ρετινοϊκό οξύ (ATRA) δεσμεύεται με μεγάλη συγγένεια στους υποδοχείς RAR ενώ το ισομερές του το 9-cis ρετινοϊκό οξύ δεσμεύεται με μεγαλύτερη συγγένεια στους υποδοχείς RXR. [9] Επιπλέον θεωρείται ότι οι δύο τύποι υποδοχέων ανήκουν σε διαφορετικές ομάδες πυρηνικών υποδοχέων με τους RAR να είναι έχουν μεγαλύτερη ομολογία με τους θυρεοειδικούς υποδοχείς TR παρά με τους RXR. [9] Διακρίνονται έξι συντηρημένες περιοχές στους υποδοχείς που χαρακτηρίζονται με τα γράμματα A-F και ονομαστικά είναι η AF-1 (activation factor-1) στο αμινοτελικό του υποδοχέα, η DBD (DNA binding domain), η LBD (ligand binding domain), η AF-2 και η μεταβλητή περιοχή F στο καρβόξυ-τελικό άκρο. Η AF-1 (Activating Factor-1) συμμετέχει στην ενεργοποίηση της μεταγραφής. Η περιοχή DBD (DNA Binding Domain) περιέχει δάκτυλους ψευδαργύρου οι οποίοι συμμετέχουν στην δέσμευση του υποδοχέα στο DNA. Η περιοχή CoR (corepressor) έχει το ρόλο συγκαταστολέα. Το πρόσδεμα προσδένεται στην περιοχή AF-2 (Activating Factor-2). [10] 12

13 Οι διμερισμένοι υποδοχείς που έχουν δεσμεύσει το πρόσδεμα (τα ρετινοειδή), προσδένονται σε ειδικές περιοχές πάνω στο DNA που χαρακτηρίζονται ως στοιχεία απόκρισης στο ρετινοϊκό οξύ (RARE) ή στοιχεία απόκρισης Χ των ρετινοειδών (RXRE) και βρίσκονται ανοδικά, συνήθως στην περιοχή του υποκινητή. Αυτά τα στοιχεία χαρακτηρίζονται από την παρουσία αλληλουχίας έξι νουκλεοτιδίων τα ο- ποία είναι AG(G/T)TCA. Το νουκλεοτιδικό μοτίβο μπορεί να επαναλαμβάνεται με την ίδια φορά των νουκλεοτιδίων, με παλίνδρομη φορά ή τέλος να διατάσσεται με ακανόνιστο τρόπο. [10] Α. Β. Εικόνα 2. Α. Σχηματική παράσταση των περιοχών του υποδοχέα. Οι περιοχές AF ενεργοποιούν την μεταγραφή, η περιοχή DBD προσδένεται στο DNA και το πρόσδεμα συνδέεται σε περιοχή που σχηματίζεται από τις περιοχές LBD δύο διμερισμένων υποδοχέων. Στο σχήμα εμφανίζονται τα σημεία που επιδρούν κινάσες όπως PKA, PKC και οι κυκλίνη cdk7. Β. Η περιοχή Α προσφέρει αρκετές θέσεις φωσφορυλίωσης. Σε συνδυασμό με την περιοχή Β διαμορφώνουν μια περιοχή που δρα ανεξάρτητα από την σύνδεση του προσδέματος, έχει ιδιότητες trans-ενεργοποίησης (AF-1) και επιπλέον ρυθμίζει την περιοχή AF-2. Η περιοχή C συμμετέχει ασθενώς στο διμερισμό του υποδοχέα μαζί με την περιοχή D. Υπάρχουν δύο δάκτυλοι ψευδαργύρου στην περιοχή C που συμβάλλουν στην πρόσδεση στο DNA. Η περιοχή Ε συμμετέχει κύρια στον διμερισμό του υποδοχέα, στη δέσμευση του προσδέματος και στην εξαρτώμενη (από τη δέσμευση) ενεργοποίηση του (AF-2). Η περιοχή F δεν έχει κάποια λειτουργική ιδιότητα και είναι απούσα από τους RXRs. Αντιθέτως όταν οι υποδοχείς δεν έχουν πρόσδεμα, συνδέονται με πρωτεΐνες που καταστέλλουν τη μεταγραφή. Τέτοιες πρωτεΐνες είναι η NCoR (nuclear receptor 13

14 corepressor) αλλά και απακετυλάσες των ιστονών HDACs που συμβάλλουν στη συμπύκνωση της χρωματίνης και στην καταστολή της μεταγραφής. [10] Υπάρχει και μια τρίτη κατηγορία υποδοχέων που δεν έχει διερευνηθεί πλήρως. Ο λόγος είναι ότι είναι μια ετερογενής ομάδα υποδοχέων με μη γνωστό πρόσδεμα που χαρακτηρίζονται ως ορφανοί υποδοχείς. Υποδοχείς αυτής της κατηγορίας ενεργοποιούνται από τα ρετινοειδή δίχως να είναι το κύριο πρόσδεμα τους. Χαρακτηριστικός τέτοιος υποδοχέας είναι ο TR4 ο οποίος σε μελέτες που έχουν γίνει φαίνεται ότι εμποδίζει την μεταγραφή γονιδίων που έχουν ως στοιχείο ελέγχου τις αλληλουχίες RARE με επαναλήψεις σε σειρά. Επειδή μάλιστα η σύνθεση του TR4 επάγεται από τα ρετινοειδή, θεωρείται ότι ρυθμίζει αρνητικά τη δράση των ρετινοειδών. [11] Τα ανθρώπινα κερατινοκύτταρα της επιδερμίδας έχουν κυρίως τρεις από τους υποδοχείς που αναφέρθηκαν. Οι RXRα είναι οι πολυπληθέστεροι, ακολουθούν στη σειρά οι RARγ και λιγότεροι είναι οι RARα. Κυρίως εκφράζονται στις ανώτερες στοιβάδες της επιδερμίδας, γεγονός που μπορεί να υποδηλώνει ότι εμπλέκονται στην τελική διαφοροποίηση των κερατινοκυττάρων. Ένα άλλο εύρημα είναι ότι σε συγκεκριμένους τύπους καρκίνου, ο αριθμός των υποδοχέων είναι ελαττωμένος και είναι σε συνάρτηση με το στάδιο της νόσου. Σε πειράματα με μύες που επιλεκτικά δεν εκφράζουν (knock-down) το γονίδιο RXRα, το δέρμα των μυών απέκτησε φαινότυπο ψωρίασης. [12] Πρωτεΐνες που δεσμεύουν ρετινοειδή Υπάρχουν αρκετές πρωτεΐνες στον ορό του αίματος αλλά και εντός των κυττάρων που δεσμεύουν τα ρετινοειδή. Κατά αυτό τον τρόπο γίνεται η μεταφορά και η αποθήκευση τους καθώς και η έναρξη των σηματοδοτικών μονοπατιών τους. Αυτές οι πρωτεΐνες πιθανότατα να αποτελούν σημεία ελέγχου των επιπέδων και των δράσεων των ρετινοειδών. Στον ορό του αίματος υπάρχει η πρωτεΐνη RBP (Retinol Binding Protein) που δεσμεύει και μεταφέρει τη ρετινόλη. Ενδοκυττάρια είναι οι CRBP (Cellular Retinoid Binding Protein) και οι CRABP Ι & ΙΙ (Cellular Retinoic Acid Binding Protein) που αποθηκεύουν αλλά και μεταφέρουν τα ρετινοειδή στο κυτταρόπλασμα. Η έκφραση αυ- 14

15 τών των πρωτεϊνών είναι χωρικά (σε διαφορετικούς ιστούς) και χρονικά (σε διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια) διαφοροποιημένη. [2], [12] Η εξειδίκευση στην έκφραση των υποδοχέων ιστοειδικά, χρονικά και σε επίπεδο υποτύπων αφ ενός, αφ ετέρου το πλήθος των συνδυασμών των διμερισμένων υποδοχέων θα μπορούσε να εξηγήσει την πλειοτροπική δράση των ρετινοειδών. Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι η επίδραση του all-trans ρετινοϊκού οξέος στην παραγωγή του ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα αγγειογένεσης (VEGF) σε τρεις διαφορετικές σειρές κυττάρων. Συγκεκριμένα αυξάνεται η έκφραση του VEGF στα στρωματικά κύτταρα του ενδομητρίου υπό την επίδραση του ρετινοϊκού οξέος, ενώ ελαττώνεται στα κερατινοκύττα- [2] [13] ρα και στα κύτταρα HL-60. All-trans ρετινοϊκό οξύ (ATRA) Το ATRA ή τρετινοϊνη είναι φυσικό ρετινοειδές της πρώτης γενιάς. Προέρχεται από την οξείδωση της ρετινόλης ή της ρετινάλης που καταλύεται από διάφορα ένζυμα όπως τις δεϋδρογονάσες της ρετιναλδεΰδης (Raldh 1, 2 &3). Η χρήση της στη θεραπευτική αφορά δερματικές παθήσεις όπως ακμή και κεράτωση, καθώς και νεοπλασίες όπως στην οξεία προμυελοκυτταρική λευχαιμία (APL). [14] Θεωρείται ως η δραστική μορφή της βιταμίνης Α και αυτό εξάγεται από την παρατήρηση ότι η τοπική εφαρμογή της δεν συνοδεύεται από αύξηση των επιπέδων της στο δέρμα, ενώ αντίθετα αυξάνονται τα επίπεδα του ρετινοϊκού οξέος. [13] Εικόνα 3. Ο χημικός τύπος της τρετινοΐνης ή ATRA. Σύμφωνα με τον ΕΟΦ οι παρενέργειες είναι πολλές και σημαντικές όπως: έντονος τοπικός ερεθισμός, ερυθρότητα, απολέπιση, ραγάδες, αλλαγή μελαγχρώματος, υποκειμενική δυσφορία, φωτοευαισθησία, ξηρότητα δέρματος και βλεννογόνων, κνησμός, αλωπεκία, εφίδρωση, χειλίτιδα. Κεφαλαλγία, καλοήθης ενδοκρανιακή υπέρταση ιδιαίτερα σε παιδιά, σύγχυση, κατάθλιψη, παραισθησία, αϋπνία, ρίγος, οπτικές και ακουστικές διαταραχές. Ναυτία, έμετοι, διάρροια ή δυσκοιλιότητα, ανορεξία, παγκρεατίτιδα. Αρρυθμίες, οίδημα. Σύνδρομο του ρετινοϊκού οξέος 15

16 (πυρετός, δύσπνοια, πνευμονικά διηθήματα, πλευριτικό εξίδρωμα, λευκοκυττάρωση, οίδημα, υπόταση, αύξηση σωματικού βάρους, ηπατική, νεφρική ανεπάρκεια καθώς και άλλων οργάνων). Τέλος, υπάρχει κίνδυνος θρόμβωσης τον 1ο μήνα της θεραπείας. [14] Ιδιαίτερα σημαντική είναι η τερατογόνος δράση της. Για αυτό το λόγο συστήνεται να μη λαμβάνεται από γυναίκες σε κύηση και επιβάλλεται να ληφθούν αυξημένα μέτρα αντισύλληψης (καθώς εξασθενούν τη δράση των αντισυλληπτικών) για εύλογο χρονικό διάστημα κατά την αγωγή με ρετινοϊκό οξύ. Ασιτρετίνη (Acitretin) Η ασιτρετίνη είναι αρωματικό, συνθετικό ρετινοειδές δεύτερης γενεάς, μεταβολίτης της ετρετινάτης (etretinate). Ο χρόνος ημιζωής της είναι δύο μέρες. Εντός του οργανισμού η ασιτρετίνη μετατρέπεται σε μικρό ποσοστό σε ετρετινάτη που έχει χαμηλό θεραπευτικό δείκτη, αυξημένη τερατογόνο δράση και μεγάλο χρόνο ημιζωής (περίπου 120 μέρες). Συνεπώς, η δράση του επεκτείνεται χρονικά, σημαντικά περισσότερο σε σύγκριση με το ρετινοϊκό οξύ. Πρακτικά αυτό σημαίνει ότι δε μπορεί να χορηγηθεί σε νεαρούς ασθενείς και γυναίκες που θέλουν να τεκνοποιήσουν καθώς συστήνεται ο τριετής αποκλεισμός κύησης μετά το πέρας της αγωγής. Εικόνα 4. Ο συντακτικός τύπος της ασιτρετίνης Οι ενδείξεις που χορηγείται είναι η βαριά και εκτεταμένης μορφής ψωρίαση, διαταραχές της κερατινοποίησης όπως νόσος Darier (θυλακική υπερκεράτωση), ι- χθύαση, ομαλός λειχήνας και κερατοδερμίες παλαμών-πελμάτων. Οι παρενέργειες είναι παραπλήσιες με αυτές που αναφέρθηκαν για το ρετινοϊκό οξύ που συνοψίζονται ως εκδηλώσεις υπερβιταμίνωσης Α. [14] Σηματοδοτικά μονοπάτια Μέχρι σήμερα δεν είναι προσδιορισμένος σε όλη την έκταση ο μηχανισμός δράσης των ρετινοειδών. Τα σηματοδοτικά μονοπάτια που ενεργοποιούνται για την τέλεση αυτής της βιολογικής δράσης δεν είναι πλήρως χαρακτηρισμένα. Ως εξήγηση 16

17 θα μπορούσε να δοθεί ότι οι υποδοχείς των ρετινοειδών αλληλεπιδρούν με πολλούς και ποικίλους υποδοχείς και μόρια που αυξάνει την πιθανότητα να υπάρχουν πολλοί διαφορετικοί μηχανισμοί δράσης. Η κατάσταση περιπλέκεται περισσότερο αν ληφθεί υπόψη ότι υπάρχει χωρική και χρονική διαφοροποίηση της έκφρασης των υποδοχέων των ρετινοειδών. Εντούτοις έχουν περιγραφεί κάποια γενικά σηματοδοτικά μονοπάτια τα οποία θα παρουσιαστούν εν συντομία στις επόμενες γραμμές. Δράση ρετινοειδών Στην Εικόνα 5 παρουσιάζεται η πορεία της βιταμίνης Α μέχρι να τελέσει τη βιολογική δράση της. Πιο αναλυτικά, η ρετινόλη με την κυκλοφορία του αίματος φθάνει στους ιστούς. Στη διάρκεια της μεταφοράς της μεταβολίζεται (ουσιαστικά οξειδώνεται με κύρια θέση το ήπαρ). Περνάει στους ιστούς με διάχυση, φθάνοντας στο κυτταρόπλασμα όπου το all-trans ρετινοϊκό οξύ μπορεί να ισομεριωθεί στο 9-cis ρετινοϊκό οξύ. Αυτά τα ρετινοειδή (all-trans & 9-cis) μπορεί να δεσμευτούν στις κυτταρικές πρωτεΐνες δέσμευσης του ρετινοϊκού οξέος, CRAB, είτε να προσδεθούν στους υποδοχείς τους. Το τελικό αποτέλεσμα και στις δύο περιπτώσεις είναι ότι τα ρετινοειδή εντοπίζονται πλέον στον πυρήνα του κυττάρου. Στους υποδοχείς με το πρόσδεμα στρατολογούνται πλήθος άλλων παραγόντων που λειτουργούν ως συνεργοποιητές όπως είναι οι πρωτεΐνες της οικογένειας p160 που αλληλεπιδρούν με τις περιοχές AF-1&2 των υποδοχέων. Εν συνεχεία στρατολογούνται άλλες συνεργοποιητικές πρωτεΐνες όπως οι AD 1&2. Το σύμπλοκο που έχει σχηματισθεί προσδένεται σε συγκεκριμένες περιοχές στο DNA (στις αλληλουχίες RARE και RXRE) και συμβάλλει στην αναδόμηση της χρωματίνης επιτρέποντας κατά αυτό τον τρόπο την μεταγραφή. Γονίδια που φέρουν αυτά τα στοιχεία ελέγχου εμπλέκονται σε διαδικασίες κυτταρικής διαφοροποίησης, ανάπτυξης, επιβίωσης και αύξησης. 17

18 Εικόνα 5. Επισκόπηση βασικών σημείων της σηματοδότησης των ρετινοειδών που οδηγεί στην έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων με τρόπο εξαρτώμενο από την παρουσία των ρετινοειδών. Λεπτομέρειες υπάρχουν στο κείμενο που προηγείται. Σημείο κλειδί είναι η φωσφορυλίωση μορίων όπως της πρωτεΐνης που δεσμεύεται στο στοιχείο ελέγχου camp (CREB), της πρωτεΐνης CBP που δεσμεύει την CREB κ.α. Επομένως, η σηματοδότηση των αυξητικών παραγόντων που οδηγεί στην ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης Α (PKA) συνδέεται με τη δράση των ρετινοϊκών οξέων. Επιπλέον, ενεργοποιούνται ακετυλάσες ΗΑΤ καθώς και η ενδογενής δράση ακετυλάσης της CBP που οδηγεί σε χρωματίνη πιο χαλαρής δομής, που επιτρέπει τη μεταγραφή. Αντίθετη δράση έχει η ενεργοποίηση μορίων όπως η CARM1 που μεθυλιώνει πρωτεΐνες όπως τις CBP, p300 με αποτέλεσμα να μη μπορούν να ενεργοποιηθούν τα μόρια που αναφέρθηκαν παραπάνω. Το σύμπλοκο των υποδοχέων με το πρόσδεμα και τους συνεργοποιητές αλληλεπιδρά με το βασικό μεταγραφικό σύμπλοκο που περιλαμβάνει την RNA πολυμεράση II και διάφορους μεταγραφικούς παράγοντες (TFs) με αποτέλεσμα να μεταγράφονται συγκεκριμένα γονίδια με τρόπο εξαρτώμενο από τα ρετινοειδή. [15] 18

19 Απόπτωση διαμεσολαβούμενη από το ATRA Στην εικόνα που ακολουθεί, παρουσιάζονται τα βασικά σημεία της σηματοδότησης του ρετινοϊκού οξέος στην απόπτωση του κυττάρου. Βασικό ρόλο φαίνεται ότι παίζει η δυσλειτουργία των μιτοχονδρίων και η απόπτωση που επάγεται από τα TRAIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand) και από τους υποδοχείς τους, TRAILR. Το ATRA ενεργοποιεί ιντερφερόνες (IFN) που από κοινού ενεργοποιούν τους υποδοχείς TRAILR και την κασπάση 8. Αποτέλεσμα είναι η πρόκληση μιτοχονδριακής βλάβης και την απελευθέρωση κυτοχρώματος C. Όταν ο υποδοχέας TRAILR που έχει το πρόσδεμα του, ενεργοποιηθεί επιπλέον από το ATRA, στρατολογεί μια G- πρωτεΐνη την DAP 3 και διαμέσου αυτής τον FADD ως ρυθμιστή απόπτωσης. Η τελευταία πρωτεΐνη στρατολογεί την κασπάση 8 η οποία «κόβει» την πρωτεΐνη BID το υπόλειμμα της οποίας tbid μετατοπίζεται στα μιτοχόνδρια και προκαλεί την απελευθέρωση του κυτοχρώματος C το οποίο αλληλεπιδρά με μια πρωτεΐνη την APAF 1 με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της κασπάσης 9 και ακολούθως της κασπάσης 3. Αυτές οι κασπάσες πρωτεολύουν κρίσιμα μόρια για τη βιωσιμότητα του κυττάρου όπως είναι η πολυμεράση PARP, οδηγώντας το κύτταρο σε θάνατο. [15] Εικόνα 6. Επισκόπηση βασικών σημείων στην απόπτωση του κυττάρου που επάγεται από τη δράση του ρετινοϊκού οξέος σε συνδυασμό με τη παρουσία TRAILs τα οποία εμφανίζονται μετά από κυτταρική βλάβη. Περισσότερες πληροφορίες στο κείμενο που προηγείται. 19

20 Η σηματοδότηση του ρετινοϊκού οξέος στα κύτταρα του εγκεφάλου Λίγα είναι γνωστά για το πλήρη μηχανισμό δράσης του ρετινοϊκού οξέος στην διαφοροποίηση και στην αύξηση των νευρικών κυττάρων, παρόλα αυτά κάποια βασικά σημεία παρατίθενται στις επόμενες γραμμές. Το ρετινοϊκό οξύ επιδρά στο μονοπάτι των φωσφολιπασών 2 (spla2, cpla2, ipla2, PlsEtn-PLA2). Με τη συνδρομή των κυτταροκινών αφενός, αφετέρου της αύξησης των ενδοκυττάριων επιπέδων του ασβεστίου, τα ένζυμα αυτά ενεργοποιούνται με αποτέλεσμα να αυξάνεται η παραγωγή και απελευθέρωση του αραχιδονικού οξέος. Με τη δράση των ενζύμων: κυκλοοξυγενάσης 2 (COX2), συνθάσης της προσταγλαδίνης Ε (PTGES), συνθάσης των λευκοτριενίων C-4 (LTC4S) και λιποξυγενάσης 5 (5-LO), το αραχιδονικό οξύ μετατρέπεται σε προσταγλαδίνες, λευκοτριένια και θρομβοξάνες (εικοσανοειδή), που παίζουν ρόλο στην κυτταρική διαφοροποίηση και στην καταστολή της κυτταρικής αύξησης. Τα μόρια αυτά εκφράζονται με διαφορετικό πρότυπο στις κατηγορίες των νευρικών κυττάρων και σε συγκεκριμένες χρονικές στιγμές. Εικόνα 7. Παρουσίαση βασικών σημείων της σηματοδότησης των ρετινοειδών σε κύτταρα του εγκεφάλου. Μεταγράφονται ένζυμα που συμμετέχουν στο μεταβολισμό του αραχιδονικού οξέος. Τα προϊόντα που παράγονται δρουν επί των νευρικών κυττάρων. Περισσότερες λεπτομέρειες στο κείμενο που προηγείται. 20

21 Η ψωρίαση Η ψωρίαση είναι μια χρόνια, φλεγμονώδης, πολυπαραγοντική νόσος του δέρματος με αδιευκρίνιστη μοριακή βάση. [16], [17], [18] Ανάλογα με τη μορφή των ψωριασικών βλαβών του δέρματος, η ψωρίαση διακρίνεται στις εξής μορφές: κατά πλάκας (ή vulgaris-κοινή), σταγονοειδής (guttata), φλυκταινώδη, ερυθροδερμική, ανάστροφη. Ως προς την κλινική εικόνα μπορεί να έχουν ήπια εκδήλωση, μέτρια ή ακόμα και σοβαρή. Συχνά επακόλουθο της ψωρίασης κατά την πάροδο των ετών είναι η ανάπτυξη αρθρίτιδας (ψωριασικής αρθρίτιδας). [19] Η ψωρίαση κατά πλάκας είναι η συχνότερη μορφή ψωρίασης με συχνότερη εντόπιση στους αγκώνες, τα γόνατα, το τριχωτό της κεφαλής και στο κατώτερο τμήμα της ράχης. Η σταγονοειδής ψωρίαση εμφανίζεται σε νεαρούς ασθενείς, συχνά μετά από λοίμωξη με στρεπτόκοκκο. Εμφανίζεται κυρίως στον κορμό και στα άκρα με τη μορφή κόκκινων στιγμάτων δίκην σταγόνας. Σπανιότερες μορφές είναι η ανάστροφη ψωρίαση που εντοπίζεται στις φυσιολογικές πτυχές παχύσαρκων ατόμων, η επίπονη ερυθροδερμική ψωρίαση στην οποία πάσχει ολόκληρο το δέρμα και το ο- ποίο είναι χαρακτηριστικά κόκκινο και τέλος η φλυκταινώδης ψωρίαση. Στην τελευταία περίπτωση παρατηρούνται φλύκταινες περιβάλλουσες από ψωριασικές βλάβες οι οποίες εντοπίζονται κυρίως σε παλάμες και πέλματα. Όταν η ψωρίαση εντοπίζεται στους όνυχες, εμφανίζονται βοθρία, πάχυνση των ονύχων και απόκτηση κιτρινωπής χροιάς. [19] Η ψωριασική αρθρίτιδα εμφανίζεται σε ποσοστό % επί των ασθενών που ήδη πάσχουν από ψωρίαση. Προσβάλει δε, τις αρθρώσεις των φαλάγγων των άκρων με συνεπακόλουθη καταστροφή του συνδετικού ιστού και επώδυνα χαρακτηριστικά. Εικόνα 8. (στην σελίδα που ακολουθεί) Α. Ασθενής με ψωρίαση κατά πλάκας, τη συνηθέστερη μορφή ψωρίασης. Β. Χαρακτηριστική εικόνα ασθενούς με ψωρίαση σταγονοειδούς τύπου. Γ. Περίπτωση ασθενούς με ερυθροδερμική ψωρίαση. Πρόκειται για κατάσταση γενικευμένων βλαβών ψωρίασης σε όλο το δέρμα. Δ. Προσβεβλημένοι όνυχες από ψωρίαση. Ε. Φλυκταινώδης ψωρίαση. Διακρίνονται καθαρά οι φλύκταινες που περιέχουν υγρό σε έδαφος ψωριασικών βλαβών. Ζ. Ανάστροφη ψωρίαση (εμφανίζεται στις πτυχές του δέρματος). Η. Χαρακτηριστική εμφάνιση δακτύλων προσβεβλημένων από ψωριασική αρθρίτιδα. Η καταστροφή των χόνδρων των αρθρώσεων συνοδεύεται από μειωμένη ικανότητα σε χειρισμούς και αυξημένο πόνο. 21

22 Α. Β. Γ. Δ. Ε. Ζ. Η. 22

23 Η εμφάνιση της ψωρίασης συνδέεται με το γενετικό υπόβαθρο, με λοιμώξεις, με υποκαλιαιμία, ψυχογενές άγχος, λήψη φαρμάκων όπως λίθιο, β- αδρενεργικοί αναστολείς, ιντερφερόνη, μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη, υψηλές δόσεις κορτικοστερόνης. Το φαινόμενο Koebner εμφανίζεται στο 1/3 των ασθενών με ψωρίαση και συμβαίνει όταν σε σημεία του σώματος που τραυματίζονται ακολου- [20] [21] θεί ανάπτυξη ψωριασικής βλάβης. Ιστολογικά χαρακτηριστικά Η δομή της επιδερμίδας φυσιολογικού δέρματος που διακρίνεται σε παχύ και λεπτό έχει εν συντομία ως εξής: Το παχύ δέρμα περιέχει πέντε στοιβάδες, ενώ το λεπτό τρεις με τέσσερις με κύριο τύπο κυττάρων τα κερατινοκύτταρα. Εν τω βάθει, βρίσκεται η βασική ή βλαστική στοιβάδα που αποτελείται από ένα στρώμα κυβικών ή κυλινδρικών κυττάρων τα οποία εμφανίζουν μιτωτική δραστηριότητα και τροφοδοτούν τις υπερκείμενες στοιβάδες. Η βασική μεμβράνη χωρίζει αλλά και συνδέει την επιδερμίδα με τον υποκείμενο ιστό -το χόριο- με σχηματισμό ακρολοφιών και καταδύσεων της μίας εντός της άλλης. Επόμενη στοιβάδα είναι η ακανθωτή που αποτελείται από πολυεδρικά κύτταρα με πολλές προεκβολές (μεσοκυττάριες γέφυρες που σχηματίζουν δεσμοσώματα με τα γειτονικά κύτταρα) που ονομάζονται ακανθοκύτταρα. Διατάσσονται σε πολλαπλά στρώματα και εμφανίζουν μιτωτική δραστηριότητα. Η επόμενη στοιβάδα είναι η κοκκώδης. Τροφοδοτείται σε κύτταρα από τις προαναφερθείσες στοιβάδες. Τα κοκκώδη κύτταρα αποθηκεύουν κοκκία κερατοϋαλίνης σε τέτοιο βαθμό που τελικά καταστρέφονται τα οργανίδια και ο πυρήνας τους. Η διαυγής στοιβάδα που είναι η τέταρτη στοιβάδα, είναι λεπτή και παρούσα μόνο σε παλάμες και πέλματα. Τα κύτταρά της δεν έχουν οργανίδια, είναι όμως πληρωμένα από ελαιοειδίνη (το προϊόν μετατροπής της κερατοϋαλίνης) και πυκνά διατεταγμένα νημάτια κερατίνης. Τέλος, επιπολής βρίσκεται η κεράτινη στοιβάδα. Αποτελείται από νεκρά κύτταρα, τις φολίδες που αποφολιδώνονται. [22] Εκτός από τα κερατινοκύτταρα, άλλοι τύποι κυττάρων που υπάρχουν στην επιδερμίδα είναι τα μελανινοκύτταρα, τα κύτταρα του Langerhans και τα κύτταρα του Merkel. Στο λεπτό δέρμα απουσιάζουν η κοκκώδης και η διαυγής στοιβάδα. [22] 23

24 Στις ψωριασικές βλάβες παρατηρείται αύξηση του αριθμού των κερατινοκυττάρων εξαιτίας υπέρμετρου πολλαπλασιασμού (φαινόμενο που λέγεται υπερκεράτωση) η οποία συνοδεύεται από ατελή ωρίμανση και ατελή κερατινοποίηση (παρακεράτωση). Αποτέλεσμα είναι να βρίσκονται κερατινοκύτταρα που διατηρούν τον πυρήνα τους στις ανώτερες στοιβάδες. Η πάχυνση της επιδερμίδας (ακάνθωση), συνοδεύεται με βαθύτερες καταδύσεις και ακρολοφίες επί του χορίου. Σημαντικό στοιχείο είναι η διήθηση της επιδερμίδας με κύτταρα που προάγουν τη φλεγμονή, όπως είναι τα δενδριτικά κύτταρα, Τ-λεμφοκύτταρα και ουδετερόφιλα. Τέλος παρατηρείται αυξημένο πλήθος τριχοειδών που φθάνουν μέχρι την επιφάνεια. [18] Στοιβάδες Κεράτινη Διαυγής Κοκκώδης Ακανθωτή Βασική Εικόνα 9. Αριστερά: Παρουσιάζεται συνοπτικά η δομή του δέρματος μετά των εξαρτημάτων του. Δεξιά: Η εικόνα εστιάζει στις στοιβάδες της επιδερμίδας οι οποίες συνοπτικά είναι: η επιπολής κεράτινη που αποτελείται από νεκρά κύτταρα που αποπίπτουν, η διαυγής και η κοκκώδης που βρίσκονται μόνο στο παχύ δέρμα, η ακανθωτή που αποτελείται από πολυεδρικά κύτταρα με μιτωτική δραστηριότητα και εν τω βάθει η βασική στοιβάδα με έντονη μιτωτική δραστηριότητα από την οποία προέρχονται τα κύτταρα των υπερκείμενων στοιβάδων. Επιδημιολογικά χαρακτηριστικά Επιδημιολογικές μελέτες της ψωρίασης σε παγκόσμιο επίπεδο φανερώνουν διαφορές στη συχνότητα εμφάνισής της. Τα ποσοστά αυτά κυμαίνονται από 0% έως 11,8%. Στην Ευρώπη και την Βόρεια Αμερική το ποσοστό ανέρχεται σε 1 έως 3%, λιγότερο συχνή είναι στην Δυτική Αφρική και στην Ιαπωνία ενώ στους Ιθαγενείς της Νότιας Αμερικής και της Αυστραλίας δεν εμφανίζεται ψωρίαση. Προσβάλλει εξίσου 24

25 τα δύο φύλα. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν πιθανή συμμετοχή περιβαλλο- [23] [24] ντικών και γενετικών παραγόντων στην παθογένεση της νόσου. Στην Ελλάδα συγκεκριμένα, το 2009 δημοσιεύτηκε μια επιδημιολογική μελέτη που διεξήχθη από το Μάιο του 2005 έως και το Μάριο του 2007 σε έξι κέντρα σε Αθήνα και Θεσσαλονίκη, στην οποία συμμετείχαν επτακόσοι ογδόντα τέσσερις (784) ασθενείς. Ο μέσος όρος ηλικίας των ασθενών ήταν 43,2 έτη. Ο μικρότερος α- σθενής ήταν πέντε (5) ετών ενώ ο γηραιότερος ογδόντα πέντε (85). Η μέση ηλικία στην οποία εμφανίστηκε η ψωρίαση ήταν 31,3 έτη (SD 16,39 έτη) με 2,6 εξάρσεις της νόσου κατ έτος που οι ασθενείς τις απέδιδαν σε αυξημένο στρες. Α. Β. Διάγραμμα 1 Α. Κατανομή των ασθενών που συμπεριλήφθησαν στη μελέτη βάσει της ηλικία τους. Β. Κατανομή των ασθενών με βάση την ηλικία εμφάνισης ψωρίασης. Η πλειονότητα των ασθενών είχε τουλάχιστον απολυτήριο λυκείου (27%) και ήταν ανώτερης (24%) ή ανώτατης (15%) μορφολογικής εκπαίδευσης. Μέσης εκπαίδευσης ήταν το 29 % και χωρίς εκπαίδευση ήταν το 5%. Η αναλογία ανδρών προς γυναίκες ήταν 1,8:1 που οφείλεται (ενώ η συνήθης αναλογία εμφάνισης είναι 1:1) στην εμφάνιση σοβαρότερων βλαβών στους άρρενες που τους οδήγησε σε μεγαλύτερο ποσοστό στα κέντρα των νοσοκομείων της μελέτης. 25

26 Διάγραμμα 2 Σε αυτό το διάγραμμα παρουσιάζεται η κατανομή των ασθενών κατά ηλικιακή ομάδα και κατά μορφωτικό επίπεδο. Το 35% των ασθενών ανέφερε οικογενειακό ιστορικό ψωρίασης με την αναλογία στα φύλα να είναι άνδρες προς γυναίκες 2:1. Σε διεθνείς μελέτες, η εμφάνιση ψωρίασης σε πρώτου βαθμού απογόνους ατόμων με ψωρίαση είναι 19 φορές συχνότερη από ότι στο γενικό πληθυσμό. Σε μελέτες με δίδυμα αδέλφια διαπιστώθηκε ότι τα περιστατικά εμφάνισης ψωρίασης και στα δύο αδέλφια ήταν 3 φορές συχνότερα στα μονοζυγωτικά δίδυμα. [25] Επίσης στην περίπτωση οικογενειακού ιστορικού, η ψωρίαση εμφανίζεται νωρίτερα (ιδιαίτερα σε ηλικίες κάτω των 19 ετών) με μέσο όρο εμφάνισης τα 27,9 έτη σε ασθενείς με οικογενειακό ιστορικό έναντι των 33,3% ετών όταν δεν υπάρχει ιστορικό. Ενδιαφέρον στοιχείο είναι ότι από το σύνολο των ασθενών, το 16% πρωτοπαρουσίασαν ψωρίαση κατά τη διάρκεια της μελέτης. [23] Σε άλλες αναφορές η ψωρίαση διακρίνεται σε ανάλογα με το χρόνο εμφάνισης. Όταν εμφανίζεται πριν τα 40 έτη χαρακτηρίζεται τύπου 1 σε αντιδιαστολή με του τύπου 2 που η εμφάνιση της είναι μετά τα 40 έτη. Βάσει αυτής της διάκρισης βρέθηκε ότι η πιθανότητα εμφάνισης της νόσου σε συγγενείς πρώτου βαθμού είναι πενταπλάσια στον τύπο 1 συγκριτικά με την ψωρίαση τύπου 2. [25] [26] Ενδεικτικό είναι ότι έρευνα σε 3000 οικογένειες έδειξε ότι η πιθανότητα εμφάνισης ψωρίασης σε τέκνο που οι γονείς δεν είχαν ψωρίαση ήταν 4%. Όταν ένας γονέας είχε ψωρίαση η πιθανότητα ανέρχεται στο 28%, ενώ όταν και οι δύο γονείς είχαν βλάβες, πιθανό- [25] [27] τητα το 65% των τέκνων να εμφάνιζε ψωρίαση. 26

27 Πίνακας 1 Εμφανίζονται τα ποσοστά της ύπαρξης οικογενειακού ιστορικού εμφάνισης ψωρίασης (στήλη Yes) στις διάφορες ηλικιακές ομάδες ασθενών που έχουν σχηματισθεί με βάση την ηλικία πρωτοεμφάνισης ψωριασικών βλαβών. Όσον αφορά την έκταση των ψωριασικών βλαβών, στο 27% των ασθενών η βλάβη εκτείνεται μέχρι 5% της συνολικής επιφάνειας του σώματος, το 23 % σε εμβαδό 5-10% της επιφανείας του σώματος, ενώ 31% των ασθενών υπερβαίνει το 20% της συνολικής επιφανείας. Ανάλογα με το φύλο φαίνεται ότι υπερτερούν συγκεκριμένοι τύποι ψωρίασης. Συγκεκριμένα στις γυναίκες υπερτερεί η σταγονοειδής ψωρίαση και η ψωρίαση σε παλάμες και πατούσες. Αντίθετα στους άνδρες υπερτερεί η ψωρίαση κατά πλάκας. Στα διαγράμματα που ακολουθούν συνοψίζονται τα ευρήματα της μελέτης αυτής. [23] Α. Β. Διάγραμμα 3 Α. Παρουσιάζεται το % ποσοστό ψωριασικών βλαβών στην επιφάνεια του σώματος ανάλογα με τις ηλικιακές ομάδες των ασθενών Β. Σε αυτό διάγραμμα παρουσιάζονται τα ποσοστά εμφάνισης των διάφορων τύπων ψωρίασης στους ασθενείς της μελέτης. Επιπλέον εμφανίζονται τα επιμέρους ποσοστά εμφάνισης βάσει του φύλου 27

28 Γενετικοί παράγοντες που σχετίζονται με εμφάνιση ψωρίασης Η ψωρίαση είναι πολυπαραγοντικής αιτιολογίας, με γενετικό υπόβαθρο καθώς εκδηλώνεται συχνότερα σε συγγενείς. Με την εμφάνιση της ψωρίασης έχουν συσχετισθεί συγκεκριμένοι γενετικοί τόποι που κωδικοποιούν μόρια του HLA τάξης Ι όπως είναι τα HLA-B13, HLA-B17, HLA-Bw57, HLA-Cw6, HLA-DR7. [16] [24] [25] [28] Μελέτες σύνδεσης που πραγματοποιήθηκαν στα τέλη του 90 και αρχές του 2000 έφεραν στο προσκήνιο αρκετούς γενετικού τόπους που σχετίζονται με την εμφάνιση της νόσου. Αυτοί οι τόποι ονομάστηκαν Psoriasis Susceptibility (PSORS) και βρίσκονται σε αρκετά χρωμοσώματα, παράδειγμα: PSORS1 στο 6q21.3, PSORS2 στο 17q, PSORS3 στο 4q, PSORS4 στο 1cen-q21, PSORS5 στο 3q21, PSORS6 στο 19p, PSORS7 στο 1p και PSORS9 στο 4q31. Με ανάλυση μικροδορυφόρων, προτάθηκε ότι γονίδιο ή γονίδια που εμπλέκονται στην ψωρίαση βρίσκονται στο χρωμόσωμα 16 στο μακρύ βραχίονα (16q). Επίσης συσχέτιση γίνεται και με την περιοχή του HLA. [25] Ο γενετικός τόπος PSORS1 βρίσκεται εντός του μείζονος συστήματος ιστοσυμβατότητας (MHC) και πιο συγκεκριμένα στα τελομερή της τάξης Ι του HLA-B. Στην ίδια περιοχή τρία επιπλέον γονίδια έχουν διερευνηθεί για το ρόλο τους στη νόσο. Αυτά τα γονίδια είναι τα: HLA-C (αλλήλιο HLA-Cw6), CCHCR1 (αλλήλιο WWCC), CDSN (αλλήλιο 5). Όπως γίνεται αντιληπτό, ορισμένα αλλήλια σχετίζονται με την εμφάνιση της ψωρίασης. Αυτό που δεν είναι γνωστό μέχρι σήμερα είναι αν αποτελούν το αίτιο της νόσου ή απλά αν συμβάλλουν σε κάποιο βαθμό στην ανάπτυξή της. Στο ίδιο μοτίβο, έχει διερευνηθεί ένας αριθμός από γονίδια όπως ο υποδοχέας για την ιντερλευκίνη- 23 (IL-23R), η μη μεταφραζόμενη περιοχή της ιντερλευκίνης-12β (UTR της IL-12B), CDKAL1 που συσχετίζεται με τη εμφάνιση επιπλέον του σακχαρώδους διαβήτη 2 και της νόσου του Crohn, ZNF313 (ή RNF114) που είναι μια πρωτεΐνη με δάκτυλο ψευδαργύρου, TNFAIP3 η πρωτεΐνη που επάγεται από τον TNF-α, η πρωτεΐνη TNIP1 που [18] [20] αλληλεπιδρά με την TNFAIP3 στο μονοπάτι του NF-κB. Ανοσολογικοί παράγοντες που σχετίζονται με εμφάνιση ψωρίασης Η συμμετοχή του ανοσοποιητικού συστήματος στην παθογένεση της ψωρίασης είναι θεμελιώδης. Όπως αναφέρθηκε ήδη, η ιστολογική εικόνα από ψωριασικές βλάβες βρίθει από κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, κυρίως δενδρι- 28

29 τικά και Τ λεμφοκύτταρα. Επίσης έχουν εντοπιστεί κλωνικές σειρές Τ λεμφοκυττάρων και συγκεκριμένο ρεπερτόριο κυτοκινών που εκφράζεται στις βλάβες. Ενδιαφέρον σημείο που καταδεικνύει την άμεση εμπλοκή του ανοσοποιητικού συστήματος είναι ότι η νόσος μπορεί να εμφανιστεί μετά από μεταμόσχευση μυελού των οστών ή αντίθετα να ιαθεί εάν προϋπάρχει στο λήπτη. Επιπλέον δεν πρέπει να αγνοηθεί ότι η ψωρίαση αντιμετωπίζεται σε σημαντικό βαθμό με φάρμακα που στοχεύουν στο ανοσοποιητικό σύστημα. [18] Σε κάποιες περιπτώσεις η εμφάνιση ψωρίασης συνδέεται με προηγηθείσες λοιμώξεις από στρεπτόκοκκο (αμυγδαλίτιδα, φαρυγγίτιδα), λοιμώξεις από ιούς ακόμα και από τον HIV. [20] Στις ψωριασικές βλάβες αν και υπάρχει ρήξη της συνέχειας της επιδερμίδας που θα καθιστούσε τις βλάβες εν δυνάμει πύλες εισόδου μικροοργανισμών στο σώμα των ασθενών, εντούτοις δεν παρατηρούνται λοιμώξεις. Ο βασικότερος λόγος είναι ότι τα κερατινοκύτταρα παράγουν αρκετά πεπτίδια με αντιμικροβιακή δράση. Ενδεικτικά αναφέρονται τα LL-37, β-defensins, S100A7 (psoriasin). Τα πεπτίδια αυτά επιπλέον ασκούν χημειοτακτική δράση με αποτέλεσμα να αυξάνεται η συσσώρευση κυττάρων του ανοσοποιητικού στις βλάβες. Επίσης επιδρούν έμμεσα στην παραγωγή μιας σειράς κυτταροκινών (IFN, TNF, IL-17, IL-20, IL-1, IL-6) και άλλων χημοκινών (IL-8, CXCL10, CXCL20) που προάγουν τις διεργασίες φλεγμονής. [18] Ο προσδιορισμός των κυτταροκινών στις ψωριασικές βλάβες έδειξε αυξημένα επίπεδα των IFN-γ, TNF-α, IL-12 που είναι χαρακτηριστικές των Τ βοηθητικών λεμφοκυττάρων τύπου 1 (Th1) ενώ οι IL-4, IL-5 και IL-10 που είναι χαρακτηριστικές των Τ βοηθητικών λεμφοκυττάρων τύπου 2 (Th2) δεν φάνηκαν επηρεασμένες. Επιπρόσθετα όταν οι τελευταίες χορηγήθηκαν σε βλάβες, φάνηκαν να ελαττώνουν τη ψωριασική φλεγμονή. Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν μια ανισορροπία στη σχέση Th1/Th2 με σαφή κλίση προς Th1. [20] Η αποτελεσματική (ως προς την βελτίωση της εικόνας των ψωριασικών βλαβών) χρήση φαρμάκων και βιολογικών παραγόντων που στοχεύουν στη λειτουργία τους ανοσοποιητικού, σε συνδυασμό με τις προηγούμενες αναφορές είχε ως αποτέλεσμα να αλλάξει η θεώρηση της νόσου γύρω στα Γεγονός είναι ότι τα τελευταία 50 χρόνια η θεώρηση για την παθογένεια της ψωρίασης έχει αλλάξει πολλές φορές. [29] Μέχρι το 90, η ψωρίαση εθεωρείτο ως διαταραχή στον πολλαπλασιασμό και στην διαφοροποίηση των κερατινοκυττάρων. Η σύγχρονη άποψη συνοψίζεται στο ότι είναι μια φλεγμονώδης νόσος του δέρμα- 29

30 τος που επάγεται από Τ λεμφοκύτταρα, σε άτομα με γενετική προδιάθεση, με αποτέλεσμα να υπάρχει υπερπλασία της επιδερμίδας. [20] Η αλλαγή στη θεώρηση της παθογένεσης της νόσου είχε ως αποτέλεσμα την μελέτη του ρόλου των διάφορων συστατικών του ανοσοποιητικού όπως των δενδριτικών και των άλλων αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων (συμπεριλαμβανομένης της αντιγονοπαρουσιάσης των κερατινοκυττάρων), των Τ βοηθητικών κυττάρων 17 (Th17) και των Τ ρυθμιστικών κυττάρων (Tregs) που ελέγχουν τη δράση των Τ λεμφοκυττάρων. Οι Sabat & Wolk [28] [29] διετύπωσαν μια θεωρία για την παθογένεση της νόσου. Βασίστηκαν στις παρατηρήσεις ότι θεραπεία που στόχευε στην εξάλειψη των Th1 είχε περιορισμένη επιτυχία, αντιθέτως θεραπείες (etanercept, adalimumab, infliximab) που δεν δρούσαν άμεσα στα Th1 αλλά στο TNF-α ήταν αποτελεσματικές. Έλαβαν υπόψη επίσης, τους διάφορους υποτύπους των Τ βοηθητικών κυττάρων που αναγνωρίστηκαν τα τελευταία έτη (Th22, Th17). Οι ερευνητές θεωρούν ότι η παθογένεση της νόσου γίνεται σε τρία βήματα, σε κάθε ένα από τα οποία εμπλέκονται διαφορετικοί τύποι κυττάρων. Η πρώτη φάση που την ονομάζουν «φάση ευαισθητοποίησης» περιλαμβάνει το αρχικό εκείνο σήμα από αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (δενδριτικά, μακροφάγα, ιστιοκύτταρα και κερατινοκύτταρα) στα δευτερογενή λεμφικά όργανα, τη δημιουργία των δραστικών Τ λεμφοκυττάρων και των λεμφοκυττάρων μνήμης. Τα Τh17, τα Τh22 και Τh1 που παράγονται σε αυτό το στάδιο φαίνεται ότι παίζουν κομβικό ρόλο στην εμφάνιση της νόσου. Η πρώτη φάση δε γίνεται αντιληπτή από τον ασθενή ή/και από τον ιατρό. Το ίδιο συμβαίνει και στη δεύτερη φάση, την «σιωπηρή» που ακολουθεί. Η τρίτη και τελευταία φάση η «δραστική φάση» περιλαμβάνει τη διήθηση του δέρματος από λεμφοκύτταρα, μονοκύτταρα, δενδριτικά, ουδετερόφιλα, τον πολλαπλασιασμό τους και την ενεργοποίησή τους. Πιθανότατα η διήθηση να ξεκινά και να διευκολύνεται από τραυματισμούς ή είσοδο μικροοργανισμών τοπικά. Το μικροπεριβάλλον και το ρεπερτόριο κυτταροκινών που παράγεται από τα κύτταρα που μετανάστευσαν, ενεργοποιούν τα δραστικά κύτταρα. Τα κερατινοκύτταρα σε συνεχή αλληλεπίδραση (μέσω κυτταροκινών και υποδοχέων) με τα κύτταρα του ανοσοποιητικού επάγουν την διήθηση επιπλέον ανοσοκυττάρων, προκαλούν την ενεργοποίησή τους, επάγουν την αγγειογένεση, ενώ αυτο-επάγεται ο πολλαπλασιασμός τους και η ατελής ωρίμανση. [28] [29] Οι Bak & Mikkelsen [30] συμπυκνώνουν τα προηγούμενα στη φράση ότι η ψωρίαση είναι το 30

31 αποτέλεσμα αδιάλειπτης επικοινωνίας των διηθημένων ανοσοκυττάρων με τα κερατινοκύτταρα. Εικόνα 10. Η επίδραση παραγόντων στρες ή μικροοργανισμών ενεργοποιεί τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή και έκκριση ενός ρεπερτορίου κυτταροκινών που δρουν αυτοκρινώς ή παρακρινώς με συνέπεια τον πολλαπλασιασμό και ενεργοποίηση τόσο των ανοσοκυττάρων όσο και των κερατινοκυττάρων. Αυτές οι διεργασίες στην πάροδο του χρόνο οδηγούν στο μετασχηματισμό της φυσιολογικής επιδερμίδας στη χαρακτηριστική παθολογική της ψωριασικής βλάβης. Θεραπευτική αγωγή Η θεραπευτική προσέγγιση για την αντιμετώπιση της ψωρίασης είναι πληθωρική, που οφείλεται στην έλλειψη αποτελεσματικής και εξειδικευμένης θεραπείας ικανής να καλύψει πλήρως τους ασθενείς. Τοπική αγωγή Εφαρμόζονται απευθείας στις ψωριασικές βλάβες. Σε αυτή την κατηγορία περιλαμβάνονται τα κορτικοστεροειδή, τα παράγωγα πίσσας, τα ανάλογα βιταμίνης D, τα ρετινοειδή, η διθρανόλη και τα ανοσοκατασταλτικά. Τα κορτικοστεροειδή έχουν δράση ανάλογη της δραστικότητάς τους. Η υ- δροκορτιζόνη που έχει ασθενέστερη δράση από την προπιονική κλομπεταζόλη χρησιμοποιείται σε ήπιες μορφές ψωρίασης ενώ η δεύτερη σε οξείες μορφές με καλά αποτελέσματα. 31

32 Η πίσσα είναι η παλαιότερη ουσία στη θεραπευτική φαρέτρα, που ακόμα χρησιμοποιείται στην αντιμετώπιση της ψωρίασης αν και λιγότερο συχνά πλέον. Η ακατέργαστη πίσσα έχει περίπου ουσίες οι οποίες τις προσδίδουν ιαματικές ιδιότητες. Η κατεργασμένη πίσσα δεν είναι το ίδιο αποτελεσματική αν και είναι πιο φιλική στη χρήση. Ο μηχανισμός δράσης της δεν είναι εξακριβωμένος. Η διθρανόλη είναι φυσικό προϊόν φυτικής προελεύσεως. Χρησιμοποιείται πάνω από 100 χρόνια στην αντιμετώπιση δερματικών βλαβών (ψωρίασης), δίχως να είναι ακόμα γνωστός ο μηχανισμός δράσης. Θεωρείται το πιο αποτελεσματικό τοπικό αντιψωριασικό φάρμακο. Τα ανάλογα της βιταμίνης D καλσιποτριόλη, καλσιτριόλη και τακαλσιτόλη διατηρούν τις θεραπευτικές ιδιότητες της βιταμίνης D, επιπλέον επιδρούν λιγότερο στο μεταβολισμό του ασβεστίου. Η δράση τους είναι διπλή. Αφενός αυξάνουν τη διαφοροποίηση των κυττάρων, αφετέρου φαίνεται να δρουν ανασταλτικά στα Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα. Στην κατηγορία των τοπικών ρετινοειδών σήμερα χρησιμοποιείται μόνο το ταζαροτέν. Γενικά, τα ρετινοειδή έχουν γνωστή τερατογόνο δράση. Οι τοπικοί αναστολείς της καλσινευρίνης όπως είναι το τακρόλιμους και το πιμεκρόλιμους είναι ανοσοκατασταλτικά που εμποδίζουν την παραγωγή κυτταροκινών από ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα. Δεν είναι ιδιαίτερα δραστικά σε κάποιες μορφές ψωρίασης (πλακώδης). Η υπεριώδης ακτινοβολία χρησιμοποιείται αποκλειστικά μόνη της ή σε συνδυασμό με χημικές ουσίες, τα ψωραλένια. Η χρήση της ξεκινά με την παρατήρηση ότι ο ήλιος δρα θετικά στην νόσο. Η ευεργετικότητα του ήλιου εντοπίστηκε στην υ- περιώδη ακτινοβολία UV. Στην θεραπευτική χρησιμοποιείται UV μήκους κύματος 311nm της ζώνης UVΒ, στο οποίο εντοπίστηκε η μέγιστη αποτελεσματικότητα. Ε- ναλλακτικά χρησιμοποιείται Laser σε μήκος κύματος 308nm το οποίο βρέθηκε να είναι αποτελεσματικό σε επίμονες βλάβες. Η φωτοχημειοθεραπεία στρατολογεί φωτοευαίσθητες χημικές ουσίες, τα ψωραλένια που απορροφούν φως και εν συνεχεία απελευθερώνουν την ενέργεια αυτή εντός του δέρματος. Έχουν την ικανότητα να συνδέονται με το DNA υπό την παρουσία UV που οδηγεί σε αναστολή της μίτωσης και του πολλαπλασιασμού των κερατινοκυττάρων. Επιπλέον εμποδίζουν τη λειτουργία των αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων καθώς και των λεμφοκυττάρων. 32

33 Συνδυάζονται με UVA (PUVA) η οποία είναι λιγότερο βλαπτική για το δέρμα. Η χορήγηση των ψωραλενίων μπορεί να είναι από το στόμα ή με τοπική εφαρμογή. Συστηματική αγωγή Η φαρέτρα της αντιψωριασικής συστηματικής αγωγής περιλαμβάνει φάρμακα που λαμβάνονται από το στόμα όπως είναι η μεθοτρεξάτη, η ασιτρετίνη και η κυκλοσπορίνη, καθώς και παρεντερικά με τους βιολογικούς παράγοντες. Η μεθοτρεξάτη είναι αναστολέας του φυλλικού οξέος, άρα εμποδίζει τη σύνθεση του DNA. Χρησιμοποιείται αρκετές δεκαετίες τώρα με σημαντική αποτελεσματικότητα. Έχει όμως ως σοβαρό μειονέκτημα ηπατοτοξική και μυελοκατασταλτική δράση. Η ασιτρετίνη είναι ρετινοειδές, ανάλογο της βιταμίνης Α. Η στρατολόγηση της ξεκίνησε από την παρατήρηση ότι η ανεπάρκεια βιταμίνης Α σχετίζεται με φολιδωτή υπερκεράτωση και ξηρότητα του δέρματος. Η σοβαρότερη παρενέργεια είναι η τερατογόνος δράση. Η κυκλοσπορίνη χρησιμοποιείται στην αντιμετώπιση της ψωρίασης με σκοπό να εμποδίσει τη δράση των ενεργοποιημένων CD4+ (βοηθητικών) Τ λεμφοκυττάρων. Έχει υψηλή αποτελεσματικότητα στην αντιμετώπιση της ψωρίασης και λιγότερες παρενέργειες έναντι της μεθοτρεξάτης και της ασιτρετίνης. Παρόλα αυτά έχει νεφροτοξική δράση, προκαλεί υπέρταση και εγείρει προβληματισμό για τις λοιμώξεις ή κακοήθειες που θα αναπτυχθούν εξαιτίας της ανοσοκαταστολής. Στο παρελθόν χρησιμοποιήθηκαν η υδροξυουρία και η αζαθειοπρίνη με λιγότερο αποτελεσματική δράση έναντι των φαρμάκων που ήδη έχουν αναφερθεί και με παρενέργεια για την υδροξυουρία την μυελοκαταστολή. Το μυκοφαινολικό μοφετίλ, προφάρμακο του μυκοφαινολικού οξέος, είναι ένα ανοσοκατασταλτικό, αναστολέας της δευδρογονάσης της μονοφωσφορικής ινοσίνης. Είναι λιγότερο δραστικό της κυκλοσπορίνης. Συστηματική χορήγηση στεροειδών είναι σπάνια και γενικώς αποφεύγεται. παλαιότερα χρησιμοποιείτο στην ερυθροδερμική ψωρίαση. Πιο πρόσφατα, ο αναστολέας της καλσινευρίνης, πιμεκρόλιμους, άρχισε να χρησιμοποιείται από το στόμα. Αναστέλλει την παραγωγή κυτταροκινών από τα Τ λεμφοκύτταρα. Πλεονέκτημα έναντι της κυκλοσπορίνης είναι ότι δεν είναι νεφροτοξικό. 33

34 Βιολογικοί παράγοντες Οι βιολογικοί παράγοντες είναι εξειδικευμένα μόρια που δρουν στοχευμένα στις ανοσολογικές διεργασίες. Τέτοια μόρια είναι οι ανασυνδυασμένες κυτταροκίνες, μονόκλωνα αντισώματα, συντηγμένες (χιμαιρικές) πρωτεΐνες. Είναι η νεώτερη γενιά φαρμάκων που στοχεύουν μεταξύ των άλλων τη ψωρίαση. Όπως γίνεται αντιληπτό, ο σχεδιασμός και η χρήση τους κατέστη εφικτός με την κατανόηση των μηχανισμών της παθογένεσης της νόσου. Ανασυνδυασμένη IL-10. Η IL-10 μετατοπίζει την ισορροπία των Τ βοηθητικών λεμφοκυττάρων από Th1 σε Th2. Σε δοκιμές που έγιναν έδειξε σημαντική αποτελεσματικότητα με ανεκτές παρενέργειες. Ανασυνδυασμένη IL-4. Η IL-4 παράγεται από τα Th2 και ελαττώνει την παραγωγή της IFNγ που παράγεται από τα Th1 με βελτίωση των βλαβών. Μονόκλωνο χιμαιρικό αντίσωμα έναντι του TNFα (Infiximab). Είναι πολύ δραστικό και αποτελεσματικό αλλά με πολλές παρενέργειες. Αρνητικό σημείο είναι η ανάπτυξη εξουδετερωτικών αντισωμάτων που καθιστά τη δράση του αναποτελεσματική με την πάροδο του χρόνου. Ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη του υποδοχέα TNFα (Etanercept). Ο υποδοχέας συνδέεται με την κυτοκίνη TNFα με αποτέλεσμα η τελευταία να μη μπορεί να συνδεθεί με τους φυσιολογικούς υποδοχείς της στα κύτταρα και να εμποδίζεται η έναρξη βιολογικής δράσης. Η δραστικότητά της είναι δοσοεξαρτώμενη. Στις παρενέργειες της, σε μικρή συχνότητα, συγκαταλέγονται η α- νάπτυξη εξουδετερωτικών αντισωμάτων και η αναζωπύρωση ή εμφάνιση λοιμώξεων που ήταν σε λανθάνουσα κατάσταση. Πρωτεΐνη συντηγμένη με την περιοχή δέσμευσης του LFA-3 (Alefacept). Το μόριο αυτό συνδέεται με το μόριο CD2 που εκφράζεται στα Τ λεμφοκύτταρα και κανονικά αλληλεπιδρά με το μόριο LFA-3 που βρίσκεται στα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα. Η δράση του έγκειται στη διακοπή της λειτουργικής σύνδεσης που παίζει ρόλο συν-διέγερσης στην ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων. Μονόκλωνο αντίσωμα έναντι του CD11A (Efalizumab). Το CD11A είναι συστατικό του LFA-1 που βρίσκεται στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων. Το σύμπλοκο LFA-1 συνδέεται με το μόριο ICAM-1 που βρίσκεται στα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα. Εμποδίζει την ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων αλλά και την 34

35 στρατολόγησή τους στην περιοχή της βλάβης. Παρουσιάζει μέτρια αποτελεσματικότητα και αρκετές συνηθισμένες παρενέργειες. Μονόκλωνο αντίσωμα ανθρώπινης προέλευσης έναντι του TNFα (Adalimumab). Είναι στη φάση 3 των κλινικών δοκιμών. Μονόκλωνο αντίσωμα έναντι των IL-12 & IL-23. Στοχεύει στη κοινή αλυσίδα [18] [21] ρ40 των δύο κυτταροκινών. Εικόνα 11. Επισκόπηση των σημαντικότερων βιολογικών παραγόντων που βρίσκονται στη φαρέτρα της αντιψωριασικής αγωγής. Παρουσιάζονται οι δύο κύριες κατηγορίες παραγόντων: α) παραγόντων που στοχεύουν στα Τ λεμφοκύτταρα και β) παραγόντων που στοχεύουν στις κυτοκίνες. Στην πρώτη κατηγορία είναι τα Efalizumab & Alefecept που συνδέονται με υποδοχείς των Τ λεμφοκυττάρων και εμποδίζουν τη λειτουργική σύναψη με τους προσδέτες τους στα δενδρικά κύτταρα, οπότε διακόπτεται η ενεργοποίησή τους. Στην δεύτερη κατηγορία, τα αντισωμάτα ή ο συντηγμένος υποδοχέας συνδέονται με την κυταροκίνη TNFα, με αποτέλεσμα να μη καθίσταται διαθέσιμη να συνδεθεί στους υποδοχείς των κυττάρων και να μη πυροδοτείται σηματοδότηση. 35

36 Γονιδιωματική ανάλυση και ο ρόλος της στη μελέτη πολυπαραγοντικών νόσων αγνώστου αιτιολογίας Γονιδιωματική ανάλυση είναι η μελέτη του προτύπου έκφρασης (τα mrnas που μεταγράφηκαν) του ανθρώπινου γονιδιώματος στο σύνολο του κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες. Προϋποθέτει τη γνώση του γονιδιώματος και την ύπαρξη τεχνολογικά εξελιγμένων τεχνικών που χαρακτηρίζονται ως υψηλής απόδοσης (high throughput). Ανθρώπινο γονιδίωμα Στην αρχή του προηγούμενου αιώνα ανακαλύφθηκε ότι φορέας της κληρονομικότητας είναι τα χρωμοσώματα και οι νόμοι της κληρονομικότητας του Mendel ανακαλύφθηκαν εκ νέου. Στο δεύτερο τέταρτο του 20 αιώνα προσδιορίστηκε ότι η πληροφορία βρίσκεται στην διπλή έλικα του DNA. Το επόμενο βήμα στην κατανόηση του ανθρώπινου γονιδιώματος ήταν η ανακάλυψη των μηχανισμών που αξιοποιούν την πληροφορία που έλαβε χώρα στο τρίτο τέταρτο του 20ού. Στο τελευταίο τέταρτο του προηγούμενου αιώνα κατέστει δυνατό ο προσδιορισμός των πρώτων γονιδίων. Το 1977 οι Allan Maxam και Walter Gilbert καθώς και ο Frederick Sanger δημοσίευσαν δύο διαφορετικές μεθόδους για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων στο DNA. Η μέθοδος του Sanger με τη χρήση διδεοξυνουκλεοτιδίων επικράτησε τελικά εξαιτίας της χρήσης σε μικρότερο βαθμό, επικίνδυνων χημικών ουσιών. Την ίδια χρονιά απομονώθηκε και αλληλουχήθηκε το πρώτο ανθρώπινο γονίδιο. Το ανθρώπινο γονιδίωμα αλληλουχήθηκε κατά το μεγαλύτερο μέρος (η ευχρωματίνη), το 2001 από δύο ανεξάρτητα κονσόρτσιουμ ερευνητών. [31] [32] Το 2004 και το 2007 δόθηκε στη δημοσιότητα εκ νέου, συμπληρωμένο ως προς τα κενά που υπήρχαν. Αποτελείται από 6 δισεκατομμύρια ζεύγη βάσεων κατανεμημένα σε 46 χρωμοσώματα. 36

37 Εικόνα 12. Καρυότυπος ανθρώπινου γονιδιώματος. Υπάρχουν 44 χρωμοσώματα που σχηματίζουν 22 ζεύγη αυτοσωμικών χρωμοσωμάτων και τα δύο φυλετικά χρωμοσώματα Χ και/ή Υ. Ο σχεδιασμός της προσπάθειας ξεκίνησε το 1986 σε ένα συνέδριο στη Σάντα Φε και οριστικοποιήθηκε το 1990 όταν με διεθνή συνεργασία ερευνητικών ι- δρυμάτων διαμορφώθηκε το Human Genome Project. Στόχος του προγράμματος ήταν η πλήρης αλληλούχιση του γονιδιώματος και η εντόπιση όλων των γονιδίων του ανθρώπου, που τα υπολογίζανε σε Το κόστος της προσπάθειας προϋπολογιζόταν στα 3 δισεκατομμύρια δολάρια Αμερικής. Το 1998 η ιδιωτική εταιρία Celera του C.Vender παρουσίασε ένα ανάλογο σχέδιο χαμηλότερου κόστους που φιλοδοξούσε να ολοκληρωθεί ταχύτερα. Σήμερα, ο στόχος είναι η αλληλούχιση ο- λόκληρου του γονιδιώματος να είναι προσιτή και εύκαιρη για κάθε ενδιαφερόμενο και το κόστος να πέσει κάτω από 1000 δολάρια Αμερικής. Ο στόχος αυτός φαίνεται ότι θα επιτευχθεί με τους αλληλουχητές νέας γενιάς μες στην επόμενη δεκαετία. [33] 37

38 Διάγραμμα 4. Στο διάγραμμα παρουσιάζονται ο αριθμός των γονιδίων (αριστερός άξονας) και των ζευγών βάσεων (δεξιός άξονας) ανά χρωμόσωμα (οριζόντιος άξονας). Δεδομένα επικαιροποιημένα το Μάρτιο του 2012 από τη βάση δεδομένων του ιδρύματος Sanger. Ο άνθρωπος έχει περίπου 23 χιλιάδες γονίδια. Τα πιο τελευταία δεδομένα που προέκυψαν από αναλύσεις υψηλής απόδοσης δείχνουν ότι τα ευκαρυωτικά γονιδιώματα μεταγράφονται σε mrna σε ποσοστό που φθάνει το 90%. Όμως μόνο 1-2% των mrnas κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Το υπόλοιπο τμήμα αποτελεί τα ncrnas (non-coding RNAs) τα οποία περιλαμβάνουν τα micrornas, τα small interfering RNAs, τα piwi-interacting RNAs, τα long ncrnas, τα enhacer RNAs και τα promoterassociated RNAs. Τα RNAs που δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες παίζουν ρυθμιστικό ρόλο κυρίως στη βιολογία του κυττάρου αν και δεν έχει αποσαφηνιστεί το πλήρες εύρος της λειτουργίας τους. [34] 38

39 Διάγραμμα 5. Οι πρωτεΐνες που είναι γνωστές (επικαιροποιημένα δεδομένα: Μάιος, 2011 ) έχουν ομαδοποιηθεί και ταξινομηθεί βάσει της λειτουργίας τους. Δίπλα στη κάθε κατηγορία πρωτεϊνών, εμφανίζεται το πλήθος των πρωτεϊνών της κάθε ομάδας και το ποσοστό που αντιπροσωπεύει στο σύνολο των πρωτεϊνών που υπολογίζονται. Μικροσυστοιχίες (Microarrays) Οι μικροσυστοιχίες DNA είναι μιας τεχνική υψηλής απόδοσης που διαμορφώθηκε την τελευταία 20ετία (Schena,1995). Επί της αρχής, σε μια επιφάνεια, συνήθως γυάλινη, με μέγεθος όσο μια αντικειμενοφόρος πλάκα είναι ακινητοποιημένα πλήθος ολιγονουκλεοτιδίων σε συγκεκριμένες συντεταγμένες. Το πλήθος των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών φθάνει τις λίγες δεκάδες χιλιάδες (περίπου αλληλουχίες διαθέτουν οι μικροσυστοιχίες που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη) και το μέγεθος των ολιγονουκλεοτιδίων μπορεί να κυμαίνεται μεταξύ 25 και 70 νουκλεοτιδίων (nt). Καταλαμβάνουν συγκεκριμένο χώρο που ορίζεται ως κηλίδα (spot) ή σημείο με χαρακτηριστική διάμετρο που είναι συνάρτηση του πλήθους των διαφορετικών αλληλουχιών και της πυκνότητας τους. Η πρόσδεση τους στην πλάκα γίνεται μέσω ομοιοπολικών δεσμών και υπάρχουν δύο βασικές τεχνικές κατασκευής τους. Η μία τεχνική, συνθέτει τα ολιγονουκλεοτίδια απευθείας στην πλάκα, όπως είναι τα πλακάκια της Affymetrix. Μειονέκτημα της μεθόδου είναι το περιορισμένο μήκος των αλληλουχιών που μπορούν να συντεθούν (περίπου 25nt) και το αυξημένο κόστος, αντιθέτως το μεγάλο πλεονέκτημα είναι η ακρίβεια της κατασκευής. Η άλλη τεχνική είναι αυτή της εκτύπωσης στην οποία τα ολιγονουκλεοτίδια που έχουν ήδη συντεθεί, δίχως περιορισμό στο μέγεθος, εκτυπώνονται στην πλάκα. Αυτού του είδους τα πλακάκια χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα έρευνα. Μειονέ- 39

40 κτημα της μεθόδου είναι ότι οι κηλίδες των ολιγονουκλεοτιδίων δεν είναι απόλυτα ευθυγραμμισμένες. Η πειραματική διαδικασία που περιλαμβάνει τη χρήση μικροσυστοιχιών α- ποτελείται από μια σειρά βημάτων καθορισμένης σειράς. Η αφετηρία και το σημαντικότερο σημείο της διαδικασίας είναι η διατύπωση του βιολογικού ερωτήματος με σαφή και καθαρό τρόπο. Βάσει αυτού γίνεται ο σχεδιασμός και/ή επιλογή της μικροσυστοιχίας. Υπάρχει η δυνατότητα είτε να χρησιμοποιηθεί μία από τις τυποποιημένες εμπορικά διαθέσιμες μικροσυστοιχίες ή να κατασκευασθεί πρωτότυπη. Το επόμενο στάδιο είναι η παρασκευή του δείγματος, η απομόνωση του βιολογικού υλικού, η επέκταση του (με αντίστροφη μεταγραφή όπου χρειάζεται) και η σήμανση του (με κάποιο φθοριόχρωμα, για παράδειγμα). Επόμενο στάδιο είναι η υβριδοποίηση του δείγματος επί της πλάκας και η κατάλληλη επεξεργασία προκειμένου η πλάκα της μικροσυστοιχίας να σαρωθεί. Ο όγκος των δεδομένων που προκύπτει χρησιμοποιείται από εξειδικευμένα λογισμικά ώστε να προκύψει κάποιο συμπέρασμα. Τα προγράμματα αυτά είναι προγράμματα στατιστικής επεξεργασίας που φιλτράρουν τα αρχικά δεδομένα, τα ομαδοποιούν, τα ιεραρχούν, κάνουν τις κατάλληλες συσχετίσεις και δημιουργούν εντέλει μια εικόνα για το τι συμβαίνει. Το τελευταίο στάδιο είναι το δυσκολότερο βήμα στην πειραματική διαδικασία, καθώς η υιοθέτηση συγκεκριμένης στατιστικής προσέγγισης μπορεί να αναδείξει διαφορετικές πτυχές της επιδιωκόμενης απάντησης στο ερευνητικό ερώτημα. Αυτός είναι ο λόγος που στη διεθνή βιβλιογραφία δημοσιεύονται εργασίες που έχουν ως αντικείμενο την εκ νέου στατιστική επεξεργασία ήδη δημοσιευμένων αποτελεσμάτων, υιοθετώντας διαφορετικούς αλγόριθμους και διαφορετικές προσεγγίσεις. Η ύπαρξη του στατιστικού επιπέδου σημαντικότητας σε κάθε στατιστική επεξεργασία είναι αυτή που επιτρέπει την «διαμάχη» των επιστημόνων περί καταλληλότερης στατιστικής προσέγγισης. Σήμερα οι μικροσυστοιχίες χρησιμοποιούνται ευρύτατα στην έρευνα για την διερεύνηση της επίδρασης του γονιδιώματος στην παθογένεια πολυπαραγοντικών νόσων. Κλασσικό παράδειγμα είναι διάφορες μορφές καρκίνου με χαρακτηριστικότερο τον καρκίνο του μαστού, που ήδη κυκλοφορούν τυποποιημένα πλακίδια για τη διαφοροδιάγνωση του. Ανάλογη περίπτωση που αναφέρεται στην διεθνή βιβλιογραφία είναι η μελέτη της νόσου Alzheimer. 40

41 Εικόνα 13. Αριστερά παρουσιάζεται η μικροσυστοιχία της Affymetrix και δεξιά της OneArray. Στην πρώτη, τα ολιγονουκλεοτίδια σχηματίστηκαν ένα προς ένα πάνω στην πλάκα, ενώ στη δεύτερη περίπτωση ήταν ήδη σχηματισμένα όταν εκτυπώθηκαν. Το χέρι χρησιμοποιείται ως μέτρο σύγκρισης του μεγέθους τους. Διάγραμμα 6. Βήματα πειραματικής διαδικασίας με τη χρήση μικροσυστοιχιών Διατύπωση ερευνητικού ερωτήματος Σχεδιασμός/Επιλογή κατάλληλης μικροσυστοιχίας Παρασκευή δείγματος Απομόνωση βιολογικού υλικού Επέκταση του και Σήμανση Υβριδοποίηση σημασμένου δείγματος με τα ολιγονουκλεοτίδια της μικροσυστοιχίας Σάρωση και λήψη αρχικών δεδομένων Ανάλυση δεδομένων Φιλτράρισμα, ποσοτικοποίηση, κανονικοποίηση αρχικών δεδομένων Στατιστική επεξεργασία Οπτικοποίηση αποτελεσμάτων, αναφορά 41

42 ΣΚΟΠΟΣ Η σημαντική και σε βάθος διεύρηνση της γνώσης γύρω από το ανθρώπινο γονιδίωμα την τελευταία δεκαετία, έχει δημιουργήσει προοπτικές σε ερευνητικά πεδία που μέχρι πρόσφατα έβρισκαν εμπόδιο λόγω έλλειψης αυτής της πληροφορίας. Σε αυτό συνεπικούρησαν η εξάπλωση των τεχνικών υψηλής απόδοσης σε συνδυασμό με την ελάττωση του κόστους χρήσης τους. Αποτέλεσμα ήταν να ενταθεί η ερευνητική προσπάθεια για επιπλέον κατανόηση των βιολογικών μηχανισμών σε μοριακές και κυτταρικές διεργασίες που είχαν διερευνηθεί έως ένα σημείο. Τα ρετινοειδή έχουν πολλές θεραπευτικές εφαρμογές (κυρίως σε δερματικές παθήσεις όπως ακμή, ψωρίαση, ιχθύαση, μυρμηκιώδης επιδερμοδυσπλασία [14] ). Η χορήγηση τους όμως, συνοδεύεται από σοβαρές παρενέργειες κατά περιπτώσεις. Μέχρι τη στιγμή που έγινε ο σχεδιασμός της πειραματικής διαδικασίας, η γνώση που υπήρχε για τους μηχανισμούς δράσης των φαρμάκων αυτών ήταν σημαντική αλλά όχι εκτεταμένη. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να διερευνηθούν ολιστικά οι μοριακοί μηχανισμοί που επηρεάζονται, είτε μέσω ενεργοποίησης, είτε μέσω μεταβολής της έντασης έκφρασης και δράσης τους, όταν συγκεκριμένα ρετινοειδή (all-trans retinoic acid και acitretin) και σε συγκεκριμένες δόσεις (10-6 Μ και 10-8 Μ) χορηγηθούν σε καλλιέργειες κυττάρων HaCaT. Στην ερευνητική μεθοδολογία γίνεται χρήση τεχνικών υψηλής απόδοσης, συγκεκριμένα μικροσυστοιχιών cdna (cdna microarrays) με σκοπό να σχηματισθεί μια συνολική εικόνα των κυτταρικών μοριακών μηχανισμών που επηρεάζονται από τη δράση των φαρμάκων. Μοριακοί μηχανισμοί που διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη θεραπευτική ιδιότητα των ρετινοειδών αλλά και στις παρενέργειες που προκαλούν. Για την αποτίμηση των αποτελεσμάτων που αναδεικνύονται από τη χρήση των μικροσυστοιχιών καθώς και για την ολοκλήρωση της εικόνας για τους μοριακούς μηχανισμούς, στοχευμένα πλέον, γίνεται χρήση ποσοσοτικής Real-Time PCR (qrt-pcr) σε γονίδια που έχουν σημαίνοντα ρόλο σε βασικές βιολογικές διεργασίες. Απώτερος στόχος είναι να αναδειχθούν οι λεπτές διαφορές μεταξύ των δραστικών ουσιών, στις συγκεντρώσεις που χορηγούνται, διαφορές που έχουν ως αποτέλεσμα να επηρεάζονται ανάλογα οι κυτταρικοί μοριακοί μηχανισμοί. 42

43 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Κυτταροκαλλιέργειες Στις πειραματικές διαδικασίες χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα HaCaT, τα οποία πρόθυμα μας παραχώρησε ο Δ. Χαρτουμπέκης, διδάκτορας στο ερευνητικό εργαστήριο ενδοκρινολογίας του κ. Ι. Χαμπαίου. Τα κύτταρα HaCaT είναι αθανατοποιημένη σειρά κερατινοκυττάρων που προέρχονται από ανθρώπινο φυσιολογικό δέρμα που ανατομικά προέρχεται από την κοιλιά. [35] Για την διενέργεια των κυτταροκαλλιεργιών ακολουθήθηκαν τα πρωτόκολλα του εργαστηρίου. Τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: Dulbecco s Modified Eagle Medium-DΜΕΜ, Fetal Bovine Serum-FBS, Antibiotic/ antimycotic [ABAM (streptomycin, penicillin G)] 100Χ, Trypsin 10Χ, της BioSera. DMSO (SIGMA). Στις παρακάτω γραμμές περιγράφονται τα πρωτόκολλα που χρησιμοποιήθηκαν για το ξεπάγωμα, την καλλιέργεια, την ανακαλλιέργεια και το πάγωμα. [36] Τα κύτταρα από το υγρό άζωτο (LN) στους -150 o C ή από τον καταψύκτη στους -80 ο C που φυλάσσονται, μεταφέρονται αμέσως σε υδατόλουτρο στους 37 o C. Όλες οι επόμενες διεργασίες γίνονται σε θάλαμο νηματικής ροής. Μεταφέρεται η ποσότητα των κυττάρων από τα κρυοφιαλίδια σε φιαλίδια Falcon 15ml. Γίνεται προσθήκη θρεπτικού υλικού (MEM, 10%FBS, ABAM) προκειμένου να ξεπλυθούν τα κύτταρα από το DMSO. Γίνεται φυγοκέντρηση στις 1500rpm για 5 min. Αποχύνουμε το υπερκείμενο και επαναδιαλύουμε προσεκτικά το ίζημα σε πλήρες θρεπτικό υλικό. Ενοφθαλμίζουμε Τ-φλάσκες ή τρυβλία και συμπληρώνουμε με πλήρες θρεπτικό υλικό. Επωάζουμε σε επωαστικό κλίβανο στους 37 o C σε ατμόσφαιρα 5% CO2. Την επόμενη μέρα ελέγχουμε την φλάσκα σε μικροσκόπιο. Εάν επιπλέουν πολλά νεκρά κύτταρα, τότε αφαιρούμε με προσεκτικές κινήσεις το παλαιό θρεπτικό υλικό και προσθέτουμε φρέσκο. Ελέγχουμε περιοδικά την ανάπτυξη των κυττάρων, με κρίσιμο όριο το 80% συρρέουσας ανάπτυξης. Η αλλαγή του θρεπτικού υλικού γίνεται κάθε 2-3 μέρες. 43

44 Ανακαλλιέργεια Όταν τα κύτταρα έχουν φθάσει σε συρρέουσα ανάπτυξη κοντά στο 80% μπορούμε να κάνουμε ανακαλλιέργεια. Ξεπλένουμε δύο φορές με PBS (Phosphate Buffer Saline) αναρροφώντας και απορρίπτοντας αρχικά το υγρό που υπήρχε στη φλάσκα και προσθέτοντας εν συνεχεία το PBS. Ακολούθως, προσθέτουμε θρυψίνη 1Χ (διάλυση με το διάλυμα φωσφορικών) ώστε να καλύψει την επιφάνεια. Επωάζουμε για 10 min περίπου στους 37 o C. Αδρανοποιούμε το ένζυμο με προσθήκη DMEM, 10% FBS. Χτυπάμε με τα χέρια, πλευρικά τη φλάσκα ώστε να ξεκολλήσουν όλα τα κύτταρα. Επιπλέον, με διαδοχικά πιπετταρίσματα (αναρροφήσειςαπορρίψεις) του υπερκείμενου υγρού, διευκολύνουμε την αποκόλληση των κυττάρων. Από τον ολικό όγκο του υγρού που περιέχει κύτταρα, αφήνουμε το 10-20% στην φλάσκα και τον υπόλοιπο όγκο ή τον απορρίπτουμε ή τον ενοφθαλμίζουμε σε άλλες φλάσκες. Μεταφέρουμε τις φλάσκες που έχουμε στον επωαστικό κλίβανο. Φύλαξη κυττάρων Κάνουμε ανάλογη διαδικασία με την ανακαλλιέργεια μέχρι να συλλέξουμε τα κύτταρα. Τα φυγοκεντρούμε στις 1500rpm για 5 min απορρίπτουμε το υπερκείμενο, επαναιωρούμε τα κύτταρα σε 90% FBS, 10% DMSO και διαμοιράζουμε από 1ml σε κρυοφιαλίδια. Φυλάμε στους -80 ο C με τρόπο ώστε η ψύξη να επιτυγχάνεται με -1 ο C/min. Για μακροχρόνια διαστήματα φύλαξης μεταφέρουμε τα κρυοφιαλίδια, την επόμενη ημέρα, σε υγρό άζωτο. Δοκιμασία επίδρασης του DMSO στα κύτταρα Σε πηγαδάκια 24άρας πλάκας ενοφθαλμίζονται ίσοι όγκοι αιωρήματος κυττάρων και επωάζεται για 2 μέρες. Κατά την αλλαγή του θρεπτικού υλικού, προστίθεται συγκεκριμένος όγκος DMSO (Biosera) όπως φαίνεται στον πίνακα που ακολουθεί. 44

45 Πίνακας 2 Δοκιμασία DMSO επί κυτταροκαλλιέργειας HaCaT σε πλάκα 24άρων βοθρίων. Α Β C D 1. (0%) 1ml DMEM 1ml DMEM 1ml (DMEM, 10% FBS) 1ml (DMEM, 10% FBS) 2. (0,1%) 999μl DMEM 1μl DMSO 999μl DMEM 1μl DMSO 999μl (DMEM, 10% FBS) 999μl (DMEM, 10% FBS) 3. (0,5%) 995μl DMEM 5μl DMSO 4. (1%) 990μl DMEM 10μl DMSO 5. (5%) 950μl DMEM 50μl DMSO 6. (10%) 900μl DMEM 100μl DMSO 995μl DMEM 5μl DMSO 990μl DMEM 10μl DMSO 950μl DMEM 50μl DMSO 900μl DMEM 100μl DMSO 1μl DMSO 995μl (DMEM, 10% FBS) 5μl DMSO 990μl (DMEM, 10% FBS) 10μl DMSO 950μl (DMEM, 10% FBS) 50μl DMSO 900μl (DMEM, 10% FBS) 100μl DMSO 1μl DMSO 995μl (DMEM, 10% FBS) 5μl DMSO 990μl (DMEM, 10% FBS) 10μl DMSO 950μl (DMEM, 10% FBS) 50μl DMSO 900μl (DMEM, 10% FBS) 100μl DMSO Στις στήλες Α και Β έγινε αποστέρηση FBS ενώ στις στήλες C και D το θρεπτικό υλικό περιείχε 10 % FBS. Σε όλες τις στήλες προστέθηκε αντιβιοτικό και αντιμυκητισιακό. Η δοκιμασία αυτή έγινε επειδή οι φαρμακευτικές ουσίες που εξετάστηκαν, χορηγήθηκαν στα κύτταρα διαλυμένες σε DMSO. Είναι γνωστό ότι τα κύτταρα όταν βρεθούν σε συνθήκες αποστέρησης θρεπτικών συστατικών (FBS) προσλάβουν ευκολότερα συστατικά από το θρεπτικό υλικό τους. Επιπλέον θα μπορούσαμε να διαπιστώσουμε αν η αλβουμίνη του FBS επιδρά στην κυτταροτοξικότητα του DMSO. Η δοκιμασία ολοκληρώθηκε σε δύο φάσεις με μέτρηση της βιωσιμότητας των κυττάρων (ως ποσοστό). Χρησιμοποιήθηκε αιμοκυττόμετρο (Neubauer) και χρώση Trypan Blue (BioSera) στις 12 ώρες (στήλες Α, D) και στις 24 ώρες (B,C). Καταμέτρηση κυττάρων με αιμοκυττόμετρο και χρώση με Trypan blue Αφαιρείται το θρεπτικό υλικό από τις καλλιέργειες, γίνεται πλύση δύο φορές με PBS όπως έχει ήδη περιγραφεί, προστίθεται θρυψίνη ώστε να καλύψει την επιφάνεια (0,1ml ανά πηγαδάκι), γίνεται επώαση για 10 min στους 37 o C, προστίθεται 10Χ όγκος θρεπτικού υλικού (1ml) για την απενεργοποίηση του ενζύμου, συλλέγονται τα κύτταρα σε φιαλίδια Eppendorf και φυγοκεντρούνται στα 3xg για 5min. Α- μέσως πριν την μέτρηση των κυττάρων αφαιρείται το υπερκείμενο, προστίθενται 100μl trypan blue, γίνεται ήπια ανάδευση με την πιπέττα, αναμονή 1-2min, μεταφέ- 45

46 ρεται ποσότητα στην πλάκα Neubauer, αναμονή 30sec ώστε να «ηρεμήσουν» τα κύτταρα και ακολουθεί μέτρηση. Η χρωστική trypan blue δεν διαπερνά τις μεμβράνες των ζώντων κυττάρων, οπότε τα κύτταρα παραμένουν άχροα. Αντιθέτως μπλε ή μερικώς χρωματισμένα σημαίνει ότι τα κύτταρα είναι νεκρά ή με σοβαρές βλάβες που οδηγούν στην απόπτωση. Α. Β. Εικόνα 14. Α. Παρουσιάζεται η πλάκα Neubauer και ο τρόπος που πληρούται με σιφώνιο. Β. Σχηματική παράσταση του πλέγματος που γίνεται ορατό με τη χρήση του μικροσκοπίου. Το κάθε μεγάλο τετράγωνο έχει μήκος 1 mm, ενώ κάθε μεσαίο 0,25mm. Το κενό που σχηματίζεται μετά την προσθήκη της καλυπτρίδας είναι 0,01mm. Η μέτρηση των κυττάρων HaCaT γίνεται στα τετράγωνα που είναι χρωματισμένα πράσινα. Στην πλάκα Neubauer λαμβάνονται υπόψη τα κύτταρα εντός συγκεκριμένων τετραγώνων και όσα είναι στις γραμμές που συμβάλουν επάνω αριστερά (δηλαδή, από τα κύτταρα που είναι πάνω σε γραμμή σε κάποιο τετράγωνο, λαμβάνονται υ- πόψιν μόνο όσα είναι σε δύο από τις τέσσερις γραμμές που ορίζουν το τετράγωνο και αυτές υποχρεωτικά θα είναι ίδιες κάθε φορά). Πρέπει να μετρηθούν τουλάχι- 46

47 στον εκατό κύτταρα. Αυτό σημαίνει ότι ο αριθμός των κυττάρων που μετράται δεν είναι συγκεκριμένος απαραίτητα, αρκεί η διασπορά των κυττάρων να είναι ομοιόμορφη. Ο υπολογισμός των κυττάρων γίνεται ως εξής: δεδομένου ότι κάθε μεγάλο τετράγωνο που ορίζεται από τριπλή γραμμή έχει μέγεθος 1mm και βάθος 0,1mm ο όγκος είναι 0,1mm 3 (10-4 ml) και η αναγωγή του αριθμού-του μέσου όρου ακριβέστερα- των κυττάρων γίνεται στο χιλιοστόλιτρο (ml). Ο απόλυτος αριθμός ζωντανών και νεκρών κυττάρων δεν είναι τόσο κατατοπιστικός, όσο ο λόγος τους και ειδικότερα το επί τοις εκατό κλάσμα βιωσιμότητας που ορίζεται από τη σχέση: % βιωσιμότητα = Ζωντανά κύτταρα Ζωντανά + νεκρά κύτταρα 100 Παρασκευή πρότυπων διαλυμάτων των φαρμακευτικών ουσιών και των διαλυμάτων εργασίας Τα πρότυπα διαλύματα των φαρμάκων έγιναν με διάλυση σε διμέθυλσουλφοξείδιο (DMSO, Sigma, >99,5 GC) και σε συγκέντρωση 0,1Μ. Οι φαρμακευτικές ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν είναι τα ρετινοειδή: all-trans-retinoic acid (ATRA), και Acitretin. ATRA: mw= 300,44. Παρασκευάστηκε 1 ml. Acitretin: mw= 326,43. Παρασκευάσθηκαν 49,92 μl. Οι αραιώσεις που έγιναν με βάση τα πρότυπα διαλύματα ήταν οι ακόλουθες: 10-2 Μ, 10-3 Μ, 10-4 Μ, 10-5 Μ. Παρασκευάσθηκαν όπως φαίνεται στο διάγραμμα που ακολουθεί. Πρότυπα Διαλύματα 10 μl 90 μl DMSO 10 μl 90 μl DMSO 10 μl 90 μl DMSO 10 μl 90 μl DMSO 0,1Μ 10-2 M 10-3 M 10-4 M 10-5 M 47

48 Καμπύλη επίδρασης των φαρμάκων σε κυτταροκαλλιέργειες Για την επιλογή της συγκέντρωσης των φαρμακευτικών ενώσεων πάνω στις οποίες θα γίνουν τα οριστικά πειράματα, καλλιεργήθηκαν κύτταρα σε πλάκα 24άρων βοθρίων. Όταν πλησίαζαν 70-80% σε συρρέουσα ανάπτυξη, το θρεπτικό υλικό αφαιρέθηκε και αντικαταστάθηκε από θρεπτικό υλικό που περιείχε 2% αντί 10% FBS, ώστε να περιοριστεί η επίδραση της αλβουμίνης αλλά και για να βρεθούν σε κατάσταση αποστέρησης. Χορηγήθηκαν 999μl θρεπτικού υλικού και 1μl διαλύματος φαρμακευτικής ουσίας (αραίωση 1:1000). Οι τελικές συγκεντρώσεις φαίνονται στον πίνακα που ακολουθεί. Πίνακας 3. Τελικές συγκεντρώσεις φαρμάκων μετά από χορήγηση 1μl σε 999μl θρεπτικού υλικού Συγκέντρωση φαρμακευτικής ουσίας Τελική συγκέντρωση (1μl στα 999 θρεπτικού υλικού) - Control 1 DMSO Control 2: 0,1% DMSO 10-5 Μ 10-8 M (0,1% DMSO) 10-4 Μ 10-7 M (0,1% DMSO) 10-3 Μ 10-6 M (0,1% DMSO) 10-2 Μ 10-5 M (0,1% DMSO) 10-1 Μ 10-4 M (0,1% DMSO) Δοκιμασία βιωσιμότητας ΜΤΤ Το ΜΤΤ: [ 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] είναι άλας τετραζολίου κίτρινου χρώματος. Η δοκιμασία στηρίζεται στην αναγωγή του κίτρινου άλατος στην ένωση formazan μπλε χρώματος. Η αναγωγή γίνεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα, ενώ σε μικρότερο βαθμό στα μιτοχόνδρια και στην κυτταρική μεμβράνη. Ένζυμα και συστατικά του κυττάρου που συμμετέχουν στην αναγωγή είναι τα NADH, NADPH, μιτοχονδριακή αναγωγάση του σουκινικού και το κυτόχρωμα C. Το προϊόν της αναγωγής είναι υδρόφοβοι κρύσταλλοι ιώδους χρώματος που διαλυτοποιούνται με οργανικούς διαλύτες (π.χ. ισοπροπανόλη, DMSO, 10% SDS, Nonident P-40, Triton X-100). Η απορρόφηση κανονικά μετριέται σε μήκος κύματος nm. Συστήνεται η μέτρηση να γίνει στα 650nm ή και περισσότερο. [37] 48

49 Διαδικασία: Αφαιρείται το θρεπτικό υλικό και πλένονται τα κύτταρα με PBS. Το ΜΤΤ (Sigma) αναμιγνύεται με πλήρες θρεπτικό υλικό σε αναλογία 1:10. Τα κύτταρα ε- πωάζονται στον κλίβανο για 3 ώρες. Αφαιρείται το θρεπτικό υλικό με το ΜΤΤ και προστίθεται οξινισμένη ισοπροπανόλη. Σκεπάζονται τα κύτταρα με αλουμινόχαρτο και επωάζονται για πέντε λεπτά της ώρας υπό ανάδευση. Η μέτρηση έγινε σε φωτόμετρο πλάκας στο ερευνητικό εργαστήριο αιματολογίας της κ. Α. Μουζάκη με την βοήθεια της υποψήφιας διδάκτορα Μ. Ρόδη. Η μέτρηση έγινε στα 540nm και 600nm μήκη κύματος. Συλλογή και φύλαξη κυττάρων HaCaT Στα κύτταρα που χορηγήθηκαν τα φάρμακα, συνελέγησαν με τη χρήση θρυψίνης όπως έχει ήδη περιγραφεί προηγουμένως. Πλύθηκαν δύο φορές με PBS μετά την απενεργοποίηση της θρυψίνης, έγινε φυγοκέντρηση στα 300x g για 5 min ώστε να συλλεχθούν τα κύτταρα. Αφαιρέθηκε το υπερκείμενο και στο ίζημα των κυττάρων προστέθηκε 300μl διάλυμα RNA Later της Ambion, προκειμένου να μην καταστραφεί το RNA. Κατόπιν η φύλαξη έγινε στους 4 ο C για μια νύχτα και ακολούθως τοποθετήθηκαν στους -20 ο C. Απομόνωση RNA από τα κύτταρα με τη χρήση προτυποποιημένων στηλών της Ambion Αρχικά έγιναν οι απαραίτητες ανασυστάσεις των αντιδραστηρίων όπως περιγράφονται και απαιτούνται από το εγχειρίδιο χρήσης (RNAqueous kit, Ambion). Όλοι οι χειρισμοί έγιναν στο θάλαμο νηματικής ροής. Συνοπτικά τα βήματα που α- κολουθήθηκαν βάσει πρωτοκόλλου της εταιρίας (βήματα: Α,Β,Γ) και πρωτοκόλλου του εργαστηρίου (βήμα Δ) είναι τα ακόλουθα. Α. Αφαίρεση RNA Later Solution 1. Φυγοκέντρηση έως 5000xg για 5 min. 2. Αφαίρεση υπερκειμένου Β. Διαδικασία εκχύλισης RNA 1. Συλλογή κυττάρων ( ) 2. Προσθήκη 500μl Lysis/Binding solution Κάνουμε έντονο vortex (προαιρετικά για να μη φράξει η στήλη κάνουμε φυγοκέντρηση για 2-3 λεπτά της ώρας) 49

50 3. Προσθήκη ίσου όγκου 64% αιθανόλης Κάνουμε απαλή μίξη 4. Μεταφέρουμε έως 700μl στη στήλη Φυγοκεντρούμε στις x g για 1 min Απόρριψη διηθήματος και επανάληψη διαδικασίας εάν χρειάζεται 5. Προσθήκη 700μl Wash Solution #1 Κάνουμε φυγοκέντρηση και απορρίπτουμε το διήθημα 6. Προσθήκη 500 μl Wash Solution #2/3 Κάνουμε φυγοκέντρηση και απορρίπτουμε το διήθημα Προσθήκη 500 μl Wash Solution #2/3 (δεύτερο βήμα) Κάνουμε φυγοκέντρηση και απορρίπτουμε το διήθημα Φυγοκεντρούμε εκ νέου να στεγνώσει η στήλη 7.Μεταφορά της στήλης σε νέο σωληνάριο. Προσθήκη 50μl (40-60μl) Elution solution προθερμασμένο στους 70-80οC. Προσοχή να πέσει στο κέντρο της στήλης. Φυγοκεντρούμε στις x g για 1 min σε θερμοκρασία περιβάλλοντος 8.Προσθέτουμε 50μl Elution Solution προθερμασμένο στους 70-80οC. Φυγοκεντρούμε στις x g για 1 min σε θερμοκρασία περιβάλλοντος Γ. Πέψη με DNase1 και απενεργοποίηση της 1. Προσθήκη 0,1X όγκο 10xDNase 1 Buffer (10μl) 1μl DNase 1 Κάνουμε απαλή μίξη 2. Επωάζουμε για 30 λεπτά της ώρας στους 37 ο C 3. Προσθήκη 0,1X όγκο DNase Inactivation Reagent (10μl) Χρειάζεται vortex και ανάδευση με το ρύγχος της πιπέττας όταν κάνουμε την αναρρόφηση 4. Απαλή μίξη και επώαση για 2 λεπτά της ώρας σε θερμοκρασία δωματίου 5. Φυγοκέντρηση στα x g min Μεταφέρουμε το υπερκείμενο σε νέο σωληνάριο eppendorf. Δ. Συμπύκνωση RNA με κατακρήμνιση 1. Προσθήκη 0,1 όγκο 5Μ οξικό αμμώνιο 0,01-0,02 όγκο γραμμικό ακρυλαμίδιο Κάνουμε σύντομο vortex. 2. Προσθέτουμε 2-2,5 όγκους απόλυτη αιθανόλη και κάνουμε καλή μίξη Επωάζουμε για 30min στους -80 o C (βάσει πρωτοκόλλου του εργαστηρίου) 3. Φυγοκεντρούμε στις x g για 30min στους 4 o C Απομακρύνουμε το υπερκείμενο με γυάλινο σιφώνιο Pasteur 4. Επαναδιαλύουμε το ίζημα RNA σε 60μl Elution solution. Η επαναδιάλυση διευκολύνεται με επώαση στους 65 ο C για 5min με τακτικές αναδεύσεις. Έλεγχος ποιότητας του απομονωμένου RNA Ποσότητα (2-3μl) από κάθε δείγμα αραιώνεται με νερό (1:200-1:300) σε τελικό όγκο 600μl. Γίνεται φωτομέτρηση στα 260 και 280nm για τον έλεγχο παρουσίας πρωτεϊνών. Χρησιμοποιείται κυβέτα χαλαζία. Ο επιθυμητός λόγος O.D. 260 / O.D. 280 είναι μεγαλύτερος από 1,8. Η συγκέντρωση του RNA προκύπτει από την ακόλουθη σχέση: O.D. 260 x συντελεστής αραίωσης x 40 =ng/μl RNA. 50

51 Η ακεραιότητα του RNA διαπιστώνεται με ηλεκτροφόρηση που πραγματοποιείται στη συσκευή BioAnalyzer της Agilent. Όταν στο ηλεκτροφόρημα υπάρχουν μόνο δύο ζώνες, το RNA θεωρείται ότι δεν έχει διασπαστεί από ριβονουκλεάσες. Η ηλεκτροφόρηση γίνεται σε κλειστό κύκλωμα με τη συσκευή Agilent RNA 6000 Nano Assay Protocol βάσει του εγχειριδίου. Τα βήματα που έγιναν αναφέρονται παρακάτω. Χαρακτηριστικά δοκιμασίας 12 δείγματα ανάλυσης σε κάθε πήκτωμα 1 μl όγκος δείγματος ng/μl εύρος ποσοτικής ανάλυσης ολικού RNA ng/μl εύρος ποιοτικής ανάλυσης ολικού RNA ng/μl εύρος ανάλυσης mrna Καθαρισμός ηλεκτροδίου 1. Ψεκάζουμε με RNA zap τη διάφανη συσκευή που ονομάζεται new electron cleaner 2. Ξεπλένουμε με RNase free νερό 3. Το χτυπάμε με χαρτί να φύγει η υγρασία 4. Τοποθετούμε σε ένα πηγαδάκι 350μl RNase free νερό 5. Βάζουμε το electron cleaner στη συσκευή και κλείνουμε το καπάκι. Αναμένουμε 10sec 6. Αφαιρούμε το cleaner και αφήνουμε ανοιχτό το καπάκι για 10 sec να στεγνώσουν τα pins Ανοίγουμε το πρόγραμμα και μετά τη συσκευή: -instrument, diagnostic, short circuit test -βάζουμε ένα άδειο chip και πατάμε οκ. Προετοιμασία gel 1. Προσθέτουμε 550μl από το RNA 6000 Nano υλικό (κόκκινο) σε ένα spin filter 2. Φυγοκέντρηση 1500 xg για 10 λεπτά της ώρας σε θερμοκρασία δωματίου 3. Διαμοιράζουμε από 65μl γέλης σε σωληνάκια ελεύθερα RNάσης (διάρκεια ζωής της γέλης είναι περίπου 4 εβδομάδες) Προετοιμασία της χρώσης της γέλης (gel dye mix) 1. Αφήνουμε τη χρωστική (μπλε) να εξισορροπηθεί σε θερμοκρασία δωματίου RT για 30 min 2. Κάνουμε μηχανική ανάδευση (vortex) για 10 sec και μετά «κατεβάζουμε» τα σταγονίδια με σύντομη φυγοκέντρηση 3. Προσθέτουμε 1μl (λ) της χρωστικής σε μία «μερίδα» γέλης (1λ στα 65λ ή 0,54λ στα 35λ γέλης) 4. Κάνουμε πολύ καλή μηχανική ανάδευση και φυγοκεντρούμε στις x g σε RT για 10min. (διάρκεια ζωής 24 ώρες) Φορτώνουμε το gel dye mix 1. Τοποθετούμε ένα καινούριο RNA6000 NaNo Chip στο priming station 2. Πιπετάρουμε 9 μl gel dye στο πηγαδάκι G 3. Βεβαιωνόμαστε ότι το έμβολο είναι τοποθετημένο στο 1ml και μετά κλείνω το chip priming station μέχρι να ακουστεί κλικ 4. Πιέζουμε το έμβολο μέχρι να κρατηθεί από το κλιπ 5. Περιμένουμε ακριβώς 30 sec και απελευθερώνουμε το έμβολο 6. Περιμένουμε 5 sec και επανατοποθετούμε το έμβολο σιγά σιγά στη θέση του 1ml 51

52 7. Ανοίγουμε το chip priming station και πιπετάρουμε 9 μl gel dye mix στο πηγαδάκι G 8. Απορρίπτουμε την υπόλοιπη ποσότητα του gel dye mix Φορτώνουμε τον Agilent RNA 6000 NaNo Marker 1. Πιπετάρουμε 5μl από τον marker στο πηγαδάκι και στα υπόλοιπα 12 πηγαδάκια για τα δείγματα Φορτώνουμε τον μάρτυρα και τα δείγματα 1. Πιπετάρουμε 1 λ από το προετοιμασμένο μάρτυρα (ladder) στο πηγαδάκι 2. Πιπετάρουμε 1 λ δείγματος σε ένα πηγαδάκι από τα Πιπετάρουμε 1 λ από το marker (πράσινο) σε κάθε μη χρησιμοποιούμενο πηγαδάκι δείγματος 4. Βάζουμε την πλακέτα οριζόντια στον υποδοχέα του μηχανικού αναδευτήρα και αναδεύουμε για 1 λεπτό της ώρας στις 2400 rpm 5. «Τρέχουμε» την πλακέτα με την γέλη στο bioanalyzer της Agilent για 5 λεπτά Εισαγωγή της πλακέτας στο bioanalyzer 1. Ανοίγουμε το καπάκι (έχει προηγηθεί ο καθαρισμός) 2. Ελέγχουμε ότι το φυσίγγιο του ηλεκτροδίου είναι σωστά τοποθετημένο και ότι το chip selector είναι στην θέση 1 3. Τοποθετούμε την πλακέτα στην υποδοχή προσεκτικά 4. Κλείνουμε το καπάκι (τα ηλεκτρόδια-pins) να εφαρμόζουν στα πηγαδάκια του chips 5. Εμφανίζεται το λογισμικό και υπάρχει ένδειξη chip-icon / instrument coutext Προετοιμασία δειγμάτων για τον υβριδισμό στις μικροσυστοιχίες Πίνακας αντιδραστηρίων Είδος Εταιρία 1. Human chips OneArray 2. Chips chambers OneArray 3. Salmon sperm Invitrogen 4. 20x SSPE GIBCO 5. CyDyes Amersham 6. Formamide SIGMA 7. Amplification / hybridization Kit Ambion 8. RNA Fragmentation reagent Ambion 52

53 Α. Σύνθεση της πρώτης αλυσίδας του cdna με αντίστροφη μεταγραφή (1η ημέρα) Το πρωτόκολλο αναφέρεται σε 4 αντιδράσεις για 2 πλακάκια μικροσυστοιχιών, επιπλέον 5% σφάλματος. Χρειάζονται: θερμικός κυκλοποιητής (συστήνεται) στους 70 ο C, υδατόλουτρο στους 42 ο C Για τη μέγιστη απόδοση της διαδικασίας συστήνεται η χρησιμοποίηση 1000ng RNA/αντίδραση (ελάχιστη ποσότητα: 100ng, μέγιστη ποσότητα: 5000ng). Μέγιστος όγκος διαλύματος RNA που θα χρησιμοποιηθεί: 10μl. Η ποσοτικοποίηση και ο έλεγχος ποιότητας γίνεται με φωτομέτρηση σε UV φωτόμετρο στα 260nm και 280nm. Η σχέση που μετατρέπει την απορρόφηση σε συγκέντρωση RNA είναι η εξής: A 260 X dilution factor X 40 = μg RNA/ml (ή ng/μl) Αναμιγνύουμε RNA και 1 μl T7 Oligo(dT) Primer. Ρυθμίζουμε τον όγκο στα 12 μl με νερό ελεύθερο νουκλεασών. Σε κάθε αντίδραση (από τις τέσσερις) RNA (1000ng) Τελικός όγκος (μl) T7 oligo(dt) Primer 1 Νερό ελεύθερο νουκλεασών (προθερμασμένο) 10 Μέχρι τελικό όγκο μίγματος 12μl Κάνουμε ελαφρύ vortex και spin down στο μίγμα, επωάζουμε για 10 min στους 70οC. Κάνουμε spin down και τοποθετούμε στον πάγο. Σε θερμοκρασία δωματίου προετοιμάζουμε το Reverse Transcription Master Mix Reverse Transcription Master Mix Για 1 αντίδραση Για 4 αντιδράσεις +5% Για 3 αντιδράσεις +5% 10X First Strand Buffer 2 μl 8,4 μl 6,30 μl dntp Mix 4 μl 16,8 μl 12,60 μl RNase Inhibitor 1 μl 4,2 μl 3,15 μl ArrayScript 1 μl 4,2 μl 3,15 μl 53

54 Κάνουμε ήπιο vortex, spin down και τοποθετούμε στον πάγο. Προσθέτουμε 8μl από αυτό το μίγμα σε κάθε αντίδραση από το βήμα 1. Συστατικά για την αντίστροφη μεταγραφή Μίγμα από το 1ο βήμα Reverse Transcription Master Mix Όγκος για κάθε αντίδραση ( Vτελ.=20μl) 12μl 8μl Αναμιγνύουμε καλά με τη βοήθεια της πιπέττας και κατόπιν με ελαφρά χτυπήματα με το δάκτυλο. Κάνουμε spin down. Επωάζουμε για 2h στους 42oC. Κάνουμε spin down και τοποθετούμε στον πάγο. Β. Σύνθεση δεύτερης αλυσίδας του cdna Χρειάζεται θερμικός κυκλοποιητής (συστήνεται) στους 16 o C. Στον πάγο προετοιμάζουμε το Second Strand Master Mix. Second Strand Master Mix (για αντίδραση των 100μl) Για 1 αντίδραση Για 4 αντιδράσεις + 5% Για 3 αντιδράσεις + 5% Nuclease-free Water 63 μl 264,6 μl 198,45 μl 10X Second Strand Buffer 10 μl 42 μl 31,50 μl dntp Mix 4 μl 16,8 μl 12,60 μl DNA Polymerase 2 μl 8,4 μl 6,30 μl RNase H 1 μl 4,2 μl 3,15 μl Κάνουμε ήπιο vortex, spin down και τοποθετούμε στον πάγο. Μεταφέρουμε 80 μl από το μίγμα μας σε κάθε μία από τις αντιδράσεις του προ η- γούμενου βήματος. Συστατικά για την σύνθεση της 2ης αλυσίδας Μίγμα από το 2ο βήμα Second Strand Master Mix Όγκος για κάθε αντίδραση ( Vτελ.= 100μl) 20 μl 80 μl Αναμιγνύουμε καλά με τη βοήθεια της πιπέττας και κατόπιν με ελαφρά χτυπήματα με το δάκτυλο. Κάνουμε spin down. Επωάζουμε για 2h στους 16oC Μετά το πέρας της επώασης, βάζουμε τα δείγματα στον πάγο. Μπορούμε να περ ι- μένουμε μέχρι 24 ώρες στους -20οC. 54

55 Γ. Καθαρισμός cdna Προθερμαίνουμε νερό ελεύθερο νουκλεασών στους o C. Όλες οι φυγοκεντρήσεις γίνονται στις xg σε θερμοκρασία δωματίου. Ελέγχουμε το cdna binding buffer για παρουσία ιζήματος. Προσθέτουμε 250 μl cdna binding buffer σε κάθε αντίδραση από το προηγούμενο βήμα. Αναμιγνύουμε με την πιπέττα, κατόπιν με ελαφρά χτυπήματα με το δάκτυλο και κάνουμε spin down. Μεταφέρουμε όλη την ποσότητα στο κέντρο μίας στήλης και φυγοκεντρούμε x g σε RT για 1min. Απορρίπτουμε το διήθημα. Πλένουμε με 500 μl Wash Buffer Φυγοκεντρούμε x g σε RT για 1min. Απορρίπτουμε το διήθημα. φυγοκεντρούμε x g σε RT για 1min εκ νέου για την απομάκρυνση καταλοίπων του wash buffer. Μεταφέρουμε το cdna filter cartridge σε ένα cdna Elution tube. Προσθέτουμε 9μl προθερμασμένο νερό ελεύθερο νουκλεασών στο κέντρο της στ ή- λης. Αφήνουμε για 2 min σε RT. Φυγοκεντρούμε για 90sec. Επαναλαμβάνουμε τη διαδικασία. Φυλάμε το έκλουσμα στους -20 o C. Μπορούμε να περιμένουμε για 24 ώρες. Δ. In Vitro μεταγραφή για τη σύνθεση τροποποιημένου Άμινο-άλλυλ-aRNA (το βράδυ της 1ης ημέρας) χρειάζεται υβριδοποιήτης στους 37 ο C Σε θερμοκρασία δωματίου προετοιμάζουμε το ακόλουθο μίγμα: Κύριο μίγμα in vitro μεταγραφής (IVT) Για 1 αντίδραση Για 4 αντιδράσεις + 5% Για 3 αντιδράσεις + 5% aautp (50 mm) 3 μl 12,6 μl 9,45 μl ATP, CTP, GTP Mix (25 mm) 12 μl 50,4 μl 37,80 μl UTP Solution (50 mm) 3 μl 12,6 μl 9,45 μl T7 10X Reaction Buffer 4 μl 16,8 μl 12,60 μl T7 Enzyme Mix 4 μl 16,8 μl 12,60 μl Κάνουμε ήπιο vortex, spin down και τοποθετούμε στον πάγο. Προσθέτουμε 26 μl από το IVT Master Mix σε κάθε δείγμα από το βήμα. Αναμιγνύουμε καλά με τη βοήθεια της πιπέττας και κατόπιν με ελαφρά χτυπήματα με το δάκτυλο. Κάνουμε spin down. 55

56 Επωάζουμε για 14h (4-14h) στους 37 o C. Σταματάμε την αντίδραση με 60 μl νερό ελεύθερο νουκλεασών. Κάνουμε ήπιο vortex, spin down. Αποθηκεύουμε στους -20 o C ή προχωράμε στο επόμενο στάδιο. Ε. Καθαρισμός arna Προθερμαίνουμε νερό ελεύθερο νουκλεασών στους o C. Προσθέτουμε 350 μl arna Binding Buffer σε κάθε αντίδραση από το προηγούμενο βήμα. Περνάμε στο επόμενο βήμα αμέσως. μόνο. Προσθέτουμε τα 250 μl της απόλυτης αιθανόλης και αναμιγνύουμε με την πιπέττα Μόλις προσθέσουμε την ποσότητα σε μία αντίδραση, πριν προχωρήσουμε στο ε- πόμενο σωληνάκι, μεταφέρουμε το σύνολο του μίγματος στη στήλη arna filter cartridge. Περνάμε μία-μία τις αντιδράσεις μας μόλις ετοιμαστούν στη στήλη. Φυγοκεντρο ύ- με για 1 min στις xg. Απορρίπτουμε το διήθημα. Προσθέτουμε 650 μl wash buffer και φυγοκεντρούμε για 1 min στις xg. Φυγοκεντρούμε για 1 min στις xg για την απομάκρυνση υπολειμμάτων του wash buffer. Μεταφέρουμε τη στήλη σε νέο arna collection tube. Προσθέτουμε 100 μl προθερμασμένο νερό ελεύθερο νουκλεασών στο κέντρο της στήλης. Αφήνουμε για 2min σε RT. Φυγοκεντρούμε για 1,5 min στις xg. Φωτομετρούμε στα 260nm και αποθηκεύουμε στους -20οC. ΣΤ. Σύζευξη της χρωστικής (2η ημέρα) Υποχρεωτικά από το σημείο αυτό, οι αντιδράσεις θα είναι 4 (2 εξεταστέα δείγματα και 2 ελέγχου). Βγάζουμε τις χρωστικές Cy3 και Cy5 και τις φέρουμε σε θερμοκρασία δωματίου (RT). Αμέσως πριν την χρήση των χρωστικών, προσθέτουμε 11 μl DMSO σε κάθε ένα από τα τέσσερα φιαλίδια χρωστικής (2+2). Κάνουμε Vortex και φυλάμε στο σκοτάδι το π ο- λύ μέχρι 1h. Υπολογίζουμε τον όγκο του διαλύματος που περιέχει 8 μg arna. Τοποθετούμε στο speedvac (οι οδηγίες χρήσης του είναι πάνω στη συσκευή) και αφυδατώνουμε - ξηραίνουμε. Ελέγχουμε τη διαδικασία κάθε 5 min (διαρκεί γύρω στα 15 min). Προσέχουμε να μην ξηραθεί υπερβολικά. ΜΠΟΡΟΥΜΕ ΝΑ ΕΠΩΦΕΛΗΘΟΥΜΕ ΤΗΣ ΑΝΑΜΟΝΗΣ ΚΑΙ ΝΑ ΠΡΟΧΩΡΗΣΟΥΜΕ ΣΤΟ ΒΗΜΑ, ΟΠΟΥ ΑΠΑΙΤΕΙΤΑΙ ΠΡΟΘΕΡΜΑΝΣΗ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΠΛΑΚΩΝ ΤΩΝ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΟΙΧΙΩΝ. 56

57 Επαναδιαλύουμε το ίζημα (ξηραμένο arna) σε 9 μl coupling buffer και κάνουμε ήπιο vortex. Προσθέτουμε 11μl Cy3 σε κάθε δείγμα που εμείς βάζουμε ως δείγμα ελέγχου (control). Προσθέτουμε 11μl Cy5 σε κάθε δείγμα που εμείς βάζουμε ως δείγμα προς εξ έ- ταση. Κάνουμε ήπιο vortex και spin down. Επωάζουμε για 30 min στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου. ΜΠΟΡΟΥΜΕ ΝΑ ΕΠΩΦΕΛΗΘΟΥΜΕ ΤΗΣ ΑΝΑΜΟΝΗΣ ΚΑΙ ΝΑ ΠΡΟΧΩΡΗΣΟΥΜΕ (Ή ΝΑ ΣΥΝΕΧΙΣΟΥΜΕ ΞΑΝΑ) ΣΤΟ ΒΗΜΑ ΤΩΝ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΟΙΧΙΩΝ. Για να σταματήσουμε την αντίδραση προσθέτουμε σε κάθε αντίδραση 4,5 μl Υδρ ο- ξυλαμίνης 4Μ. Κάνουμε ήπιο vortex. Επωάζουμε για 15 min σε RT και στο σκοτάδι. Προσθέτουμε 5,5 μl νερό ελεύθερο νουκλεασών σε κάθε αντίδραση, ώστε ο τελ ι- κός όγκος να έρθει στα 30 μl. Ζ. καθαρισμός του σημασμένου arna επόμενο βήμα. Προθερμαίνουμε νερό ελεύθερο νουκλεασών στους ο C. Όλες οι φυγοκεντρήσεις γίνονται στα x g. Προσθέτουμε 105 μl arna binding buffer σε κάθε δείγμα. Προχωράμε άμεσα στο Προσθέτουμε 75μl απόλυτης αιθανόλης. Ανακατεύουμε ΜΟΝΟ με πιπεττάρισμα (3 φορές). ΔΕΝ κάνουμε ταυτόχρονα όλα τα δείγματα. ΚΑΘΕ δείγμα που ετοιμάζεται πάει στο επόμενο στάδιο ΑΜΕΣΑ. Κάθε δείγμα που ετοιμάζεται από το προηγούμενο βήμα μεταφέρεται άμεσα στη στήλη Labeled arna Filter Cartridge. φυγοκεντρούμε όλες τις στήλες για 1 min στις x g και πετάμε το διήθημα. Προσθέτουμε 500 μl wash buffer και φυγοκεντρούμε για 1 min στις xg. Φ υ- γοκεντρούμε για 1 min στις xg για την απομάκρυνση υπολειμμάτων του wash buffer. Μεταφέρουμε τη στήλη σε νέο Labeled arna Elution Tube. Στο κέντρο της στήλης προσθέτουμε 10μl προθερμασμένο νερό ελεύθερο νουκλ ε- ασών. Αφήνουμε για 2min σε RT. Φυγοκεντρούμε για 1,5 min στις xg. Προσθέτουμε εκ νέου 10μl προθερμασμένο νερό και επαναλαμβάνουμε τη διαδικασία. Αποθηκεύουμε στους 20 C στο σκοτάδι και συνεχίζουμε με την φωτομέτρηση Η. Φωτομετρική ανάλυση της ενσωμάτωσης των μορίων χρωστικής Φωτομετρούμε στα 260nm και υπολογίζουμε τη συγκέντρωση του arna έτσι όπως έχει περιγραφεί. 57

58 A260 X dilution factor X 40 = μg RNA/ml (ή ng/μl) Τα αποτελέσματα είναι ακριβή όταν η απορρόφηση κυμαίνεται μεταξύ 0,1-1,0. Αν χρειαστεί αλλάζουμε την αραίωση του φωτομετρούμενου δείγματος. Συστήνεται επίσης να γίνει φωτομέτρηση και στα μήκη κύματος 550nm για το Cy3 (ε= ) και 650 nm Cy5 (ε= ). Μπορούμε να υπολογίσουμε τα μόρια της χρωστικής που ενσωματώθηκαν στα 1000 nts είτε με online εργαλείο είτε με τον τύπο: # μορίων χρωστικής Α = χρωστικής 9010 cm -1 M -1 Χ Χ νουκλεοτίδια Α 260 Συντελεστής απόσβεσης χρωστικής (ε) Το προσδοκώμενο αποτέλεσμα είναι μόρια χρωστικής στα 1000 νουκλεοτίδια. Για τα επόμενα βήματα θα χρειαστεί 1-5 μg ποσότητα σημασμένου arna. Εμείς θα δουλέψουμε με 2 μg. Αυτή η ποσότητα θέλουμε να αντιστοιχεί το πολύ σε 9μl όγκο δι α- λύματος σημασμένου arna. Αν χρειαστεί συμπυκνώνουμε το διάλυμα με αφαίρεση νερού στο speedvac. Σε αυτή την περίπτωση καλύπτουμε με αλουμινόχαρτο τη διάφανη θύρα. Θ. Προ-υβριδοποίηση της μικροσυστοιχίας Χρησιμεύει στην βελτιστοποίηση της απόδοσης και στη μείωση του θορύβου. Θα χρειαστούν δύο υδατόλουτρα: ένα στους 42 ο C και ένα 60 o C. Προθερμαίνουμε το pre-hybridization solution (5X SSPE, 0,1%SDS, 1%BSA) στους 42οC. Προτιμάται είναι να είναι φρέσκο. Προθερμαίνουμε τα πλακάκια για 10 min στους 60oC στην πλαστική τους θήκη ως έχουν στο υδατόλουτρο (συστήνεται σε πλάκα υβριδισμού). Τα μεταφέρουμε σε άλλη πλαστική θήκη, στις εξωτερικές θέσεις, που περιέ χει α- πόλυτη αιθανόλη σε θερμοκρασία δωματίου. Τα αφήνουμε για 15 sec. Τα ανακινούμε έντονα με το χέρι για 20 sec (το πρωτόκολλο αναφέρει 1-2min). Αφαιρούμε τα πλακάκια από τη θήκη και ξεπλένουμε την επιφάνεια προσεκτικά με ddh2o ώστε να απομακρυνθεί η αλκοόλη. Μεταφέρουμε αργά και προσεκτικά τα πλακάκια σε θήκη που περιέχει 35ml πρ ο- θερμασμένου pre-hybridization solution (5X SSPE, 0,1%SDS, 1%BSA). Κάνουμε επώαση για 2h στους 42οC. ΣΤΗ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΤΗΣ ΕΠΩΑΣΗΣ ΣΥΝΕΧΙΖΟΥΜΕ ΣΤΑ ΠΡΟΗΓΟΥΜΕΝΑ ΒΗΜΑΤΑ ΠΟΥ Α- ΠΟΜΕΝΟΥΝ. ΣΤΟ ΧΡΟΝΟ ΠΟΥ ΑΠΟΜΕΝΕΙ ΠΡΟΧΩΡΑΜΕ ΣΤΗΝ ΕΠΟΜΕΝΗ ΕΝΟΤΗΤΑ ΚΑΙ ΣΤΟ ΕΠΟΜΕΝΟ ΒΗΜΑ. Στο πέρας της επώασης, βγάζουμε τα πλακάκια από την θήκη και τα ξεπλένουμε προσεκτικά με ddh2o (σε RT) για 1-2min. Στεγνώνουμε τα πλακάκια με spin ή φυγοκέντρηση για 3-4 min στα rpm. Τα πλακάκια πρέπει να χρησιμοποιηθούν μέσα σε μια ώρα. 58

59 Ξεκολλάμε τα chambers από τη ζελατίνα τους και τα κολλάμε προσεκτικά στα πλ α- κάκια. Τοποθετούμε τα πλακάκια στον υβριδοποιητή με την ετικέτα στην επάνω πλευρά και προς τα εμάς. Καλύπτουμε με αλουμινόχαρτο και τα διατηρούμε στους 42οC. Ι. Προετοιμασία υβριδοποίησης Προετοιμάζουμε τα διαλύματα έτσι όπως περιγράφονται στο εγχειρίδιο της OneArray Έχουμε 9 μl διαλύματος arna που περιέχουν 2 μg arna Προσθέτουμε 1μl 10X Fragmentation Reagent. Επώαση για 15 min στους 70oC. Προσθέτουμε 1 μl stop solution και κάνουμε μίξη με την πιπέττα. Προσθέτουμε 23μl νερό ελεύθερο νουκλεασών ώστε ο τελικός όγκος να είναι 34μL προθερμαίνουμε το 1,5x hybridization buffer + formamide για 10min στους 42oC. Προετοιμάζουμε το μίγμα υβριδισμού: Μίγμα υβριδισμού Labeled arna 34 μl 1,5x hybridization buffer + formamide 74 μl Sheared salmon sperm DNA (10 μg/μl) 2 μl Ενώνουμε τα μίγματα του δείγματος ελέγχου και το εξεταζόμενου (κάνουμε pool) για τελικό όγκο 220μl. Φυγοκεντρούμε για 3min στις 2000rpm. Μεταφέρουμε 200μl σε σωληνάρια PCR. Κάνουμε επώαση στους 95οC για 5 min σε θερμικό κυκλοποιητή. Κατεβάζουμε τη θερμοκρασία στους 60οC και αφήνουμε για 2-3 min ή έως ότου πιπετάρουμε το μίγμα στο πλακάκι. ΙΑ. Πλήρωση διαμερίσματος υβριδοποίησης της μικροσυστοιχίας Γεμίζουμε υπό κλίση το πλακάκι, από την πλευρά του γραμμωτού κώδικα. Μόλις γεμίσει ο διάμεσος χώρος, κλείνουμε την μία οπή με το αυτοκόλλητο και με τη βοήθεια λαβίδας. Προσπαθούμε να αφαιρέσουμε τυχό ν φυσαλίδες ή να τις περιορίσουμε στην περιφέρεια. Μόλις το καταφέρουμε σφραγίζουμε και την δεύτερη οπή. Τοποθετούμε τις μικροσυστοιχίες στον υβριδοποιητή στους 42οC για 15 h. Η περιστροφή βελτιώνει το σήμα. 59

60 ΙΒ. Πλύσιμο υβριδοποιημένης μικροσυστοιχίας Τοποθετούμε τα πλακάκια (ένα τη φορά) από τον υβριδοποιητή και τα τοποθετο ύ- με σε ένα μεγάλο «μπανάκι» (γυάλινο τρυβλίο). Το γεμίζουμε με προθερμασμένο στους 42οC διάλυμα 2x SSPE, 0,1% SDS solution. Προσπαθούμε να ξεκολλήσουμε το chamber από την επιφάνεια. Ξεπλένουμε το πλακάκι πάρα πολύ καλά. Οι μετακινήσεις των πλακιδίων από υγρό σε υγρό, όπως περιγράφεται εν συνεχεία θα πρέπει να γίνονται γρήγορα. Τοποθετούμε το πλακάκι στην πλαστική θήκη που περιέχει το ίδιο προθερμασμένο διάλυμα. Το αναδεύουμε για 5 min με το χέρι σε υδατόλουτρο θερμοκρασίας 42οC. Μεταφέρουμε το πλακάκι σε άλλη θήκη που περιέχει 0,1x SSPE, 0,1% SDS και το ανακινούμε για 5 min με το χέρι σε θερμοκρασία δωματίου Ξεπλένουμε τα πλακάκια με ddh2o. Τα στεγνώνουμε με φυγοκέντρηση (ή με spin) όπως έ χει περιγραφεί προηγουμένως. Μέχρι τη σάρωση, τα πλακάκια τα φυλάμε στο σκοτάδι. Σάρωση πλακιδίων μικροσυστοιχιών Ανοίγουμε τον σαρωτή (Perkin Elmer, ScanArray Express) και τον υπολογιστή. Ανοίγουμε το λογισμικό ScanArray Express. Από το κουμπί configuration επιλέγουμε το Quantitation και ενεργοποιούμε την διεπαφή του λογισμικού (Scan layout) που εμφανίζει τη δυνατότητα (το κουμπί) σάρωσης (Scan). Πατάμε στα κουμπιά των laser 1 & 3 (635 & 532 nm αντίστοιχα) προκειμένου να ξεκινήσει η προθέρμανση η οποία διαρκεί δέκα έως είκοσι λεπτά της ώρας. Κάνουμε τις εξής ρυθμίσεις: PMT στα 630 και 590 V, minimum diameter 80%, max diameter 150%, CPI threshold 100. Όταν η συσκευή είναι έτοιμη, βάζουμε το πλακάκι με την ετικέτα του γραμμωτού κώδικα να είναι προς τα πάνω και προς τα έξω. Το πλακάκι δεν μπαίνει όλο μες στην πτυχή της συσκευής που είναι πάνω από το μεταλλικό έλασμα. Το επόμενο βήμα είναι να πατήσουμε το κουμπί Scan (το οποίο πριν την είσοδο του πλακιδίου της μικροσυστοιχίας ήταν ανενεργό και μη διαθέσιμο προς επιλογή). Η συσκευή αμέσως μετά έλκει το πλακάκι εσωτερικά εντελώς και αρχίζει να το σαρώνει. Επί της οθόνης φαίνονται στιγμιότυπα της σαρωμένης επιφάνειας για το κάθε μήκος κύματος (της κάθε φθορίζουσας χρωστικής). Με την ολοκλήρωσης της σάρωσης πατάμε 60

61 File, Save all, επιλέγουμε φάκελο προορισμού και κατόπιν επιλέγουμε all files και save. Ποσοτικοποίηση του σήματος (Quantitation) Κατά την ποσοτικοποίηση του σήματος η ένταση του φθοριοχρώματος σε κάθε κηλίδα μετατρέπεται σε αριθμό. Επίσης γίνεται αντιστοίχηση της κάθε κηλίδας σε συγκεκριμένο γονίδιο ή νουκλεοτιδική αλληλουχία ελέγχου ή σημείο οριοθέτησης. Για να συμβεί αυτό χρησιμοποιείται ένα αρχείο (ΗΟΑ5) με επέκταση.gal ( που έχει όλες τις απαραίτητες πληροφορίες σε μορφή csv. Ε- πιλέγουμε το Easy Quantitation και ρυθμίζουμε το πλέγμα των γονιδίων να συμπίπτει με τα όρια της μικροσυστοιχίας. Πραγματοποιούμε τις απαραίτητες ρυθμίσεις στο πλέγμα: διάταση, συρρίκνωση, περιστροφή καθώς και προσαρμογή στις κηλίδες όπου χρειάζεται. Η μετακίνηση των κηλίδων είναι μάλλον απαραίτητη γιατί οι μικροσυστοιχίες της OneArray που χρησιμοποιήσαμε έχουν κατασκευασθεί με τη μέθοδο της εκτύπωσης των ολιγονουκλεοτιδίων (50-60 νουκλεοτίδια). Αυτό συνεπάγεται, όπως διαπιστώθηκε εξάλλου, μικρές αποκλίσεις των κηλίδων από τις συντεταγμένες που κανονικά θα έπρεπε να βρίσκονται οι κηλίδες αυτές στην πλάκα της μικροσυστοιχίας. Όταν είμαστε έτοιμοι από την τακτοποίηση του πλέγματος, πατάμε το κουμπί quantitate να ξεκινήσει η διαδικασία. Αποτέλεσμα είναι να πάρουμε ένα αρχείο csv ή gpr που περιέχει πλήθος πληροφορίες για την ένταση του κάθε φθοριοχρώματος, την ένταση του σήματος θορύβου, τις αναλογίες εκπομπής κάθε φθοριοχρώματος και πλήθος στατιστικών παραμέτρων. Εικόνα 15. Εικόνα από την οθόνη του υπολογιστή που παρουσιάζει το πλέγμα και τα εργαλεία που υπάρχουν διαθέσιμα για την καλύτερη ταύτιση του πλέγματος πάνω στα σημεία που οριοθετούν την περιοχή των γονιδίων. 61

62 Επεξεργασία των δεδομένων με την ομάδα προγραμμάτων της ΤΜ4 Αλλαγή του τύπου αρχείου σε συμβατή μορφή Τα προγράμματα της ομάδας λογισμικού ΤΜ4 αναγνωρίζουν συγκεκριμένους τύπους αρχείων. Για το λόγο αυτό υπάρχει το πρόγραμμα Express Converter που μετατρέπει αρχεία διαφορετικής διαμόρφωσης σε συμβατού φορμάτ αρχεία (.mev). Παράλληλα δημιουργεί ένα επιπλέον αρχείο με συνοδευτικές πληροφορίες (annotation file) με κατάληξη.ann. Εικόνα 16. Απεικόνιση διεπαφής του προγράμματος ExpressConverter για τη μετατροπή του αρχείου δεδομένων σε συμβατή μορφή (mev file). Επεξεργασία δεδομένων με το TIGR MIDAS Τα αρχικά, μη επεξεργασμένα δεδομένα (raw data) έχουν «ενσωματωμένα» στις τιμές τους σφάλματα συστηματικά ή και τυχαία. Παράδειγμα, οι τιμές της έ- ντασης ενός φθοριοχρώματος σε συγκεκριμένα σημεία (κηλίδες-σποτς) εξαρτάται, εκτός από το βαθμό που εκφράζεται το γονίδιο αυτό, από το ποσοστό των μορίων χρωστικής που έχουν συνδεθεί με τα τροποποιημένα μόρια arna, από το ποσοστό του μη ειδικού υβριδισμού, από το μοριακό συντελεστή εκπομπής του κάθε είδους χρωστικής. Αυτού του είδους τα σφάλματα αντιμετωπίζονται με τη χρήση αλγορίθμων ή αλλιώς φίλτρων που εξομαλύνουν ή κανονικοποιούν τα δεδομένα. Το φίλτρο που χρησιμοποιείται περισσότερο στην κανονικοποίηση των δεδομένων από τη χρήση μικροσυστοιχιών, όπως φαίνεται στη βιβλιογραφία, είναι το φίλτρο Lowess. Λει- 62

63 τουργεί ως εξής: ξεκινά με ένα «παράθυρο», μια ομάδα δεδομένων και προσπαθεί να σχηματίσει την καλύτερη δυνατή ευθεία. Αμέσως μετά μετακινείται μερικώς αυτό το παράθυρο» σχηματίζοντας καινούρια ομάδα δεδομένων με το μεγαλύτερο κομμάτι να προέρχεται από την προηγούμενη ομάδα. Μια καινούρια ευθεία σχηματίζεται που εκφράζει αυτά τα μερικά δεδομένα. Στο τέλος από τη σύνθεση των ευθειών αυτών γίνεται η άριστη προσαρμογή των δεδομένων σε νέα κλίμακα που είναι πλησιέστερη στην αληθή. Α. Β. Γ. Εικόνα 17. Διαδοχικά στιγμιότυπα της διεπαφής του προγράμματος TIGR Midas. Α. Απεικόνιση διεπαφής του προγράμματος TIGR Midas. Αριστερά φαίνεται σχηματικά η ροή εργασιών που ακολουθήθηκε. Β. Το παράθυρο των παραμέτρων του TIGR με τις συνήθεις ρυθμίσεις. Γ. Το παράθυρο από το οποίο επιλέγεται το αρχείο mev που πρόκειται να επεξεργασθεί. 63

64 Στο πρόγραμμα TIGR Midas σχεδιάζουμε τα βήματα ως εξής: Read Data / Single Data File, Operations / Locfit Normalization (Lowess), Reports (μαρκάρισμα σεtxt report & PDF report), Write Data / Write, Tools/ Set all Parameters. Set all parameters: Data file: το όνομα αρχείου, one bad channel: επιλέγουμε generous ή και stringent όταν θέλουμε να αυστηροποιήσουμε τα κριτήρια επιλογής των έγκυρων κηλίδων. Μαρκάρουμε τα επόμενα κουτάκια που αναφέρονται στα flags. Mode: block, smoothing parameter: 0.33, reference: Cy3. Μόλις ολοκληρωθούν οι ρυθμίσεις πατάμε στο κουμπί Execution ώστε να πραγματοποιηθεί η ανάλυση. Το αρχείο που προκύπτει έχει την κατάληξη _MDS.mev. Ανάλυση επεξεργασμένων δεδομένων με το πρόγραμμα MeV-Multi Experiment Viewer Τα νέα δεδομένα που προέκυψαν από το πρόγραμμα TIGR επεξεργάζονται στο πρόγραμμα MeV. Το συγκεκριμένο πρόγραμμα περιέχει ένα πλήθος αλγορίθμων και εργαλείων για την στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων, την ομαδοποίηση σε δενδρογράμματα, την οπτικοποίηση των αποτελεσμάτων και πολλά άλλα. Φορτώνουμε όλα τα δεδομένα ως εξής: File/ Load Data/ Select File Loader/ TIGR files/ mev Files. Επιλέγουμε τα αρχεία _MDS.mev, το αντίστοιχο αρχείο ann και επιλέγουμε να φορτωθούν οι τιμές median. Μόλις ολοκληρωθεί η φόρτωση των δεδομένων από όλα τα πλακάκια, τότε επιλέγουμε από τη λίστα Statistics την επιλογή Rank Products (RP). Το τεστ RP είναι μια απλή και γρήγορη μη παραμετρική στατιστική μέθοδο που βρίσκει εφαρμογή σε πειράματα που περιέχουν ανάλυση προφίλ έκφρασης, με σκοπό να αναδειχθούν σημαντικές διαφορές στην έκφραση. Η επεξεργασία των δεδομένων έγινε χωρίζοντας τα πλακάκια σε δύο ομάδες ανάλογα με τη φαρμακευτική ουσία (two class unpaired) οπότε προέκυψαν τρεις λίστες γονιδίων με σημαντικώς θετικά, σημαντικώς αρνητικά γονίδια καθώς και τα μη σημαντικά γονίδια. Το επίπεδο σημαντικότητας ορίσθηκε στο 99%. 64

65 Α Β Γ Δ Εικόνα 18. Διαδοχικά στιγμιότυπα της διεπαφής του προγράμματος MeV. Α. Αρχική οθόνη του προγράμματος MeV και το μενού φόρτωσης αρχείων. Β. Η οθόνη εισαγωγής των αρχείων και των παραμέτρων που χρειάζονται. Εισάγονται ταυτόχρονα τα αρχεία με κατάληξη _MDS.mev και το αντίστοιχό του ann. Γ. Φαίνεται το μενού των επιλογών της στατιστικής επεξεργασίας των δεδομένων και τμήμα από την χρωματική έκφραση των γονιδίων σε κάθε μικροσυστοιχία (heatmap). ΔΤο μενού με το οποίο διαμορφώνεται το είδος της ανάλυσης που πραγματοποιείται (two class unpaired), με επίπεδο σημαντικότητας 99%. Επιλογή γονιδίων για επιβεβαίωση αποτελεσμάτων και βασικών βιολογικών διεργασιών Τα αποτελέσματα που παρήχθησαν από την επεξεργασία των αρχικών δεδομένων από τις μικροσυστοιχίες είχαν την μορφή πινάκων γονιδίων που χώριζαν τα γονίδια σε δύο ομάδες ενδιαφέροντος: σε αυτά που ρυθμίζονταν θετικά σε στατιστικά σημαντικό βαθμό και αυτά που ρυθμίζονταν αρνητικά σε στατιστικά σημαντικό βαθμό. Προκειμένου να ελεχθεί η μεθοδολογία που ακολουθήθηκε, δειγματοληπτικά σε κάποια γονίδια που συμμετέχουν σε βασικές βιολογικές διεργασίες εφαρμόστηκε real-time PCR προς επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων. 65

66 Από τις λίστες των γονιδίων που προέκυψαν, έγινε αναζήτηση πληροφοριών για τα γονίδια που καταλάμβαναν τις πρώτες θέσεις σε κάθε κατηγορία. Χρησιμοποιήθηκε η βάση δεδομένων GENE του NCBI ώστε να επιλεγούν κάποια γονίδια για περαιτέρω επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων των μικροσυστοιχιών. Υπήρχε σαφής προσανατολισμός στην αναζήτηση γονιδίων που πιθανά να εμπλέκονται στην παθογένεση ή στην εξέλιξη της ψωρίασης, σε μεταβολικά μονοπάτια, μονοπάτια ελεγχόμενου κυτταρικού θανάτου, σηματοδοτικά μονοπάτια, συστατικά της πρωτεϊνοσυνθετικής μηχανής. Τελικά επιλέχθηκαν 34 γονίδια από αυτές τις λίστες. Προστέθηκαν 22 επιπλέον γονίδια στα οποία εφαρμόστηκε real-time PCR προκειμένου να εξεταστεί πως συγκεκριμένες βιολογικές διεργασίες επηρεάζονται από τη δράση των φαρμάκων. Σε αυτά τα γονίδια συμπεριλήφθηκαν οι υποδοχείς των ρετινοειδών, παράγοντες έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης, ο υποδοχέας της ι- ντερλευκίνης 23, κάποια γονίδια της ριβουνεκλεάσης Ρ, οι συνθάσες της τυροσίνης και της λυσίνης, ο γενετικός τόπος PSORS 1. Τα γονίδια και οι εκκινητές που επιλέχθηκαν με τη χρήση του προγράμματος Primer Designer του NCBI καταγράφονται σε πίνακα στο παράρτημα. Σχεδιασμός εκκινητών και προετοιμασία των διαλυμάτων εργασίας Ο σχεδιασμός των εκκινητών έγινε με το πρόγραμμα Primer Designer που βρίσκεται ελεύθερα διαθέσιμο προς χρήση στην αρχική σελίδα του NCBI. Κατά το σχεδιασμό τηρήθηκαν κάποια κριτήρια. Καταρχήν οι εκκινητές έπρεπε να είναι ειδικοί για το κάθε γονίδιο. Αν υπήρχαν αρκετές ισομορφές ενός γονιδίου, επιλέχθηκαν εκείνοι οι εκκινητές που ενίσχυαν όσες περισσότερες ήταν εφικτό. Οι εκκινητές έ- πρεπε να μην είναι συμπληρωματικοί και να μην διμερίζονται μεταξύ τους. Δόθηκε σημασία όλοι οι εκκινητές να έχουν παραπλήσιο t m και t a, να υβριδίζουν σε διαφορετικά εξόνια ώστε να διαπιστωθεί αν υπάρξει επιμόλυνση με DNA, να μην έχουν διαδοχικά GCs στο 3 άκρο και τέλος το ενισχυόμενο προϊόν να έχει μέγεθος γύρω στα 200nt. Οι εκκινητές (Invitrogen) πριν τη χρήση τους αναδιαλύονται με υπερκάθαρο νερό σε συγκέντρωση 100mM (πρότυπο διάλυμα-stock). Οι υπολογισμοί γίνονται 66

67 για τον κάθε εκκινητή ξεχωριστά βάσει της ποσότητας που περιέχεται σε κάθε φιαλίδιο. Απαραίτητο είναι να μελετηθεί το φυλάδιο που συνοδεύει τους εκκινητές, το οποίο αναφέρει λεπτομερώς την ποσότητα, την καθαρότητα και λοιπές πληροφορίες για κάθε εκκινητή ξεχωριστά. Από το πρότυπο αυτό διάλυμα παρασκευάστηκε διάλυμα εργασίας σε τελική συγκέντρωση 10mM. Αυτό έγινε ως εξής: 50μl από το πρότυπο διάλυμα προστέθηκαν σε 450μl υπερκάθαρου νερού. Τα φιαλίδια επισημάνθηκαν με τα στοιχεία του κάθε εκκινητή. Real-time PCR Θερμικός κυκλοποιητής: Agilent, Stratagene Mx3000P Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QRT-PCR Master Mix της Agilent Προετοιμασία συσκευής Ανοίγουμε αρχικά τον υπολογιστή και κατόπιν τον κυκλοποιητή. Περιμένουμε λιγάκι και συνδέουμε το κυκλοποιητή μέσω USB θύρας στον Η/Υ. Ανοίγουμε το λογισμικό MxPro. Επιλέγουμε τη δεύτερη διαθέσιμη επιλογή: Comperative Quantitation (Calibrator). Περιμένουμε να ζεσταθεί η λάμπα. Εν τω μεταξύ ετοιμάζουμε τις αντιδράσεις. Πρωτόκολλο (βάσει του ηλεκτρονικού εγχειριδίου της Agilent) Προετοιμάζουμε την χρωστική αναφοράς (Reference dye) στην ενδεδειγμένη αραίωση για τη συσκευή που διαθέτουμε 1:500. Με τη σειρά και στον πάγο βάζουμε τα ακόλουθα συστατικά: Πίνακας 4. Συστατικά και ποσότητες για την πραγματοποίηση real time PCR για μία ή για δώδεκα αντιδράσεις Για 1 αντίδραση Για 12 αντιδράσεις Νερό ελεύθερο νουκλεασών Έως Vτελικό=20μl Έως Vτελικό=240μl 2Χ Master Mix SYBR Green 10 μl 120 μl 100mM DTT 0.2 μl 2.4 μl Diluted reference dye 0.3 μl 3.6 μl Total RNA 10ng 120ng Διαμοιράζουμε από 17,4 μl στα NO RT βοθρία της πλάκας PCR RT/RNase Block 1 μl 11 μl Διαμοιράζουμε από 18,4 μl σε κάθε βοθρίο (εκτός τα NO RT) 10mM Primers mix (F:R, 1:1) 1,6 μl σε κάθε βοθρίο Προσθέτουμε 1μl νερό στα NO RT βοθρία 67

68 No RT Normalizer Actin b Προσέχουμε να μη δημιουργήσουμε φυσαλίδες στα πηγαδάκια της PCR. Κλείνουμε καλά τα καπάκια, ώστε να εφαρμόζουν πλήρως και σωστά. Προαιρετικά φυγοκεντρούμε. Το γενικό σχέδιο διαμοιρασμού στην πλάκα PCR είναι το ακόλουθο: A B C D E F G H Calibrator (drugs free HaCaT RNA) γονίδια προς έλεγχο (Unknown) Εικόνα 19. Σχέδιο φόρτωσης αντιδράσεων real time PCR. Τα γονίδια ελέχθησαν εις διπλούν. Οι σειρές (Α,Β κτλ) αντιστοιχούσαν σε πειραματικές συνθήκες (φάρμακα). Οι στήλες (1,2,3 κτλ) έχουν ως μεταβλητή τα γονίδια. Η στήλη NO RT περιέχει αντιδράσεις που δεν έχουν αντίστροφη μεταγραφάση προκειμένου να διαπιστώσουμε επιμόλυνση από DNA. Η στήλη normalizer περιέχει εκκινητές για το γονίδιο της ακτίνης β που εκφράζεται διαρκώς (housekeeping gene). Χρησιμοποιείται για να εξομαλυνθούν μικροδιαφορές στην ποσότητα του RNA που προστέθηκε στο κάθε βοθρίο. Η γραμμή calibrator περιέχει ολικό RNA από κύτταρα στα οποία δεν χορηγήθηκε καμιά φαρμακευτική ουσία. Τα αποτελέσματα των μεταβλητών (των γονιδίων σε κάθε πειραματική συνθήκη) θα εκφράζονται σε σύγκριση με τα αποτελέσματα των βοθρίων calibrators. Προγραμματισμός MxPro Τοποθετούμε την πλάκα PCR στον κυκλοποιητή και ορίζουμε να διαβάσει τα φθοριοχρώματα SYBR Green και ROX ως φθοριόχρωμα αναφοράς. Επιλέγουμε την πρώτη στήλη και την ορίζουμε ως ΝΟ RT. Επιλέγουμε τα κελιά της δεύτερης στήλης και την ορίζουμε ως normaliser. Τα κελιά της πρώτης γραμμής τα ορίζουμε ως calibrator. Τα υπόλοιπα βοθρία τα δηλώνουμε ως άγνωστα (unknown). Ονοματίζουμε τα κελιά του πλέγματος που παριστάνουν τα βοθρία της πλάκας PCR με το γονίδιο για το οποίο έχουμε φορτώσει τους εκκινητές. Δηλώνουμε αν επιθυμούμε τα ζεύγη των γονιδίων (duplicates). Το σημαντικότερο σε αυτή τη διαδικασία είναι 68

69 να δηλώσουμε να διαβάσει τα δύο φθοριοχρώματα καθώς ο προγραμματισμός μπορεί να ακολουθήσει της ενίσχυσης των γονιδίων. Ακολούθως διαμορφώνουμε το πρόγραμμα του θερμικού κυκλοποιητή. Βάσει των οδηγιών για τη συσκευή Stratagene Mx3000P διαμορφώνουμε το ακόλουθο πρόγραμμα: Πίνακας 5. Θερμοκρασίες και χρόνοι για την πραγματοποίηση των αντιδράσεων real time PCR στη συσκευή Stratagene Mx3000P. Κύκλοι Διάρκεια Θερμοκρασία o C 1 10min 50 o C 1 3min 95 o C 40 30sec 95 o C 30sec 60 o C Ανάγνωση σήματος στο πέρας κάθε κύκλου Καμπύλη αποδιάταξης. 1min 95 o C Ανάγνωση σήματος ανά βαθμό 30sec 55 o C o C 30sec 95 o C 30sec 25 o C Ζητάμε επιπλέον να σχηματισθεί η καμπύλη αποδιάταξης των προϊόντων της PCR προκειμένου να διαπιστώσουμε την ποιότητα της ενίσχυσης. Το επόμενο βήμα είναι να πατήσουμε RUN προκειμένου να τρέξει η ανάλυση. Το πρόγραμμα ζητάει να ορίσουμε που θα αποθηκευτεί η ανάλυση του σήματος, επιλέγουμε και αμέσως μετά ξεκινάει η διαδικασία. Α Εικόνα 20. Α. Προγραμματισμένη πλάκα PCR πριν την ενίσχυση των RNAs. Β. Το θερμικό προφίλ όπως παρουσιάζεται από το λογισμικό του κυκλοποιητή. οι χρόνοι και οι θερμοκρασίες που φαίνονται στο διάγραμμα αναφέρονται στον πίνακα που προηγείται. Β 69

70 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Επίδραση του DMSO στις κυτταροκαλλιέργειες Στην δοκιμασία της τοξικότητας προσδιορίσθηκε η επί τοις εκατό (%) βιωσιμότητα και η σχετική επί τοις εκατό (%) βιωσιμότητα. Πίνακας 6. Οι σχέσεις που δίνουν την % βιωσιμότητα των κυττάρων και την % σχετική βιωσιμότητα. % βιωσιμότητα = Ζώντα κύτταρα Ζώντα και νεκρά κύτταρα Χ 100 % σχετική βιωσιμότητα = % βιωσιμότητα συγκεκριμένης σειράς κυττάρων % βιωσιμότητα κυττάρων ελέγχου Χ 100 Παρατηρήθηκε ότι η τοξικότητα του διμέθυλ-σουλφοξειδίου ήταν χρονοεξαρτώμενη και ανάλογα την περίπτωση, δοσοεξαρτώμενη ή μη. Συγκεκριμένα, τα επίπεδα βιωσιμότητας των κυττάρων HaCaT στις 12 ώρες μετά την χορήγηση του DMSO, ήταν στο ίδιο ποσοστό ανεξάρτητα με τη δόση που εφαρμόσθηκε στις καλλιέργειες. Αντίθετα, τα ποσοστά επιβίωσης των κυττάρων HaCaT στις 24 ώρες μετά την εφαρμογή διαβαθμισμένων δόσεων DMSO, είναι αντιστρόφως ανάλογα της δόσης. Στην τελευταία περίπτωση το ποσοστό βιωσιμότητας των κυττάρων στη δόση 0,1% είναι παραπλήσια των κυττάρων που δεν εφαρμόσθηκε DMSO, παραπλήσια επίσης είναι τα ποσοστά βιωσιμότητας στις δόσεις 0,5% και 1% καθώς και στις δόσεις 5% και 10%. Βάσει αυτών των αποτελεσμάτων, στο επόμενο βήμα της πειραματικής διαδικασίας που είναι η δοκιμασία τοξικότητας στα ρετινοειδή, οι φαρμακευτικές ουσίες που θα εφαρμοσθούν στα κύτταρα HaCaT θα είναι διαλυμένες σε DMSO τελικής συγκέντρωσης 0,1%. 70

71 % σχετική βιωσομότητα % Βιωσιμότητα των κυττάρων 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Δοκιμασία τοξικότητας στο DMSO 0,00% 0,10% 0,50% 1,00% 5,00% 10,00% 12h 63,15% 63,40% 71,15% 61,36% 65,38% 62,37% 24h 56,81% 61,29% 47,72% 48,11% 22,22% 23,80% % Συγκέντρωση DMSO Διάγραμμα 7. Δοκιμασία τοξικότητας διαβαθμισμένων δόσεων του DMSO σε κύτταρα HaCaT στις 12 και 24 ώρες μετά την εφαρμογή της ουσίας. Ο προσδιορισμός της % βιωσιμότητας των κυττάρων έγινε με τη μικροσκόπηση των κυττάρων σε αιμοκυττόμετρο μετά από χρώση Trypan Blue. Τα ζώντα κύτταρα δεν χρωματίζονται, ενώ τα νεκρά και όσα έχουν υποστεί βλάβες εμφανίζονται με μπλε χρώμα. Παρουσιάζεται η επί τοις εκατό βιωσιμότητα των κυττάρων με ±10% σφάλμα. 120% % σχετική βιωσιμότητα κυττάρων στην εφαρμογή DMSO 100% 80% 60% 40% 20% 0% 12h 24h Διαβαθμισμένη δόση DMSO σε 12 και 24 ώρες 0,00% 0,10% 0,50% 1,00% 5,00% 10,00% Διάγραμμα 8. Η επί τοις εκατό σχετική βιωσιμότητα κυττάρων HaCaT 12 και 24 ώρες μετά την εφαρμογή διαβαθμισμένων δόσεων DMSO στο θρεπτικό υλικό των κυτταροκαλλιεργειών. Ο προσδιορισμός έγινε με τη μέτρηση κυττάρων χρωσμένων με Trypan Blue σε αιμοκυττόμετρο. Η αναγωγή έγινε έναντι του ποσοστού βιωσιμότητας των κυττάρων της καλλιέργειας ελέγχου. 71

72 % βιωσιμότητα Επίδραση των φαρμακευτικών ουσιών all-trans-retinoic Acid (ATRA), Acitretin στα κύτταρα Η εφαρμογή διαβαθμισμένων δόσεων all-trans-ρετινοϊκού οξέος και Acitretin είχε διαφορετικά αποτελέσματα στην επιβίωση των κυττάρων. Πιο συγκεκριμένα, η επίδραση του ATRA στη βιωσιμότητα των κυττάρων ήταν ηπιότερη συγκριτικά, με μικρή ελάττωση του ποσοστού βιωσιμότητας όσο αύξανε η συγκέντρωση του. Το ποσοστό επιβίωσης έπεφτε στο 50% (LD50) όταν η τελική συγκέντρωση του ATRA ήταν 10-4 Μ. Αντιθέτως η LD50 της φαρμακευτικής ουσίας Acitretin παρουσιαζόταν σε μικρότερη δόση ( Μ). Ενδιαφέρον σημείο στην καμπύλη του ATRA ήταν η αυξημένη ελάττωση της βιωσιμότητας που παρατηρήθηκε στη συγκέντρωση 10-8 Μ συγκριτικά με τα κύτταρα ελέγχου και τα κύτταρα στα οποία ε- φαρμόσθηκαν δόσεις μεγαλύτερες ( Μ). Στα επόμενα πειραματικά βήματα θα εφαρμοσθεί η δόση 10-8 Μ στην οποία υπάρχει εμφανώς κάποιο βιολογικό αποτέλεσμα από τη δράση των φαρμακευτικών ουσιών καθώς και η δόση 10-6 Μ που προσεγγίζει κατά περίπτωση την LD50 αλλά σε καμιά περίπτωση δεν τη ξεπερνά. 100,0% 80,0% % βιωσιμότητα κυττάρων HaCaT 60,0% 40,0% 20,0% 0,0% 0,00 10^-8 10^-7 10^-6 10^-5 10^-4 ATRA 82,3% 61,8% 76,4% 75,0% 66,7% 41,1% Acitretin 64,5% 56,5% 39,1% 36,1% 36,2% 33,9% Δόση φαρμάκου (Μ) Διάγραμμα 9. Η % βιωσιμότητα των κυττάρων HaCaT μετά από εφαρμογή διαβαθμισμένων δόσεων all-trans-ρετινοϊκού οξέος και Acitretin. Η γραμμη τάσης καταδεικνύει ότι οι δύο φαρμακευτικές ουσίες εμφανίζουν διαφορετική καμπύλη τοξικότητας. 72

73 % σχετική βιωσιμότητα % σχετική βιωσιμότητα κυττάρων HaCaT 100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0% ATRA Διαβάθμιση δόσεων (Μ) Acitretin 0,00 10^-8 10^-7 10^-6 10^-5 10^-4 Διάγραμμα 10. Η % σχετική βιωσιμότητα κυττάρων HaCaT μετά την εφαρμογή του ATRA ή του Acitretin σε διαβαθμισμένες δόσεις στο θρεπτικό υλικό των κυτταροκαλλιεργειών. Γίνεται εμφανές ότι το ATRA είναι λιγότερο τοξικό έως τη συγκέντρωση 10-5 Μ και αμέσως μετά η καμπύλη παρουσιάζει έντονη κλίση και η επόμενη συγκέντρωση (10-4 Μ) έχει ως αποτέλεσμα τη θανάτωση το 50% των κυττάρων. Δοκιμασία βιωσιμότητας ΜΤΤ Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας βιωσιμότητας με τη χρήση ΜΤΤ επιβεβαίωσαν τα αποτελέσματα που προηγήθηκαν με την χρώση με trypan blue. Εικόνα 21. Πλάκα 96 βοθρίων στην οποία καλλιεργήθηκαν κύτταρα HaCaT, εφαρμόσθηκαν διαβαθμισμένες δόσεις φαρμακευτικών ουσιών, μεταξύ των οποίων ATRA και Acitretin. Προσδιορίσθηκε η βιωσιμότητα των κυττάρων με τη μέθοδο ΜΤΤ. Συγκεκριμένα μετά από κατάλληλο χειρισμό των κυττάρων, προστίθεται η χρωστική ΜΤΤ κίτρινου χρώματος η οποία προσλαμβάνεται από τα ζώντα κύτταρα. Η χρωστική ανάγεται στο κυτταρόπλασμα και στα μιτοχόνδρια, σχηματίζοντας δυσδιάλυτους κρυστάλλους ιώδους χρώματος. Η προσθήκη οργανικού διαλύτη (οξινισμένη ισοπροπανόλη) διαλυτοποιεί τους κρυστάλλους και με αυτό τον τρόπο αναπτύσσεται ιώδες χρώμα το οποίο φωτομετρείται. 73

74 % σχετική βιωσιμότητα Οπτική απορρόφηση Συγκεκριμένα, τα ποσοστά επιβίωσης, όπως φαίνεται στα διαγράμματα που ακολουθούν, εμφανίζουν μια παρόμοια τάση με τα αποτελέσματα που ελήφθησαν στη δοκιμασία με το Trypan-blue. Διαφέρουν όμως στις τιμές του ποσοστού επιβίωσης στη χορήγηση Acitretin. Η εξήγηση που θα μπορούσε να δοθεί είναι ότι ενώ γενικά θεωρείται ότι η οπτική απορρόφηση στη δοκιμασία με ΜΤΤ είναι ευθέως ανάλογη με τη βιωσιμότητα των κυττάρων, η σχέση που συνδέει απορρόφηση με επιβίωση μπορεί να μην είναι απόλυτα γραμμική. 1,2000 1,0000 Δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων με τη δοκιμασία ΜΤΤ 0,8000 0,6000 0,4000 0,2000 0, ^-8 10^-7 5x10^-7 10^-6 5x10^-6 10^-5 10^-4 Διαβαθμίσεις Δόσεων (Μ) ATRA ACI Διάγραμμα 11. Σε αυτό το διάγραμμα παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της δοκιμασίας βιωσιμότητας με τη χρήση του ΜΤΤ. Η βιωσιμότητα των κυττάρων συνδέεται άμεσα με την οπτική απορρόφηση των χρωμογόνων αλάτων ιώδους χρώματος που προκύπτουν μετά από την αναγωγή τους από τα ζώντα κύτταρα. Τα αποτελέσματα αυτής της μεθόδου επιβεβαιώνουν τα αποτελέσματα που ήδη είχαμε από τη δοκιμασία με το Trypan Blue. % σχετική βιωσιμότητα με τη δοκιμασία ΜΤΤ ^ ATRA ACI 10^-7 5x10^-7 10^-6 5x10^-6 10^-5 Διαβαθμίσεις δόσεων (Μ) 10^-4 Διάγραμμα 12. Αν θεωρήσουμε ότι η οπτική απορρόφηση είναι ευθέως ανάλογη με γραμμική σχέση με τη βιωσιμότητα των κυττάρων στη δοκιμασία με ΜΤΤ, τότε μπορούμε να αποδώσουμε την επί 74

75 τοις εκατό βιωσιμότητα. Τα αποτελέσματα έχουν την ίδια μορφή με την δοκιμασία με Trypan Blue αλλά φαίνεται να παρουσιάζουν υψηλότερο ποσοστό βιωσιμότητας συγκριτικά με αυτήν, ειδικά στην χορήγηση του φαρμάκου Acitretin. Έλεγχος ποιότητας του RNA που απομονώθηκε Η φωτομέτρηση του RNA που εκχυλίσθηκε από τα κύτταρα έγινε στα 260 και 280 nm προκειμένου να υπολογισθεί η συγκέντρωσή του και να διαπιστωθεί αν υπάρχει επιμόλυνση με DNA. Τα αποτελέσματα καταγράφονται στο πίνακα που ακολουθεί. Πίνακας 7. Πίνακας αποτελεσμάτων φωτομέτρησης του RNA που εκχυλίσθηκε από τα κύτταρα. Λόγος οπτικής απορρόφησης στα 260nm έναντι στα 280nm κοντά στο 2 και πάνω υποδηλώνει υψηλής καθαρότητας RNA. Για την ποσοτικοποίηση του RNA πρέπει να ληφθεί υπόψιν ότι για κυβέτα 1cm, οπτική απορρόφηση 1 στα 260nm, υποδηλώνει συγκέντρωση RNA 25mg/ml. Κύτταρα O.D. 260 O.D. 280 O.D. 260 / O.D. 280 Συγκέντρωση (ng/μl) 1 HaCaT free ,3 177,6 2 HaCaT DMSO 0,1% 0,0157 0,0084 1,86 125,6 3 HaCaT ATRA 10-8 M 0,0146 0,0051 2,8 116,8 4 HaCaT ATRA 10-6 M 0,0037 0,0006 >3 29,6 5 HaCaT Acitretin 10-8 M 0,0095 0,0028 3, HaCaT Acitretin 10-6 M 0,0143 0,0053 2,7 114,4 Το γράφημα της ηλεκτροφόρησης έδειξε δύο κορυφές RNA που αντιστοιχούν στις υπομονάδες 16S και 18S του ριβοσωμικού RNA και πιστοποίησε ότι δεν έχει υποστεί υδρόλυση. Αυτό σημαίνει ότι το απομονωθέν RNA μπορούσε να χρησιμοποιηθεί σε περαιτέρω χειρισμούς. Εικόνα 22. Γράφημα των αποτελεσμάτων της ηλεκτροφόρησης των απομονωθέντων RNA. Οι δύο κορυφές αντιστοιχούν στις υπομονάδες 16S και 18S του rrna. Η ύπαρξή τους υποδηλώνει ότι δεν 75

76 υπάρχει υδρόλυση του RNA, πράγμα που καθιστά τα δείγματα κατάλληλα για περαιτέρω πειραματισμούς. Αποτελέσματα ποσοτικοποίησης του σήματος Από την χρήση του προγράμματος ScanArray Express προκύπτει ένα αρχείο CSV το οποίο περιέχει το σύνολο των πληροφοριών κάθε σημείου (ή κηλίδας) που αντιστοιχεί σε γονίδιο. Τέτοιες πληροφορίες είναι: η παρουσία ή όχι σήματος, η έ- νταση του σήματος του κάθε φθοριοχρώματος, ο λόγος των εντάσεων, το μέγεθος της κηλίδας του γονιδίου, η ένταση του θορύβου ακριβώς έξω από κάθε κηλίδα, η ένταση του θορύβου σε ευρύτερες περιοχές της μικροσυστοιχίας και πολλά άλλα. Ο πίνακας που προκύπτει έχει την μορφή της εικόνας που ακολουθεί. Το δε αρχείο επεξεργάζεται και αναλύεται περαιτέρω από τα προγράμματα της «σουίτας» προγραμμάτων του ΤΜ4. Εικόνα 23. Μετά την ποσοτικοποίηση του σήματος κάθε γονιδίου προκύπτει ένας πίνακας όπου είναι καταγεγραμμένες οι τιμές διάφορων παραμέτρων. Αριστερά εμφανίζονται τρεις εικόνες από το επιλεγμένο (μπλε) γονίδιο που οι δύο προς τα κάτω αντιστοιχούν στο σήμα του κάθε φθοριοχρώματος ξεχωριστά, ενώ πάνω είναι η σύνθεση των δύο χρωμάτων. Πρόκειται για ένα γονίδιο που δεν υπερτερεί το σήμα ενός χρώματος μόνο. Αποτελέσματα κανονικοποίησης των αρχικών δεδομένων Από την χρήση του προγράμματος προκύπτουν δεδομένα σε μορφή αρχείου MDS.mev τα οποία χρησιμοποιούνται στο MeV πρόγραμμα προκειμένου να αναδειχθούν οι διαφορές στην έκφραση των γονιδίων. Τα αποτελέσματα της κανονικοποίησης φαίνονται στις εικόνες που ακολουθούν. 76

77 Εικόνα 24. Αποτελέσματα κανονικοποίησης των αρχικών δεδομένων με τη χρήση του προγράμματος TIGR. Σχηματίζεται ένας πίνακας με τα γονίδια, που πλέον παίρνουν νέες τιμές για τις διάφορες μεταβλητές όπως ένταση, θόρυβος, διορθωμένες ως προς τις αρχικές. Α Β Εικόνα 25. Α. Διάγραμμα κατανομής της συχνότητας των κηλίδων βάσει του λόγου της έντασης του κάθε φθοριοχρώματος εκφρασμένη στη λογαριθμική κλίμακα. Παρατηρούμε ότι τα σημεία των γονιδίων είναι μετατοπισμένα δεξιά από το μηδέν, που σημαίνει ότι η μία χρωστική δίνει συστηματικά εντονότερο σήμα. Β. Ίδιο διάγραμμα μετά την κανονικοποίηση. Παρατηρούμε ότι η κατανομή των συχνοτήτων πλέον είναι μετατοπισμένη αριστερά με κέντρο συμμετρίας το μηδέν που σημαίνει ότι για τα περισσότερα γονίδια η ένταση των δύο φθοριοχρωμάτων είναι της ίδιας τάξης μεγέθους. Α Εικόνα 26. (Περιγραφή στην επόμενη σελίδα) Β 77

78 Εικόνα26. Α. Το διάγραμμα κατανομής των σημείων των γονιδίων βάσει του λογαρίθμου της έντασης κάθε φθοριοχρώματος, δείχνει μια ελαφριά κλίση προς τον άξονα Υ (κλίση >45 ο ) που υποδηλώνει ότι η ένταση του χρώματος στο κανάλι Β είναι υψηλότερη. Β. Παρόμοιο διάγραμμα με την προηγούμενη εικόνα με τη διαφορά ότι μετά την κανονικοποίηση η κλίση της νοητής ευθείας του κύριου όγκου των γονιδίων είναι περίπου 45 ο. Αυτό σημαίνει ότι στα περισσότερα γονίδια το σήμα των χρωστικών είναι της ίδιας τάξης μεγέθους. Αποτελέσματα ανάλυσης δεδομένων με το πρόγραμμα MeV Η περαιτέρω στατιστική ανάλυση των δεδομένων, έχει ως αποτέλεσμα να προκύψουν πίνακες με γονίδια τα οποία εκφράζονται θετικά ή αρνητικά σε στατιστικά σημαντικό βαθμό καθώς και γονίδια τα οποία δεν εμφανίζουν στατιστικά σημαντικές διαφορές με τη χορήγηση των φαρμάκων. Το πρόγραμμα δίνει τη δυνατότητα σχηματισμού δικτύων γονιδίων καθώς και το σχηματισμό δενδρογράμματος. Αυτά τα εργαλεία σε συνδυασμό με την αναζήτηση πληροφοριών από βάσεις δεδομένων (GENE/NCBI) παρέχουν μια πρώτη εικόνα για μονοπάτια που ενεργοποιούνται ή καταστέλλονται με τη χορήγηση της φαρμακευτικής ουσίας. Το αυξημένο πλήθος γονιδίων (περίπου 350 γονίδια σε κάθε πίνακα με στατιστικώς σημαντικές διαφορές) καθώς και το γεγονός ότι τα αποτελέσματα των μικροσυστοιχιών παρέχουν ποιοτικό παρά ποσοτικό προφίλ έκφρασης των γονιδίων, οδήγησε στην επιλογή ένας αριθμού (35, το 5 % των στατιστικώς σημαντικών γονιδίων) χαρακτηριστικών γονιδίων από τους πίνακες αυτούς που θα εξετασθούν με τη μέθοδο Real-time PCR προς επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων. Α Β 78

79 Γ Δ Εικόνα 27. Α. Η αρχική οθόνη του προγράμματος MeV στο οποίο απεικονίζονται τα δεδομένα των μικροσυστοιχιών από το πρόγραμμα TIGR. Τα διάφορα γονίδια εμφανίζουν διαφορετικής έντασης σήμα σε κάθε πειραματική συνθήκη, το οποίο σήμα αποδίδεται με ένα χαρακτηριστικό χρώμα επί της οθόνης (από κόκκινο έως πράσινο στη συγκεκριμένη περίπτωση). Απόδοση Heatmap. Β. Παρουσιάζεται το μενού που αναπτύσσεται όταν επιλεχθεί ένα γονίδιο. Υπάρχει η δυνατότητα άντλησης πληροφοριών από βάσεις δεδομένων. Στο φόντο είναι ο πίνακας με την κατάταξη των γονιδίων που εκφράζονται θετικά σε στατιστικά σημαντικό βαθμό. Γ. Δενδρόγραμμα στατιστικώς σημαντικών γονιδίων που συσχετίζει τόσο ομάδες γονιδίων ως προς το ποσοστό έκφρασής τους καθώς και τα δείγματα ως προς την δραστικότητα της φαρμακευτικής ουσίας ή της δόσης. Τα αποτελέσματα αυτά παρέχουν μια ένδειξη και δεν αποτελούν πρότυπο οργάνωσης. Δ. Δίκτυα γονιδίων τα οποία προέκυψαν από τον τρόπο έκφρασης των γονιδίων στις διάφορες πειραματικές συνθήκες και από βάσεις δεδομένων (gene ontology). Σχηματίσθηκαν με αυτόματο τρόπο. Τα ευρήματα αυτά αποτελούν ένδειξη πιθανών σχέσεων μεταξύ των γονιδίων και συμβάλλει μερικώς στη μορφοποίηση μιας άποψης για τον τρόπο δράσης των συγκεκριμένων φαρμακευτικών ουσιών, στις συγκεκριμένες πειραματικές συνθήκες. Επιβεβαίωση αποτελεσμάτων με qrt-pcr Η επιβεβαίωση των ευρημάτων από τη χρήση των μικροσυστοιχιών με Realtime PCR έδωσε τα αποτελέσματα που καταγράφονται σε πίνακα που παρατίθεται στο παράρτημα. Οι τιμές που αναγράφονται στα κελιά του πίνακα είναι η μεταβολή στην έκφραση του κάθε γονιδίου έναντι του γονιδίου της ακτίνης β εκφρασμένη σε κλίμακα του λογαρίθμου του δύο. Στις επόμενες σελίδες παρουσιάζονται τα διαγράμματα των αποτελεσμάτων. Στο διάγραμμα 13 φαίνεται ότι η γονιδιακή έκφραση των εναρκτήριων παραγόντων μεταβάλλεται ελαφρώς με μέγιστη μεταβολή κοντά τις δύο φορές. Αυτά τα γονίδια (EIF2B1 & EIF4G1) είναι δύο από τα 22 επιπλέον γονίδια. Στην ίδια κατηγορία ανήκουν και τα γονίδια του υποδοχέα Χ των ρετινοειδών. Τα γονίδια RXR μεταβάλλονται σημαντικά, κοντά 6 φορές και πάνω στην χορήγηση ATRA 10-6 Μ, ενώ στις άλλες συνθήκες αυξομειώνονται κατά περίπτωση σε πολύ μικρότερο βαθμό. Τα επόμενα γονίδια που εμφανίζονται στο γράφημα (ADAMTS2, CASP10, FABP, ACER1, 79

80 Συγκριτική μεταβολή έκφρασης (log2) POMC) συμπεριλαμβάνονται στην ομάδα των 34 γονιδίων που επιλέχθηκαν από τα 700 περίπου που ξεχώρισαν από τη διαδικασία των μικροσυστοιχιών. Σε όλα τα γονίδια παρουσιάζεται αύξηση των επιπέδων έκφρασής τους τουλάχιστον 2 φορές και επιβεβαιώνουν κατά αυτό τον τρόπο τα αρχικά αποτελέσματα από τις μικροσυστοιχίες. 6,000 Αποτελέσματα μελέτης έκφρασης γονιδίων με τη χρήση qrt-pcr 4,000 2,000 0,000-2,000-4,000 EIF2B1 EIF4G1 RXR α RXR β RXR γ ADAMTS CASP 10 FABP ACER 1 POMC 2-6,000-8,000-10,000 Γονίδια ATRA 10^-6 M Μεταβολή (log2) Acitretin 10^-6 M Μεταβολή (log2) ATRA 10^-8 M Μεταβολή (log2) Acitretin 10^-8 M Μεταβολή (log2) Διάγραμμα 13. Aποτελέσματα qrt-pcr. Παρουσιάζονται οι διαφορές στην έκφραση των γονιδίων συγκριτικά με το γονίδιο της ακτίνης β. Τα αποτελέσματα είναι σε κλίμακα log2. Φαίνεται χαρακτηριστικά ότι στη χορήγηση ATRA 10-6 M η γονιδιακή έκφραση του υποδοχέα RXR ρυθμίζεται αρνητικά τουλάχιστον 5 φορές συγκριτικά με το δείγμα ελέγχου. Ενδιαφέρον επίσης παρουσιάζεται η θετική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης των γονιδίων ADAMTS2, CASP10, ACER1, POMC. Στο διάγραμμα 14 περιλαμβάνονται γονίδια από την ομάδα των 34 επιλεχθέντων. Στα περισσότερα εμφανίζεται μεταβολή που κατά περίπτωση πλησιάζει τις 2 φορές στην λογαριθμική κλίμακα. Υπάρχουν όμως περιπτώσεις όπως στα γονίδια CNK, ACVR1C, EXOSC4 που η μεταβολή στην έκφραση είναι κατά απόλυτη τιμή κάτω από 2 φορές, δηλαδή κάτω από 1 φορά σε κλίμακα του λογαρίθμου με βάση το 2. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν μερικώς τα αρχικά αποτελέσματα που η α- ναμενόμενη μεταβολής της γονιδιακής έκφρασης είναι τουλάχιστον 2 φορές στην λογαριθμική κλίμακα. 80

81 Συγκριτική μεταβολή έκφρασης (log2) 3,000 Αποτελέσματα μελέτης έκφρασης γονιδίων με τη χρήση qrt-pcr 2,000 1,000 0,000-1,000-2,000-3,000-4,000-5,000 Γονίδια ATRA 10^-6 M Μεταβολή (log2) Acitretin 10^-6 M Μεταβολή (log2) ATRA 10^-8 M Μεταβολή (log2) Acitretin 10^-8 M Μεταβολή (log2) Διάγραμμα 14. Aποτελέσματα qrt-pcr. Παρουσιάζονται οι διαφορές στην έκφραση των γονιδίων συγκριτικά με το γονίδιο της ακτίνης β. Τα αποτελέσματα είναι σε κλίμακα log2. Ενδιαφέρον παρουσιάζει η αρνητική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης των MSC, POMP και η κατά φαρμακευτική δόση αύξηση ή μείωση της γονιδιακής έκφρασης των ICOS και TNFRSF10D. Αξιολογούνται μεταβολές στην έκφραση τουλάχιστον 2 τάξεις μεγέθους (>2Χ). Στο διάγραμμα 15 τα γονίδια MAPK8, POP5, KIF24, CDC27, CELF3, POLR1B, NCS1 ανήκουν στα αρχικά επιλεγέντα γονίδια. Το γονίδιο της MAPK8 καθώς και τα 3 τελευταία παρουσιάζουν σημαντική μεταβολή στη γονιδιακή έκφραση κατά περίπτωση, γεγονός που επιβεβαιώνει τα αποτελέσματα που προέρχονται από τις μικροσυστοιχίες. Τα γονίδια POP5, KIF24 επιβεβαιώνουν μερικώς τα αρχικά αποτελέσματα. Αντίθετα η περίπτωση του γονιδίου CDC27 απέχει αρκετά από τα αναμενόμενα αποτελέσματα και πιθανόν να οφείλεται σε τυχαίο σφάλμα στην ανάλυση των αποτελεσμάτων των μικροσυστοιχιών. Τα υπόλοιπα γονίδια είναι επιπρόσθετα, τα οποία μεταβάλλονται κοντά στις 2 φορές (σε κλίμακα log 2 ) ή και παραπάνω κατά περίπτωση. 81

82 Συγκριτική μεταβολή έκφρασης (log2) Αποτελέσματα μελέτης έκφρασης γονιδίων με τη χρήση qrt-pcr 4,000 2,000 0,000-2,000 MAPK 8 POP 5 KIF 24 CDC 27 CELF 3 POLR1B NCS 1 MTOR PSORS 1 IL 23R -4,000-6,000 Γονίδια ATRA 10^-6 M Μεταβολή (log2) Acitretin 10^-6 M Μεταβολή (log2) ATRA 10^-8 M Μεταβολή (log2) Acitretin 10^-8 M Μεταβολή (log2) Διάγραμμα 15. Aποτελέσματα qrt-pcr. Παρουσιάζονται οι διαφορές στην έκφραση των γονιδίων συγκριτικά με το γονίδιο της ακτίνης β. Τα αποτελέσματα είναι σε κλίμακα log2. Παρατηρείται ότι στις μικρές δόσεις των φαρμάκων ρυθμίζεται θετικά η έκφραση του γονιδίου MAPK8. Στο επόμενα διάγραμμα (16 ο και 17 ο ), περιλαμβάνονται γονίδια που προστέθηκαν ανεξάρτητα των αποτελεσμάτων που προέκυψαν από τη διαδικασία των μικροσυστοιχιών. Γίνεται αντιληπτό ότι όπως και στα γονίδια RXR έτσι και στα γονίδια RAR του αντίστοιχου υποδοχέα των ρετινοειδών, παρουσιάζεται μικρή ή μεγαλύτερη μείωση της γονιδιακής έκφρασης, ανάλογα τη δραστική ουσία και τη δόση που χορηγείται. Στα γονίδια TNF και NFkB1 η έκφρασή τους ελαττώνεται σχετικά ελαφρώς. Αντίθετα στο γονίδιο EIF4BP1 η γονιδιακή του έκφραση αυξάνεται ελαφρώς ενώ στα γονίδια VDR, AIMP2, EIF4E, ICAM η αύξηση της γονιδιακής έκφρασης είναι εντυπωσιακά υψηλή. Ανάλογη αύξηση παρουσιάζεται στα γονίδια YARS, KARS και KIAA0391, ενώ μικρή είναι στα γονίδια MYC, AIMP1, POP1 και RGTD1. 82

83 Συγκριτική μεταβολή έκφρασης (log2) Συγκριτική μεταβολή έκφρασης (log2) 9,000 7,000 5,000 3,000 1,000-1,000-3,000-5,000-7,000 Αποτελέσματα μελέτης έκφρασης γονιδίων με τη χρήση qrt-pcr RAR α RAR β RAR γ TNF NFKb 1 VDR AIMP 2 EIF4BP1 EIF4E ICAM Γονίδια ATRA 10^-6 M Μεταβολή (log2) Acitretin 10^-6 M Μεταβολή (log2) ATRA 10^-8 M Μεταβολή (log2) Acitretin 10^-8 M Μεταβολή (log2) Διάγραμμα 16. Aποτελέσματα qrt-pcr. Παρουσιάζονται οι διαφορές στην έκφραση των γονιδίων συγκριτικά με το γονίδιο της ακτίνης β. Τα αποτελέσματα είναι σε κλίμακα log2. Χαρακτηριστική είναι η αρνητική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης του υποδοχέα RAR και ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι μεταβολές των γονιδίων ICAM, EIF4E AIMP2, VDR. Τέλος, κατά περίπτωση η ελάττωση της γονιδιακής έκφρασης κατά 2 περίπου φορές των TNF, NFkB1. 6,000 5,000 4,000 3,000 2,000 1,000 0,000-1,000-2,000-3,000-4,000 Αποτελέσματα μελέτης έκφρασης γονιδίων με τη χρήση qrt-pcr YARS KARS MYC AIMP1 HSD17B10 KIA 0391 POP 1 RGTD1 Γονίδια ATRA 10^-6 M Μεταβολή (log2) Acitretin 10^-6 M Μεταβολή (log2) ATRA 10^-8 M Μεταβολή (log2) Acitretin 10^-8 M Μεταβολή (log2) Διάγραμμα 17. Aποτελέσματα qrt-pcr. Παρουσιάζονται οι διαφορές στην έκφραση των γονιδίων συγκριτικά με το γονίδιο της ακτίνης β. Τα αποτελέσματα είναι σε κλίμακα log2. Σημαντική μεταβολή της γονιδιακής έκφρασης υπάρχει στη συνθετάσης της τυροσίνης (YARS) και λιγότερο στη συνθετάση της λυσίνης (KARS), ενώ κάπου στη μέση είναι το συστατικό της ριβονουκλεάσης P (KIA0391). 83

84 Συγκριτική μεταβολή έκφρασης (log2) 3,000 Αποτελέσματα μελέτης έκφρασης γονιδίων με τη χρήση qrt-pcr 2,000 1,000 0,000-1,000 RPP 25 RPP 30a RPP38 RPP 40 RPP 21 POP 4 POP 7 RPP 14-2,000-3,000 Γονίδια ATRA 10^-6 M Μεταβολή (log2) Acitretin 10^-6 M Μεταβολή (log2) ATRA 10^-8 M Μεταβολή (log2) Acitretin 10^-8 M Μεταβολή (log2) Διάγραμμα 18 Aποτελέσματα qrt-pcr. Παρουσιάζονται οι διαφορές στην έκφραση των γονιδίων της ριβονουκλεάσης P συγκριτικά με το γονίδιο της ακτίνης β. Τα αποτελέσματα είναι σε κλίμακα log2. Ενδιαφέρον είναι ότι τα συστατικά της ριβονουκλεάσης P δεν έχουν παρόμοιο πρότυπο στη μεταβολή της γονιδιακής έκφρασης υπό την επίδραση των φαρμακευτικών ουσιών. Στο διάγραμμα 18 παρουσιάζονται τα γονίδια της ριβονουκλεάσης Ρ (κάποια παρουσιάζονται σε προηγηθέντα γραφήματα). Με εξαίρεση το γονίδιο RPP30a που εμφανίζει αύξηση η γονιδιακή έκφρασή του σε μέτρια επίπεδα, όλα τα υπόλοιπα γονίδια ελαττώνουν την έκφρασή τους σε μικρό ή μεγαλύτερο ποσοστό. Ξεχωρίζουν οι μεταβολές των RPP40 και POP7 που η γονιδιακή τους έκφραση ελαττώνεται κοντά στις 4 φορές κατά απόλυτη τιμή (2 φορές σε κλίμακα του log 2 ). 84

85 ΣΥΖΗΤΗΣΗ Τα γονίδια που επιλέχθηκαν για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων από την εφαρμογή των μικροσυστοιχιών καθώς και εκείνα που επιλέχθηκαν με σκοπό τη διερεύνηση βιολογικών διεργασιών, μπορούν να ταξινομηθούν σε λειτουργικές ο- μάδες. Συγκεκριμένα ομαδοποιούνται σε γονίδια μεταγωγής σήματος, σε γονίδια που ελέγχουν την πρωτεϊνοσύνθεση, την απόπτωση, διάφορες βιολογικές διεργασίες και τέλος σε αυτά που σχετίζονται με τη χορήγηση των ρετινοειδών. Επισημαίνεται ότι η κατηγοριοποίηση των γονιδίων γίνεται προς διευκόλυνση της μελέτης τους. Πρωτεϊνοσύνθεση Σε αυτή την λειτουργική ομάδα βρίσκονται γονίδια που ελέγχουν με διαφορετικό τρόπο τη διαδικασία της πρωτεϊνοσύνθεσης. Περιλαμβάνονται εναρκτήριοι παράγοντες της μεταγραφής και πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με αυτούς πχ eif4e, eif2b1, παράγοντες της ριβονουκλεάσης P (POP, RPP) που συμμετέχουν στην ωρίμανση των t-rnas, αμινοάκυλο-trna συνθετάσες (AARS), μεταγραφικοί παράγοντες. Η έκφραση του εναρκτήριου παράγοντα eif2b1 αυξάνει με τη χορήγηση των φαρμάκων. Σημαντικότερη είναι η αύξηση στις μικρές δόσεις που προσεγγίζει τις 2 φορές σε σχέση με το δείγμα ελέγχου. Ο παράγοντας eif2b1 που αποτελεί κομβικό σημείο στη ρύθμιση της πρωτεϊνοσύνθεσης, ανταλλάσει το GDP του eif2 με GTP (GTP exchange factor- GEF). Διευκολύνεται κατά αυτό τον τρόπο η πρόσδεση του αμινοακυλιωμένου εναρκτήριου trna (fmet-trna) στον παράγοντα eif2 και ο σχηματισμός του τριμερούς συμπλόκου (fmet-trna eif2 GTP). Συμβάλλει θετικά δηλαδή στην πρωτεϊνοσύνθεση. [38] [39] [40] [41] [42] Παρόμοια, αυξάνεται η έκφραση του eif4e πάνω από δύο φορές ανεξάρτητα με το χορηγηθέν φάρμακο και τη δόση. Ο eif4e συμβάλλει στην αναγνώριση της καλύπτρας του mrna και τη στρατολόγηση του ριβοσώματος. Ο συγκεκριμένος παράγοντας όμως όταν συνδεθεί με συγκεκριμένα μόρια (CYFIP1, FMR1) αναστέλλει την πρωτεϊνοσύνθεση. Επίσης όταν συνδεθεί με τον παράγοντα eif4ebp1 εμποδίζεται η σύνδεση του με την καλύπτρα. Η έκφραση του eif4ebp1 ελαττώνεται ελαφρώς με τη χορήγηση του ATRA, ενώ αυξάνε- 85

86 ται ελαφρώς όταν χορηγηθεί Acitretin. Δίχως τη γνώση των επιπέδων έκφρασης των μορίων CYFIP1, FMR1, στηριζόμενοι αποκλειστικά στα επίπεδα έκφρασης των eif4e και eif4ebp1 θα μπορούσαμε να συμπεράνουμε ότι ευνοείται η πρωτεϊνοσύνθεση. Ο παράγοντας eif4g1 που παίζει επίσης ρόλο στην αναγνώριση της καλύπτρας του mrna, δεν αυξάνεται η έκφραση του στον ίδιο βαθμό, αντιθέτως ελαττώνεται κατά μία περίπου φορά στην χορήγηση του ATRA στη δόση 10-6 Μ. Εικόνα 28. Επισκόπηση των εναρκτήριων βημάτων της πρωτεϊνοσύνθεσης. Η ανταλλαγή του GDP του παράγοντα eif2b με GTP, επιτρέπει τη σύνδεση του fmet-trna και το σχηματισμό του τριμερούς συμπλόκου, απαραίτητου βήματος για την πρόσδεση στην μικρή υπομονάδα του ριβοσώματος στη θέση Α. Ο εναρκτήριος παράγοντας eif4g συνδέεται με τις πρωτεΐνες που δεσμεύονται στην poly-a ουρά ΡΑΒΡ, συνδέεται με τον παράγοντα eif4e που συνδέεται με την καλύπτρα του mrna και με άλλους παράγοντες που συγκροτούν το σύμπλοκο του εναρκτήριου παράγοντα eif4f που κυκλοποιεί το mrna. Το στάδιο αυτό είναι απαραίτητο προκειμένου να στρατολογηθούν και οι υπόλοιποι εναρκτήριοι παράγοντες με τελικό στόχο την στρατολόγηση των υπομονάδων του ριβοσώματος, πρώτα της μικρής των 40S και κατόπιν της μεγάλης των 60S. Συνθήκες στρες και έλλειψης θρεπτικών συστατικών μπλοκάρουν την δράση του μονοπατιού PI3K/AKT, mtor που φωσφορυλιώνει πρωτεΐνες και ευνοεί την πρωτεϊνοσύνθεση. Αυτό το μονοπάτι κανονικά ενεργοποιείται από μιτογόνα και αυξητικούς παράγοντες. Η πρωτεΐνη 4Ε-ΒΡ πρέπει να είναι φωσφορυλιωμένη από την κινάση mtor προκειμένου ο εναρκτήριος παράγοντας eif4 να είναι διαθέσιμος να αλληλεπιδράσει με άλλους εναρκτήριους παράγοντες και να σχηματίσει το σύμπλοκο eif4f. Η έκφραση της πολυμεράσης Ι (POLR1B) ελαττώνεται ελαφρώς με εξαίρεση μια ανεπαίσθητη αύξηση όταν χορηγείται ATRA 10-6 M και μια σημαντική μείωση κατά τρεις φορές όταν χορηγείται Acitretin 10-8 M. Η συγκεκριμένη πολυμεράση 86

87 συνθέτει ριβοσωμικό RNA, με αποτέλεσμα να επηρεάζει τα επίπεδα της μετάφρασης. [43] Το συμπέρασμα που εξάγεται είναι ότι μακροπρόθεσμα περιορίζεται η πρωτεϊνοσύνθεση. Τα συστατικά της ριβονουκλεάσης Ρ παρουσιάζουν κυρίως μικρή ελάττωση στην έκφραση τους με εξαίρεση την πρωτεΐνη RPP30 που αυξάνεται έως 2 φορές στην χορήγηση της ασιτρετίνης. Η RPP30 συνδέεται με την υπομονάδα Η1 που είναι το καταλυτικό RNA της ριβονουκλεάσης Ρ. [44] Η συγκεκριμένη υπομονάδα (RPP30), όπως φαίνεται στη βιβλιογραφία μέχρι τώρα, δεν έχει κάποια ιδιαίτερη λειτουργία ώστε να καθίσταται αυτή η διαφοροποίηση αξιοσημείωτη. Εντούτοις ενδιαφέρον σημείο είναι το γεγονός ότι σχετίζεται με αυτοάνοση δερματική πάθηση. Συγκεκριμένα, σε ασθενείς με σκληρόδερμα έχουν βρεθεί αυτοαντιγόνα έναντι [45] [46] της RPP30 και της RPP38. Τα αποτελέσματα από τις υπόλοιπες υπομονάδες της RNase P συμπληρώνουν τα ευρήματα που είχαν προκύψει από πειράματα του εργαστηρίου Βιολογικής Χημείας τα οποία έδειχναν ότι τα ρετινοειδή αναστέλλουν [47] [48] [49] in vitro τη δράση της RNase P. Επομένως, τα ρετινοειδή δρουν επί της ριβονουκλεάσης Ρ και αναστέλλουν τη δράση της τόσο σε λειτουργικό επίπεδο όσο και σε μεταγραφικό επίπεδο. Τα ευρήματα αυτά, αν γίνει αναγωγή, υποδηλώνουν ότι μακροπρόθεσμα, επιβραδύνεται η διαδικασία ωρίμανσης στο 5 άκρο των trnas με επακόλουθο αντίκτυπο στην πρωτεϊνοσύνθεση. Τα επίπεδα μεταβολής της έκφρασης των AIMPs και των άμινοάκυλο trna συνθετασών ΑΑRS (τυροσίνης:yars, λυσίνης:kars) δεν συμβαδίζουν. Με πυρήνα τις συνδετικές πρωτεΐνες AIMPs (Aminoacyl- trna synthetase complex interacting multifunctional protein) που οργανώνουν και συγκρατούν άμινοάκυλο trna συνθετάσες μεταξύ των άλλων τις KARS και YARS, σχηματίζεται ένα «ογκώδες» λειτουργικό πολυενζυμικό σύμπλοκο με το ο- ποίο γίνεται η φόρτωση των αμινοξέων στα μεταφορικά RNA. [50] Τα επίπεδα έκφρασης των μορίων που ελέχθησαν ήταν αυξημένα, όχι όμως στον ίδιο βαθμό. Σημαντική αύξηση κατά τέσσερις φορές περίπου είχε η YARS και κατά 3,5 φορές η ΑΙΜΡ2. Τα άλλα δύο μόρια είχαν μικρότερη αύξηση έως ανεπαίσθητη ανάλογα με τις δόσεις των φαρμάκων. Τα ευρήματα αυτά συνηγορούν προς την κατεύθυνση της αυξημένης παραγωγής αμινοακυλιωμένων trnas εν μέρει, επειδή δεν υπάρχει ι- σορροπημένη αύξηση των επιπέδων έκφρασης. Εναλλακτική-συμπληρωματική εξήγηση, θα μπορούσε να είναι ο ρόλος των μορίων αυτών σε μονοπάτια μεταγωγής σήματος. 87

88 Η KARS όταν εκκρίνεται έχει προφλεγμονώδη δράση κυταροκίνης. Μεταξύ των άλλων καταλύει την παραγωγή μορίων (παραδείγματος χάριν: Ap4A: τετραφωσφορική διαδενοσίνη) με ρόλο δεύτερου αγγελιοφόρου που εμπλέκονται στον έ- λεγχο της μεταγραφής μορίων τα οποία παίζουν ρόλο στον ανοσολογικό έλεγχο, σε ογκογόνες διεργασίες, στην παραγωγή του TNF. Η YARS εκκρίνεται σε δύο τμήματα, το αμινοτελικό άκρο με δράση αγγειογενετική και το καρβόξυ- τελικό που έχει χημειοτακτική δράση κυτοκίνης και επάγει την παραγωγή του TNF. [50] [51] Η ΑΙΜΡ1 παρουσιάζει ανεπαίσθητη αύξηση σε όλες τις πειραματικές συνθήκες, ενώ η έκφραση της ΑΙΜΡ2 αυξάνεται 3-4 φορές κατά περίπτωση. Τα δύο αυτά μόρια έχουν πλειοτροπική δράση. Συγκεκριμένα η ΑΙΜΡ1, εκτός του ότι διεγείρει τη καταλυτική δραστηριότητα της RRS (αμινοάκυλο trna συνθετάση της αργινίνης), έχει δράση φλεγμονώδους κυτοκίνης, ρυθμίζει αρνητικά τη σηματοδότηση του TGFβ, σε χαμηλές δόσεις επάγει την μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων ενώ σε υψηλές δόσεις επάγει την απόπτωση. Η ΑΙΜΡ2 μεσολαβεί στην ουβικιτινυλίωση διάφορων μορίων με αποτέλεσμα να παίζει ρόλο στην διαφοροποίηση των κυττάρων και στην [50] [51] [52] επιβίωση τους. Έχει προαποπτωτική δράση. Η πρωτεΐνη MSC (musculin) είναι μεταγραφικός παράγοντας που για να δράσει ομοδιμερίζεται ή ετεροδιμερίζεται και θεωρείται ότι έχει κατασταλτικό ρόλο στην μεταγραφή. Όταν ετεροδιμεριστεί, για παράδειγμα, με τον μεταγραφικό ενεργοποιητή TCF3/E47, εμποδίζει τη δράση του τελευταίου. Γενικότερα η MSC εμπλέκεται στην διαφοροποίηση των κυττάρων, στην λειτουργία τους καθώς και σε ποικίλες αναπτυξιακές διαδικασίες. [53] [54] Τα ελαττωμένα επίπεδα έκφρασης της κατά μέσο όρο 2 φορές φανερώνει ότι ευνοείται η δράση του μεταγραφικού ενεργοποιητή και άρα η πρωτεϊνοσύνθεση των αντίστοιχων μορίων. Ο παράγοντας CELF3 παίζει ρόλο στο εναλλακτικό μάτισμα mrnas που εξαρτάται από το αναπτυξιακό στάδιο ενός οργανισμού καθώς και τον ιστό που εκφράζεται. [55] [56] Η έκφραση του CELF3 αυξάνεται σε τρεις φαρμακευτικές συνθήκες, εκτός της δόσης Acitretin 10-8 M που μειώνεται κατά τρεις φορές. Η ερμηνεία που θα μπορούσε να δοθεί είναι ότι εξυπηρετεί αυξημένες ή ενδεχομένως συγκεκριμένες ανάγκες του κυττάρου στην παραγωγή πρωτεϊνών. 88

89 Μεταγωγή σήματος Η κινάση σερίνης/θρεονίνης MAPK8 (ή JNK1) έχει πλειοτροπική δράση και επηρεάζει σημαντικές κυτταρικές διεργασίες όπως τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των κυττάρων, τη μετανάστευσή τους, τον μετασχηματισμό τους και τον κυτταρικό θάνατο. Εκφράζεται μετά από συνθήκες που προκαλούν stress και εξωκυττάρια δράση προφλεγμονωδών κυτταροκινών. [57] [58] [59] [60] [61] Στην πειραματική διαδικασία που περιγράφεται σε αυτή τη μελέτη, η έκφραση της MAPK8 αυξάνεται στις μικρές δόσεις των φαρμάκων που χορηγήθηκαν, ενώ στις μεγαλύτερες η μεταβολή είναι ανεπαίσθητη και αμφίσημη. Η ερμηνεία που θα μπορούσε να δοθεί είναι ότι στις μικρές δόσεις των φαρμάκων εντοπίζεται φαρμακευτική δράση και απόκριση των κυττάρων, η κατεύθυνση της οποίας προσδιορίζεται με την παρατήρηση μορίων που έχουν πιο εξειδικευμένη δράση. Η έκφραση της κινάσης mtor (mammalian Target of rapamycin) αυξάνεται με τη χορήγηση των φαρμάκων με εξαίρεση τη χορήγηση Acitretin 10-8 M στην ο- ποία ελαττώνεται κατά 5 φορές. Στο κύτταρο η πρωτεΐνη mtor συνδυάζεται λειτουργικά με άλλα μόρια, με αποτέλεσμα να σχηματίζονται δύο διακριτά ενζυμικά σύμπλοκα που χαρακτηρίζονται με τους αριθμούς 1 και 2. Το σύμπλοκο mtorc1 είναι ευαίσθητο στη ραπαμυκίνη και στα θρεπτικά μόρια (αμινοξέα), αντίθετα με το σύμπλοκο mtorc2 που δεν είναι ευαίσθητο. Η κινάση mtor παίζει ρόλο σε πολλές σημαντικές κυτταρικές διεργασίες επηρεάζοντας τον μεταβολισμό, την αύξηση και την επιβίωση του κυττάρου σε απόκριση ορμονικών, θρεπτικών, στρεσογόνων ερεθισμάτων. [52] [62] Ρυθμίζει την πρωτεϊνοσύνθεση μέσω φωσφορυλίωσης μορίων που παίζουν ρόλο στην μεταγραφή, για παράδειγμα τον μεταγραφικό παράγοντα Stat3, και στη σύνθεση του ριβοσώματος, όπως της ριβοσωμικής πρωτεΐνης S6. Ο Stat3 φωσφορυλιώνεται επίσης από την προσδετο-εξαρτώμενη ενεργοποίηση του υποδοχέα IL23 (IL23R), ο οποίος δεν έχει ενδογενή δράση κινάσης αλλά συνδέεται με την κινάση Jak2 (και η Tyk2 στην υπομονάδα IL-12Rβ1). Ο Stat3 συνδέεται με αυτοάνοσες νόσους κυρίως επειδή είναι ο μεταγραφικός παράγοντας που προσδιορίζει τη μοίρα ενός βοηθητικού Τ λεμφοκυττάρου (Th) να γίνει Th17. [63] Επίσης διερευνήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα IL23R τα οποία βρέθηκαν αυξημένα γύρω στις 2 φορές, εκτός από την χορήγηση Acitretin 10-8 M που υπάρχει ελάττωση πάνω από 2 φορές. Αυτό που θα μπορούσε να υποδηλώνεται είναι ότι τα κύτ- 89

90 ταρα κάτω από τις συνθήκες στρες που υπάρχουν στο περιβάλλον τους εξαιτίας των ρετινοειδών, συνθέτουν εκείνα τα μόρια που θα τα βοηθήσουν να αλληλεπιδράσουν με άλλα κύτταρα προκειμένου να ληφθούν οι τελικές αποφάσεις για την περαιτέρω τύχη τους. Στους στόχους της κινάσης mtor ανήκει και η πρωτεΐνη που δεσμεύεται στον εναρκτήριο παράγοντα 4 της μεταγραφής, eif4ebp1 ο οποίος όταν δεν είναι φωσφορυλιωμένος εμποδίζει την πρωτεϊνοσύνθεση (βλέπε Εικόνα 28). [52] Η έκφραση της πρωτεΐνης eif4ebp1, αυξάνεται ελαφρώς με τη χορήγηση των φαρμάκων με εξαίρεση τη συνθήκη ATRA 10-6 M που η έκφραση της ελαττώνεται σε μικρό βαθμό. Τα ευρήματα αυτά θα μπορούσαν να σημαίνουν ότι περιορίζεται η πρωτεϊνοσύνθεση, όμως το γεγονός ότι αυξάνονται τα επίπεδα της κινάσης mtor άρα και η πιθανότητα φωσφορυλίωσης της eif4ebp1, τελικά μάλλον θα έ- βγαινε το συμπέρασμα ότι αυξάνει η πρωτεϊνοσύνθεση. Σε παρόμοια κατεύθυνση είναι η απενεργοποίηση του μορίου MAF1από την κινάση mtor, που κανονικά ε- μποδίζει τη δράση της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ. Αποτέλεσμα είναι η αύξηση της σύνθεσης των συστατικών του ριβοσώματος (5S) και των trnas. Επίσης η mtor ρυθμίζει τη βιογένεση των μιτοχονδρίων, εμποδίζει την αυτοφαγία, ρυθμίζει τον κυττα- [64] [65] [66] [67] ροσκελετό. Εικόνα 29. Η κινάση mtor ενεργοποιείται από τη δράση αυξητικών παραγόντων, ορμονών, σημάτων ενεργειακής κατάστασης. PI3K/AKT είναι το βασικό μονοπάτι που οδηγεί στη ενεργοποίηση της mtor. Η ενεργοποίηση του μονοπατιού έχει ως αποτέλεσμα την φωσφορυλίωση μορίων που ρυθμίζουν τη μεταγραφή και την κυτταρική ανάπτυξη, την αυτοφαγία και την αγγειογένεση. Η κινάση mtor αναστέλλεται από συνθήκες υποξίας και στρες. 90

91 Ο μεταγραφικός παράγοντας NFκB1 εμπλέκεται σε πολλές κυτταρικές διεργασίες όπως φλεγμονή, ανοσία, διαφοροποίηση, κυτταρική αύξηση, ογκογένεση και απόπτωση. Ο NFκB1 βρίσκεται διμερισμένος στο κυτταρόπλασμα με πρωτεΐνες που περιέχουν περιοχή παρόμοια με την πρωτεΐνη Rel (Rel-like) και ταυτόχρονα είναι συνδεδεμένος με μόρια που εμποδίζουν τη δράση του και καλούνται αναστολείς του kb (ΙκΒ). Ενεργοποιείται υπό την παρουσία επιβλαβών σημάτων όπως είναι οι δρώσες ρίζες του οξυγόνου (ROS), ο βακτηριακός λιποπολυσακχαρίτης LPS και από τον νεκρωτικό παράγοντα όγκων TNF. Η ενεργοποίηση του γίνεται με την αποδόμηση του αναστολέα με τον οποίο είναι συνδεδεμένος αφού προηγηθεί φωσφορυλίωση του ΙκΒ από εξειδικευμένες κινάσες ΙΚΚ, ουβικιτινιλίωση και δράση του πρωτεοσώματος. Ανάλογα με το συνδυασμό των μορίων στο διμερισμό του NFκB1 άλλοτε δρα ως μεταγραφικός ενεργοποιητής και άλλοτε ως μεταγραφικός καταστολέας. [60] [68] [69] [70] Διαπιστώθηκε στην παρούσα μελέτη ότι τα επίπεδα έκφρασης του ελαττώνονται με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Εξαίρεση η συνθήκη ATRA 10-8 M που είναι οριακά αυξημένα. Τα αποτελέσματα αυτά δεν συμφωνούν με προηγούμενες μελέτες στις οποίες έδειχναν ότι αγωγή με ATRA 10-7 M σε καλλιέργεια με κερατινοκύτταρα είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του TNF και την επακόλουθη αύξηση του NFκB. [70] Τα αποτελέσματα που προκύπτουν στην τρέχουσα μελέτη συμφωνούν μεταξύ τους καθώς τα επίπεδα έκφρασης του TNF ελαττώνονται (σε αντίθεση με την αναφορά [70]). Η μικρότερη μείωση του TNF συμβαίνει στην δόση ATRA 10-8 M, στην οποία ο NFκB1 είναι αυξημένος ανεπαίσθητα (κατά 0,5 φορές). Αυτές οι διαφορές μπορεί να οφείλονται στις διαφορετικές πειραματικές συνθήκες και τεχνικές προσδιορισμού, εν τέλει στην διαφορετική μεθοδολογία. Το σημαντικό είναι ότι τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης αλληλοσυμβαδίζουν όπως φαίνεται και στην περίπτωση των επιπέδων έκφρασης της POMC. 91

92 Εικόνα 30. Επισκόπηση σηματοδοτικών μονοπατιών στα οποία ο μεταγραφικός παράγοντας NFκB συμμετέχει. Βασικό μονοπάτι σηματοδότησης στο οποίο παίζει ρόλο είναι του TNF. Γενικά ο NFκB βρίσκεται διμερισμένος στο κυτταρόπλασμα με διάφορες πρωτεΐνες που έχουν περιοχές παρόμοιες με της πρωτεΐνης Rel. Ταυτόχρονα τα διμερή αυτά είναι συνδεδεμένα με πρωτεΐνες αναστολείς ΙΚΒ που συγκρατούν επιπλέον τα διμερή στο κυτταρόπλασμα. Όταν ενεργοποιηθούν οι υποδοχείς αυξητικών παραγόντων, της ιντερλευκίνης-1 (IL-1R), του TNF (TNFR) κ.ά. ενεργοποιούνται κινάσες IKK, οι οποίες οργανωμένες υπό την πρωτεΐνη ΝΕΜΟ, φωσφορυλιώνουν τους αναστολείς ΙΚΒ, με αποτέλεσμα να απελευθερώνονται τα διμερή και να οδεύουν στον πυρήνα. Οι αναστολείς ουβικιτιλιώνονται και οδεύουν στο πρωτεάσωμα για αποδόμηση. Ανάλογα με τον συνδυασμό των πρωτεϊνών του διμερούς μπορεί να ξεκινά διαφορετική κυτταρική απόκριση. Η έκφραση της POMC (pro-opiomelanocortin) αυξάνεται σε κάθε δόση φαρμάκου κάτι που υποδηλώνει αυξημένη σηματοδότηση. Η POMC είναι μια πρόδρομος πρωτεΐνη που υφίσταται πολλές τροποποιήσεις (γλυκοζυλιώσεις, ακετυλιώσεις) και πρωτεολυτικές πέψεις προκειμένου να παραχθούν με ιστοειδικό τρόπο διαφορετικές ορμόνες: NPP (αμινοτελικό πεπτίδιο της POMC), μελανοτροπίνη α, β & γ, κορτικοτροπίνη (ACTH), corticotropin-like intermediary peptide (CLIP), λιποτροπίνη β & γ, β-ενδορφίνη, Met-εγκεφαλίνη. [71] Παίζει ρόλο σε μεταβολικές και ενεργειακές διεργασίες. Έχει συσχετισθεί αρνητικά με την παραγωγή του TNF κάτι που επιβεβαιώνεται από τα αποτελέσματά μας, ενώ συσχετίζεται θετικά με τη δράση της RNA pol II. [72] Επίσης η β-ενδορφίνη προάγει τον πολλαπλασιασμό των κερατινοκυττάρων. Γενικώς τα αποτελέσματα της παρούσης μελέτης συμβαδίζουν με τα ευρήματα της αναφοράς [73] στην οποία διατυπώνεται η υπόθεση (βάσει των αντι- 92

93 στρεσογόνων δράσεων των παραγώγων ορμονών) ότι η POMC πιθανά έχει δράση αντιφλεγμονώδη, ανοσοκασταλτική και επάγει τον πολλαπλασιασμό των κερατινοκυττάρων. [73] Εικόνα 31. Η εικόνα αυτή είναι από την πηγή [73] και αριστερά παρουσιάζει τις αλληλεπιδράσεις νευρικού ιστού και επιδερμίδας κάτω από καταστάσεις τοπικού στρες. Στη σηματοδότηση παίζουν ρόλο ιντερλευκίνες και ο παράγοντας TNF που μεταξύ των άλλων επάγουν την σύνθεση POMC, η οποία πέπτεται στις παράγωγες ορμόνες. Δεξιά παρουσιάζεται η υπόθεση που διετύπωσαν οι συγγραφείς μετά από χειρισμό επιδερμίδας με τριχλωροοξικό οξυ (TCA). Στο σχήμα αυτό διατυπώνουν ότι η POMC μπλοκάρει τη σηματοδότηση που επάγει την φλεγμονή, ενώ ευνοεί τα μονοπάτια που επάγουν την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό. Η έκφραση του ICAM (intercellular adhesion molecules) αυξάνεται εντυπωσιακά γύρω στις επτά φορές σε σύγκριση με το δείγμα ελέγχου. Ο ρόλος του συγκεκριμένου μορίου είναι να προσελκύσει τα Τ-λεμφοκύτταρα τα οποία μέσω του προσδέματος LFA-1 που φέρουν θα προσκολληθούν και θα μεταναστεύσουν στην επιδερμίδα. [74] [75] Στην αντίθετη κατεύθυνση είναι τα επίπεδα έκφρασης του παράγοντα ICOS (inducible T-cell costimulator) που συμβάλλει στην ενεργοποίηση και δράση των Τ-λεμφοκυττάρων. Όταν χορηγήθηκε Acitretin, τα επίπεδα έκφρασης αποδείχθηκε ότι ήταν αυξημένα σε πολύ μικρό βαθμό. Στο ρετινοϊκό οξύ στην χαμηλότερη δόση, η έκφραση αυξάνεται περισσότερο ενώ αντιθέτως στην υψηλότερη δόση τα επίπεδα έκφρασης του ICOS ελαττώνονται. Ο παράγοντας ICOS είναι σημαντικός για την ενεργοποίηση και αλληλεπίδραση και άλλων συστατικών του ανοσοποιητικού εκτός των Τ-λεμφοκύτταρα, όπως τα μονοκύτταρα και τα Β- λεμφοκύτταρα. [76] [77] Ο συνδυασμός των τελευταίων ευρημάτων πιθανά υποδηλώνει την προσπάθεια των κυττάρων HaCaT να αλληλεπιδράσουν και να επικοινωνήσουν μεταξύ τους καθώς και με κύτταρα του ανοσοποιητικού, πιθανά όχι άμεσα με τα Τ-λεμφοκύτταρα. 93

94 Απόπτωση Η έκφραση της κυτοκίνης TNF ελαττώνεται με δοσοεξαρτώμενο τρόπο στην χορήγηση των ρετινοειδών. Ο TNF επάγει την φλεγμονή και τον κυτταρικό θάνατο, ενώ κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες προάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση. [78] Πιθανότατα η ελάττωση των επιπέδων του mrna υποδηλώνει τα φάρμακα που χορηγήθηκαν έχουν αντι-αποπτωτική δράση. Επισημαίνεται ότι τα αποτελέσματα αυτά έρχονται σε αντίθεση με τα αποτελέσματα που έχουν δημοσιεύσει ο Dai, X. et al το 2004 (βλέπε NFκB), [70] αλλά τα επίπεδα έκφρασης των σχετικών μορίων στη τρέχουσα μελέτη μεταβάλλονται προς την ίδια κατεύθυνση. Σε μία άλλη μελέτη που έγινε το 2000, διαπιστώθηκε ότι ο TNF έδρασε ανεξάρτητα από τον NFκB αλλά μέσω του μονοπατιού PI3K/Akt, που είχε ως αποτέλεσμα εμφάνιση αντι-αποπτωτικής δράσης. [79] Ο υποδοχέας TNFRSF10D των TRAILs (TNF-related apoptosis-inducing ligand), ανήκει στην κατηγορία των υποδοχέων TRAILR-4 (DcR2/TRUNDD) με ανταγωνιστική δράση έναντι των υποδοχέων TRAILR-1&2. [80] [81] [82] Από τον υποδοχέα 4 (όπως και από τον υποδοχέα TRAILR-3) λείπει η ενδοκυττάρια περιοχή που προάγει την απόπτωση (death domain), ως εκ τούτου δεν επάγει τον κυτταρικό θάνατο. Στην βιβλιογραφία δεν έχει ξεκαθαριστεί ο ακριβής φυσιολογικός τους ρόλος. Επιπλέον, υπάρχουν αντικρουόμενες αναφορές για την ικανότητα να επάγουν τον παράγοντα NFκB. [83] [84] Τα επίπεδα της έκφρασή του παραμένουν σχεδόν αμετάβλητα (μικρές αυξομειώσεις) με εξαίρεση την χορήγηση Acitretin 10-6 M που η έκφραση αυξάνει κατά 2,5 φορές. Ίσως να προσπαθούν τα κύτταρα να αποφύγουν την απόπτωση η οποία φαίνεται ότι προάγεται από τα πολύ αυξημένα επίπεδα έκφρασης (4 φορές μεγαλύτερα σε σύγκριση με το δείγμα ελέγχου) της κασπάσης 10 (CASP10). Η κασπάση 10 (πρωτεάση κυστεΐνης-ασπαρτικου/ ενδοπεπτιδάση) αποτελεί συστατικό των μονοπατιών που ενεργοποιούνται τόσο από το TNF όσο και από τον υποδοχέα Fas τα οποία οδηγούν σε απόπτωση. [85] Γενικά οι κασπάσες συνθέτονται σε πρόδρομη μορφή, πρωτεολύονται σε δύο τμήματα τα οποία εν συνεχεία διμερίζονται. [86] Η κασπάση 10 θεωρείται ότι ενεργοποιεί άλλες κασπάσες προκειμένου αυτές να πρωτεολύσουν κυτταρικά συστατικά κατά τη διαδικασία της απόπτωσης. Συμμετέχει σε ένα καταρράκτη ενεργοποίησης κασπασών και ενίσχυσης του σήματος σε σηματο- [87] [88] δοτικά μονοπάτια φλεγμονής και απόπτωσης. 94

95 Εικόνα 32. Στην εικόνα παρουσιάζονται οι υποδοχείς TRAIL-R3&4 στους οποίους απουσιάζει η ενδοκυττάρια περιοχή θανάτου (death domain)η οποία βρίσκεται στους υποδοχείς 1&2. Στους TRAIL- R1&2 στην περιοχή που αναφέρθηκε, οργανώνεται ένα σύμπλοκο μορίων που επάγει τον κυτταρικό θάνατο-disc (Death-inducing signaling complex). Το σύμπλοκο αυτό ενεργοποιεί τον καταρράκτη των κασπασών που οδηγούν στην απόπτωση. Στην εικόνα φαίνονται μόρια (XIAP, Bid) που μπλοκάρουν τη διαδικασία του κυτταρικού θανάτου. Κυτταρική λειτουργία Η πρωτεΐνη POMP (proteasome maturation protein) συμβάλλει στην ωρίμανση του πρωτεασώματος, το οποίο παίζει ρόλο στην πρωτεόλυση ουβικιτυλιωμένων πρωτεϊνών. [89] [90] Τα επίπεδα της ελαττώνονται με τη χορήγηση των ρετινοειδών, γεγονός που μπορεί να υποδηλώνει μια προσπάθεια εξισορρόπησης της απόπτωσης και της εκτεταμένης πρωτεόλυσης ή ακόμα και να ευνοείται η πρωτεϊνοσύνθεση. Ενδιαφέρον είναι ότι μη φυσιολογική πρωτεΐνη POMP σχετίζεται με νόσους όπως ιχθύωση και κερατόδερμα σε παλάμες και πατούσες, οι οποίες αμφότερες είναι αποτέλεσμα υπερκεράτωσης. Η έκφραση της μεταλλοπρωτεάσης ADAMTS2 αυξάνει εξαιτίας των δραστικών ουσιών που χορηγήθηκαν. Έχει ως υπόστρωμα τα ινίδια του προκολλαγόνου, στα οποία αφαιρεί το αμινοτελικό άκρο. Συντελεί στην ωρίμανση του κολλαγόνου Ι και ΙΙ επηρεάζοντας τη δομή των κυττάρων και της επιδερμίδας. [91] [92] Η αύξηση της έκφρασή της μπορεί να οφείλεται σε προσπάθεια αναδόμησης της αρχιτεκτονικής του ιστού, της επιδερμίδας εν προκειμένω, εάν τα κύτταρα ήταν στη φυσιολογική τους θέση στον οργανισμό και δεν ήταν σε καλλιέργεια. 95

96 Η NCS1(neuronal calcium sensor-1) είναι μια πρωτεΐνη με 4 περιοχές EF χεριού που φανερώνει ότι προσδένει ιόντα ασβεστίου. [93] Ενώ αρχικά εθεωρείτο ότι εκφραζόταν μόνο στον νευρικό ιστό, στην πορεία, αποκαλύφθηκε ότι βρίσκεται στους περισσότερους ιστούς και μάλιστα είναι καλά συντηρημένη μεταξύ των οργανισμών. [94] [95] Ο φυσιολογικός της ρόλος είναι ο έλεγχος και ρύθμιση τασεοεξαρτώμενων καναλιών Ca 2+ και K + καθώς και η ενεργοποίηση της κινάσης της 4 φωσφατιδυλ-ινοσιτόλης (PI4K). Στο αμινοτελικό άκρο είναι μυριστοϋλιωμένη που την καθιστά υδρόφοβη και ικανή να αλληλεπιδρά με παράγωγα του ρετινοϊκού οξέος. Χαρακτηριστικό είναι ότι η ρεκοβερίνη που ανήκει σε αυτή την οικογένεια πρωτεϊνών συμμετέχει στη λειτουργία της όρασης. [93] Στην τρέχουσα μελέτη, τα επίπεδα έκφρασης της NCS1 ελαττώνονται κυρίως στις μικρές δόσεις των φαρμάκων και περισσότερο στην Ασιτρετίνη. Οριακά αυξημένα είναι τα επίπεδα όταν χορηγείται AT- RA 10-6M, με πιθανή εξήγηση ότι τα κύτταρα δεν έχουν προλάβει να αποδομήσουν το mrna της πρωτεΐνης. Συνολικά η ελάττωση των επιπέδων έκφρασης υποδηλώνει μειωμένη δράση της PI4K και σηματοδότηση μέσω της 3P- φωσφατιδυλ-ινοσιτόλης. Στην αλκαλική κεραμιδάση (ACER1) αυξάνονται τα επίπεδα του mrna σε ό- λες τις φαρμακευτικές συνθήκες με μεγαλύτερη αύξηση στις μικρότερες δόσεις. Η ACER1 υδρολύει κεραμίδια και παράγει σφιγγολιπίδια. Τα κεραμίδια συμμετέχουν στον φραγμό της επιδερμίδας και έχουν αντιμικροβιακή δράση. Ενεργοποιούν αντιμιτωτική σηματοδότηση και ευνοούν την απόπτωση με την ενεργοποίηση κινασών και την επακόλουθη ενεργοποίηση ενός καταρράκτη κασπασών. Παίζουν επίσης ρόλο στη διαφοροποίηση των κερατινοκυττάρων. [96] [97] Τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με τη βιβλιογραφία στην οποία αναφέρεται ότι η έκφραση της κεραμιδάση επάγεται από ρετινοειδή [98] και άλλα σήματα όπως κυτοκίνες, ασβέστιο, ακτινοβολία. [97] Σύμφωνα επίσης με τη βιβλιογραφία ευνοείται η απόπτωση και η διαφοροποίηση των κερατινοκυττάρων με παράλληλη αναστολή του πολλαπλασιασμού τους. Ενδιαφέρον είναι ότι φυσιολογικά δεν εκφράζεται στα κύτταρα HaCaT και στα κερατινοκύτταρα που προέρχονται από εξαλλαγές. [99] 96

97 Εικόνα 33. Ο ρόλος των κεραμιδασών στην κυτταρική απόκριση. Παρουσιάζονται διάφορες κυτταρικές αποκρίσεις από τα παράγωγα της δράσης των κεραμιδασών. Οι κεραμιδάσες διακρίνονται σε όξινες, ουδέτερες και αλκαλικές, υπάρχουν σε διάφορους ιστούς, με διαφορετικά επίπεδα έκφρασης και προάγουν διαφορετικό αποτέλεσμα. CDases: ceramides, MOMP: Mitochondrial outer membrane permeabilization, LMP: lysosomal membrane permeabilization, FGA: fragmentation of the Golgi apparatus, S1RP: S1P receptor, SDK: SPHdependent kinase, PP1: protein phosphatase 1, PP2A: protein phosphatase 2A, PKC: protein kinase C, SRC: Src kinase, ERK: extracellular signal-regulated kinase, AKT: protein kinase B. Ρετινοειδή Οι υποδοχείς RAR α,β,γ των ρετινοειδών, παρατηρήθηκε ότι η έκφραση τους ελαττώνεται με τη χορήγηση των φαρμάκων, πιθανόν ως απόκριση στην εκτεταμένη έκθεση τους στα φάρμακα. Σχεδόν ανάλογο είναι το φαινόμενο και για τους υποδοχείς RXR α,β,γ με εξαίρεση τις μικρές δόσεις των φαρμάκων στις οποίες αυξάνεται η έκφραση των RXRs σε μικρό βαθμό. Ο πυρηνικός υποδοχέας της βιταμίνης D 3 (VDR) παρατηρήθηκε ότι αυξάνεται η έκφραση του. Ετεροδιμερίζεται με τους υποδοχείς RXR και λειτουργεί ως μεταγραφικός παράγοντας. [100] Παίζει ρόλο στην ομοιόσταση του ασβεστίου (το οποίο εμπλέκεται σε πολλά σηματοδοτικά μονοπάτια: ACER1, NCS1). Επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των κερατινοκυττάρων ευνοώντας την διαφοροποίηση τους έναντι του πολλαπλασιασμού τους. Η έκφραση της πρωτεΐνης που δεσμεύει τα λιπαρά οξέα (FABP) αυξάνεται στην πειραματική διαδικασία. Παίζει ρόλο στην πρόσληψη των λιπαρών οξέων, την είσοδο τους στα κύτταρα και στον μεταβολισμό τους. Υπάρχουν ενδείξεις ότι παίζει 97

ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ

ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ Καθώς η επιστημονική γνώση και κατανόηση αναπτύσσονται, ο μελλοντικός σχεδιασμός βιοτεχνολογικών προϊόντων περιορίζεται μόνο από τη φαντασία μας Βιοτεχνολογία

Διαβάστε περισσότερα

Διαβάστε περισσότερα στο διαδικτυακό τόπο www.psorinfo.gr

Διαβάστε περισσότερα στο διαδικτυακό τόπο www.psorinfo.gr Αυτό το φυλλάδιο είναι μέρος του «Προγράμματος Ενημέρωσης για την Ψωρίαση», το οποίο δημιουργήθηκε για να παρέχει πληροφορίες για την πάθηση. Το φυλλάδιο κάνει μία εισαγωγή στην ψωρίαση και στις θεραπείες

Διαβάστε περισσότερα

Έλεγχος κυτταρικού κύκλου-απόπτωση Πεφάνη Δάφνη Επίκουρη καθηγήτρια, Ιατρική σχολή ΕΚΠΑ Μιχαλακοπούλου 176, 1 ος όροφος

Έλεγχος κυτταρικού κύκλου-απόπτωση Πεφάνη Δάφνη Επίκουρη καθηγήτρια, Ιατρική σχολή ΕΚΠΑ Μιχαλακοπούλου 176, 1 ος όροφος Έλεγχος κυτταρικού κύκλου-απόπτωση Πεφάνη Δάφνη Επίκουρη καθηγήτρια, Ιατρική σχολή ΕΚΠΑ Μιχαλακοπούλου 176, 1 ος όροφος Κυτταρικός κύκλος Φάσεις του κυτταρικού κύκλου G1:Αύξηση του κυττάρου και προετοιμασία

Διαβάστε περισσότερα

Κυτταρική Βιολογία. Ενότητα 12 : Απόπτωση ή Προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος. Παναγιωτίδης Χρήστος Τμήμα Φαρμακευτικής ΑΠΘ

Κυτταρική Βιολογία. Ενότητα 12 : Απόπτωση ή Προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος. Παναγιωτίδης Χρήστος Τμήμα Φαρμακευτικής ΑΠΘ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΙΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ Κυτταρική Βιολογία Ενότητα 12 : Απόπτωση ή Προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος Παναγιωτίδης Χρήστος ΑΠΘ Άδειες Χρήσης Το παρόν εκπαιδευτικό

Διαβάστε περισσότερα

Κ Ε Φ Α Λ Α Ι Ο 22 : Η ενεργοποίηση της µεταγραφής

Κ Ε Φ Α Λ Α Ι Ο 22 : Η ενεργοποίηση της µεταγραφής Κ Ε Φ Α Λ Α Ι Ο 22 : Η ενεργοποίηση της µεταγραφής Εικόνα 22.1 Η γονιδιακή έκφραση ελέγχεται κυρίως κατά την έναρξη της µεταγραφής και σπάνια στα επόµενα στάδια της γονιδιακής έκφρασης, παρόλο που ο έλεγχος

Διαβάστε περισσότερα

Εφαρμοσμένη Διατροφική Ιατρική

Εφαρμοσμένη Διατροφική Ιατρική Γλωσσάρι για το Μάθημα της Διατροφικής Ιατρικής Λιπαρά οξέα: περιέχουν μακριές αλυσίδες μορίων που αποτελούν σχεδόν όλο το σύμπλεγμα λιπιδίων τόσο για τα ζωικά όσο και για τα φυτικά λίπη. Αν αποκοπούν

Διαβάστε περισσότερα

Η ζωη µου. µε την ψωριαση. Eνημερωτικό φυλλάδιο για τη νόσο της ψωρίασης

Η ζωη µου. µε την ψωριαση. Eνημερωτικό φυλλάδιο για τη νόσο της ψωρίασης Πανελλήνιος Σύλλογος Ασθενών με Ψωρίαση και Ψωριασική Αρθρίτιδα Αριστοτέλους 21, Θεσσαλονίκη, τηλ 21315 553 780, email:epidermia.greece@gmail.com www.epidermia.gr Επιστημονική Επιμέλεια Ελληνική Δερματολογική

Διαβάστε περισσότερα

ΘΕΩΡΙΑ 3 η ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ. ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΕΣ ή ΚΥΤΤΟΚΙΝΕΣ Dr ΠΑΠΑΓΙΑΝΝΗΣ ΔΗΜΗΤΡΗΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΩΝ ΤΕΙ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ

ΘΕΩΡΙΑ 3 η ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ. ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΕΣ ή ΚΥΤΤΟΚΙΝΕΣ Dr ΠΑΠΑΓΙΑΝΝΗΣ ΔΗΜΗΤΡΗΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΩΝ ΤΕΙ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΘΕΩΡΙΑ 3 η ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΕΣ ή ΚΥΤΤΟΚΙΝΕΣ Dr ΠΑΠΑΓΙΑΝΝΗΣ ΔΗΜΗΤΡΗΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΩΝ ΤΕΙ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ Είδαμε ότι οι ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΜΗ ΕΙΔΙΚΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ είναι 1. Ανατομικοί φραγμοί - Δέρμα - Βλεννώδεις

Διαβάστε περισσότερα

να ταράξουν την λειτουργία των ιστών και των οργάνων του; α. τη θέση τους στο ανθρώπινο σώμα β. την γενικευμένη ή εξειδικευμένη δράση

να ταράξουν την λειτουργία των ιστών και των οργάνων του; α. τη θέση τους στο ανθρώπινο σώμα β. την γενικευμένη ή εξειδικευμένη δράση Ερωτήσεις κατανόησης της θεωρίας του 1 ο κεφαλαίου (συνέχεια) 1. Από τι εξαρτάται η επιβίωση του ανθρώπου και ποιοι εξωτερικοί παράγοντες θα μπορούσαν να ταράξουν την λειτουργία των ιστών και των οργάνων

Διαβάστε περισσότερα

ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΑΜΥΝΑΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥ

ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΑΜΥΝΑΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΑΜΥΝΑΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΑΜΥΝΑΣ Με βάση τη θέση στο ανθρώπινο σώμα Με βάση την ιδιότητα για γενικευμένη ή εξειδικευμένη δράση Εξωτερικοί εσωτερικοί μη ειδικοί μηχανισμοί ειδικοί

Διαβάστε περισσότερα

Γονιδιωματική. G. Patrinos

Γονιδιωματική. G. Patrinos Γονιδιωματική Η μεταγονιδιωματική εποχή... Σημαντικότερα επιτεύγματα POST GENOME ERA Ολοκλήρωση της αποκρυπτογράφησης της αλληλουχίας των γονιδιωμάτων πολλών οργανισμών. Προτύπωση μεθοδολογιών για προσδιορισμό

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ Φαρμακολογία ΙI Κυτταροτοξικά Διδάσκοντες: Μ. Μαρσέλος, Μ. Κωνσταντή, Π. Παππάς, Κ. Αντωνίου Άδειες Χρήσης Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό υπόκειται σε άδειες

Διαβάστε περισσότερα

Φλεγμονή. Α. Χατζηγεωργίου Επίκουρος Καθηγητής Φυσιολογίας Ιατρικής Σχολής ΕΚΠΑ

Φλεγμονή. Α. Χατζηγεωργίου Επίκουρος Καθηγητής Φυσιολογίας Ιατρικής Σχολής ΕΚΠΑ Φλεγμονή Α. Χατζηγεωργίου Επίκουρος Καθηγητής Φυσιολογίας Ιατρικής Σχολής ΕΚΠΑ Μη ειδική ανοσολογική άμυνα ΑΝΑΤΟΜΙΚΟΙ ΦΡΑΓΜΟΙ Φυσικοί: δέρμα, βλεννογόνοι, βλέννα, βήχας Χημικοί: λυσοζύμη, αντιμικροβιακά

Διαβάστε περισσότερα

ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΑΝΟΣΟΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ: Ενεργοποίηση των Τ κυττάρων από τους µικροοργανισµούς. Οι φάσεις των Τ κυτταρικών απαντήσεων

ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΑΝΟΣΟΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ: Ενεργοποίηση των Τ κυττάρων από τους µικροοργανισµούς. Οι φάσεις των Τ κυτταρικών απαντήσεων ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΑΝΟΣΟΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ: Ενεργοποίηση των Τ κυττάρων από τους µικροοργανισµούς Οι φάσεις των Τ κυτταρικών απαντήσεων Αναγνώριση του αντιγόνου και συνδιέγερση Αναγνώριση πεπτιδίων συνδεδεµένων µε το

Διαβάστε περισσότερα

ρ Έλενα Κουλλαπή 2014

ρ Έλενα Κουλλαπή 2014 ρ Έλενα Κουλλαπή 2014 Το µεγαλύτερο όργανο του σώµατο Μέση επιφάνεια περίπου 2 m2 Το βάρο του δέρµατο (χωρί το υποδόριο λίπο ) είναι κατά µέσο όρο 4,85 Kgr στον ενήλικο άνδρα και 3,18 Kgr στην ενήλικη

Διαβάστε περισσότερα

είναι τα αυτοάνοσα νοσήματα

είναι τα αυτοάνοσα νοσήματα είναι τα αυτοάνοσα νοσήματα Χ.Μ. Μουτσόπουλος Καθηγητής Ιατρικής Σχολής Πανεπιστημίου Αθηνών ο ανοσολογικό (αμυντικό) σύστημα έχει σκοπό την προστασία του οργανισμού από ξένους εισβολείς, όπως είναι τα

Διαβάστε περισσότερα

Kυτταρική Bιολογία. Απόπτωση, ή Προγραμματισμένος Κυτταρικός Θάνατος ΔIAΛEΞΗ 20 (9/5/2017) Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Τμήμα Φαρμακευτικής Α.Π.Θ.

Kυτταρική Bιολογία. Απόπτωση, ή Προγραμματισμένος Κυτταρικός Θάνατος ΔIAΛEΞΗ 20 (9/5/2017) Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Τμήμα Φαρμακευτικής Α.Π.Θ. Kυτταρική Bιολογία ΔIAΛEΞΗ 20 (9/5/2017) Απόπτωση, ή Προγραμματισμένος Κυτταρικός Θάνατος Τι είναι απόπτωση; Απόπτωση είναι ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος Η καταστροφή του κυττάρου γίνεται «ήπια»

Διαβάστε περισσότερα

ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΣΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ

ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΣΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ 23-10-11 ΘΕΡΙΝΑ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΣΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΜΑ 1 Ο Α. Να επιλέξετε τη φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις: 1. Όλα τα βακτήρια: Α. διαθέτουν κυτταρικό

Διαβάστε περισσότερα

Ηλίας Ηλιόπουλος Εργαστήριο Γενετικής, Τµήµα Γεωπονικής Βιοτεχνολογίας, Γεωπονικό Πανεπιστήµιο Αθηνών

Ηλίας Ηλιόπουλος Εργαστήριο Γενετικής, Τµήµα Γεωπονικής Βιοτεχνολογίας, Γεωπονικό Πανεπιστήµιο Αθηνών Χηµική Μεταβίβαση Σήµατος Ηλίας Ηλιόπουλος Εργαστήριο Γενετικής, Τµήµα Γεωπονικής Βιοτεχνολογίας, Γεωπονικό Πανεπιστήµιο Αθηνών 1 Η Επικοινωνία στα Ζωϊκά Κύτταρα 1. Δίκτυα εξωκυτταρικών και ενδοκυτταρικών

Διαβάστε περισσότερα

ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΑ ΣΧΗΜΑΤΑ ΣΤΗ ΜΕΤΑΜΟΣΧΕΥΣΗ ΝΕΦΡΟΥ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ Σ. ΓΟΥΜΕΝΟΣ

ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΑ ΣΧΗΜΑΤΑ ΣΤΗ ΜΕΤΑΜΟΣΧΕΥΣΗ ΝΕΦΡΟΥ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ Σ. ΓΟΥΜΕΝΟΣ ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΑ ΣΧΗΜΑΤΑ ΣΤΗ ΜΕΤΑΜΟΣΧΕΥΣΗ ΝΕΦΡΟΥ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ Σ. ΓΟΥΜΕΝΟΣ Γενικά Η πρόληψη των επεισοδίων οξείας απόρριψης και η μακροχρόνια διατήρηση του νεφρικού μοσχεύματος αποτελούν τους στόχους της

Διαβάστε περισσότερα

ΕΝΔΟΚΡΙΝΕΙΣ ΑΔΕΝΕΣ. Οι ρυθμιστές του οργανισμού

ΕΝΔΟΚΡΙΝΕΙΣ ΑΔΕΝΕΣ. Οι ρυθμιστές του οργανισμού ΕΝΔΟΚΡΙΝΕΙΣ ΑΔΕΝΕΣ Οι ρυθμιστές του οργανισμού Είδη αδένων στον άνθρωπο o Εξωκρινείς αδένες: εκκρίνουν το προϊόν τους μέσω εκφορητικού πόρου είτε στην επιφάνεια του σώματος (π.χ. ιδρωτοποιοί και σμηγματογόνοι

Διαβάστε περισσότερα

Ψωρίαση. Αναπληρωτής Καθηγητής Δερματολογίας, ΟΡΙΣΜΟΣ-ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΠΑ

Ψωρίαση. Αναπληρωτής Καθηγητής Δερματολογίας, ΟΡΙΣΜΟΣ-ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΠΑ Ψωρίαση Δημήτριος Ιωαννίδης Αναπληρωτής Καθηγητής Δερματολογίας, ΑΠΘ ΟΡΙΣΜΟΣ-ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΠΑ ψωρίαση προσβάλλει κυρίως το δέρμα και είναι αρκετά συχνή πάθηση, αφού αφορά το 1-3% του γενικού πληθυσμού. Επομένως,

Διαβάστε περισσότερα

ΧΡΟΝΙΑ ΔΥΣΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ/ΝΕΦΡΟΠΑΘΕΙΑ ΚΑΙ ΑΠΩΛΕΙΑ ΝΕΦΡΙΚΩΝ ΜΟΣΧΕΥΜΑΤΩΝ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ Σ. ΓΟΥΜΕΝΟΣ

ΧΡΟΝΙΑ ΔΥΣΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ/ΝΕΦΡΟΠΑΘΕΙΑ ΚΑΙ ΑΠΩΛΕΙΑ ΝΕΦΡΙΚΩΝ ΜΟΣΧΕΥΜΑΤΩΝ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ Σ. ΓΟΥΜΕΝΟΣ ΧΡΟΝΙΑ ΔΥΣΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ/ΝΕΦΡΟΠΑΘΕΙΑ ΚΑΙ ΑΠΩΛΕΙΑ ΝΕΦΡΙΚΩΝ ΜΟΣΧΕΥΜΑΤΩΝ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ Σ. ΓΟΥΜΕΝΟΣ Εισαγωγή Η πρόληψη των επεισοδίων οξείας απόρριψης και η μακροχρόνια διατήρηση του νεφρικού μοσχεύματος αποτελούν

Διαβάστε περισσότερα

ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ / Γ ΛΥΚΕΙΟΥ (ΘΕΡΙΝΑ) ΣΕΙΡΑ: ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 15/11/2015

ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ / Γ ΛΥΚΕΙΟΥ (ΘΕΡΙΝΑ) ΣΕΙΡΑ: ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 15/11/2015 ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ / Γ ΛΥΚΕΙΟΥ (ΘΕΡΙΝΑ) ΣΕΙΡΑ: ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 15/11/2015 ΘΕΜΑ Α Να επιλέξετε την φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις: Α1. Η φαγοκυττάρωση

Διαβάστε περισσότερα

Μικροοργανισμοί. Οι μικροοργανισμοί διακρίνονται σε: Μύκητες Πρωτόζωα Βακτήρια Ιούς

Μικροοργανισμοί. Οι μικροοργανισμοί διακρίνονται σε: Μύκητες Πρωτόζωα Βακτήρια Ιούς Μικροοργανισμοί Οι μικροοργανισμοί διακρίνονται σε: Μύκητες Πρωτόζωα Βακτήρια Ιούς Παθογόνοι μικροοργανισμοί Παθογόνοι μικροοργανισμοί ονομάζονται οι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούν τον άνθρωπο ως ξενιστή

Διαβάστε περισσότερα

όλοι αναπνευστική οδός στομάχι στόμα

όλοι αναπνευστική οδός στομάχι στόμα κεράτινη στιβάδα περιέχει σμήγμα λιπαρά οξέα Μηχανισμοί που παρεμποδίζουν την είσοδο Δέρμα περιέχει ιδρώτας φυσιολογική μικροχλωρίδα λυσοζύμη γαλακτικό οξύ μικροοργανισμών Βλεννογόνοι όλοι αναπνευστική

Διαβάστε περισσότερα

ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΚΑΙ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΤΩΝ ΣΤΙΓΜΑΤΩΝ ΤΟΥ ΦΥΤΟΥ ΚΡΟΚΟΣ (Crocus sativus L. )

ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΚΑΙ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΤΩΝ ΣΤΙΓΜΑΤΩΝ ΤΟΥ ΦΥΤΟΥ ΚΡΟΚΟΣ (Crocus sativus L. ) ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΚΑΙ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΤΩΝ ΣΤΙΓΜΑΤΩΝ ΤΟΥ ΦΥΤΟΥ ΚΡΟΚΟΣ (Crocus sativus L. ) Μόσχος Γ. Πολυσίου, Χημικός, Καθηγητής Χημείας, Εργαστήριο Γενικής Χημείας, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών

Διαβάστε περισσότερα

ΕΡΑΣΜΕΙΟΣ ΕΛΛΗΝΟΓΕΡΜΑΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ

ΕΡΑΣΜΕΙΟΣ ΕΛΛΗΝΟΓΕΡΜΑΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΕΡΑΣΜΕΙΟΣ ΕΛΛΗΝΟΓΕΡΜΑΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ Ιδιωτικό Γενικό Λύκειο Όνομα: Ημερομηνία:./04/2014 ΤΑΞΗ : A Λυκείου ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΟ 1 ο ΘΕΜΑ ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 11: Ενδοκρινείς αδένες ΒΙΟΛΟΓΙΑ Α ΛΥΚΕΙΟΥ

Διαβάστε περισσότερα

4. Η κίρρωση του ήπατος προκαλείται εξαιτίας της αποθήκευσης στα ηπατικά κύτταρα: Πρωτεϊνών Υδατανθράκων Λιπών Αλκοόλ

4. Η κίρρωση του ήπατος προκαλείται εξαιτίας της αποθήκευσης στα ηπατικά κύτταρα: Πρωτεϊνών Υδατανθράκων Λιπών Αλκοόλ ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΓΠ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ (ΘΕΡΙΝΑ) ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 22/10/2017 ΕΠΙΜΕΛΕΙΑ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑΤΟΣ: ΛΑΖΑΡΑΚΗ ΝΟΤΑ ΘΕΜΑ Α Να επιλέξετε τη φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις: 1. Το

Διαβάστε περισσότερα

Εισαγωγή στην Ανοσολογία Επίκτητη Ανοσία I. Σωτήρης Ζαρογιάννης Επίκ. Καθηγητής Φυσιολογίας Εργαστήριο Φυσιολογίας Τμήμα Ιατρικής Π.Θ.

Εισαγωγή στην Ανοσολογία Επίκτητη Ανοσία I. Σωτήρης Ζαρογιάννης Επίκ. Καθηγητής Φυσιολογίας Εργαστήριο Φυσιολογίας Τμήμα Ιατρικής Π.Θ. Εισαγωγή στην Ανοσολογία Επίκτητη Ανοσία I Σωτήρης Ζαρογιάννης Επίκ. Καθηγητής Φυσιολογίας Εργαστήριο Φυσιολογίας Τμήμα Ιατρικής Π.Θ. 14/10/2016 Φυσιολογία Συστημάτων Ακαδημαϊκό Ετος 2016-2017 Γενικά στοιχεία

Διαβάστε περισσότερα

ΜΕΣΟΘΕΡΑΠΕΙΑ ΕΝΕΣΙΜΗ ΤΟΠΙΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ

ΜΕΣΟΘΕΡΑΠΕΙΑ ΕΝΕΣΙΜΗ ΤΟΠΙΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΜΕΣΟΘΕΡΑΠΕΙΑ ΕΝΕΣΙΜΗ ΤΟΠΙΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΜΕΣΟΘΕΡΑΠΕΙΑ Αυτό σημαίνει ότι χρησιμοποιούμε μόνο ενέσιμα φάρμακα και μόνο στο σημείο που πάσχει. ΜΕΣΟΘΕΡΑΠΕΙΑ Ξεκίνησε στη λογική του γιατί να μη χορηγήσω ένα αντιφλεγμονώδες

Διαβάστε περισσότερα

ΜΟΝΟΠΑΤΙΑ ΕΝΔΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΣΗΜΑΤΟΣ

ΜΟΝΟΠΑΤΙΑ ΕΝΔΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΣΗΜΑΤΟΣ ΜΟΝΟΠΑΤΙΑ ΕΝΔΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΣΗΜΑΤΟΣ Το ένζυμο Αδενυλική κυκλάση, υπεύθυνο για τη βιοσύνθεση του camp. Το camp είναι ένα παράδειγμα μορίου «αγγελιοφόρου» καθοδικά των G πρωτεινών Αύξηση του camp

Διαβάστε περισσότερα

Ερωτήµατα προς απάντηση

Ερωτήµατα προς απάντηση Κεφ. 9. Ανοσιακή ανοχή και αυτοανοσία: Η διάκριση εαυτού-ξένου και οι διαταραχές της Ερωτήµατα προς απάντηση Πως διατηρεί το ανοσοποιητικό σύστηµα τηµη απαντητικότητα σε εαυτά αντιγόνα (=ανοχή); Ποιοι

Διαβάστε περισσότερα

Αυτοάνοσα νοσήματα. Χ.Μ. Μουτσόπουλος

Αυτοάνοσα νοσήματα. Χ.Μ. Μουτσόπουλος Αυτοάνοσα νοσήματα Χ.Μ. Μουτσόπουλος Καθηγητής Παθολογίας στην Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών Η έγκαιρη αντιμετώπιση αποτελεί «κλειδί» για τον έλεγχο των αυτοάνοσων ασθενειών- της μεγάλης αυτής κατηγορίας

Διαβάστε περισσότερα

ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΑ ΠΡΟΟΠΤΙΚΗ

ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΑ ΠΡΟΟΠΤΙΚΗ Απαντήσεις του κριτηρίου αξιολόγησης στη βιολογία γενικής παιδείας 1 ο ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΘΕΜΑ 1 ο Να γράψετε τον αριθμό καθεμίας από τις ημιτελείς προτάσεις 1 έως και 5, και δίπλα σε αυτόν το γράμμα που αντιστοιχεί

Διαβάστε περισσότερα

Ρευματολογία. Ψωριασική Αρθρίτιδα. Στέφανος Πατεράκης Φυσικοθεραπευτής, καθηγητής φυσ/πείας

Ρευματολογία. Ψωριασική Αρθρίτιδα. Στέφανος Πατεράκης Φυσικοθεραπευτής, καθηγητής φυσ/πείας Ρευματολογία Ψωριασική Αρθρίτιδα Στέφανος Πατεράκης Φυσικοθεραπευτής, καθηγητής φυσ/πείας Τι είναι η ψωριασική αρθρίτιδα; Η ψωριασική αρθρίτιδα είναι μια χρόνια φλεγμονώδης πάθηση που προσβάλλει τις αρθρώσεις

Διαβάστε περισσότερα

ΒΑΣΙΚΕΣ ΔΟΜΕΣ - ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟ

ΒΑΣΙΚΕΣ ΔΟΜΕΣ - ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟ ΤΕΙ ΠΑΤΡΑΣ ΤΜΗΜΑ ΝΟΣΗΛΕΥΤΙΚΗΣ ΑΝΑΤΟΜΙΑ I ΥΠΕΥΘΥΝΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ : Γεράσιμος Π. Βανδώρος ΒΑΣΙΚΕΣ ΔΟΜΕΣ - ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟ Οι βασικές δομές που εξετάζουμε στην ανατομία μπορούν ιεραρχικά να ταξινομηθούν ως εξής:

Διαβάστε περισσότερα

Αντιμικροβιακά πεπτίδια και ψωρίαση

Αντιμικροβιακά πεπτίδια και ψωρίαση Αντιμικροβιακά πεπτίδια και ψωρίαση Ψωρίαση: Πέρα από τα όρια Πορταριά, 18-20 Ιανουαρίου 2013 Ελισάβετ Λαζαρίδου Επικ. Καθηγήτρια Δερματολογίας-Αφροδισιολογίας Α Δερματολογική Κλινική Α.Π.Θ. Αντιμικροβιακά

Διαβάστε περισσότερα

Νεανική σπονδυλοαρθρίτιδα/αρθρίτιδα που σχετίζεται με ενθεσίτιδα (jspa/era)

Νεανική σπονδυλοαρθρίτιδα/αρθρίτιδα που σχετίζεται με ενθεσίτιδα (jspa/era) www.printo.it/pediatric-rheumatology/gr/intro Νεανική σπονδυλοαρθρίτιδα/αρθρίτιδα που σχετίζεται με ενθεσίτιδα (jspa/era) Έκδοση από 2016 1. ΤΙ ΕΙΝΑΙ Η ΝΕΑΝΙΚΗ ΣΠΟΝΔΥΛΟΑΡΘΡΙΤΙΔΑ/ΑΡΘΡΙΤΙΔΑ ΠΟΥ ΣΧΕΤΙΖΕΤΑΙ

Διαβάστε περισσότερα

ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΜΟΝΟΚΛΩΝΙΚΑ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ ΕΜΒΟΛΙΑ. Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ

ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΜΟΝΟΚΛΩΝΙΚΑ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ ΕΜΒΟΛΙΑ. Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΜΟΝΟΚΛΩΝΙΚΑ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ ΕΜΒΟΛΙΑ Στάδια μικροβιακής λοίμωξης δημιουργία αποικίας σε εξωτερική επιφάνεια διείσδυση στον οργανισμό τοπική μόλυνση συστηματική (γενικευμένη) μόλυνση H σημασία

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ Βιολογία ΙI Κυτταρική Επικοινωνία Διδάσκοντες: Σ. Γεωργάτος, Θ. Τζαβάρας, Π. Κούκλης, Χ. Αγγελίδης Υπεύθυνος μαθήματος: Σ. Γεωργάτος Άδειες Χρήσης Το

Διαβάστε περισσότερα

Επίκτητη Ανοσιακή Απάντηση (χυμικό σκέλος) Β λεμφοκύτταρα

Επίκτητη Ανοσιακή Απάντηση (χυμικό σκέλος) Β λεμφοκύτταρα Επίκτητη Ανοσιακή Απάντηση (χυμικό σκέλος) Β λεμφοκύτταρα φυσική ή μη ειδική ανοσία δεν απαιτεί προηγούμενη έκθεση στο παθογόνο και δεν διαθέτει μνήμη. σε επίκτητη ή ειδική ανοσία χυμική ανοσία με παραγωγή

Διαβάστε περισσότερα

Βιολογία Ο.Π. Θετικών Σπουδών Γ' Λυκείου

Βιολογία Ο.Π. Θετικών Σπουδών Γ' Λυκείου Βιολογία Ο.Π. Θετικών Σπουδών Γ' Λυκείου ΘΕΜΑ Α Α1. Στα χρωμοσώματα ενός ανθρώπινου σωματικού κυττάρου στο στάδιο της μετάφασης της μίτωσης υπάρχουν: Α. 23 μόρια DNA Β. 92 μόρια DNA Γ. 46 μόρια DNA Δ.

Διαβάστε περισσότερα

Υποψήφιος διδάκτορας: Καββαδάς Παναγιώτης. Έτος ολοκλήρωσης διδακτορικής διατριβής: 2010

Υποψήφιος διδάκτορας: Καββαδάς Παναγιώτης. Έτος ολοκλήρωσης διδακτορικής διατριβής: 2010 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Υποψήφιος διδάκτορας: Καββαδάς Παναγιώτης Έτος ολοκλήρωσης διδακτορικής διατριβής: 2010 Μελέτη τοπ ρόλοπ της ιντεγκρινοσπνδεόμενης κινάσης στην πνεπμονική ίνσση, Διδακτορική Διατριβή, Πανεπιστήμιο

Διαβάστε περισσότερα

1. Πού πραγματοποιούνται η αντιγραφή και η μεταγραφή; ΘΩΜΑΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗ. 2. Ποιες είναι οι κατηγορίες γονιδίων με κριτήριο το προϊόν της μεταγραφής τους;

1. Πού πραγματοποιούνται η αντιγραφή και η μεταγραφή; ΘΩΜΑΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗ. 2. Ποιες είναι οι κατηγορίες γονιδίων με κριτήριο το προϊόν της μεταγραφής τους; Βιολογία Γ Ενιαίου Λυκείου / Θετική Κατεύθυνση κεφαλαιο 2ο: αντιγραφη, εκφραση και ρυθμιση τησ ΓενετικηΣ ΠληροφοριαΣ 1. Πού πραγματοποιούνται η αντιγραφή και η μεταγραφή; Ευκαρυωτικά κύτταρα: στον πυρήνα,

Διαβάστε περισσότερα

Κεφάλαιο 20 Η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς

Κεφάλαιο 20 Η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς Κεφάλαιο 20 Η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς Πυρίνας ανθρώπινου μεσοφασικού κυττάρου στον οποίο παρατηρούμε, με ανοσοφθορισμό, τη διάστικτη κατανομή της απακετυλάσης των

Διαβάστε περισσότερα

Βιολογία Ο.Π. Θετικών Σπουδών Γ' Λυκείου

Βιολογία Ο.Π. Θετικών Σπουδών Γ' Λυκείου Βιολογία Ο.Π. Θετικών Σπουδών Γ' Λυκείου ΘΕΜΑ Α Α1. Η αναλογία Α+G/T+C στο γενετικό υλικό ενός ιού είναι ίση με 2/3. Ο ιός μπορεί να είναι: α. ο φάγος λ. β. ο ιός της πολιομυελίτιδας. γ. φορέας κλωνοποίησης

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΕΙΚΟΝΙΣΗΣ ΤΩΝ ΟΓΚΩΝ

ΑΠΕΙΚΟΝΙΣΗΣ ΤΩΝ ΟΓΚΩΝ 2. ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΟ ΜΟΝΤΕΛΟ ΑΠΕΙΚΟΝΙΣΗΣ ΤΩΝ ΟΓΚΩΝ Οι όγκοι χαρακτηρίζονται από πολλαπλές αλλαγές του μεταβολισμού. Η χαρακτηριστική μεταβολική λειτουργία μπορεί να μετρηθεί in vivo με τη βοήθεια ενός ραδιοσημασμένου

Διαβάστε περισσότερα

Το σύστημα τελομερών/τελομεράσης στις χρόνιες φλεγμονώδεις διαταραχές

Το σύστημα τελομερών/τελομεράσης στις χρόνιες φλεγμονώδεις διαταραχές Το σύστημα τελομερών/τελομεράσης στις χρόνιες φλεγμονώδεις διαταραχές Βιβλιογραφική Ανασκόπηση Κορδίνας Βασίλειος Μοριακός Βιολόγος και Γενετιστής Ειδικευόμενος Παθολόγος Γενικό Νοσοκομείο Νίκαιας-Πειραιά

Διαβάστε περισσότερα

Εξέλιξη και ανθρώπινος πολιτισμός: Η ρύθμιση του γονιδίου της λακτάσης

Εξέλιξη και ανθρώπινος πολιτισμός: Η ρύθμιση του γονιδίου της λακτάσης Εξέλιξη και ανθρώπινος πολιτισμός: Η ρύθμιση του γονιδίου της λακτάσης Η διατήρηση του ενζύμου της λακτάσης στους ενήλικες είναι ένα παράδειγμα πρόσφατης εξέλιξης στον άνθρωπο. Μας δείχνει επίσης πώς μεταλλαγές

Διαβάστε περισσότερα

4. Η κίρρωση του ήπατος προκαλείται εξαιτίας της αποθήκευσης στα ηπατικά κύτταρα: Πρωτεϊνών Υδατανθράκων Λιπών Αλκοόλ

4. Η κίρρωση του ήπατος προκαλείται εξαιτίας της αποθήκευσης στα ηπατικά κύτταρα: Πρωτεϊνών Υδατανθράκων Λιπών Αλκοόλ ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΓΠ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ (ΘΕΡΙΝΑ) ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 22/10/2017 ΕΠΙΜΕΛΕΙΑ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑΤΟΣ ΛΑΖΑΡΑΚΗ ΝΟΤΑ ΘΕΜΑ Α Να επιλέξετε τη φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις: 1. Το

Διαβάστε περισσότερα

Επικαιροποιημένα μέτρα για την πρόληψη εγκυμοσύνης κατά τη χρήση ρετινοειδών

Επικαιροποιημένα μέτρα για την πρόληψη εγκυμοσύνης κατά τη χρήση ρετινοειδών Επικαιροποιημένα μέτρα για την πρόληψη εγκυμοσύνης κατά τη χρήση ρετινοειδών Προειδοποίηση για πιθανό κίνδυνο εμφάνισης νευροψυχιατρικών διαταραχών με τα από του στόματος ρετινοειδή Ο Ευρωπαϊκός Οργανισμός

Διαβάστε περισσότερα

Να επιλέξετε την φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις:

Να επιλέξετε την φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις: ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 2/12/2016 ΕΠΙΜΕΛΕΙΑ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑΤΟΣ: ΛΑΖΑΡΑΚΗ ΝΟΤΑ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α Να επιλέξετε την φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες

Διαβάστε περισσότερα

ENOTHTA 11. ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΑΣΘΕΝΕΙΕΣ ΤΟΥ ΔΕΡΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΤΡΙΧΑΣ ΤΗΣ ΚΕΦΑΛΗΣ

ENOTHTA 11. ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΑΣΘΕΝΕΙΕΣ ΤΟΥ ΔΕΡΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΤΡΙΧΑΣ ΤΗΣ ΚΕΦΑΛΗΣ ENOTHTA 11. ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΑΣΘΕΝΕΙΕΣ ΤΟΥ ΔΕΡΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΤΡΙΧΑΣ ΤΗΣ ΚΕΦΑΛΗΣ 11.1 Δομή του δέρματος της κεφαλής Διδακτικοί Στόχοι: Να μπορείτε (α) να αναφέρετε τι είναι το δέρμα (β) να αναφέρετε τις στιβάδες

Διαβάστε περισσότερα

Γνωριμία με τα αυτοάνοσα ρευματικά νοσήματα

Γνωριμία με τα αυτοάνοσα ρευματικά νοσήματα Γνωριμία με τα αυτοάνοσα ρευματικά νοσήματα Αντώνης Φανουριάκης Μονάδα Ρευματολογίας και Κλινικής Ανοσολογίας Δ Πανεπιστημιακή Παθολογική Κλινική Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο «Αττικόν» Αθήνα, 01/02/2016

Διαβάστε περισσότερα

Ατυπία Υπερπλασία- Δυσπλασία. Κίττυ Παυλάκη

Ατυπία Υπερπλασία- Δυσπλασία. Κίττυ Παυλάκη Ατυπία Υπερπλασία- Δυσπλασία Κίττυ Παυλάκη Jeanne Calment Κάπνιζε µέχρι τα 117 Πέθανε στα 122 Η σωστή λειτουργία των οργανισµών απαιτεί τη δυνατότητα προσαρµογής των κυττάρων και κατά συνέπεια και των

Διαβάστε περισσότερα

Ρευματοειδής αρθρίτιδα

Ρευματοειδής αρθρίτιδα Ρευματοειδής αρθρίτιδα Μ.Ν. Μανουσάκης En. Καθηγητής Ιατρικής Σχολής Πανεπιστημίου Αθηνών ρευματοειδής αρθρίτιδα είναι μία χρόνια φλεγμονή των αρθρώσεων (Πιν. 1). Με τον όρο χρόνια φλεγμονή των αρθρώσεων,

Διαβάστε περισσότερα

Κεφάλαιο 4: Ανασυνδυασμένο DNA

Κεφάλαιο 4: Ανασυνδυασμένο DNA Κεφάλαιο 4: Ανασυνδυασμένο DNA 1. Η ανάπτυξη της γενετικής μηχανικής επέτρεψε: α. την κατανόηση των μηχανισμών αντιγραφής του γενετικού υλικού β. την απομόνωση των πλασμιδίων από τα βακτήρια γ. την πραγματοποίηση

Διαβάστε περισσότερα

ΜΕΤΑΜΟΣΧΕΥΣΗ ΝΕΦΡΟΥ. Λειτουργία των νεφρών. Συμπτώματα της χρόνιας νεφρικής ανεπάρκειας

ΜΕΤΑΜΟΣΧΕΥΣΗ ΝΕΦΡΟΥ. Λειτουργία των νεφρών. Συμπτώματα της χρόνιας νεφρικής ανεπάρκειας ΜΕΤΑΜΟΣΧΕΥΣΗ ΝΕΦΡΟΥ Η χρόνια νεφρική ανεπάρκεια είναι η προοδευτική, μη αναστρέψιμη μείωση της νεφρικής λειτουργίας, η οποία προκαλείται από βλάβη του νεφρού ποικίλης αιτιολογίας. Η χρόνια νεφρική ανεπάρκεια

Διαβάστε περισσότερα

Επιστημονικά Δεδομένα για τη βιοχημική δράση της αντιοξειδωτικής Βιταμίνης C.

Επιστημονικά Δεδομένα για τη βιοχημική δράση της αντιοξειδωτικής Βιταμίνης C. Βιταμίνη C - Ενισχύει το ανοσοποιητικό με 20 διαφορετικούς τρόπους - ΚΑΛΑΜΠΑΚΑ CITY KALAMP Επιστημονικά Δεδομένα για τη βιοχημική δράση της αντιοξειδωτικής Βιταμίνης C. Η βιταμίνη C, γνωστή και ως ασκορβικό

Διαβάστε περισσότερα

Ψωρίαση: ο πονοκέφαλος του δερματολόγου και του ασθενούς

Ψωρίαση: ο πονοκέφαλος του δερματολόγου και του ασθενούς Ψωρίαση: ο πονοκέφαλος του δερματολόγου και του ασθενούς Αντώνης Βαρελιζίδης Ομοτ. Καθηγητής Δερματολογίας, Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών Δ εν υπάρχει πιο πολυπρόσωπη δερματοπάθεια από την ψωρίαση.

Διαβάστε περισσότερα

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 4 Ο, 7 Ο, 8 Ο, 9 Ο ΚΕΦΑΛΑΙΩΝ

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 4 Ο, 7 Ο, 8 Ο, 9 Ο ΚΕΦΑΛΑΙΩΝ ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 4 Ο, 7 Ο, 8 Ο, 9 Ο ΚΕΦΑΛΑΙΩΝ 1. Η μεταφορά ανθρώπινου γονιδίου σε βακτήριο δίνει διαφορετικό προϊόν μεταγραφής και μετάφρασης, ενώ σε μύκητες μεταγράφεται κανονικά αλλά το προϊόν μετάφρασης εμφανίζει

Διαβάστε περισσότερα

Συστηματικός ερυθηματώδης λύκος: το πρότυπο των αυτόάνοσων ρευματικών νοσημάτων

Συστηματικός ερυθηματώδης λύκος: το πρότυπο των αυτόάνοσων ρευματικών νοσημάτων Συστηματικός ερυθηματώδης λύκος: το πρότυπο των αυτόάνοσων ρευματικών νοσημάτων Φ.Ν. Σκοπούλη Καθηγήτρια τον Χαροκόπειου Πανεπιστημίου Αθηνών συστηματικός ερυθηματώδης λύκος θεωρείται η κορωνίδα των αυτοάνοσων

Διαβάστε περισσότερα

ΦΛΥΚΤΑΙΝΩΔΗΣ ΨΩΡΙΑΣΗ ΣΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΜΕ ADALIMUBAB

ΦΛΥΚΤΑΙΝΩΔΗΣ ΨΩΡΙΑΣΗ ΣΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΜΕ ADALIMUBAB ΦΛΥΚΤΑΙΝΩΔΗΣ ΨΩΡΙΑΣΗ ΣΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΜΕ ADALIMUBAB Γυναίκα ετών 52 με ΡΑ από 20ετίας Θεραπεία με DMARDS έως το 2004 2005-2006 θεραπεία με ANAKINRA 2007-2008 θεραπεία με ETANERCEPT 2009-2010 θεραπεία με ADALIMUMAB

Διαβάστε περισσότερα

Χρόνια φλεγμονή. Βαλεντίνη Τζιούφα-Ασημακοπούλου. Νοέμβριος 2018

Χρόνια φλεγμονή. Βαλεντίνη Τζιούφα-Ασημακοπούλου. Νοέμβριος 2018 Χρόνια φλεγμονή Βαλεντίνη Τζιούφα-Ασημακοπούλου Νοέμβριος 2018 Οξεία φλεγμονή Ταχεία εισβολή και λύση Εξιδρωματικά στοιχεία Πολυμορφοπύρηνα Χρόνια φλεγμονή Ύπουλη εισβολήπαρατεταμένη πορείαβραδεία λύση

Διαβάστε περισσότερα

Το Humira είναι φάρμακο που δρα στο ανοσοποιητικό σύστημα και χρησιμοποιείται για τη θεραπεία των ακόλουθων παθήσεων:

Το Humira είναι φάρμακο που δρα στο ανοσοποιητικό σύστημα και χρησιμοποιείται για τη θεραπεία των ακόλουθων παθήσεων: EMA/518634/2017 EMEA/H/C/000481 Περίληψη EPAR για το κοινό αδαλιμουμάμπη Το παρόν έγγραφο αποτελεί σύνοψη της Ευρωπαϊκής Δημόσιας Έκθεσης Αξιολόγησης (EPAR) του. Επεξηγεί τον τρόπο με τον οποίο ο Οργανισμός

Διαβάστε περισσότερα

Λειτουργική και γονιδιωματική ανάλυση της επίδρασης αναλόγων του ρετινοϊκού οξέος σε ανθρώπινα κερατινοκύτταρα

Λειτουργική και γονιδιωματική ανάλυση της επίδρασης αναλόγων του ρετινοϊκού οξέος σε ανθρώπινα κερατινοκύτταρα ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ Λειτουργική και γονιδιωματική ανάλυση της επίδρασης αναλόγων του ρετινοϊκού οξέος σε ανθρώπινα κερατινοκύτταρα Kατερίνα

Διαβάστε περισσότερα

Έλεγχος κυτταρικού κύκλου Πεφάνη Δάφνη Επίκουρη καθηγήτρια, Ιατρική σχολή ΕΚΠΑ Μιχαλακοπούλου 176, 1 ος όροφος

Έλεγχος κυτταρικού κύκλου Πεφάνη Δάφνη Επίκουρη καθηγήτρια, Ιατρική σχολή ΕΚΠΑ Μιχαλακοπούλου 176, 1 ος όροφος Έλεγχος κυτταρικού κύκλου Πεφάνη Δάφνη Επίκουρη καθηγήτρια, Ιατρική σχολή ΕΚΠΑ Μιχαλακοπούλου 176, 1 ος όροφος Πως το κύτταρο διπλασιάζει τα συστατικά του; Πως γίνεται ο διαχωρισμός των συστατικών στα

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΙ ΠΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΙ ΠΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΙ ΠΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών του ενδοσυμβιωτικού ιού του παρασιτοειδούς υμενόπτερου Cotesia congregata

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ 1ο. 1. γ 2. γ 3. δ 4. α 5. β

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ 1ο. 1. γ 2. γ 3. δ 4. α 5. β ΑΠΟΛΥΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΚΑΙ ΠΑΝΕΛΛΑ ΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΕΠΑΛ (ΟΜΑ Α Β ) ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 22 ΜΑΪΟΥ 2009 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΘΕΜΑ 1ο 1. γ 2. γ 3.

Διαβάστε περισσότερα

ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ / Γ ΛΥΚΕΙΟΥ (ΘΕΡΙΝΑ) ΣΕΙΡΑ: ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 15/11/2015

ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ / Γ ΛΥΚΕΙΟΥ (ΘΕΡΙΝΑ) ΣΕΙΡΑ: ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 15/11/2015 ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ / Γ ΛΥΚΕΙΟΥ (ΘΕΡΙΝΑ) ΣΕΙΡΑ: ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 15/11/2015 ΘΕΜΑ Α Να επιλέξετε την φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις: Α1. Η φαγοκυττάρωση

Διαβάστε περισσότερα

Ν. Κατσίκη[1], Α. Γκοτζαμάνη-Ψαρράκου[2], Φ. Ηλιάδης[1], Τρ. Διδάγγελος[1], Ι. Γιώβος[3], Δ. Καραμήτσος[1]

Ν. Κατσίκη[1], Α. Γκοτζαμάνη-Ψαρράκου[2], Φ. Ηλιάδης[1], Τρ. Διδάγγελος[1], Ι. Γιώβος[3], Δ. Καραμήτσος[1] Ολόγοςλεπτίνης/αδιπονεκτίνης ως ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας 10ετούς καρδιαγγειακού κινδύνου σε ινσουλινοθεραπευόμενους ασθενείς με διαβήτη τύπου 2 Ν. Κατσίκη[1], Α. Γκοτζαμάνη-Ψαρράκου[2], Φ. Ηλιάδης[1],

Διαβάστε περισσότερα

Β. ΚΑΜΙΝΕΛΛΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑ. Είναι η επιστήμη που μελετά τους ζωντανούς οργανισμούς. (Αποτελούνται από ένα ή περισσότερα κύτταρα).

Β. ΚΑΜΙΝΕΛΛΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑ. Είναι η επιστήμη που μελετά τους ζωντανούς οργανισμούς. (Αποτελούνται από ένα ή περισσότερα κύτταρα). ΒΙΟΛΟΓΙΑ Είναι η επιστήμη που μελετά τους ζωντανούς οργανισμούς. (Αποτελούνται από ένα ή περισσότερα κύτταρα). Είδη οργανισμών Υπάρχουν δύο είδη οργανισμών: 1. Οι μονοκύτταροι, που ονομάζονται μικροοργανισμοί

Διαβάστε περισσότερα

Σύντομη Περιγραφή Συνολικής Προόδου Φυσικού Αντικειμένου από την έναρξη του έργου μέχρι τις 30/06/2015

Σύντομη Περιγραφή Συνολικής Προόδου Φυσικού Αντικειμένου από την έναρξη του έργου μέχρι τις 30/06/2015 Σύντομη Περιγραφή Συνολικής Προόδου Φυσικού Αντικειμένου από την έναρξη του έργου μέχρι τις 30/06/2015 Δ1: Συντονισμός του έργου. Προκηρύξεις και επιλογή εξωτερικών επιστημονικών συνεργατών. Ολοκλήρωση

Διαβάστε περισσότερα

Τα ορμονικά μόρια και η διαχείριση τους μέσα στο φυτό

Τα ορμονικά μόρια και η διαχείριση τους μέσα στο φυτό Φυσιολογία Φυτών Διαχείριση ορμονικών μορίων Τα ορμονικά μόρια και η διαχείριση τους μέσα στο φυτό Φυσιολογία Φυτών 3 ου Εξαμήνου Δ. Μπουράνης, Σ. Χωριανοπούλου 1 Φυσιολογία Φυτών Διαχείριση ορμονικών

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΜΑ 1ο Να γράψετε στο τετράδιο σας τον αριθμό καθεμιάς από τις παρακάτω ημιτελείς προτάσεις 1 έως 5 και δίπλα το γράμμα που αντιστοιχεί στη φράση που συμπληρώνει

Διαβάστε περισσότερα

Βιολογία Προσανατολισμού Γ Λυκείου Κεφάλαιο: Κεφάλαια 1,2,4 Ονοματεπώνυμο Μαθητή: Ημερομηνία: 08/12/2018 Επιδιωκόμενος Στόχος: 75/100

Βιολογία Προσανατολισμού Γ Λυκείου Κεφάλαιο: Κεφάλαια 1,2,4 Ονοματεπώνυμο Μαθητή: Ημερομηνία: 08/12/2018 Επιδιωκόμενος Στόχος: 75/100 Μάθημα/Τάξη: Βιολογία Προσανατολισμού Γ Λυκείου Κεφάλαιο: Κεφάλαια 1,2,4 Ονοματεπώνυμο Μαθητή: Ημερομηνία: 08/12/2018 Επιδιωκόμενος Στόχος: 75/100 ΘΕΜΑ Α Να γράψετε στο τετράδιο σας τον αριθμό καθεμιάς

Διαβάστε περισσότερα

ΑΡΧΗ 1ΗΣ ΣΕΛΙ ΑΣ ΤΑΞΗ

ΑΡΧΗ 1ΗΣ ΣΕΛΙ ΑΣ ΤΑΞΗ ΑΡΧΗ 1ΗΣ ΣΕΛΙ ΑΣ ΑΠΟΛΥΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Σ ΕΣΠΕΡΙΝΟΥ ΕΝΙΑΙΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 2 ΙΟΥΝΙΟΥ 2006 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΣΥΝΟΛΟ ΣΕΛΙ ΩΝ: ΠΕΝΤΕ (5) ΘΕΜΑ 1ο Α. Για τις ημιτελείς προτάσεις

Διαβάστε περισσότερα

Ποιες είναι οι ομοιότητες και οι διαφορές μεταξύ της αντιγραφής και της

Ποιες είναι οι ομοιότητες και οι διαφορές μεταξύ της αντιγραφής και της ΚΕΦ. 2 ο ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΚΡΙΣΕΩΣ Ποιες είναι οι ομοιότητες και οι διαφορές μεταξύ της αντιγραφής και της μεταγραφής; Διαφορές Αντιγραφή Μεταγραφή 1. Διατηρείται και μεταβιβάζεται η 1. Μεταβιβάζεται η γενετική

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΟΛΥΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΤΡΙΤΗ 27 ΜΑΪΟΥ 2008 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ

ΑΠΟΛΥΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΤΡΙΤΗ 27 ΜΑΪΟΥ 2008 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΑΠΟΛΥΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΤΡΙΤΗ 27 ΜΑΪΟΥ 2008 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 1 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ 1ο 1. β 2. δ 3. β 4. δ 5. β ΘΕΜΑ 2ο 1. Σχολικό βιβλίο, σελ.

Διαβάστε περισσότερα

ΟΥΣΙΕΣ ΠΟΥ ΠΡΟΚΑΛΟΥΝ ΕΘΙΣΜΟ. Το πέρασμα από τη χρήση στον εθισμό έχει ασαφή όρια

ΟΥΣΙΕΣ ΠΟΥ ΠΡΟΚΑΛΟΥΝ ΕΘΙΣΜΟ. Το πέρασμα από τη χρήση στον εθισμό έχει ασαφή όρια ΟΥΣΙΕΣ ΠΟΥ ΠΡΟΚΑΛΟΥΝ ΕΘΙΣΜΟ Το πέρασμα από τη χρήση στον εθισμό έχει ασαφή όρια Βασικές έννοιες Εθισμός Μερικές από τις ουσίες που καταναλώνει ο άνθρωπος προκαλούν εθισμό, δηλαδή μεταβάλλουν τη λειτουργία

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. γ Α3. δ Α4. γ Α5. β

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. γ Α3. δ Α4. γ Α5. β ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. γ Α3. δ Α4. γ Α5. β 1 ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΤΟΥ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΥΠΑΛΛΗΛΩΝ ΣΤΟ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟ ΤΕΤΑΡΤΗ 10 ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΥ 2014 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ:

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΕΝΔΕΙΚΤΙΚΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΩΝ 2017 ΘΕΜΑ Α Α1. δ Α2. δ Α3. β Α4. γ Α5. α ΘΕΜΑ Β Β1. Ι Α, ΙΙ Ε, ΙΙΙ ΣΤ, ΙV Β, V Ζ, VII Γ, VII Δ Β2. Η εικόνα 1 αντιστοιχεί σε προκαρυωτικό κύτταρο. Στους προκαρυωτικούς

Διαβάστε περισσότερα

Φάσμα group προπαρασκευή για Α.Ε.Ι. & Τ.Ε.Ι.

Φάσμα group προπαρασκευή για Α.Ε.Ι. & Τ.Ε.Ι. σύγχρονο Φάσμα group προπαρασκευή για Α.Ε.Ι. & Τ.Ε.Ι. µαθητικό φροντιστήριο Γραβιάς 85 ΚΗΠΟΥΠΟΛΗ 50.51.557 50.56.296 25ης Μαρτίου 74 ΠΛ.ΠΕΤΡΟΥΠΟΛΗΣ 50.50.658 50.60.845 25ης Μαρτίου 111 ΠΕΤΡΟΥΠΟΛΗ 50.27.990

Διαβάστε περισσότερα

Μοριακή κυτταρική βιοχημεία Ανοσοποιητικό σύστημα

Μοριακή κυτταρική βιοχημεία Ανοσοποιητικό σύστημα Μοριακή κυτταρική βιοχημεία Ανοσοποιητικό σύστημα κωδικός μαθήματος: ETY-335 Χειμερινό εξάμηνο 2014 / 2015 Μαρία Χατζηνικολαΐδου mchatzin@materials.uoc.gr Έμφυτο και προσαρμοστικό ανοσοποιητικό σύστημα

Διαβάστε περισσότερα

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΚΑΤΑΝΟΗΣΗΣ

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΚΑΤΑΝΟΗΣΗΣ ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΚΑΤΑΝΟΗΣΗΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ο 1. Με ποιο μηχανισμό αντιγράφεται το DNA σύμφωνα με τους Watson και Crick; 2. Ένα κύτταρο που περιέχει ένα μόνο χρωμόσωμα τοποθετείται σε θρεπτικό υλικό που περιέχει ραδιενεργό

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΤΡΙΤΗ 18 ΙΟΥΝΙΟΥ 2019 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΕΝΔΕΙΚΤΙΚΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ

ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΤΡΙΤΗ 18 ΙΟΥΝΙΟΥ 2019 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΕΝΔΕΙΚΤΙΚΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΤΡΙΤΗ 18 ΙΟΥΝΙΟΥ 2019 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΕΝΔΕΙΚΤΙΚΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α Α1 α Α2 β Α3 γ Α4 γ Α5 β ΘΕΜΑ Β Β1. 1 ζ 2 στ 3

Διαβάστε περισσότερα

04/11/2018 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΝΟΤΑ ΛΑΖΑΡΑΚΗ ΘΕΜΑ Α

04/11/2018 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΝΟΤΑ ΛΑΖΑΡΑΚΗ ΘΕΜΑ Α ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ 04/11/2018 ΝΟΤΑ ΛΑΖΑΡΑΚΗ ΘΕΜΑ Α Να επιλέξετε τη φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις: 1. Πυρηνική περιοχή διαθέτει: Α. Ο ιός της

Διαβάστε περισσότερα

ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΑ ΜΗΤΑΛΑΣ ΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙ ΕΙΑΣ

ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΑ ΜΗΤΑΛΑΣ ΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙ ΕΙΑΣ ΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙ ΕΙΑΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1.3 : ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΑΜΥΝΑΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥ ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΑΝΟΣΙΑΣ ΘΕΜΑ 1 Χαρακτηρίστε τις προτάσεις ως σωστές ή λανθασµένες. 1. Οι βλεννογόνοι

Διαβάστε περισσότερα

Χρωμοσώματα και ανθρώπινο γονιδίωμα Πεφάνη Δάφνη

Χρωμοσώματα και ανθρώπινο γονιδίωμα Πεφάνη Δάφνη Χρωμοσώματα και ανθρώπινο γονιδίωμα Πεφάνη Δάφνη 12.02.2019 Νουκλεoτίδια-Δομικοί λίθοι του DNA H διπλή έλικα του DNAχωροπληρωτικό μοντέλο To ευκαρυωτικό DNA οργανώνεται σε χρωμοσώματα Τα χρωμοσώματα περιέχουν

Διαβάστε περισσότερα

Απόσπασμα από το βιβλίο «Πως να ζήσετε 150 χρόνια» του Dr. Δημήτρη Τσουκαλά

Απόσπασμα από το βιβλίο «Πως να ζήσετε 150 χρόνια» του Dr. Δημήτρη Τσουκαλά Απόσπασμα από το βιβλίο «Πως να ζήσετε 150 χρόνια» του Dr. Δημήτρη Τσουκαλά 10 ο Κεφάλαι ο Όλοι ευχόμαστε να υπήρχε ένα μαγικό χάπι που να μας έλυνε όλα τα προβλήματα. Έπειτα από 25 χρόνια έρευνας, οι

Διαβάστε περισσότερα

ΕΠΙΝΕΦΡΙΔΙΑ ΚΟΡΤΙΖΟΛΗ

ΕΠΙΝΕΦΡΙΔΙΑ ΚΟΡΤΙΖΟΛΗ ΕΠΙΝΕΦΡΙΔΙΑ ΚΟΡΤΙΖΟΛΗ Μεταβολισμός της κορτιζόλης Η κορτιζόλη μεταβολίζεται στο ήπαρ. Στην συνέχεια οι μεταβολίτες συζευγνύνται με γλυκουρονιδικές και θειικές ομάδες, γίνονται υδατοδιαλυτά, εισέρχονται

Διαβάστε περισσότερα

Τοπική θεραπεία : Ποια & πότε

Τοπική θεραπεία : Ποια & πότε ΑΚΜΗ από το Α έως το Ω κλινικό φροντιστήριο Τοπική θεραπεία : Ποια & πότε Παντελής Παναγάκης Δερματολόγος - Αφροδισιολόγος Νοσοκομείο «Ανδρέας Συγγρός» Η πιο κοινή δερματική πάθηση Μία φυσιολογική κατάσταση

Διαβάστε περισσότερα

ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΕΚΠ. ΕΤΟΥΣ

ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΕΚΠ. ΕΤΟΥΣ ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΟΥ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 05/02/1017 ΘΕΜΑ 1 ο Α1. Τα βακτήρια του γένους Mycobacterium: α. είναι προκαρυωτικοί οργανισμοί. Α2. Η προσαρμογή των μικροοργανισμών

Διαβάστε περισσότερα

ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΕΘΝΙΚΟΥ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ ΜΟΝΑΔΑ ΕΡΕΥΝΑΣ Β'ΠΡΟΠΑΙΔΕΥΤΙΚΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗΣ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Θ.

ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΕΘΝΙΚΟΥ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ ΜΟΝΑΔΑ ΕΡΕΥΝΑΣ Β'ΠΡΟΠΑΙΔΕΥΤΙΚΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗΣ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Θ. ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΕΘΝΙΚΟΥ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ ΜΟΝΑΔΑ ΕΡΕΥΝΑΣ Β'ΠΡΟΠΑΙΔΕΥΤΙΚΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗΣ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Θ. ΟΙΚΟΝΟΜΟΠΟΥΛΟΣ 1 ΙΕΡΙΛΗΨΗ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ: ΕΡΙΦΥΛΗ ΚΥΡΙΑΖΗ

Διαβάστε περισσότερα

Συστήματα επικοινωνίας Ανθρωπίνου σώματος. ενδοκρινολογικό νευρικό σύστημα

Συστήματα επικοινωνίας Ανθρωπίνου σώματος. ενδοκρινολογικό νευρικό σύστημα Κύτταρο Το κύτταρο αποτελείται από μέρη τα οποία έχουν συγκεκριμένη δομή και επιτελούν μία συγκεκριμένη λειτουργία στην όλη οργάνωση του κυττάρου. Δομή κυτταροπλασματικής μεμβράνης Συστήματα επικοινωνίας

Διαβάστε περισσότερα

Γυμνάσιο Κερατέας ΚΑΡΚΙΝΟΣ & ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ. Αναστασία Σουλαχάκη Κωνσταντίνα Πρίφτη

Γυμνάσιο Κερατέας ΚΑΡΚΙΝΟΣ & ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ. Αναστασία Σουλαχάκη Κωνσταντίνα Πρίφτη Γυμνάσιο Κερατέας ΚΑΡΚΙΝΟΣ & ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ Αναστασία Σουλαχάκη Κωνσταντίνα Πρίφτη 2013 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ : Ορολογία και λίγα λόγια για τον καρκίνο Χαρακτηριστικά του καρκίνου Μεταλλάξεις Μεταλλάξεις και καρκίνος

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ ΤΟΥ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΥ

ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ ΤΟΥ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΥ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ ΤΟΥ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΥ ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ 6 Η ΚΑΤΑΝΑΛΩΣΗ ΥΔΑΤΑΝΘΡΑΚΩΝ ΚΑΙ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΓΛΥΚΑΙΜΙΑΣ 1 Έλεγχος της ενέργειας Τα πραγματικά «Βιοκαύσιμα» 2 Υδατανθρακούχα τρόφιμα 3 Σημασία της ρύθμισης κατανάλωσης

Διαβάστε περισσότερα

Περιορισμοί στη χρήση του Xeljanz ενώ ο Ευρωπαϊκός Οργανισμός Φαρμάκων (ΕΜΑ) εξετάζει τον κίνδυνο εμφάνισης θρόμβων αίματος στους πνεύμονες

Περιορισμοί στη χρήση του Xeljanz ενώ ο Ευρωπαϊκός Οργανισμός Φαρμάκων (ΕΜΑ) εξετάζει τον κίνδυνο εμφάνισης θρόμβων αίματος στους πνεύμονες 17 Μαίου 2019 ΕΜΑ/267216/2019 Περιορισμοί στη χρήση του Xeljanz ενώ ο Ευρωπαϊκός Οργανισμός Φαρμάκων (ΕΜΑ) εξετάζει τον κίνδυνο εμφάνισης θρόμβων αίματος στους πνεύμονες Η Επιτροπή Φαρμακοεπαγρύπνησης

Διαβάστε περισσότερα

Το Stelara είναι φάρμακο που χρησιμοποιείται για τη θεραπεία των ακόλουθων παθήσεων:

Το Stelara είναι φάρμακο που χρησιμοποιείται για τη θεραπεία των ακόλουθων παθήσεων: EMA/636854/2016 EMEA/H/C/000958 Περίληψη EPAR για το κοινό ουστεκινουμάμπη Το παρόν έγγραφο αποτελεί σύνοψη της Ευρωπαϊκής Δημόσιας Έκθεσης Αξιολόγησης (EPAR) του. Επεξηγεί τον τρόπο με τον οποίο ο Οργανισμός

Διαβάστε περισσότερα