SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD

Transcript

1 Κατασκευαστής Οδηγίες χρήσης για το SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD για τα συστήµατα DHPLC ιαβάστε προσεκτικά αυτές τις οδηγίες χρήσης προτού χρησιµοποιήσετε αυτό το προϊόν. Φυλάξτε αυτές τις οδηγίες χρήσης για µελλοντική αναφορά.

2 Αυτή η σελίδα έχει παραµείνει σκόπιµα κενή

3 Πίνακας περιεχοµένων 1 Κατασκευαστής SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD Χρήση για την οποία προορίζεται Ενδείξεις χρήσης Αρχές του προσδιορισµού ανίχνευσης µεταλλάξεων SURVEYOR Scan KRAS KRAS και NRAS Ανάλυση δειγμάτων ασθενών με χρήση των κιτ SURVEYOR Scan SURVEYOR Nuclease Ιχνηλασιµότητα των µαρτύρων του κιτ Συστατικά Αριθμός δειγμάτων που μπορούν να εξεταστούν με ένα κιτ Προσδιορισμός αλληλουχίας DNA Επιπλέον απαιτούµενος εξοπλισµός και αντιδραστήρια Παρασκευή αντιδραστηρίων Φύλαξη και διάρκεια ζωής Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις Συλλογή, χειρισµός και φύλαξη πρωτογενών δειγµάτων ιαδικασία προσδιορισµού Ανίχνευση σωματικών μεταλλάξεων με τα κιτ SURVEYOR Scan - Επισκόπηση Οδηγίες βήµα προς βήµα Αρχική προετοιμασία/βαθμονόμηση του συστήματος DHPLC Ζητήματα που πρέπει να ληφθούν υπόψη πριν από την ανάλυση δείγματος για KRAS Ζητήματα σχετικά με τη μήτρα Ζητήματα σχετικά με τη ροή εργασίας Πρωτόκολλο ενίσχυσης Πρόγραμμα θερμικού κυκλοποιητή για το πρωτόκολλο ενίσχυσης Ποιοτικός έλεγχος προϊόντων PCR Πέψη με SURVEYOR Nuclease ιαδικασίες ελέγχου Ποιοτικός έλεγχος του SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD Χρήση μαρτύρων πλασμιδιακού DNA Ερµηνεία των αποτελεσµάτων Ανάλυση του εξωνίου 2 του KRAS με SURVEYOR Nuclease Επισκόπηση δεδομένων των αποτελεσμάτων SURVEYOR Scan Παραδείγματα αποτελεσμάτων Χαρακτηριστικά απόδοσης Επίπεδο ανίχνευσης μεταλλάξεων με τα κιτ SURVEYOR Scan Επιβεβαίωση αλληλουχίας Περιορισμοί της διαδικασίας προσδιορισμού Παράρτηµα A A.1 Σχέδιο διάταξης πλάκας για τα κιτ SURVEYOR Scan A.2 Σφραγίδες DNA μάρτυρα A.3 Απαιτήσεις του συστήματος αποδιατακτικής HPLC (DHPLC) A.4 Διάταξη εργαστηρίου για τους προσδιορισμούς PCR A.5 Βιβλιογραφικές αναφορές Παράρτηµα B Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων Στοιχεία παραγγελίας Στοιχεία επικοινωνίας Μετάφραση Αποποίηση Άδειες, εµπορικά σήµατα και πνευµατικά δικαιώµατα... 36

4 1 Κατασκευαστής 1 Κατασκευαστής Κατασκευαστής Αντιπρόσωπος στην Ε.Ε. M P Transgenomic, Inc Emmet Street, Omaha, NE 68164, USA Αρ. τηλ Transgenomic Limited 40 Watt Road, Hillington Park, Glasgow G52 4RY, UK Αρ. τηλ SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD 2.1 Χρήση για την οποία προορίζεται Μόνο για επαγγελµατική χρήση. Το κιτ SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD της Transgenomic είναι ένας in vitro διαγνωστικός προσδιορισµός που ανιχνεύει σωµατικές µεταλλάξεις στο εξώνιο 2 του γονιδίου KRAS. Αυτές οι µεταλλάξεις υποδεικνύονται από τις κορυφές διάσπασης µε SURVEYOR Nuclease και περιλαµβάνουν τις µεταλλάξεις µε γνωστή δυνατότητα κλινικής σπουδαιότητας. Αυτό το κιτ είναι σχεδιασµένο για χρήση σε κλινικό διαγνωστικό εργαστήριο από κατάλληλα εκπαιδευµένο προσωπικό που διενεργεί εξετάσεις σε DNA εκχυλισµένο από ιστούς που έχουν µονιµοποιηθεί σε φορµόλη και εγκλειστεί σε παραφίνη. Αυτό το κιτ, µε αριθµό καταλόγου , παρέχεται ως ένα ξεχωριστό κουτί το οποίο περιέχει τα είδη που παρατίθενται παρακάτω. Αυτές οι οδηγίες χρήσης είναι διαθέσιµες για λήψη στη διαδικτυακή τοποθεσία Ενδείξεις χρήσης Οι κλινικοί ιατροί µπορούν να χρησιµοποιούν το κιτ SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD µε συστήµατα DHPLC, επικουρικά, ώστε να µπορέσουν να αποφασίσουν εάν οι όγκοι ορθοκολικού καρκίνου των ασθενών µπορεί να µην ανταποκριθούν σε κάποιον θεραπευτικό παράγοντα αντι-egfr (υποδοχέας επιδερµικού αυξητικού παράγοντα), όπως είναι η πανιτουµουµάµπη. Το κιτ SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD προορίζεται για χρήση σε συνδυασµό µε το κιτ SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD και το κιτ SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD. Το κιτ SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD δεν θα πρέπει να χρησιµοποιείται για τη διάγνωση του ορθοκολικού καρκίνου ή οποιουδήποτε άλλου τύπου καρκίνου. Το κιτ SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD είναι ένας προσδιορισµός που ανιχνεύει την παρουσία πιθανών σωµατικών µεταλλάξεων στο εξώνιο 2 του γονιδίου KRAS, αλλά δεν επιβεβαιώνει την ταυτότητα της αλληλουχίας της µετάλλαξης. Για την επιβεβαίωση της ακριβούς µετάλλαξης που ανιχνεύθηκε, απαιτείται περαιτέρω ανάλυση, όπως προσδιορισµός της αλληλουχίας DNA. Παρότι τα αποτελέσµατα της ανάλυσης µε αυτό το κιτ θα υποδείξουν την κατάσταση µετάλλαξης του ασθενούς, θα πρέπει να λαµβάνονται υπόψη άλλοι κλινικοί παράγοντες, συµπεριλαµβανοµένων των µεταλλάξεων στα εξώνια 3 και 4 του γονιδίου KRAS και στα εξώνια 2, 3 και 4 του γονιδίου NRAS. Τα αποτελέσµατα που λαµβάνονται µε χρήση του κιτ SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD δεν θα πρέπει να αποτελούν τη µοναδική µέθοδο λήψης αποφάσεων σχετικά µε οποιαδήποτε θεραπεία ασθενών µε ορθοκολικό καρκίνο. Είναι σηµαντικό να σηµειωθεί ότι η χρήση του DHPLC για την ταυτοποίηση των θετικών για µετάλλαξη KRAS δειγµάτων µε αυτό το κιτ θα πρέπει να αποτελεί µόνο την κατευθυντήρια γραµµή και ότι όλες οι µεταλλάξεις θα πρέπει να επιβεβαιώνονται µε περαιτέρω ανάλυση, όπως µε προσδιορισµό της αλληλουχίας DNA.

5 3 Αρχές του προσδιορισµού ανίχνευσης µεταλλάξεων SURVEYOR Scan KRAS 3 Αρχές του προσδιορισµού ανίχνευσης µεταλλάξεων SURVEYOR Scan KRAS 3.1 KRAS και NRAS Οι θεραπευτικοί παράγοντες που στοχεύουν τον υποδοχέα του επιδερµικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) έχει καταδειχτεί ότι είναι αποτελεσµατικοί έναντι του ορθοκολικού καρκίνου. Η έρευνα έχει καταδείξει ότι περίπου 40% των ορθοκολικών όγκων φέρουν σωµατικές µεταλλάξεις του γονιδίου KRAS και οι κλινικές µελέτες κατέδειξαν ότι οι µεταλλάξεις του εξωνίου 2 του KRAS (κωδικόνια 12 και 13) προβλέπουν την απουσία ανταπόκρισης σε θεραπείες αντι-egfr. Πρόσφατες ερευνητικές µελέτες έχουν καταδείξει ότι ο πληθυσµός των ασθενών µπορεί να κατηγοριοποιηθεί περαιτέρω, καθώς οι ασθενείς των οποίων οι όγκοι µεταστατικού ορθοκολικού καρκίνου (mcrc) φέρουν µια επιπλέον µετάλλαξη στα εξώνια 3 και 4 του KRAS και στα εξώνια 2, 3 και 4 του NRAS τείνουν επίσης να µην ανταποκρίνονται σε θεραπεία που περιέχει αντι-egfr 1-7. Αυτό το κιτ είναι σχεδιασµένο για χρήση σε διαγνωστική ανάλυση των σωµατικών µεταλλάξεων του εξωνίου 2 του KRAS. Το κιτ SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD είναι ένας προσδιορισµός για ανίχνευση όλων των αλλαγών στην αλληλουχία και των µικρών προσθηκών/ελλείψεων στο εξώνιο 2 του γονιδίου KRAS. Μεταλλάξεις στα κωδικόνια 12 και 13 του KRAS έχουν συσχετισθεί µε την έλλειψη αποτελεσµατικότητας της πανιτουµουµάµπης. Σε αυτό το κιτ παρέχονται Positive Controls για µεταλλάξεις στα κωδικόνια 12 και 13. Αυτό το κιτ χρησιµοποιεί την αποκλειστική τεχνολογία SURVEYOR Nuclease της Transgenomic και, όταν συνδυάζεται µε DHPLC, εξασφαλίζει απλή και ευαίσθητη ανίχνευση των πιθανών µεταλλάξεων. Μπορεί να ανιχνεύσει ένα µίγµα 2-5% µεταλλαγµένου DNA σε υπόβαθρο µη µεταλλαγµένου DNA. Μελέτες επαλήθευσης έχουν καταδείξει εξαιρετικά υψηλή αντιστοιχία µε τον προσδιορισµό της αλληλουχίας σε καλά χαρακτηρισµένα δείγµατα ορθοκολικού καρκίνου. Η χρήση του κιτ SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD αφενός θα µειώσει τον φόρτο εργασίας που ενέχει ο προσδιορισµός αλληλουχίας για τον χρήστη και αφετέρου θα βοηθήσει στον προσδιορισµό της αλληλουχίας, στις περιπτώσεις που το λογισµικό αυτοµατοποιηµένου προσδιορισµού της αλληλουχίας αποτυγχάνει να επιβεβαιώσει την παρουσία µιας µετάλλαξης χαµηλού επιπέδου. Λόγω της υψηλής ευαισθησίας αυτού του προσδιορισµού σε σχέση µε τον προσδιορισµό αλληλουχίας κατά Sanger, συνιστάται η βελτιστοποίηση της διάταξης του εργαστηρίου ώστε να αποφευχθεί τυχόν διασταυρούµενη επιµόλυνση δειγµάτων ή µαρτύρων. Για ένα παράδειγµα ιδανικής εργαστηριακής οργάνωσης, βλ. Παράρτηµα A.4 Εργαστηριακή οργάνωση για προσδιορισµούς PCR. 3.2 Ανάλυση δειγµάτων ασθενών µε χρήση των κιτ SURVEYOR Scan Το κιτ SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD θα πρέπει να χρησιµοποιείται µόνο στο πλαίσιο µίας από τις ροές εργασίας που υποδεικνύονται παρακάτω. Ροή εργασίας A είγµα ασθενούς είγµα ασθενούς Ροή εργασίας B Εξέταση KRAS Exons 2, 3 & 4 και NRAS Exons 2, 3 & 4 Αναφορά αποτελέσµατος Εξέταση KRAS Exon 2 Αποτέλεσµα Μετάλλαξη στο κωδικόνιο 12 ή 13 του KRAS Αποτέλεσµα Μετάλλαξη στο κωδικόνιο 12 ή 13 του KRAS Αναφορά αποτελέσµατος Εξέταση KRAS Exons 3 & 4 και NRAS Exons 2, 3 & 4 Αναφορά αποτελέσµατος Σχήµα 1 Ροές εργασίας κιτ ανίχνευσης µεταλλάξεων SURVEYOR Scan για διαλογή KRAS και NRAS Οδηγίες χρήσης για το SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD για DHPLC Σελίδα 5

6 3 Αρχές του προσδιορισµού ανίχνευσης µεταλλάξεων SURVEYOR Scan KRAS Για µια πρόταση σχετικά µε την προετοιµασία πλακών 96 πηγαδιών για ανάλυση των εξωνίων 2-4 των KRAS και NRAS βλ. Παράρτηµα A.1 Σχέδιο διάταξης πλάκας για τα κιτ SURVEYOR Scan. 3.3 SURVEYOR Nuclease Το SURVEYOR Nuclease Transgenomic είναι φυτική ενδονουκλεάση DNA, ειδική για τις λανθασµένα ζευγαρωµένες βάσεις του DNA, η οποία µπορεί να ανιχνεύσει γνωστές ή άγνωστες µεταλλάξεις και πολυµορφισµούς σε ετερόδιπλα µόρια DNA 8. Το ένζυµο διασπά το DNA, µε υψηλή ειδικότητα, σε θέσεις λανθασµένου ζευγαρώµατος βάσης που έχει προκύψει από αντικατάσταση βάσης, καθώς και σε θέσεις άλλων διαταραχών των βάσεων του DNA. Αυτή η ενδονουκλεάση DNA κόβει και τους δύο κλώνους ενός ετερόδιπλου µορίου DNA στο 3 άκρο της θέσης λανθασµένου ζευγαρώµατος βάσεων. Το λανθασµένο ζευγάρωµα βάσεων που έχει προκύψει µε εισαγωγή/έλλειψη βάσεων και όλα τα λανθασµένα ζευγαρώµατα που έχουν προκύψει από αντικατάσταση βάσης αναγνωρίζονται, αλλά η αποτελεσµατικότητα της διάσπασης ποικίλλει ανάλογα µε την αλληλουχία στο σηµείο του λανθασµένου ζευγαρώµατος βάσεων. Σχήµα 2. Τρόπος δράσης του SURVEYOR Nuclease. Η ενδονουκλεάση αναγνωρίζει ένα λανθασµένο ζευγάρωµα βάσεων και κόβει στο 3 άκρο των λανθασµένα ζευγαρωµένων βάσεων. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα τη διάσπαση του δίκλωνου DNA, αφήνοντας προεξέχον 3 άκρο µιας µεµονωµένης βάσης. Το ένζυµο SURVEYOR Nuclease έχει χρησιµοποιηθεί σε ένα ευρύ φάσµα περιπτώσεων για την ακριβή ανίχνευση µιας ποικιλίας µεταλλάξεων και πολυµορφισµών των γονιδίων. Αξίζει να σηµειωθεί ότι το ένζυµο SURVEYOR Nuclease έχει χρησιµοποιηθεί για την επαλήθευση της παρουσίας γνωστών µεταλλάξεων σε έναν αριθµό γονιδίων που συσχετίζονται µε τον καρκίνο του νεφρού, του πνεύµονα, της κεφαλής και του τραχήλου, τη λευχαιµία, τον καρκίνο του ενδοµητρίου, αλλά και µε την πρόβλεψη της έκβασης της ακτινοθεραπείας 9,10,11. Το κιτ SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD έχει σχεδιαστεί για τη διάσπαση λανθασµένα ζευγαρωµένων βάσεων στο εξώνιο 2 του KRAS για επόµενη ανάλυση µε DHPLC. Σηµείωση: εάν κάποιο δείγµα DNA είναι µεταλλαγµένο σε ποσοστό 100%, δεν µπορούν να σχηµατιστούν ετερόδιπλα µόρια και το δείγµα θα εµφανίζεται ως «Wild-Type». Ωστόσο, τα δείγµατα βιοψίας όγκου θα περιέχουν κύτταρα Wild-Type λόγω της ετερογένειας του όγκου ή/και της επιµόλυνσης µε φυσιολογικό ιστό. Πρέπει να σηµειωθεί ότι µόνο το 5% Wild-Type είναι ανιχνεύσιµο από αυτό το κιτ, µε ίχνη πανοµοιότυπα µε το 5% µεταλλαγµένου DNA. Σηµείωση: Για αυτό τον προσδιορισµό, θα πρέπει να χρησιµοποιείται µόνο η DNA πολυµεράση που παρέχεται µε αυτό το κιτ. Σηµείωση: Ακολουθήστε τις ειδικές οδηγίες που αναφέρονται στο εγχειρίδιο του συστήµατος DHPLC που διαθέτετε. Για την αποτελεσµατική χρήση αυτού του κιτ, συνιστάται ιδιαίτερα να διαβάσετε διεξοδικά αυτό το εγχειρίδιο και να ακολουθήσετε προσεκτικά τις οδηγίες και κατευθυντήριες γραµµές που δίνονται. Οι νέοι χρήστες θα πρέπει να διενεργήσουν τα πειράµατα ελέγχου που περιγράφονται στην ενότητα Χρήση των µαρτύρων πλασµιδιακών DNA. Εάν έχετε περαιτέρω απορίες ή χρειάζεστε βοήθεια, καλέστε στον αριθµό τηλεφώνου (888) (µόνο για τη Βόρεια Αµερική), +1 (402) ή +44 (0) (Ευρώπη) και Οδηγίες χρήσης για το SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD για DHPLC Σελίδα 6

7 3 Αρχές του προσδιορισµού ανίχνευσης µεταλλάξεων SURVEYOR Scan KRAS ζητήστε το «τµήµα υποστήριξης KRAS». Εναλλακτικά, µπορείτε να µας αποστείλετε µήνυµα ηλεκτρονικού ταχυδροµείου στη διεύθυνση: 4 Ιχνηλασιµότητα των µαρτύρων του κιτ Οι µάρτυρες που παρέχονται µε αυτό το κιτ είναι πλασµιδιακοί κλώνοι των αλληλουχιών του εξωνίου 2 του KRAS. Έχει πραγµατοποιηθεί προσδιορισµός αλληλουχίας όλων των κλώνων για τον έλεγχο της πιστότητας της αλληλουχίας σε σύγκριση µε την αλληλουχία αναφοράς NCBI Reference Sequence: NG_ Οι µάρτυρες έχουν γενετική «σφραγίδα». Βλ. Παράρτηµα A.2 Σφραγίδες µαρτύρων DNA. Αυτές οι παραλλαγές σε σχέση µε την αλληλουχία KRAS Wild-Type, σε µια περιοχή στην οποία δεν αναµένεται να υπάρχουν µεταλλάξεις, µπορούν να χρησιµοποιηθούν για την αντιµετώπιση προβληµάτων επιµόλυνσης δείγµατος από τους θετικούς µάρτυρες Positive Control. Βλ. Παράρτηµα Β - Οδηγός αντιµετώπισης προβληµάτων, Πρόβληµα 8, για ένα παράδειγµα ανίχνευσης τέτοιου είδους επιµόλυνσης µε το SURVEYOR Scan. Το «KRAS Control Wild-Type» κατασκευάστηκε µε σύνθεση και κλωνοποίηση του εξωνίου 2 του KRAS χρησιµοποιώντας την παραπάνω αλληλουχία αναφοράς του NCBI. Το «KRAS Positive Control Exon 2» κατασκευάστηκε µε σύνθεση του εξωνίου 2 του KRAS, χρησιµοποιώντας την παραπάνω αλληλουχία αναφοράς, η οποία όµως περιείχε τη µετάλλαξη G12D. Ο προσδιορισµός της αλληλουχίας DNA επιβεβαίωσε ότι η µόνη αλλαγή στην αλληλουχία είναι στο κωδικόνιο 12, µε αλλαγή G12D, GGT>GAT. Στη συνέχεια, αυτός ο κλώνος αναµειγνύεται µε το DNA του KRAS Control Wild-Type, ώστε να δηµιουργηθεί ένα µίγµα ετερόζυγων µορίων. 5 Συστατικά Το κιτ SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD αποτελείται από (1) ένα κουτί συστατικών πέψης µε SURVEYOR µε 10 σωληνάρια αντιδραστηρίων και χωρίς καµία κενή οπή και (2) µια εξωτερική βάση σωληναρίων συστατικών και µαρτύρων PCR που περιέχει 11 σωληνάρια αντιδραστηρίων και 9 κενές οπές. Αριθµός καταλόγου Συστατικό Κουτί συστατικών πέψης SURVEYOR Χρώµα πώµατος σωληναρίου Όγκος που παρέχεται για κιτ 100 αντιδράσεων SURVEYOR Nuclease W Μωβ 2 x 105 µl SURVEYOR Enhancer W2 Μαύρο 105 µl SURVEYOR Enhancer Cofactor Ροζ 105 µl M MgCl 2 Solution Καφέ 105 µl SURVEYOR Stop Solution Κόκκινο 250 µl F Universal Sequencing Primer 1 (10 µm) Πορτοκαλί 2 x 125 µl R Universal Sequencing Primer 2 (10 µm) Πορτοκαλί 2 x 125 µl Κουτί συστατικών και µαρτύρων PCR DNA Polymerase Κόκκινο 100 µl DNA Polymerase 10X PCR Buffer Άχρωµο 1 ml dntps (10 mm) Άχρωµο 500 µl F KRAS Primer Exon 2 Forward (10 µm) Μπλε 3 x 90 µl R KRAS Primer Exon 2 Reverse (10 µm) Μπλε 3 x 90 µl KRAS Control Wild-Type Κίτρινο 120 µl KRAS Positive Control Exon 2 Πράσινο 40 µl Οδηγίες χρήσης Λήψη από τη διαδικτυακή τοποθεσία* Οδηγίες χρήσης για το SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD για DHPLC Σελίδα 7

8 5 Συστατικά 5.1 Αριθµός δειγµάτων που µπορούν να εξεταστούν µε ένα κιτ Το κιτ SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD είναι σχεδιασµένο ώστε να επιτρέπει την πραγµατοποίηση 100 αντιδράσεων εξέτασης. Ο συνολικός αριθµός δειγµάτων που µπορούν να εξεταστούν µε το κιτ εξαρτάται από το µέσο µέγεθος της παρτίδας δειγµάτων που εξετάζεται οποιαδήποτε στιγµή, επειδή ένα σετ αντιδράσεων µαρτύρων (Μάρτυρας άγριου τύπου Wild-Type, θετικός µάρτυρας Positive Control και µάρτυρας χωρίς µήτρα) πρέπει να συµπεριλαµβάνονται σε κάθε πλάκα αντίδρασης. Ο παρακάτω πίνακας δείχνει τον αριθµό των δειγµάτων που µπορούν να αναλυθούν µε το κιτ KRAS, ανάλογα µε το µέσο µέγεθος παρτίδας δειγµάτων. Λαµβάνονται υπόψη (α) οι 3 µάρτυρες (Wild-Type, Positive Control, µάρτυρας χωρίς µήτρα) που απαιτούνται για κάθε εκτέλεση ανάλυσης και (β) το όριο των 100 αντιδράσεων ανά κιτ. Σηµείωση: Εάν εκτελείται ανάλυση σε πολλές πλάκες, πρέπει να αναλύεται ένα σετ των 3 µαρτύρων που παρατίθενται παραπάνω σε κάθε πλάκα. Κατά συνέπεια, δύο πλάκες απαιτούν συνολικά 6 αντιδράσεις µαρτύρων, 3 πλάκες απαιτούν 9 αντιδράσεις µαρτύρων, κ.λπ. Όταν το µέγεθος παρτίδας δειγµάτων αυξάνεται, ο αριθµός των δειγµάτων που µπορούν να εξεταστούν µε ένα κιτ αυξάνεται, µειώνοντας το µέσο κόστος αντιδραστηρίων ανά δείγµα. Ο παρακάτω πίνακας αποτελεί έναν οδηγό για τον αριθµό τον δειγµάτων που µπορούν να εξεταστούν µε ένα µεµονωµένο κιτ. Μέγεθος παρτίδας δειγµάτων Αρ. αντιδράσεων µαρτύρων + Αρ. ενισχυµένων τµηµάτων δειγµάτων Αρ. αντιδράσεων που απαιτούνται ανά εκτέλεση ανάλυσης Συνολικός αρ. εκτελέσεων ανάλυσης παρτίδας δειγµάτων ανά κιτ Συνολικά δείγµατα που εξετάζονται ανά κιτ Προσδιορισµός αλληλουχίας DNA Οι εκκινητές Universal Sequencing Primers (κωδικοί είδους F και R) παρέχονται για χρήση, για τον προσδιορισµό της αλληλουχίας DNA όλων των δειγµάτων που εξετάζονται. Για τον προσδιορισµό της αλληλουχίας θα πρέπει να χρησιµοποιηθούν τα ενισχυµένα τµήµατα PCR που δηµιουργούνται πριν από την πέψη µε SURVEYOR Nuclease. Οδηγίες χρήσης για το SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD για DHPLC Σελίδα 8

9 6 Επιπλέον απαιτούµενος εξοπλισµός και αντιδραστήρια 6 Επιπλέον απαιτούµενος εξοπλισµός και αντιδραστήρια Στα επιπλέον συστατικά και εξοπλισµός που απαιτούνται για τη χρήση του κιτ SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD για DHPLC συγκαταλέγονται τα εξής: Σύστηµα DHPLC, στήλη, ρυθµιστικά διαλύµατα, πρότυπο µεγέθους DNA - Για τα χαρακτηριστικά ενός κατάλληλου συστήµατος DHPLC για χρήση µε αυτό το κιτ, βλ. Παράρτηµα A.3.1 Προδιαγραφές DHPLC για εφαρµογές SURVEYOR Scan Νερό καθαρότητας µοριακής βιολογίας Σωληνάρια PCR των 0,2 ml, ταινίες ή πλάκα 96 πηγαδιών Μικροπιπέτες Ρύγχη πιπετών Λουτρό πάγου Αναδευτήρας τύπου vortex Μικροφυγόκεντρος Θερµικός κυκλοποιητής Πηκτώµατα αγαρόζης και εξοπλισµός ηλεκτροφόρησης σε πήκτωµα αγαρόζης. διάλυµα λευκαντικού µέσου 10% ή παρόµοιος παράγοντας καθαρισµού 7 Παρασκευή αντιδραστηρίων Όλα τα αντιδραστήρια που παρέχονται µε αυτό το κιτ είναι έτοιµα προς χρήση. Ορισµένα συστατικά θα χρειαστούν απόψυξη, ανακίνηση σε αναδευτήρα τύπου vortex ή µικροφυγοκέντρηση πριν από τη χρήση. Για λεπτοµέρειες, ανατρέξτε παρακάτω, στην ενότητα ιαδικασία προσδιορισµού. Τα αντιδραστήρια θα πρέπει να συνδυαστούν µεταξύ τους προκειµένου να παραχθούν κύρια µίγµατα και µίγµατα αντίδρασης. Αναλυτικές οδηγίες παρέχονται παρακάτω, στην ενότητα ιαδικασία προσδιορισµού. 8 Φύλαξη και διάρκεια ζωής Το κιτ θα πρέπει να φυλάσσεται σε θερµοκρασία µεταξύ -18 ºC και -25 C, σε καταψύκτη σταθερής θερµοκρασίας µέχρι να χρησιµοποιηθεί. ίνετε προσοχή στην ηµεροµηνία λήξης του κάθε κιτ που παραλαµβάνετε. Μη χρησιµοποιείτε το κιτ µετά την παρέλευση της ηµεροµηνίας λήξης. Το µίγµα SURVEYOR Nuclease που παρασκευάστηκε στο βήµα 7 της πέψης µε SURVEYOR Nuclease θα πρέπει να χρησιµοποιηθεί αµέσως, καθώς το SURVEYOR Nuclease W αδρανοποιείται µε την πάροδο του χρόνου, όταν είναι παρόντα τα υπόλοιπα συστατικά του µίγµατος αντίδρασης SURVEYOR Nuclease. 9 Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις Κανένα από τα αντιδραστήρια αυτού του κιτ δεν αποτελεί κίνδυνο για την υγεία στις ποσότητες που παρέχεται. Το έγγραφο υπ αριθµ. MSD της Transgenomic µπορεί να ληφθεί από τη διαδικτυακή τοποθεσία εν υπάρχουν ουσίες ζωικής ή ανθρώπινης προέλευσης σε αυτό το κιτ που να παρουσιάζουν κίνδυνο πρόκλησης λοίµωξης. Αυτό το κιτ θα πρέπει να χρησιµοποιείται µόνο από άτοµα που έχουν εκπαιδευτεί στις κατάλληλες εργαστηριακές τεχνικές. Όταν εργάζεστε µε τα περιεχόµενα αυτού του κιτ, να φοράτε πάντοτε την κατάλληλη ρόµπα εργαστηρίου, γάντια µίας χρήσης και προστατευτικά µατιών. Μετά τη χρήση, τα συστατικά του κιτ θα πρέπει να απορρίπτονται ως κλινικά απόβλητα και σύµφωνα µε τους τοπικούς κανόνες και κανονισµούς. Τα κλάσµατα των αντιδραστηρίων που µεταφέρονται µε πιπέτα από τα σωληνάρια αυτού του κιτ προορίζονται για µία µόνο χρήση. Έχει αποδειχθεί ότι τα συστατικά αυτού του κιτ διατηρούν τη Οδηγίες χρήσης για το SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD για DHPLC Σελίδα 9

10 9 Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις σταθερότητά τους για 25 κύκλους κατάψυξης-απόψυξης. Μη χρησιµοποιήσετε αυτό το κιτ, εάν έχετε υπερβεί τον αριθµό των κύκλων κατάψυξης-απόψυξης. 10 Συλλογή, χειρισµός και φύλαξη πρωτογενών δειγµάτων Το κιτ SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD για το σύστηµα DHPLC έχει επικυρωθεί για χρήση µε DNA που εκχυλίζεται από δείγµατα όγκου ορθοκολικού καρκίνου, τα οποία έχουν µονιµοποιηθεί σε φορµόλη και εγκλειστεί σε παραφίνη (FFPE). Για βέλτιστη εκχύλιση του DNA, ο ιστός θα πρέπει να έχει µονιµοποιηθεί στη φορµόλη για ώρες πριν από τον εγκλεισµό του σε παραφίνη. Οι βιοψίες όγκων είναι ένα ετερογενές µίγµα καρκινικών και µη καρκινικών κυττάρων. Επιπρόσθετα, ο ίδιος ο όγκος είναι ένα ετερογενές µίγµα καρκινικών κυττάρων µε µεταλλάξεις και καρκινικών κυττάρων χωρίς µεταλλάξεις. Επειδή αυτές οι σωµατικές µεταλλάξεις ενδέχεται να µην είναι οµοιόµορφα κατανεµηµένες στον όγκο, η επακόλουθη ανάλυση µεταλλάξεων των διαφόρων τµηµάτων του ίδιου όγκου µπορεί να διαφέρει. Για να αυξήσετε την πιθανότητα ανίχνευσης κάποιας µετάλλαξης, το DNA από την περιοχή του ιστού στην οποία βρίσκεται ο όγκος θα πρέπει να αποµονωθεί µε απόξεση µόνο της περιοχής του όγκου από τη γυάλινη αντικειµενοφόρο πλάκα, χρησιµοποιώντας ένα καθαρό, αποστειρωµένο νυστέρι για κάθε νέα αντικειµενοφόρο πλάκα. Για την επιτυχή χρήση αυτού του κιτ, το εκχυλισµένο DNA θα πρέπει να πληροί τα κριτήρια που παρατίθενται στην ενότητα Ζητήµατα σχετικά µε τη µήτρα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα εκχυλισµένα δείγµατα DNA που δεν προορίζονται άµεσα για ανάλυση µε αυτό το κιτ θα πρέπει να φυλάσσονται στην κατάψυξη, σε θερµοκρασία -20 ºC έως -80 ºC. 11 ιαδικασία προσδιορισµού 11.1 Ανίχνευση σωµατικών µεταλλάξεων µε τα κιτ SURVEYOR Scan - Επισκόπηση Η ανίχνευση και η επιβεβαίωση µίας µετάλλαξης µε το SURVEYOR Nuclease περιλαµβάνει τρία βήµατα: Βήµα 1 - Προετοιµάστε τα ενισχυµένα τµήµατα PCR από το µεταλλαγµένο DNA (προς εξέταση) και το φυσιολογικό DNA (αναφοράς), συνεχίζοντας από τον τελευταίο κύκλο ενίσχυσης µε PCR για να αποδιατάξετε όλα τα δίκλωνα µόρια και, κατόπιν, ψύξτε αργά για βέλτιστο σχηµατισµό ετερόδιπλων και οµόδιπλων µορίων (τα ετερόδιπλα µόρια Οδηγίες χρήσης για το SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD για DHPLC Σελίδα 10

11 11 ιαδικασία προσδιορισµού προκύπτουν όταν ένας κλώνος µε αλληλουχία Wild-Type υβριδοποιείται µε έναν κλώνο µε µεταλλαγµένη αλληλουχία). Βήµα 2 - Υποβάλλετε ένα µερίδιο του µίγµατος υβριδοποιηµένων ετερόδιπλων/οµόδιπλων µορίων σε επεξεργασία µε το ένζυµο SURVEYOR Nuclease. Το ένζυµο SURVEYOR Nuclease θα κόψει και τους δύο κλώνους του ετερόδιπλου DNA δηµιουργώντας θραύσµατα DNA. Με παρόµοια επεξεργασία, το Control Wild-Type DNA χρησιµεύει ως µάρτυρας υποβάθρου. Βήµα 3 - Αναλύστε τα θραύσµατα DNA σε ένα σύστηµα DHPLC. Ο σχηµατισµός νέων προϊόντων διάσπασης λόγω της παρουσίας ενός ή περισσοτέρων λανθασµένων ζευγαρωµάτων βάσεων, υποδεικνύεται από την παρουσία επιπλέον κορυφών χρωµατογραφίας. Οι χρόνοι µετανάστευσης των προϊόντων διάσπασης υποδεικνύουν το µέγεθος των θραυσµάτων και, κατά συνέπεια, τη θέση του λανθασµένου ζευγαρώµατος ή των λανθασµένων ζευγαρωµάτων βάσεων κατά προσέγγιση. 12 Οδηγίες βήµα προς βήµα 12.1 Αρχική προετοιµασία/βαθµονόµηση του συστήµατος DHPLC Όταν προετοιµάζετε την πλάκα SURVEYOR Nuclease για ανάλυση µε DHPLC, ανατρέξτε στο Παράρτηµα A.3 Απαιτήσεις του συστήµατος αποδιατακτικής HPLC (DHPLC) Ζητήµατα που πρέπει να ληφθούν υπόψη πριν από την ανάλυση δείγµατος για KRAS Πριν από την εκτέλεση ανάλυσης δειγµάτων σε ένα σύστηµα DHPLC, πρέπει να αναλυθεί ένα κατάλληλο πρότυπο µεγέθους DNA, προκειµένου να διασφαλιστεί ότι το σύστηµα λειτουργεί κανονικά. Το προσωπικό του εργαστηρίου που χρησιµοποιεί το όργανο θα πρέπει να ελέγχει την ποιότητα της διακριτικής ικανότητας του προτύπου µεγέθους DNA προτού προχωρήσει στην ανάλυση Ζητήµατα σχετικά µε τη µήτρα 1. Για µήτρα DNA που έχει αποµονωθεί από δείγµα FFPE, ακολουθήστε τις συνήθεις εργαστηριακές διαδικασίες για την εκτίµηση της ποιότητας και της ποσότητας του εκχυλισµένου DNA, έτσι ώστε να διασφαλίσετε ότι υπάρχει αρκετή µήτρα για PCR. 2. Ο λόγος απορρόφησης 260/280 θα πρέπει να είναι υψηλότερος από 1, Για να επισπεύσετε την προετοιµασία της αντίδρασης PCR, προσαρµόστε τη συγκέντρωση της µήτρας σε 12,5 ng/µl περίπου. Αραιώστε τη µήτρα DNA σε νερό καθαρότητας µοριακής βιολογίας, όταν απαιτείται. Οδηγίες χρήσης για το SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD για DHPLC Σελίδα 11

12 12 Οδηγίες βήµα προς βήµα 12.4 Ζητήµατα σχετικά µε τη ροή εργασίας Το κιτ έχει σχεδιαστεί ώστε να επιτρέπει την ανάλυση 100 αντιδράσεων. Μπορεί να εκτελεστεί ανάλυση µικρότερων παρτίδων δειγµάτων, αλλά µε κάθε παρτίδα δειγµάτων πρέπει να περιλαµβάνονται οι µάρτυρες του κιτ και ένας «µάρτυρας χωρίς µήτρα». Το κιτ περιέχει µάρτυρες που επαρκούν για 100 αντιδράσεις για όλους τους συνδυασµούς µεγεθών παρτίδας δειγµάτων προς χρήση. Γενικά, η επεξεργασία των δειγµάτων θα πρέπει να γίνεται από την αρχή έως το τέλος, όπως περιγράφεται σε αυτές τις οδηγίες χρήσης. Εάν η επεξεργασία ενός δείγµατος πρέπει να διακοπεί πριν από την ολοκλήρωση όλων των βηµάτων, το DNA θα πρέπει να φυλάσσεται στους -20 C στα χρονικά σηµεία που υποδεικνύονται. Ωστόσο, θα πρέπει να αποφεύγεται η έκθεση οποιουδήποτε κατεψυγµένου δείγµατος σε επαναλαµβανόµενους κύκλους κατάψυξης-απόψυξης, καθώς και η κατάψυξη (-18 έως -25 C) του DNA που έχει ενισχυθεί µε PCR ή των προϊόντων πέψης µε SURVEYOR Nuclease για παρατεταµένες περιόδους (>1 εβδοµάδα). Η ανάλυση δειγµάτων θα πρέπει να ακολουθεί τη ροή εργασιών που παρατίθεται παρακάτω: Απόξεση ιστού 1 Αποµόνωση DNA και PCR 2 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα 3 5 Αποτυχία SURVEYOR Scan Αξιολόγηση ισχυρού/ασθενούς προϊόντος PCR SURVEYOR Nuclease και ανάλυση DHPLC 4 Θετικό αποτέλεσµα SURVEYOR Scan Αρνητικό αποτέλεσµα SURVEYOR Scan 7 6 Επιβεβαίωση αλληλουχίας NVD 8 Αποτυχία ποιότητας αλληλουχίας Επιτυχία ποιότητας αλληλουχίας 9 Μεταλλάξεις στα κωδικόνια G12 ή G13 NVD Σχήµα 3: Ροή εργασίας του κιτ ανάλυσης SURVEYOR Scan KRAS Οδηγίες χρήσης για το SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD για DHPLC Σελίδα 12

13 12 Οδηγίες βήµα προς βήµα Σηµειώσεις για το Σχήµα 3 1. Αποµονώστε το DNA από τον ιστό FFPE χρησιµοποιώντας τυπικές εργαστηριακές διαδικασίες. 2. Εκτελέστε PCR και ελέγξτε την ποιότητα του DNA µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα. 3. Καταγράψτε εάν η ζώνη PCR είναι Ισχυρή ( 20 ng/µl) ή Ασθενής (<20 ng/µl). Εάν υπάρχουν πολλές ζώνες PCR, προετοιµάστε νέο γονιδιωµατικό DNA από ιστό FFPE. 4. Στην περίπτωση δειγµάτων που χαρακτηρίζονται είτε ως Ισχυρό προϊόν PCR είτε ως Ασθενές προϊόν PCR µετά από ενίσχυση µε PCR, συνεχίστε µε επεξεργασία µε SURVEYOR Nuclease και ανάλυση στο σύστηµα DHPLC. Θα πρέπει να σηµειωθεί ότι µε ένα δείγµα χαρακτηρισµένο ως Ασθενές προϊόν PCR µπορεί να µην υπάρχει αρκετό DNA για τη δηµιουργία ουσιαστικών αποτελεσµάτων µε DHPLC, αλλά µπορεί να υπάρχει αρκετό DNA για τον προσδιορισµό αλληλουχίας. 5. Βλ. Παράρτηµα B Οδηγός αντιµετώπισης προβληµάτων για παραδείγµατα ανεπιτυχών αποτελεσµάτων SURVEYOR Scan. Όλα τα δείγµατα µε ανεπιτυχές αποτέλεσµα SURVEYOR Scan θα πρέπει να υποβάλλονται εκ νέου σε επεξεργασία µε: a. επανάληψη της αντίδρασης PCR, εάν έχει αποµένει αρκετό γονιδιωµατικό DNA ή b. επανάληψη της εκχύλισης DNA από τον ιστό FFPE. Αυτή η επιλογή θα πρέπει να είναι δευτερεύουσα, καθώς συνήθως δεν είναι επιθυµητή η κοπή ενός άλλου τεµαχίου FFPE, ή c. εάν χρησιµοποιηθεί µια άλλη τοµή ή τεµάχιο, θα πρέπει να επαναληφθεί ολόκληρος ο προσδιορισµός, επειδή µπορεί να υπάρχουν ασυµφωνίες στις πέψεις λόγω της ετερογένειας του όγκου. 6. Εάν δεν υπάρχουν ορατές κορυφές διάσπασης, καταγράψτε αρνητικό αποτέλεσµα SURVEYOR Scan, δηλαδή NVD = No Variant Detected ( εν ανιχνεύθηκε καµία παραλλαγή). 7. Εάν ένα δείγµα εµφανίζει προϊόντα διάσπασης µε SURVEYOR Nuclease (τα οποία δεν αντιστοιχούν στον αντίστοιχο µάρτυρα Wild-Type Control), τα προϊόντα θα πρέπει να αποστέλλονται για επιβεβαίωση µε προσδιορισµό αλληλουχίας. 8. Εάν η ανάλυση επιβεβαίωσης αλληλουχίας δεν είναι αποδεκτή, τότε: a. επαναλάβετε την αντίδραση PCR, εάν έχει αποµένει αρκετό γονιδιωµατικό DNA ή b. επαναλάβετε την εκχύλιση DNA από τον ιστό FFPE. Αυτή η επιλογή θα πρέπει να είναι δευτερεύουσα, καθώς συνήθως δεν είναι επιθυµητή η κοπή επιπλέον δειγµάτων από ένα τεµάχιο FFPE. 9. Εάν η ανάλυση επιβεβαίωσης αλληλουχίας είναι αποδεκτή, τα αποτελέσµατα θα πρέπει να υποδεικνύουν είτε: a. Αλληλουχία Wild-Type, δηλαδή ότι δεν ανιχνεύθηκε καµία παραλλαγή (NVD) ή b. ότι ανιχνεύθηκε παραλλαγή. Εάν η επιβεβαίωση αλληλουχίας υποδεικνύει αλλαγή οποιασδήποτε βάσης η οποία οδηγεί σε µια αλλαγή αµινοξέος: i. στο κωδικόνιο 12 ή ii. στο κωδικόνιο 13 αξιολογήστε το δείγµα ως θετικό για µετάλλαξη KRAS. Σηµείωση: είναι δυνατό να υπάρχει ένα θετικό αποτέλεσµα µε τον προσδιορισµό SURVEYOR Scan που µπορεί επίσης να έχει ως αποτέλεσµα «δεν ανιχνεύθηκε παραλλαγή» από µια εξέταση επιβεβαίωσης µε προσδιορισµό αλληλουχίας. Το επίπεδο ανίχνευσης (LOD) του SURVEYOR Nuclease σε ένα σύστηµα DHPLC είναι έως και 2% µεταλλαγµένου DNA σε 98% DNA Wild-Type για κάποιες µεταλλάξεις, ενώ το LOD του προσδιορισµού αλληλουχίας είναι περίπου 10-25% µεταλλαγµένου DNA σε 90-75% DNA Wild-Type. Οδηγίες χρήσης για το SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD για DHPLC Σελίδα 13

14 12 Οδηγίες βήµα προς βήµα Σηµείωση: εάν κάποιο δείγµα DNA είναι µεταλλαγµένο σε ποσοστό 100%, δεν µπορούν να σχηµατιστούν ετερόδιπλα µόρια και το δείγµα θα εµφανίζεται ως «Wild-Type». Ωστόσο, τα δείγµατα βιοψίας όγκου θα περιέχουν κύτταρα Wild-Type λόγω της ετερογένειας του όγκου ή/και της επιµόλυνσης µε φυσιολογικό ιστό. Το 5% Wild-Type είναι ανιχνεύσιµο από αυτό το κιτ, µε ίχνη πανοµοιότυπα µε το 5% µεταλλαγµένου DNA. Σηµείωση: µπορούν να προκύψουν θετικά αποτελέσµατα SURVEYOR Scan λόγω αλλαγών βάσεων διαφορετικών από εκείνες για τις οποίες έχει καταδειχτεί ότι οδηγούν σε µεταλλάξεις ενεργοποίησης του KRAS. Παρότι αυτές οι µεταλλάξεις είναι σπάνιες, θα απαιτηθεί επιβεβαίωση µε µια άλλη µέθοδο, όπως ο προσδιορισµός αλληλουχίας DNA, προκειµένου να καθοριστεί εάν ένα θετικό αποτέλεσµα SURVEYOR Scan είναι µια µετάλλαξη ενεργοποίησης του KRAS. Σηµείωση: η διαδικασία µονιµοποίησης σε φορµόλη που χρησιµοποιείται κατά την προετοιµασία των δειγµάτων βιοψίας όγκων FFPE µπορεί να προκαλέσει απαµίνωση κυτοσινών. Αυτή η απαµίνωση µετατρέπει την κυτοσίνη σε ουρακίλη. Η πολυµεράση θα «διαβάσει» αυτή την ουρακίλη ως θυµίνη και θα ενσωµατώσει µια αδενίνη στους κλώνους που αντιγράφονται. Έτσι, αυτό θα φαίνεται ως µετάλλαξη, όπου η φυσιολογική G θα έχει πλέον αντικατασταθεί µε µια A, προκαλώντας µία µετάλλαξη G/C σε A/T, η οποία είναι ένα τέχνηµα µετάλλαξης που προκύπτει από τη διαδικασία µονιµοποίησης και όχι µια πραγµατική σωµατική µετάλλαξη. Πρόκειται για σπάνιες περιπτώσεις, οι οποίες ωστόσο, εάν αντιγραφούν στους πρώτους κύκλους της αντίδρασης PCR, θα «µοιάζουν» µε µεταλλάξεις. εν επαναλαµβάνονται κατά την εκ νέου ανάλυση. Παραδείγµατα πιθανών µεταλλάξεων απαµίνωσης κυτοσίνης οι οποίες θα πρέπει να λαµβάνονται υπόψη κατά τον καθορισµό της θεραπείας του ασθενούς είναι τα εξής: - Κωδικόνιο 12: AGT (G12S) και GAT (G12D) - Κωδικόνιο 13: AGC (G13S), GAC (G13D) και GGT (G13G, µια σιωπηλή µετάλλαξη) Συνεπώς, συνιστάται οποιαδήποτε τέτοιου είδους µετάλλαξη να επιβεβαιώνεται µε ανάλυση επαναληπτικού δείγµατος του ίδιου γονιδιωµατικού DNA ή όλα τα δείγµατα να υπόκεινται σε ανάλυση επαναληπτικού δείγµατος από την αρχή της ανάλυσης Πρωτόκολλο ενίσχυσης 1. Το προαναµεµειγµένο διάλυµα dntp της Transgenomic (κωδ. είδους ) παρέχεται µε µια συγκέντρωση εργασίας 10 mm συνολικών δεοξυριβονουκλεοτιδίων (2,5 mm από καθένα από τα τέσσερα δεοξυριβονουκλεοτίδια). 2. Οι εκκινητές KRAS Exon 2 Forward και Reverse (κωδ. είδους F/R) παρέχονται σε συγκέντρωση 10 µm. 3. Βγάλτε τους εκκινητές 10 µm, το διάλυµα dntps 10 mm και το DNA Polymerase 10X PCR Buffer (κωδ. είδους ) από τον καταψύκτη και αφήστε τα να αποψυχθούν στον πάγο. 4. Μόλις αποψυχθούν, αναδεύστε όλα τα συστατικά του κιτ σε αναδευτήρα τύπου vortex (~10 δευτερόλεπτα), έτσι ώστε να αναµειχθούν καλά, φυγοκεντρήστε τα σύντοµα (~10 δευτερόλεπτα), έτσι ώστε να διασφαλίσετε ότι δεν έχουν αποµείνει καθόλου υγρά στα πώµατα των σωληναρίων και τοποθετήστε τα στον πάγο. 5. Προετοιµάστε το κύριο µίγµα στον πάγο. Οδηγίες χρήσης για το SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD για DHPLC Σελίδα 14

15 12 Οδηγίες βήµα προς βήµα 6. Χρησιµοποιήστε τον παρακάτω πίνακα ως οδηγό για την προετοιµασία του κύριου µίγµατος για τις αντιδράσεις KRAS Exon 2: Αριθµός αντιδράσεων: 10 Υπολογισµός όγκου: Όγκος νερού (µl) 330** DNA Polymerase 10X PCR Buffer (µl) 50 dntps (µl) 40 KRAS Primer Exon 2 Forward (µl) 25 KRAS Primer Exon 2 Reverse (µl) 25 DNA Polymerase (µl) 10 Συνολικός όγκος κύριου µίγµατος 48,0 **Σηµείωση: Ο στόχος του χρήστη θα πρέπει είναι τουλάχιστον 25 ng DNA ανά 50 µl αντίδρασης. Όταν οι συγκεντρώσεις του εκχυλισµένου DNA είναι χαµηλότερες από 12,5 ng/µl, αυξήστε αναλογικά τον όγκο του εκχυλισµένου DNA, έτσι ώστε να εξασφαλίσετε 25 ng ανά αντίδραση. Επίσης, µειώστε από τον όγκο του νερού του κυρίου µίγµατος ποσότητα ίση µε την αύξηση του όγκου του εκχυλισµένου DNA, ώστε να προκύψουν 50 µl ανά αντίδραση. Σε όλα τα δείγµατα που έχουν παρασκευαστεί µε αυτό το κύριο µίγµα, το εκχυλισµένο DNA θα πρέπει να είναι αραιωµένο περίπου στο ίδιο χαµηλότερο επίπεδο συγκέντρωσης. εν συνίσταται η χρήση συγκεντρώσεων εκχυλισµένου DNA χαµηλότερων από 5 ng/µl. 7. Υπολογίστε τους απαιτούµενους όγκους για οποιοδήποτε δεδοµένο κύριο µίγµα, ανατρέχοντας στο παραπάνω διάγραµµα. Πρέπει να σηµειωθεί ότι: Για αυτό το κύριο µίγµα, θα χρειαστούν τρεις επιπλέον αντιδράσεις για τον µάρτυρα KRAS Control Wild-Type, τον θετικό µάρτυρα KRAS Positive Control Exon 2 και τον µάρτυρα χωρίς µήτρα KRAS Exon 2 (NTC). Σηµείωση: λάβετε υπόψη ότι θα χρειαστεί όγκος κύριου µίγµατος ελαφρώς µεγαλύτερος από εκείνον που προκύπτει µε αυτό τον υπολογισµό, για την αντιµετώπιση τυχόν απωλειών κατά τη διάρκεια της µεταφοράς µε πιπέτα. 8. Επισηµάνετε τα σωληνάρια PCR των 0,2 ml ή τα πηγάδια µιας πλάκας 96 πηγαδιών µε τις αντίστοιχες πληροφορίες δείγµατος. 9. Επισηµάνετε ένα σωληνάριο φυγοκέντρησης 2,0 ml για την παρασκευή του κύριου µίγµατος. 10. Προσθέστε τον απαιτούµενο όγκο νερού καθαρότητας µοριακής βιολογίας στα σωληνάρια φυγοκέντρησης 2,0 ml που φέρουν την επισήµανση «κύριο µίγµα». 11. Προσθέστε την απαιτούµενη ποσότητα DNA Polymerase 10X PCR Buffer στο σωληνάριο του κύριου µίγµατος. 12. Προσθέστε τον απαιτούµενο όγκο 10 mm dntps στο σωληνάριο του κύριου µίγµατος. 13. Προσθέστε τον απαιτούµενο όγκο KRAS Forward Primer στο σωληνάριο του κύριου µίγµατος. 14. Προσθέστε τον απαιτούµενο όγκο KRAS Reverse Primer στο σωληνάριο του κύριου µίγµατος. 15. Βγάλτε το ένζυµο DNA Polymerase (κωδ. είδους ) από τον καταψύκτη. 16. Φυγοκεντρήστε το ένζυµο DNA Polymerase για ~10 δευτερόλεπτα. 17. Ανακινήστε το ένζυµο DNA Polymerase σε αναδευτήρα τύπου vortex για ~10 δευτερόλεπτα. 18. Προσθέστε τον απαιτούµενο όγκο DNA Polymerase στο σωληνάριο του κύριου µίγµατος. 19. Πωµατίστε το σωληνάριο του κύριου µίγµατος. 20. Πριν από τη χρήση, ανακινήστε το σωληνάριο του κύριου µίγµατος σε αναδευτήρα τύπου vortex για ~30 δευτερόλεπτα και, κατόπιν, φυγοκεντρήστε σύντοµα για ~10 δευτερόλεπτα. Οδηγίες χρήσης για το SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD για DHPLC Σελίδα 15

16 12 Οδηγίες βήµα προς βήµα 21. Φυλάξτε σε πάγο µέχρι τη χρήση. 22. Μεταφέρετε µε την πιπέτα 48,0 µl (δείτε την παραπάνω σηµείωση στο βήµα 6) από το κύριο µίγµα στα κατάλληλα πηγάδια, αλλάζοντας τα ρύγχη πιπέτας από δείγµα σε δείγµα, εάν χρησιµοποιείτε µονοκάναλη πιπέτα. Εάν χρησιµοποιείτε µια επαναληπτική πιπέτα, βεβαιωθείτε ότι δεν υπάρχει έκχυση ή εκτίναξη υγρού από πηγάδι σε πηγάδι. ιατηρήστε την πλάκα στον πάγο. 23. Στα κατάλληλα πηγάδια, προσθέστε 2,0 µl (δείτε την παραπάνω σηµείωση στο βήµα 6) από κάθε µήτρα DNA ή 2,0 µl νερό (µάρτυρας χωρίς µήτρα, NTC). Χρησιµοποιήστε ξεχωριστά ρύγχη πιπέτας για κάθε δείγµα και αποφύγετε τη διασταυρούµενη µόλυνση των δειγµάτων από τυχόν εκτίναξη υγρού. Πωµατίστε τα πηγάδια που περιέχουν τα δείγµατα DNA και τον µάρτυρα NTC µε τις ταινίες 8 πωµάτων (εάν χρησιµοποιείτε πλάκα 96 πηγαδιών) ή πωµατίστε τα σωληνάρια PCR των 0,2 ml. Βεβαιωθείτε ότι τα πώµατα έχουν σφραγιστεί καλά. 24. Μόνο τότε ανοίξτε τα σωληνάρια των µαρτύρων µήτρας DNA του κιτ (κωδ. είδους , ) του κιτ, ένα κάθε φορά. Μεταφέρετε µε την πιπέτα 2,0 µl κάθε µήτρας µαρτύρων τελευταία, έτσι ώστε να µειώσετε την πιθανότητα επιµόλυνσης οποιουδήποτε δείγµατος DNA. Πωµατίστε ξανά όλα τα πηγάδια µε τις ταινίες 8 πωµάτων (εάν χρησιµοποιείτε πλάκα 96 πηγαδιών) ή πωµατίστε τα σωληνάρια PCR των 0,2 ml. Βεβαιωθείτε ότι τα πώµατα έχουν σφραγιστεί καλά. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η ορθή πρακτική υπαγορεύει την τοποθέτηση µαρτύρων χωρίς µήτρα (NTC) σε πηγάδια τα οποία δεν βρίσκονται δίπλα στον θετικό µάρτυρα Positive Control ή στα δείγµατα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Για µια πρόταση σχετικά µε την προετοιµασία πλακών 96 πηγαδιών για ανάλυση των εξωνίων 2-4 των KRAS και NRAS βλ. Παράρτηµα A.1 Σχέδιο διάταξης πλάκας για τα κιτ SURVEYOR Scan. 25. Ανακινήστε σε αναδευτήρα τύπου vortex (~1/2 ταχύτητα) για 10 δευτερόλεπτα. 26. Φυγοκεντρήστε για 1-2 λεπτά για να διασφαλίσετε ότι όλη η ποσότητα των διαλυµάτων είναι συγκεντρωµένη στον πυθµένα των πηγαδιών ή των σωληναρίων. Βεβαιωθείτε ότι τα διαλύµατα βρίσκονται στον πυθµένα κάθε πηγαδιού ή σωληναρίου. Εάν δεν βρίσκονται, επαναλάβετε τη φυγοκέντρηση. Οδηγίες χρήσης για το SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD για DHPLC Σελίδα 16

17 12 Οδηγίες βήµα προς βήµα 12.7 Πρόγραµµα θερµικού κυκλοποιητή για το πρωτόκολλο ενίσχυσης 1. Χρησιµοποιήστε το ακόλουθο πρωτόκολλο θερµικού κυκλοποιητή για ενίσχυση µε PCR και σχηµατισµό ετερόδιπλων µορίων: 15 κύκλοι 30 κύκλοι Αρχική αποδιάταξη 95 ºC 5 λεπτά Ενίσχυση Touchdown 95 ºC 30 δευτερόλεπτα 62 ºC, -0,5 ºC/κύκλο 30 δευτερόλεπτα 72 ºC 25 δευτερόλεπτα Ενίσχυση 95 ºC 30 δευτερόλεπτα 55 ºC 30 δευτερόλεπτα 72 ºC 25 δευτερόλεπτα Τελική επέκταση 1 κύκλος 72 ºC 2 λεπτά Σχηµατισµός ετερόδιπλων µορίων 95 ºC 2 λεπτά 12 ºC Αναµονή 12.8 Ποιοτικός έλεγχος προϊόντων PCR 1. Συνιστάται να ελέγξετε την ποιότητα και την ποσότητα του ενισχυµένου τµήµατος µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα (ή αντίστοιχα µέσα) προτού προχωρήσετε σε πέψη µε SURVEYOR Nuclease. 2. Αναλύστε ένα κλάσµα του προϊόντος PCR µαζί µε διαφορετικές ποσότητες ενός δείκτη µοριακού βάρους DNA των 100 bp. 3. Χρησιµοποιήστε τον δείκτη µοριακού βάρους για να υπολογίσετε τη συγκέντρωση του ενισχυµένου DNA. 4. Θα πρέπει να παρατηρηθεί µόνο µία µονή ζώνη, µε συγκέντρωση υψηλότερη από 20 ng/µl, η οποία αντιστοιχεί στο κύριο προϊόν PCR. 5. Εάν παρατηρηθούν πολλές ζώνες, βεβαιωθείτε ότι η ποιότητα του αρχικού δείγµατος µήτρας DNA ήταν επαρκής (βλ. Παράρτηµα Β Οδηγός αντιµετώπισης προβληµάτων). 6. Εάν δεν παρατηρηθεί κανένα προϊόν, βεβαιωθείτε ότι η ποιότητα του αρχικού δείγµατος µήτρας DNA ήταν επαρκής (βλ. Παράρτηµα Β Οδηγός αντιµετώπισης προβληµάτων). Εάν η ποιότητα είναι σύµφωνη µε τις προδιαγραφές, αυξήστε τον όγκο της µήτρας σε 4,0 µl ανά 50 µl αντίδρασης (µειώστε τον όγκο νερού ανά αντίδραση σε 31,0 µl). 7. Κανένα προϊόν PCR δεν θα πρέπει να είναι ορατό στο δείγµα µάρτυρα χωρίς µήτρα. Εάν είναι ορατά προϊόντα DNA µε αυτό τον µάρτυρα, είναι πιθανό να υπάρχει επιµόλυνση. Βλ. Παράρτηµα Β - Οδηγός αντιµετώπισης προβληµάτων. 8. Χαρακτηρίστε την αντίδραση PCR ως Ισχυρό προϊόν PCR ή Ασθενές προϊόν PCR. a. Το ισχυρό προϊόν PCR θα πρέπει να έχει µία µόνο ζώνη µεγαλύτερη από ή ίση µε 20 ng/µl. b. Το ασθενές προϊόν PCR θα πρέπει να έχει µία µόνο ζώνη µικρότερη από 20 ng/µl. c. Προχωρήστε στην πέψη µε SURVEYOR Nuclease, τόσο για το ισχυρό προϊόν PCR όσο και για το ασθενές προϊόν PCR. ΣΥΜΒΟΥΛΗ: σε αυτό το στάδιο τα προϊόντα PCR µπορούν να φυλαχθούν στους -20 ºC ή σε χαµηλότερη θερµοκρασία επί έως και µία εβδοµάδα. Οδηγίες χρήσης για το SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD για DHPLC Σελίδα 17

18 12 Οδηγίες βήµα προς βήµα 12.9 Πέψη µε SURVEYOR Nuclease 1. Αφού το δείγµα PCR κριθεί επαρκές ως προς την ποιότητα και την ποσότητά του, εκτελέστε την αντίδραση πέψης µε SURVEYOR Nuclease, όπως περιγράφεται παρακάτω. 2. Αφήστε τα σωληνάρια που περιέχουν τα διαλύµατα 0.15 M MgCl 2 Solution και SURVEYOR Enhancer Cofactor να αποψυχθούν στον πάγο. 3. Προσθέστε 10,0 µl από καθένα από τα παραπάνω δείγµατα που έχουν ενισχυθεί µε PCR σε ένα νέο σωληνάριο PCR των 0,2 ml ή σε πηγάδι πλάκας 96 πηγαδιών. 4. Παρασκευάστε ένα νέο µίγµα µε 0.15 M MgCl 2 Solution, SURVEYOR Enhancer Cofactor, SURVEYOR Enhancer W2 και SURVEYOR Nuclease W (µίγµα SURVEYOR Nuclease). Χρησιµοποιήστε τον παρακάτω πίνακα ως οδηγό για την παρασκευή του κύριου µίγµατος πέψης µε SURVEYOR Nuclease για την ανάλυση πολλαπλών δειγµάτων. Το παρακάτω παράδειγµα περιλαµβάνει τους όγκους για ένα κύριο µίγµα 10 δειγµάτων. Λάβετε υπόψη ότι θα χρειαστεί όγκος κύριου µίγµατος ελαφρώς µεγαλύτερος από εκείνον που προκύπτει µε αυτόν τον υπολογισµό, για την αντιµετώπιση τυχόν απωλειών κατά τη διάρκεια της µεταφοράς µε πιπέτα. Αριθµός αντιδράσεων πέψης µε SURVEYOR Nuclease: Υπολογισµός όγκου: 0.15 M MgCl 2 Solution (µl) 10,0 SURVEYOR Enhancer Cofactor (µl) 10,0 SURVEYOR Enhancer W2 (µl) 10,0 SURVEYOR Nuclease W (µl) 20,0 Συνολικός όγκος κύριου µίγµατος: 50,0 Προσθέστε 5 µl κύριου µίγµατος SURVEYOR Nuclease δείγµα που έχει ενισχυθεί µε PCR (µl) 10,0 Συνολικός όγκος αντίδρασης πέψης µε SURVEYOR Nuclease: 15,0 a. Φυγοκεντρήστε κάθε αντιδραστήριο πριν από τη χρήση. b. Πριν από τη µεταφορά µε πιπέτα, ανακινήστε ήπια το αντιδραστήριο σε αναδευτήρα τύπου vortex. Φυγοκεντρήστε σύντοµα για ~10 δευτερόλεπτα µετά από κάθε βήµα ανακίνησης σε αναδευτήρα τύπου vortex. c. Για κάθε πέψη, προσθέστε τα ακόλουθα συστατικά σε ένα σωληνάριο µικροφυγοκέντρησης PCR των 0,2 ml (ή µεγαλύτερο). 1,0 µl 0.15 M MgCl 2 Solution (κωδ. είδους ) 1,0 µl SURVEYOR Enhancer Cofactor (κωδ. είδους ) 1,0 µl SURVEYOR Enhancer W2 (κωδ. είδους ) 2,0 µl SURVEYOR Nuclease W (κωδ. είδους ) Ή προσθέστε 5 µl κύριου µίγµατος, όπως έχει παρασκευαστεί σύµφωνα µε τον παραπάνω πίνακα. 5. Ανακινήστε ήπια το κύριο µίγµα πέψης µε SURVEYOR Nuclease σε αναδευτήρα τύπου vortex για 10 δευτερόλεπτα, σε χαµηλή ταχύτητα. 6. Φυγοκεντρήστε το κύριο µίγµα πέψης µε SURVEYOR Nuclease για 10 δευτερόλεπτα, σε χαµηλή ταχύτητα. 7. Τοποθετήστε το κύριο µίγµα πέψης µε SURVEYOR Nuclease στον πάγο έως ότου το χρησιµοποιήσετε. Σηµείωση: Το κύριο µίγµα πέψης µε SURVEYOR Nuclease που παρασκευάστηκε στο βήµα 7 θα πρέπει να χρησιµοποιηθεί άµεσα, καθώς το ένζυµο SURVEYOR Nuclease W αδρανοποιείται µε την πάροδο του χρόνου, όταν είναι παρόντα τα υπόλοιπα συστατικά του κύριου µίγµατος πέψης µε SURVEYOR Nuclease. 10 Οδηγίες χρήσης για το SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD για DHPLC Σελίδα 18

19 12 Οδηγίες βήµα προς βήµα 8. Μεταφέρετε µε πιπέτα 5,0 µl κύριου µίγµατος πέψης µε SURVEYOR Nuclease σε κάθε σωληνάριο ή πηγάδι το οποίο περιέχει 10,0 µl προϊόντος που έχει ενισχυθεί µε PCR (βλ. παραπάνω, το βήµα 3). 9. Όταν ολοκληρωθεί η µεταφορά µε πιπέτα, φυγοκεντρήστε τα σωληνάρια PCR των 0,2 ml ή την πλάκα 96 πηγαδιών για 10 δευτερόλεπτα. 10. Ανακινήστε ήπια τα σωληνάρια δείγµατος PCR των 0,2 ml ή την πλάκα 96 πηγαδιών σε αναδευτήρα τύπου vortex, για 10 δευτερόλεπτα. 11. Φυγοκεντρήστε για 10 δευτερόλεπτα σε χαµηλή ταχύτητα (αυτό το βήµα είναι ιδιαιτέρως σηµαντικό, εάν η πέψη πραγµατοποιείται σε ένα όργανο χωρίς θερµαινόµενο καπάκι). 12. Επωάστε στους 42 C για 30 λεπτά. 13. Προσθέστε 1,0 µl SURVEYOR Stop Solution (κωδ. είδους ) σε κάθε σωληνάριο ή πηγάδι και ανακινήστε ήπια σε αναδευτήρα τύπου vortex (ο συνολικός όγκος αντίδρασης µε SURVEYOR Nuclease είναι 16,0 µl). ΣΥΜΒΟΥΛΗ: Τα προϊόντα πέψης SURVEYOR µπορούν να φυλαχθούν σε θερµοκρασία -20 ºC επί έως και µία εβδοµάδα. 14. Φορτώστε τις αντιδράσεις πέψης των δειγµάτων σε ένα σύστηµα DHPLC. Σηµείωση: Για τις προτεινόµενες ρυθµίσεις κλίσης συγκέντρωσης για την ανάλυση των αντιδράσεων πέψης µε SURVEYOR Nuclease στο σύστηµα DHPLC, επισκεφθείτε τη διαδικτυακή τοποθεσία 13 ιαδικασίες ελέγχου 13.1 Ποιοτικός έλεγχος του SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD Οι µάρτυρες πλασµιδιακού DNA συµπεριλαµβάνονται σε αυτό το κιτ για να χρησιµοποιηθούν σε ποιοτικούς έλεγχους, σε συγκεκριµένα βήµατα της διαδικασίας προσδιορισµού. Για το Πρωτόκολλο ενίσχυσης, αυτοί οι µάρτυρες παρέχουν ένα µέσο διασφάλισης ότι το κύριο µίγµα έχει παρασκευαστεί κατάλληλα και ότι η ενίσχυση πραγµατοποιείται σωστά. Επίσης, απαιτούνται µάρτυρες χωρίς µήτρα (στους οποίους προστίθεται νερό αντί για µήτρα DNA) για τον έλεγχο για πιθανή επιµόλυνση των συστατικών του κιτ από οποιαδήποτε ξένη µήτρα DNA. Στο στάδιο πέψης µε SURVEYOR Nuclease, το ενισχυµένο τµήµα από τον µάρτυρα πλασµιδιακού DNA παρέχει έναν αποτελεσµατικό έλεγχο που επιβεβαιώνει ότι οι συνθήκες αντίδρασης διάσπασης (συνθήκες παρασκευής και επώασης κύριου µίγµατος πέψης µε SURVEYOR Nuclease) ήταν ικανοποιητικές. Στο στάδιο της ανάλυσης, τα χρωµατογραφήµατα του συστήµατος DHPLC των ενισχυµένων τµηµάτων του µάρτυρα που έχουν υποβληθεί σε πέψη µε SURVEYOR Nuclease παρέχουν καθοδήγηση ως προς το πού θα εκλουστούν οι κορυφές των προϊόντων διάσπασης που αντιστοιχούν στη µετάλλαξη του εξωνίου 2 του KRAS, ακόµα και σε χαµηλά επίπεδα (βλ. Σχήµα 4). Οι κορυφές των προϊόντων διάσπασης που αντιστοιχούν σε άλλες µεταλλάξεις του εξωνίου 2 του KRAS µπορεί να εκλουστούν σε ελαφρώς διαφορετικές θέσεις. Αν τα ενισχυµένα τµήµατα PCR δεν αντιστοιχούν στα αποτελέσµατα που περιγράφονται στην ενότητα Ποιοτικός έλεγχος προϊόντων PCR, συµβουλευτείτε το Παράρτηµα Β - Οδηγός αντιµετώπισης προβληµάτων ή επικοινωνήστε µε το Τµήµα τεχνικής υποστήριξης της Transgenomic, προτού προχωρήσετε στα επόµενα βήµατα της ανάλυσης των δειγµάτων Χρήση µαρτύρων πλασµιδιακού DNA Το κιτ περιλαµβάνει δύο µάρτυρες DNA: KRAS Control Wild-Type, κωδ. είδους KRAS Positive Control Exon 2, κωδ. είδους Αυτοί οι µάρτυρες DNA είναι πλασµίδια µε ενθέσεις. Ο µάρτυρας Positive Control περιέχει δύο πλασµίδια: ένα µίγµα του KRAS Control Wild-Type και ενός µεταλλαγµένου κλώνου που διαφέρει από τον άγριο τύπο Wild-Type µόνο κατά ένα ζεύγος βάσεων. Οι µάρτυρες παρέχονται σε ξεχωριστά φιαλίδια, ο καθένας σε συγκέντρωση 10 5 αντίγραφα/µl. Οδηγίες χρήσης για το SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD για DHPLC Σελίδα 19

20 13 ιαδικασίες ελέγχου Οι εκκινητές PCR KRAS Exon 2 Forward και Reverse που απαιτούνται για την ενίσχυση µε PCR παρέχονται ξεχωριστά στο κιτ. Για τη χρήση αυτών των µαρτύρων, ακολουθήστε τις οδηγίες που παρατίθενται στις ενότητες Πρωτόκολλο ενίσχυσης, Πέψη µε SURVEYOR Nuclease και Ανάλυση του εξωνίου 2 του KRAS µε SURVEYOR Nuclease. ΣΥΝΙΣΤΟΥΜΕ Ι ΙΑΙΤΕΡΑ ΣΤΟΥΣ ΧΡΗΣΤΕΣ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝ ΤΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΓΙΑ ΠΡΩΤΗ ΦΟΡΑ ΝΑ ΙΕΝΕΡΓΗΣΟΥΝ ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΜΟΝΟ ΜΕ ΤΟΥΣ ΜΑΡΤΥΡΕΣ ΠΡΙΝ ΑΠΟ ΤΗΝ ΕΞΕΤΑΣΗ ΕΙΓΜΑΤΩΝ ΓΟΝΙ ΙΩΜΑΤΟΣ 14 Ερµηνεία των αποτελεσµάτων 14.1 Ανάλυση του εξωνίου 2 του KRAS µε SURVEYOR Nuclease Για λόγους σύγκρισης και ελέγχου, ΠΑΝΤΑ να εκτελείτε πέψη µε SURVEYOR Nuclease σε κάθε έναν από τους µάρτυρες (Wild-Type και Positive Controls), σε έναν µάρτυρα χωρίς µήτρα, καθώς και στα δείγµατα DNA και να χρησιµοποιείτε την ίδια πλάκα δειγµάτων του συστήµατος DHPLC. Στο στάδιο πέψης µε SURVEYOR Nuclease, τα ενισχυµένα τµήµατα από αυτούς τους µάρτυρες πλασµιδιακού DNA παρέχουν έναν αποτελεσµατικό έλεγχο που επιβεβαιώνει ότι οι συνθήκες αντίδρασης διάσπασης (συνθήκες παρασκευής και επώασης µίγµατος µε SURVEYOR Nuclease) ήταν ικανοποιητικές. Στο στάδιο της ανάλυσης, τα ίχνη, στο σύστηµα DHPLC, αυτών των µαρτύρων ενισχυµένων τµηµάτων που έχουν υποβληθεί σε πέψη µε SURVEYOR Nuclease παρέχουν καθοδήγηση ως προς το πού θα εκλουστούν τα θραύσµατα DNA που προέρχονται από τη διάσπαση σε αυτές τις συγκεκριµένες θέσεις µεταλλάξεων που προέρχονται από λανθασµένο ζευγάρωµα βάσεων, ακόµα και σε χαµηλά επίπεδα (βλ. Σχήµα 4). Εάν, είτε τα ενισχυµένα τµήµατα PCR είτε τα θραύσµατα διάσπασης µε SURVEYOR Nuclease που προέρχονται από τους µάρτυρες DNA δεν αντιστοιχούν στα αποτελέσµατα που περιγράφονται, συµβουλευτείτε το Παράρτηµα Β-Οδηγός αντιµετώπισης προβληµάτων ή επικοινωνήστε µε το Τµήµα τεχνικής υποστήριξης της Transgenomic, προτού προχωρήσετε στα επόµενα βήµατα της ανάλυσης των δειγµάτων. Τα παρακάτω παραδείγµατα παρέχονται αποκλειστικά για επεξηγηµατικούς σκοπούς και ΕΝ προορίζονται για χρήση στην ταυτοποίηση οποιασδήποτε συγκεκριµένης µετάλλαξης. Απαιτείται η επιβεβαίωση της ταυτότητας µίας µετάλλαξης για τον σαφή καθορισµό της ύπαρξης µίας συγκεκριµένης αλλαγής βάσης στο εξώνιο 2 του γονιδίου KRAS. Το ένζυµο SURVEYOR Nuclease διασπά όλα τα λανθασµένα ζευγαρώµατα βάσεων που προκύπτουν από σχηµατισµό ετερόδιπλων µορίων µεταξύ DNA άγριου τύπου και µεταλλαγµένου DNA και όχι απλά τις µεταλλάξεις στο εξώνιο 2. Το ένζυµο SURVEYOR Nuclease επιβεβαιώνει την ύπαρξη ενός λανθασµένου ζευγαρώµατος βάσεων. Εάν απαιτείται η ταυτότητα της συγκεκριµένης αλλαγής βάσης της µετάλλαξης προκειµένου να καθοριστεί εάν πρόκειται για µετάλλαξη ενεργοποίησης KRAS, πρέπει να επιβεβαιωθεί µε άλλη µέθοδο, όπως ο προσδιορισµός αλληλουχίας Επισκόπηση δεδοµένων των αποτελεσµάτων SURVEYOR Scan Επισκοπήστε τα χρωµατογραφήµατα και συγκρίνετε τα χρωµατογραφήµατα των µαρτύρων Wild- Type και Positive Controls µε εκείνα του δείγµατος. Καθορίστε εάν το χρωµατογράφηµα του δείγµατος είναι παρόµοιο µε το πρότυπο του άγριου τύπου Wild-Type ή διαφορετικό από αυτό. Εάν είναι διαφορετικό, τότε το δείγµα πρέπει να θεωρηθεί «θετικό για SURVEYOR Scan» και να αποσταλεί για ανάλυση αλληλουχίας DNA. Βλ. Σχήµα 4 για παραδείγµατα και Παράρτηµα B Οδηγός αντιµετώπισης προβληµάτων, Προβλήµατα 7 και 8, για παραδείγµατα τέτοιων δειγµάτων. Οποιοδήποτε δείγµα µε πρότυπο SURVEYOR Nuclease διαφορετικό από εκείνο του άγριου τύπου Wild-Type θα πρέπει να αποστέλλεται για επιβεβαίωση αλληλουχίας, ακόµη και αν δεν είναι πανοµοιότυπο µε τον µάρτυρα. Βλ. Παράρτηµα B Οδηγός αντιµετώπισης προβληµάτων, Πρόβληµα 7, για ένα παράδειγµα τέτοιου δείγµατος. Όταν απαιτείται, κάντε ζουµ στην περιοχή ενδιαφέροντος και επικαλύψτε το χρωµατογράφηµα του δείγµατος µε τον µάρτυρα Wild-Type για εκείνο το ενισχυµένο τµήµα. Σηµειώστε τυχόν διαφορές µεταξύ του µάρτυρα Wild-Type και του δείγµατος που αναλύθηκε. Οδηγίες χρήσης για το SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD για DHPLC Σελίδα 20

21 14 Ερµηνεία των αποτελεσµάτων Σηµαντικό! Μετά από ενδελεχή επισκόπηση κάθε δείγµατος, ο ελεγκτής των δεδοµένων θα πρέπει να εξετάσει κατά πόσον τα διπλανά δείγµατα στην πλάκα ανάλυσης έχουν τα ίδια θετικά αποτελέσµατα SURVEYOR Scan. Εάν προκύψουν τα ίδια θετικά αποτελέσµατα, τότε αυτό µπορεί να είναι οφείλεται στη διασταυρούµενη επιµόλυνση του δείγµατος ή του µάρτυρα και η ανάλυση πρέπει να επαναληφθεί Παραδείγµατα αποτελεσµάτων Στο παρακάτω Σχήµα 4, παρουσιάζονται παραδείγµατα αποτελεσµάτων που λαµβάνονται µε χρήση του κιτ SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD για DHPLC. Σε αυτά τα παραδείγµατα, χρησιµοποιώντας τα συστήµατα WAVE 4500 Systems τόσο µε ανιχνευτές υπεριώδους ακτινοβολίας όσο και µε ανιχνευτές φθορισµού, ακολουθήθηκε πιστά η διαδικασία που παρουσιάζεται στην ενότητα Οδηγίες βήµα προς βήµα. Για οδηγίες σχετικά µε τις προτεινόµενες ρυθµίσεις κλίσης συγκέντρωσης για την ανάλυση των αντιδράσεων πέψης µε SURVEYOR Nuclease στο σύστηµα DHPLC, επισκεφθείτε τη διαδικτυακή τοποθεσία Σχήµα 4A Ροή µέσω του DHPLC Η µετάλλαξη G12D παράγει θραύσµατα 74 και 116 bp Μάρτυρας KRAS Wild-Type Μάρτυρας KRAS Exon 2 Άκοπο είγµα 1, KRAS Exon 2 ενισχυµένο είγµα 2, KRAS Exon 2 τµήµα 200 είγµα bp 3, KRAS Exon 2 Πρότυπο προσδιορισµού µεγέθους DNA Άκοπο ενισχυµένο τµήµα 190 bp Πλύση στο DHPLC Σχήµα 4B Η µετάλλαξη G12D παράγει θραύσµατα 74 και 116 bp Μάρτυρας KRAS Wild-Type Μάρτυρας KRAS Exon 2 Άκοπο είγµα 1, KRAS Exon 2 ενισχυµένο είγµα 2, KRAS Exon 2 τµήµα 200 είγµα bp 3, KRAS Exon 2 Πρότυπο προσδιορισµού µεγέθους DNA Άκοπο ενισχυµένο τµήµα 190 bp Σχήµατα 4A και 4B: Ανάλυση WAVE DHPLC µε ανίχνευση, µε υπεριώδη ακτινοβολία (Σχήµα 4A) και µε φθορισµό (Σχήµα 4B), προϊόντων πέψης µε SURVEYOR Nuclease του µάρτυρα KRAS Positive Control Exon 2, του µάρτυρα KRAS Control Wild-Type και του DNA ορθοκολικού καρκίνου που έχει αποµονωθεί από τοµές FFPE. Όταν εξετάζετε οπτικά τα χρωµατογραφήµατα, τα δείγµατα που έχουν υποβληθεί σε πέψη θα πρέπει να συγκρίνονται µε τον µάρτυρα Wild-Type Control (καφέ γραµµή). Ο µάρτυρας KRAS Positive Control Exon 2 (µπλε Οδηγίες χρήσης για το SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD για DHPLC Σελίδα 21

22 14 Ερµηνεία των αποτελεσµάτων γραµµή) αποτελεί ένα µίγµα πλασµιδίου Wild-Type και πλασµιδίου µε τη µετάλλαξη G12D, το οποίο δηµιουργεί κορυφές πέψης 74 και 116 bp. Αυτός ο µάρτυρας υποδεικνύει ότι το βήµα πέψης µε SURVEYOR Nuclease έχει εκτελεστεί και υποδεικνύει την περιοχή του χρωµατογραφήµατος η οποία θα πρέπει να επιθεωρηθεί οπτικά, προκειµένου να καθοριστεί εάν ένα δείγµα θα πρέπει να αποσταλεί για ανάλυση αλληλουχίας DNA. Από τη σύγκριση των προτύπων πέψης για τα δείγµατα 1-3 µε το ηλεκτροφορογράφηµα του άκοπου µάρτυρα Wild-Type, είναι προφανές ότι τα δείγµατα 1 και 2 (κόκκινη και τιρκουάζ γραµµή) φέρουν πιθανές µεταλλάξεις και θα πρέπει να προσδιοριστεί η αλληλουχία τους προκειµένου να επιβεβαιωθεί η παρουσία ή η απουσία µιας µετάλλαξης στο αντίστοιχο κωδικόνιο. Το δείγµα 3 (πράσινη γραµµή) παρουσιάζει παρόµοια χρωµατογραφήµατα µε εκείνα που παρατηρούνται για τον µάρτυρα Wild-Type Control και δεν χρειάζεται να αποσταλεί για ανάλυση αλληλουχίας DNA. Πρέπει να σηµειωθεί ότι το αποτέλεσµα προσδιορισµού αλληλουχίας είναι το οριστικό αποτέλεσµα, καθώς µπορεί να υπάρχουν άλλες µη σχετικές µεταλλάξεις που µπορούν να οδηγήσουν στον σχηµατισµό των ίδιων µεγεθών θραυσµάτων. 15 Χαρακτηριστικά απόδοσης 15.1 Επίπεδο ανίχνευσης µεταλλάξεων µε τα κιτ SURVEYOR Scan Η επικύρωση των κιτ SURVEYOR Scan για τις πλατφόρµες DHPLC µε χρήση πλασµιδιακών κλώνων όλων των µεταλλάξεων που υποδεικνύονται έχει καταδείξει ότι µπορούν να ανιχνευθούν κορυφές SURVEYOR Nuclease σε ένα µίγµα 2-5% µεταλλαγµένου DNA, σε υπόβαθρο άγριου τύπου Wild-Type. Ο αυτοµατοποιηµένος προσδιορισµός αλληλουχίας και των δύο κλώνων, µε κατεύθυνση 5-3 και µε κατεύθυνση 3-5, συχνά αποτυγχάνει να ανιχνεύσει µεταλλάξεις σε επίπεδα χαµηλότερα από 10% σε µίγµατα µε DNA άγριου τύπου Wild-Type. Μαζί µε τα αποτελέσµατα SURVEYOR Nuclease είναι δυνατόν να ερµηνευθούν µε µεγαλύτερη ακρίβεια τα ηλεκτροφορογραφήµατα προσδιορισµού αλληλουχίας 5-10% µεταλλαγµένου DNA. Εάν µια ανάλυση δείγµατος καταδείξει ένα θετικό αποτέλεσµα SURVEYOR Scan, αλλά δεν υπάρχει καµία ανιχνεύσιµη µετάλλαξη KRAS ή NRAS µε τη χρήση προσδιορισµού αλληλουχίας DNA, συνιστάται να καταγράφεται ως αποτέλεσµα ότι «δεν ανιχνεύθηκε καµία παραλλαγή». Για περισσότερες λεπτοµέρειες, βλ. ενότητα «Ζητήµατα σχετικά µε τη ροή εργασίας» Επιβεβαίωση αλληλουχίας Προχωρήστε στην επιβεβαίωση αλληλουχίας για όλα τα θετικά αποτελέσµατα SURVEYOR Scan, προκειµένου να ταυτοποιήσετε την αλληλουχία των µεταλλάξεων του εξωνίου 2 του KRAS. Μην προχωρήσετε στην επιβεβαίωση µε προσδιορισµό αλληλουχίας, εάν το αποτέλεσµα της εξέτασης SURVEYOR Scan ήταν αρνητικό. Μπορεί να αναφερθεί ότι το δείγµα είναι Wild-Type ή ότι δεν ανιχνεύθηκε καµία παραλλαγή. Οι εκκινητές Universal Sequencing Primers που περιλαµβάνονται σε αυτό το κιτ προορίζονται για χρήση κατά την επιβεβαίωση αλληλουχίας. Ο κωδικός είδους για τον εκκινητή forward είναι F (Universal Sequencing Primer 1) και ο κωδικός είδους για τον εκκινητή reverse είναι R (Universal Sequencing Primer 2) Περιορισµοί της διαδικασίας προσδιορισµού Οι ουσίες επιµόλυνσης που µεταφέρθηκαν κατά την εκχύλιση δειγµάτων που έχουν µονιµοποιηθεί σε φορµόλη και εγκλειστεί σε παραφίνη µπορεί να προκαλέσουν παρεµπόδιση στις διαδικασίες ενίσχυσης µε PCR και πέψης µε SURVEYOR Nuclease. Οι διαδικασίες ποιοτικού ελέγχου που περιγράφονται στην ενότητα Ποιοτικός έλεγχος προϊόντων PCR θα διασφαλίσουν ότι το εκχυλισµένο DNA είναι κατάλληλο για χρήση µε αυτό το κιτ. Αυτό το κιτ έχει επικυρωθεί για την ανάλυση δειγµάτων όγκων ορθοκολικού καρκίνου που έχουν µονιµοποιηθεί σε φορµόλη και εγκλειστεί σε παραφίνη. εν έχει επικυρωθεί για διαγνωστική χρήση σε άλλους τύπους καρκίνου ή σε πρόσφατα ή κατεψυγµένα δείγµατα βιοψίας. Οδηγίες χρήσης για το SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD για DHPLC Σελίδα 22

23 15 Χαρακτηριστικά απόδοσης Για την αντιµετώπιση µη συνηθισµένων αποτελεσµάτων και λεπτοµέρειες για παράγοντες που µπορούν να επηρεάσουν αυτό τον προσδιορισµό, ανατρέξτε παρακάτω, στο Παράρτηµα Β - Οδηγός αντιµετώπισης προβληµάτων. Πρέπει να είστε προσεκτικοί για την αποφυγή επιµόλυνσης εκ µεταφοράς και διασταυρούµενης επιµόλυνσης µε αυτό το κιτ. Η εξαιρετικά υψηλή ευαισθησία της µεθόδου του προσδιορισµού απαιτεί τη λήψη προφυλάξεων στα ακόλουθα σηµεία: Βεβαιωθείτε ότι ο χειρισµός όλων των δειγµάτων πραγµατοποιείται µε τρόπο ώστε να µην µπορεί να συµβεί διασταυρούµενη επιµόλυνση µεταξύ των δειγµάτων. Εργαστείτε σε έναν σταθµό εργασίας PCR ή σε κάποιον άλλο κατάλληλο χώρο εργασίας που µπορεί να εκτεθεί σε υπεριώδη ακτινοβολία πριν από την προετοιµασία των αντιδράσεων ενίσχυσης µε PCR. Χρησιµοποιήστε έναν ξεχωριστό σταθµό εργασίας PCR ή δωµάτιο για το άνοιγµα των δειγµάτων µετά την ενίσχυση µε PCR για τον ποιοτικό έλεγχο µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα. Η προετοιµασία της πέψης µε SURVEYOR Nuclease θα πρέπει να γίνει σε ξεχωριστό δωµάτιο ή σε έναν ξεχωριστό σταθµό εργασίας PCR από τον χώρο στον οποίο προετοιµάστηκε η αρχική αντίδραση PCR. Βεβαιωθείτε ότι ο χειρισµός των πλασµιδιακών µαρτύρων του κιτ γίνεται ξεχωριστά από τα εξεταζόµενα δείγµατα σε όλα τα στάδια του προσδιορισµού. o o o Πριν από το άνοιγµα των σωληναρίων που περιέχουν τον µάρτυρα πλασµιδιακού DNA, βεβαιωθείτε ότι όλα τα διαλύµατα, καθώς και το πηγάδι µε τον µάρτυρα χωρίς µήτρα και τα πηγάδια µε τα δείγµατα DNA είναι πωµατισµένα. ΧΕΙΡΙΣΤΕΙΤΕ ΤΟΥΣ ΜΑΡΤΥΡΕΣ ΤΕΛΕΥΤΑΙΟΥΣ. Προσθέστε τον µάρτυρα πλασµιδιακού DNA στα κατάλληλα σωληνάρια, αφού πρώτα βεβαιωθείτε ότι έχουν πωµατιστεί ΟΛΑ τα πηγάδια µε τον µάρτυρα χωρίς µήτρα και µε τα δείγµατα. Αφού πωµατίσετε τα σωληνάρια µε τον µάρτυρα DNA, σκουπίστε ΟΛΑ τα σωληνάρια και τα πώµατα µε έναν παράγοντα που καταστρέφει το DNA (όπως λευκαντικό µέσο 10%) προτού τα µεταφέρετε σε άλλο χώρο. Βεβαιωθείτε ότι όταν µεταφέρετε µε πιπέτα τα δείγµατα στις πλάκες 96 πηγαδιών, δεν επιµολύνετε τα διπλανά πηγάδια, είτε λόγω εκτίναξης υγρού κατά την ανάµιξη είτε λόγω µη αλλαγής των ρυγχών των πιπετών. Οδηγίες χρήσης για το SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD για DHPLC Σελίδα 23

24 Παράρτηµα A Παράρτηµα A A.1 Σχέδιο διάταξης πλάκας για τα κιτ SURVEYOR Scan Το σχέδιο διάταξης πλάκας που προτείνεται παρακάτω προορίζεται για την πραγµατοποίηση της ανάλυσης SURVEYOR Scan και για τα επτά εξώνια των KRAS και NRAS σε 10 δείγµατα ταυτόχρονα. Υπόµνηµα: Ex = Exon, WT = Wild-Type, Mut = Μετάλλαξη, NTC = Μάρτυρας χωρίς µήτρα. A.2 Σφραγίδες DNA µάρτυρα Παρακάτω παρέχονται οι αλληλουχίες µε «σφραγίδα». Υπόµνηµα: Οι πιο συχνά µεταλλαγµένες περιοχές επισηµαίνονται µε µωβ χρώµα. Η αλληλουχία µε ΚΕΦΑΛΑΙΑ γράµµατα είναι οι κωδικές βάσεις. Η αλληλουχία µε µικρά γράµµατα είναι µη κωδικές βάσεις. Οι µάρτυρες έχουν γενετική «σφραγίδα», η οποία επισηµαίνεται µε κίτρινο χρώµα. Αυτή η παραλλαγή σε σχέση µε την αλληλουχία KRAS Wild-Type, σε µια περιοχή στην οποία δεν αναµένεται να υπάρχουν µεταλλάξεις, µπορεί να χρησιµοποιηθεί για την αντιµετώπιση προβληµάτων επιµόλυνσης δείγµατος από τους θετικούς µάρτυρες Positive Controls. Βλ. Παράρτηµα Β - Οδηγός αντιµετώπισης προβληµάτων, Πρόβληµα 8, για ένα παράδειγµα ανίχνευσης τέτοιου είδους επιµόλυνσης µε το SURVEYOR Scan. «Σφραγίδα» KRAS Exon 2 Μέγεθος ενισχυµένου τµήµατος: 190 bp. Για τη δηµιουργία της γενετικής σφραγίδας του πλασµιδιακού µάρτυρα του KRAS Exon 2, η αλληλουχία TAT έχει αλλάξει σε ATA. Επίσης, τα κωδικόνια 12 και 13 επισηµαίνονται παρακάτω. GCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGAC GAAATAGAT Οδηγίες χρήσης για το SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD για DHPLC Σελίδα 24

25 Παράρτηµα A A.3 Απαιτήσεις του συστήµατος αποδιατακτικής HPLC (DHPLC) A.3.1 Προδιαγραφές DHPLC για εφαρµογές SURVEYOR Scan Οι παρακάτω προδιαγραφές αποτελούν τις ελάχιστες απαιτήσεις για τη διενέργεια των προσδιορισµών του κιτ SURVEYOR Scan KRAS και NRAS στο σύστηµα DHPLC. Σύστηµα χορήγησης διαλύτη κλίσης υψηλής απόδοσης υνατότητα διπλής κλίσης, υψηλή πίεση ή χαµηλή πίεση Μάρτυρας παροχής, ελάχιστο εύρος: 0,7 1,6 ml/min Ακρίβεια παροχής: ± 2% (H 2 O σε θερµοκρασία 20 ºC) Απαερωτής διαλύτη Αυτόµατος δειγµατολήπτης Ελεγχόµενη θερµοκρασία για την ψύξη των πλακών, ρυθµιζόµενη θερµοκρασία: 4 έως 14 ºC Όγκος έγχυσης: 5 50 µl Κασέτα διαχωρισµού Σχεδιασµένη για διαχωρισµό θραυσµάτων δίκλωνου DNA (dsdna) µε βάση το µέγεθος, µεγέθη θραυσµάτων 50 bp έως 250 bp Κλίβανος ελεγχόµενης θερµοκρασίας, υψηλής πιστότητας Εύρος θερµοκρασίας: 40 έως 70 ºC Πιστότητα θερµοκρασίας: ± 0,2 ºC Αναπαραγωγιµότητα θερµοκρασίας: ± 0,2 ºC Γραµµικότητα στο πλήρες εύρος θερµοκρασίας: ± 2,0 ºC Εναλλακτική επιλογή ανίχνευσης 1 Ανιχνευτής υπεριώδους/ορατού φωτός Εύρος µήκους κύµατος: nm Πηγή υπεριώδους ακτινοβολίας: Λυχνία δευτερίου Εναλλακτική επιλογή ανίχνευσης 2 Ανιχνευτής φθορισµού Εύρος µήκους κύµατος: διέγερση: nm, εκποµπή: nm Πηγή φθορισµού: Λυχνία ξένου 150 W Αντλία φθορίζουσας χρωστικής Σταθερή παροχή σε 0,1 ml/min 20%/+50% Χαµηλή πάλµωση ροής A.3.2 Λειτουργία του συστήµατος Για την προετοιµασία και τη λειτουργία του συστήµατος DHPLC, συµβουλευτείτε και ακολουθήστε τις συστάσεις του κατασκευαστή για την ανάλυση των θραυσµάτων dsdna µε εύρος µεγεθών 50 bp έως 250 bp, αποσκοπώντας σε διακριτική ικανότητα µεγέθους 10 bp ή µεγαλύτερη. Αυτό είναι το εύρος µεγεθών για θραύσµατα µετά από πέψη µε SURVEYOR Nuclease, µε τη χρήση αυτού του κιτ. Για οδηγίες σχετικά µε τις προτεινόµενες ρυθµίσεις κλίσης συγκέντρωσης για την ανάλυση των αντιδράσεων πέψης µε SURVEYOR Nuclease στο σύστηµα DHPLC, επισκεφθείτε τη διαδικτυακή τοποθεσία A.3.3 Συντήρηση των κασετών DHPLC Για τη συντήρηση των κασετών DHPLC, ακολουθήστε τις συστάσεις του κατασκευαστή. Σηµείωση: η ανάλυση των αντιδράσεων µε SURVEYOR Nuclease απαιτεί πρωτόκολλα συχνότερου και αυστηρότερου καθαρισµού σε σύγκριση µε εκείνα που εφαρµόζονται για την τυπική ανάλυση δειγµάτων PCR. Για περισσότερες λεπτοµέρειες, συµβουλευτείτε τις κατευθυντήριες οδηγίες του συστήµατος DHPLC. Οδηγίες χρήσης για το SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD για DHPLC Σελίδα 25

26 Παράρτηµα A A.4 ιάταξη εργαστηρίου για τους προσδιορισµούς PCR Για την παραγωγή αξιόπιστων αποτελεσµάτων PCR, χωρίς επιµόλυνση, ακολουθήστε την ορθή εργαστηριακή πρακτική κατά τον σχεδιασµό της εργαστηριακής διάταξης PCR. Όταν σχεδιάζετε τη διευθέτηση του εργαστηρίου, λάβετε υπόψη την ανάγκη για διαχωρισµό του χώρου στον οποίο πραγµατοποιούνται οι διαδικασίες προετοιµασίας της ενίσχυσης µε PCR και οι διαδικασίες µετά την ενίσχυση. Είναι σηµαντικό να διαχωρίσετε (i) τη διαδικασία αποµόνωσης του DNA, (ii) τη διαδικασία ενίσχυσης µε PCR και (iii) τις διαδικασίες µετά την αντίδραση PCR, όπως το άνοιγµα σωληναρίων που περιέχουν ενισχυµένα δείγµατα κατά την προετοιµασία της ανάλυσης σε πηκτώµατα και την προετοιµασία άλλων προσδιορισµών, π.χ. πέψεις µε SURVEYOR Nuclease και προσδιορισµός αλληλουχίας DNA. Επίσης, είναι σηµαντικό να διαθέτετε εργαστηριακά αναλώσιµα και εξοπλισµό αποκλειστικά για κάθε περιοχή, τα οποία θα χρησιµοποιούνται µόνο σε εκείνη την περιοχή. Το καθάρισµα των επιφανειών µε διάλυµα λευκαντικού µέσου 10% (v/v), το οποίο προετοιµάζεται µία φορά την εβδοµάδα, θα υποβοηθήσει την εξάλειψη θραυσµάτων DNA 500 bp που θα µπορούσαν να αποτελέσουν µήτρες της αντίδρασης PCR. Επίσης, µπορεί να είναι χρήσιµο να υποβάλλετε τα πλαστικά υλικά και τα διαλύµατα σε έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία βραχέος µήκους κύµατος για 7 10 λεπτά, χρησιµοποιώντας έναν θάλαµο δηµιουργίας διασταυρούµενων δεσµών µε υπεριώδη ακτινοβολία (UV crosslinker). Σηµείωση: τα ένζυµα και το DNA που πρόκειται να ενισχυθεί δεν θα πρέπει να εκτίθενται σε υπεριώδη ακτινοβολία. Μπορείτε να συµβάλλετε σηµαντικά στη µείωση της επιµόλυνσης φορώντας κατάλληλο προστατευτικό ρουχισµό, αλλάζοντας συχνά γάντια και σκουπίζοντας τα γάντια σας, ενώ τα φοράτε στα χέρια σας, µε διάλυµα λευκαντικού µέσου 10% (v/v) προτού εισέλθετε στον σταθµό εργασίας. Θα πρέπει να υπάρχει τουλάχιστον µια διάταξη παρόµοια µε τη διευθέτηση σε δύο δωµάτια που παρουσιάζεται στο παρακάτω διάγραµµα και η οποία έχει σχεδιαστεί ειδικά για PCR, καθώς και για ανάλυση µε χρήση SURVEYOR Nuclease. 1 Θάλαµος δηµιουργίας διασταυρούµενων δεσµών µε υπεριώδη ακτινοβολία Οδηγίες χρήσης για το SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD για DHPLC Σελίδα 26

27 Παράρτηµα A A.5 Βιβλιογραφικές αναφορές 1. Amgen News Release (2013) New analyses identify predictive biomarkers for Vectibix (panitumumab) in patients with metastatic colorectal cancer Peeters M et al (2013) Massively parallel tumor multigene sequencing to evaluate response to panitumumab in a randomized phase III study of metastatic colorectal cancer. Clin Cancer Res De Roock W et al (2010) Association of KRAS p.g13d mutation with outcome in patients with chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. JAMA Peeters M et al (2013) Mutant KRAS codon 12 and 13 alleles in patients with metastatic colorectal cancer: assessment as prognostic and predictive biomarkers of response to panitumumab. J Clin Oncol Andre T et al (2013) Panitumumab combined with irinotecan for patients with KRAS wildtype metastatic colorectal cancer refractory to standard chemotherapy: a GERCOR efficacy, tolerance, and translational molecular study. Ann Oncol Loupakis F et al (2009) KRAS codon 61, 146 and BRAF mutations predict resistance to cetuximab plus irinotecan in KRAS codon 12 and 13 wild-type metastatic colorectal cancer. Br J Cancer De Roock W et al (2010) Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer: a retrospective consortium analysis. Lancet Oncol Qiu P et al (2004) Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques Kuang Y et al (2009) Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res Mitani N et al (2007) Surveyor nuclease-based detection of p53 gene mutations in haematological malignancy. Ann. Clin. Biochem Engelman JA et al (2006) Allelic dilution obscures detection of a biologically significant resistance mutation in EGFR-amplified lung cancer. J. Clin. Invest Επισκεφθείτε επίσης τη διαδικτυακή τοποθεσία για βιβλιογραφικές αναφορές σχετικά µε το ένζυµο SURVEYOR Nuclease και τις εφαρµογές του. Οδηγίες χρήσης για το SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD για DHPLC Σελίδα 27

28 Παράρτηµα B Παράρτηµα B Οδηγός αντιµετώπισης προβληµάτων Η αποτελεσµατική χρήση των κιτ SURVEYOR Scan για το σύστηµα DHPLC εξαρτάται από την επιτυχή ολοκλήρωση ενός αριθµού βηµάτων. Ένα από τα πιο σηµαντικά βήµατα είναι η ενίσχυση µε PCR που πρέπει να έχει ως αποτέλεσµα την παραγωγή ειδικών τµηµάτων DNA οµοιόµορφου µεγέθους, σε επαρκή ποσότητα, έτσι ώστε να ανιχνεύονται µετά από υβριδισµό και διάσπαση. Αυτό, µε τη σειρά του, εξαρτάται από την ποιότητα του αρχικού δείγµατος. εν συνιστάται η διενέργεια του προσδιορισµού µε DNA που δεν πληροί τα κριτήρια ποιότητας και ποσότητας. Σηµείωση: Εάν χρησιµοποιείτε το SURVEYOR Nuclease για πρώτη φορά, πραγµατοποιήστε τα πειράµατα που αναφέρονται στην ενότητα Χρήση των µαρτύρων πλασµιδιακού DNA, αφού πρώτα διαβάσετε και κατανοήσετε την ενότητα Οδηγίες βήµα προς βήµα. Πρέπει να έχετε πρόχειρα τα αποτελέσµατα των µαρτύρων πλασµιδιακού DNA προτού επικοινωνήσετε µε το τµήµα τεχνικής υποστήριξης της Transgenomic. Αυτός ο οδηγός αντιµετώπισης προβληµάτων περιλαµβάνει έναν κατάλογο ζητηµάτων τα οποία µπορεί να αντιµετωπίσετε όταν χρησιµοποιείτε τα κιτ SURVEYOR Scan για το σύστηµα DHPLC, καθώς και προτάσεις σχετικά µε την αντιµετώπισή τους. Συµβουλευτείτε το εγχειρίδιο οργάνου του συστήµατος DHPLC για λεπτοµερείς πληροφορίες σχετικά µε τη λειτουργία και τη συντήρηση του οργάνου. Το εγχειρίδιο περιλαµβάνει συγκεκριµένες διαδικασίες για τον έλεγχο και τη διατήρηση της απόδοσης των στηλών, καθώς και λεπτοµέρειες για την αντιµετώπιση προβληµάτων. Πρόβληµα 1 Μικρή ποσότητα προϊόντος PCR ή καθόλου προϊόν PCR κατά την ανάλυση σε πήκτωµα αγαρόζης Μικρή ποσότητα προϊόντος PCR Καλή ποσότητα προϊόντος PCR Μικρή ποσότητα προϊόντος PCR Ζώνη RNA ΠΙΘΑΝΗ ΑΙΤΙΑ Κακή ποιότητα µήτρας DNA Πάρα πολύ RNA στο δείγµα, το οποίο θα προκαλέσει την υπερεκτίµηση της συγκέντρωσης του DNA Ο θερµικός κυκλοποιητής δεν έχει βαθµονοµηθεί εν υπάρχει αρκετή ποσότητα µήτρας ΕΠΙΛΥΣΗ Επαναλάβετε τον καθαρισµό του DNA, επανεξετάστε τη µέθοδο καθαρισµού που χρησιµοποιήθηκε. Εάν το DNA που έχει εκχυλιστεί από ιστό FFPE είναι πολύ κατακερµατισµένο, µπορεί να χρειαστούν εναλλακτικά τεµάχια FFPE. Επαναλάβετε την επεξεργασία µε RNάση του δείγµατος DNA και καθαρίστε εκ νέου το DNA Βαθµονοµήστε τον θερµικό κυκλοποιητή. Αυξήστε την ποσότητα της µήτρας. Σηµείωση: Θα πρέπει να χρησιµοποιηθεί DNA υψηλής ποιότητας από ιστό FFPE. Το δείγµα DNA θα πρέπει να έχει συγκέντρωση 25 ng/µl, όπως καθορίζεται από την απορρόφηση στα 260 nm, να έχει λόγο απορρόφησης στα 260/280 nm µεγαλύτερη από 1,8 και η περιεκτικότητά του σε DNA να είναι µεγαλύτερη από 90% (δηλαδή, να µην έχει επιµόλυνση από το µεγαλύτερο µέρος trna και rrna, όπως αυτό κρίνεται από την εµφάνιση σε πήκτωµα αγαρόζης). Φυλάσσετε τα δείγµατα DNA σε θερµοκρασία µεταξύ -20 C και -80 C. Η ανάλυση µήτρας DNA που έχει εκχυλιστεί από ιστό εγκλεισµένο σε παραφίνη απαιτεί τη λήψη Οδηγίες χρήσης για το SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD για DHPLC Σελίδα 28