ΘΕΜΑ: ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΩΝ ΤΟΥ ΕΝΤΕΡΟΚΟΚΚΟΥ STREPTOCOCCUS FAECIUM

Transcript

1 ΕΛ.ΚΕ.ΠΑ. ΙΝΣΤΙΤΟΥΤΟ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΩΝ ΕΦΑΡΜΟΓΩΝ ΜΟΝΑ Α ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΣΕΜΙΝΑΡΙΟ: ΕΞΟΙΚΟΝΟΜΗΣΗ ΕΝΕΡΓΕΙΑΣ ΜΕ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΘΕΜΑ: ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΩΝ ΤΟΥ ΕΝΤΕΡΟΚΟΚΚΟΥ STREPTOCOCCUS FAECIUM ΚΩΝ/ΝΟΣ Ε. ΚΕΡΑΜΑΡΗΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΑΘΗΝΑ 1991 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ, ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ- ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Η.Μ. ΚΑΘ.: ΛΟΥΚΑΣ Χ. ΜΑΡΓΑΡΙΤΗΣ

2 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι στρεπτόκοκκοι είναι σφαιρικοί µικροοργανισµοί µε χαρακτηριστική διάταξη υπό µορφή αλυσίδας και µε ευρεία διάδοση στη φύση. Μερικοί από αυτούς αποτελούν µέλη της φυσιολογικής χλωρίδας του ανθρώπου, άλλοι προκαλούν σηµαντικές νόσους στον άνθρωπο, που αποδίδονται εν µέρει στην λοίµωξη από τους στρεπτόκοκκους και εν µέρει στην ευαισθητοποίηση του οργανισµού από αυτούς. Παράγουν διάφορες εξωκυττάριες ουσίες και ένζυµα. Η ικανότητά τους να αιµολύουν τα ερυθρά αιµοσφαίρια σε διάφορο βαθµό αποτελεί σηµαντικό χαρακτηριστικό για την ταξινόµησή τους. Μορφολογία και ταυτοποίηση Οι µεµονωµένοι κόκκοι έχουν σχήµα σφαιρικό ή ωοειδές και διατάσσονται σε σχηµατισµούς όµοιους µε αλυσίδες. ιαιρούνται σε επίπεδο κάθετο προς τον επιµήκη άξονα της αλυσίδας. Τα στοιχεία της αλυσίδας συχνά παρουσιάζουν χαρακτηριστική εµφάνιση διπλόκοκκου και περιστασιακά µπορούν να αναπτυχθούν βακτηριοειδείς µορφές. Το µήκος των αλυσίδων ποικίλλει ευρύτατα και καθορίζεται, τις πιο πολλές φορές, από παράγοντες του περιβάλλοντος. Μερικοί στρεπτόκοκκοι παράγουν έλυτρο πολυσακχαρικής φύσεως, που µοιάζει µε εκείνο των πνευµονιόκοκκων. Τα περισσότερα από τα στελέχη των οµάδων Α,Β και C παράγουν έλυτρο που αποτελείται από υαλουρονικό οξύ. Το έλυτρο, το οποίο σε πολύ πρόσφατα καλλιεργήµατα είναι πιο ευδιάκριτο, εµποδίζει τη φαγοκυττάρωση των µικροβίων. Το κυτταρικό τοίχωµα των στρεπτόκοκκων περιέχει πρωτεΐνες (αντιγόνα Μ, Τ, R), υδατάνθρακες (ειδικούς για την οµάδα) και πεπτιδογλυκάνες (εικ. 1). 2

3 Εικόνα 1: Αντιγονική σύσταση του κυττάρου των στρεπτόκοκκων της οµάδας Α. α) Το έλυτρο αποτελείται από υαλουρονικό οξύ. β) Πρωτεϊνικά αντιγόνα Μ, Τ, και R του κυτταρικού τοιχώµατος. γ) Ο ειδικός υδατάνθρακας για την οµάδα Α των στρεπτόκοκκων είναι η ραµνόζο-ν-ακετυλογλυκοζαµίνη. Καλλιέργεια Χαρακτηριστικά της αναπτύξεως Οι περισσότεροι στρεπτόκοκκοι αναπτύσσονται σε στερεά θρεπτικά υλικά, όπου παράγουν δισκοειδής αποικίες µε διάµετρο 1-2mm συνήθως. Στελέχη της οµάδας Α που φέρουν έλυτρο, συχνά σχηµατίζουν βλεννώδης (mucoid) αποικίες. Οι στρεπτόκοκκοι της οµάδας D, Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, αποτελούν µέλη της φυσιολογικής χλωρίδας της εντερικής οδού. Οι εντερόκοκκοι τυπικά αναπτύσσονται παρουσία 6.5% NaCl ή 40% χολής, αναστέλλονται αλλά δεν φονεύονται από τις πενικιλλίνες και βρίσκονται εκτός από το έντερο στο ουροποιητικό σύστηµα ή τις καρδιαγγειακές λοιµώξεις ή στη µηνιγγίτιδα. Έχει βρεθεί ότι συγκεκριµένοι εντερόκοκκοι δρουν ανταγωνιστικά στα Gram αρνητικά εντεροβακτήρια. Βοηθούν στην αποφυγή διαρροιών και προκαλούν αύξηση του βάρους των ζώων ή τροφή των οποίων έχει εµπλουτιστεί µε εντερόκοκκο. Εξωτοξίνες παραγόµενες από αερόβια αρνητικά κατά Gram εντερικά βακτήρια - Πρόκληση και αποφυγή διαρροιών. Πολλά εντερικά βακτήρια εκτός από την ενδοτοξίνη που περιέχουν τα ίδια παράγουν εξωτοξίνες µε σηµαντική ιατρική σπουδαιότητα. (Στον πίνακα 1 µερικά 3

4 βακτηρίδια είναι gram αρνητικά και µερικά gram θετικά. Μερικές από τις διάρροιες οφείλονται στις τοξίνες και άλλες στην εισβολή των µικροβίων). 4

5 Η εντεροτοξινογόνος Ε. coli είναι η πιο συνηθισµένη αιτία της «διάρροιας των ταξιδιωτών». Ορισµένα στελέχη E. coli παράγουν θερµοευαίσθητη εξωτοξίνη που η παραγωγή της βρίσκεται κάτω από γενετικό έλεγχο ενός µεταβιβαζοµένου πλασµιδίου. Η θερµοευαίσθητη αυτή τοξίνη αποτελείται από συνδεδεµένα πεπτίδια µε συνολικό µοριακό βάρος περίπου Οι υπoµoνάδες Α και Β έχουν διάφορες δράσεις. Η υποµονάδα Β πρoσκολλάται στην γαγγλιοσίδη GM1 της ψηκτροειδούς παρυφής των επιθηλιακών κυττάρων του λεπτού εντέρου. Η υποµονάδα Β διευκολύνει την είσοδο της υποµονάδας Α στο κύτταρο, όπου η Α (Μ.Β ) ενεργοποιεί την αδενυλική κυκλάση, η οποία µε την σειρά της αυξάνει σηµαντικά την τοπική συγκέντρωση της camp (κυκλική µoνoφωσφοσφορική αδενοσίνη). Aυτό προκαλεί έντονη και παρατεταµένη υπερέκκριση ύδατος και χλωριούχων στον εντερικό αυλό και αναστέλλει την επαναρρόφηση του νατρίου. Ο αυλός του εντέρου διατείνεται από τα υγρά και προκαλείται έντονη υπερκικητικότητα και διάρροια που διαρκεί αρκετές µέρες. Ορισµένα στελέχη Ε. coli παράγουν µια θερµoανθεκτική εντεροτοξίνη (Μ.Β. <5000) που βρίσκεται υπό γενετικό έλεγχο µιας ετερογενούς οµάδας πλασµιδίων. Πολλά τέτοια στελέχη παράγουν επίσης και θερµoανθεκτική εντεροτοξίνη και µπορούν να προκαλέσουν σoβαρή διάρροια. Η θερµoανθεκτική εντεροτοξίνη ενεργοποιεί τη γoυανυλική κυκλάση στα επιθηλιακά κύτταρα του εντέρου και διεγείρει την έκκριση υγρού. Τα πλασµίδια που µεταφέρουν τα γονίδια για την παραγωγή των εντεροτοξινών (θερµοευαίσθητης και θερµoανθεκτικής) είναι δυνατό να µεταφέρουν επίσης και γονίδια για την παραγωγή παραγόντων αποικισµού, που διευκολύνουν την προσκόλληση των στελεχών της E.coli στο επιθήλιo του εντέρου µε τον έλεγχο επιφανειακών αντιγόνων. Από την ικανότητα ορισµένων στελεχών E.coli καθώς και των Σιγγελλών να προσβάλλουν το επιφανειακό εντερικό επιθήλιο εξαρτάται ένας δεύτερος µηχανισµός προκλήσεως διάρροιας που έχει παρατηρηθεί. Ο µηχανισµός της αποφυγής διαρροιών µε την ανάπτυξη στο έντερο του Streptococcus faecium δεν είναι γνωστός. Πιθανόν να σχετίζεται µε την παρεµπόδιση της προσκόλλησης της E.coli στο εντερικό επιθήλιο. Αυτό θα µπορούσε να επιτευχθεί 5

6 είτε µε την µηχανική προστασία του επιθηλίου είτε µε την έκκριση βακτηριοσινών από τον στρεπτόκοκκο µε συνέπεια την µείωση του πληθυσµού των άλλων αρνητικών κατά gram βακτηρίων του εντέρου ή ακόµη και µε την θετική συνεισφορά του στις µεταβολικές διαδικασίες. Πρέπει εδώ να αναφερθεί η µεγάλη σηµασία των εντεροβακτηρίων για την σύνθεση βιταµίνης Κ, την µετατροπή χολοχρωστικών και χολικών οξέων, την απορρόφηση θρεπτικών ουσιών και προϊόντων διασπάσεως και τον ανταγωνισµό προς τα µικροβιακά παθογόνα. ΣΚΟΠΟΣ Η παρούσα µελέτη εντάσσεται στα πλαίσια γενικότερου προγράµµατος του εργαστηρίου που σκοπό έχει την παραγωγή στερεού σκευάσµατος του στρεπτόκοκκου που είναι ανθεκτικό στις περιβαλλοντικές συνθήκες (υγρασία και θερµοκρασία) εξασφαλίζοντας την προστασία και βιωσιµότητα του µικροοργανισµού. Το σκεύασµα θα χρησιµοποιηθεί αναµεµειγµένο µε τροφή για την βελτίωση της θρέψης των ζώων (βοοειδών, χοιρινών, κοτόπουλων, ψαριών). Αυτό θα έχει ως αποτέλεσµα την βελτίωση της ποιότητας και του βάρους των ζώων. Έτσι η αποφυγή κατά τη θρέψη αντιβιοτικών και ορµονών θα είναι σε όφελος της ποιότητας ενώ η ελάττωση των ζωοτροφών θα έχει ως συνέπεια την µείωση του κόστους παραγωγής. Στην µελέτη αυτή ερευνάται η ποιότητα και η µορφή του τελικού προϊόντος µε µεθόδους ηλεκτρονικής και φωτονικής µικροσκοπίας. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Βιολογικό υλικό α) Ανάπτυξη του εντερόκοκκου S. faecium σε βιοαντιδραστήρα σύµφωνα µε διαδικασία που έχει αναπτυχθεί στο εργαστήριο Βιοτεχνολογίας του Ινστιτούτου Τεχνολογικών Εφαρµογών του ΕΛΚΕΠΑ. β) Συµπύκνωση του ενερόκοκκου και ανάµειξή του µε προστατευτικά υλικά, όπως αραβικό κόµµι ή/και αλγινικό νάτριο. γ) Το τελικό σκεύασµα προέρχεται από το πέρασµα του µίγµατος του εντερόκοκκου από spray - dryer µε στόχο την αποµάκρυνση του νερού και την 6

7 έγκλειση του στρεπτόκοκκου σε στοιβάδες. Αυτό είναι το τελικό προϊόν που εξετάζεται µορφολογικά. δ) Σκεύασµα στρεπτόκοκκου µε αραβικό κόµµι αναµιγνύεται µε διάλυµα αλγινικού νατρίου 2%. Σταγόνες του διαλύµατος ρίχνονται σε διάλυµα CaCl 2 1M οπότε σχηµατίζονται σφαιρίδια (pellets), τα οποία ελέγχονται µορφολογικά στο φωτονικό και ηλεκτρονικό µικροσκόπιο. Εγκλείσεις Η διαδικασία περιλαµβάνει µονιµοποίηση του σκευάσµατος µε 2% γλουταρική αλδεΰδη (Tousimis R.C.) και 2% φορµαλδεΰδη (Tousimis R.C.) σε 0,1Μ διάλυµα κακοδυλικού νατρίου, ξέπλυµα µε 4% σακχαρόζη σε κακοδυλικό νάτριο, δεύτερη µονιµοποίηση µε 2% τετροξείδιο του οσµίου (Tousimis R.C.) και ξέπλυµα µε το ίδιο διάλυµα. Ακολουθεί αφυδάτωση σε αυξανόµενη συγκέντρωση αλκοολών (30% έως 100% τελείως αφυδατωµένη) και τέλος διαπότιση µε ρητίνη και προπυλενοξείδιο σε αναλογίες 1:3, 1:1, 3:1 και καθαρή ρητίνη (µίγµα Araldite 502 ή 506, Epon 812 και DDSA-Tousimis R.C.). Ο πολυµερισµός έγινε µε επιταχυντή DΜΡ-30 σε κλίβανο 65 o C (Μαργαρίτης, 1980). Τοµές και Χρώσεις Οι τοµές έγιναν σε υπερµικροτόµο Sorval MT-1 και MT-2 και χρησιµοποιήθηκαν γυάλινα και αδαµάντινα µαχαίρια. Για την φωτονική µικροσκοπία χρησιµοποιήθηκαν αντικειµενοφόροι καλυµµένες µε ζελατίνα. Σ' αυτές τοποθετήθηκαν πάνω σε σταγόνες νερού τοµές πάχους 2-4µm. Χρώση των τοµών έγινε µε µπλε της τολουιδίνης (Droz et. al. 1976) (Εικ. 1, 2, 3). Για την ηλεκτρονική µικροσκοπία χρησιµοποιήθηκαν χάλκινα πλέγµατα 200 mesh (Tousimis R.C.). Οι τοµές είχαν πάχος Å. Η χρώση των τοµών έγινε µε 7% οξεικό ουρανύλιο (Watson, 1958) και 0,2% κιτρικό µόλυβδο (Venable and Coggeshall, 1965) (Εικ. 4). 7

8 Παρατήρηση Η εξέταση των δειγµάτων έγινε µε τα εξής µικροσκόπια: Στερεοσκοπικό µικροσκόπιο Zeiss Stereo IV. Φωτονικό µικροσκόπιο Leitz ortholux µε σύστηµα αντίθεσης φάσεως συνεχούς µεταβολής, συγκεντρωτικό φακό σκοτεινού πεδίου, σύστηµα φθορισµού µε λάµπα υπεριώδους xenon, φακούς επiπεδους αχρωµατικούς. Ηλεκτρονικό µικροσκόπιο διέλευσης Philips ΕΜ 200 (60KV). Φωτογραφικές διατάξεις και υλικά Κατά τη φωτογραφική εργασία χρησιµοποιήθηκαν τα ακόλουθα µηχανήµατα και υλικά: Μεγεθυντήρας Laborator 138 (Durst S.A. Bolzano-Bozen). Εστίαση µε Scoponet. ιάταξη εµφάνισης φωτογραφιών Rapidoprint LD 37 (Agfa Gevaert). Φίλµ φωτονικού µικρoσκoπίoυ Panatomic Χ (Kodak). Εµφανιστής DK-50 (Kodak) (αραίωση 1:1) για 5min, ή HC-110 (Kodak) (αραίωση 1:25) για 4-5min, σε θερµοκρασία 20 ο C. Fixer (Kodak). Φίλµ ηλεκτρονικού µικροσκοπίου 35FGP 5302 (Kodak). Εµφανιστής D-19 (Kodak) για 3.5 min. Φωτογραφικό χαρτί rapidoprint Ρ1-1 έως Ρl-4 (Agfa Gevaert). Εµφανιστής χαρτιού rapidoprint G180B activator (Agfa Gevaert) ή Neutol (1:10) ή Ektaflo (1:3) (Kodak). Στερεωτής rapidoprint G382B stabilizator (Agfa Gevaert) ή Fixer (Kodak). 8

9 Εικ. 1) Φωτονιογραφία στρεπτόκοκκων µετά από µονιµοποίηση του σκευάσµατος σε διάλυµα 2% φορµαλδεύδης σε PBS και άπλωµα σε αντικειµενοφόρο πλάκα καλυµµένη µε ζελατίνη. Οι κόκκοι χρωµατίζονται µπλε µε τουλουϊδίνη. Παρατηρούµε την τυχαία κατανοµή των κόκκων (x160). Εικ. 2) Φωτονιογραφία µετά απο έγκλειση του σκευάσµατος σε ρητίνη. Οι κόκκοι χρωµατίζονται µπλε. Το αραβικό κόµµι δεν διακρίνεται (x40)..; Εικ. 3) Φωτονιογραφία όπως εικ. 2 (x160). Εικ. 4) Ηλεκτρονιογραφία στρεπτόκοκκου (x192000). 9

10 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 1. Μορφολογική µελέτη τελικών σκευασµάτων S. faecium. Όπως έχει αναφερθεί στα υλικά και µεθόδους η ανάπτυξη του µικροοργανισµού γινόταν κάτω από ελεγχόµενες συνθήκες σε βιοαντιδραστήρα. Το µικροβιακό υλικό υποβαλλόταν σε συµπύκνωση µε φυγοκέντρηση και στη συνέχεια αναµειγνυόταν σε διάφορες αναλογίες µε αραβικό κόµµι ή αλγινικό νάτριο ή και µε τα δύο ταυτόχρονα. Το µίγµα µε σκοπό την ξήρανσή του και την έγκλειση του µικροοργανισµού σε στοιβάδες που θα τον προστάτευαν από το περιβάλλον υποβαλλόταν σε διαδικασία ξήρανσης µε ξεκασµό και στροβιλισµό σε spray - dryer. Εξετάσαµε τέσσερα τέτοια τελικά δείγµατα (SF1, SF6, SF10, SF13) µε µεθόδους φωτονικής και ηλεκτρονικής µικροσκοπίας και διερευνήσαµε τόσο την κατάσταση των µικροοργανισµών µετά την διαδικασία ξήρανσης όσο και την επίτευξη ή µη της έγκλεισης των κόκκων σε στοιβάδες. Οι πίνακες 1,2 δίνουν λεπτοµερής πληροφορίες τόσο για την σύσταση των σκευασµάτων όσο και για τις συνθήκες της ξήρανσης. 10

11 Αυτό που διαπιστώνεται είναι ότι στα τέσσερα αυτά δείγµατα παρουσιάζονται αλλοιώσεις και σπασίµατα στο κυτταρικό τοίχωµα. Η απότοµη αφυδάτωση φαίνεται ότι προκαλεί προβλήµατα και µείωσή της βιωσιµότητας, θανάτωση δηλ. ενός σηµαντικού αριθµού βακτηρίων. Έτσι στο πρώτο δείγµα SF1 (εικ. 5, 6, 7) µπορούµε να πούµε ότι 1 στα 3 µικροβιακά κύτταρα είναι κατεστραµµένα, παρόλο που η θερµοκρασία είναι σχετικά χαµηλή (57 C). ιάφορη εικόνα παρουσιάζεται στο δείγµα SF6, όπου έχουµε παρουσία ταυτόχρονα αραβικού κόµµεος και αλγινικού νατρίου. Εδώ παρατηρούµε (εικ. 8, 9) αναδιπλώσεις στο κυτταρικό τοίχωµα, αλλά όχι σπασίµατα, αν και η θερµοκρασία φτάνει στους 77 C. Φαίνεται ότι κάποιο προστατευτικό ρόλο παίζει το αλγινικό νάτριο. Σε ότι αφορά την οµαδοποίηση των βακτηρίων και την έγκλεισή τους σε στοιβάδες αυτή δεν έχει επιτευχθεί. Οι κόκκοι στα δύο αυτά δείγµατα δεν φαίνεται να περικλείονται από στοιβάδες αραβικού κόµµεος ή αλγινικού νατρίου. Αντίθετα κάτι τέτοιο φαίνεται να επιτυγχάνεται στο δείγµα SF13 (εικ. 21, αστερίσκοι). Σ αυτό το δείγµα επίσης η απώλεια των µικροβιακών κυττάρων φτάνει σε αναλογία 1 στα 3, (60-70%) (εικ. 21, 22, 23). Το SFI0 σκεύασµα εµφανίζεται ως παραπροϊόν στην διαδικασία της ξήρανσης. Είναι υλικό χοντρόκοκκο που µένει στο µεγάλο σωλήνα του spray - dryer. Η καταστροφή των βακτηρίων στην περίπτωση αυτή δεν είναι µεγαλύτερη από εκείνη του δείγµατος SF1 (εικ. 10,11). Αντίθετα όµως παρατηρούµε (εικ. 12, 13, αστερίσκοι) οι εντερόκοκκοι οµαδοποιούνται και περικλείονται από αραβικό κόµµι. 11

12 Εικ. 5) Ηλεκτρονιογραφία σκευάσµατος στρεπτοκόκκων SF1. Οι κόκκοι είναι τυχαία κατανεµηµένοι στο υλικό (x3500). Εικ. 6) Ηλεκτρονιογραφία στρεπτοκόκκων (SF1). Παρατηρούµε την αλλοίωση της δοµής σε µεγάλο βαθµό. Τα βέλη δείχνουν σπασίµατα στο κυτταρικό τοίχωµα (x10000). Εικ. 7) Ηλεκτρονιογραφία όπως εικ.6 (x52000). 12

13 Εικ. 8) Ηλεκτρονιογραφία σκευάσµατος SF6 του S. faesium. Τα βέλη δείχνουν αλλοιώσεις στο κυτταρικό τοίχωµα. εν παρατηρούνται σπασίµατα των κυττάρων. Φαίνεται ότι η παρουσία ταυτόχρονα µε το αραβικό κόµµι του αλγινικού νατρίου προστατεύει τον µικροοργανισµό, παρόλο που η θερµοκρασία είναι αρκετά υψηλή (βλ. πίνακες 1,2), (Χ 8000). Εικ. 9) Ηλεκτρονιογραφία όπως εικ. 8, (Χ 13500). 13

14 Εικ. 10) Ηλεκτρονιογραφία σκευάσµατος SF10 που συλλέγεται από τον µεγάλο σωλήνα του spray- dryer. Η υφή του είναι χοντρόκοκκη συγκρινόµενη µε αυτή του υλικού στο δοχείο συλλογής του µηχανήµατος. Τα βέλη δείχνουν αλλoιώσεις και σπασίµατα των κυττάρων, (x3500). Εικ. 11) Ηλεκτρονιογραφία όπως εικ.10, (x13500). Εικ. 12) Ηλεκτρονιογραφία του σκευάσµατος SF10. Παρατηρούµε ότι οι κόκκοι συγκεντρώνoνται στις ανοιχτόχρωµες περιοχές που σηµειώνoνται µε αστερίσκο και περιβάλλονται από τις σκουρόχρωµες που πιθανόν αντιπροσωπεύουν το αραβικό κόµµι. (x2000). Εικ. 13) Ηλεκτρονιογραφία όπως εικ.12, (X3500). 14

15 Σηµαντικός παράγοντας για την µείωση των απωλειών φαίνεται να είναι η θερµοκρασία. Όσο µικρότερη είναι αυτή τόσο λιγότερη η απώλεια. Η εφαρµογή µικροβιολογικών µεθόδων είναι αναγκαία προϋπόθεση για την πιστοποίηση της βιωσιµότητας στα παραπάνω σκευάσµατα. ιαπιστώνεται τέλος ότι µε την µείωση της αναλογίας του νερού επιτυγχάνεται οµαδοποίηση των βακτηρίων και έγκλεισή τους στο προστατευτικό µέσο, όπως φάνηκε στα δείγµατα SFI0, SFI3. Ένα ερώτηµα που θα πρέπει να απαντηθεί στο µέλλον είναι κατά πόσο υλικά σαν το αραβικό κόµµι και αλγινικό νάτριο πράγµατι προστατεύουν το µικροοργανισµό από τις περιβαλλοντικές συνθήκες. 2. Μορφολογικός έλεγχος της βιωσιµότητας των µικροοργανισµών κατά την διαδικασία παραγωγής του τελικού σκευάσµατoς. Πάρθηκαν δείγµατα από όλες τις φάσεις της διαδικασίας. είγµα από τον βιοαντιδραστήρα (εικ. 14, 15, 16), δείγµα µετά από την συµπύκνωση µε φυγοκέντρηση (εικ. 17, 18), δείγµα µίγµατος βακτηρίων αραβικού κόµµεος (εικ. 19, 20) και τέλος δείγµα από το spray- dryer. Το συµπέρασµα που προκύπτει είναι ότι δεν υπάρχουν απώλειες σε κανένα στάδιο της επεξεργασίας παρά µόνο στο τελευταίο µετά το spray - dryer. Αυτό σηµαίνει ότι πρέπει να προσεχθούν οι τελικές συνθήκες για να βελτιωθούν τα επίπεδα βιωσιµότητας του στρεπτόκοκκου. 3. Μελέτη των σφαιριδίων αλγινικού νατρίου. Το δείγµα SF1 διαλύεται σε 2% αλγινικό νάτριο και σταγόνες του διαλύµατος αυτού ρίχνονται σε διάλυµα 1Μ CaCl 2, οπότε σχηµατίζεται σφαιρίδιο αλγινικού ασβεστίου, που εξετάζεται µορφολογικά. Στην εικ. 24 φαίνεται το σχηµατιζόµενο σφαιρίδιο σε τοµή µετά από έγκλειση σε ρητίνη, ενώ στις εικ. 25, 26 διακρίνονται τα βακτήρια που έχουν εγκλειστεί µαζί µε το αραβικό κόµµι σε κάποιες περιοχές του σφαιριδίου. Τις ίδιες παρατηρήσεις κάνουµε και µε το Η.Μ., όπως φαίνεται στις εικ.27, 28. Είναι εµφανής επίσης στις εικ. 27, 28 η καταστροφή που έχουν υποστεί τα βακτηριακά κύτταρα, χωρίς να µπορούµε να διευκρινίσουµε αν η διαδικασία σχηµατισµού του σφαιριδίου επηρεάζει επιπλέον τους µικροοργανισµούς. 15

16 Εικ.14) Ηλεκτρονιογραφία δείγµατος από το βιοαντιδραστήρα µετά από έγκλειση και τοµές. Παρατηρούµε ότι οι στρεπτόκοκκοι δεν παρουσιάζουν αλλοιώσεις και σπασίµατα των κυτταρικών τοιχωµάτων, (Χ 6500). Εικ.15) Ηλεκτρονιογραφία όπως εικ.14, (Χ 8000). Εικ.16) Ηλεκτρονιογραφία οπως εικ.14, (Χ 19000). 16

17 Εικ. 17) Ηλεκτρονιογραφία δείγµατος βακτηρίων από τον βιοαντιδραστήρα µετά από συµπύκνωση µε φυγοκέντρηση, έγκλειση και τοµές. Οι µικροοργανισµοί δεν παρουσιάζουν αλλοιώσεις, µορφολογικά φαίνονται φυσιολογικοί, (Χ 8000). Εικ. 18) Μεγαλύτερη µεγέθυνση της εικ.17, (Χ 23000). Εικ. 19) Ηλεκτρονιογραφία µίγµατος βακτηρίων και αραβικού κόµµεος µετά από έγκλειση σε ρητίνες και τοµές. Τα βακτήρια εµφανίζονται φυσιολογικά, χωρίς παραµορφώσεις στην επιφάνειά τους, (Χ 5000). Εικ. 20) Μεγαλύτερη µεγέθυνση της εικ.19, (Χ 19000). 17

18 Εικ.21) Ηλεκτρονιογραφία τελικού σκευάσµατος του στρεπτόκοκκου (SF13), µετά από έγκλειση και τοµές. Τα βέλη δείχνουν σπασίµατα στο κυτταρικό τοίχωµα µερικών βακτηρίων. Η καταστροφή των κόκκων φτάνει σε µεγάλα ποσοστά. Οι αστερίσκοι δείχνουν περιοχές οµαδοποίησης των κόκκων, ενώ το γκρίζο υπόβαθρο αντιπροσωπεύει το αραβικό κόµµι, (x 2500). Εικ.22) Ηλεκτρονιογραφία όπως εικ.21, (Χ 8000). Εικ.23) Μεγέθυνση εικ. 21, (Χ 23000). 18

19 Εικ. 24) Φωτονιογραφία σφαιριδίου µετά από έγκλειση και τοµές. Το αλγινικό ασβέστιο χρωµατίζεται µπλε µε τουλουϊδίνη, ενώ το αραβικό κόµµι όχι (βέλη) (X 40). Εικ.25) Φωτονιογραφία όπως εικ.24. Τα µπλε στίγµατα µέσα στις λευκές περιοχές αντιπροσωπεύουν τους στρεπτόκοκκους (Χ 160). Εικ.26) Φωτονιογραφία µε συγκεντρωτήρα αντίθεσης φάσεων. Οι κόκκοι φαίνονται µε κίτρινο xρώµα (βέλη),(x 160). Εικ.27) Ηλεκτρονιογραφία σφαιριδίου. Οι λευκές περιοχές αντιπροσωπεύουν το αραβικό κόµµι, ενώ οι πιο γκρίζες το αλγινικό ασβέστιο. Οι κόκκοι µέσα στο αραβικό κόµµι φαίνονται αλλοιωµένοι (X 30000). Εικ.28) Ηλεκτρονιογραφία όπως εικ.27. Τα βέλη δείχνουν τις αλλoιώσεις του στρεπτόκοκκου (Χ 40000). 19

20 Το σφαιρίδιο του αλγινικού ασβεστίου διαπιστώθηκε ότι είναι πολύ ανθεκτικό. εν επηρεάζεται από ισχυρά οξέα και βάσεις και επιπλέον διατηρείται εκτεθειµένο στον αέρα. Αποδιατάσσεται µόνο σε διάλυµα φωσφορικού οξέος. Τα σφαιρίδια αλγινικού ασβεστίου µπορούν να χρησιµοποιηθούν επιτυχώς για την έγκλειση ενζύµων και µικροοργανισµών στην περίπτωσή µας. Πρέπει να δειχθεί µε περαιτέρω έρευνα αν οι εγκλεισµένοι µικροοργανισµοί διατηρούν την λειτουργικότητά τους. Ένα άλλο πρόβληµα που θα µας απασχολήσει σχετίζεται µε την ανθεκτικότητα των σφαιριδίων και κατά πόσο αυτά, σε περίπτωση που χρησιµοποιηθούν ως τροφή, θα διαλύονται στο στοµάχι ή το έντερο του ζώου ώστε να απελευθερώνονται οι µικροοργανισµοί. Στα πλαίσια αυτά θα γίνει προσπάθεια να σχηµατιστούν παρόµοια σφαιρίδια άλλων µετάλλων, όπως µαγνησίου, µαγγανίου, κ.ά. και να διερευνηθεί κατά πόσο αυτά είναι ανθεκτικότερα ή όχι από τα σφαιρίδια αλγινικού ασβεστίου. Στα πλαίσια βιοτεχνολογικών εφαρµογών τα σφαιρίδια αυτά πρέπει να τύχουν ιδιαίτερης µελέτης, γιατί όπως φαίνεται θα µπορούσαν να χρησιµοποιηθούν αποτελεσµατικά στην βελτίωση της θρέψης των ζώων. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Brieger Ε. Μ Structure and Ultrastructure of Microorganisms. Academic Press, New York and London. Droz, Β., Μ. Bouteille, and D. Santoz J. Micr. Biol. Cel1ul. 27:71. Hayat Arif Μ Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications. Volume 1. Van Nostrand Reinhold Company. Jawetz Ε., Melnick J., Adelberg Ε Ιατρική Μικροβιολογία. Επιστηµονικές εκδόσεις Γρ. Παρισιάνος. Αθήνα. Venable, J. and R. Coggeshall Α simplified lead citrate stain for use in electron microscopy. J. Cell Biol. 25:407. Watson, Staining of tissue section for Ε.Μ. witb heavy metals. J. Biophys. Biochem. Cytol. 4: