hgh-easia KAP1081 DIAsource ImmunoAssays S.A. - Rue de l'industrie, 8 - B-1400 Nivelles - Belgium

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1 hgheasia KAP1081 DIAsource ImmunoAssays S.A. Rue de l'industrie, 8 B1400 Nivelles Belgium

2 : 0904/1

3 en Read entire protocol before use. hgheasia I. INTENDED USE Immunoenzymetric assay for the in vitro quantitative measurement of human Growth Hormone (hgh) in serum and plasma. II. GENERAL INFORMATION A. Proprietary name : DIAsource hgheasia Kit B. Catalogue number : KAP1081 : 96 tests C. Manufactured by : DIAsource ImmunoAssays S.A. Rue de l'industrie, 8, B1400 Nivelles, Belgium. III. CLINICAL BACKGROUND For technical assistance or ordering information contact : Tel : +32 (0) Fax : +32 (0) A. Biological activities hgh is a polypeptide hormone (molecular weight 21,0 Da) produced by the acidophil cells of the anterior pituitary under the control of two main substances from the median eminence : Growthhormone Releasing Factor (GRF) and an inhibitory agent, somatostatin. Dopaminergic, adrenergic and serotoninergic neuroendocrine pathways also play an important role in the control of hgh secretion. Excitatory stimuli of hgh secretion include hypoglycemia, exercise, fasting, meals with a high protein content, deep sleep, stress, glucagon, L Dopa, amino acids, etc. Inhibitory stimuli include glucose, cortisol, hgh and free fatty acids. Because of its short plasma half life (±25 minutes) and of the frequent excitatory or inhibitory stimuli, hgh displays frequent and large variations of concentration in serum. One of the main physiological functions of hgh is to act on the liver and other tissues to produce somatomedins, which in turn induce growth by direct action on target tissues. In contrast to hgh, the concentration of somatomedins in serum is kept stable by virtue of being largely bound to circulating plasma proteins. B. Clinical application Growth retardation hgh hyposecretion is one of the various causes of small stature in children. Serum hgh measurement with a highly sensitive assay, especially following a provocative stimulus (absence of response), is an important way to establish this diagnosis because this group of patients can be treated by administration of hgh. Hypopituitarism Serum hgh measurement is also an index of pituitary function when hypopituitarism (either idiopathic or due to tumour and surgery) is suspected. Gigantism and acromegaly Serum hgh measurement, especially following a provocative inhibitory test (absence of response), is an important way to establish the diagnosis of hgh hypersecretion due to acidophilic pituitary tumour. This results in gigantism in children and acromegaly in adults. Both of these disorders may be treated by surgery or radiation.

4 IV. PRINCIPLES OF THE METHOD The DIAsource HGHEASIA is a solid phase Enzyme Amplified Sensitivity Immunoassay performed on a microtiterplate. Calibrators and samples react with the capture monoclonal antibody (M 1) coated on microtiter well and with a monoclonal antibody (M 2) labelled with horseradish peroxidase (HRP). After an incubation period allowing the formation of a sandwich: coated M 1 hgh M 2 HRP, the microtiterplate is washed to remove unbound enzyme labelled antibody. Bound enzymelabelled antibody is measured through a chromogenic reaction. The Chromogenic Solution (TMB H 2O 2) is added and incubated. The reaction is stopped with the addition of Stop Solution and the microtiterplate is then read at the appropriate wavelength. The amount of substrate turnover is determined colourimetrically by measuring the absorbance, which is proportional to the hgh concentration. A calibration curve is plotted and hgh concentration in samples is determined by interpolation from the calibration curve. V. REAGENTS PROVIDED Reagents Conjugate: HRP labelled antihgh (monoclonal antibodies) in stabilizing buffer Conjugate buffer: TRISHCl buffer with bovine serum albumin and thymol Zero calibrator in sheep serum and thymol Calibrator N = 1 to 5 (see exact values on vial labels) in sheep serum and thymol Wash Solution (TrisHCl) Controls N = 1 or 2 in human serum with thymol Chromogen TMB Solution (Tetramethylbenzydine) Stop Solution: HCl 1N 96 tests Kit Color Code Reconstitution 96 wells blue Ready to use 1 vial 0,2 ml 1 vial 6 ml 1 vial lyophilized 5 vials lyophilized 1 vial 10 ml 2 vials lyophilized 1 vial 12 ml 1 vial 12 ml yellow red yellow yellow brown silver brown white Dilute 40X with conjugate buffer Ready to use Add 2.0 ml distilled water Add 0.5 ml distilled water Dilute 200 x with distilled water (use a magnetic stirrer). Add 0.5 ml distilled water Ready to use Ready to use Note: 1. Use the zero calibrator for sample dilutions µiu of the calibrator preparation is equivalent to 1 µiu of the 2 nd IS 98/574. VI. CAL CAL WASH CONTROL STOP CONJ CHROM Breakable microtiterplate with 96 anti hgh (monoclonal antibodies) coated wells HRP 0 N SOLN TMB SOLN BUF N CONC CONC SUPPLIES NOT PROVIDED The following material is required but not provided in the kit: 1. High quality distilled water 2. Pipettes for delivery of: μl, 200 µl, 0 µl and 2 ml (the use of accurate pipettes with disposable plastic tips is recommended) 3. Vortex mixer 4. Magnetic stirrer 5. Washer for microtiterplates 6. Microtiterplate reader capable of reading at 4 nm and 6 nm (bichromatic reading) VII. REAGENT PREPARATION A. Calibrators : Reconstitute the zero calibrator with 2.0 ml distilled water and the other calibrators with 0.5 ml distilled water. B. Controls : Reconstitute the controls with 0.5 ml distilled water. C. Working antihghhrp conjugate: Prepare an adequate volume of conjugate solution by adding 25 µl of the concentrated antihghhrp conjugate to 1 ml of conjugate buffer. Use a vortex to homogenize. Extemporaneous preparation is recommended. D. Working Wash Solution : Prepare an adequate volume of Working Wash Solution by adding 199 volumes of distilled water to 1 volume of Wash Solution (200x). Use a magnetic stirrer to homogenize. Discard unused Working Wash Solution at the end of the day. VIII. STORAGE AND EXPIRATION DATING OF REAGENTS Before opening or reconstitution, all kits components are stable until the expiry date, indicated on the vial label, if kept at 2 to 8 C. Unused wells must be stored, at 28 C, in a sealed bag containing a desiccant until expiration date. After reconstitution, calibrators and controls are stable for 1 week at 2 to 8 C. For longer storage periods, aliquots should be made and kept at 20 C. Avoid successive freeze thaw cycles. The concentrated Wash Solution is stable at room temperature until expiration date. Freshly prepared Working Wash Solution should be used on the same day. After its first use, the conjugate is stable until expiry date, if kept in the original wellclosed vial at 2 to 8 C. Alterations in physical appearance of kit reagents may indicate instability or deterioration. IX. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION Serum and plasma must be kept at 2 8 C. If the test is not run within 24 hours, storage in aliquots at 20 C is recommended. Avoid subsequent freeze thaw cycles. Prior to use, all samples should be at room temperature. It is recommended to vortex the samples before use. Serum, heparinized plasma or EDTA plasma provide similar results. Y(serum) = 0.89 x (EDTA plasma) µiu/ml r=0.98 n=46 Y(serum) = 1.02 x (Heparin plasma) µiu/ml r=0.98 n=46 Do not use haemolysed samples. X. PROCEDURE A. Handling notes Do not use the kit or components beyond expiry date. Do not mix materials from different kit lots. Bring all the reagents to room temperature prior to use. Thoroughly mix all reagents and samples by gentle agitation or swirling. Perform calibrators, controls and samples in duplicate. Vertical alignment is recommended. Use a clean plastic container to prepare the Wash Solution. In order to avoid crosscontamination, use a clean disposable pipette tip for the addition of each reagent and sample. For the dispensing of the Chromogenic Solution and the Stop Solution avoid pipettes with metal parts. High precision pipettes or automated pipetting equipment will improve the precision. Respect the incubation times. To avoid drift, the time between pipetting of the first calibrator and the last sample must be limited to the time mentioned in section XIII paragraph E (Time delay). Prepare a calibration curve for each run, do not use data from previous runs. Dispense the Chromogenic Solution within 15 minutes following the washing of the microtiterplate. During incubation with Chromogenic Solution, avoid direct sunlight on the microtiterplate.

5 B. Procedure 1. Select the required number of wells for the run. The unused wells should be resealed in the bag with a desiccant and stored at 28 C. 2. Secure the wells into the holding frame. 3. Pipette µl of each Calibrator, Control and Sample into the appropriate wells. 4. Pipette µl of working antihghhrp conjugate into all the wells. 5. Incubate for 30 minutes at room temperature It is mandatory to respect the 30 minuteduration of this incubation 6. Aspirate the liquid from each well. 7. Wash the plate 3 times by: Dispensing 0.4 ml of Wash Solution into each well Aspirating the content of each well 8. Pipette 100 µl of the Chromogenic Solution into each well within 15 minutes following the washing step. 9. Incubate the microtiterplate for 30 minutes at room temperature, avoid direct sunlight. 10. Pipette 100 µl of Stop Solution into each well. 11. Read the absorbencies at 4 nm (reference filter 630 nm or 6 nm) within 1 hour and calculate the results as described in section XI. XI. CALCULATION OF RESULTS 1. Read the plate at 4 nm against a reference filter set at 6 nm (or 630 nm). 2. Calculate the mean of duplicate determinations. 3. On semilogarithmic or linear graph paper plot the OD values (ordinate) for each calibrator against the corresponding concentration of hgh (abscissa) and draw a calibration curve through the calibrator points by connecting the plotted points with straight lines. 4. Read the concentration for each control and sample by interpolation on the calibration curve. 5. Computer assisted data reduction will simplify these calculations. If automatic result processing is used, a 4parameter logistic function curve fitting is recommended. XII. TYPICAL DATA The following data are for illustration only and should never be used instead of the real time calibration curve. Calibrator hgheasia 0.00 μiu/ml 0.45 μiu/ml 5.40 μiu/ml μiu/ml 43. μiu/ml μiu/ml XIII. PERFORMANCE AND LIMITATIONS OD units A. Detection Limit Twenty zero calibrators were assayed along with a set of other calibrators. The detection limit, defined as the apparent concentration two standard deviations above the average OD at zero binding, was 0.17 μiu/ml. C. Precision INTRA ASSAY Serum N <X> ± SD A B ± ± 0.90 CV SD : Standard Deviation; CV: Coefficient of variation D. Accuracy Sample Serum Plasma Added hgh INTER ASSAY Serum N <X> ± SD A B RECOVERY TEST 8 8 Recovered hgh DILUTION TEST Sample Dilution Theoretical Concent. Serum 1 Serum 2 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 Samples were diluted with zero calibrator. Conversion factor : µIU hgheasia Calibrator = 0.33 ng ± ± 1.2 Recovery CV Measured Concent E. Time delay between last calibrator and sample dispensing As shown hereafter, assay results remain accurate even when a sample is dispensed 60 minutes after the calibrators have been added to the coated wells. TIME DELAY 0 min 10 min 20 min 30 min 45 min 60 min B. Specificity Crossreactive hormones were added to a low and to a high hgh value Control sample. The apparent hgh response was measured. S1 S added Hormone hgh C1 hgh C2 µiu/ml µiu/ml hcg miu/ml hpl ng/ml PRL 120 ng/ml F. Hook effect A sample spiked with hgh up to 4000 μiu/ml gives higher OD s than the last calibrator point.

6 XIV. INTERNAL QUALITY CONTROL If the results obtained for Control 1 and/or Control 2 are not within the range specified on the vial label, the results cannot be used unless a satisfactory explanation for the discrepancy has been given. If desirable, each laboratory can make its own pools of control samples, which should be kept frozen in aliquots. Controls that contain azide will interfere with the enzymatic reaction and cannot be used. Acceptance criteria for the difference between the duplicate results of the samples should rely on Good Laboratory Practises It is recommended that Controls be routinely assayed as unknown samples to measure assay variability. The performance of the assay should be monitored with quality control charts of the controls. It is good practise to check visually the curve fit selected by the computer. XV. REFERENCE INTERVALS These values are given only for guidance; each laboratory should establish its own normal range of values. In normal subjects, growth hormone (hgh) secretion is pulsatile. During daytime, hgh concentrations range from <0.210 μiu/ml. During sleep, hgh concentrations increase consistently (± 30 μiu/ml). hgh secretion is greatly stimulated by exercise and stress (venous puncture, hypoglycemia,...), but is decreased by hyperglycemia. In normal subjects (n=34), two hours after oral glucose load (75 g in adults), hgh levels were lower than 10 μiu/ml and the hgh response to stimulation tests (insulin, arginine, glucagon administration) exceeded 20 μiu/ml. hgh levels were elevated (even after glucose load) in acromegaly (> 10 μiu/ml). In hgh deficiency, the response to stimulation test is absent or blunted (short stature by hgh deficiency; hypopituitarism from various origins). XVI. PRECAUTIONS AND WARNINGS 3. DROBNY E.C., AMBURN K., BAUMANN G. (1983) Circadian variation of basal plasma growth hormone in man. J. Clin. Endo. and Metab., 57: HASHIDA S., NAKAWAGA K., ISHIKAWA E., OHTAKI S. (1985) Basal level of human growth hormone (hgh) in normal serum. Clin. Chim. Acta, 151: LEWIS V.J. et al. (1980) Human growth hormone : A complex of proteins. Rec. Progr. Horm. Res., 36: LI C.H. (1974) Human growth hormone : perspective on its chemistry and physiology. In : "Advances in human growth hormone research", S. Raiti ed. U.S. Department of Health, Education and Welfare Publ. DMEW publ. no. (NJH) 74612, p REUTENS AT. (1995) Evaluation and application of a highly sensitive assay for serum growth hormone (GH) in the study of adult GH deficiency. J. Clin. Endocrinol. Metab., 80(2): CROWLEY S. et al. (1995) Growth and the growth hormone axis in prepubertal children with asthma. J. Pediatr. 126(2): KELLY JT. et al. (1993) Effect of different oral oestrogen formulations on insulinlike growth factor I, growth hormone and growth hormone binding protein in postmenopausal women. Clin. Endocrinol. 39(5) : Safety For in vitro diagnostic use only. The human blood components included in this kit have been tested by European approved and/or FDA approved methods and found negative for HBsAg, anti HCV, antihiv1 and 2. No known method can offer complete assurance that human blood derivatives will not transmit hepatitis, AIDS or other infections. Therefore, handling of reagents, serum or plasma specimens should be in accordance with local safety procedures. All animal products and derivatives have been collected from healthy animals. Bovine components originate from countries where BSE has not been reported. Nevertheless, components containing animal substances should be treated as potentially infectious. Avoid any skin contact with all reagents. In case of contact, wash thoroughly with water. Do not smoke, drink, eat or apply cosmetics in the working area. Do not pipette by mouth. Use protective clothing and disposable gloves. XVIII. SUMMARY OF THE PROTOCOL Calibrators (05) Controls, Samples Working AntihGHHRP conjugate CALIBRATORS (µl) Incubate for 30 minutes at room temperature Aspirate the contents of each well. Wash 3 times with 400 µl of Wash Solution and aspirate. SAMPLE(S) CONTROLS (µl) XVII. BIBLIOGRAPHY 1. CAMANNI F., MASSARA F., BELFORTE L., ROSATELLO A., MOLENATTI G.M. (1977) Effect of dopamine on plasma growth hormone and prolactin levels in normal and acromegalic subjects. J. Clin. Endo. and Metab., 44: DAUGHADAY W.H. (1981) The adenohypophysis In : "Textbook of Endocrinology", R.H. Williams ed., W.B. Saunders, Philadelphia, p;73. Chromogenic Solution Incubate for 30 minutes at room temperature Stop Solution Read on a microtiterplate reader and record the absorbance of each well at 4 nm (versus 630 or 6 nm). DIAsource Catalogue Nr : KAP1081 P.I. Number : /en Revision nr : 0904/1 Revision date :

7 fr Lire entièrement le protocole avant utilisation. hgheasia I. BUT DU DOSAGE Trousse de dosage immunoenzymatique pour la mesure quantitative in vitro de l hormone de croissance (hgh) dans le sérum et le plasma humain. II. INFORMATIONS GENERALES A. Nom du produit : DIAsource hgheasia kit B. Numéro de catalogue : KAP1081 : 96 tests C. Fabriqué par : DIAsource ImmunoAssays S.A. Rue de l'industrie, 8 B1400 Nivelles Belgium. Pour une assistance technique ou une information sur une commande : Tel : +32 (0) Fax : +32 (0) III. CONTEXTE CLINIQUE A. Activités biologiques La hgh est une hormone polypeptide (poids moléculaire 21,0 Da) produites par les cellules acidophiles de l hypophyse antérieure sous contrôle de deux substances principales : le facteur de libération de l hormone de croissance (GRF) et un agent inhibiteur, la somatostatine. Les voies neuroendocrines dopaminergiques, adrénergiques et sérotoninergiques jouent également un rôle important dans le contrôle de la sécrétion de la hgh. Les stimulus excitateurs de la sécrétion en hgh sont provoqués par l hypoglycémie, le sport, le jeûne, des repas hautement protéiques, le sommeil profond, le stress, glucagon, L Dopa, les acides aminés, etc. Les stimulus inhibiteurs sont provoqués par le glucose, le cortisol, la hgh et les acides gras libres. Du fait de sa courte demivie (±25 minutes) et de la fréquence des stimulus excitateurs ou inhibiteurs, la concentration de la hgh varie fréquemment de façon irrégulière dans le sérum. Une des principales fonctions physiologiques de la hgh est d agir sur le foie et d autres tissus pour produire la Somatomédine, qui induit alors la croissance par action directe sur les tissus cibles. En contraste avec la hgh, la concentration de somatomédine dans le sérum reste stable car la grande partie est liée aux protéines de plasma de circulation. B. Application clinique Retard de croissance L hyposécrétion en hgh est une des causes différentes de la petite taille chez les enfants. Le dosage de la hgh sérique avec un test hautement sensible, particulièrement après un stimulus provocateur (absence de réponse), est important pour établir ce diagnostic car ce groupe de patients peut être traité par administration de hgh. Hypopituitarisme Le dosage en hgh sérique est également un index de la fonction pituitaire lorsque l hypopituitarisme est suspecté (soit idiopathique ou dû à une tumeur ou chirurgie). Gigantisme et acromégalie Le dosage en hgh sérique, particulièrement après un test provocateur inhibiteur (absence de réponse), est important pour établir le diagnostic de l hypersécrétion en hgh due à une tumeur pituitaire acidophilique. Ceci résulte en un gigantisme chez les enfants et une acromégalie chez les adultes. Les deux disfonctionnements peuvent être traités par chirurgie ou radiation.

8 IV. PRINCIPES DU DOSAGE La DIAsource hgheasia est une «Enzyme Amplified Sensitivity Immunoassay» en phase solide effectuée sur des microplaques. Les calibrateurs et les échantillons réagissent avec l anticorps de capture monoclonal (M 1) recouvrant les puits et avec un anticorps monoclonal (M 2) marqué avec la peroxydase (HRP). Après une période d incubation permettant la formation d un sandwich: M 1 recouvert hgh M 2 HRP, la microplaque est lavée afin d enlever l anticorps libre marqué enzymatiquement. L anticorps lié marqué enzymatiquement est mesuré avec une réaction chromogénique. Une solution chromogénique (TMB H 2O 2) est ajoutée et incubée. La réaction est arrêtée avec l addition de Solution d arrêt et la microplaque est alors lue à la longueur d onde appropriée. La quantité de remplacement de substrat est déterminée colorimétriquement par la mesure de l absorbance, qui est proportionnelle à la concentration en hgh. Une courbe de calibration est dessinée et la concentration en hgh dans les échantillons est déterminée par interpolation de la courbe de calibration. V. REACTIFS FOURNIS Reactifs Conjugué: antihgh marqué avec de l HRP (anticorps monoclonal) dans un tampon stabilisant CONJ Microplaque de titration sécable avec 96 puits recouvert d anti hgh (anticorps monoclonal) HRP BUF CONC Tampon du conjugué: un tampon TRISHCl avec de l'albumine bovine et du thymol 96 tests Kit Code Couleur Reconstitution 96 puits bleu Prêt à l emploi 1 flacon 0,2 ml 1 flacon 6 ml Jaune Rouge Diluer 40 x avec le tampon du conjugué Prêt à l emploi VII. PREPARATION DES REACTIFS A. Calibrateurs : Reconstituer le calibrateur zéro avec 2,0 ml d eau distillée et les autres calibrateurs avec 0,5 ml d eau distillée.. B. Contrôles : Reconstituer les contrôles avec 0,5 ml d eau distillée. C. Conjugué antihghhrp de travail: Préparer un volume adéquat de conjugué antihghhrp de travail en ajoutant 25 µl du conjugué antihgh HRP concentré (40x) à 1 ml de tampon du conjugué. Utiliser un agitateur magnétique pour homogénéiser. Il est recommandé de faire une dilution extemporanée. D. Solution de Lavage : Préparer un volume adéquat de Solution de Lavage en ajoutant 199 volumes d eau distillée à 1 volume de Solution de Lavage (200x). Utiliser un agitateur magnétique pour homogénéiser. Eliminer la Solution de Lavage non utilisée à la fin de la journée. VIII. STOCKAGE ET DATE D EXPIRATION DES REACTIFS Avant l ouverture ou la reconstitution, tous les composants de la trousse sont stables jusqu à la date d expiration, indiquée sur l étiquette, si la trousse est conservée entre 2 et 8 C. Des barrettes inutilisées doivent être gardées, à 28 C, dans un sachet cacheté contenant un desiccant jusqu à la date d expiration. Après reconstitution, les calibrateurs et les contrôles sont stables pendant 7 jours entre 2 et 8 C. Pour de plus longues périodes de stockage, des aliquots devront être réalisés et ceuxci seront gardés à 20 C pendant 3 mois. Eviter des cycles de congélation et décongélation successifs. La Solution de Lavage concentrée est stable à température ambiante jusqu à la date d expiration. La Solution de Lavage préparée doit être utilisée le jour même. Après la première utilisation, le conjugué est stable jusqu à la date d expiration, si celuici est conservé entre 2 et 8 C dans le flacon d origine correctement fermé. Des altérations dans l apparence physique des réactifs de la trousse peuvent indiquer une instabilité ou une détérioration. IX. PREPARATION ET STABILITE DE L ECHANTILLON CAL Calibrateur zéro dans du sérum de brebis et du thymol CAL 0 N Calibrateur N = 1 à 5 (cfr. Valeurs exactes sur chaque flacon) dans du sérum de brebis et du thymol 1 flacon lyophilisé 5 flacons lyophilisés Jaune Jaune Ajouter 2,0 ml d eau distillée Ajouter 0,5 ml d eau distillée Les échantillons de sérum ou de plasma doivent être gardés entre 2 et 8 C. Si le test n est pas réalisé dans les 24 heures, un stockage en aliquots à 20 C est recommandé. Eviter des cycles de congélation et décongélation successifs. Avant l utilisation des échantillons, ceuxci doivent être à température ambiante. On recommande de vortexer les échantillons avant de les utiliser. Le sérum ou le plasma (héparnés ou EDTA) donne des résultats similaires. Y(sérum) = 0,89 x (plasma EDTA) + 0,14 r=0.98 n=46 Y(sérum) = 1,02 x (plasma hép.) r=0.98 n=46 Ne pas utiliser d échantillons hémolysés Solution de Lavage (TrisHCl) Contrôles N = 1 ou 2 dans du sérum humain et du thymol Solution Chromogène TMB (Tetramethylbenzydine) Solution d arrêt: HCl 1N 1 flacon 10 ml 2 flacons lyophilisés 1 vial 12 ml 1 vial 12 ml Brun Gris Brun Blanc Diluer 200 x avec de l eau distillée (utiliser un agitateur magnétique). Ajouter 0,5 ml d eau distillée Prêt à l emploi Prêt à l emploi Note: 1. Utiliser le calibrateur zéro pour la dilution des échantillons μiu de la préparation du calibrateur est équivalent à 1 μiu de 2 nd IS 98/574. VI. WASH CONTROL CHROM STOP SOLN TMB SOLN N CONC MATERIELS NON FOURNIS Le matériel mentionné cidessous est requis mais non fourni avec la trousse: 1. Eau distillée d une haute qualité 2. Pipettes pour distribuer: μl, 200 µl, 0 μl et 2 ml (l utilisation de pipettes précises et de pointes en plastique est recommandée) 3. Agitateur vortex 4. Agitateur magnétique 5. Laveur de microplaques 6. Lecteur de microplaques capable de lire à 4 nm et 6 nm (lecture bichromatique) X. MODE OPERATOIRE A. Notes de manipulation Ne pas utiliser la trousse ou ses composants après avoir dépassé la date d expiration. Ne pas mélanger du matériel provenant de trousses de lots différents. Mettre tous les réactifs à température ambiante avant utilisation. Mélangez tous les réactifs et les échantillons sous agitation douce. Réaliser les calibrateurs, les contrôles et les échantillons en double. Un alignement vertical est recommandé. Utiliser un récipient en plastic propre pour préparer la Solution de Lavage. Pour éviter toute contamination croisée, utiliser une nouvelle pointe de pipette pour l addition de chaque réactif et échantillon. Pour la distribution de la solution du chromogène et de la solution d arrêt, éviter des pipettes avec des parties en métal. Des pipettes de haute précision ou un équipement de pipetage automatique permettent d augmenter la précision. Respecter les temps d incubation. Afin d éviter des anomalies, le délai entre le pipetage du premier calibrateur et celui du dernier échantillon doit être limité au délai indiqué à la section XIII paragraphe E (Délai). Préparer une courbe d étalonnage pour chaque nouvelle série d expériences, ne pas utiliser les données d expériences précédentes. Distribuer la solution du chromogène dans les 15 minutes après le lavage de la microplaque de titration. Eviter exposition à la lumière du soleil lors de l incubation avec la solution du chromogène. B. Mode opératoire 1. Sélectionner le nombre de barrettes nécessaires pour le test. Les barrettes inutilisées doivent être cachetées de nouveau dans le sachet avec un desiccant et gardées à 28 C.

9 2. Placer les barrettes dans le support. 3. Pipeter µl de chaque Calibrateur, Contrôle et Echantillon dans les puits appropriés. 4. Pipeter µl du conjugué antihghhrp de travail dans tous les puits. 5. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante Il est obligatoire de respecter la durée de trente minutes pour cette incubation. 6. Aspirer le liquide de chaque puits. 7. Laver la plaque 3 fois en: distribuant 0,4 ml de la Solution de Lavage dans chaque puits aspirant le contenu de chaque puits 8. Pipeter 100 µl de la solution chromogène dans chaque puits dans les 15 minutes après la phase de lavage. 9. Incuber la microplaque pendant 30 minutes à température ambiante, éviter exposition à la lumière du soleil. 10. Pipeter 100 µl de la Solution d arrêt dans chaque puits. 11. Lire les absorbances à 4 nm (filtre de référence 630 nm ou 6 nm) endéans l heure et calculer les résultats comme décrits dans la section XI. D. Exactitude Echantillon Sérum Plasma TEST DE RECUPERATION hgh ajoutée 4,3 13,5 26,8 52,1 4,3 13,5 26,8 52,1 TEST DE DILUTION hgh récupérée 4,1 12,8 28,1 58,9 4,6 13,2 25,3 53,0 Récupération XI. CALCUL DES RESULTATS 1. Lire la plaque à 4 nm contre un filtre de référence mis à 6 nm (ou 630 nm). 2. Calculer la moyenne de chaque détermination réalisée en double. 3. Dessiner sur un graphique linéaire ou semilogarithmique les cpm (ordonnées) pour chaque calibrateur contre la concentration correspondante en hgh (abscisses) et dessiner une courbe de calibration à l aide des points de calibration, en connectant les points avec des lignes droites. 4. Lire la concentration pour chaque contrôle et échantillon par interpolation sur la courbe de calibration. 5. L analyse informatique des données simplifiera les calculs. Si un système d analyse de traitement informatique des données est utilisé, il est recommandé d utiliser la fonction «4 paramètres» du lissage de courbes. XII. DONNEES TYPES Les données représentées cidessous sont fournies pour information et ne peuvent jamais être utilisées à la place d une courbe d étalonnage. Calibrateur hgheasia XIII. PERFORMANCE ET LIMITES 0 μiu/ml 0,45 μiu/ml 5,4 μiu/ml 12,9 μiu/ml 43,5 μiu/ml 98,0 μiu/ml Unités OD 0,030 0,062 0,226 0,1 1,429 2,330 A. Sensibilité Vingt calibrateurs zéro ont été testés en parallèle avec un assortiment d autres calibrateurs. La limite de détection, définie comme la concentration apparente située 2 déviations standards audessus de la moyenne DO déterminée à la fixation zéro, était de 0,17 μiu/ml. B. Spécificité Des hormones crossréactives ont été ajoutées à un control de valeur haute en hgh et à un control de valeur basse. La réponse hgh apparente a été mesurée. Hormone ajoutée hgh C1 µiu/ml hgh C2 µiu/ml 1,9 13,5 hcg miu/ml 2,0 14,3 hpl ng/ml 1,4 13,0 PRL 120 ng/ml 1,8 12,6 C. Précision INTRAESSAI INTERESSAI Echantillon Dilution Concent. théorique Sérum 1 Sérum 2 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 48,8 24,4 12,2 6,1 3,1 10,6 5,3 2,7 1,3 0,7 Les échantillons ont été dlilué avec le calibrateur zéro. Facteur de conversion: 1µIU de la préparation du calibrateur hgheasia = 0,33 ng Concent. Mesurée 97,7 57,0 27,7 13,6 6,4 3,0 21,2 9,3 4,6 2,2 1,1 0,6 E. Délai entre la distribution du dernier calibrateur et celle de l échantillon Comme montré cidessous, les résultats d un essai restent précis même quand un échantillon est distribué 60 minutes après que le calibrateur a été ajouté aux tubes avec l anticorps. S1 S2 DELAI 0 min 10 min 20 min 30 min 45 min 60 min 4,0 13,5 3,6 15,0 3,3 13,8 3,3 13,0 3,0 12,6 3,8 13,0 F. Effet crochet Un échantillon dopé avec de l hgh jusqu à 4000 μiu/ml donne des DO supérieurs au dernier point de calibration. XIV. CÔNTROLE DE QUALITE INTERNE Si les résultats obtenus pour le(s) contrôle(s) 1 et/ou 2 ne sont pas dans l intervalle spécifié sur l étiquette du flacon, les résultats ne peuvent pas être utilisés à moins que l'on ait donné une explication satisfaisante de la nonconformité. Chaque laboratoire est libre de faire ses propres stocks d échantillons contrôles, lesquels doivent être congelés aliquotés. Des contrôles qui contiennent de l azide influenceront la réaction enzymatique et ne peuvent pas être utilisés. Les critères d acceptation pour les écarts des valeurs in duplo des échantillons doivent être basés sur les pratiques de laboratoire courantes. On recommande que les contrôles soient testés de façon routinière comme des échantillons inconnus pour mesurer la variabilité du test. La réalisation du test doit être suivie avec des fichiers de contrôle de qualité des contrôles. On recommande de vérifier visuellement la courbe sélectionnée par l ordinateur. Serum N <X> ± SD A B ,90 ± 0,34 16,61 ± 0,90 CV 4,9 5,4 Serum N <X> ± SD SD : Déviation Standard; CV: Coéfficient de variation A B ,4 ± 0,9 23,5 ± 1,2 CV 8,1 5,1 XV. VALEURS ATTENDUES Les valeurs sont donnés à titre d information; chaque laboratoire doit établir ses propres écarts de valeurs. Chez les sujets normaux, la sécrétion de l hormone de croissance (hgh) est pulsatile. Durant la journée, le domaine des concentrations en hgh est <0,210

10 μiu/ml. Pendant le sommeil, les concentrations en hgh augmentent constamment (± 30 μiu/ml). La sécrétion en hgh est fortement stimulée par le sport et le stress (ponction veineuse, hypoglycémie,...), mais décroît en hyperglycémie. Chez les sujets normaux (n=34), deux heures après une prise orale de glucose (75 g pour les adultes), les taux en hgh étaient inférieurs à 10 μiu/ml et la réponse hgh aux tests de stimulation (administration d insuline, arginine, glucagon) excédait 20 μiu/ml. Les taux en hgh étaient élevés (même après prise de glucose) en acromégalie (> 10 µiu/ml). En déficience de hgh, la réponse aux tests de stimulation est absente ou faible (petite taille par déficience en hgh; hypopituitarisme de différentes origines). XVI. PRECAUTIONS ET AVERTISSEMENTS XVIII. RESUME DU PROTOCOLE Calibrateurs (05) Echantillons, Contrôles Conjugué antihghhrp de travail CALIBRATEURS (µl) Incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Aspirer le contenu de chaque puits. Laver 3 fois avec 400 µl de la Solution de Lavage et aspirer. ECHANTILLON(S) CONTROLES (µl) Sécurité Pour utilisation en diagnostic in vitro uniquement. Les composants de sang humain inclus dans ce kit ont été évalués par des méthodes approuvées par l Europe et/ou la FDA et trouvés négatifs pour HBsAg, l antihcv, l antihiv1 et 2. Aucune méthode connue ne peut offrir l'assurance complète que des dérivés de sang humain ne transmettront pas d hépatite, le sida ou toute autre infection. Donc, le traitement des réactifs, du sérum ou des échantillons de plasma devront être conformes aux procédures locales de sécurité. Tous les produits animaux et leurs dérivés ont été collectés d'animaux sains. Les composants bovins proviennent de pays où l ESB n'a pas été détectée. Néanmoins, les composants contenant des substances animales devront être traités comme potentiellement infectieux. Eviter le contact de la peau avec tous les réactifs. En cas de contact, laver avec beaucoup d eau. Ne pas fumer, ni boire, ni manger ni appliquer de produits cosmétiques dans les laboratoires. Ne pas pipeter avec la bouche. Utiliser des vêtements protecteurs et des gants à usage unique. XVII. BIBLIOGRAPHIE Solution du chromogène Incuber pendant 30 min à température ambiante. Solution d arrêt Lire sur un lecteur de microplaques et enregistrer l absorbance de chaque puits à 4 nm (contre 630 ou 6 nm) et 490 nm (contre 630 ou 6 nm) DIAsource Catalogue Nr : KAP1081 P.I. Number : /fr Revision nr : 0904/1 Date de révision : CAMANNI F., MASSARA F., BELFORTE L., ROSATELLO A., MOLENATTI G.M. (1977) Effect of dopamine on plasma growth hormone and prolactin levels in normal and acromegalic subjects. J. Clin. Endo. and Metab., 44: DAUGHADAY W.H. (1981) The adenohypophysis In : "Textbook of Endocrinology", R.H. Williams ed., W.B. Saunders, Philadelphia, p; DROBNY E.C., AMBURN K., BAUMANN G. (1983) Circadian variation of basal plasma growth hormone in man. J. Clin. Endo. and Metab., 57: HASHIDA S., NAKAWAGA K., ISHIKAWA E., OHTAKI S. (1985) Basal level of human growth hormone (hgh) in normal serum. Clin. Chim. Acta, 151: LEWIS V.J. et al. (1980) Human growth hormone : A complex of proteins. Rec. Progr. Horm. Res., 36: LI C.H. (1974) Human growth hormone : perspective on its chemistry and physiology. In : "Advances in human growth hormone research", S. Raiti ed. U.S. Department of Health, Education and Welfare Publ. DMEW publ. no. (NJH) 74612, p REUTENS AT. (1995) Evaluation and application of a highly sensitive assay for serum growth hormone (GH) in the study of adult GH deficiency. J. Clin. Endocrinol. Metab., 80(2): CROWLEY S. et al. (1995) Growth and the growth hormone axis in prepubertal children with asthma. J. Pediatr. 126(2): KELLY JT. et al. (1993) Effect of different oral oestrogen formulations on insulinlike growth factor I, growth hormone and growth hormone binding protein in postmenopausal women. Clin. Endocrinol. 39(5) :

11 de Vor Gebrauch des Kits lesen Sie bitte diese Packungsbeilage. hgheasia I. VERWENDUNGSZWECK Ein immunenzymetrisches Assay für die quantitative in vitro Bestimmung von humanem Wachstumshormon (hgh) in Serum und Plasma. II. ALLGEMEINE INFORMATION A. Handelsbezeichnung : DIAsource hgheasia Kit B. Katalognummer : KAP1081 : 96 Tests C. Hergestellt von: DIAsource ImmunoAssays S.A. Rue de l'industrie, 8, B1400 Nivelles, Belgien. Für technische Unterstützung oder Bestellungen wenden Sie sich bitte an: Tel : +32 (0) Fax : +32 (0) Für Deutschland : Kostenfreie Rufnummer : Kostenfreie Faxnummer : Ordering : ordering@diasource.be III. KLINISCHER HINTERGRUND A. Biologische Aktivität hgh ist ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 21.0 Da. Synthetisiert in den azidophilen Zellen des Hypophysenvorderlappens (HVL) erfolgt die Ausschüttung unter der Kontrolle von Somatotropin ReleasingFaktor (GRF) und Somatostatin als inhibierendem Agens. Neurotransmitter wie Dopamin, Adrenalin und Serotonin spielen ebenfalls eine wichtige Rolle in der hghsekretion. Stimulierend auf die hghausschüttung wirken Hypoglykämie, Sport, Fasten, Nahrung mit hohem Proteingehalt, Schlaf, Stress, Glucagon, LDopa, Aminosäuren, usw. Glucose, Cortisol, hgh und freie Fettsäuren hingegen hemmen die Freisetzung von hgh. Neben der kurzen Halbwertszeit von hgh (± 25 Minuten) ist die Vielzahl der die Ausschüttung beeinflussenden Faktoren für die häufige und große Variationsbreite der hghspiegel im Serum verantwortlich. Eine der Hauptwirkungen von hgh ist die Induktion der SomatomedinProduktion in Leber und anderen Geweben. Somatomedine beeinflussen das Wachstum durch direkte Wirkung auf die entsprechenden Zielorgane. Im Gegensatz zu hgh bleibt die SomatomedinKonzentration im Serum durch die weit gehende Bindung an zirkulierende Plasmaproteine stabil. B. Klinische Anwendung Minderwuchs Zu geringe hghausschüttung ist eine der möglichen Ursachen für Minderwuchs bei Kindern. Die Bestimmung von hgh im Serum nach einem Provokationstest (ausbleibende Reaktion) mittels eines sehr sensitiven Tests ist eine wichtige Methode zur Identifizierung solcher Patientengruppen, da diese Patienten durch Gabe von hgh sehr gut therapiert werden können. Hypopituitarismus Die Bestimmung von hgh im Serum gibt auch einen Hinweis auf die Hypophysenfunktion, falls eine Hypophysenunterfunktion (entweder idiopathisch oder bedingt durch einen Tumor oder chirurgischen Eingriff) vermutet wird. Gigantismus und Akromegalie Die hghbestimmung im Serum vor allem nach einem Inhibitionstest (ausbleibende Reaktion) ist wesentlicher Bestandteil der Diagnose einer tumorbedingten hghüberproduktion. hghüberproduktion führt bei Kindern zu Riesenwuchs, bei Erwachsenen zu Akromegalie. Beide Erkrankungen können durch einen chirurgischen Eingriff oder Bestrahlung therapiert werden.

12 IV. GRUNDSÄTZLICHES ZUR DURCHFÜHRUNG Der DIAsource hgheasia ist ein solid phaseenzyme Amplified Sensitive Immunoassay (EASIA) im Mikrotiterplattenformat. Kalibratoren und Proben reagieren mit dem primären monoklonalen Antikörper (MAk 1), mit dem die Wells der Mikrotiterplatte beschichtet sind, und mit einem monoklonalen Antikörper (MAk 2), der mit MeerrettichPeroxidase (MRP) markiert ist. Nach einer Inkubationsphase bildet sich ein SandwichKomplex: MAk 1 hgh MAk 2 MRP; nicht gebundene enzymbeschriftete Antikörper werden durch Waschen der Mikrotiterplatte entfernt. Gebundene enzymbeschriftete Antikörper werden durch eine Farbreaktion gemessen. Chromogene Lösung (TMB H 2O 2) wird hinzugefügt und inkubiert. Die Reaktion wird durch Hinzufügen einer Stopplösung beendet und die Mikrotiterplatte wird bei adäquater Wellenlänge ausgewertet. Die Menge an Substratumsatz wird kolorimetrisch durch Messung der sorption bestimmt, die proportional zur hghkonzentration ist. Es wird eine Kalibrationskurve erstellt und die hghkonzentration in den Proben wird durch Interpolation von der Kalibrationskurve bestimmt. V. MITGELIEFERTE REAGENZIEN Reagenzien Konjugat: MRP beschriftete AntihGH (monoklonale Antikörper) in Stabilisierungspuffer Konjugatpuffer: TRISHCl Puffer mit Rinderserumalbumin und Thymol NullKalibrator in Schafserum und Thymol Kalibrator N = 1 bis 5 (genaue Werte auf Gefäß Etiketten) in Schafserum und Thymol Waschlösung (TrisHCl) Kontrollen N = 1 oder 2 Humanserum und Thymol Chromogenes TMB (Tetramethylbenzydin) Stopplösung: HCl 1N 96 Test Kit Farb Code Rekonstitution 96 Wells Blau gebrauchsfertig 1 Gefäß 0,2 ml 1 Gefäß 6 ml 1 Gefäß lyophilisiert 5 Gefäße lyophilisiert 1 Gefäß 10 ml 2 Gefäße lyophilisiert 1 Gefäß 12 ml 1 Gefäß 12 ml Gelb Rot Gelb Gelb Braun Silber Braun weiβ 40 fach mit Konjugatpuffer verdünnen gebrauchsfertig 2,0 ml dest. Wasser zugeben 0,5 ml dest. Wasser zugeben 200 x mit dest. Wasser verdünnen (Magnetrührer benutzen). 0,5 ml dest. Wasser zugeben gebrauchsfertig gebrauchsfertig Bemerkung: 1. Benutzen Sie den NullKalibrator zur Probenverdünnung μiu der Kalibratorzubereitung ist äquivalent zu 1 μiu 2 nd IS 98/574. VI. CONJ CAL CAL WASH CONTROL CHROM STOP Mikrotiterplatte mit 96 AntihGH beschichteten, abbrechbaren Wells (monoklonale Antikörper) HRP 0 N SOLN TMB SOLN BUF N CONC CONC ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL Folgendes Material wird benötigt, aber nicht mit dem Kit mitgeliefert: 1. Hochwertiges destilliertes Wasser 2. Pipetten: μl, 200 µl, 0 μl und 2 ml (Verwendung von Präzisionspipetten mit Einwegplastikspitzen wird empfohlen) 3. Vortex Mixer 4. Magnetrührer 5. Waschgerät für Mikrotiterplatten 6. MikrotiterplattenLesegerät zur Auswertung bei 4 nm und 6 nm (bichromatischer Auswertung) VII. VORBEREITUNG DER REAGENZIEN A. Kalibratoren: Rekonstituieren Sie den NullKalibrator mit 2,0 ml dest. Wasser, die anderen Kalibratoren mit 0,5 ml dest. Wasser. B. Kontrollen: Rekonstituieren Sie die Kontrollen mit 0,5 ml dest. Wasser. C. AntihGHHRP Konjugat Gebrauchslösung: Bereiten Sie eine geeignete Menge Konjugatlösung zu indem Sie 25 µl des AntihGHHRP Konzentrats zu 1 ml Konjugatpuffer geben. Benutzen Sie einen Vortex zum Homogenisieren. Es ist die spontane Zubereitung gefordert. D. Waschlösung: Bereiten Sie ein angemessenes Volumen Waschlösung aus einem Anteil Waschlösung (200x) mit 199 Anteilen dest. Wasser zu. Verwenden Sie einen Magnetrührer zum gleichmäßigen Durchmischen. Werfen Sie die nicht benutzte Waschlösung am Ende des Tages weg. VIII. AUFBEWAHRUNG UND LAGERUNG DER REAGENZIEN Vor dem Öffnen oder der Rekonstitution sind die Reagenzien des Kits bis zum laufdatum (Angaben auf Etikett) bei Lagerung bei 2 C bis 8 C stabil. Nicht verwendete Mikrotiterstreifen sollten bis zum Verfallsdatum dicht in der Folie verschlossen mit Trockenmittel bei 2 bis 8 C gelagert werden. Nach der Rekonstitution sind die Kalibratoren und Kontrollen bei 2 C bis 8 C 7 Tage stabil. Aliquots müssen bei längerer Aufbewahrung bei 20 C eingefroren werden, dann sind Sie 3 Monate haltbar. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen. Die konzentrierte Waschlösung ist bei Raumtemperatur bis zum Verfallsdatum haltbar. Frisch zubereitete Waschlösung sollte am selben Tag benutzt werden. Nach der ersten Benutzung ist das Konjugat bei Aufbewahrung im Originalgefäß und bei 2 bis 8 C bis zum laufdatum stabil. Veränderungen im Aussehen der Kitkomponenten können ein Anzeichen für Instabilität oder Zerfall sein. IX. PROBENSAMMLUNG UND VORBEREITUNG Serum oder Plasmaproben müssen bei 28 C aufbewahrt werden. Falls der Test nicht innerhalb von 24 Std. durchgeführt wird, ist die Aufbewahrung bei 20 C erforderlich. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen. Vor Gebrauch müssen alle Proben Raumtemperatur erreichen. Vortexmischen der Proben wird vor Gebrauch empfohlen. Serum, Heparinisiertes Plasma oder EDTAPlasmaproben liefern ähnliche Ergebnisse. Y(Serum) = 0,89 x (EDTAPlasma) + 0,14 r=0,98 n=46 Y(Serum) = 1,02 x (Hep. Plasma) + 0,01 r=0,98 n=46 Keine hämolytischen Proben benutzen X. DURCHFÜHRUNG A. Bemerkungen zur Durchführung Verwenden Sie den Kit oder dessen Komponenten nicht nach laufdatum. Vermischen Sie Materialien von unterschiedlichen KitChargen nicht. Bringen Sie alle Reagenzien vor der Verwendung auf Raumtemperatur. Mischen Sie alle Reagenzien und Proben gründlich durch sanftes Schütteln oder Rühren. Führen Sie Kalibratoren, Kontrollen und Proben doppelt aus. Vertikale Ausrichtung wird empfohlen. Verwenden Sie zur Zubereitung der Waschlösung reinen Kunststoffbehälter. Verwenden Sie saubere Einwegpipettenspitzen, um Kreuzkontamination zu vermeiden. Verwenden Sie zur Pipettierung der chromogene Lösung und der Stopplösung keine Pipetten mit Metallteilen. Präzisionspipetten oder ein automatisches Pipettiersystem erhöhen die Präzision. Achten Sie auf die Einhaltung der Inkubationszeiten. Zur Vermeidung von Drift muss die Zeit zwischen dem Pipettieren des ersten Kalibrators und der letzten Probe auf die Zeit beschränkt werden, die in schnitt XIII satz E (Zeitverzögerung) erwähnt wird. Erstellen Sie für jeden Durchlauf eine Kalibrationskurve, verwenden Sie nicht die Daten von früheren Durchläufen. Pipettieren Sie die chromogene Lösung innerhalb von 15 Minuten nach dem Waschen der Mikrotiterplatte. Während der Inkubation mit der chromogene Lösung ist die Mikrotiterplatte vor direktem Sonnenlicht zu schützen.

13 B. Durchführung 1. Wählen Sie die erforderliche Anzahl der Streifen für den Lauf aus. Nicht verwendete Mikrotiterstreifen sollten wieder dicht in der Folie verschlossen mit Trockenmittel bei 2 bis 8 C gelagert werden. 2. Befestigen Sie die Streifen im Halterahmen. 3. Pipettieren Sie jeweils µl Kalibrator, Kontrolle und Probe in die entsprechenden Wells. 4. Pipettieren Sie µl AntihGHHRP Gebrauchslösung in alle Wells. 5. Inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur Es ist zwingend notwendig, die 30 Minuten Inkubationszeit einzuhalten. 6. Saugen Sie die Flüssigkeit aus jedem Well ab. 7. Waschen Sie die Platte dreimal: pipettieren Sie 0,4 ml Waschlösung in jeden Well saugen Sie der Inhalt jedes Wells ab 8. Pipettieren Sie 100 µl der chromogene Lösung innerhalb von 15 Minuten nach dem Waschvorgang in jeden Well. 9. Inkubieren Sie die Mikrotiterplatte 30 Minuten bei Raumtemperatur; vermeiden Sie direktes Sonnenlicht. 10. Pipettieren Sie 100 µl der Stopplösung in jeden Well. 11. Werten Sie die sorptionen bei 4 nm (Referenzfilter 630 nm oder 6 nm) innerhalb 1 Stunde aus und berechnen Sie die Resultate wie in schnitt XI beschrieben. C. Präzision INTRA ASSAY Serum N <X> ± SD A B ,90 ± 0,34 16,61 ± 0,90 CV 4,9 5,4 INTER ASSAY Serum N <X> ± SD A B SD : Standardabweichung; CV: Variationskoeffizient D. Genauigkeit Probe Serum 8 8 WIEDERFINDUNGSTEST Zugeg. hgh 4,3 13,5 26,8 52,1 Wiedergef. hgh 4,1 12,8 28,1 58,9 11,4 ± 0,9 23,5 ± 1,2 CV 8,1 5,1 Wiedergefunden XI. BERECHNUNG DER ERGEBNISSE 1. Werten Sie die Platte bei 4 nm gegen einen Referenzfilter auf 6 nm (oder 630 nm) aus. 2. Berechnen Sie den Durchschnitt aus den Doppelbestimmungen. 3. Tragen Sie auf semilogarithmischem oder linearem Millimeterpapier den c.p.m. (Ordinate) für jeden Standard gegen die entsprechende Konzentration hgh (szisse) und zeichnen Sie eine Kalibrationskurve durch die Kalibrationspunkte, indem Sie die eingetragenen Punkte durch gerade Linien verbinden. 4. Berechnen Sie die Konzentration für jede Kontrolle und Probe durch Interpolation aus der Kalibrationskurve. 5. Computergestützte Methoden können ebenfalls zur Erstellung der Kalibrationskurve verwendet werden. Falls die Ergebnisberechnung mit dem Computer durchgeführt wird, empfehlen wir die Berechnung mit einer 4 Parameter Kurvenfunktion. XII. TYPISCHE WERTE Die folgenden Daten dienen nur zu Demonstrationszwecken und können nicht als Ersatz für die Echtzeitstandardkurve verwendet werden. Plasma 4,3 13,5 26,8 52,1 4,6 13,2 25,3 53,0 VERDÜNNUNGSTEST Probe Verdünn. Theoret. Konzent. Serum 1 Serum 2 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 48,8 24,4 12,2 6,1 3,1 10,6 5,3 2,7 1,3 0, Gemess. Konzent. 97,7 57,0 27,7 13,6 6,4 3,0 21,2 9,3 4,6 2,2 1,1 0,6 hgheasia OD Einheiten Die Proben wurden mit NullKalibrator verdünnt. Kalibrator 0 μiu/ml 0,45 μiu/ml 5,4 μiu/ml 12,9 μiu/ml 43,5 μiu/ml 98,0 μiu/ml 0,030 0,062 0,226 0,1 1,429 2,330 Umrechnungsfaktor: 1µIU der Standardzubereitung hgheasia = 0,33 ng E. Zeitverzögerung zwischen letzter Kalibrator und Probenzugabe Es wird im Folgenden gezeigt, dass die Genauigkeit der Tests selbst dann gewährleistet ist, wenn die Probe 60 Minuten nach Zugabe des Kalibrators in die beschichteten Röhrchen zugegeben wird. XIII. LEISTUNGSMERKMALE UND GRENZEN DER METHODIK A. Nachweisgrenze Zwanzig NullKalibratoren wurden zusammen mit einem Satz anderer Kalibratoren gemessen. Die Nachweisgrenze, definiert als die scheinbare Konzentration bei zwei Standardabweichungen über dem gemessenen Durchschnittswert bei Nullbindung, entsprach 0,17 μiu/ml. S1 S2 ZEITDIFFERENCE 0 min 10 min 20 min 30 min 45 min 60 min 4,0 13,5 3,6 15,0 3,3 13,8 3,3 13,0 3,0 12,6 3,8 13,0 B. Spezifität Kreuzreaktive Hormone wurden zu einem minderwertigen und zu einem hochwertigen Kontrolle zugegeben. Das Scheinbare hgh Ergebnis wurde gemessen. Zugeg. Hormon hgh C1 µiu/ml hgh C2 µiu/ml 1,9 13,5 hcg miu/ml 2,0 14,3 hpl ng/ml 1,4 13,0 PRL 120 ng/ml 1,8 12,6 F. HookEffekt Eine Probe mit hgh bis zu 4000 μiu/ml liefert höhere Messwerte als der letzte Kalibratormeßwert. XIV INTERNE QUALITÄTSKONTROLLE Entsprechen die IstWerte nicht den auf den Fläschchen angegebenen Soll Werten, können die Werte, ohne treffende Erklärung der weichungen, nicht weiterverarbeitet werden. Falls zusätzliche Kontrollen erwünscht sind, kann jedes Labor seinen eigenen Pool herstellen, der in Aliquots eingefroren werden sollte. Kontrollen mit erhöhten Azidkonzentrationen stören die Enzymreaktion und können nicht verwendet werden.

14 Akzeptanzkriterien für die Differenz zwischen den Resultaten der Wiederholungstests anhand der Proben müssen auf Guter Laborpraxis beruhen. Es wird empfohlen, Kontrollen im Assay routinemäßig wie unbekannte Proben zu behandeln, um die Assayvarianz zu messen. Die Leistung des Assay muss mit den Qualitätskontrollkarten der Kontrollen überprüft werden. Es hat sich bewährt, die durch den Computer ausgewählte Kurvenanpassung visuell zu überprüfen. XV. REFERENZ INTERVALLE Diese Werte sind nur Richtwerte; jedes Labor muss seinen eigenen Normalwertbereich ermitteln. Bei gesunden Personen erfolgt die hghausschüttung pulsatil. Tagsüber variiert die hghkonzentration von < 0,2 bis 10 µie/ml. Im Schlaf steigt die hgh Konzentration kontinuierlich an (± 30 µie/ml). Nach sportlichen Aktivitäten oder Stress (Blutentnahme, Hypoglykämie) werden hohe Werte, bei Hyperglykämie niedrige hghspiegel gefunden. Zwei Stunden nach GlucoseBelastung (75 g bei Erwachsenen) wurden bei gesunden Personen (n = 34) hghspiegel < 10 µie/ml, nach einem Stimulationstest (Insulin, Arginin, Glucagon) hghspiegel > 20 µie/ml gefunden. Patienten mit Akromegalie zeigten selbst nach GlucoseGabe erhöhte hghwerte (> 10 µiu/ml). Bei hghmangel kann keine oder nur verminderte Erhöhung der hghspiegel nach Stimulation detektiert werden (Minderwuchs durch hghmangel; Hypopituitarismus verschiedener Ursachen). In : "Advances in human growth hormone research", S. Raiti ed. U.S. Department of Health, Education and Welfare Publ. DMEW publ. no. (NJH) 74612, p REUTENS AT. (1995) Evaluation and application of a highly sensitive assay for serum growth hormone (GH) in the study of adult GH deficiency. J. Clin. Endocrinol. Metab., 80(2): CROWLEY S. et al. (1995) Growth and the growth hormone axis in prepubertal children with asthma. J. Pediatr. 126(2): KELLY JT. et al. (1993) Effect of different oral oestrogen formulations on insulinlike growth factor I, growth hormone and growth hormone binding protein in postmenopausal women. Clin. Endocrinol. 39(5) : XVIII. ZUSAMMENFASSUNG DES PROTOKOLLS KALIBRATOREN (µl) PROBE(N) KONTROLLEN (µl) XIII. VORSICHTSMASSNAHMEN UND WARNUNGEN Sicherheit Nur für diagnostische Zwecke. Die menschlichen Blutkomponenten in diesem Kit wurden mit europäischen und in den USA erprobten FDAMethoden getestet, sie waren negativ für HBsAG, antihcv und antihiv 1 und 2. Keine bekannte Methode kann jedoch vollkommene Sicherheit darüber liefern, dass menschliche Blutbestandteile nicht Hepatitis, AIDS oder andere Infektionen übertragen. Deshalb sollte der Umgang mit Reagenzien, Serum oder Plasmaproben in Übereinstimmung mit den Sicherheitsbestimmungen erfolgen. Alle tierischen Produkte und deren Derivate wurden von gesunden Tieren gesammelt. Komponenten von Rindern stammen aus Ländern in denen BSE nicht nachgewiesen wurde. Trotzdem sollten Komponenten, die tierische Substanzen enthalten, als potenziell infektiös betrachtet werden. Vermeiden Sie Hautkontakt mit allen Reagenzien. Bei Kontakt gründlich mit Wasser spülen. Bitte rauchen, trinken, essen Sie nicht in Ihrem Arbeitsbereich, und verwenden Sie keine Kosmetika. Pipettieren Sie nicht mit dem Mund. Verwenden Sie Schutzkleidung und Wegwerfhandschuhe. XVII. LITERATUR 1. CAMANNI F., MASSARA F., BELFORTE L., ROSATELLO A., MOLENATTI G.M. (1977) Effect of dopamine on plasma growth hormone and prolactin levels in normal and acromegalic subjects. J. Clin. Endo. and Metab., 44:465. Kalibratoren (05) Proben, Kontrollen AntihGHHRP Gebrauchslösung 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Inhalt jedes Wells absaugen. Dreimal mit 400 µl Waschlösung waschen und absaugen. chromogene Lösung Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Stopplösung Auf einem MikrotiterplattenLesegerät auswerten und sorption jedes Wells bei 4 nm (gg. 630 oder 6 nm) vermerken. DIAsource Katalognummer : KAP1081 Beipackzettelnummer: /de Nummer der Originalausgabe: 0904/1 Revisionsdatum : DAUGHADAY W.H. (1981) The adenohypophysis In : "Textbook of Endocrinology", R.H. Williams ed., W.B. Saunders, Philadelphia, p; DROBNY E.C., AMBURN K., BAUMANN G. (1983) Circadian variation of basal plasma growth hormone in man. J. Clin. Endo. and Metab., 57: HASHIDA S., NAKAWAGA K., ISHIKAWA E., OHTAKI S. (1985) Basal level of human growth hormone (hgh) in normal serum. Clin. Chim. Acta, 151: LEWIS V.J. et al. (1980) Human growth hormone : A complex of proteins. Rec. Progr. Horm. Res., 36: LI C.H. (1974) Human growth hormone : perspective on its chemistry and physiology.

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