Ο ρόλος της Οργανικής Χημείας στην Ανάπτυξη νέων Φαρμάκων

Transcript

1 ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΕΚΠΑΙΔΕΥΤΙΚΟ ΙΔΡΥΜΑ ΚΑΒΑΛΑΣ ΤΜΗΜΑ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΠΕΤΡΕΛΑΙΟΥ & ΦΥΣΙΚΟΥ ΑΕΡΙΟΥ Ο ρόλος της Οργανικής Χημείας στην Ανάπτυξη νέων Φαρμάκων Πτυχιακή Εργασία Επιβλέπουσα Καθηγήτρια : Μητκίδου Σοφία Παλιούρα Καλλιόπη Φοιτήτρια του Τμήματος Τεχνολογίας Πετρελαίου & Φυσικού Αερίου του Τ.Ε.Ι. Καβάλας Καβάλα,

2 Περιεχόμενα Πρόλογος 4 1. Εισαγωγή Αναδρομή στην Ιστορία των Φαρμάκων Από τα βάθη των αιώνων Αρχαία Ελλάδα Ιστορική αναδρομή από την Αναγέννηση μέχρι σήμερα Η ανακάλυψη της Πενικιλίνης Η ανακάλυψη της Ασπιρίνης Η σύνθεση του σαλικυλικού και του ακετυλοσαλικυλικού οξέος Συνδυαστική και Υπολογιστική Χημεία Combinatorial Chemistry Eισαγωγή Χημειοπληροφορική Cheminformatics Υπολογιστική Χημεία Μοριακός δεσμός με τη βοήθεια υπολογιστή Ποσοτική σχέση Δομής Δράσης (QSAR) στο σχεδιασμό Φαρμάκων Διαχείριση Πληροφορίας Κατασκευή Χημικών Βιβλιοθηκών Εξέλιξη των Φαρμάκων Η Φαρμακευτική Έρευνα μέχρι το Διαδικασίες έρευνας και ανάπτυξης νέων φαρμάκων Στόχος της δραστικής ουσίας Προσυμπτωματικός έλεγχος και σχεδιασμός (screening and desing) Προκλινικές δοκιμές Κλινικές δοκιμές Η Φαρμακευτική Βιομηχανία Από την Ασπιρίνη στα έξυπνα Φάρμακα Η Φαρμακευτική βιομηχανία στην Ελλάδα Ο λογικός σχεδιασμός Φαρμάκων Ιματινίβη: Η δραστική ουσία του φαρμάκου Glivec ή Gleevec Σύγχρονος σχεδιασμός φαρμάκων και κρυσταλογραφία πρωτεϊνών Η περίπτωση των αναστολέων της νευραμινιδάσης Σύνθεση και εφαρμογές Ταξόλης Φυσικά προϊόντα ως αντικαρκινικές ουσίες Ιστορική αναδρομή Η ανακάλυψη της ταξόλης Μηχανισμός δράσης της ταξόλης Κλινικές έρευνες. Περιβαλλοντικά και πολιτικά προβλήματα. Εμπορική εκμετάλλευση Αντιρρήσεις Ημισυνθετική οδός παρασκευής ταξόλης και νέες φυσικές πηγές

3 5.4.1 Κρισιμότητα των επιμέρους ομάδων του μορίου Ολικές συνθέσεις της ταξόλης Σύνθεση κατά Holton Σύνθεση κατά Nicolaou Σύνθεση κατά Danishefsky Παραγωγή της ταξόξης από BMS μέσω φυτικών κυττάρων Κλινικές εφαρμογές Χορήγηση Αντικαρκινικά φάρμακα παρόμοιας δράσης Ταξάνια Αντιικά Φάρμακα Σύνθεση και Εφαρμογές Φωσφορικής Οσελταμιβίρης (Tamiflu) Γενικά για τους Ιούς Ιοί γρίπης Μετάλλαξη των ιών γρίπης Αντιικά Φάρμακα Τα αντιικά φάρμακα Relenza και Tamiflu Nευραμινιδάσεις Σύνθεση της οσελταμιβίρης Τυπική σύνθεση Tamiflu Άλλες μέθοδοι παρασκευής Το αντιικό φάρμακο Tamiflu για τις πανδημίες της γρίπης Αντιική δράση και κλινική χρήση του Tamiflu Aνάπτυξη ανθεκτικότητας του ιού Η1Ν1 προς το Tamiflu 77 Bιβλιογραφία 78 Ευχαριστίες 79 3

4 Πρόλογος Η κοινωνία μας βρίσκεται αντιμέτωπη με πολλές προκλήσεις που μπορούν να βρουν απαντήσεις στις σύγχρονες εφαρμογές της Χημείας. Παραδείγματα τέτοιων προκλήσεων αποτελούν η ανάπτυξη αντίστασης στα φάρμακα από τους μικροοργανισμούς, νέες ασθένειες όπως το AIDS, η μεγάλη έξαρση των διάφορων μορφών καρκίνου κ.λ.π. Προς το παρόν τα περισσότερα φάρμακα που υπάρχουν στην αγορά έχουν σχεδιαστεί με κλασικές μεθόδους που βασίζονται σε συνεχείς δοκιμές και καμιά φορά σε εμπειρικές γνώσεις. Οι κλασικές μέθοδοι έχουν αποδειχθεί πλήρως ικανοποιητικές στο παρελθόν, αλλά οι νέες εξελίξεις στη βιολογία μοιραία θα καταστήσουν ένα μέρος αυτών παρωχημένο. Παραδείγματος χάριν, όταν δεν γνωρίζουμε τι ακριβώς προκαλεί μία ασθένεια, έχει νόημα να δοκιμάσουμε χιλιάδες μόρια για να εντοπίσουμε εκείνο που κατευνάζει τα συμπτώματά της. Τώρα όμως που βιώνουμε τη μετά την αποκωδικοποίηση του ανθρωπίνου γονιδιώματος εποχή, όπου τεράστια δεδομένα παράγονται καθημερινά, και βαθμηδόν αρχίζουμε να ανακαλύπτουμε τη μοριακή και γενετική βάση ασθενειών, ο σχεδιασμός φαρμάκων δεν θα μπορούσε να παραμείνει ανεπηρέαστος - και δεν έχει παραμείνει. Τα πρώτα φάρμακα που σχεδιάστηκαν με γνώμονα τη δομή του μορίου του κυττάρου με το οποίο επρόκειτο να σχετιστούν για να αποτραπεί η παθογένεια κυκλοφορούν ήδη στην αγορά. «Ο ορθολογικός σχεδιασμός φαρμάκων επί τη βάσει της μοριακής δομής των στόχων αυτών των φαρμάκων είναι ένα ερευνητικό πεδίο με τεράστιες δυνατότητες. Είναι γεγονός ότι προς το παρόν στην πλειονότητά τους οι φαρμακευτικές ουσίες έχουν σχεδιαστεί με άλλες μεθόδους. Ωστόσο, καθώς οι γνώσεις μας αυξάνονται, είναι μοιραίο να υπάρχουν όλο και περισσότερα φάρμακα που θα προκύπτουν από τη μελέτη της τρισδιάστατης δομής των κυτταρικών συστατικών που ευθύνονται για την παθογένεια» αναφέρει η βρετανίδα επιστήμων, Λουίζ Τζόνσον, καθηγήτρια Μοριακής Βιοφυσικής στο Πανεπιστήμιο της Οξφόρδης. 4

5 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή Φάρμακο γενικά ονομάζεται κάθε χημική ουσία ικανή να επηρεάσει την λειτουργία κάθε εμβίου όντος ή μικροοργανισμού όταν εισέρθει σε αυτόν. Απλούστερα χαρακτηρίζεται κάθε ουσία ή παρασκεύασμα που ανακουφίζει, είτε θεραπεύει, από ασθένειες ή πόνους του ανθρώπινου οργανισμού και γενικότερα αποκαθιστά την ανθρώπινη υγεία. Σύμφωνα με τον ορισμό του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (WHO) φάρμακο χαρακτηρίζεται: «Κάθε ουσία ή μίγμα ουσιών, που παράγεται, προσφέρεται προς πώληση, ή παρουσιάζεται για χρήση...στη διάγνωση, στη θεραπεία, στον μετριασμό ή στην πρόληψη νόσου, μη φυσιολογικής φυσικής κατάστασης, ή των συμπτωμάτων τους στον άνθρωπο ή στα ζώα καθώς και για χρήση...στην αποκατάσταση, την διόρθωση, ή την μεταβολή οργανικών λειτουργιών στον άνθρωπο ή τα ζώα». Εκ του παραπάνω ορισμού δίνεται βαρύτητα στη παρασκευή της ουσίας και όχι εκείνης που υφίσταται αυτούσια στη φύση, όπως π.χ. τα βότανα. Επίσης ο ορισμός αφορά ουσίες για χρήση σε ανθρώπους και ζώα και όχι για φυτά που αφορούν τελείως άλλη ειδική κατηγορία της Βοτανικής, τα φυτοφάρμακα. Ταξινόμηση φαρμάκων Η ταξινόμηση γενικά των διαφόρων φαρμακευτικών προϊόντων ακολουθεί τέσσερις συνήθως κύριες μεθόδους, 1. Χημική: δηλαδή από την χημική ομάδα στην οποία μπορεί αυτά να ανήκουν, π.χ. αλκαλοειδή. 5

6 2. Φαρμακολογική: εκ της φαρμακολογικής τους δράσης, π.χ. αναλγητικά, σπασμολυτικά, αντιμικροβιακά, αναισθητικά, κ.λπ. 3. Θεραπευτική: εκ της θεραπευτικής τους δράσης, π.χ. αντικαταθλιπτικά, ανθελονοσιακά, αγχολυτικά κ.λπ. 4. Σύνθετη: εκ της παθήσεως του λειτουργικού συστήματος ή οργάνου για το οποίο χορηγούνται και του επιδιωκόμενου σκοπού π.χ. αντισηπτικά, αντιχολινεργικά, καθαρκτικά, αποχρεμπτικά, βλεννολυτικά κ.λπ. 5. Δευτερευόντως: εκ της μορφής διάθεσής τους προς χρήση ανάλογα της ηλικίας και των δυνατοτήτων του λήπτη, π.χ. δισκία, σκόνη, ταμπλέτες, σταγόνες, υπόθετα, ενέσιμα, οροί, εμβόλια κ.λπ.. Σημειώνεται ότι η φαρμακολογική ταξινόμηση και η θεραπευτική ταξινόμηση των φαρμάκων διαφέρουν σημαντικά μεταξύ τους, με δεδομένο ότι κάποια φάρμακα με διαφορετικό μηχανισμό δράσης μπορεί να παρουσιάσουν ίδιο θεραπευτικό αποτέλεσμα. Στην Ελλάδα η ταξινόμηση των φαρμακευτικών προϊόντων όπως προσδιορίζεται από τον ΕΟΦ γίνεται με βάση τις παθήσεις των συστημάτων και οργάνων δια των οποίων χορηγούνται αλλά και της δράσης αυτών. Ο σύνθετος αυτός τρόπος ταξινόμησης είναι προσαρμοσμένος με εκείνον της ευρωπαϊκής φαρμακοποιίας και του Π.Ο.Υ. (WHO). Τα φάρμακα κατατάσσονται σε κατηγορίες ανάλογα με τη δραστικότητά τους και το όργανο του σώματος το οποίο επηρεάζουν: καρδιοτονωτικά, υπνωτικά, ναρκωτικά, καθαρτικά, διουρητικά, αντιπυρετικά, παυσίπονα, αναισθησιογόνα και άλλα. Φυσικά η κατάταξη αυτή δεν είναι πραγματική, αφού είναι γνωστό ότι ένα φάρμακο επιδρά όχι μόνο στο συγκεκριμένο όργανο που χρειάζεται θεραπεία, αλλά επηρεάζει ολόκληρο τον οργανισμό. Ειδική κατηγορία φαρμάκων αποτελούν οι ουσίες που επενεργούν άμεσα πάνω στα αίτια που προκαλούν τις ασθένειες: αντισυφιλιδικά, αντιφυματικά κ.ά. Ιδιαίτερα σημαντική για τη θεραπευτική αποτελεσματικότητα ενός φαρμάκου είναι η δόση που χορηγείται και που σχετίζεται όχι μόνο με τη δραστικότητά του αλλά και με την ευαισθησία του θεραπευομένου και τις αντιδράσεις του οργανισμού το+υ στο φάρμακο. Σε περίπτωση υπερβολικής δόσης φαρμάκου είναι πιθανή ακόμα και μία δηλητηρίαση, γι' αυτό απαιτείται προσοχή στη δοσολογία των φαρμάκων πριν από τη χρήση τους. Στο φαρμακευτικό κώδικα μάλιστα καθορίζονται οι ημερήσιες δόσεις των περισσότερων φαρμάκων. Τα φάρμακα, ανάλογα με τον τρόπο που χρησιμοποιούνται, διακρίνονται σε εξωτερικά (χρησιμοποιούνται στο δέρμα, πάνω σε εκζέματα, πληγές κ.ά.), εσωτερικά (λαμβάνονται από το στόμα, τις αναπνευστικές οδούς κ.ά.) και σ' αυτά που έχουν τη μορφή ενέσεων (υποδόριες, ενδομυϊκές, ενδοφλέβιες). Ο διαχωρισμός αυτός έχει μεγάλη σημασία για τη δράση της θεραπευτικής ουσίας, φάρμακα που δε λαμβάνονται με τον αυστηρά καθορισμένο τρόπο μπορεί να προκαλέσουν επικίνδυνες δηλητηριάσεις. 6

7 Εκτός από τα φάρμακα που προορίζονται για τον άνθρωπο υπάρχουν και τα φάρμακα για τα φυτά που θεραπεύουν τις ασθένειές τους ή τις προλαμβάνουν και καταστρέφουν τους μικροοργανισμούς εχθρούς των φυτών. Η χρήση των γεωργικών φαρμάκων απαιτεί ιδιαίτερη προσοχή γιατί είναι δηλητηριώδη. Η διαδρομή μέχρι το φαρμακείο Κάθε φάρμακο έχει μικρή ή μεγάλη ιστορία. Κάποιων είναι σχεδόν θρυλική, όπως της πενικιλίνης: η ανακάλυψή της από τον Αλέξανδρο Φλέμινγκ έσωσε τις ζωές αναρίθμητων τραυματιών κατά τη διάρκεια του B' Παγκοσμίου Πολέμου και έκανε τον Φλέμινγκ ήρωα του συνεχιζόμενου και στις ημέρες μας πολέμου εναντίον των λοιμώξεων. Συνήθως αυτές οι ιστορίες δεν γίνονται γνωστές στον μέσο άνθρωπο, ο οποίος καταναλώνει τα σκευάσματα που του συνιστά ο γιατρός του χωρίς να φαντάζεται τον χρόνο, τον κόπο και τα χρήματα που δαπανήθηκαν για τη δημιουργία τους Ανεξάρτητα από το είδος της ασθένειας την οποία θεραπεύουν, όλα τα φάρμακα προτού γίνουν φάρμακα περνούν από μία σειρά σταδίων που μοιάζουν με σχολικές εξετάσεις: αν δεν περάσουν επιτυχώς τη μία «τάξη» δεν μπορούν να πάνε στην επόμενη. Αντίθετα δε με ότι συμβαίνει στο σχολείο, δεν υπάρχουν επαναληπτικές εξετάσεις παρά μόνο σε πολύ σπάνιες περιπτώσεις (όταν χρόνια μετά, υπό το φως νέων δεδομένων, κάποιες ουσίες επανεξετάζονται ως πιθανά φάρμακα για την ίδια ή συνηθέστερα άλλη ένδειξη). Υπολογίζεται ότι μόνο μία στις ουσίες οι οποίες δοκιμάζονται για πιθανές φαρμακευτικές ιδιότητες περνά επιτυχώς όλα τα στάδια και παίρνει την έγκριση να κυκλοφορήσει στα φαρμακεία. Οι υπόλοιπες εγκαταλείπονται στη διαδρομή. Η διαδρομή που ακολουθεί ένα φάρμακο από τη στιγμή της σύλληψής του ώσπου να φτάσει στο φαρμακείο έχει σχεδιαστεί έτσι ώστε να εξασφαλίζεται η αποτελεσματικότητα και η ασφάλειά του. Όλα αρχίζουν από το ερευνητικό εργαστήριο το οποίο είτε ερευνά στοχευόμενα με σκοπό την αναζήτηση φαρμάκων για μια συγκεκριμένη πάθηση είτε διεξάγει βασική έρευνα από την οποία αποκαλύπτεται η αιτιολογία μιας νόσου. Οπλισμένοι με τη γνώση τού «τι δεν πάει καλά» στον οργανισμό, οι επιστήμονες μπορούν να σκεφθούν τρόπους αποκατάστασης της βλάβης και να υποδείξουν ουσίες που κατ' αρχάς, in vitro (στον δοκιμαστικό σωλήνα), φαίνεται να διαθέτουν τις κατάλληλες ιδιότητες. Χαρακτηριστικό παράδειγμα τέτοιων ουσιών είναι οι αναστολείς των υποδοχέων, μορίων τα οποία συμμετέχουν στη ροή πληροφοριών που δέχεται ένα κύτταρο. Οι υποδοχείς εντοπίζονται στην επιφάνεια και στο εσωτερικό των κυττάρων και πάνω τους προσδένονται μόρια τα οποία στέλνουν ένα μήνυμα στο κύτταρο. Ανταποκρινόμενο στο μήνυμα, το κύτταρο υιοθετεί μια συμπεριφορά η οποία κάποιες φορές είναι παθολογική. Οι αναστολείς που χρησιμοποιούνται ως φάρμακα έχουν σχεδιαστεί έτσι ώστε να εμφανίζουν μεγαλύτερη δυνατότητα πρόσδεσης στον υποδοχέα σε σχέση με το μόριο-μήνυμα. Προσδενόμενοι λοιπόν στους υποδοχείς, καταλαμβάνουν 7

8 τη θέση των μορίων-μηνυμάτων και έτσι το κύτταρο παύει να συμπεριφέρεται παθολογικά. Όταν κάποια ουσία θεωρηθεί πως διαθέτει τα κατάλληλα χαρακτηριστικά για να χρησιμοποιηθεί ως φάρμακο, η φαρμακευτική εταιρεία ή η εταιρεία βιοτεχνολογίας ή το ερευνητικό εργαστήριο ενός ινστιτούτου, στο οποίο έγιναν οι έρευνες που κατέδειξαν τις δυνατότητές της, καταθέτει αίτηση για αποκλειστικό δικαίωμα της χρήσης αυτής της ουσίας ως φαρμάκου για μια δεδομένη ασθένεια. Τα αποκλειστικά δικαιώματα (πατέντα) χορηγούνται για μια εικοσαετία και ο λόγος για τον οποίο χρειάζονται είναι καθαρά οικονομικός: τα επόμενα στάδια ανάπτυξης ενός φαρμάκου είναι τόσο δαπανηρά, που μόνο η αποκλειστική εκμετάλλευση του σκευάσματος που θα προκύψει κάνει την επένδυση βιώσιμη και, στην καλύτερη των περιπτώσεων, εξαιρετικά προσοδοφόρα. 8

9 Κεφάλαιο 2 Αναδρομή στην Ιστορία των Φαρμάκων 2.1 Από τα βάθη των αιώνων Αρχαία Ελλάδα Oι αρχαίοι Έλληνες, όπως και όλοι οι λαοί, αρχαίοι και νεότεροι, πρωτόγονοι και προηγμένοι, χρησιμοποιούσαν φάρμακα για να θεραπεύουν αρρώστιες ή για να ανακουφίζουν από δυσάρεστες, επώδυνες καταστάσεις. Στην αρχαία Ελλάδα (όπως και σε αντίστοιχους πολιτισμούς) χρησιμοποιούσαν για θεραπευτικούς σκοπούς κυρίως μέρη φυτών (ρίζες, φύλλα, άνθη, καρπούς κ.λπ.), αλλά και ζωικά προϊόντα (μέρη του σώματος ή εκκρίματα ζώων), καθώς και ανόργανες (ορυκτές) ουσίες. Για τη χρήση τους ως φαρμάκων τα μέρη των φυτών (και τα άλλα φυσικά προϊόντα) υποβάλλονταν σε σχετικά απλές επεξεργασίες: πολτοποίηση, ξήρανση, κονιοποίηση, βράσιμο (σε νερό ή κρασί), ανάμιξη με άλλες ουσίες (π.χ. μέλι) κ.ά. Αναφορές για χρήση (και δράσεις) φαρμάκων βρίσκουμε σε πολύ παλαιά κείμενα (και βέβαια όχι μόνο από τον ελλαδικό χώρο). Η πρώτη αναφορά στα βότανα και τις φαρμακευτικές τους ιδιότητες έγινε από τον Κινέζο αυτοκράτορα Shenung το 2700 π.χ. Ο αιγυπτιακός πάπυρος Ebers (1550 π.χ.) καταγράφει ένα μεγάλο αριθμό ασθενειών καθώς και πλήθος συνταγών για την αντιμετώπισή τους. Επίσης από τον ίδιο πάπυρο μαθαίνουμε π.χ. πως η χρήση του κικινελαίου (ρετσινόλαδο) ήταν από τότε γνωστή. Οι γνώσεις αυτές μεταφέρθηκαν στους αρχαίους Έλληνες φιλόσοφους. Ο Ιπποκράτης ( π.χ.), εφαρμόζοντας τη μέθοδο της παρατήρησης, έθεσε τις βάσεις της επιστημονικής ιατρικής στηρίζοντάς την στη λογική και διαχωρίζοντάς την από τη θρησκεία και τη μαγεία, ώστε δικαίως θεωρείται σήμερα πατέρας της ιατρικής. Στο βιβλίο του "Αφορισμοί", διατύπωσε μεταξύ άλλων την άποψη ότι ο γιατρός οφείλει να ανακουφίζει τον άνθρωπο από τους πόνους όχι με την επίκληση των θεών, αλλά με τη χρήση θεραπευτικών και διαιτητικών μέσων. Ο μεγάλος φιλόσοφος Αριστοτέλης ( π.χ.) έκανε σημαντικές παρατηρήσεις για τα ζώα. Ο μαθητής του Θεόφραστος ( π.χ.) ταξινόμησε όλα τα μέχρι τότε γνωστά φαρμακευτικά φυτά στο μεγάλο του έργο "Φυτών αιτίαι και Φυτών ιστορίαι". Το έργο 9

10 αυτό συμπληρώθηκε από τον έλληνα γιατρό και φαρμακοποιό Διοσκουρίδη τον Πεδάνιο (1ος μ.χ. αι.). Στο περίφημο έργο του "Περί ύλης ιατρικής" (Materia Medica), (77-78 μ.χ.), που περιλήφθηκε σε πέντε βιβλία και αποτέλεσε μια πλήρη πραγματεία περί φαρμακολογίας, περιγράφονται πάνω από 600 φαρμακευτικά φυτά. Οι φαρμακευτικές τους ουσίες κατονομάζονται και περιγράφονται σύμφωνα με την πηγή προέλευσης, την ταυτοποίηση, τον τρόπο παρασκευής, τη συνιστώμενη δοσολογία και τον τρόπο χρήσης τους. Η προσφορά του υλικού αυτού θεωρείται ανεκτίμητη γιατί αποτέλεσε το πλαίσιο για τη σύνταξη των πρώτων φαρμακοποιιών. Όπως ισχύει και για όλους τους λαούς σε αντίστοιχες ιστορικές περιόδους (αλλά και για ένα πολύ μεγάλο μέρος της ιστορίας της ανθρωπότητας), στην αρχαία Ελλάδα αυτοί που εκτελούσαν ιατρικές-θεραπευτικές δραστηριότητες ανήκαν σε διάφορες κατηγορίες. Καταρχάς υπήρχαν, όπως παντού, οι «λαϊκοί θεραπευτές». Από την άλλη μεριά μπορούμε να διακρίνουμε αυτούς που θα ονομάζαμε «θεσμοθετημένους θεραπευτές». Τέτοιοι είναι στις αρχαίες κοινωνίες αρχικά οι θεραπευτές που ανήκουν στο ιερατείο (όπως στα ελληνικά Ασκληπιεία). H μάγισσα Kίρκη ενώ προσπαθεί να πείσει τον Oδυσσέα να πιει το μαγικό της ποτό. Παράσταση από καβειρικό αγγείο, 4ος αι. Oξφόρδη, Mουσείο Ashmolean. Ριζότομοι, φαρμακοπώλες και λαϊκή ιατρική Επιπλέον, στην αρχαία Ελλάδα εμφανίζονται σε κάποια εποχή αυτοί που θα ονομάζαμε «επιστήμονες γιατροί», όπως εκείνοι που ανήκαν στη σχολή της Κω και της Κνίδου. 10

11 Λαϊκοί θεραπευτές στην αρχαία Ελλάδα ήταν, μεταξύ των άλλων, οι ονομαζόμενοι «ριζοτόμοι» (αυτοί που κόβουν, που μαζεύουν ρίζες και, γενικότερα, φαρμακευτικά φυτά) και «φαρμακοπώλαι» ( αυτοί που πουλούν φάρμακα, κυρίως φαρμακευτικά φυτά). Οι άνθρωποι αυτοί, που δεν είχαν ιδιαίτερη ιατρική μόρφωση, προμήθευαν γιατρούς και αρρώστους με φαρμακευτικά φυτά, αλλά παράλληλα έδιναν και ιατρικές συμβουλές και εκτελούσαν, σε μεγάλη έκταση, θεραπείες. Ιδιαίτερα στα λαϊκά στρώματα φαίνεται ότι βασίζονταν, σε μεγάλο βαθμό, σ αυτούς για να αντιμετωπίσουν τις αρρώστιες τους. Φάρμακα και Ασκληπιεία Τα Ασκληπιεία είχαν μεγάλο κύρος στην αρχαία Ελλάδα, στην Κλασική περίοδο, ακόμη και μετά τη διάδοση της ιπποκρατικής ιατρικής, αλλά και στην Ελληνιστική και τη Ρωμαϊκή περίοδο. Οι άρρωστοι που προσέρχονταν σ αυτά για θεραπεία ακολουθούσαν διαδικασίες που περιλάμβαναν δεήσεις, ακροάσεις μουσικών εκτελέσεων ή θεατρικών παραστάσεων, λουτρά, δίαιτα κλπ. Το τελικό στάδιο ήταν η εγκοίμηση, κατά την οποία ο άρρωστος κοιμόταν μέσα σε ένα ειδικό χώρο του Ασκληπιείου και στον ύπνο του εμφανιζόταν ο θεός ή κάποια άλλη μορφή που εκτελούσε τη θεραπεία ή έδινε στον άρρωστο θεραπευτικές οδηγίες. Μέθοδοι μουσικοθεραπείας που χρησιμοποιούσαν στα Ασκληπιεία. Εικόνα από Berlin Athen Άρθρο: «Aινείται τον Κύριον εν χορδαίς και εν οργάνοις» Η προέλευση των γνώσεων για τα φάρμακα Οι γνώσεις σχετικά με τα φάρμακα που περιέχονται στα αρχαιοελληνικά κείμενα επεκτείνονται σε πολλές λεπτομέρειες: 11

12 Τρόπος συλλογής των φυτών (ακόμα κατάλληλη εποχή, ενδεχομένως και ώρας της ημέρας), τρόπος διατήρησης, τρόποι παρασκευής, δοσολογία, καταστάσεις για τις οποίες είναι κατάλληλο το κάθε φάρμακο κ.λπ. Είναι φανερό (από αναφορές των συγγραφέων και από συγκρίσεις των κειμένων) ότι πολλές από τις πληροφορίες που αναφέρει ένας συγγραφέας προέρχονται από τους παλαιοτέρους του. Ο Γαληνός π.χ. Έχει πάρει πολλά στοιχεία από τον Διοσκουρίδη και άλλους, ο Διοσκουρίδης από παλαιοτέρους του και από τη λαϊκή ιατρική διαφόρων περιοχών κ.ο.κ. Το γεγονός, όμως, αυτό δεν μας διαφωτίζει και πολύ, γιατί παραμένει αναπάντητο το πώς είχαν αποκτήσει τις γνώσεις αυτές οι παλαιότεροι. Μια πρόχειρη απάντηση είναι ότι οι γνώσεις αυτές αποκτήθηκαν αρχικά με τυχαίες παρατηρήσεις ή τυχαίες δοκιμές. Μια τέτοια απάντηση, όμως δεν είναι καθόλου ικανοποιητική. Είναι εξαιρετικά προβληματικό να δεχθεί κανείς ότι όλο το σώμα των σχετικών γνώσεων αποκτήθηκε με «συσσώρευση» τέτοιων τυχαίων παρατηρήσεων ή δοκιμών. Πολλά από τα φάρμακα αυτά είναι θεραπευτικά μόνο σε συγκεκριμένες δόσεις ή σε συγκεκριμένες συνθήκες παρασκευής και χορήγησης. Άλλοτε πάλι τα φάρμακα πρέπει να λαμβάνονται για μεγάλο χρονικό διάστημα πριν εμφανίσουν θεραπευτικά αποτελέσματα. Αυτό που μπορεί να προσφέρει μια τυχαία παρατήρηση είναι μάλλον να οδηγήσει σε κάποια τροποποίηση, συμπλήρωση κ.λπ. μιας γνώσης που ήδη υπάρχει. Με άλλα λόγια: για να προχωρήσει κανείς σε γνώσεις σχετικά με τα φάρμακα πρέπει να ξεκινήσει από (και να στηριχθεί σε) ήδη δομημένες γνώσεις. Μία τέτοια παρατήρηση μας οδηγεί στις πιο πρώιμες (ή πρωτόγονες) φάσεις ενός πολιτισμού, στις οποίες, όπως είναι γνωστό, οι άνθρωποι χρησιμοποιούσαν ήδη ένα μεγάλο φάσμα φαρμάκων. Όπως παρατηρεί ο R.Schmitz: Στον άνθρωπο των προϊστορικών εποχών ή των πρωτόγονων πολιτισμών εκδηλώνονται κάποια έμφυτα ένστικτα που αναπτύσσονται τόσο περισσότερο, όσο λιγότερο οι δραστηριότητες του κατευθύνονται από συνειδητή, συστηματική σκέψη. Όπως συμβαίνει με το υγιές ζώο, έτσι και ο υγιής άνθρωπος αναζητούσε τη φυτική, ζωική ή ορυκτή τροφή του και έβρισκε ασυνείδητα αυτό το οποίο χρειαζόταν το σώμα του, ενώ απέφευγε εκείνο που θα τον έβλαπτε. Αυτό ισχύει ιδιαίτερα στην περίπτωση μιας αρρώστιας, στην οποία ο οργανισμός αναζήτα εκείνο που του είναι απαραίτητο για να ανακτήσει την υγεία του. 12

13 2.2 Ιστορική Αναδρομή από την Αναγέννηση μέχρι σήμερα Οι αντιλήψεις και οι γνώσεις των αρχαίων Ελλήνων για τα φάρμακα (και γενικότερα για την Ιατρική) έμελλε να κυριαρχήσουν για πολλούς αιώνες, όχι μόνο στον ελληνόφωνο κόσμο, αλλά και σε όλη τη Δύση. Τα έργα του Διοσκουρίδη και του Γαληνού μεταφράστηκαν γρήγορα στα λατινικά και ήταν ανάμεσα στα πρώτα έργα που τυπώθηκαν μετά την εισαγωγή της τυπογραφίας. Η θεραπευτική αυτή, όσο κι αν φαντάζει σήμερα μακρινή και ξένη σε σύγκριση με τις σημερινές ιατρικές αντιλήψεις, στην πραγματικότητα παρέμενε ζωντανή (και, σε μεγάλο βαθμό, κυρίαρχη) ακόμη και τον 17ο και τον 18ο αιώνα. Τα φάρμακα και οι θεραπείες αυτές παραμερίστηκαν, από τον 19ο αιώνα, με την επικράτηση της σύγχρονης ιατρικής και την ανάπτυξη των νέων χημικών φαρμάκων. Τις τελευταίες όμως δεκαετίες, όπως είναι γνωστό, πολλοί άνθρωποι στις ανεπτυγμένες χώρες προτιμούν πάλι να χρησιμοποιούν, σε πολλές περιπτώσεις, φυσικά προϊόντα, κυρίως φυτικά, επεξεργασμένα με απλούς τρόπους, αντί για τα χημικά φάρμακα του εμπορίου. Με κάποια έννοια, θα μπορούσε να μιλήσει κανείς για αναβίωση των αρχαίων ελληνικών φαρμάκων. Περίοδος της Αναγέννησης Η περίοδος της Αναγέννησης στην Ευρώπη επέφερε σημαντικές εξελίξεις και στον τομέα της φαρμακολογικής έρευνας. Η ανακάλυψη της τυπογραφίας συνέβαλε στην εκτύπωση της πρώτης φαρμακοποιίας από το Γερμανό Valerius Cordus ( ), ο οποίος περιέγραψε τις πρώτες αξιόλογες μεθόδους παρασκευής φαρμάκων. Την ίδια εποχή έκανε την εμφάνισή του ο Ελβετός γιατρός και χημικός Theophrast Bombast von Hohenheim ( ), ο οποίος μετονομάστηκε στα λατινικά σε Philippus Aureolus Theophrastus Bombastus Paracelsus. Ο Παράκελσος, όπως έμεινε γνωστός στη ιστορία, ήταν ο πρώτος που ξέφυγε από τα γαληνικά σκευάσματα και χρησιμοποίησε για θεραπευτικούς σκοπούς ανόργανες χημικές ουσίες. Οι επιστημονικές και φιλοσοφικές αντιλήψεις του Παράκελσου είναι εξαιρετικά συγκεχυμένες. Βασική αρχή των αντιλήψεων του αποτέλεσε η ιδέα ότι οι ζωικές διαδικασίες είναι χημικής φύσεως και ότι η υγεία εξαρτάται από την ισορροπημένη σύσταση των χυμών που μπορούσε να αποκατασταθεί με τη χρήση κατάλληλων φαρμάκων. Για το λόγο αυτό ο Παράκελσος έδινε μεγάλη σημασία στη παρασκευή των φαρμάκων, στη μελέτη των οποίων αφιέρωσε μεγάλο μέρος της ζωής του συνδυάζοντας πειραματικές παρατηρήσεις με αλχημικές αντιλήψεις. Παρ όλες τις αντιφάσεις των έργων και του χαρακτήρα του, αναγνωρίζεται στον Παράκελσο ότι έθεσε τις βάσεις της χημειοθεραπείας. 13

14 17 ος και 18 ος αιώνας Κατά τη διάρκεια του 17ου και 18ου αιώνα άνθησε το εμπόριο φαρμακευτικών προϊόντων καθώς και τα ιατρικά πειράματα. Ανακαλύφτηκαν φάρμακα όπως το κινίνο, η διγιτάλη (δακτυλίτις Digitalis purpurea) και διάφορα αλκαλοειδή. Η διγιτάλη χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά από τον William Withering ( ) στη θεραπεία της καρδιακής ανεπάρκειας. Ο William Harvey ( ) ανακάλυψε την κυκλοφορία του αίματος και διαπίστωσε ότι τα φάρμακα κυκλοφορούν στον οργανισμό με το αίμα. Ο Christopher Wren ( ) πραγματοποίησε την πρώτη ενδοφλέβια χορήγηση φαρμάκου σε σκύλο. Μόλις όμως το 1853 ανακαλύφτηκε η πρώτη υποδερμική βελόνα από τον Alexander Wood. Το γεγονός αυτό είχε τεράστια σημασία για τη διεξαγωγή των φαρμακολογικών πειραμάτων που ακολούθησαν. Ο Edward Jenner ( ) ανακάλυψε τις αρχές της ενεργού Φαρμακοκινητικής ανοσοποίησης κατά της ευλογιάς και πρώτος εφάρμοσε το δαμαλισμό. Περιέγραψε επίσης το φαινόμενο της αναφυλαξίας. 19 ος αιώνας Η βάση της σύγχρονης Φαρμακολογικής έρευνας Ο 19ος αιώνας χαρακτηρίζεται από την ραγδαία ανάπτυξη της χημείας, πράγμα που διευκόλυνε τον χημικό προσδιορισμό και τη μελέτη των δραστικών φαρμακευτικών ουσιών φυσικής προέλευσης. Ο Γερμανός φαρμακοποιός Friedrich Sertuner ( ) απομόνωσε από το όπιο τη ναρκωτική ουσία μορφίνη, την οποία ονόμασε έτσι από το όνομα του Ρωμαίου θεού του ύπνου Morpheus. Οι βάσεις όμως της σύγχρονης φαρμακολογικής έρευνας τέθηκαν από τον Francois Magendie ( ) και τους μαθητές του, οι οποίοι μελέτησαν το πρόβλημα της σχέσης δόσης-αποτελέσματος, της κατανομής του φαρμάκου στον οργανισμό, του μηχανισμού δράσης και της σχέσης μεταξύ της χημικής δομής του φαρμάκου και της δράσης του. Ο τιμημένος με το βραβείο Nobel Γερμανός μικροβιολόγος Paul Ehrlich ( ) θεωρείται ο θεμελιωτής της χημειοθεραπείας με την ανακάλυψη του περίφημου αρσενικούχου σκευάσματος 606 ή σαλβαρσάνης, που υπήρξε το πρώτο πραγματικά αποτελεσματικό φάρμακο κατά της σύφιλης. Το γεγονός αυτό απέδειξε τη δυνατότητα αντιμετώπισης των παθογόνων μικροοργανισμών με χημικά σκευάσματα. Η χρήση μικροβίων ως πηγής δραστικών ουσιών εναντίον λοιμωδών ασθενειών θα πρέπει να ήταν γνωστή από την αρχαιότητα. Η πρώτη όμως ουσιαστική παρατήρηση έγινε το 1877 από τους Pasteur και Joubert, οι οποίοι ανακοίνωσαν ότι το βακτηρίδιο του άνθρακα παύει να πολλαπλασιάζεται, όταν στην καλλιέργεια υπάρχει ανάπτυξη του B. subtilis. 14

15 Η σημαντικότερη όμως επιβεβαίωση του φαινομένου της αντιβίωσης έγινε το 1929 όταν ο Alexander Fleming δημοσίευσε σε εργασία του στην οποία περιέγραφε την ανασταλτική επίδραση που προκαλούσε η παραγόμενη από το μύκητα Penicillium notatum ουσία σε αποικία σταφυλόκοκκων. Η παραγόμενη από το μύκητα ουσία ονομάστηκε πενικιλλίνη και χρησιμοποιήθηκε στην αρχή ως αντισηπτικό. Η θεραπευτική της αξία ως αντιμικροβιακού επιβεβαιώθηκε δέκα χρόνια αργότερα, όταν οι Florey και Chain την απομόνωσαν σε καθαρή μορφή και τη χορήγησαν σε πειραματόζωα. Μετά τη διαπίστωση ότι διάφοροι μικροοργανισμοί παράγουν ουσίες που μπορεί να εκδηλώνουν αντιμικροβιακές ιδιότητες άρχισε η εντατική αναζήτηση του εντοπισμού τους. Έτσι το 1944 στο αγρόκτημα του Πανεπιστημίου Rutgers του New Jersey των ΗΠΑ εντοπίστηκε σε εδάφη έντονα επιβαρημένα από την κοπριά των ζώων του αγροκτήματος ο μύκητας Streptomyces griseus από τον οποίο απομονώθηκε η στρεπτομυκίνη. Την περίοδο αυτή η κτηνιατρική φαρμακολογία αρχίζει να αναπτύσσεται σε αυτόνομο επιστημονικό κλάδο διαφοροποιούμενη από την ανθρώπινη. Ο οικονομικός χαρακτήρας του φαρμάκου στη ζωική παραγωγή γίνεται ολοένα και πιο έκδηλος. Εξάλλου η μελέτη της τύχης του φαρμάκου στον οργανισμό, που αποτελεί αντικείμενο του σύγχρονου κλάδου της Φαρμακοκινητικής, δίνει τη δυνατότητα να επισημανθούν οι σημαντικές διαφορές της συγκέντρωσης, κατανομής και απομάκρυνσης του φαρμάκου μεταξύ των διαφορετικών ειδών ζώων. Η αναζήτηση των μηχανισμών δράσης του φαρμάκου οδηγεί στην εμφάνιση της Φαρμακοδυναμικής ως ξεχωριστού φαρμακολογικού κλάδου. Η τεκμηρίωση της θεωρίας των υποδοχέων (receptors) αποτελεί επαναστατική εξέλιξη στις αντιλήψεις για τον τρόπο δράσης των διαφόρων φαρμάκων. Το γεγονός αυτό σηματοδοτεί την εμφάνιση της Μοριακής Φαρμακολογίας. Αυτή με τη σειρά της βοηθά τη φαρμακοβιομηχανία στη σύνθεση νέων φαρμακευτικών μορίων με καθορισμένη μοριακή δομή ικανή να συνδεθεί και να ενεργοποιήσει συγκεκριμένους μακρομοριακούς υποδοχείς στους ιστούς. Σαν παράδειγμα αναφέρεται η ανακάλυψη της θειαβενδαζόλης το 1960, του πρώτου βενζιμιδαζολικού πυρήνα που αποτέλεσε τη βάση σύνθεσης της μεγάλης σήμερα ομάδας των βενζιμιδαζολικών ανθελμινθικών. Η δυνατότητα παρέμβασης στο φαρμακευτικό μόριο με την αντικατάσταση ή προσθήκη χημικών ομάδων ικανών να αυξάνουν την προσήλωση του φαρμάκου προς τον υποδοχέα, οδηγεί στην αύξηση της φαρμακολογικής δράσης με παράλληλη μείωση των ανεπιθύμητων ενεργειών του. Τα τελευταία χρόνια η ποιότητα, η αποτελεσματικότητα και η ασφάλεια ενός φαρμάκου αποτελούν τα βασικά κριτήρια που προβλέπονται από τη νομοθεσία της Ε.Ε για την έγκρισή τους. 15

16 Έτσι σήμερα οι φαρμακοβιομηχανίες προκειμένου να αποκτήσουν την έγκριση κυκλοφορίας ενός νέου φαρμακευτικού μορίου, υποχρεούνται να υποβάλουν στις αρμόδιες αρχές ειδικό φάκελο που να περιέχει εμπεριστατωμένες μελέτες τεκμηρίωσης της ποιότητας, αποτελεσματικότητας και ασφάλειας του νέου φαρμάκου. Η ίδια διαδικασία ισχύει και για την έγκριση οποιουδήποτε νέου ιδιοσκευάσματος με ήδη αναγνωρισμένη δραστική ουσία, όταν ζητείται άδεια κυκλοφορίας σε μια χώρα. Στην περίπτωση αυτή δίνεται ιδιαίτερη έμφαση στον ποιοτικό έλεγχο, ενώ για την τεκμηρίωση της αποτελεσματικότητας και ασφάλειας αρκεί η παραπομπή στην επιστημονική βιβλιογραφία που αφορά τη δραστική ουσία. Τα παραπάνω αποτελούν τα βασικά σημεία της υπ αριθμόν 51 Κοινοτικής Οδηγίας που θέσπισε το Ευρωπαϊκό Συμβούλιο το 1981 σχετικά με την έγκριση κυκλοφορίας ενός κτηνιατρικού ιδιοσκευάσματος σε μια χώρα μέλος της Ε.Ε. 2.3 Η ανακάλυψη της Πενικιλίνης Η ανακάλυψη της πενικιλίνης του αντιβιοτικού που έσωσε εκατομμύρια ζωές καταπολεμώντας βακτηριακές λοιμώξεις που θέριζαν την ανθρωπότητα, κατέστησε τον σκωτσέζο γιατρό Αλέξανδρο Φλέμινγκ, ήρωα. Ακόμη και σήμερα γοητευόμαστε από την «τυχαία» ανακάλυψή του. Ο μύθος όμως συχνά αδιαφορεί για της λεπτομέρειες και τελικά αδικεί τον ήρωα. Αλέξανδρος Φλέμινγκ, Γιατρός ( ) Ο Αλέξανδρος Φλέμινγκ συνέδεσε το όνομά του με την πενικιλίνη αλλά έκανε και άλλες σημαντικές ανακαλύψεις. Επιπροσθέτως, η ανακάλυψη της πενικιλίνης δεν ήταν καθόλου τυχαία: η ανεύρεση ενός αντισηπτικού βασάνιζε τον Φλέμινγκ για πολλά χρόνια και έτσι ήταν έτοιμος να αναγνωρίσει την ύπαρξη του όταν τυχαία βρέθηκε στον δρόμο του. 16

17 Πολύ νωρίς το ερευνητικό ενδιαφέρον του Αλεξάνδρου Φλέμινγκ στράφηκε στη δράση των βακτηρίων στο αίμα και στα αντισηπτικά. Αναζητούσε αντιβακτηριακούς παράγοντες οι οποίοι δεν θα ήταν τοξικοί στους ζωικούς ιστούς, πράγμα που τον οδήγησε το 1921 στην ανακάλυψη της λυσοζύμης, ενός ενζύμου με βακτηριολυτικές ιδιότητες το οποίο υπάρχει σε «ιστούς και εκκρίσεις», όπως ανέφερε στο σχετικό σύγγραμμά του. Μελετώντας τις βακτηριολυτικές ιδιότητες της λυσοζύμης, ο Φλέμινγκ πραγματοποίησε στοιχειομετρικές αναλύσεις οι οποίες θα του φαίνονταν πολύ χρήσιμες αργότερα, όταν η περίφημη τύχη του τον έφερε αντιμέτωπο με την πενικιλίνη. Κρύσταλλος λυσοζύμης (el.wikipedia.org) Το 1928 βρήκε τον Αλέξανδρο Φλέμινγκ να εργάζεται με τον ιό της γρίπης. Φεύγοντας για διακοπές δύο εβδομάδων, άφησε πάνω στον πάγκο του ένα τρυβλείο πετρί («πιατάκι» με σκέπασμα στο οποίο καλλιεργούνται μικροοργανισμοί στο εργαστήριο) στο οποίο είχε εμβολιάσει σταφυλόκοκκο. Όταν γύρισε, είδε ότι εκτός από τον σταφυλόκοκκο στο τρυβλείο είχε αναπτυχθεί και ένας μύκητας. Η μόλυνση με μύκητα καθιστά τις βακτηριακές καλλιέργειες άχρηστες για το εργαστήριο και η φυσική πορεία των πραγμάτων θα ήταν να τις πετάξει κανείς στο καλάθι τον αχρήστων. Ο Φλέμινγκ όμως δεν μπόρεσε να μην παρατηρήσει ότι γύρω από τον μύκητα υπήρχε μια καθαρή από βακτήρια περιοχή, γεγονός το οποίο θα μπορούσε να δικαιολογηθεί με την ύπαρξη ενός παράγοντα ο οποίος εκκρινόμενος από τον μύκητα έμποδιζε την ανάπτυξη την βακτηρίων. Penicillium notatum. Εικόνα από Microbelibrary.org 17

18 Η ανάλυση που πραγματοποίησε ο Φλέμινγκ έδειξε ότι ο μύκητας ήταν ο Pencillium notatum και έτσι ο παράγοντας, ο οποίος απεδείχθη ικανός να σκοτώνει τα βακτήρια ακόμη και αραιωμένος 800 φορές, ονομάστηκε πενικιλίνη. Παρά το γεγονός ότι ο Φλέμινγκ δημοσίευσε τα αποτελέσματα του το 1929, η σημασία τους δεν έγινε φανερή παρά μία δεκαετία αργότερα. Ακόμη και ο ίδιος ο Φλέμινγκ έπαψε να ασχολείται με την πενικιλίνη το Ο κυριότερος λόγος για αυτό ήταν η αδυναμία του να προχωρήσει στην απομόνωση μεγάλων ποσοτήτων καθαρής πενικιλίνης, πράγμα το οποίο απαιτούσε γνώσεις τις οποίες δεν διέθετε. Σαν καλός επιστήμονας όμως, είχε φροντίσει να διατηρήσει τον πολύτιμο μύκητα που παρήγαγε το αντιβιοτικό του και να τον παραδώσει στους Howard Florey και Ernst Chain, οι οποίοι σε διάστημα ενός έτους όχι μόνο παρήγαγαν καθαρή πενικιλίνη, αλλά πραγματοποίησαν και το πείραμα που κατέδειξε την αξία αυτού του μορίου: χορήγησαν πενικιλίνη σε ποντίκια τα οποία είχαν μολυνθεί θανάσιμα με μικροοργανισμούς και τα παρατήρησαν να αναρρώνουν! Η πενικιλίνη έσωσε τη ζωή χιλιάδων στρατιωτών κατά τη διάρκεια του Β Παγκοσμίου Πολέμου και το 1945 χάρισε στους τρεις άνδρες το βραβείο Νόμπελ Ιατρικής. Αξίζει όμως να σημειωθεί ότι ο ίδιος ο Φλέμινγκ είχε δει την αχίλλειο πτέρνα του αντιβιοτικού του από το πρώτα κιόλας χρόνια, καθώς το 1946 σημείωνε ότι «η χορήγηση της πενικιλίνης ακόμα και σε μικρές δόσεις, οδηγούσε σε ανάπτυξη ανθεκτικότητας στους μικροοργανισμούς». 2.4 Η ανακάλυψη της Ασπιρίνης Η ασπιρίνη, το ευρύτερα χρησιμοποιούμενο φάρμακο στον κόσμο, ή αλλιώς ακετυλοσαλικυλικό οξύ, είναι ένα από τα πιο δημοφιλέστερα αναλγητικά φάρμακα. Σήμερα χρησιμοποιείται για την αντιμετώπιση μιας μεγάλης ποικιλίας προβλημάτων υγείας. Το 1500 π.χ. οι Αιγύπτιοι χρησιμοποιούν εκχυλίσματα από φύλλα μυρτίας (που περιέχει σαλικυλικό οξύ) για τους πόνους της πλάτης. Ο πατέρας της Ιατρικής Ιπποκράτης ( π.χ) το 200 π.χ. χρησιμοποίησε μια πικρή σκόνη από τον φλοιό της ιτιάς, (που περιέχει επίσης σαλικυλικό οξύ) καθώς και αφεψήματα ιτιάς ή και λεύκας για να ανακουφίζει από τον πόνο και τον πυρετό. 18

19 Άνθη και φύλλα ιτιάς Δέντρο ιτιάς Φλοιός ιτιάς Eικόνες από Φαρμακευτικά προϊόντα με βάση την ιτιά χρησιμοποιήθηκαν από τους Κινέζους, όπως επίσης και από τους Ινδιάνους της Αμερικής για τη θεραπεία τραυμάτων, ρευματισμών, κρυολογημάτων και πονοκεφάλου. Ο Γάιος Πλίνιος Σεκούνδος (23-79 μ.χ.), στο σύγγραμμά του Naturalis Historia, αναφέρεται σε κάποιες ουσίες (παράγωγα του σαλικυλικού οξέος) που παρασκευάζονταν από σκόνη φλοιού ιτιάς. Το 1757, ο Άγγλος κληρικός Edmund Stone έφερε στο προσκήνιο τις θεραπευτικές ιδιότητες του φλοιού της ιτιάς. Οι χημικοί και οι φαρμακοποιοί άρχισαν να δείχνουν μεγαλύτερο ενδιαφέρον για τις ιδιότητες του φλοιού της ιτιάς κατά τη διάρκεια των Ναπολεόντειων πολέμων ( ), όταν, λόγω των ναυτικών αποκλεισμών, οι εισαγωγές φαρμάκων από τη Νότια Αμερική είχαν περιοριστεί σημαντικά. Το 1828 ο Edward Stove, ένας Άγγλος κληρικός, αναφέρει στο Royal Society of London τη χρήση φλοιού ιτιάς για τον πυρετό, ενώ ο Johann Buchner, Γερμανός από το Μόναχο, απομονώνει καθαρή salicin από φλοιό ιτιάς. Το όνομα salicin προήλθε από το salix που σημαίνει ιτιά στα λατινικά. Το 1895, ο Frederick Bayer, ιδιοκτήτης της χημικής βιομηχανίας Frederick Bayer - Company (αργότερα Bayer AG), άρχισε να ενδιαφέρεται για τη σύνθεση παραγώγων του σαλικυλικού με αναλγητικές και αντιπυρετικές ιδιότητες, αλλά χωρίς την πικρή γεύση, την όξινη αντίδραση και τα ανεπιθύμητα στομαχικά προβλήματα που προκαλούσε το ίδιο το οξύ και τα άλατα. Ανέθεσε το θέμα αυτό σε ένα χημικό, τον Felix Hoffmann που εργαζόταν στο Εργαστήριο Πειραματικής Φαρμακολογίας της βιομηχανίας. 19

20 Ο Hoffman είχε προσωπικό κίνητρο για την έρευνα αυτή. Ο πατέρας του που έπασχε από αθρίτιδα και ελάμβανε σαλικυλικά άλατα για να περιορίσει τους πόνους, δεν ήταν πλέον δυνατόν να συνεχίσει τη λήψη τους λόγω των εμετών που του προκαλούσαν. Felix Hoffmann ( ) Γερμανός χημικός Eικόνα από Το ακετυλοσαλικυλικό οξύ που παρασκεύασαν τον Αύγουστο του 1897 δοκιμάστηκε πρώτα σε χρυσόψαρα και διαπιστώθηκε ότι δεν είχε τοξικές ιδιότητες. Ο Bayer έστειλε το νέο παράγωγο του σαλικυλικού οξέος στον Γερμανό ιατρό Kurt Witthauer, o οποίος το δοκίμασε σε 50 ασθενείς του και διαπίστωσε την αναλγητική, αντιπυρετική και αντιφλεγμονώδη δράση του. Το 1899, το φάρμακο κυκλοφόρησε με την εμπορική ονομασία Aspirin. H ονομασία προέρχεται από το a για τη χημική ομάδα acetyl, το spir από το φύτο Spiraea ulmaria και την συνηθισμένη κατάληξη in για φαρμακευτικές ουσίες. Από τις πρώτες φαρμακευτικές συσκευασίες της ασπιρίνης, η οποία υπήρξε το πρώτο φάρμακο που κυκλοφόρησε στη μορφή δίσκων. Eικόνα από Η ασπιρίνη έγινε αμέσως εξαιρετικά δημοφιλής και οι πωλήσεις της αυξήθηκαν αστραπιαία σε όλο τον κόσμο. Οι μόνες αρνητικές πλευρές του φαρμάκου ήταν κάποιες περιορισμένες γαστρεντερικές διαταραχές. Η σημαντική επιτυχία του φαρμάκου 20

21 οφειλόταν ακριβώς στο ό,τι ήταν πολύ πιο ήπιο στο στομάχι, σε σχέση με το σαλικυλικό οξύ, η τοξικότητα του ήταν περιορισμένη και είχε καλές αναλγητικές και αντιπυρετικές ιδιότητες. Από το 1915 η ασπιρίνη άρχισε να διατίθεται χωρίς να είναι απαραίτητη η ιατρική συνταγή Η σύνθεση του σαλικυλικού και του ακετυλοσαλικυλικού οξέος Το σαλικυλικό οξύ (ο-υδροξυ-βενζοϊκό οξύ) παρασκευάζεται σε ποσότητες της τάξης των 60 χιλιάδων τόνων ετησίως με τη μέθοδο Kolbe και πρώτη ύλη την πάμφθηνη φαινόλη, ένα από τα προϊόντα απόσταξης της λινθανθρακόπισσας. Φαινολικό νάτριο αντιδρά σε υψηλή θερμοκρασία (125 ο C) και πίεση (100 atm) με διοξείδιο του άνθρακα και τα παραγόμενο σαλικυλικό νάτριο με θειικό οξύ παρέχει σαλικυλικό οξύ, σύμφωνα με την αντίδραση που είναι γνώστη ως αντίδραση Kolbe-Schmitt. H σύνθεση της ασπιρίνης γίνεται με πρώτη ύλη το σαλικυλικό οξύ και οξικό ανυδρίτη, ο οποίος ακετυλιώνει το φαινολικό υδροξύλιο του μορίου του. Μικρές ποσότητες θειικού ή φωσφορικού οξέος καταλύουν την αντίδραση. Η παρασκευή αυτή είναι εξαιρετικά εύκολη και αποτελεί συνηθισμένη πειραματική άσκηση σε εργαστήρια Οργανικής Χημείας προπτυχιακών φοιτητών. Κατά την παλαιότερη σύνθεση του ακετυλοσαλικυλικού οξέος από τον Gerhardt χρησιμοποιήθηκε ακετυλοχλωρίδιο, το οποίο είναι δραστικότατο ακετυλιωτικό μέσο, αλλά συγχρόνως είναι υγρό πολύ πιο πτητικό από τον οξικό ανυδρίτη, γεγονός που το καθιστά εργαστηριακά πιο δύσχρηστο. Kolbe-Schmitt αντίδραση 21

22 Αντίδραση παρασκευής ασπιρίνης 22

23 Κεφάλαιο 3 Συνδυαστική και Υπολογιστική Χημεία Combinatorial Chemistry 3.1 Εισαγωγή Μερικές από τις περισσότερο ανεπτυγμένες περιοχές της χημείας στην ανακάλυψη και ανάπτυξη φαρμάκων είναι η Συνδυαστική και η Υπολογιστική Χημεία. Η Συνδυαστική Χημεία είναι η χρησιμοποίηση των τεχνικών παράλληλης σύνθεσης για την ενίσχυση της έρευνας, και η Υπολογιστική Χημεία υποστηρίζει καίριες αποφάσεις στην έρευνα, όπως θέτοντας ερωτήσεις τύπου: «Ποιο ανάλογο θα πρέπει να συνθέσουμε;» Στις μέρες μας η παράλληλη ανάπτυξη υλικού και λογισμικού στον τομέα των υπολογιστών, σε συνδυασμό με την ανάπτυξη του Διαδικτύου όσο και τη σχεδίαση και χρήση βάσεων δεδομένων που περιέχουν βιολογικά δεδομένα ανοίγει νέους ορίζοντες στο χώρο της μοριακής σχεδίασης. Οι τεχνικές της Συνδυαστικής Χημείας αναπτύσσονται μέσω διαφόρων αρχών, που περιλαμβάνουν την οργανική, την ιατρική και τη φυσική χημεία, την μηχανική και την ρομποτική, την υπολογιστική χημεία, την πληροφορική και την τεχνολογία σάρωσης. Η συνδυαστική χημεία εκτός των άλλων, έφερε τα πάνω κάτω στην παραδοσιακή χημεία. Απαιτούσε οι χημικοί να σκέφτονται όχι με όρους σύνθεσης απλών, καλά χαρακτηριζόμενων αναλόγων, αλλά με όρους ταυτόχρονης σύνθεσης μεγάλων πληθυσμών αναλόγων. Τα συστήματα πληροφοριών ως τότε, ασχολούνταν ουσιωδώς μόνο με ένα μόριο τη φορά. Αντί να φτιάχνουν ένα συγκεκριμένο ανάλογο και μετά να κάνουν μια περιορισμένη ποσότητα διαχωρισμού, οι χημικοί δημιουργούν μια τεράστια ποσότητα πληροφορίας. Έτσι έχουμε έναν μεμονωμένο χημικό που στην πραγματικότητα είναι πολύ περισσότερο παραγωγικός, αλλά με έναν λιγότερο ακριβή τρόπο. Όταν πρωτοξεκίνησε η Συνδυαστική Χημεία εστίαζε στη σύνθεση μεγάλων μορίων, κυρίως πεπτιδίων και ολιγονουκλεοτιδίων. Πιο πρόσφατα, η έμφαση μεταστράφηκε σε μη πεπτιδικά μικρά μόρια-αυτά με μοριακά βάρη μικρότερα των 500 dalton. 23

24 Παράλληλα μερικοί παρατηρητές διαπίστωσαν μια μεταστροφή της έμφασης από την πλήρη ποσότητα στη μεγαλύτερη επιλεκτικότητα. Όταν για παράδειγμα η Συνδυαστική Χημεία άρχισε να γίνεται δημοφιλής, ένας αριθμός ανθρώπων μιλούσε για την αξία της τεχνολογίας στην προσπάθεια της δημιουργίας εκατομμυρίων ή ακόμα και δισεκατομμυρίων αναλόγων. Καθώς οι χημικές εταιρείες συνέθεταν το ένα μόριο μετά το άλλο στην έρευνα για τη διαλογή των υποψήφιων φαρμάκων, χρειάζονταν να έχουν αρχεία του τι είχαν συνθέσει οι χημικοί τους. Γι αυτό το λόγο, οι πρώτες εκδόσεις των συστημάτων διαχείρισης πληροφοριών στόχευαν στη δημιουργία εμπορικών βάσεων δεδομένων μεμονωμένων αναλόγων, σε μορφές που θα διευκόλυναν τους ερευνητές να ανατρέξουν στις βάσεις δεδομένων με διάφορους τρόπους. Οι σύγχρονες βάσεις βιολογικών μορίων περιλαμβάνουν χιλιάδες τρισδιάστατες δομές. Ο σχεδιασμός φαρμάκων είναι μια επαναληπτική διαδικασία η οποία ξεκινά με μια ένωση η οποία παρουσιάζει ένα ενδιαφέρον βιολογικό προφίλ και καταλήγει με τη βελτιστοποίηση του προφίλ δράσης του μορίου και της χημικής του σύνθεσης. Η διαδικασία τίθεται σε εφαρμογή όταν ο χημικός συλλαμβάνει μια υπόθεση που συσχετίζει τα χημικά χαρακτηριστικά του μορίου (ή σειράς μορίων) με τη βιολογική δράση. Η βιολογική δράση είναι το αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης επιλεγμένων μοριακών ενώσεων με μια βιολογική οντότητα. Στις κλινικές μελέτες τη βιολογική οντότητα αντιπροσωπεύει ο ανθρώπινος οργανισμός και στις προ-κλινικές δοκιμές είναι τα πειραματόζωα (in vivo) ή τα πειραματικά μοντέλα (in vitro). Η βιολογική δράση εξαρτάται από τη φύση της ένωσης (δομή και φυσικοχημικές ιδιότητες), τη βιολογική οντότητα (είδος, φύλο, ηλικία, κλπ) και τον τρόπο της θεραπείας (δόση, οδός χορήγησης, κλπ). Υπάρχει μια ιεραρχία στις βιολογικές δράσεις η οποία ανταποκρίνεται στη φυσική βιολογική ακολουθία. Οι βιολογικές δράσεις μπορούν να καθορισθούν και να προσδιορισθούν σε επίπεδο οργανισμού, οργάνου/ιστού, και σε κυτταρικό ή μοριακό επίπεδο. Εάν το μόριο ευρίσκεται να έχει διάφορες δράσεις σε διάφορα επίπεδα, οι δράσεις των επιπρόσθετων επιπέδων μπορούν να θεωρηθούν σαν αιτία (μηχανισμός). Προσεγγίσεις για την εκτίμηση των ενώσεων με παρόμοια δράση βασικά στηρίζονται στην ιδέα πως σημαντικές ομοιότητες στη μοριακή δομή και τις ιδιότητες είναι υπεύθυνες για την ίδια βιολογική δράση. Χωρίς μια λεπτομερή κατανόηση των βιοχημικών διαδικασιών που είναι υπεύθυνες για την δράση, η υπόθεση γενικά τελειοποιείται εξετάζοντας δομικές ομοιότητες και διαφορές για δραστικά και μη δραστικά μόρια. Οι ενώσεις επιλέγονται για σύνθεση η οποία μεγιστοποιεί την παρουσία λειτουργικών ομάδων ή χαρακτηριστικών που υποτίθεται πως είναι υπεύθυνα για την δράση. 24

25 Οι συνδυαστικές πιθανότητες αυτής της στρατηγικής ακόμα και για απλά συστήματα μπορεί να είναι εκρηκτικές. Σαν παράδειγμα, ο αριθμός των ενώσεων που απαιτείται για σύνθεση με σκοπό να τοποθετήσουμε 10 υποκατάστατα στις τέσσερις ανοιχτές θέσεις ενός συστήματος διυποκατεστημένου βενζολικού δακτυλίου είναι περίπου Τα περισσότερα φάρμακα σήμερα προκύπτουν με τη διαδικασία του Ορθολογικού Σχεδιασμού (Rational Drug Design) και οι Ποσοτικές Σχέσεις Δομής Δράσης (Quantitative Structure Activity Relationships, QSAR) διαδραματίζουν ένα κεντρικό ρόλο σε αυτή την προσπάθεια. 3.2 Χημειοπληροφορική - Cheminformatics Η Χημειοπληροφορική (Cheminformatics), είναι η εφαρμογή της επιστήμης των υπολογιστών στη χημεία σε όλες τις εκφάνσεις της. Πολλές από τις παρούσες χρήσεις των τεχνικών της Χημειοπληροφορικής είναι στην φαρμακευτική έρευνα. Ωστόσο ένας ορισμός της πληροφορικής της χημείας είναι «η μίξη πηγών πληροφοριών για τη μετατροπή των δεδομένων σε πληροφορία και της πληροφορίας σε γνώση, με σκοπό τη λήψη καλύτερων και γρηγορότερων αποφάσεων στην αρένα της αναγνώρισης και βελτιστοποίησης φαρμάκων.» Τώρα πια η πληροφορική της χημείας εφαρμόζεται σε προβλήματα σε όλο το εύρος της χημείας. Οι χημικοί-πληροφορικοί συχνά εργάζονται με μεγάλες ποσότητες δεδομένων. Κατασκευάζουν πληροφοριακά συστήματα που βοηθούν τους χημικούς να κατανοούν τα δεδομένα, συχνά επιχειρώντας να προβλέψουν επακριβώς τις ιδιότητες χημικών υποκαταστατών από ένα δείγμα δεδομένων. Έτσι, μέσω της εφαρμογής της πληροφορικής τεχνολογίας, η πληροφορική της χημείας βοηθά τους χημικούς να οργανώσουν και να αναλύσουν γνωστά επιστημονικά δεδομένα για να βοηθήσουν στην ανάπτυξη νέων αναλόγων, υλικών και διαδικασιών. Οι επιστήμονες οι οποίοι εργάζονται στην πληροφορική της χημείας μπορεί να εστιάζουν στην μοριακή μοντελοποίηση, στην κωδικοποίηση και την αναζήτηση μοριακών δομών, στην οπτικοποίηση χημικών δεδομένων ή σε ένα μεγάλο αριθμό άλλων περιοχών εξειδίκευσης. Οι μέθοδοι και τα εργαλεία που χρησιμοποιούνται στην Χημειοπληροφορική περιλαμβάνουν: Ποσοτικές Σχέσεις Δομής-Δράσης (Quanitative Structure Activity Relationships, QSAR) Γενετικούς Αλγορίθμους Στατιστικά εργαλεία 25

26 Εργαλεία ανάλυσης δεδομένων Τεχνικές οπτικοποίησης Γλώσσα ιστού χημικά ενήμερη Υπολογιστική Χημεία / Μοριακή Μοντελοποίηση 3.3 Υπολογιστική Χημεία - Μοριακός σχεδιασμός με τη βοήθεια Υπολογιστή Τα περισσότερα φάρμακα σήμερα προκύπτουν διαμέσου του Ορθολογικού Σχεδιασμού (Rational Drug Design) ως αποτέλεσμα μιας κυκλικής διαδικασίας τριών φάσεων: σχεδιασμού, σύνθεσης και δοκιμής. Κεντρικό ρόλο σε αυτή τη διαδικασία διαδραματίζει η Υπολογιστική Χημεία (Computational Chemistry), η οποία συνίσταται στη χρήση των μεθοδολογιών που προσφέρει η σύγχρονη χημεία και η τεχνολογία των υπολογιστών και της πληροφορικής. Τέτοια εργαλεία αποτελούν η μοριακή μοντελοποίηση (molecular modelling), οι υπολογισμοί μοριακών τροχιακών (MO calculations), μοριακής μηχανικής (molecular mechanics) και μοριακής δυναμικής (molecular dynamics), οι αλγόριθμοι αναζήτησης διαμορφώσεων (conformational analysis), οι αλγόριθμοι Ποσοτικών Σχέσεων Δομής-Δράσης (Quantitative Structure-Activity Relationship, QSAR), οι μελέτες Απορρόφησης, Κατανομής, Μεταβολισμού, Απέκκρισης, Τοξικότητας (Abso-rption- Distribution-Metabolism-Excretion-Toxicity, ADMET) και οι μελέτες αγκυροβόλησης στην περιοχή πρόσδεσης του μακρομορίου (docking). Οι μεθοδολογίες αυτές στο σύνολό τους συνιστούν το λεγόμενο Μοριακό Σχεδιασμό με τη Βοήθεια Υπολογιστή (Computer Aided Molecular Design, CAMD). To CAMD αποτελεί δηλαδή ένα συνδυασμό μεθοδολογιών Υπολογιστικής Χημείας και τεχνολογίας της πληροφορίας που μας βοηθούν να ανακαλύψουμε νέα εν δυνάμει φαρμακευτικά προϊόντα με μια σειρά από εύχρηστα εργαλεία. Τα εργαλεία σχεδιασμού φαρμάκων με τη βοήθεια υπολογιστή, μπορούν να δημιουργήσουν πολλά χρήσιμα και ισχυρά μοντέλα, τα οποία επεξηγούν τις παρατηρήσεις Σχέσεων Δομής-Δράσης με έναν ποσοτικό τρόπο. Τα μοντέλα αυτά αυξάνουν κατά πολύ την δυνατότητα απόκτησης πληροφορίας και περαιτέρω αξιοποίησή της. Η απόκτηση πληροφορίας λοιπόν, εξαρτάται κατά πολύ από τους υπολογιστές σήμερα. Με την ενσωμάτωση σύγχρονων αισθητήρων ανίχνευσης στη χημική τεχνολογία, ο όγκος των δεδομένων που μπορεί να παραχθεί είναι τεράστιος. Η μελλοντική τεχνολογία θα ενσωματώνει πληροφορίες από υπάρχουσες βάσεις δεδομένων, θα προσλαμβάνει 26

27 τεχνικές μοντελοποίησης, και θα αναλύει τα πειραματικά δεδομένα κατά την παραγωγή τους. Τέτοια «έξυπνη τεχνολογία» θα βελτιώσει σημαντικά την ικανότητα των χρηστών να παίρνουν έξυπνες αποφάσεις για την πορεία ενός πειράματος, καθώς τα δεδομένα συλλέγονται και αναλύονται. Σήμερα υπάρχουν δύο συμπληρωματικές οδοί για την παραγωγή και τη συλλογή πληροφοριών στις χημικές επιστήμες: ο πειραματισμός και η υπολογιστική προσομοίωση. Παραδοσιακά, η συνάθροιση δεδομένων από πειράματα γινόταν χειροκίνητα, όμως με την ανάπτυξη των αρκετά μικρών υπολογιστών που μπορούσαν να αγορασθούν από μεμονωμένα εργαστήρια, η φράση «οι υπολογιστές στη χημεία» εμφανίσθηκε για να περιγράψει τη χρήση τους. Αρκετές δεκαετίες παλιότερα αυτή η έκφραση σήμαινε την διασύνδεση ενός υπολογιστή σε ένα πείραμα όπως για παράδειγμα ήταν ένα φασματοφωτόμετρο ή ένας χρωματογράφος, και τη συλλογή των δεδομένων σε πραγματικό χρόνο για αποθήκευση και περαιτέρω χειρισμούς. Ενώ αυτό ακόμα γίνεται με τους μικροεπεξεργαστές που περιέχονται στον τεχνολογικό εξοπλισμό, ένας περισσότερο περιγραφικός όρος για το ευρύτατο φάσμα των χημικών δραστηριοτήτων που περιλαμβάνουν υπολογιστές είναι η «Υπολογιστική Χημεία». Η Υπολογιστική Χημεία αναζητά να προβλέψει ποσοτικές μοριακές και βιομοριακές δομές, ιδιότητες και αντιδραστικότητες, με υπολογιστικές μεθόδους μόνο. Χρησιμοποιεί μοντέρνα χημική θεωρία για να προβλέψει την ταχύτητα άγνωστων αντιδράσεων και τις συνθετικές αλληλουχίες μέσω των οποίων πολύπλοκα νέα μόρια μπορούν να γίνουν περισσότερο αποτελεσματικά. Η Υπολογιστική Χημεία δίνει στους χημικούς τη δυνατότητα να εξερευνήσουν το πώς λειτουργούν τα πράγματα σε ατομικά και μοριακά επίπεδα και να εξάγουν συμπεράσματα που είναι αδύνατο να ληφθούν μόνο με πειραματισμό. Με αυτό τον τρόπο η Υπολογιστική Χημεία συμπληρώνει τα δεδομένα που έχουν εξαχθεί πειραματικά. Πιο συγκεκριμένα οι υψηλής τεχνολογίας ηλεκτρονικοί υπολογιστές παρέχουν πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με: 1) την τρισδιάστατη αρχιτεκτονική των μορίων, 2) τις φυσικοχημικές τους ιδιότητες, 3) τη σύγκριση ενός μορίου με άλλα μόρια, 4) τα σύμπλοκα μικρομορίων- μακρομορίων, 5) τις προβλέψεις για νέα μόρια. Παράλληλα έχουν ωριμάσει οι συνθήκες για την επιλεκτική φαρμακευτική στόχευση και σύντομα αναμένεται η συνεισφορά της Βιοπληροφορικής και στο σχεδιασμό νέων φαρμάκων. Ως πρώτος στόχος των επιστημόνων που ασχολούνται με τη σχεδίαση φαρμάκων με τη βοήθεια ηλεκτρονικού υπολογιστή τίθεται η αποτελεσματική απεικόνιση των δομών κανονικών και παθολογικών μορίων τα οποία στη συνέχεια συγκρίνονται με παθογενή ένζυμα και ενεργούς υποδοχείς αντίστοιχα οπότε και καθορίζεται ο στόχος σχεδιασμού. 27

28 Έτσι αν γνωρίζουμε τη δομή μιας πρωτεΐνης και τον τρόπο που ο υποδοχέας ή η ενεργός περιοχή της δρα, μπορούμε να «χτίσουμε» και να προσομοιώσουμε την προσάραξη τους στην οθόνη του ηλεκτρονικού υπολογιστή εξοικονομώντας τον χρόνο και το κόστος που θα απαιτούσαν αντίστοιχες πειραματικές δοκιμές. Παράλληλα μπορούμε να ανακαλύπτουμε νέες ενώσεις και να τις μοντελοποιούμε προκειμένου να διερευνούμε παραγόμενα συνθετικά ανάλογα και την πιθανή δραστικότητά τους. Και στις δύο περιπτώσεις η μοριακή σχεδίαση είναι ουσιώδης για την κατανόηση και διερεύνηση της σχέσης δομής - δράσης. Αυτό βέβαια δε σημαίνει ότι καταργούμε τα in-vitro πειράματα, γιατί αρκετές φορές τα αποτελέσματα δεν είναι τα αναμενόμενα Ορθολογικός Σχεδιασμός Φαρμάκων, Εικόνα από mmlab.ceid.upatras.gr/bioinfo/slide6.pptx Οι ενώσεις-οδηγοί (lead compounds) είναι ενώσεις από τις οποίες με κατάλληλες τροποποιήσεις της δομής είναι δυνατόν να προκύψουν νέα παράγωγα με βελτιωμένες ιδιότητες που θα αποτελέσουν νέα φαρμακευτικά προϊόντα. Η ένωση-οδηγός φέρει στο μόριό της το φαρμακοφόρο, συγκεκριμένες δηλαδή χαρακτηριστικές ομάδες με καθορισμένη στερεοδιάταξη, η παρουσία των οποίων είναι αναγκαία, όχι όμως πάντοτε και ικανή συνθήκη για την εμφάνιση φαρμακολογικής δράσης. Η βελτιστοποίηση μιας ένωσης-οδηγού αποτελεί μία εξελικτική διαδικασία στην 28

29 οποία κάθε μικρή ή μεγάλη βελτίωση ορισμένων ιδιοτήτων οδηγεί σε ένα νέο ανάλογο, το οποίο βελτιστοποιείται περαιτέρω έως ότου η τελική υποψήφια ένωση αποκτήσει όλες τις επιθυμητές ιδιότητες για να αρχίσει η σχετική κλινική έρευνα. Μια άποψη της Υπολογιστικής Χημείας είναι η μοριακή μοντελοποίηση. Η μοριακή μοντελοποίηση εμπλέκεται στην αναζήτηση τρισδιάστατων μοριακών δομών χρησιμοποιώντας κλασσικές και κβαντικές μηχανικές μεθόδους υποβοηθούμενη από γραφικά υπολογιστών. Άλλες τεχνικές μοριακής μοντελοποίησης περιλαμβάνουν ποσοτικές σχέσεις δομής- ιδιότητας, οι οποίες βρίσκουν εφαρμογή στον σχεδιασμό φαρμάκων βάσει δομής, στην αναζήτηση ομοιότητας και στην πρόβλεψη μοριακής διαμόρφωσης. Οι τεχνικές της μοριακής μοντελοποίησης αξιοποιούνται εκτενώς στην φαρμακευτική έρευνα, ιδιαίτερα στην πρόβλεψη των φαρμακοφόρων- των ιδιαίτερων διαμορφώσεων των μορίων που απαιτούνται για συγκεκριμένες βιολογικές δράσεις. Έτσι, οι καλύτεροι τύποι θέσης και προσαρμογής των αναλόγων μελετώνται για τις περισσότερο ευνοϊκές διαμορφώσεις με βάση τις ενεργειακές θεωρήσεις. Αυτή η δραστική-αναλογική προσέγγιση βοηθά στο σχεδιασμό παρόμοιων υποκαταστατών ενός συνόλου αναλόγων που αναμένεται να έχει την επιθυμητή δράση. 3.4 Ποσοτική σχέση Δομής Δράσης (QSAR) στο σχεδιασμό Φαρμάκων Η δομή κάθε μορίου καθορίζεται από τη δομή του ηλεκτρονιακού νέφους που το περιβάλλει. Κάθε μικρή περιοχή ενός μη περιορισμένου ηλεκτρονιακού νέφους ενός μορίου περιέχει τη συνολική πληροφορία της ηλεκτρονιακής πυκνότητας, οπότε μπορεί να καθορίσει πλήρως τις ιδιότητες του μορίου. Η εναλλακτική σε αυτή την εντατική εργαστηριακή προσέγγιση στη βελτιστοποίηση της ένωσης, είναι η ανάπτυξη μιας θεωρίας η οποία συσχετίζει ποσοτικά τις διακυμάνσεις στην βιολογική δράση με τις αλλαγές στους μοριακούς τύπους που μπορούν να ληφθούν εύκολα για κάθε ένωση. Μια Ποσοτική Σχέση Δομής Δράσης (QSAR) μπορεί έπειτα να χρησιμοποιηθεί για να βοηθήσει την κατεύθυνση της χημικής σύνθεσης. Η ποσοτική σχέση δομής δράσης (QSAR) είναι μια μαθηματική αναπαράσταση της βιολογικής δράσης μιας σειράς ομόλογων μορίων με όρους δομικών χαρακτηριστικών. Ο κύριος σκοπός της QSAR είναι να αναζητήσει νέα μόρια με τις απαιτούμενες ιδιότητες χρησιμοποιώντας τη χημική διαίσθηση και εμπειρία μετασχηματισμένες σε μια μαθηματικά ποσοτικοποιημένη και υπολογισμένη μορφή. Αφού επαληθευθεί ένας συσχετισμός, μπορεί να προβλεφθεί η δομή οποιουδήποτε αριθμού ενώσεων με τις επιθυμητές ιδιότητες. Έτσι η μεθοδολογία QSAR αποθηκεύει τις πηγές και επισπεύδει τη 29

30 διαδικασία ανάπτυξης νέων μορίων και φαρμάκων. Η επιτυχία της QSAR στην ανάπτυξη νέων μορίων φαρμάκων και στην πρόβλεψη της τοξικότητας μορίων είναι υψηλής σημασίας. Τα μοντέλα ποσοτικών σχέσεων δομής-δράσης (QSAR) έχουν αποδείξει τη χρησιμότητά τους τόσο από τη φαρμακευτική όσο και από την τοξικολογική τους πλευρά, για αναγνώριση χημικών ενώσεων που μπορεί να αλληλεπιδρούν με τους πυρηνικούς υποδοχείς. Προσφέρουν αρκετά επιπρόσθετα πλεονεκτήματα πέραν της πρόγνωσης: χρήση των υπαρχόντων δεδομένων δομής-δράσης, παρέχουν βαθιά γνώση των μηχανισμών δράσης (π.χ. αγωνιστές έναντι ανταγωνιστών) ή αναγνωρίζουν εναλλακτικούς μηχανισμούς (π.χ. μεταβολισμός), αναγνωρίζουν βασικές δομικές διαμορφώσεις που συνδέονται με υψηλή/χαμηλή δράση, προτείνουν νέες στρατηγικές σχεδιασμού και στόχους σύνθεσης, περιορίζουν τη διακύμανση της δόσης για μια σχεδιασμένη χημική ανάλυση, βοηθούν στη δημιουργία νέων υποθέσεων για περαιτέρω έρευνα, αποκαλύπτουν χημικές ενώσεις που αποκλίνουν από το μοντέλο QSAR και, ως εκ τούτου, από το δεδομένο βιολογικό μοντέλο. Βασικά, τα μοντέλα QSAR αναθέτουν σε ποσοτικές μεθόδους απόκλισης να συσχετίσουν και να εκλογικεύσουν διακυμάνσεις στη βιολογική δράση μιας δομικά συσχετισμένης σειράς χημικών ενώσεων με παραλλαγές στις μοριακές τους δομές, όπως κωδικοποιούνται στις προεπιλεγμένες ποσότητες, κοινώς γνωστές σαν μοριακά χαρακτηριστικά. Η βασική υπόθεση που ενυπάρχει σε κάθε μοντέλο QSAR, είναι ότι οι φυσικές και χημικές ιδιότητες μιας χημικής ένωσης καθώς και η βιολογική της δράση υποστηρίζονται από τη δομή της. Φυσικές και χημικές ιδιότητες, καθώς και δεδομένα βιολογικής δράσης αποθηκεύονται σε μια βάση γνώσης, μια βιβλιοθήκη χαρακτηριστικών, μια βάση δεδομένων διαχείρισης πληροφοριών. Η διαχείριση πληροφοριών είναι ένα κρίσιμο σημείο όλων των ουσιωδών βημάτων που εμπλέκονται σε ένα έργο συνδυαστικής σύνθεσης. Τυπικά, ένα έργο ξεκινά με τον σχεδιασμό μιας χημικής βιβλιοθήκης. Η βιβλιοθήκη είναι ένας πληθυσμός μορίων που θα παραχθούν σαν ξεχωριστά ανάλογα ή σαν μίγματα αναλόγων, που μπορούν να σαρωθούν βιολογικά για δραστικότητα έναντι ενός επιθυμητού στόχου. Από το στάδιο του σχεδιασμού, το έργο συνεχίζει με την κατασκευή της βιβλιοθήκης από τη συνδυαστική σύνθεση στη σάρωση αναλόγων, την αρχειοθέτηση των δεδομένων και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων. 30

31 Προβλήματα η απουσία ενός γενικού και ενιαίου εργαλείου σχεδίασης μοριακών δομών που να περιλαμβάνει το σύνολο των βιολογικών μορίων, η αυξημένη υπολογιστική πολυπλοκότητα που εκφράζεται σε χρόνο και απαιτούμενους πόρους και η οποία αυξάνει εκθετικά με την αύξηση του μεγέθους του υπό εξέταση μορίου, η επιλογή του κατάλληλου μοντέλου αναπαράστασης (ανάλογα πάντα με το βιολογικό μόριο) και ο καθορισμός των κρίσιμων παραμέτρων (π.χ.: γεωμετρικές συντεταγμένες) που πρέπει να εξεταστούν ειδικότερα σε επίπεδο διανυσματικής γεωμετρίας, η αντιμετώπιση των σφαλμάτων στα δεδομένα εισόδου και η ανακατασκευή ενός τρισδιάστατου μοντέλου από ελλιπή ή λανθασμένα δεδομένα. 3.5 Διαχείριση Πληροφορίας-Κατασκευή Χημικών Βιβλιοθηκών Η διαχείριση πληροφοριών είναι ένα κρίσιμο σημείο όλων των ουσιωδών βημάτων που εμπλέκονται σε ένα έργο συνδυαστικής σύνθεσης. Τυπικά, ένα έργο ξεκινά με ένα σχεδιασμό μιας χημικής βιβλιοθήκης. Η βιβλιοθήκη είναι ένας πληθυσμός μορίων που θα παραχθούν σαν ξεχωριστά ανάλογα ή σαν μίγματα αναλόγων που μπορούν να σαρωθούν βιολογικά για δραστικότητα έναντι ενός επιθυμητού στόχου. Από το στάδιο του σχεδιασμού, το έργο συνεχίζει με την κατασκευή της βιβλιοθήκης από τη συνδυαστική σύνθεση στη σάρωση αναλόγων, την αρχειοθέτηση των δεδομένων και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Συνεπώς, η βιβλιοθήκη είναι μια κεντρική ιδέα στην συνδυαστική χημεία. Ο σχεδιασμός της εξαρτάται από τον σκοπό χρήσης της, είτε για ευρεία σάρωση για αρχική δημιουργία, ή στην όπως καλείται χημική αναλογοποίηση για κατευθυνόμενη βελτιστοποίηση. Αυτά τα δύο είναι διαφορετικά στη φύση τους και παρουσιάζουν διαφορετικές ανάγκες διαχείρισης της πληροφορίας. Για παράδειγμα, μια βιβλιοθήκη αρχικής δημιουργίας τείνει να είναι πολύ μεγάλη με ευρεία δομική ποικιλία. Μια βιβλιοθήκη κατευθυνόμενης βελτιστοποίησης από την άλλη, θα είναι ενός μετρίου μεγέθους, με περισσότερο περιορισμένη δομική ποικιλία. Μια σχεδιαστική προσέγγιση είναι η δημιουργία μιας ουσιαστικής εικονικής βιβλιοθήκης. Ένας χημικός, θα μπορούσε για παράδειγμα να δημιουργήσει σε έναν εικονικό χώρο-σε έναν υπολογιστή- όλα τα ανάλογα που θα παρήγαγε μια δοθείσα σύνθεση. Αυτά θα 31

32 μπορούσαν να συγκριθούν με ήδη συντεθιμένα ανάλογα-σε μια εμπορική βάση δεδομένων -ή με άλλες εικονικές βάσεις δεδομένων, ψάχνοντας για τα ανάλογα που είναι τα περισσότερο ή λιγότερο ποικίλα. Αυτά στη συνέχεια θα μπορούσαν να συντεθούν σε ένα εργαστήριο. Ή ο χημικός θα μπορούσε να επιλέξει κάποιες συγκεκριμένες ιδιότητες - όπως το logp (συντελεστής κατανομής οκτανόλης) ή το μοριακό βάρος, για παράδειγμαγια να λειτουργήσουν ως φίλτρα για την εικονική βιβλιοθήκη με σκοπό να την περιορίσουν στην συγκεκριμένη βιβλιοθήκη που χρειάζεται να συντεθεί στο εργαστήριο. Μέρος της διαδικασίας σχεδιασμού είναι ο καθορισμός του κόστους και της διαθεσιμότητας των αντιδραστηρίων που χρειάζονται σαν δομικοί λίθοι. Κατά συνέπεια, οι διαθέσιμες βάσεις χημικών δεδομένων γι αυτή τη χρήση, είναι ένα σημαντικό στοιχείο για τη διαχείριση πληροφοριών για το συγκεκριμένο έργο. Η σύνθεση καθ εαυτού, όταν σχεδιάζεται μια βιβλιοθήκη, παίρνει σχετικά λίγο χρόνο. Η διαχείριση πληροφοριών σε αυτό το στάδιο παίζει κάποιο ρόλο με την αρχειοθέτηση πορείας αντιδράσεων για χρήση στην συχνά απαραίτητη επανασύνθεση. Και καθώς αρκετά από τα βήματα σύνθεσης είναι αυτοματοποιημένα, με τους ρομποτικά συστήματα να βγάζουν εις πέρας τους χειρισμούς, η διαχείριση πληροφοριών έχει έναν περαιτέρω ρόλο στον έλεγχο του εξοπλισμού και τον προσπορισμό των δεδομένων. Όταν τα ανάλογα συντεθούν υφίστανται υψηλή-, μέτρια- ή ήπια- σάρωση, που περιλαμβάνει, για παράδειγμα, in vitro, κυτταρικούς και ιστολογικούς βιολογικούς προσδιορισμούς. Έτσι η απόκτηση δεδομένων βιολογικών προσδιορισμών είναι άλλο ένα συστατικό της εικόνας διαχείρισης πληροφοριών. Και η αρχειοθέτηση και ο συσχετισμός όλων των πληροφοριών που παράγονται από ένα συνδυαστικό έργο είναι ένα προφανές βήμα στη διαχείριση πληροφοριών που βοηθά στην ανάλυση και την ερμηνεία. Η Υπολογιστική Χημεία χρησιμοποιείται για το σχεδιασμό συνδυαστικών βιβλιοθηκών. Για παράδειγμα, στατιστικές τεχνικές όπως η ανάλυση Ποσοτικών Σχέσεων Δομής-Δράσης (QSAR) μπορούν να χρησιμοποιηθούν με σκοπό τη στοχευμένη επιλογή αναλόγων με τις απαιτούμενες διαμορφώσεις, και για ευρύτερες βιβλιοθήκες, τεχνικές όπως η Ανάλυση Κύριας Συνιστώσας ( Principal Component Analysis, PCA) μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εξασφάλιση όσο το δυνατόν μεγαλύτερου εύρους αναλόγων στη βιβλιοθήκη. Τα συστατικά στοιχεία εδώ μπορεί να είναι δραστικότητες, ιδιότητες ή υποδομές ενός μορίου. Στις Ποσοτικές Σχέσεις Δομής-Δράσης (QSAR) η στατιστική συσχέτιση ερευνάται μεταξύ μιας δραστικότητας ή μιας ιδιότητας και γεωμετρικών ή χημικών χαρακτηριστικών ( φαρμακοφόρων) του μορίου. Ένα από τα πράγματα που οι άνθρωποι αρχίζουν τώρα να εκτιμούν, είναι ότι η σάρωση μεγάλων βιβλιοθηκών δημιουργεί τεράστιες ποσότητες δεδομένων, κυρίως δεδομένων σχέσεων Δομής-Δράσης (SAR) και Ποσοτικών Σχέσεων Δομής-Δράσης (QSAR). 32

33 Οι διάφορες βιβλιοθήκες αναλόγων αντικαθίστανται από μικρότερες, πιο συγκεκριμένες βιβλιοθήκες. Οι ερευνητές βασίζονται στο λογισμικό για να πραγματοποιήσουν την μοριακή μοντελοποίηση η οποία, ελπίζουν πως θα αυξήσει την πιθανότητα να βρουν τα κατάλληλα προς ανάπτυξη μόρια73. Η πρόοδος στις εφαρμογές που βασίζονται στη δομή έχει οδηγήσει στη δημιουργία ολοκληρωμένων χημικών πληροφοριακών συστημάτων και σε εξειδικευμένες εφαρμογές όπως είναι τα Συστήματα Διαχείρισης Πληροφορίας Εργαστηρίου (Labotarory Information Management Systems, LIMS). Μια από τις πραγματικές προκλήσεις είναι η μεγιστοποίηση των πλεονεκτημάτων των βιβλιοθηκών με την σύλληψη των δεδομένων και την κατασκευή μοντέλων SAR και QSAR. Καθώς ο χρόνος περνά τέτοια μοντέλα θα αποδειχθούν πολύ ευεργετικά στην βελτιστοποίηση οδηγών ενώσεων και στην πιο γρήγορη λήψη ενός αναλόγου με την επιθυμητή βιολογική δράση, και τις ελάχιστες παρενέργειες, και ούτω καθ εξής. Οι προσπάθειες ανακάλυψης φαρμάκων μέσω πληροφοριακών βάσεων δεδομένων δείχνουν να υπόσχονται πολλά στην αναζήτηση συσχετίσεων μεταξύ του προφίλ των φαρμάκων και πιθανών θεραπευτικών παραγόντων. Η επέκταση αυτών των προσπαθειών με περαιτέρω διερεύνηση των σχέσεων μεταξύ του προφίλ και της χημικής δομής, μπορεί να προάγει την ανακάλυψη νέων χημειοθεραπευτικών παραγόντων. 33

34 Κεφάλαιο 4 Εξέλιξη των Φαρμάκων 4.1 Η Φαρμακευτική Έρευνα μέχρι το 1990 Το 1850 το 80% των φαρμάκων προερχόταν από φυτά. Σήμερα με την κυριαρχία της χημικής φαρμακοβιομηχανίας, μόνο το 20-30% των φαρμάκων παρασκευάζονται από φυτά. Μέχρι το 1990 η ανακάλυψη των φαρμάκων στηριζόταν στην επεξεργασία πληροφοριών και τυχαίων παρατηρήσεων καθώς και στη μελέτη φυσικών προϊόντων με σκοπό τον προσδιορισμό νέων βιοδραστικών ενώσεων. Ο σχεδιασμός βασιζόταν σε πληροφορίες από την συστηματική μελέτη των βιολογικών στόχων (μεμβράνες, πρωτεΐνες, κλπ) και των ιδιοτήτων τους. Εικόνα από ifet.gr 11 Mαρτίου 2005, Πανελλήνια ημέρα Χημείας. 34

35 Μετά την αποσαφήνιση της δομής μιας νέας βιοδραστικής ένωσης ακολουθεί η εργαστηριακή σύνθεση του βασικού μορίου, καθώς και παραγώγων της ένωσης (βιβλιοθήκες βιοδραστικών παραγώγων) με στόχο τη βελτίωση ή τη διερεύνηση της δράσης. Οι συνθετικές βιοδραστικές ενώσεις που παρουσιάζουν χαμηλή τοξικότητα προκρίνονται για κλινικές δοκιμές και εισέρχονται στη διαδικασία της επεξεργασίας (processing). Οι ενώσεις αυτές χαρακτηρίζονται ως ουσίες-οδηγοί (leading compounds). Στη φάση αυτή γίνονται πολλές παράλληλες έρευνες που αφορούν στη διεξοδική μελέτη της σύνθεσης ( παρασκευής) της δραστικής ένωσης με παράλληλες πορείες, στη μελέτη όλων των παραπροϊόντων των σταδίων της σύνθεσης και στην εξέταση της καθαρότητας ανά στάδιο, καθώς επίσης και στην αποφυγή των απαγορευμένων διαδικασιών, έτσι ώστε να επιλεχθούν οι τελικές μέθοδοι που θα περάσουν σε παραγωγή μεσαίας κλίμακας (scale-up, pilot plan). Παράλληλα γίνεται συστηματική έρευνα για την καταλληλότερη χορήγηση και την αποτελεσματικότερη φαρμακευτική του σκευάσματος (ενέσιμο, χάπι, ενκαψυλιωμένο, διαδερμικό, κλπ) και διεξάγονται μελέτες βιοδιαθεσιμότητας. Όλα τα νέα παρασκευάσματα μελετώνται βιοχημικά και τοξικολογικά, ενώ τα τελικά προϊόντα δοκιμάζονται in vitro και ακολούθως in vivo σε πειραματόζωα και τέλος σε εθελοντές. Τα στάδια αυτά της παραγωγικής διαδικασίας είναι γνωστά ως Φάση Ι, Φάση ΙΙ κλπ. Μετά την επιτυχή δοκιμασία σε όλες αυτές τις φάσεις ακολουθεί η κατάθεση φακέλου στον αντίστοιχο Εθνικό Οργανισμό Φαρμάκων της χώρας διάθεσης του φαρμάκου για την απόκτηση άδειας κυκλοφορίας (lisencing). Στην παρακάτω εικόνα δίνονται τα διάφορα στάδια κατά την ανάπτυξη ενός φαρμάκου. Εικόνα από ifet.gr 11 Mαρτίου 2005, Πανελλήνια ημέρα Χημείας. 35

36 Ανακάλυψη δραστικής ουσίας: Στη φάση αυτή γίνεται έρευνα και θέτονται οι πρωτεϊνικοί στόχοι τους οποίους θα σημαδέψουν τα υποψήφια φάρμακα. Εδώ γίνεται σύνθεση χημικών ουσιών, και όσες από αυτές δείξουν υποσχόμενα αποτελέσματα περνούν στη φάση των προκλινικών δοκιμών. Προκλινικές δοκιμές: Στη φάση αυτή οι δραστικές ουσίες που διακρίθηκαν στο προηγούμενο στάδιο υποβάλλονται σε βιολογικές δοκιμές, όπου εξετάζονται ως προς τη σύνθεση, τη σταθερότητα και την τοξικότητα, σε κυτταρικό επίπεδο αρχικά και μετά σε κατάλληλα πειραματόζωα. Πάλι όσες από αυτές δείξουν επιθυμητά αποτελέσματα λαμβάνουν έγκριση να περάσουν στη φάση των κλινικών δοκιμών. Κλινικές δοκιμές: Στη φάση αυτή οι ουσίες χορηγούνται σε υγιείς εθελοντές και ασθενείς, ώστε να εξεταστούν ως προς την αποτελεσματικότητα, την τοξικότητα, τη δοσολογία και τέλος τα αποτελέσματα από μακροχρόνια χρήση. Στο στάδιο αυτό γίνεται και η ονοματολογία της δραστικής ουσίας (και από δραστική ουσία ονομάζεται «φάρμακο»). Όσα φάρμακα επιτύχουν σε αυτή τη φάση, αν λάβουν έγκριση από τις αρμόδιες αρχές, θα παραχθούν και θα μπορούν να προσφερθούν σε ιατρούς και τους ασθενείς τους με σκοπό την αντιμετώπιση ασθενειών. Διάθεση του φαρμάκου στην αγορά και παρακολούθηση του. Εικόνα από ifet.gr «Γ. Δημόπουλος: Ο ρόλος της Χημείας στην Ανάπτυξη νέων φαρμάκων» 36

37 4.2 Διαδικασίες έρευνας και ανάπτυξης νέων φαρμάκων Οι ανακαλύψεις της τελευταίας δεκαετίας στους τομείς της βιολογίας (Proteomics, genomics) της βιοτεχνολογίας (High Throughput Screening, HTPS) της χημείας (Combinatorial Chemistry) και της πληροφορικής (αυτοματοποίηση, μοντελοποίηση) έχουν αλλάξει ριζικά την διαδικασία έρευνας και ανάπτυξης στον τομέα του φαρμάκου. Από την εποχή της τυχαίας ανακάλυψης από γενικές παρατηρήσεις και μελέτη των φυσικών προϊόντων και της βραδείας ανάπτυξης με παραδοσιακή χημεία και βιολογία έχουμε περάσει σήμερα στην εποχή της συστηματικής μελέτης των φαρμακευτικών στόχων (πρωτεϊνες, RNA, κλπ) και των βιοδραστικών χημικών δομών (πιθανές φαρμακευτικές ουσίες) Στόχος της δραστικής ουσίας Αρχικά πρέπει να οριστεί ο στόχος του φαρμάκου, δηλαδή η κυτταρική ή μοριακή δομή στην οποία αυτό θα δράσει. Οι στόχοι χωρίζονται σε δύο διακριτές κατηγορίες: υπάρχοντες και νέοι. Οι υπάρχοντες στόχοι είναι αυτοί για τους οποίους υπάρχει αρκετή αλλά όχι πλήρη επιστημονική κατανόηση, και αρκετή βιβλιογραφία σχετικά με τον τρόπο που ενεργούν φυσιολογικά και παθολογικά. Όσο περισσότερες γνώσεις υπάρχουν για τον στόχο τόσο μικρότερη χρηματική και χρονική επένδυση χρειάζεται για την εξέλιξη της θεραπείας. 37

38 Οι νέοι στόχοι είναι όλοι αυτοί για τους οποίους δεν υπάρχουν αρκετές γνώσεις και έτσι ξεκινά η διαδικασία της ανακάλυψης του φαρμάκου. Αυτά συνήθως περιλαμβάνουν πρωτεΐνες που ανακαλύφθηκαν πρόσφατα, ή πρωτεΐνες η λειτουργία των οποίων έγινε πρόσφατα γνωστή ως αποτέλεσμα βασικής επιστημονικής έρευνας Προσυμπτωματικός έλεγχος και σχεδιασμός (screening and design) Η διαδικασία της ανακάλυψης ενός φαρμάκου ενάντια σε έναν επιλεγμένο στόχο για μια συγκεκριμένη ασθένεια συνήθως περιλαμβάνει προσυμπτωματικό έλεγχο, όπου μεγάλος αριθμός χημικών δοκιμάζεται ως προς τη δυνατότητα του να τροποποιήσει τον εκάστοτε στόχο. Άλλη μια λειτουργία του προσυμπτωματικού ελέγχου είναι να δείξει πόσο επιλεκτικά είναι τα χημικά για τον επιλεγμένο στόχο. Το ιδανικό είναι να βρεθεί μία ουσία η οποία αντιδρά μόνο με το συγκεκριμένο στόχο και όχι άλλους. Σε περίπτωση που η ουσία αντιδρά και με άλλους στόχους, είναι πολύ πιθανό να προκαλέσει μεγάλα επίπεδα τοξικότητας όταν το φάρμακο φτάσει στη φάση των κλινικών δοκιμών όπου θα δοκιμάζεται σε ανθρώπους. Η διαδικασία αυτή θα χρειαστεί επαναληπτικές δοκιμές, κατά τις οποίες, ευελπιστούμε ότι οι ιδιότητες των ουσιών που χρησιμοποιήθηκαν θα βελτιωθούν, και θα καταφέρουν να φτάσουν για δοκιμές in vitro (πειράματα που πραγματοποιούνται σε αυστηρά ελεγχόμενες συνθήκες έξω από τους ζωντανούς οργανισμούς) και in vivo (πειράματα που πραγματοποιούνται σε ιστούς εντός ζώντος οργανισμού). Ο σχεδιασμός του φαρμάκου, όπου μελετώνται οι βιολογικές και φυσικές ιδιότητες του, είναι εξίσου σημαντικός με την εξέλιξη του διότι μπορεί να γίνει μία πρόβλεψη του τύπου των χημικών που θα χρειαστούν. Μόλις επιλεγεί μια σειρά ουσιών με τα απαιτούμενα χαρακτηριστικά, μία ή δύο ουσίες θα προταθούν για το στάδιο της εξέλιξης του φαρμάκου. Αξίζει να αναφερθεί ότι οι πηγές για καινοτόμες χημικές δομές που εξελίσσονται για την αντιμετώπιση κάποιων αντιβακτηριδιακών θεραπειών, συχνά προέρχονται από φυσικές ουσίες. Οι ουσίες αυτές μπορεί να είναι από φυτά, μικρόβια, θαλάσσια ασπόνδυλα, κτλ Προκλινικές δοκιμές Το στάδιο προκλινικών δοκιμών, αφορά την έρευνα που λαμβάνει χώρα πριν τις κλινικές δοκιμές (όπου γίνονται δοκιμές σε ανθρώπους) και συλλέγονται σημαντικά στοιχεία σχετικά με τη σκοπιμότητα, την επαναληπτική δοκιμασία και την ασφάλεια. Ο βασικός στόχος των προκλινικών δοκιμών είναι ο προσδιορισμός του προφίλ ασφαλείας του εκάστοτε προϊόντος. Τα προϊόντα αυτά μπορεί να είναι νέες ή βελτιωμένες ιατρικές συσκευές, φάρμακα, κτλ. Κάθε είδος προϊόντος διερευνάται με διαφορετικό τρόπο. Για 38

39 παράδειγμα, τα φάρμακα υποβάλλονται σε δοκιμές φαρμακοδυναμικής (PD), φαρμακοκινητικής (PK) και τοξικότητας σε πειραματόζωα. Τα στοιχεία που συλλέγονται επιτρέπουν στους ερευνητές να καθορίσουν μία ασφαλή αρχική δόση του φαρμάκου για χρήση στις κλινικές δοκιμές. Οι έρευνες για την τοξικότητα ενός φαρμάκου συγκεντρώνονται κατά κύριο λόγο στα όργανα τα οποία στοχεύει το φάρμακο, καθώς και τις μακροχρόνιες παρενέργειες σχετικά με την καρκινογένεση. Οι πληροφορίες οι οποίες αποκομίζονται από αυτές τις έρευνες είναι καθοριστικές για την έναρξη των δοκιμών στον άνθρωπο. Συνήθως οι δοκιμές σε πειραματόζωα περιλαμβάνουν τη χρήση δύο διαφορετικών ειδών. Αυτά που χρησιμοποιούνται συνήθως είναι ποντίκια και σκυλιά, ενώ σε κάποιες περιπτώσεις χρησιμοποιούνται πίθηκοι ή γουρούνια. Η επιλογή του είδους σχετίζεται άμεσα με τις ομοιότητες που θα έχει η επίδραση του φαρμάκου στον άνθρωπο. Τα σκυλιά για παράδειγμα δεν είναι καλά πειραματόζωα για φάρμακα τα οποία χορηγούνται από το στόμα λόγω του πεπτικού τους συστήματος. Επίσης τα τρωκτικά δεν είναι κατάλληλα για αντιβιοτικά φάρμακα επειδή τους προκαλούν δυσμενή αποτελέσματα στην εντερική περιοχή. Αναλόγως τη λειτουργία του φαρμάκου, μπορεί να μεταβολιστεί με παρόμοιο ή εντελώς διαφορετικό τρόπο ανάμεσα στα διάφορα είδη, επηρεάζοντας τόσο την αποτελεσματικότητα όσο και την τοξικότητα. Οι περισσότερες έρευνες διεξάγονται σε πειραματόζωα μεγαλύτερου μεγέθους όπως σκύλοι, γουρούνια και πρόβατα, τα οποία επιτρέπουν τη δοκιμασία σε όργανα με μέγεθος παραπλήσιο των ανθρωπίνων. Βασισμένα σε κλινικές δοκιμές, ορίζονται τα επίπεδα μη παρατηρήσιμων παρενεργειών (No Observable Effect Level, NOEL) τα οποία χρησιμεύουν στην εύρεση της δοσολογίας των κλινικών δοκιμών. Σε γενικές γραμμές περιλαμβάνεται ένα περιθώριο ασφαλείας της τάξεως του 1/100 το οποίο οφείλεται σε διαφορές μεταξύ των ειδών και των ασθενών. Οι δοκιμές με χρήση πειραματόζωων έχουν περιοριστεί τα τελευταία χρόνια για ηθικούς και χρηματικούς λόγους. Πολλές έρευνες όμως συνεχίζουν να χρησιμοποιούν πειραματόζωα για τις δοκιμές τους, λόγω των απαραιτήτων για την εξέλιξη του φαρμάκου ανατομικών και φυσιολογικών ομοιοτήτων Κλινικές δοκιμές Οι κλινικές δοκιμές αφορούν ένα σύνολο διαδικασιών στην ιατρική έρευνα και την εξέλιξη φαρμάκων, οι οποίες θα προσφέρουν χρήσιμα δεδομένα συσχετισμένα με την ασφάλεια και την αποτελεσματικότητα κάθε ιατρικής παρέμβασης. Οι δοκιμές αυτές λαμβάνουν χώρα μόνο αν η συλλογή πληροφοριών κατά τις προκλινικές δοκιμές είναι ικανοποιητική και λάβει έγκριση από τις αρχές της χώρας στην οποία εξελίσσεται το φάρμακο. 39

40 Αναλόγως το είδος του φαρμάκου και το στάδιο της εξέλιξης, οι ερευνητές επιστρατεύουν αρχικά λίγους υγιείς εθελοντές και/ή ασθενείς, στους οποίους δοκιμάζονται οι διάφορες λύσεις που έχουν προκύψει από τις προκλινικές δοκιμές. Εφόσον συλλέξουν θετικές πληροφορίες κατά τη χορήγηση του φαρμάκου σχετικά με την αποτελεσματικότητα και την ασφάλεια του, ο αριθμός των ασθενών αυξάνεται. Το μέγεθος των κλινικών δοκιμών ποικίλει σημαντικά καθώς μπορεί να αποτελείται από ένα ερευνητικό κέντρο σε μία χώρα ή από πολλά ερευνητικά κέντρα παγκόσμια. Συνήθως για τις κλινικές δοκιμές επιλέγονται ασθενείς με συγκεκριμένες παθήσεις, οι οποίοι επωφελούνται από τη χορήγηση θεραπειών οι οποίες δεν υπάρχουν ακόμα σε τελική μορφή. Στην πρώτη φάση χρησιμοποιούνται υγιείς εθελοντές οι οποίοι λαμβάνουν χρηματική ανταμοιβή για τις υπηρεσίες του. Κατά τις περιόδους δοσολογίας, οι εθελοντές παραμένουν στις ερευνητικές εγκαταστάσεις για διάστημα ενός έως τριάντα ημερών, και κάποιες φορές παραπάνω, για να γίνουν οι απαραίτητες μετρήσεις. Αφού προσδιοριστεί ο τύπος των ασθενών που θα επωφεληθούν από την φαρμακευτική αγωγή, επιστρατεύονται οι κατάλληλοι ασθενείς και συλλέγονται οι απαραίτητες πληροφορίες για αυτούς. Οι ασθενείς αυτοί είναι εθελοντές και συνήθως δεν πληρώνονται για τις δοκιμές. Οι πληροφορίες που συλλέγονται αφορούν τις ζωτικές ενδείξεις, την περιεκτικότητα του φαρμάκου στο αίμα και τη βελτίωση ή μη στην κατάσταση του ασθενή. Οι ερευνητές μετά στέλνουν τις πληροφορίες στους σπόνσορες οι οποίοι τις αναλύουν με στατιστικές μεθόδους διερευνώντας περαιτέρω την ασφάλεια και την αποτελεσματικότητα του φαρμάκου είτε μεμονωμένα για κάθε ασθενή είτε συγκρίνοντας μεταξύ ασθενών με την ίδια πάθηση. 40

41 Για την αντιμετώπιση μιας ασθένειας, είναι υποψήφιες για χρήση 5000 έως χημικές ουσίες. Κατά μέσο όρο μόνο 250 από αυτές θα δώσουν καλές ενδείξεις ώστε να προχωρήσουν σε εργαστηριακές δοκιμές σε ποντίκια και άλλα πειραματόζωα. Σε γενικές γραμμές μόνο 10 από αυτά θα προκριθούν για δοκιμή σε ανθρώπους. Σε μια μελέτη που έγινε από το Tufts Center for the Study of Drug Development, εκτιμήθηκε ότι μόνο το 21.5% από τα φάρμακα που έφτασαν στο στάδιο κλινικών δοκιμών, εγκρίθηκαν για παραγωγή και διάθεση στην αγορά. 4.3 Η Φαρμακευτική Βιομηχανία - Από την Ασπιρίνη στα έξυπνα Φάρμακα Ο όρος φαρμακευτική βιομηχανία ουσιαστικά εμφανίστηκε στις αρχές του 20 ου την παρασκευή και εμπορία της ασπιρίνης από την εταιρεία Bayer. αιώνα με Έκτοτε το συστηματοποιημένο μοντέλο ανάπτυξης που ακολούθησε η φαρμακοβιομηχανία στηρίχθηκε ουσιαστικά στην ανακάλυψη νέων φαρμάκων, στη βελτίωση του τρόπου χορήγησης (σκευάσματα- formulation), στη συσκευασία και φυσικά στη διαφήμιση και στα δίκτυα πωλήσεων. Η επανάσταση στην Ιατρική τα τελευταία χρόνια έλαβε χώρα όταν η προσέγγιση στην ανακάλυψη μιας φαρμακευτικής ουσίας άρχισε να γίνεται με ορθολογιστικό τρόπο (rational design) και όχι με την τυχαία επιλογή (random screening) όπως γινόταν αρχικά. Σημαντικό ρόλο σε αυτήν την αλλαγή έπαιξε η μοριακή βιολογία που οδηγούσε στη γνώση της μοριακής δομής, αλλά και του βιοχημικού μηχανισμού ο οποίος οδηγεί στην ασθένεια. Επιτεύγματα της μοριακής βιολογίας είναι η χαρτογράφηση του ανθρώπινου γονιδιώματος (genome) που μελλοντικά θα αντιμετωπίζει τις ασθένειες στην ρίζα τους, αλλά και η αποκρυπτογράφηση της αλληλεπίδρασης των πρωτεϊνών ή πεπτιδίων του πρωτεόματος (proteome) με τους αντίστοιχους βιολογικούς υποδοχείς που επιτρέπει τον σχεδιασμό χημικών δομών - μιμητών για την αντιμετώπιση μιας ασθένειας στην εμφάνισή της. Έτσι σήμερα έχουμε μια νέα γενιά φαρμάκων, τα έξυπνα φάρμακα, όπως για παράδειγμα: α) νέα γενιά αντιυπερασικών: Σαρτάνες β) μιμητές πεπτιδίων στην αντιμετώπιση του διαβήτη, του καρκίνου, της σκλήρυνσης κατά πλάκας και του AIDS γ) νέα βιοτεχνολογικά φάρμακα γνωστά ως traps (παγίδες) δ) «έξυπνες βόμβες» κατά του καρκίνου 41

42 ε) αλλά και παλαιά φάρμακα με νέες ιδιότητες ( όπως η χρήση της ασπιρίνης στην πρόληψη ορισμένων μορφών καρκίνου) Οι σύγχρονες τεχνολογίες είχαν ως αποτέλεσμα την -με γεωμετρική πρόοδο- οριζόντια ανάπτυξη των ερευνητικών δραστηριοτήτων γύρω από το φάρμακο. Ο πολλαπλασιασμός των ερευνητικών πεδίων, δηλ. των προς μελέτη φαρμακευτικών στόχων και των ελπιδοφόρων βιοδραστικών μικρών μορίων, αύξησε δραματικά την πολυπλοκότητα διαχείρισης των ερευνητικών έργων και -κυρίως- τις ανάγκες σε εξειδικευμένες διεπιστημονικές ομάδες (βιολογία, χημεία, πληροφορική) με αποτέλεσμα να καταστούν αριθμητικά και επιστημονικά ανεπαρκή τα συμβατικά τμήματα της φαρμακοβιομηχανίας Η Φαρμακευτική βιομηχανία στην Ελλάδα Στην Ελλάδα, η φαρμακοβιομηχανία, παρόλο που έχει αρκετά χρόνια ιστορία, δεν δραστηριοποιείται παρά μόνο από το στάδιο του formulation και μετά. Σήμερα όμως, υπάρχει η επιστημονική γνώση και τεχνογνωσία στη χώρα μας που μπορεί να υποστηρίξει την ανάπτυξη της Ελληνικής φαρμακοβιομηχανίας. Αρκετά πανεπιστήμια και ερευνητικά κέντρα ασχολούνται με την βασική έρευνα στον τομέα του φαρμάκου με ελπιδοφόρα αποτελέσματα. Επίσης, αναπτύσσονται συνεχώς μικρές δυναμικές εταιρείες βιοτεχνολογίας με υψηλή επιστημονική κατάρτιση. Το Ινστιτούτο Φαρμακευτικής Έρευνας και Τεχνολογίας διαθέτει άριστα εκπαιδευμένο προσωπικό και εξοπλισμό υψηλής τεχνολογίας και μεταξύ άλλων δραστηριοποιείται στην ανάπτυξη μεθοδολογίας και τη διενέργεια μελετών βιοϊσοδυναμίας και βιοδιαθεσιμότητας. Η πρόκληση μιας νέας «ελαφράς» βιομηχανίας που στηρίζεται πολύ περισσότερο στο «γνωστικό κεφάλαιο» παρά στην κλασική παραγωγική υποδομή, είναι μπροστά μας. Και είναι πιο έντονη γιατί συνδέεται με τα πιο πολύτιμα αγαθά κάθε ανθρώπου. Την Υγεία και το Ευ ζείν 4.4 Ο λογικός σχεδιασμός Φαρμάκων Ο παραδοσιακός τρόπος ανακάλυψης νέων φαρμακευτικών ουσιών, που βασίζεται στην τακτική «δοκιμή και λάθος», αντικαταστάθηκε από τον ονομαζόμενο λογικό σχεδιασμό φαρμάκων. 42

43 Εικόνα από Ο λογικός σχεδιασμός φαρμάκων βασίζεται στη γνώση της χημείας και βιοχημείας μιας ασθένειας, στη γνώση των «ενοχοποιούμενων» βιομορίων και στο πώς αυτά ή ένα τμήμα τους, μπορούν να δεσμευτούν και να αδρανοποιηθούν από την φαρμακευτική ουσία, ώστε να επέλθει θεραπεία. Εάν π.χ. το πρόβλημα οφείλεται στην ανεπιθύμητη ενζυμική δράση μιας πρωτεϊνης, με τη βοήθεια ηλεκτρονικών υπολογιστών είναι πλέον σχετικά απλή η εξέταση μορίωνυποψηφίων φαρμάκων πριν ακόμη συντεθούν (μελέτη in silico: μελέτη στον υπολογιστή ή μέσω υπολογιστή) ως προς το κατά πόσο «ταιράιζουν» δομικά στη δραστική περιοχή της πρωτεϊνης, στην οποια θα πρέπει να συνδεθούν για να την απενεργοποιήσουν. Τυπικό παράδειγμα φαρμακευτικής ουσίας που παρασκευάσθηκε με αυτό το είδος «στοχευμένης σύνθεσης» αποτελεί η χημική ένωση ιματιβίνη Ιματινίβη: Η δραστική ουσία του φαρμάκου Glivec ή Gleevec Η αντικαρκινική ουσία ιματινίβη έχει εξελιχθεί τα τελευταία χρόνια σε ένα νέο θεραπευτικό «θαύμα» με μεγάλες προοπτικές για τη θεραπεία της λευχαιμίας, αλλά και άλλων τύπων καρκίνου. Η ανακάλυψη της ιματινίβης δεν ήταν τυχαία, αλλά υπήρξε αποτέλεσμα συστηματικής έρευνας στον τομέα αναστολέων της τυροσινικής κινάσης και πραγματοποιήθηκε από τον Brian Druker. 43

44 Αναπτύχθηκε ως φάρμακο από την Novartis Pharmaceuticals, μετά από κλινικές μελέτες, το 1998 για διάφορες μορφές χρόνιας μυελογενούς λευχαιμίας σε παιδία και ενήλικες και εγκρίθηκε το 2001 από την FDA ( Food and Drug Administration. Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων του αμερικανικού Υπουργείου Υγείας και Ανθρώπινων Υπηρεσιών). Η υψηλή θεραπευτική ικανότητα της ιματινίβης για τη CML την έφερε στην επικαιρότητα το 2001, όταν εγκρίθηκε η χρήση της από την FDA των ΗΠΑ. Η έγκριση αυτή πραγματοποιήθηκε μόλις μέσα σε 3 χρόνια ( γεγονός που αποτέλεί ρεκόρ για τις μέχρι τότε πρακτικές της FDA) και από τότε εμφανίζονται στην ιατρική βιβλιογραφία τα αποτελέσματα αρκετών κλινικών ερευνών που δείχνουν την αποτελεσματικότητα του φαρμάκου. Ιματινίβη Κατά κανόνα, οι ασθενείς έδειξαν βελτίωση της υγείας τους μετά την πάροδο μερικών εβδομάδων από τη λήψη του φαρμάκου, ενώ οι παρενέργειές του ήταν σχετικά ήπιες (ναυτία, διάρροια, οιδήματα, πόνοι και κράμπες στα κάτω άκρα, εξανθήματα, πονοκέφαλοι κ.λπ.). Επίσης, παρουσιάστηκε σοβαρή κατακράτηση υγρών στο 2% των περιπτώσεων. Η εμπορική ονομασία του φαρμακευτικού σκευάσματος ιματινίβης στην Ευρώπη είναι Glivec και στις ΗΠΑ Gleevec. To σκεύασμα αυτό είναι ευρύτερα γνωστό ως το χάπι της λευχαιμίας. Πρόσφατα (Ιούνιος 2006), η ιματινίβη εμφανίσθηκε στα μέσα ενημέρωσης λόγω της δημοσιοποίησης αποτελεσμάτων μακροχρόνιας έρευνας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ασθενείς με CML επιβίωσαν κατά 90% και με πολύ καλή ποιότητα ζωής, πέντε χρόνια μετά τη λήψη του φαρμάκου, ενώ συνήθως πέθαιναν σε 4 χρόνια. Μηχανισμός δράσης της ιματινίβης Ο μηχανισμός δράσης της ιματινίβης έχει μελετηθεί και έχουν διερευνηθεί οι τρόποι με τους οποίους καταπολεμά την λευχαιμία. 44

45 Συγκεκριμένα, η ιματινίβη δεσμεύει ένα μη-φυσιολογικό ένζυμο, το οποίο αποτελεί χαρακτηριστικό γνώρισμα της λευχαιμίας. Η ιματινίβη παρεμβαίνει στη μεταγωγή μηνυμάτων (signal trasduction) και αναστέλλει τη δράση ορισμένων ενζύμων, τα οποία αποτελούν την αιτία έναρξης και επέκτασης της νόσου. Από την άποψη αυτή αποτελεί σημαντική πρόοδο στη θεραπεία διαφόρων τύπων καρκίνου. H CML είναι μία νόσος κατά την οποία ο μυελός των οστών παράγει υπερβολικό αριθμό ανώριμων λευκών αιμοσφαιρίων. Στο πρώτα στάδια η νόσος δε γίνεται αντιληπτή. Ωστόσο, στο τέλος αρχίζει η συσσώρευση εκατομμυρίων άχρηστων λευκών αιμοσφαιρίων σε βάρος της παραγωγής χρήσιμων λευκών αιμοσφαιρίων, όπως επίσης και σε βάρος της παραγωγής αιμοπεταλίων που είναι απαραίτητα στο μηχανισμό πήξης του αίματος. Αποτέλεσμα είναι αναιμία, εύκολη προσβολή του ασθενούς από λοιμώξεις, ανεξέλεγκτες αιμορραγίες και άλλες επιπλοκές που οδηγούν στο θάνατο. Η συχνότητα εμφάνισης της νόσου αυξάνει με την ηλικία και εκτιμάται σε 1 στο για άτομα ηλικίας μέχρι 10 ετών, 1 στις για άτομα ηλικίας 50 ετών και 1 στις για άτομα ηλικίας 80 ετών. Μηχανισμός δράσης ιματινίβης. H ιματινίβη καθιστά αδύνατη τη διέγερση των καρκινικών πρωτεϊνών με φωσφορυλίωση Εικόνα από Το 1960, ερευνητές στη Φιλαδέλφεια διαπίστωσαν ότι το χρωμόσωμα 22 ήταν αφύσικα μικρό σε ασθενείς που έπασχαν από CML. To ανώμαλο αυτό χρωμόσωμα ονομάστηκε Φιλαδέλφεια (Philadelphia chromosome, Ph) και βρίσκεται στο 95% περίπου των πασχόντων από CML. 45

46 Το 1973 διαπιστώθηκε ότι αυτό οφείλεται στο τμήμα του γενετικού υλικού του χρωμοσώματος 22 έχει ανταλλαχθεί με τμήμα του χρωμοσώματος 9. Το γονίδιο Abl (Ableson leukemia virus) του χρωμοσώματος 9 κινείται και συνενώνεται με το γονίδιο Bcr (breakpoint cluster region) του χρωμοσώματος 22. Το αποτέλεσμα αυτής της διαμετάθεσης (translocation) είναι η δημιουργία ενός υβριδικού γονιδίου Bcr-Abl, το οποίο παράγει αντίστοιχα την ανώμαλή πρωτεϊνη Bcr-Abl, η δράση της οποίας είναι και το αίτιο της CML. Σχηματισμός του ελαττωματικού γονιδίου Bcr-Abl και της αντίστοιχης πρωτεϊνης. Εικόνα από Το φυσιολογικό γονίδιο Abl παράγει πρωτεϊνες που είναι απαραίτητες για τη διαίρεση του κυττάρου, μέσω φωσφορυλίωσης της τυροσίνης. Η ιδιότητα αυτή μεταβιβάζεται και στην πρωτεϊνη Bcr-Abl, η οποία διαθέτει δραστική περιοχή με ιδιότητες τυροσινικής κινάσης (tyrosine kinase, TK), ενζύμου που παράγει τη φωσφορική ομάδα σε μόρια- στόχους. Ωστόσο, σε αντίθεση με την ελεγχόμενη φωσφορυλιωτική δράση της πρωτεϊνης που παράγεται από το φυσιολογικό γονίδιο Abl, η πρωτεϊνη που παράγεται από το υβριδικό γονίδιο Bcr-Alb παρουσιάζει ανεξέλεγκτη φωσφορυλιωτική δράση. Η μεταγραφή της Bcr-Abl είναι συνεχής και δεν απαιτεί ενεργοποίηση από άλλες κυτταρικές πρωτεϊνες- αγγελιοφόρους. Έτσι, η Bcr-Abl ενεργοποιεί με φωσφορυλίωση μια αλληλουχία πρωτεϊνών επιταχύνοντας τη διαίρεση του κυττάρου. Επιπλέον, η Bcr-Abl παρεμποδίζει την επιδιόρθωση του DNA, προκαλώντας μια γενικευμένη γονιδιακή αστάθεια και την ανάπτυξη επιπρόσθετων γονιδιακών ανωμαλιών. Η ιματινίβη δρα ως ειδικός αναστολέας (inhibitor) των τυροσινικών κινασών. Η ιματινίβη δεσμεύεται στη θέση της Bcr-Abl, όπου κανονικά δεσμεύεται το ΑΤΡ (αδενοσινοτριφωσφορικό οξύ). Χάνοντας την ικανότητα δέσμευσης του ΑΤΡ, η Bcr-Abl χάνει την ικανότητα φωσφορυλίωσης άλλων πρωτεϊνων (όπως π.χ. των αυξητικών παραγόντων GRB-2 και SHC) και έτσι παύει η παραγωγή χημικων σημάτων που 46

47 διεγείρουν τη διαδικασία διαίρεσης των κυττάρων, με αποτέλεσμα την παρεμπόδιση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων. Πρέπει να σημειωθεί ότι η ιματινίβη παρεμποδίζει την πρωτεϊνη Abl και των μηκαρκινικών κυττάρων, αλλά υπό φυσιολογικές συνθήκες τα κύτταρα διαθέτουν πλεόνασμα τυροσινικών κινασών και επομένως δεν βλάπτεται η κανονική λειτουργία τους. Βελτιωμένες μορφές και προοπτικές για τη θεραπεία και άλλων τύπων καρκίνου Χωρίς αμφιβολία, τα θεραπευτικά αποτελέσματα της ιματινίνης σε ασθενείς με CLM είναι σημαντικά, ωστόσο αποδείχθηκε ότι η λύση του προβλήματος δεν είναι τόσο απλή. Αναπτύχθηκαν μορφές λευχαιμίας, όπου τα καρκινικά κύτταρα ανέπτυξαν ανθεκτικότητα στην ιματινίβη, μέσω της επικράτησης των κλώνων εκείνων που έφεραν σημειακές μεταλλάξεις στην πρωτεϊνη Abl. Οι μεταλλάξεις αυτές παρεμποδίζουν την αποτελεσματική σύνδεση του φαρμάκου, επομένως και τη δράση του. Αυτά τα προβλήματα, δημιουργούν σήμερα την πιεστική ανάγκη για την ανάπτυξη και αξιολόγηση νέων φαρμάκων, όπως επίσης και νέων στρατηγικών θεραπείας. Τυπικά παραδείγματα νέων ουσιών, οι οποίες δεσμεύουν αποτελεσματικότερα την Bcr- Abl είναι οι ουσίες dasatinib (BMS ) και nilotinib (AMN107), οι οποίες δομικά διαθέτουν τμήματα δομής της ιματινίβης. Συντακτικοί τύποι dasatinib της και της nilotinib Πλησιάζοντας το θαύμα H επιτυχία της θεραπείας της CML μέσω σχεδιασμού in silico και σύνθεσης αναστολέων της τυροσινικής κινάσης, έχει ενισχύσει την επικρατούσα εδώ και χρόνια άποψη, ότι μόνο η ακριβής γνώση των μοριακών μηχανισμών της καρκινογένεσης μπορεί να οδηγήσει στη θεραπεία του καρκίνου. 47

48 Μετά την πάροδο αρκετών ετών από την έγκριση της ιματινίβης / Glivec για τη θεραπεία CML, έχει πλέον ανοίξει ο δρόμος για την αποδοχή αυτής της στρατηγικής που έγκειται στην ανάπτυξη και σχεδιασμό νέων φαρμάκων και την άμεση δοκιμή σε κλινικές μελέτες. Σήμερα, στην εποχή της Πρωτεομικής, μέσω της ταυτοποίησης και του προσδιορισμού των πρωτεϊνων οι οποίες εκκρίνονταιστον ορό των ασθένων με καρκίνο ως αποτέλεσμα ελαττωματικών γονιδίων, είναι δυνατή η επιλογή κατάλληλων στόχων, η σχεδίαση μιας στοχευμένης θεραπείας και η μέτρηση της ανταπόκρισης των ασθενών σε αυτή. Η επιστημονική έρευνα, μέσω των βιοδεικτών καρκίνου, μπορεί να αλλάξει ριζικά τον τρόπο διεξαγωγής των κλινικών μελετών και να επιταχύνει την αξιολόγηση των θεραπευτικών δυνατοτήτων των φαρμάκων στοχευμένης θεραπείας. 4.5 Σύγχρονος σχεδιασμός φαρμάκων και κρυσταλλογραφία πρωτεϊνών Παρατηρώντας κανείς την πολυπλοκότητα του χημικού τύπου ορισμένων φαρμάκων είναι φυσικό να διερωτηθεί πως προέκυψε αυτός ο τύπος και πόσες παραλλαγές θα πρέπει να δοκιμάστηκαν, ώσπου οι επιστήμονες να καταλήξουν στην ουσία αυτή, όταν μάλιστα η σύνθεσή της δεν μπορεί να θεωρηθεί και ως απλή υπόθεση. Ο σύγχρονος τρόπος ανακάλυψης φαρμακευτικών ουσιών ξεκινάει με επιλογή του βιολογικού στόχου, που συνήθως είναι μία πρωτεϊνη, η οποία συνδέεται με την ασθένεια (όπως η νευραμινιδάση στην περίπτωση του Tamiflu). Eάν ως φαρμακευτική ουσία προτιμάται μια ένωση σχετικά μικρού μοριακού βάρους, η οποία επιδιώκεται να συνδεθεί με την πρωτεϊνη αυτή, οι φαρμακοχημικοί χρησιμοποιούν μια τεχνολογία γνωστή ως σχεδιασμός φαρμάκου με βάση τη δομή (structure-based drug design, SBDD). Στην ουσία πρόκειται για σχεδιασμό ενός μορίου με τη βοήθεια ηλεκτρονικών υπολογιστών. Η τεχνολογία SBDD χρησιμοποιεί τρισδιάστατες (3D) δομές της πρωτεϊνης -στόχου και βελτιστοποιεί τη δομή μικρών (σχετικά) οργανικών μορίων, ώστε να συνδεθούν στις κατάλληλες περιοχές και να επιδράσουν στη λειτουργικότητα της πρωτεϊνης-στόχου κατά τον επιθυμητό τρόπο. Η γνώση της τρισδιάστατης δομής της πρωτεϊνης-στόχου μειώνει ή καταργεί τον εμπειρικό τρόπο σχεδιασμού του φαρμάκου. 48

49 Σχεδιασμός φαρμάκου με βάση τη δομή (SBDD) - Εικόνα από: Based_Drug_Design.html Στην ουσία βλέπουν τι είδους δομές θα πρέπει να χρησιμοποιήσουν ή τι δομικές τροποποιήσεις πρέπει να κάνουν ώστε να ταιριάξουν αποτελεσματικότερα το υπό σχεδίαση μόριο στα κατάλληλα κοιλώματα της πρωτεϊνης στόχου. Οι δομικές πληροφορίες λαμβάνονται κυρίως μέσω της τεχνικής της κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ. Αρχή κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ. Εικόνα από: Απαραίτητη προϋπόθεση για την εφαρμογή αυτής της τεχνικής αυτής είναι η παρασκευή ενός καθαρού κρυστάλλου της πρωτεϊνης-στόχου. Με τη σημερινή τεχνολογία ένας μικροσκοπικός κρύσταλλος (π.χ μm) είναι αρκετός για να ληφθούν οι επιθυμητές πληροφορίες. 49

50 Ωστόσο, η λήψη έστω και ενός μικροσκοπικού κρυστάλλου δεν είναι κάτι το απλό. Για την ανάπτυξη κρυστάλλων πρωτεϊνών (που κατά κανόνα είναι διαθέσιμες σε ελάχιστες ποσότητες) έχουν κατασκευαστεί ιδιαίτερα ρομποτικά συστήματα. Η χρησιμοποιούμενη οργανολογία είναι εξαιρετικά δαπανηρή και μόνο άριστα εξοπλισμένα εργαστήρια μεγάλων φαρμακευτικών εταιριών και ερευνητικών ιδρυμάτων εξειδικεύονται στον τομέα αυτό. Δομικά χαρακτηριστικά πρωτεϊνων (και νουκλεϊκων οξέων) μπορούν να αναζητηθούν δωρεάν μέσω διαδικτύου από την Τράπεζα Πρωτεϊνικών Δεδομένων (Protein Bank). Όταν αυτή η τράπεζα ιδρύθηκε το 1971 είχε δεδομένα από επτά πρωτεϊνες, ενώ σήμερα έχει ξεπεράσει τις Ανάπτυξη μικροσκοπικών κρυστάλλων πρωτεϊνών σε σταγονίδια διαλύματος τους. Εικόνα από: H περίπτωση των αναστολέων της νευραμινιδάσης Στην περίπτωση των αναστολέων της νευραμινιδάσης, ο αγώνας δρόμου για την παρασκευή τους φαίνεται να ξεκίνησε από τη διαπίστωση ότι ένα φυσικό μόριο του σιαλικού οξέος, ένα μόριο-παράγωγο του σιαλικού οξέος, το 2-δεοξυ-2,3-διδεϋδρο-D,Nακετυλονευραμικό οξύ (συντομογραφικά: Neu5Ac2en) ασκούσε ανασταλτική δράση (ανταγωνιστικού τύπου) στη νευραμινιδάση (1974). Μία ομάδα επιστημόνων από την Αυστρία, με τη βοήθεια υπολογιστών εκτίμησαν τι είδους τροποποιήσεις έπρεπε να κάνουν στο μόριο αυτό ώστε να αυξηθεί η ανασταλτική του δράση. Χρησιμοποίησαν το λογισμικό GRID (της Molecular Discovery) για να προσδιορίσουν τις ενεργειακές συμφερότερες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των διαφόρων δραστικών ομάδων και των αντίστοιχων ομάδων του κοιλώματος του ενεργού κέντρου της νευραμινιδάσης. 50

51 Έτσι εκτίμησαν ότι η αντικατάσταση μιας υδροξυλομάδας με αμινο-ομάδα ή καλύτερα με γουανιδινο-ομάδα (στις πρωτονιωμένες τους μορφές) θα καταστήσει ενεργειακά συμφερότερη την προσαρμογή αυτών των μικρών μορίων στο ενεργό κέντρο της νευραμινιδάσης εξουδετερώνοντας έτσι την ενζυματική της δράση. Στη συνέχεια δοκίμασαν αυτές τις ενώσεις και διαπίστωσαν ότι πράγματι ασκούν κατά τάξεις μεγέθους μεγαλύτερη ανασταλτική δράση στη νευραμινιδάση σε σχέση με τη Neu5Ac2en. Οι επιστήμονες προέβλεψαν ότι αυτά τα μόρια θα μπορούσαν να αποτελέσουν τη βάση νέων δραστικών φαρμάκων για την προφύλαξη από τη γρίπη, αλλά και για τη θεραπεία της. Πράγματι η μία από αυτές, η 4-γουανιδινο-Neu5Ac2en (η ζαναμιβίρη) κυκλοφόρησε λίγα χρόνια αργότερα (1999) ως το πρώτο αντι-ιικό φάρμακο-αναστολέας της νευραμινιδάσης με το εμπορικό όνομα Relenza και λίγο αργότερα ακολούθησε η δομικώς ανάλογη ένωση, η οσελταμιβίρη με το εμπορικό όνομα Tamiflu, η οποία παρουσίαζε ορισμένα πλεονεκτήματα σε σχέση με την προηγούμενη (λήψη από το στόμα, μεγαλύτερη βιοδιαθεσιμότητα). Σύζευγμα οσελταμιβίρης (στο κέντρο) με την νευραμινιδάση Εικόνα από: 51

52 Κεφάλαιο 5 Σύνθεση και Εφαρμογές Ταξόλης 5.1 Φυσικά προϊόντα ως αντικαρκινικές ουσίες Ιστορική αναδρομή Με πρωτοβουλία του Εθνικού Ινστιτούτου Καρκίνου των ΗΠΑ (National Cancer Institute, NCI) ιδρύθηκε το 1955 το Εθνικό Κέντρο για τη Χημειοθεραπεία του Καρκίνου (Cancer Chemotherapy National Service Center, CCNSC). Από τότε, το CCNSC είναι ο κεντρικός φορέας συλλογής και μελέτης αντικαρκινικών φαρμάκων (συνθετικά και φυσικά). Στις δραστηριότητες του περιλαμβάνεται το πρόγραμμα ελέγχου (screening) νέων φυτικών εκχυλισμάτων (από φυτά, δένδρα, φύλλα, φλοιός κορμού, κ.λπ.) για πιθανές αντικαρκινικές ιδιότητες. Τα εκχυλίσματα αυτά στέλνονται για αντικαρκινικό έλεγχο σε εξωτερικά ινστιτούτα, πανεπιστήμια, ερευνητές και εταιρίες φαρμάκων. Αν και οι περισσότερες ουσίες που μελετήθηκαν ήταν συνθετικές, ο χημικός Jonathan Hartwell του NCI, ο οποίος είχε μεγάλη εμπειρία με φυσικά εκχυλίσματα φυτικών προϊόντων, άρχισε να συλλέγει μεγάλο αριθμό φυτικών δειγμάτων και να τα ελέγχει για αντικαρκινική δράση. Οι μελέτες αυτές διεξάγονταν στο παρελθόν με τη χρήση πειραματόζωων, στα οποία είχαν χορηγηθεί υψηλές δόσεις καρκινογόνων ουσιών (ενέσιμα, με την τροφή, λήψη από το στόμα) και στη συνέχεια ελάμβαναν τα αντικαρκινικά σκευάσματα με τη διατροφή τους. Προφανώς η όλη διαδικασία ήταν αργή και δαπανηρή. Αργότερα, στις έρευνες για νέες αντικαρκινικές ουσίες άρχισαν να χρησιμοποιούνται καλλιέργειες καρκινικών κυττάρων (όπως L1210, P388, κυτταρικές σειρές λευχαιμίας). Στις καλλιέργειες καρκινικών κυττάρων προσέθεταν σταδιακά αυξανόμενες συγκεντρώσεις των πιθανών αντικαρκινικών ουσιών. Εάν τα προκαταρκτικά αυτά πειράματα έδειχναν, αυξημένη αντικαρκινική (θάνατο κυττάρων, αναστολή πολλαπλασιασμού, απόπτωση, μίτωση, παρεμπόδιση μετάστασης κ.λπ.) τότε συνεχίζονταν οι μελέτες και σε πειραματόζωα. Με αυτό το πρωτόκολλο εξετάσθηκαν χιλιάδες φυσικές ουσίες (εκτιμούνται σε περισσότερο από ), εκχυλίσματα φυτικών προϊόντων, αλλά και ουσίες που ελήφθησαν από μικροοργανισμούς, θαλάσσια είδη κ.λπ. Αν αυτά τα πειράματα έδιναν 52

53 κάποια ενθαρρυντικά αποτελέσματα, ακολουθούσαν οι μελέτες τριών σταδίων σε ασθενείς με διάφορα είδη κακοήθων νεοπλασιών. Συνήθως, για ένα αντικαρκινικό φάρμακο χρειάζονται χρόνια από το έτος της ανακάλυψής του, για να εγκριθεί και να αρχίσει η διάθεσή του στη φαρμακοθεραπευτική αγορά. Στις ΗΠΑ η υπεύθυνη υπηρεσία για την έγκριση φαρμάκων είναι η Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων (Food and Drug Administration, FDA) και στην Ευρώπη ο Ευρωπαϊκός Οργανισμός Φαρμάκων (European Medicines Agency, EMA) με έδρα το Λονδίνο. 5.2 Η ανακάλυψη της ταξόλης Από το 1960 οι βοτανολόγοι των ΗΠΑ άρχισαν να συλλέγουν 1000 περίπου φυτά τον χρόνο για μελέτη της αντικαρκινικής δράσης των εκχυλισμάτων τους. Το 1962, ο βοτανολόγος Arthur S. Barclary, συγκέντρωσε 200 δείγματα φυτών σε μια μεγάλη περιοδεία του. Μεταξύ αυτών υπήρχαν και δείγματα φλοιού του κορμού ενός ήμερου ελάτου, ( του Ελάτου του Ειρηνικού με τη συστηματική ονομασία Taxus brevifolia Nutt). Το Έλατο του Ειρηνικού και ο κορμός του. Εικόνες από: 53

54 Τον Μάιο του 1964 πραγματοποιήθηκε η μελέτη της αντικαρκινικής δράσης του δείγματος σε κυτταρικές καλλιέργειες και βρέθηκε ότι το εκχύλισμα από τον φλοιό του Taxus παρουσίαζε ισχυρή αντικαρκινική δράση. Το 1965, με φρέσκο δείγμα του φλοιού Taxus και με καθαρό κλάσμα του εκχυλίσματος πραγματοποιήθηκε νέος έλεγχος σε ένα άλλο εργαστήριο ( Monroe E. Wall, Research Triangle Park, North Carolina). Τα νέα πειράματα επιβεβαίωσαν την παρουσία μιας άγνωστης μέχρι τότε ουσίας, που ονομάστηκε ταξόλη, με ισχυρή αντικαρκινική στο εκχύλισμα και οι επιστήμονες ανακοίνωσαν τα αποτελέσματα σε συνέδριο της American Chemical Society (Miami Beach, April 1967). Απόξεση και παραλαβή φλοιού Taxus για την απομόνωση της ταξόλης Το NCI αποφάσισε τη διεύρυνση της έρευνας για την ταξόλη και τη συλλογή ακόμη μεγαλύτερων ποσοτήτων φλοιού του ελάτου. Έτσι, ο 1969, από 1200kg φλοιού ελήφθησαν 28kg μη καθαρού εκχυλίσματος, από τα οποία μετά από επίπονες διαδικασίες διαχωρισμών απομονώθηκαν 10g καθαρής ταξόλης. Ο προσδιορισμός της δομής της μέχρι τότε άγνωστης ένωσης δημοσιεύτηκε στο περιοδικό Journal of American Chemical Society (JACS) το Ωστόσο, η έρευνα δεν προχώρησε για αρκετά χρόνια, παρά το γεγονός ότι μια νέα έρευνα του 1975 επιβεβαίωνε για μια ακόμη φόρα την εξαιρετική αντικαρκινική δράση της ένωσης. Πέρασαν άλλα δύο χρόνια μέχρι να γίνει επανεξέταση των αποτελεσμάτων και τελικά προτάθηκε να εντατικοποιηθούν τα πειράματα με μεγαλύτερες ποσότητες. Πράγματι, το 1977 παρασκευάσθηκαν 600g ταξόλης από περίπου 3,5 τόνους φλοιού ελάτου. Το 1978 νέες έρευνες έδειξαν ότι η ταξόλη παρουσίαζε αντικαρκινική δράση σε ποντίκια με λευχαιμία. 54

55 5.3 Μηχανισμός δράσης της ταξόλης Η ταξόλη έγινε ευρύτερα γνωστή το 1979, μετά τη δημοσίευση των ερευνητικών αποτελεσμάτων της ερευνήτριας Susan B. Horwitz (Albert Einstein College of Medicine). Οι έρευνες της ομάδας της Horwitz απέδειξαν ότι η ταξόλη δρα με ένα άγνωστο μέχρι τότε μηχανισμό: προκαλούσε ένα είδος υπερβολικής σταθεροποίησης των κυτταρικών μικροσωληνίσκων. Οι μικροσωληνίσκοι είναι σωληνοειδείς διατάξεις από ετεροδιμερή των πρωτεϊνών α- και β-τουμπουλίνης. Αποτελούν μία από τις κύριες δομές του κυτταροσκελετού και διαδραματίζουν σημαντικό οργανωτικό και λειτουργικό ρόλο σε όλα τα ευκαρυωτικά κύτταρα. Η ταξόλη είχε τη ασυνήθιστη ικανότητα να προκαλεί πολυμερισμό των τουμπουλινών, χωρίς να απαιτείται η δράση της τριφωσφορικής γουανοσίνης (GTP), που υπεισέρχεται στον φυσιολογικό μηχανισμό πολυμερισμού. Η υπερσταθεροποίηση των μικροσωληνίσκων οφείλεται στην πρόσδεση της ταξόλης με τη β-τουμπουλίνη. Αυτή η ανεπιθύμητη σταθεροποίηση των μικροσωληνίσκων καθιστά αδύνατο το κόψιμο τους κατά τη μίτωση και ειδικά κατά τη φάση διαχωρισμού των χρωμοσωμάτων (μπλοκάρισμα στα στάδια μετάφρασης και ανάφασης). Έτσι, το κύταρρο δεν μπορεί να διαιρεθεί και πεθαίνει. Πέρα από τη σταθεροποίηση των μικροσωληνίσκων, η ταξόλη δρα ως μοριακή σκούπα δεσμεύοντας την ελεύθερη β-τουμπουλίνη, με αποτέλεσμα να μειώνει την παροχή μονομερών και διμερών τουμπουλίνης στο κύτταρο ανακόπτοντας την ανανέωση των μικροσωληνίσκων. Απεικόνιση του συμπλέγματος του ετεροδιμερούς των α- και β-τουμπουλινων και της ταξόλης (κίτρινο μόριο δεξιά). 55

56 Νεότερες έρευνες έδειξαν ότι εκτός από τον προηγούμενο τρόπο δράσης, η ταξόλη επάγει την απόπτωση, δηλ. τον προγραμματισμένο (φυσιολογικό) θάνατο του κυττάρου, στα καρκινικά κύτταρα. Αυτό οφείλεται στη σύνδεσή της με την πρωτεϊνη Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) και την αχρήστευσή της. Η πρωτεϊνη Bcl-2 ευθύνεται για την διακοπή του μηχανισμού απόπτωσης και η παρουσία της ευνοεί την ανεπιθύμητη αθανασία των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, έχει αναφερθεί μηχανισμός δράσης της ταξόλης μέσω δέσμευσης της τουμπουλίνης πάνω σε μικροκρυστάλλους της. Η ταξόλη, είναι καλό αντικαρκινικό φάρμακο για τους επιθετικούς καρκίνους, που απαιτούν διαίρεση κυττάρων και αναδιαμόρφωση του κυτταροσκελετού. Αν και επηρεάζει συγχρόνως και τα φυσιολογικά κύτταρα, τα καρκινικά κύτταρα, επειδή διαιρούνται πιο γρήγορα, καταστρέφονται σε μεγαλύτερο βαθμό από την πακλιταξέλη Κλινικές έρευνες Περιβαλλοντικά και πολιτικά προβλήματα Εμπορική εκμετάλλευση. Το 1982 ολοκληρώθηκαν οι μελέτες αντικαρκινικής δράσης της ταξόλης σε πειραματόζωα (ποντίκια). Τον ίδιο χρόνο το NCI υπέβαλε αίτηση για κλινικές μελέτες σε ανθρώπους. Το 1984 ξεκίνησε η Φάση Ι των κλινικών ερευνών και αργότερα το ίδιο έτος αποφασίστηκε η έναρξη της Φάσης ΙΙ. Οι έρευνες αυτές απαιτούσαν μεγάλες ποσότητες φλοιού του ελάτου. Μέχρι το τέλος του 1986 χρειάστηκαν σχεδόν 6 τόνοι για τις δοκιμές, αλλά για την ολοκλήρωση της Φάσης ΙΙ θα χρειάζονταν ακόμη τουλάχιστον 30 τόνους φλοιού. Οι τεράστιες αυτές ποσότητες απαιτούσαν την κοπή μεγάλου αριθμού ελάτων. Το γεγονός αυτό προκάλεσε διαμαρτυρίες των δασικών υπηρεσιών, των πολιτικών και των κατοίκων των περιοχών και το θέμα της ταξόλης έγινε πλέον πολιτικό και περιβαλλοντικό θέμα. Τα αποτελέσματα της Φάσης ΙΙ (Μάιος 1988) έδειξαν ικανοποιητική δράση σε περιπτώσεις μελανωμάτων και εξαιρετικά αποτελέσματα σε περιπτώσεις καρκίνου των ωοθηκών. Ωστόσο, το κόστος των ερευνών ήταν τεράστιο, εξαιτίας των απαιτούμενων μεγάλων ποσοτήτων φλοιού Taxus. Οι υπεύθυνοι του NCI σκέφθηκαν ότι θα έπρεπε το ινστιτούτο να συνεργασθεί με κάποια μεγάλη φαρμακευτική εταιρία για να συμβάλλει οικονομικά και να λύσει το πρόβλημα ανεφοδιασμού με φλοιό ελάτου. Σε αντάλλαγμα, το NCI θα εκχωρούσε στη εταιρεία όλα τα ερευνητικά αποτελέσματα που είχε συλλέξει μέχρι εκείνη την εποχή. Η μεγάλη φαρμακευτική εταιρεία Bristol-Myers Squib (BMS) ήταν μια από τις 4 εταιρείες που έδειξαν ενδιαφέρον. 56

57 5.3.2 Αντιρρήσεις Ήταν αναμενόμενο να υπάρξουν πολλές αντιρρήσεις από διάφορους επιστήμονες για τους όρους του συμβολαίου και τις διαπραγματεύσεις. Το NCI έγινε στόχος επικρίσεων. Το θέμα της ταξόλης έγινε αφορμή για ομιλίες στο Κογκρέσο των ΗΠΑ κατά το 1991 και 1992 λόγω των αμφισβητήσεων ως προς τη σκοπιμότητα ή και τη νομιμότητα της συμφωνίας με την πολυεθνική φαρμακευτική εταιρεία BMS. Τελικά, το 1992 η εταιρεία BMS υπέβαλε αίτηση για νέο αντικαρκινικό φάρμακο και το FDA της έδωσε την απαραίτητη έγκριση για τη συνέχιση των κλινικών μελετών. Αν και δεν υπήρξε κάποιο δίπλωμα ευρεσιτεχνίας για τα δικαιώματα στο φάρμακο ταξόλη (επειδή πρόκειται για φυσική ουσία), η εταιρεία BMS απόκτησε αποκλειστικά δικαιώματα 5 έτων. Το 1993, η BMS άρχισε τη διάθεση της ταξόλης στην αγορά, ως ισχυρότατο χημειοθεραπευτικό φάρμακο για τον καρκίνο. Θα πρέπει εδώ να σημειωθεί ότι σε μια ετήσια αναφορά (του 2000) της BMS, η εταιρεία ανακοίνωσε πωλήσεις του φαρμάκου εκατομμυρίων δολαρίων ( ημερήσιες πωλήσεις 4,3 εκατομμυρίων δολαρίων). Το παρασκήνιο της εμπορικής διάθεσης υπήρξε ιδιαίτερα έντονο και επιπλέον πληροφορίες σχετικές με το θέμα, όσο και για το εκτιμούμενο κόστος των σχετικών μελετών μπορούν να αναζητηθούν σε πολλές πηγές. 5.4 Ημισυνθετική οδός παρασκευής ταξόλης και νέες φυσικές πηγές Μετά από τα επιτυχή πειράματα των κλινικών φάσεων, η ταξόλη αναγνωρίστηκε οριστικά ως ένα επιτυχημένο αντικαρκινικό φάρμακο. Ωστόσο, παρέμεινε το πρόβλημα των τεράστιων ποσοτήτων φλοιού του Taxus που χρειάζονταν. Η περιεκτικότητα σε ταξόλη του ξηρού εσωτερικού φλοιού του Taxus brevifolia, όπου κυρίως βρίσκεται η ουσία, είναι πολύ μικρή (0,01-0,3%). Αυτό σήμαινε πως για την απομόνωση 1kg ταξόλης χρειάζονταν σχεδόν 10 τόνοι φλοιού, που θα λαμβάνονταν από 2 έως 3 χιλίαδες δέντρα τα οποία έτσι θα καταστρέφονταν. Για μια πλήρη θεραπευτική αγωγή με ταξόλη χρειάζονταν μέχρι 2g ταξόλης (σε 4 έως 6 ενέσεις). Έτσι, υπολογίσθηκε ότι κάθε χρόνο θα έπρεπε να κόβονται 360 χιλιάδες δέντρα. Ο Taxus αναπτύσσεται πολύ αργά, είναι ένα σχετικά σπάνιο δέντρο που βρίσκεται σε απόμακρες περιοχές, δεν σχηματίζει μεγάλες συστάδες και έτσι δεν είναι εύκολη η δημιουργία φυτειών του. Όλα αυτά καθιστούσαν το πρόβλημα μη αντιμετωπίσιμο. Τότε ξεκίνησε μια άλλη αναζήτηση: Η συνθετική και η ημισυνθετική παρασκευή φαρμάκου. 57

58 Από τα τέλη της δεκαετίας του 1970 Γάλλοι και Αμερικάνοι επιστήμονες άρχισαν να ενδιαφέρονται για τη συνθετική παρασκευή της ταξόλης. Ο Αμερικανός χημικός Robert A. Holton ξεκίνησε την ολική σύνθεσή της ταξόλης από απλές χημικές ουσίες, θέλοντας να δοκιμάσει τα επιμέρους στάδια της σύνθεσης και τις σχετικές τεχνικές και όχι για πρακτική εφαρμογή σε μεγάλη κλίμακα. Αντίθετα, ο Γάλλος χημικός Potier Pierre εξαρχής σκόπευσε στην καλή απόδοση, ώστε να είναι εφαρμόσιμη στη φαρμακευτική βιομηχανία. Αρίθμηση των ατόμων άνθρακα της ταξόλης, στερεοχημεία των 11 ασύμμετρων ανθράκων του μορίου της και το τρισδιάστατο μοντέλο του. Η ταξόλη είναι ένα διτερπένιο. Το κεντρικό τμήμα του μορίου είναι ένα ταξάνιο, δηλ. ένα σύστημα δύο εξαμελών δακτυλίων (Α, C), σχεδόν σχεδόν κάθετα τοποθετημένων σε ένα οκταμελή δακτύλιο (B). Eπιπλέον, ένας ακόμη δακτύλιος, ο D (οξετάνιο) είναι προσκολλημένος στον δακτύλιο D. Η ταξόλη αναφέρεται και ως παράγωγο του κυκλοδεκανίου (συνδυασμός των δακτυλίων Α και B). Η κατά IUPAC ονομασία της ταξόλης είναι: βενζοϊκό (2α,4α,5β, 7β, 10β,13α)-4,10-δις(ακετυλοξυ)-13-{[2R,3S)-3-(βενζοϋλαμινο)-2-υδροξυ-3-φαινυλοπροπανοϋλο]οξυλο-1,7-διυδροξυ-9-οξο- 5,20-εποξυταξ-11-εν-2-ύλιο Η ομάδα του Holton, έχοντας την εμπειρία της ολικής σύνθεσης, παρουσίασε μια σχετικά εύχρηστη ημισυνθετική μέθοδο. Χρησιμοποίησε ως πρώτη ύλη τη φυσική ουσία 10- δεακετυλομπακατίνη, η οποία βρίσκεται σε αρκετή ποσότητα στο Ευρωπαϊκό έλατο Taxus baccata. Η 10-DAB εμπεριέχει το κύριο (συνθετικά δύσκολο) τμήμα της δομικής πολυπλοκότητας της ταξόλης (τους 9 ασύμετρους άνθρακες από τους 11 της ταξόλης). Τα βελονοειδή φύλλα και τα κλαδιά του ελάτου περιείχαν αρκετή ποσότητα ( περίπου 0,1% 58

59 σε ξηρά βάση) της 10-DAB. Το έλατο δεν χρειαζόταν πλέον να κοπεί και επομένως η πηγή της 10-DAB ήταν ανανεώσιμη και δεν υπήρχε κάποια βλάβη για το οικοσύστημα. 10-δεακετυλομπακατίνη (10-DAB) Το τμήμα των ανθράκων 1, 2 και 3 (Ν-βενζοϋλο-2 R, 3 S-3-φαινυλο-ισοσερίνη), που συδέεται με τον άνθρακα 13 του συγκροτήματος των δακτυλίων, συχνά αναφέρεται απλά ως ουρά του μορίου. Για το τμήμα αυτό, παρασκευάζεται χωριστά μια β-λακτάμη, γνωστή ως λακτάμη Ojima, η οποία στη συνέχεια συνδέεται με την 10-DAB, αφού προηγουμένως προστατευθούν ορισμένες ομάδες της τελευταίας. Η σειρά των αντιδράσεων για την απόδοση της ταξόλης. Εικόνα από : Κρισιμότητα των επιμέρους ομάδων του μορίου. Η επίδραση και η χρησιμότητα των διάφορων χαρακτηριστικών ομάδων του μορίου στη βιοδραστικότητα της ταξόλης εξετάσθηκε με τη σύνθεση διάφορων τροποποιημένων μορφών της. Ορισμένα από τα συμπεράσματα στα οποία οι έρευνες αυτές κατέληξαν να έχουν ως εξής. Σε ότι αφορά την «ουρά», την ομάδα δηλαδή που είναι συνδεμένη με τον C13 του κεντρικού συγκροτήματος των δακτυλίων: Προστασία του υδροξυλίου του C2 με εστεροποίηση, απενεργοποιεί τη δραστικότητα ως προς τη σταθεροποίηση των κυτταροσκελετικών μικροσωληνίσκων, όχι όμως την κυτταροτοξικότητα της ένωσης. Η αμιδική-ακυλική ομάδα του C3 είναι απαραίτητη, ωστόσο δεν έχει σημασία αν έχει αρωματική ομάδα ή αλκύλιο. 59

60 Το άζωτο που συνδέεται με τον C3 μπορεί να αντικατασταθεί με οξυγόνο χωρίς απώλεια της βιοδραστικότητας. Το αρύλιο που συνδέεται με τον C3 είναι απαραίτητο. Αντικατάστασή του με μεθύλιο μειώνει τη βιοδραστικότητα κατά 19 φορές. Σε ό,τι αφορά το σύστημα των τεσσάρων δακτυλίων: Ο οξετανικός δακτύλιος D είναι ιδιαίτερα κρίσιμος. Διάνοιξή του παρέχει ένωση με δραματικά μειωμένη βιοδραστικότητα. Στένεμα του 8-μελούς δακτυλίου Β σε 7-μέλη παρέχει ένωση με την ίδια βιοδραστικότητα ως προς τη σταθεροποίηση των μικροσωληνίσκων. Απομάκρυνση της ακετυλικής ομάδας από τον C10 παρέχει ένωση με την ίδια βιοδραστικότητα. Απομάκρυνση της Ο-βενζοϋλικής ομάδας από τον C2 παρέχει εξαιρετικά μειωνμένη βιοδραστικότητα. 5.5 Ολικές συνθέσεις της ταξόλης Η αδυναμία της εξασφάλισης των απαραίτητων ποσοτήτων ταξόλης εξαρχής έθεσε το ερώτημα του κατά πόσο είναι δυνατή μια ολική σύνθεση της ένωσης. Δηλαδή μιας σύνθεσης, όπου θα γινόταν χρήση απλών (μικρομοριακών) και εμπορικά διαθέσιμων χημικών ουσιών, ως πρώτων υλών. Εξαρχής οι επιστήμονες που ασχολήθηκαν με την ολική σύνθεση της ταξόλης δεν έτρεφαν αυταπάτες. Σε καμιά περίπτωση οποιοδήποτε σχήμα ολικής σύνθεσης δεν θα μπορούσε να οδηγήσει σε μια οικονομικά βιώσιμη παρασκευή της ουσίας σε μεγάλες ποσότητες. Η ολική σύνθεση ήταν περισσότερο ένα είδος επιστημονικής πρόκλησης και ένα πεδίο δοκιμών βελτίωσης των υπαρχουσών τεχνικών οργανικής σύνθεσης και εισαγωγής νέων, αλλά και ένα πεδίο ανταγωνισμού των μεγαλύτερων συνθετικών οργανικών χημικών της εποχής μας. Θα πρέπει να τονιστεί ότι η ολική σύνθεση της ίδιας της ταξόλης δεν έχει μόνο θεωρητικό ενδιαφέρον. Οι συνθέσεις αυτές, εύκολα μπορούν να τροποποιηθούν σε κάποια στάδια τους και να οδηγήσουν σε τροποποιημένες μορφές ταξόλης, που συλλογικά αναφέρονται ως ταξοειδή (taxoids). Πολλά ταξοειδή θα μπορούσαν να αποδειχθούν κατά πολύ δραστικότερες από την ίδια. Κατά τη δεκαετία του 1990, ασχολήθηκαν με την ολική σύνθεση της ταξόλης περίπου 30 ερευνητικές ομάδες σε όλο τον κόσμο. Αυτές οι συνθέσεις της ταξόλης περιλαμβάνονται πλέον στις αριστουργηματικές και μνημειώδεις οργανικές συνθέσεις. 60

61 Εδώ περιγράφονται μόνο οι αρχές των συνθετικών οδών που ακολούθησαν ανεξάρτητα μεταξύ τους οι ερευνητικές ομάδες των καθηγητών Holton, Nicolaou και Danishefsky, με. βάση την αντίστοιχη περιγραφή που γίνεται. Η παρουσίαση είναι εκ των πραγμάτων εξαιρετικά συνοπτική λόγω των πολλών σταδίων και των απαιτούμενων εξαιρετικά εξειδικευμένων γνώσεων σε θέματα σύγχρονης οργανικής σύνθεσης και των ιδιοτήτων πλήθους σύγχρονων ειδικών αντιδραστηρίων εναντιοεκλεκτικής σύνθεσης Σύνθεση κατά Holton Το 1994, η ομάδα του Holton χρησιμοποίησε μια γραμμική (linear) συνθετική οδό, δηλαδή σταδιακές αλλαγές και προσθήκες σε ένα αρχικό μόριο. Χρησιμοποιεί τη φυσική ουσία (-) βορνεόλη ως πρώτη ύλη, την οποία μετατρέπει στην ακόρεστη κετόνη σε 13 χημικά στάδια. Εικόνα από: Στην 1 πραγματοποιείται εισαγωγή της εποξειδικής ομάδας για να ληφθεί η ένωση 2, το οξείδιο του β-πατσουλενίου, με μια εμπορικά διαθέσιμη φυσική ένωση, παράγωγο της πατσουλόλης, συστατικού του αρωματικού αιθέριου ελαίου πατσουλί. Η 2 ήδη περιέχει τα 15 από τα 20 άτομα άνθρακα του συστήματος των δακτυλίων ABCD. Η 2 μετά από σκελετική αντιμετάθεση παρέχει την τριτοταγή αλκοόλη 3. Η 3 με νέα εποξείδωση και θραυσματοποίηση οδηγεί στην ένωση 4 που περιλαμβάνει πλέον το χαρακτηριστικό σύστημα των δακτυλίων Α και Β της ταξόλης. Ακολουθεί εισαγωγή του δακτυλίου C με τη μεθοδολογία σχηματισμού δακτυλίου Robinsin-Stock. Άλλα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν ως πρώτες ύλες ήταν: η 4- πεντενάλη, το m- χλωροϋπερβενζοϊκο οξύ, το μεθυλομαγνησιοβρωμίδιο και το φωσγένιο. 61

62 5.5.2 Σύνθεση κατά Nicolaou Το 1994, η ομάδα του Nicolaou χρησομοποίησε μια συγκλίνουσα συνθετική οδό. Οι δακτύλιοι A και C παρασκευάστηκαν χωριστά (συνθόνες) και στη συνέχεια συνδέθηκαν μεταξύ τους μέσω μιας αντίδρασης Shapiro (μετατροπή κετόνης ή αλδεϋδης σε αλκένιο, μέσω ενδιάμεσου σχηματισμού υδραζόνης). Ακολούθησε μια σύζευξη McMurray (σύζευξη δύο καρβονυλικών ενώσεων προς το σχηματισμό αλκενίου, γνωστή και πινακολινική σύζευξη) για να κλείσει ο οκταμελής δακτύλιος Β. Στη συνέχεια παραγματοποίθηκε η εισαγωγή του οξετανικού δακτυλίου D και η συνθόνη της ουράς (λακτάμη Ojima) του άνθρακα 13. Χρησιμοποιήθηκε ένα πλήθος αντιδραστηρίων ως πρώτες ύλες, ως προστατευτικά μέσα ομάδων κ.α. Μεταξύ αυτών περιλαμβάνονται τα: βλενικό οξύ (mucic acid), 2- χλωροακρυλινιτρίλιο, υδρίδιο αργιλίου-λιθίου, φωσγένιο, γλυκολικό οξύ, βενζαλδεϋδη, εξαμεθυλοφωσφοραμίδιο, προπιονικός αιθυλεστέρας, αλλική αλκοόλη, ακετόνη, ακετυλακετόνη, μεθυλοβρωμίδιο, οξικό οξύ, φαινυλολίθιο και χλωροχρωμικό πυριδίνιο Σύνθεση κατά Danishefsky. To 1996, η ομάδα του Danishefsky χρησιμοποίησε μια επίσης συγκλίνουσα συνθετική οδό με πολλές ομοιότητες με εκείνης της σύνθεσης της ομάδας Nicolaou. Μία από τις αρχικές ενώσεις ήταν η κετόνη Wieland-Miescher, μια εξαιρετικά χρήσιμη και εμπορικά διαθέσιμη συνθόνη, η οποία έχει χρησιμοποιηθεί σε μεγάλο αριθμό ολικών συνθέσεων φυσικών προϊόντων. Μια επιπλέον διαφορά της συνθετικής πορείας - σε σχέση με τη σύνθεση της ομάδαςnicolaou - είναι η προηγούμενη εισαγωγή του οξετανικού δακτυλίου D στον κυκλοεξανικό δακτύλιο C, πριν από το κλείσιμο του κεντρικού οκταμελούς δακτυλίου Β. Και στη σύνθεση αυτή χρησιμοποίθηκε ένα πλήθος αντιδραστηρίων ως πρώτες ύλες, ως προστατευτικά μέσα ομάδων κ.α., όπως τα: κετόνη Wieland-Miescher, 2-μεθυλο-3- πεντανόνη, υδρίδιο αργιλίου-λιθίου, τετροξείδιο του οσμίου, φαινυλολίθιο, ακρυλοϋλοχλωρίδιο και χλωροχρωμικό πυριδίνιο. Κύριες αντιδράσεις μετασχηματισμών ήταν η αντίδραση Johnson-Corey-Chaykovsky ( μετατροπή καρβονυλικής ομάδας σε εποξειδική) και η αντίδραση Heck (εισαγωγή ομάδων σε αλκένια). 62

63 Συνοπτική παρουσίαση των ολικών συνθέσεων της ταξόλης από τις ομάδες (από αριστερά προς δεξιά) Holton-Nicolaou-Damishefsky από άποψη πρώτων υλών. Τα διάφορα χρώματα υποδεικνύουν τα τμήματα του μορίου της ταξόλης, που προέρχονται από διαφορετικές πρώτες ύλες. Εικόνα από: Παραγωγή της ταξόλης από την BMS μέσω φυτικών κυττάρων Η ημισυνθετική μέθοδος της ομάδας Holton κάλυψε τις ανάγκες σε ταξόλη για πολλά χρόνια (από το 1993). Ωστόσο, και αυτή ήταν πολύπλοκη. Χρειαζόταν 11 χημικές μετατροπές και 7 απομονώσεις. Ακόμη απαιτούσε τη χρήση 13 διαλυτών και 13 οργανικών αντιδραστηρίων και πολλά άλλα υλικά απαραίτητα για τους καθαρισμούς. Τελικά, η εταιρία Bristol-Myers Squibb προτίμησε μια βιοτεχνολογική μέθοδο ζύμωσης με κύτταρα φυτών (Plant Cell Fermentation Technology, PCF), που ανέπτυξε η βιοτεχνολογική εταιρία Phyton Biotech Inc και εφάρμοσε στο εργοστάσιό της στη Γερμανία. Η μέθοδος αυτή ξεκινάει με μάζες αδιαφοροποίητων κυττάρων (calluses) του ελάτου Τaxus, τα οποία πολλαπλασιάζονται σε υδατικό διάλυμα σε μεγάλους αντιδραστήρες ζύμωσης με προσθήκη θρεπτικών συστατικών (σάκχαρα, αμινοξέα, βιταμίνες, ιχνοστοιχεία) και υπό ελεγχόμενες συνθήκες. Η ταξόλη εκχυλίζεται άμεσα, καθαρίζεται με χρωματογραφία και απομονώνεται με κρυστάλλωση. Σε σύγκριση με την ημι-συνθετική, η βιοτεχνολογική μέθοδος είναι πολύ καλύτερη, δεν χρησιμοποιεί τοξικές ουσίες και διαλύτες και καταναλώνει ελάχιστη ενέργεια. Στην ουσία η μέθοδος είναι μια τυπική μέθοδος πράσινης χημείας (Green Chemistry) και αποδίδει τα ίδια προϊόντα με λιγότερα προβλήματα από περιβαλλοντική άποψη. Η BMS βραβεύθηκε 63

64 το 2004 με το βραβείο Πράσινης Χημείας στις ΗΠΑ και είναι η μόνη πλέον μέθοδος που χρησιμοποιείται σήμερα για την παραγωγή ταξόλης. Το 1993 ανακαλύφθηκε ότι η ταξόλη παράγεται στο έλατο από μύκητες που ζουν στο φλοιό του ελάτου, αλλά βρέθηκε ότι και άλλοι ενδοφυτικοί μύκητες (όπως ο Nodulisporium sylviforme) μπορούν να παράγουν την ταξόλη. Αντιδραστήρες ζύμωσης φυτικών κυττάρων σε μια από τις εγκαταστάσεις της Phyton Biotech Inc Κλινικές εφαρμογές Χορήγηση Η ταξόλη έχει εγκριθεί ως αντικαρκινικό φάρμακο για τους καρκίνους των ωοθηκών, του μαστού και των πνευμόνων. Επίσης έχει χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία του σαρκώματος Kaposi. Έχει εκτιμηθεί ότι το κόστος της θεραπείας ασθενούς με έγκαιρα διαγνωσμένο καρκίνο του μαστού (για 4 κύκλους θεραπείας) είναι περίπου 6000 δολάρια ΗΠΑ, ένω το κόστος της καθαρής (99,5%) ουσίας είναι περίπου 235 δολάρια ΗΠΑ για ποσότητα 1g ( τιμή Αυγούστου 2009). Η ταξόλη χορηγείται ενδοφλεβίως πάντοτε υπό ιατρική επίβλεψη. Ένα από τα μειονεκτήματα του φαρμάκου είναι η χαμηλή διαλυτότητά του στο νερό αλλά και στους περισσότερους φαρμακευτικώς αποδεκτούς διαλυτές. Στο εμπόριο διατίθεται σε φιαλίδια ως διάλυμα σε μίγμα (1:1) αιθανόλης και μίας υγρής μη- ιοντικής επιφανειακώς ενεργού ουσίας, με την εμπορική ονομασία Cremophor L (προϊόν της BASF). To Cremophor L είναι υδατοδιαλυτό, πολυοξυαιθυλιωμένο παράγωγο του καστορέλαιου. Παρασκευάζεται με αντίδραση του καστορέλαιου με αιθυλονοξείδιο 64

65 σε γραμμομοριακή αναλογία 1 προς 35. Το Cremophor L δρα ως γαλακτωματοποιητής (emulsifier), είναι ικανοποιητικά ανεκτός από τον οργανισμό. Πριν από την ενδοφλέβια χορήγηση, το διάλυμα αυτό αραιώνεται με φυσιολογικό ορό ή διάλυμα γλυκόζης 5%, οπότε δημιουργείται ένα εναιώρημα ταξόλης. Έχουν προταθεί αρκετοί άλλοι βελτιωμένοι τρόποι χορήγησης της ταξόλης (περισσότερο ανεκτοί από τους ασθενείς, ταχύτερη διαδικασία χορήγησης), όπως υπό τη μορφή λιποσωμάτων ή νανοσωματιδίων. Υδατοδιαλυτά είναι και ορισμένα συμπλέγματα ταξόλης με δεξτράνες και κυκλοδεξτρίνες. Ένα σκεύασμα με την εμπορική ονομασία Abraxane είναι σύζευγμα ταξόλης-αλβουμίνης και διατίθεται σε μορφή σκόνης μετά από λυοφιλίωση. Το Abraxane υπόκειται σε ανασύσταση με νερό και παρέχει ενέσιμο εναιώριμα λίγο πριν από τη χορήγηση σε ασθενείς. Η ταξόλη, ως δραστικότατο αντικαρκινικό χημειοθεραπευτικό φάρμακο, προκαλεί σοβαρές και δυσάρεστες παρενέργειες παροδικού χαρακτήρα. Σε αυτές περιλαμβάνονται: πλήρη απώλεια τριχοφυίας, αναιμία, αιμορραγίες, πόνοι στους μυς και στις αρθρώσεις, διάρροια, εμετοί, βραδυκαρδία, υπόταση, αλλά και υπέρταση. Η σοβαρότητα των παρενεργειών δεν επιτρέπει τη χρήση της ταξόλης σε περιπτώσεις παιδικών καρκίνων. 5.7 Αντικαρκινικά φάρμακα παρόμοιας δομής Ταξάνια Τα τελευταία χρόνια έχουν εγκριθεί παρόμοια αντικαρκινικά φάρμακα παρόμοιας δομής και δράσης με εκείνης της ταξόλης. Τυπικό παράδειγμα αποτελεί το φάρμακο ντοκοταξέλη (docotaxel) με την εμπορική ονομασία Taxotere. Η ντοκοταξέλη διαφέρει δομικά από την ταξόλη σε δύο μόνο σημεία που την καθιστά περισσότερο υδατοδιαλυτή σε σχέση με την ταξόλη: Τι υδροξείδιο του C-10 είναι ελεύθερο και στην ουρά C-13 υπάρχει μια ομάδα καρβαμιδικού εστέρα της t-βουτυλικής αλκοόλης αντί της ομάδας του βενζυλαμιδίου. Η ομάδα των φαρμάκων αυτών ονομάζονται συλλογικά ταξάνια και η φυσιολογική τους δράση είναι παρόμοια. Όλα τα ταξάνια περιλαμβάνουν ως κύριο δομικό στοιχείο το διτερπένιο ταξαδιένιο, το οποίο παράγεται από τα έλατα του γένους Taxus. Η βιοσύνθεση του ταξαδιενίου και της ταξόλης έχουν ως αποτελέσει αντικείμενο έντονης έρευνας και τα κύρια στάδιά της έχουν διευκρινισθεί. 65

66 Κεφάλαιο 6 Αντιικά Φάρμακα Σύνθεση και Εφαρμογές Φωσφορικής Οσελταμιβίρης (Tamiflu) 6.1 Γενικά για τους Ιούς Οι ιοί (viruses, από τη Λατινική λέξη virus: τοξίνη, δηλητήριο) αν και φαίνεται να συμπεριφέρονται ως ζωντανές οντότητες, στην πραγματικότητα δεν είναι. Δεν θεωρούνται ως ζωντανοί οργανισμοί διότι είναι αδύνατον να φέρουν σε πέρας όλες τις διεργασίες που χαρακτηρίζουν τους ζωντανούς οργανισμούς, δηλαδή: Δεν αποτελούνται από κύτταρα Δεν αναπαράγονται από μόνοι τους Δεν μπορούν να μεγαλώσουν και να υποδιαιρεθούν Δεν έχουν τη δυνατότητα ενεργειακών μετασχηματισμών (τροφή/ανάπτυξη) Δεν διαθέτουν μηχανισμούς πρωτεϊνοσύνθεσης Οι ιοί, ως ανεξάρτητες οντότητες, ανακαλύφθηκαν το 1892 από το Ρώσο βιολόγο Dimitry Ivanovsky, ο οποίος είχε αναλάβει να εξετάσει μια ασθένεια που παρουσιάστηκε στις καπνοκαλλιέργειες της Kριμαίας. Οι μελέτες του οδήγησαν στον χαρακτηρισμό του ιού της ασθένειας του καπνού, γνωστού πλέον ως ιού του μωσαϊκό καπνού (tobacco mosaic virus, TMV). Οι ιοί επιβιώνουν και πολλαπλασιάζονται χρησιμοποιώντας τους χημικούς μηχανισμούς ζώντων κυττάρων (ενδοκυτταρικά παράσιτα) άλλων οργανισμών, τα οποία χαρακτηρίζονται ως κύτταρα-ξενιστές. Οι ιοί αναπαράγωνται μόνο ενσωματώνοντας το γενετικό υλικό τους στο γονιδίωμα του κυττάρου-ξενιστή. Εκεί, σαν λαθρεπιβάτες, χρησιμοποιούν τους φυσιολογικούς μηχανισμούς σύνθεσης πρωτεϊνών και τα ένζυμά τους για τον πολλαπλασιασμό τους, μετατρέποντας τα κύτταρα-ξενιστές σε βιομηχανίες ιών. Εκεί αναπαράγονται δίνοντας πιστά αντίγραφά τους, συχνά όμως και με ορισμένα λάθη, οπότε προκύπτουν νέοι μεταλλαγμένοι ιοί. Το μέγεθος των ιών κατά κανόνα βρίσκεται στην περιοχή των 0,025-0,25μm. Τυπικά θεωρείται ότι έχουν το 1/100 του μεγέθους ενός βακτηρίου, δεν είναι ορατοί με τα οπτικά μικροσκόπια γεγονός που αρχικά τους προσέδωσε τον χαρακτηρισμό αόρατη μολυσματική ύλη. Οι ιοί είναι ορατοί μέσω πανίσχυρων ηλεκτρονικών μικροσκοπίων. 66

67 Διάφορες οικογένειες ιών (γενετικό υλικό, περίβλημα, σχήμα-μέγεθος) Εικόνα από: Οι ιοί αποτελούνται από νουκλεϊκά οξέα, δηλ. ριβοζονουκλεϊκά οξέα (RNA) ή δεοξυριβοζονουκλεϊκά οξέα (DNA), σε μονό ή διπλό κλώνο ή κυκλική αλυσίδα, που αποτελούν το γενετικό τους υλικό και περιέχουν τις απαραίτητες πληροφορίες για τη δημιουργία αντιγράφων τους και από ένα προστατευτικό πρωτεϊνικό καψίδιο, το οποίο τα περιβάλει. Πολλοί ιοί περιβάλλονται από μια μεμβρανώδη στιβάδα αποτελούμενη από λιπίδια και πρωτεϊνες. Επιπλέον στις επιφάνειες τους υπάρχουν θέσεις χημικής αναγνώρισης των κυττάρων-ξενιστών, στα οποία θα εισβάλουν. Πριν εισβάλει σε ένα κύτταρο, ο ιός βρίσκεται σε εξωκυτταρική κατάσταση, δηλ. στην πλήρη μορφή που περιγράφηκε. Μόλις εισβάλει στο κύτταρο, αποβάλει το καψίδιο και υφίστανται μόνο ως γενετικό υλικό (δηλ. ως νουκλεϊκά οξέα). Μέτα την παραγωγή ενός αριθμού ιών, το κύτταρο-ξενιστής πεθαίνει, λόγω καταστροφής της μεμβράνης του ή επειδή η παραγωγή νέων ιών δεν το αφήνει να αναπηρώσει τις χρήσιμες για τη ζωή του πρωτεϊνες. Σε λίγες περιπτώσεις τα κύτταρα- ξενιστές συνεχίζουν κανονικά τη λειτουργία τους, ενώ σε άλλες οι ιοί παραμένουν σ αυτά σε λανθάνουσα κατάσταση (ανενεργοί ιοί για μακρά χρονική περίοδο. 6.2 Ιοί γρίπης Υπάρχουν τρεις γενικοί τύποι ιών γρίπης που χαρακτηρίζονται ως Α, Β, και C. Οι δύο πρώτοι προκαλούν ουσιαστικά ίδιες νόσους, ο ιός Α οδηγεί συνήθως στις μεγάλες επιδημίες και προσβάλει ανθρώπους και ορισμένα ζώα (χοίρους, πτηνά, άλογα, φώκιες). Ο ιός Β προσβάλει μόνο ανθρώπους και κυρίως νεαρά άτομα. Ο ιός C προσβάλει ανθρώπους και χοίρους και προκαλεί ελαφρότερες μορφές της νόσου, σαν απλό κρυολόγημα. 67

68 Γενική μορφή των ιών γρίπης. Εικόνα από: Οι ιοί της γρίπης Α έχουν διάμετρο nm (όσο περίπου το μήκος δεσμών C- H στη σερά) και στην επιφάνειά τους έχουν περίπου 500 ακίδες γλυκοπρωτεϊνών (πρωτεϊνες ομοιοπολικά συνδεδεμένες με υδατάνθρακες και παράγωγά τους) προσαρμοσμένων σε μια μεμβράνη λιπιδικής διπλοστοιβάδας. Οι ιοί της γρίπης Α και Β κατηγοροποιούνται ανάλογα με τις δύο γλυκοπρωτεϊνες των ακίδων της επιφάνειάς τους: αιμοσυγκολλητίνη, που αποτελεί περίπου το 80% των ακίδων και τη νευραμιδάση, που αποτελεί το υπόλοιπο 20%. Οι δομές των γλυκοπρωτεϊνών αυτών μπορεί να διαφέρουν σε ορισμένα σημεία λόγω της ταχείας μετάλλαξης που μπορεί να υποστεί το γονιδίωμα του ιού. Έτσι δημιουργούνται διάφορες ποικιλίες του ιού, γνωστές ως υπότυποι. Κάθε υπότυπος μπορεί να κατηγοριοποιηθεί παραπέρα σε στελέχη ανάλογα με την ακολουθία και τη συγγένεια του γενετικού τους υλικού. Για την περιγραφή των υπότυπων ιών της γρίπης Α, ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας καθιέρωσε τη συντομογραφία HxNy, όπου x και y οι αριθμοί που χαρακτηρίζουν τους τύπους αιμοσυγκολλητίνης και νευραμινιδάσης, αντίστοιχα. Υπάρχουν 16 διαφορετικοί τύποι αιμοσυγκολλητίνης (Η1-Η16) και 9 διαφορετικοί τύποι (Ν1-Ν9), που είναι γνωστοί στους ιούς γρίπης των πτηνών. Στους ιούς γρίπης του ανθρώπου έχουν βρεθεί οι αιμοσυγκολλητίνες Η1-Η3 και οι νευραμινιδάσεις Ν1 και Ν2. Οι γλυκοπρωτεϊνες Η και Ν είναι απολύτως απαραίτητες για τη μολυσματικότητα και μεταδοτικότητα του ιού. Η αιμοσυγκολλητίνη είναι υπεύθυνη για την πρόσδεση και την είσοδο του ιού στα κύτταρα ξενιστές. Η νευραμινιδάση είναι υπεύθυνη για την έξοδο των νέων ιών από τα κύτταρα, όπως επίσης και για την ευκινησία του ιού στις βλέννες του αναπνευστικού συστήματος. Επίσης παρουσιάζουν ισχυρές αντιγονικές ιδιότητες (χαρακτηρίζονται και ως αντιγόνα Η και Ν), δηλαδή διεγείρουν το ανοσολογικό σύστημα του προσβληθέντος οργανισμού με 68

69 αποτέλεσμα την παραγωγή αντισωμάτων. Αντισώματα που προσβάλουν την αιμοσυγκολλητίνη προσφέρουν ανοσία εξουδετερώνοντας τον ιό, ενώ εκείνα που προσβάλουν την νευραμινιδάση περιορίζουν τη μεταδοτικότητα του ιού από το ένα κύτταρο στο άλλο. Φωτογραφία μέσω ηλεκτρονικού μικροσκοπίου του ιού Η1Ν1. Εικόνα από: Μετάλλαξη των ιών γρίπης. Οι διάφοροι τύποι του ιού της γρίπης έχουν την τάση να υφίστανται μονοσημειακές μεταλλάξεις που οδηγούν σε μερικώς διαφοροποιημένα επιφανειακά αντιγόνα Η και Ν. Αποτέλεσμα των μεταλλάξεων αυτών είναι η μη αναγνώριση των νέων αντιγόνων από αντισώματα ήδη υπάρχοντα στον προσβεβλημένο οργανισμό. Έτσι, ένας οργανισμός μπορεί να προσβληθεί επανειλημμένως από γρίπη, αφού κάθε φορά αντιμετωπίζει έναν ελαφρά τροποποιημένο ιό ως προς τον οποίο δεν έχει αναπτύξει ανοσία. Τα προβλήματα εμφανίζονται αν δύο υπότυποι του ιού βρεθούν ταυτόχρονα στον ίδιο οργανισμό (πχ. Χοίρο ή άνθρωπο). Τότε μπορεί να πραγματοποιηθεί ανταλλαγή ολόκληρων τεμαχίων RNA μεταξύ των δύο υπότυπων με αποτέλεσμα τη γενετική αναδιοργάνωση του ιού και τη δημιουργία ενός νέου υπότυπου. Τέτοιες μεγάλες αλλαγές στο RNA, παρατηρούνται μόνο στον ιό της γρίπης και είναι σπάνιες, αν όμως συμβούν μπορούν να προκαλέσουν πανδημίες. 69

70 6.3 Αντιικά Φάρμακα Τα αντιικά φάρμακα (antiviral drugs) αποτελούν μια τάξη φαρμακευτικών ουσιών για τη θεραπεία μολύνσεων από ιούς. Όπως και στην περίπτωση των αντιβιοτικών για τα βακτήρια, έτσι και ένα ορισμένο αντιιικό φάρμακο δρα επιλεκτικά εναντίον ενός συγκεκριμένου ιού. Σε αντίθεση με τα ιοκτόνα φάρμακα (viricides) τα οποία δρουν εξωσωματικά, τα αντιικά φάρμακα δρουν στο εσωτερικό του σώματος, αποτρέποντας τον πολλαπλασιασμό των ιών και επομένως πρέπει να είναι σχετικώς αβλαβή για τους ξενιστές. Όπως συμβαίνει και στα αντιμικροβιακά φάρμακα, έτσι και στα αντι-ιικά φάρμακα εμφανίζεται το πρόβλημα της ανάπτυξης ανθεκτικότητας (drug resistance), καθώς τα παθογόνα υπόκεινται με το χρόνο σε μεταλλάξεις και ανθίστανται στη θεραπεία καθιστώντας τα φάρμακα συνεχώς και λιγότερο αποτελεσματικά. 6.4 Τα αντιικά φάρμακα Relenza και Tamiflu Τα πλέον δραστικά και πετυχημένα αντιικά φάρμακα για την πρόληψη και θεραπεία της γρίπης είναι η ζαναμιβίρη (zanamivir) με εμπορικό όνομα Relenza και η οσελταμιβίρη (oseltamivir) με εμπορικό όνομα Tamiflu (φωσφορικό άλας οσελταμιβίρης). Και τα δύο δρουν ως αναστολείς των νευραμινιδασών, που βρίσκονται στην επιφάνεια των ιών γρίπης τύπου Α και Β και παρεμποδίζουν την απελευθέρωση των νέων ιών από το κύτταρο-ξενιστή Νευραμινιδάσεις Οι νευραμινιδάσεις (ή σιαλιδάσεις) είναι μια οικογένεια ενζύμων που βρίσκονται σε μια μεγάλη ποικιλία οργανισμών και ανήκουν στις υδρολάσες. Γενικά, υδρολύουν τους γλυκοζιτικούς δεσμούς των σιαλικών οξέων. Σιαλικά οξέα (sialic acids) είναι γενική 70

71 ονομασία των Ο- ή Ν- υποκατεστημένα παράγωγα (συνήθως ακετυλοπαράγωγα) του νευραμινικού οξέος. Οι ακίδες αιμοσυγκολλητίνης που βρίσκονται στις επιφάνειες των ιών συνδέονται με τις ομάδες σιαλικών οξέων των μεμβρανών των κυττάρων της άνω αναπνευστικής οδού. Οι ομάδες αυτές αποτελούν τα σημεία προσκόλλησης των κυττάρων με τους ιούς της γρίπης. Μετά την προσβολή του κυττάρου και τη μετατροπή του σε κύτταρο-ξενιστή, οι νεοπαραχθέντες ιοί εξέρχονται (εκβλάστηση) από τη μεμβράνη του κυττάρου, αλλά παραμένουν προσκολλημένοι στην επιφάνειά του παγιδευμένοι από τις ίδιες ομάδες σιαλικών οξέων. Τότε, νευραμινιδάση των ιών καταλύει την υδρόλυση αυτών γεγονός που τους αποδεσμεύει από την επιφάνεια του κυττάρου-ξενιστή. Χωρίς τη νευραμινιδάση, ένας ιός θα μπορούσε να προκαλέσει μόνο ένα κύκλο αντιγραφής, κάτι που δεν θα επαρκούσε να οδηγήσει σε ασθένεια. Επιπλέον, οι νευραμινιδάσεις αποτρέπουν τον σχηματισμό συσσωματωμάτων μεταξύ των ίδιων των ιών, λόγω αυτοσυγκόλλησής τους και διευκολύνουν την κινητικότητά τους, διασπώντας τις ομάδες σιαλικών οξέων της βλέννας των αεραγωγών του αναπνευστικού συστήματος. Ο μηχανισμός δράσης των αναστολέων της νευραμινιδάσης δείχνεται παραστατικά παρακάτω. Τα μόρια του αναστολέα (ζαναμιβίρη ή οσελταμιβίρη) μπλοκάρουν τα ενεργά κέντρα της νευραμινιδάσης, οπότε ο νέος ιός παραμένει δεσμευμένος στην επιφάνεια του κυττάρου-ξενιστή.τυπική δράση της νευραμινιδάσης και του αναστολέα της: Μόλις αναπαραχθεί και εξέλθει ο νέος ιός γρίπης από το κύτταρο-ξενιστή, προσκολλάται στην επιφάνειά του μέσω των ακίδων αιμοσυγκολλητίνης. Στον μηχανισμό της "προσκόλλησης" εμπλέκονται ενεργά οι ομάδες σιαλικών οξέων. Τα σιαλικά οξέα βρίσκονται στις διάφορες γλυκοπρωτεΐνες της επιφάνειας του κυττάρου-ξενιστή και τον ίδιο μηχανισμό προσκόλλησης εκμεταλλεύεται ο ιός για να προσβάλλει ένα νέο κύτταρο-ξενιστή. Για να απελευθερωθεί πρέπει η παρακείμενη νευραμινιδάση να "κόψει" ενζυματικά το δεσμό αυτόν από τις γλυκοπρωτεΐνες του ξενιστή. Η παρουσία αναστολέα της νευραμινιδάσης (όπως του Tamiflu) δεν επιτρέπει στον ιό να αποκολληθεί από την επιφάνεια του κυττάρου-ξενιστή. Ο σημαντικός ρόλος των νευραμινιδασών στη δράση των ιών, σε συνδυασμό με το ότι αποτελούν καθοριστικό κέντρο αντιγονικής δράσης στην επιφάνειά τους, τις κατέστησε βασικό στόχο κάθε αντιγριπικού φαρμάκου. Ένα πλέον πλεονέκτημα των νευραμινιδασών ως στόχος μικρών μορίων-αναστολέων σε σχέση με τις άλλες πρωτεϊνες της επιφάνειας του ιού, είναι το ότι παρουσιάζουν τις σχετικά λιγότερες δομικές μεταβολές σε περιπτώσεις μεταλλάξεων του ιού, γεγονός που περιορίζει τις πιθανότητες ανάπτυξης ανθεκτικότητας των ιών απέναντι του ανντιγριπικού φαρμάκου. Το πρόβλημα αυτό παρουσιάζεται έντονο σε αντιικά φάρμακα παλαιότερης γενεάς, όπως η αμανταδίνη και η ριμανταδίνη (απλά παράγωγα του αδαμαντάνιου) οι οποίες δρουν ως αναστολείς της 71

72 πρωτεϊνης Μ2, που βρίσκεται στην επιφάνεια του ιού και δρα ως δίαυλος ιόντος υδρογόνου. Η πρωτεϊνη Μ2 είναι απαραίτητη για την απελευθέρωση των νουκλεϊκών οξέων του ιού μέσα στο κύτταρο-ξενιστή. Εικόνα από: Το Relenza χορηγείται ως εισπνεόμενη λεπτή σκόνη (μέσω ειδικού εισπνευστήρα) και παρουσιάζει σχετικά μικρή βιοδιαθεσιμότητα και είναι δυνατόν να μη γίνει καλά ανεκτό από άτομα που πάσχουν από αναπνευστικά προβλήματα. Το Tamiflu χορειγείται από το στόμα και παρουσιάζει εξαιρετική απορρόφηση από το πεπτικό σύστημα. Το Tamifu υδρολύεται (διάσπαση του εστερικού δεσμού) στο ήπαρ, παρέχοντας τον δραστικό μεταβολίτη, το ελεύθερο οξύ της οσελταμιβίρης και αποβάλλεται μέσω των νεφρών Σύνθεση της οσελταμιβίρης H τυπική σύνθεση της οσελταμιβίρης, ξεκινά με πρώτη ύλη το σικιμικό οξύ. Το σικιμικό οξύ βρίσκεται σε μικρές ποσότητες στους περισσότερους αυτότροφους οργανισμούς, δηλ. οργανισμούς που παράγουν σύνθετες οργανικές ενώσεις από απλά ανόργανα μόρια με ενέργεια από το φως (φωτοσύνθεση) ή από ανόργανες χημικές αντιδράσεις. Το σικιμικό οξύ εμπλέκεται σε πολλούς βιοχημικούς κύκλους και αποτελεί πρόδρομο ένωσης της βιοσύνθεσης των αρωματικών αμινοξέων και πολλών αλκαλοειδών. 72

73 Το σικιμικό οξύ απομονώνεται συνήθως από ένα είδος γλυκάνισου το illicium anisatum, γνωστό με ονόματα όπως ιαπωνικό αστέρι, ιαπωνικός ή κινεζικός γλυκάνισος, γλυκάνισος αστεροειδής, του οποίου οι πόροι του περιέχουν 3 έως 7% σικιμικό οξύ. Αναφέρεται ότι η πτώση της παραγωγής Tamiflu κατά το 2005, οφειλόταν στη μειωμένη περιεκτικότητα σε σικιμικό οξύ του αστεροειδούς γλυκάνισου που είχε εισαχθεί από την Κίνα. Το θαμνώδες φυτό illicium anisatum. Eικόνα από: Λόγω της περιορισμένης παραγωγής σικιμικού οξέος από φυσικές πηγές, έχουν αναπτυχθεί βιοτεχνολογικές μέθοδοι παραγωγής μικροοργανισμών με αυξημένα επίπεδα σικιμικού οξέος. Επίσης έχουν δημοσιευτεί και άλλα συνθετικά σχήματα παρασκευής οσελταμιβίρης, όπου δεν χρησιμοποιείται το σικιμικό οξύ ως πρώτη ύλη. Ιδιαίτερη σημασία για τη σύνθεση έχει ο έλεγχος της στερεοχημείας των προϊόντων στα επιμέρους στάδια. Η οσελταμιβίρη διαθέτει 3 ενεργά στερεοχημικά κέντρα και επομένως υπάρχουν 8 στερεοχημικώς ισομερή και από αυτά μόνο το ένα παρουσιάζει την επιθυμητή φαρμακευτική δράση Τυπική σύνθεση Tamiflu Η σύνθεση της φωσφορικής οσελταμιβίρης ξεκινώντας με το φυσικό (-) σικιμικό οξύ είναι αρκετά πολύπλοκη λαμβάνοντας υπόψη την ανάγκη ελέγχου της στερεοχημείας των προϊόντων κάθε σταδίου. Ενδεικτικό είναι το σχήμα Karpf-Trussardi που περιληπρικά 73

74 αναφέρεται παρακάτω και στο οποίο χρησιμοποιόυνται αρκετά από τα πλέον εξειδικευμένα αντιδραστήρια της σύγχρονης οργανικής σύνθεσης. Σε πρώτη φάση σχηματίζειται ο αιθυλικός εστέρας (2) του σικιμικού οξέος (1) με επίδραση θειονυλοχλωριδίου και στη συνέχεια αιθυλικής αλκοόλης. Με επίδραση διαιθυλοκετόνης (3-πεντανόνης) παρουσία π-τουλουολοσουλφονικού οξέος σχηματίζεται η αντίστοιχη κετάλη (3). Με επίδραση μεθανοσουλφονυλοχλωριδίου- γνωστού ως μεσυλοχλωριδίουπαρουσία τριαιθυλαμίνης, μεσυλιώνεται το ελεύθερο υδροξύλιο (4). Εικόνα από : Με αναγωγική διάνοιξη του ακεταλικού δακτυλίου με βοράνιο υπό τη μορφή του σταθερού συμπλόκου του με διμεθυλοαιθειαθέρα και τριφθορομεθανοσουλφονικό τριμεθυλοπυριτύλιο, σχηματίζεται μη διαχωρίσιμο μίγμα ισομερών μεσυλικών εστέρων (5). 74