ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ «Κρυστάλλωση και δομικός χαρακτηρισμός ανθρώπινης Ινσουλίνης με τους οργανικούς προσδέτες 4-(2-Pyridylazo)-Resorcinol και 3,5-Dihydroxybenzoic acid» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Παναγιώτα-Μαρίνα Καλαθά Α.Μ ΠΑΤΡΑ, Σεπτέμβριος 2012

2 Επιβλέπουσα Ειρήνη Μαργιωλάκη Λέκτορας Τμήμα Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Τα μέλη της Τριμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Μίντζας Αναστάσιος Ροσμαράκη Ελευθερία Μαργιωλάκη Ειρήνη Καθηγητής Λέκτορας Λέκτορας 1

3 Πρόλογος Η Κρυσταλλογραφία είναι η επιστήμη η οποία αποτελεί το «κλειδί» για τη μελέτη της τρισδιάστατης εσωτερικής δομής των μορίων και των ατόμων όταν αυτά διατάσσονται σε περιοδικές, τακτοποιημένες δομές, δηλαδή τους κρυστάλλους. Μελετά τόσο οργανικά όσο και ανόργανα μόρια, αλλά στην παρούσα εργασία θα μας απασχολήσει μόνο η κρυσταλλογραφία των οργανικών μορίων και πιο συγκεκριμένα των πρωτεϊνών. Απαραίτητη προϋπόθεση σε κάθε πείραμα που αφορά την Κρυσταλλογραφία, είναι η απόκτηση της υπό μελέτη ουσίας σε κρυσταλλική μορφή. Αυτό επιτυγχάνεται με την κρυστάλλωση, μία τόσο εύκολη αλλά παράλληλα και τόσο δύσκολη διαδικασία αφού πρέπει αρκετές παράμετροι (όπως είναι για παράδειγμα το ph, η θερμοκρασία, η φύση της πρωτεΐνης κ.α.) να βρίσκονται στα κατάλληλα όρια τιμών ούτως ώστε να αποκτηθούν κρύσταλλοι κατάλληλοι για την μετέπειτα πειραματική πορεία. Οι κρύσταλλοι για τη δημιουργία τους απαιτούν από μερικές ώρες έως και μερικές ημέρες, ανάλογα με την εκάστοτε περίπτωση. Οι κρύσταλλοι μπορεί να έχουν διάφορα σχήματα, όποιο όμως σχήμα και να έχουν αυτό δεν είναι ενδεικτικό και της εσωτερικής τους δομής. Οπότε καταλαβαίνουμε πως είναι απαραίτητη η χρήση μιας μεθοδολογίας με τη βοήθεια της οποίας μπορούμε ουσιαστικά να «δούμε» μέσα στον κρύσταλλο. Αυτό γίνεται εφικτό με την έκθεση των κρυστάλλων σε ακτίνες Χ, οι οποίες όμως δεν παράγονται σε εργαστηριακό επίπεδο αλλά σε εγκαταστάσεις σύγχροτρον. Αυτή η αλληλεπίδραση ακτίνων και ύλης διέπεται από το φαινόμενο της περίθλασης. Οι ακτίνες που περιθλώνται από τον ένα κρύσταλλο (περίθλασης ακτίνων Χ από μονοκρύσταλλο single crystal diffraction) ή από τους πολλούς κρυστάλλους (περίθλαση ακτίνων Χ από πολυκρυσταλλικά υλικά powder diffraction) αφήνουν το σήμα τους επάνω σε έναν ανιχνευτή. Παλαιότερα όταν τα τεχνολογικά μέσα ήταν περιορισμένα, οι πολύπλοκες μαθηματικές πράξεις που απαιτούνται για την εξαγωγή αποτελεσμάτων πραγματοποιούνταν όλες στο χέρι. Γι αυτόν ακριβώς το λόγο, ήταν μια επίπονη και ταυτόχρονα χρονοβόρα διαδικασία. Πλέον, υπάρχουν κατάλληλα προγράμματα ηλεκτρονικού υπολογιστή τα οποία διεξάγουν τις μαθηματικές πράξεις, εφαρμόζοντας τις απαιτούμενες εξισώσεις και δίνουν αποτελέσματα σε ελάχιστο 2

4 χρόνο. Ωστόσο, η πορεία προς την απόκτηση του τελικού ατομικού μοντέλου για μια νέα άγνωστη διαμόρφωση απαιτεί ένα μεγάλο χρονικό διάστημα. Περίπου 150 εκατομμύρια άνθρωποι σε όλο τον κόσμο πάσχουν από σακχαρώδη διαβήτη και υπολογίζεται πως αυτός ο αριθμός θα διπλασιαστεί μέχρι το Όταν δεν ακολουθείται κάποια αγωγή, ο διαβήτης μπορεί να οδηγήσει σε πρόκληση στεφανιαίας νόσου, καταστροφή των νεφρών, τύφλωση, ακρωτηριασμό των άκρων και πρόωρο θάνατο. Το βασικό χαρακτηριστικό του διαβήτη τύπου Ι είναι η έλλειψη της ινσουλίνης και ως αγωγή είναι απαραίτητη η χορήγηση της ορμόνης στους ασθενείς. Δυστυχώς κατά τη διάρκεια της μέρας οι απαιτήσεις του οργανισμού σε ινσουλίνη ποικίλλουν, με υψηλές συγκεντρώσεις να απαιτούνται μετά την κατανάλωση γεύματος και ένα σταθερό επίπεδο κατά τη διάρκεια της υπόλοιπης μέρας. Η ινσουλίνη είναι ενεργή στη μονομερή της μορφής και έχει την τάση να σχηματίζει σύμπλοκα τα οποία αποχωρίζονται κατά την αραίωση. Συγκεκριμένα, σχηματίζει διμερή στις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιούνται σε φαρμακευτικές φόρμουλες και αυτά με τη σειρά τους παρουσία ιόντων ψευδαργύρου σχηματίζουν εξαμερή. Η κρυστάλλωση του μορίου της ινσουλίνης είναι μια πολύ σημαντική διαδικασία, καθώς συχνά χορηγείται σε μικροκρυσταλλική μορφή με υποδόριες ενέσεις. Με το πέρασμα των χρόνων έχει κρυσταλλωθεί και χαρακτηριστεί σε διάφορα κρυσταλλικά συστήματα. Χάρη στην απόκτηση περισσότερων γνώσεων όσον αφορά την τρισδιάστατη δομή της (με τη βοήθεια κρυσταλλικών δειγμάτων), στην κανονική της μορφή χωρίς προσθήκες [Hodgkin, 1971], σε μεταλλάγματα [Whittingham et al., 1998] και σε σύμπλοκο με ιόντα ψευδαργύρου και μικρά μόρια όπως η φαινόλη [Derewenda et al., 1989], έχει δώσει τη δυνατότητα της απόκτησης ενός μεγάλου αριθμού παρασκευασμάτων με άμεση ή πιο εκτεταμένη διάρκεια βελτιώνοντας έτσι την ποιότητα ζωής εκατομμυρίων ανθρώπων [Brange, 1997]. 3

5 Πίνακας Περιεχομένων Περίληψη... 5 Abstract... 6 ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 7 ΙΝΣΟΥΛΙΝΗ... 7 ΚΡΥΣΤΑΛΛΩΣΗ ΑΚΤΙΝΕΣ Χ ΣΥΓΧΡΟΤΡΟΝ Πηγές ακτινοβολίας σύγχροτρον ID ΠΕΡΙΘΛΑΣΗ ΑΚΤΙΝΩΝ Χ ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΚΡΥΣΤΑΛΛΟΓΡΑΦΙΑΣ ΦΑΡΜΑΚΑ ΣΕ ΜΙΚΡΟΚΡΥΣΤΑΛΛΙΚΗ ΜΟΡΦΗ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Προετοιμασία του διαλύματος ανθρώπινης ινσουλίνης Συγκρυστάλλωση ινσουλίνης με 3,5 Dihydroxybenzoic acid Συγκρυστάλλωση ινσουλίνης με 4-(2-Pyridylazo)-Resorcinol Έκθεση των δειγμάτων σε ακτινοβολία σύγχροτρον WinPLOTR Πρόγραμμα DASH - Indexing Μέθοδος Pawley PRODD ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Κρύσταλλοι Αποτελέσματα από το ESRF Αποτελέσματα από το DASH Αποτελέσματα από το PRODD ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

6 Περίληψη Στα πλαίσια της κρυσταλλογραφίας πρωτεϊνών, τα πειράματα αυτής της πτυχιακής εργασίας περιελάμβαναν κρυστάλλωση ανθρώπινης ινσουλίνης με οργανικές ουσίες. Συγκεκριμένα, αυτές οι οργανικές ουσίες είναι το 4-(2-Pyridylazo)- Resorcinol και το 3,5-Dihydroxybenzoic acid και καλούνται προσδέτες, καθώς προσδένονται σε διαφορετικές περιοχές του μορίου της ινσουλίνης οδηγώντας έτσι σε ευδιάκριτες διαμορφώσεις αυτού. Η κρυστάλλωση πραγματοποιήθηκε σε ένα εύρος τιμών ph από 4.77 έως 8.70 και με την παρουσία ιόντων ψευδαργύρου (Zn). Οι κρύσταλλοι που αποκτήθηκαν εκτέθηκαν κατόπιν σε ακτίνες Χ στο ESRF (στη Γκρενόμπλ, Γαλλία). Εκεί, ταχέως κινούμενα ηλεκτρόνια σε έναν αποθηκευτικό δακτύλιο μεγάλης περιμέτρου εκτρέπονται από την τροχιά τους σε μερικά σημεία και ως αποτέλεσμα παράγονται ακτίνες Χ. Η αλληλεπίδραση ανάμεσα στις ακτίνες Χ και στους κρυστάλλους διέπεται από το φαινόμενο της περίθλασης. Τα δεδομένα τα οποία αποκτήθηκαν από την περίθλαση ακτίνων Χ επεξεργάστηκαν σε προγράμματα ηλεκτρονικού υπολογιστή (DASH, Prodd) και πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός της φάσης. Σε αυτό το στάδιο της ανάλυσης παρουσιάζονται οι αλλαγές φάσης σε σχέση με την αύξηση του ph και με την κρυστάλλωση με τους δύο επιλεγμένους προσδέτες. Κάθε φάση χαρακτηρίζεται από τις διαστάσεις της μοναδιαίας κυψελίδας, τη συμμετρία του κρυστάλλου και το space group, όπως αυτά περιγράφονται στο κομμάτι της εισαγωγής. Ο απώτερος στόχος της όλης πορείας είναι να βρεθούν νέες διαμορφώσεις της ανθρώπινης ινσουλίνης οι οποίες θα είναι οι πλέον κατάλληλες και αποτελεσματικές για τη χρήση τους σε φαρμακευτικά προϊόντα για ασθενείς που πάσχουν από σακχαρώδη διαβήτη. 5

7 Abstract Within the field of protein crystallography, the experiments for this task included crystallization of human insulin with organic substances. In specific, these organic substances are 4-(2-Pyridylazo)-Resorcinol and 3,5-Dihydroxybenzoic acid and are called ligands because they are linked with different regions of the insulin molecule leading to distinct molecular conformations. The crystallization screens took place in the ph range from 4.77 to 8.70 and in the presence of zinc ions. The crystals obtained were then exposed to X-rays at the ESRF (Grenoble, France). There, rapidly moving electrons in a storage ring of a big perimeter are deviated from their orbit at some points and as a result X-rays are emitted. The interactions between the X-rays and the crystals are governed by the phenomenon of diffraction. The data obtained by the X-ray diffraction were processed in computer programs (DASH, Prodd) and phase identification was performed. In this stage of analysis we present phase alterations upon ph increase and crystallization with the 2 selected ligands. Each phase is characterized by the dimensions of the unit cell, crystal symmetry and space group as these are defined in the introduction. The further goal of the whole project is to find novel conformations of human insulin which would be most appropriate and effective to be used as pharmaceutical formulations for patients suffering from diabetes mellitus. 6

8 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΙΝΣΟΥΛΙΝΗ Ιστορική Αναδρομή Η ιστορία της ινσουλίνης ξεκίνησε το Ένας φοιτητής ιατρικής του Πανεπιστημίου του Βερολίνου, ο Paul Langerhans εξετάζοντας στο μικροσκόπιο τομές παγκρεατικού ιστού, εντόπισε κάποιες άγνωστες μέχρι τότε συστάδες κυττάρων των οποίων δεν μπόρεσε να διαπιστώσει το βιολογικό ρόλο. Αυτές οι συστάδες ονομάστηκαν αργότερα νησίδες του Langerhans και αποτελούν συναθροίσεις κυττάρων που εκκρίνουν μεταξύ άλλων και ινσουλίνη. Το 1889, ο Πολωνο-Γερμανός γιατρός Oscar Minkowski σε συνεργασία με τον Joseph von Mering αφαίρεσαν το πάγκρεας από ένα σκύλο για να διαπιστώσουν το ρόλο του στην διαδικασία της πέψης. Στη συνέχεια, διαπίστωσαν ότι τα ούρα του σκύλου περιείχαν μη φυσιολογικές υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης. Από το γεγονός αυτό έβγαλαν το συμπέρασμα ότι το πάγκρεας εμπλέκεται στο μεταβολισμό των υδατανθράκων και πως θα πρέπει να σχετίζεται με τη νόσο του διαβήτη. Το 1901, ο Eugen Lindsay Opie διαπίστωσε ότι ο διαβήτης συνδέεται με τις νησίδες του Langerhans αφού η καταστροφή τους οδηγούσε στην εμφάνιση της νόσου. Οι Banting και Best με πειράματά τους στο Πανεπιστήμιο του Τορόντο το 1921 κατάφεραν να απομονώσουν ινσουλίνη (σε μη καθαρή μορφή ωστόσο), εφαρμόζοντας πειράματα σε σκύλους αλλά και σε έμβρυα βοώς. Η ινσουλίνη σε αυτή την ακάθαρτη μορφή της προκαλούσε στα πειραματόζωα έντονες αλλεργικές αντιδράσεις. Στον καθαρισμό της ινσουλίνης πολύ σημαντική υπήρξε η συμβολή του βιοχημικού James Collip. Τα πειράματα σε ανθρώπους ξεκίνησαν τον Ιανουάριο του Εκείνη την εποχή οι ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη δεν επιβίωναν για μεγάλο χρονικό διάστημα μετά τη διάγνωση. Σε συνδυασμό με την έλλειψη αποτελεσματικής θεραπείας οι ασθενείς ήταν καταδικασμένοι. Ο πρώτος διαβητικός στον οποίο χορηγήθηκε ινσουλίνη ήταν ο δεκατετράχρονος Leonard Thompson που βρισκόταν σε κωματώδη κατάσταση στο Γενικό νοσοκομείο του Τορόντο, αλλά του 7

9 προκλήθηκαν αλλεργικές αντιδράσεις επειδή η ινσουλίνη δεν ήταν πολύ καθαρή. Με την εξασφάλιση της καθαρής μορφής της από τον Collip η χορήγηση της ινσουλίνης στον Leonard Thompson ήταν επιτυχής κι έτσι κατάφερε να ζήσει μέχρι την ηλικία των 27 ετών. Το 1922 η μέθοδος εκχύλισης της ινσουλίνης βελτιώθηκε και άρχισε να παράγεται σε μεγάλες ποσότητες, με περιορισμένη ωστόσο ακόμα καθαρότητα. Η παραλαβή καθαρής ινσουλίνης για θεραπεία διαβητικών τα πρώτα χρόνια γινόταν με εκχύλιση από πάγκρεας βοοειδών ή χοίρων. Σε εργοστασιακή κλίμακα άρχισε από το Το 1961 έγινε η παρασκευή του πρώτου ουδέτερου διαλύματος ινσουλίνης, αλλά το 1982 επιτεύχθηκε η πρώτη παραγωγή βιοσυνθετικής ανθρώπινης ινσουλίνης με τεχνικές ανασυνδυασμένου DNA από την εταιρεία Eli Lilly. Ινσουλίνη παράγει εδώ και πολλές δεκαετίες και η φαρμακευτική εταιρεία Novo Nordisk στη Δανία. Ο καθηγητής φυσιολογίας στο Πανεπιστήμιο της Κοπεγχάγης August Krogh του οποίου η σύζυγος ήταν διαβητική, πήγε στην Αμερική το 1922 και παρακολούθησε μια ομιλία των Banting και Best για την ανακάλυψη και τη φαρμακευτική χρήση της ινσουλίνης στη Δανία. Ίδρυσε την εταιρεία Nordisk και άρχισε την παραγωγή ινσουλίνης από βόειο πάγκρεας. Η ινσουλίνη υπήρξε η πρώτη πρωτεΐνη της οποίας προσδιορίστηκε η τριτοταγής κρυσταλλική δομή. Η μελέτη αυτή πραγματοποιήθηκε το 1969 με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ από την Dorothy Crowford Hodgkin (εικόνα 1) στο Πανεπιστήμιο της Οξφόρδης. Ο προσδιορισμός αυτός υπήρξε σημαντικό επίτευγμα για την εποχή εκείνη που δεν υπήρχαν ηλεκτρονικοί υπολογιστές για να διεξάγουν τους απαιτούμενους υπολογισμούς. [17] Eικόνα 1: Η Dorothy Crowford Hodgkin προσδιόρισε πρώτη την τριτοταγή δομή της ινσουλίνης με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ το 1969 (πηγή: Η ευρύτατα πλέον χρησιμοποιούμενη ανθρώπινη ινσουλίνη δε λαμβάνεται από τα β κύτταρα του ανθρώπινου παγκρέατος, αλλά παράγεται σε βιομηχανική κλίμακα από γενετικώς τροποποιημένα βακτήρια Escherichia coli ή κύτταρα ζύμης τα 8

10 οποία περιέχουν στο γονιδίωμά τους ανθρώπινα γονίδια. Παράγονται και απομονώνονται οι δύο αλυσίδες Α και Β από δύο διαφορετικά στελέχη Escherichia coli και στη συνέχεια συνδέονται στο εργαστήριο με δισουλφιδικούς δεσμούς. Έκκριση και κύτταρα στόχοι της ινσουλίνης Η ινσουλίνη είναι μία πεπτιδική ορμόνη η οποία εκκρίνεται από τις νησίδες του Langerhans, ομάδες ενδοκρινικών κυττάρων στο πάγκρεας (εικόνα 2). Υπάρχουν ένα έως τρία εκατομμύρια τέτοιων νησίδων που σχηματίζουν την ενδοκρινή μοίρα του παγκρέατος (το 2% της μάζας του οργάνου), το οποίο είναι κυρίως ένας εξωκρινής αδένας. Συγκεκριμένα, τα β κύτταρα που αποτελούν το 60-80% όλων των κυττάρων των νησίδων είναι η πηγή της ινσουλίνης. Τα α κύτταρα του παγκρέατος παράγουν την ορμόνη γλυκαγόνη. Η ινσουλίνη είναι η πιο σημαντική ρυθμιστική πρωτεΐνη του μεταβολισμού του οργανισμού της οποίας η έκκριση και επομένως η πλασματική συγκέντρωση αυξάνεται κατά τη διάρκεια της απορροφητικής φάσης και μειώνεται κατά τη διάρκεια της μετα-απορροφητικής. Εικόνα 2: Ανατομία του παγκρέατος (πηγή: plogger/?level=picture&id=771). 9

11 Οι μεταβολικές επιδράσεις της ινσουλίνης εντοπίζονται κυρίως στα μυϊκά, ηπατικά κύτταρα και στο λιπώδη ιστό. Στην εικόνα 3 απεικονίζονται τα κύτταρα στόχοι της. Εικόνα 3: Συνοπτική παρουσίαση των αποκρίσεων των διαφορετικών τύπων κυττάρων στην α) αύξηση και β) μείωση της πλασματικής συγκέντρωσης της ινσουλίνης (πηγή: Vander et al s Human Physiology: The Mechanisms of Body Functions, 9 th edition). Όπως όλες οι πεπτιδικές ορμόνες, έτσι και η ινσουλίνη προσδένεται στους υποδοχείς της στην πλασματική μεμβράνη των κυττάρων-στόχων της. Η πρόσδεσή της ενεργοποιεί μονοπάτια μετάδοσης σήματος τα οποία επηρεάζουν τις πρωτεΐνεςμεταφορείς της κυτταρικής μεμβράνης, καθώς και ενδοκυτταρικά ένζυμα του κυττάρου-στόχου (εικόνα 4). Για παράδειγμα, στα μυϊκά κύτταρα αυξημένη συγκέντρωση ινσουλίνης ενεργοποιεί κυτταροπλασματικά κυστίδια που περιέχουν ένα συγκεκριμένο τύπο μεταφορέα γλυκόζης (GLUT-4) στη μεμβράνη τους, να συντηχθούν με την πλασματική μεμβράνη. Αυτή η αύξηση των μεταφορέων γλυκόζης που προκαλείται από τη σύντηξη των κυστιδίων έχει σαν αποτέλεσμα τη μεγαλύτερη κίνηση γλυκόζης από το εξωκυτταρικό περιβάλλον μέσα στο κύτταρο, μέσω διευκολυνόμενης διάχυσης. [3] 10

12 Εικόνα 4: Πρόκληση από την ινσουλίνη της μετατόπισης των μεταφορέων γλυκόζης από κυτταροπλασματικά κυστίδια στην κυτταροπλασματική μεμβράνη στα μυϊκά κύτταρα και στα κύτταρα του λιπώδους ιστού. Αυτοί οι μεταφορείς ανακυκλώνονται συνεχώς με ενδοκυττάρωση από την κυτταρική μεμβράνη μέσω των ενδοσωμάτων, σε κυστίδια. Για όσο χρονικό διάστημα τα επίπεδα της ινσουλίνης είναι αυξημένα, ολόκληρος ο κύκλος συνεχίζεται και ο αριθμός των μεταφορέων στην κυτταροπλασματική μεμβράνη παραμένει υψηλός. Με αυτό τον τρόπο η ινσουλίνη μειώνει τα επίπεδα της γλυκόζης στο πλάσμα. Αντίθετα, όταν τα επίπεδα της ινσουλίνης μειώνονται, ο κύκλος αυτός σταματά, τα κυστίδια συσσωρεύονται στο κυτταρόπλασμα και ο αριθμός των μεταφορέων στην κυτταροπλασματική μεμβράνη μειώνεται. Έτσι, χωρίς ινσουλίνη τα επίπεδα της γλυκόζης στο πλάσμα θα αυξηθούν από τη στιγμή που η μεταφορά γλυκόζης από το πλάσμα στα κύτταρα θα μειωθεί (πηγή: Vander et al s Human Physiology: The Mechanisms of Body Functions, 9 th edition). Μηχανισμός έκκρισης ινσουλίνης Ο μηχανισμός έκκρισης της ινσουλίνης λόγω αυξημένης αιματικής συγκέντρωσης της γλυκόζης λειτουργεί ως εξής: o Η γλυκόζη εισέρχεται στα β-κύτταρα μέσω του μεταφορέα γλυκόζης GLUT 1/ GLUT 2, με διευκολυνόμενη διάχυση κι έτσι η ενδοκυτταρική συγκέντρωση γλυκόζης ισούται με αυτή του διάμεσου υγρού (εικόνα 5). o Η γλυκόζη υφίσταται γλυκόλυση στον αναπνευστικό κύκλο όπου παράγονται μέσω οξείδωσης πολλά υψηλής ενέργειας μόρια ATP. o Ανάλογα με τα επίπεδα ATP και τα ενισχυμένα αιματικά επίπεδα γλυκόζης, τα κανάλια Κ + που ελέγχονται από το ATP κλείνουν και η κυτταρική μεμβράνη εκπολώνεται. o Λόγω της εκπόλωσης, οι τασεοευαίσθητοι δίαυλοι Ca + ανοίγουν και το Ca + εισέρχεται στο κύτταρο. 11

13 Εικόνα 5: Ρύθμιση της έκκρισης ινσουλίνης από την αυξημένη συγκέντρωση γλυκόζης στο κυτταρόπλασμα (πηγή: o Αυξημένα επίπεδα Ca + προκαλούν ενεργοποίηση της φωσφολιπάσης C, η οποία αποκόπτει το μεμβρανικό φωσφολιπίδιο φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη 4 σε ινοσιτόλη 1 και διακυλογλυκερόλη (DAG). o Η ινοσιτόλη 1,4,5-τριφωσφατάση (IP3) προσδένεται στο μεμβρανικό υποδοχέα της μεμβράνης του ενδοπλασματικού δικτύου (ER). Αυτό επιτρέπει την απελευθέρωση του Ca + από το ER μέσω καναλιών IP3 και επιπλέον αύξηση της συγκέντρωσης του Ca + στο κυτταρόπλασμα. o Ιδιαιτέρως αυξημένα επίπεδα Ca + στα κύτταρα προκαλούν την απελευθέρωση της ήδη συντεθειμένης ινσουλίνης, η οποία είναι αποθηκευμένη σε εκκριτικά κυστίδια. [Ι] Ο υποδοχέας της ινσουλίνης Ο υποδοχέας της ινσουλίνης (υπάρχουν περισσότεροι από υποδοχείς ανά κύτταρο) βρίσκεται κυρίως στο ήπαρ και στο λιπώδη ιστό. Ο υποδοχέας είναι ένα ετεροτετραμερές (α 2 β 2 ) και το μόριο της ινσουλίνης προσδένεται στις εξωκυτταρικές υπομονάδες του (εικόνα 6). 12

14 Εικόνα 6: Ο υποδοχέας της ινσουλίνης (πηγή: courses/molbio/molstudents/spring2003/williford/assignment2_home). Με την πρόσδεση ενός μορίου ινσουλίνης, η ενδοκυτταρική β υπομονάδα η οποία είναι μια τυροσίνη κινάση, ενεργοποιείται. Μέσω μιας σειράς πολλών διαδοχικών φωσφορυλιώσεων, ενεργοποιούνται αρκετές κυτταροπλασματικές και μεμβρανικές πρωτεΐνες. [15] Αποικοδόμηση της ινσουλίνης Μόλις το μόριο της ινσουλίνης προσδεθεί στον υποδοχέα του και προκαλέσει την απόκριση, τότε μπορεί να ελευθερωθεί πάλι πίσω στο εξωκυτταρικό περιβάλλον ή μπορεί να αποικοδομηθεί από το κύτταρο. Η αποικοδόμηση περιλαμβάνει συνήθως ενδοκυττάρωση του συμπλόκου ινσουλίνη-υποδοχέας, που ακολουθείται από τη δράση αποικοδομητικών ενζύμων. Τα περισσότερα μόρια ινσουλίνης αποικοδομούνται από τα ηπατικά κύτταρα. Υπολογίζεται ότι ένα μόριο ινσουλίνης που παράγεται ενδογενώς από τα παγκρεατικά β κύτταρα αποικοδομείται περίπου μέσα σε μία ώρα από την αρχική του απελευθέρωση στην κυκλοφορία. [Ι] 13

15 Έλεγχος της έκκρισης της ινσουλίνης Ο κύριος ρυθμιστικός παράγοντας της έκκρισης ινσουλίνης είναι η πλασματική συγκέντρωση της γλυκόζης. Αύξηση αυτής της συγκέντρωσης, όπως συμβαίνει μετά από το γεύμα, έχει επίδραση στα β κύτταρα των νησίδων του Langerhans ενεργοποιώντας την έκκριση ινσουλίνης, ενώ μείωση της συγκέντρωσης εμποδίζει την έκκριση (εικόνα 7). Εικόνα 7: Η φύση του ελέγχου της γλυκόζης του πλάσματος στην έκκριση της ινσουλίνης (πηγή: Vander et al s Human Physiology: The Mechanisms of Body Functions, 9 th edition). Η ινσουλίνη προκαλεί την είσοδο γλυκόζης μέσα στα μυϊκά κύτταρα και τα κύτταρα του λιπώδους ιστού. Αυτό τελικά οδηγεί στη μείωση της συγκέντρωσης της γλυκόζης στην κυκλοφορία του αίματος στα επίπεδα που βρισκόταν πριν από το γεύμα, οπότε απομακρύνεται και το ερέθισμα για την έκκριση της ινσουλίνης. Εκτός όμως από την κυτταροπλασματική συγκέντρωση της γλυκόζης υπάρχουν και άλλοι παράγοντες-ρυθμιστές για την έκκριση της ινσουλίνης όπως φαίνεται στην εικόνα 8, όπως είναι για παράδειγμα τα αυξημένα επίπεδα συγκέντρωσης αμινοξέων. 14

16 Εικόνα 8: Βασικοί παράγοντες που ελέγχουν την έκκριση ινσουλίνης (πηγή: Vander et al s Human Physiology: The Mechanisms of Body Functions, 9 th edition). Αυτός είναι ένας αρνητικός ανατροφοδοτικός έλεγχος, καθώς οι συγκεντρώσεις των αμινοξέων αυξάνονται μετά την κατανάλωση ενός πρωτεϊνικού γεύματος και η αυξημένη συγκέντρωση της ινσουλίνης του πλάσματος προκαλεί την πρόσληψη αυτών των αμινοξέων από τα μυϊκά κύτταρα. Επιπρόσθετα, υπάρχει ορμονικός έλεγχος για την έκκριση της ινσουλίνης. Για παράδειγμα μια ορμόνη που ονομάζεται γλυκοζοεξαρτώμενο ινσουλινοτροπικό πεπτίδιο (GIP), το οποίο εκκρίνεται από ενδοκρινικά κύτταρα στον γαστρεντερικό αυλό ως απόκριση στην κατανάλωση τροφής και προκαλεί την έκκριση ινσουλίνης. Αυτή η απόκριση παρέχει εκ των προτέρων ένα παράγοντα ρύθμισης της γλυκόζης κατά τη διάρκεια της πέψης ενός γεύματος. Έτσι, η έκκριση της ινσουλίνης γίνεται πιο νωρίς και σε μεγαλύτερο βαθμό απ ότι αν ο μόνος ρυθμιστής της ήταν η γλυκόζη του πλάσματος. Τέλος, οι αυτόνομοι νευρώνες των νησίδων του Langerhans επηρεάζουν επίσης την έκκριση ινσουλίνης. Ενεργοποίηση των παρασυμπαθητικών νευρώνων, η οποία συμβαίνει κατά τη διάρκεια της πέψης ενός γεύματος, ενεργοποιεί την έκκριση της ορμόνης και αυτό αποτελεί ακόμα ένα μηχανισμό που ρυθμίζει γρήγορα και σε μεγαλύτερο βαθμό (όπως συμβαίνει και με τον ορμονικό έλεγχο). Αντίθετα, ενεργοποίηση των συμπαθητικών νευρώνων των νησίδων ή αύξηση της πλασματικής συγκέντρωσης επινεφρίνης εμποδίζουν την έκκριση ινσουλίνης. [3] 15

17 Δομή της ινσουλίνης Η ινσουλίνη είναι μια σχετικά μικρή πρωτεΐνη με μοριακό βάρος περίπου 6000 Da και συνίσταται από δύο πεπτιδικές αλυσίδες την Α και τη Β αποτελούμενες από 21 και 30 αμινοξέα αντίστοιχα, συνολικά 51 αμινοξέα (εικόνα 9). [15] [ΙΙ] Εικόνα 9: Οι πεπτιδικές αλυσίδες της ινσουλίνης και η αλληλουχία των αμινοξέων από τα οποία αποτελούνται (πηγή: Εικόνα 10: Οι δύο αλυσίδες συνδέονται με μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις που περιλαμβάνουν το σχηματισμό των δισουλφιδικών γεφυρών (φαίνονται στην εικόνα με κίτρινο χρώμα) (πηγή: content/articlepanelview/article_id/8/panel_id/2). 16

18 Αυτές οι δύο αλυσίδες συνθέτουν το μονομερές της ινσουλίνης (εικόνες 10 και 16), τη φυσιολογικώς δραστική μορφή της. Η αλυσίδα Β περιέχει τον κορμό της βιολογικής δραστηριότητας, ενώ η Α περιέχει ως επί το πλείστον θέσεις ειδικές για κάθε είδος. Η αλληλουχία των αμινοξέων είναι υψηλά συντηρημένη στα Σπονδυλωτά και η ινσουλίνη από ένα θηλαστικό είναι σχεδόν σίγουρο πως θα είναι βιολογικά ενεργή και σε ένα άλλο. Οι ινσουλίνες που λαμβάνονται από διαφορετικούς οργανισμούς διατηρούν την ίδια γενική δομή και διαφέρουν μόνο ως προς λίγα αμινοξέα σε ορισμένες θέσεις. Η ακολουθία των αμινοξέων και η δομή της ινσουλίνης προσδιορίστηκε από τον καθηγητή Frederick Sanger στο πανεπιστήμιο του Cambridge και περιγράφεται σε μια σειρά 9 επιστημονικών του δημοσιεύσεων κατά το χρονικό διάστημα Ο Sanger τιμήθηκε με το βραβείο Nobel Χημείας του [17] Από τα 20 αμινοξέα κοινά συστατικά όλων των πρωτεϊνών η ινσουλίνη δεν διαθέτει την τρυπτοφάνη (try) και τη μεθειονίνη (met). Οι δύο αλυσίδες συνδέονται μεταξύ τους με δύο δισουλφιδικές γέφυρες, όπως φαίνεται και στην εικόνα 9. Μία τρίτη δισουλφιδική γέφυρα υπάρχει εσωτερικά στην Α αλυσίδα. Καμία από τις δύο αλυσίδες χωριστά δεν εμφανίζει κάποια φυσιολογική δραστικότητα και επομένως η δράση της ινσουλίνης οφείλεται στη συνολική διαμόρφωση του μορίου της (τριτοταγής δομή) και όχι στα επιμέρους συστατικά της πεπτίδια ή αμινοξέα. [8] [15] Η σύνθεση της ινσουλίνης Η ινσουλίνη ως πεπτιδική ορμόνη ακολουθεί μια γενική διεργασία η οποία χαρακτηρίζει τη σύνθεση όλων των εκκρινόμενων πρωτεϊνών, όπως φαίνεται στην εικόνα 11. Το γονίδιο που κατευθύνει τη σύνθεση των ορμονών μεταγράφει το αγγελιοφόρο RNA. Το m-rna με τη σειρά του διαπερνά το πυρηνικό περίβλημα, εξέρχεται στο κυτταρόπλασμα και μεταφράζεται στα ριβοσώματα σχηματίζοντας το πρωταρχικό γονιδιακό προϊόν το οποίο είναι μεγαλύτερο από την ίδια την ορμόνη και καλείται προ-προορμόνη (προ- προϊνσουλίνη σε αυτή την περίπτωση). Στο αμινοτελικό της άκρο, ένα σηματοδοτικό πεπτίδιο κατευθύνει τη μεταφορά της προορμόνης από το ριβόσωμα στο ER. Κατά τη διάρκεια αυτής της διεργασίας το σηματοδοτικό πεπτίδιο αποικοδομείται απελευθερώνοντας την προ-ορμόνη, η οποία μαζί με άλλες πεπτιδικές αλληλουχίες περιέχει και την ορμόνη. 17

19 Εικόνα 11: Σχηματική αναπαράσταση της σύνθεσης των πεπτιδικών ορμονών (πηγή: Αρχές Φυσιολογίας τόμος ΙΙ, Robert M. Berne, Matthew N. Levy). Η προ-ορμόνη κατόπιν μεταφέρεται στη συσκευή Golgi, όπου υφίσταται περαιτέρω επεξεργασία και τελικά προκύπτει η ορμόνη η οποία συσκευάζεται μαζί με άλλα πεπτίδια σε ένα εκκριτικό κοκκίο (εικόνα 12). Το περιεχόμενο αυτών, απελευθερώνεται με εξωκυττάρωση στο εξωκυττάριο υγρό και στη συνέχεια στα παρακείμενα τριχοειδή, κατά τη διέγερση των ενδοκρινικών κυττάρων. Εικόνα 12: Έκκριση των πεπτιδικών ορμονών με εξωκυττάρωση. Α. ένα ερέθισμα αυξάνει τη συγκέντρωση των ιόντων Ca στο κυτταρόπλασμα και τα επίπεδα του camp, B. τα εκκριτικά κοκκία κινούνται προς τη μεμβράνη με τη βοήθεια των μικροσωληναρίων, Γ. σύντηξη κοκκίων με την κυτταρική μεμβράνη, Δ. η κοινή μεμβράνη υφίσταται λύση απελευθερώνοντας την ορμόνη στον διάμεσο χώρο (πηγή: Αρχές Φυσιολογίας τόμος ΙΙ, Robert M. Berne, Matthew N. Levy). 18

20 Με τη συστολή των μικρονηματίων και την καθοδήγηση των μικροσωληναρίων τα εκκριτικά κοκκία κινούνται προς την κυτταρική μεμβράνη και συντήκονται με αυτή. Μια πρωτεΐνη που δεσμεύει GTP υποβοηθά στην πρόσδεση των κοκκίων σε ειδικές θέσεις. Απαραίτητη προϋπόθεση για την απελευθέρωση του περιεχομένου των κοκκίων είναι η αύξηση της συγκέντρωσης του κυτταροπλασματικού Ca+. Τα ιόντα Ca+ προέρχονται από το εξωκυττάριο υγρό και από το ER. [8] Βήματα μετατροπής της προ-προϊνσουλίνης σε ινσουλίνη Το m-rna της ινσουλίνης αρχικά μεταφράζεται ως μια αλυσίδα πρόδρομου μορίου, την προ-προϊνσουλίνη (εικόνα 13) στα β κύτταρα. Αυτή συνολικά αποτελείται από 110 αμινοξέα και φέρει μια αλληλουχία-σήμα 24 αμινοξέων στο Ν- τελικό της άκρο η οποία απαιτείται για τη μεταφορά δια μέσου της μεμβράνης του ενδοπλασματικού δικτύου. Εικόνα 13: Τα στάδια επεξεργασίας του μορίου της προ-προϊνσουλίνης (πηγή: %20protein.html). Μέσα στο ενδοπλασματικό δίκτυο η προ-προϊνσουλίνη υφίσταται μεταμεταφραστική τροποποίηση με την απομάκρυνση αυτής της αλληλουχίας-σήματος, με τη συμβολή πρωτεασών. Στο κύτταρο δεν υπάρχει σχεδόν καθόλου προπροϊνσουλίνη καθώς η απομάκρυνση του πεπτιδίου-σήματος δεν είναι ένα αποκομμένο βήμα, αλλά συνδέεται στενά με τη μετάθεση μέσα στο ER. Μετά την επεξεργασία από τις πρωτεάσες προκύπτει η προϊνσουλίνη η οποία αποτελείται από 86 αμινοξέα κατανεμημένα σε τρεις τομείς (domains): μια 19

21 αμινοτελική Β αλυσίδα, μια καρβοξυτελική Α αλυσίδα και ένα ενδιάμεσο συνδετικό πεπτίδιο γνωστό ως το πεπτίδιο C (εικόνα 14). Εικόνα 14: Το πρόδρομο μόριο της ινσουλίνης όπου απεικονίζονται εκτός των αλυσίδων που αποτελούν την ινσουλίνη, το πεπτίδιο C και η αλληλουχία σήμα των 24 αμινοξέων. Τα αμινοξέα με λευκό χρώμα αποτελούν τις θέσεις δράσης των ενδοπεπτιδασών οι οποίες αποκόπτουν το πεπτίδιο C (πηγή: Η προϊνσουλίνη σχηματίζεται στο ενδοπλασματικό δίκτυο, όπου αναδιπλώνεται και οξειδώνονται οι δισουλφιδικοί δεσμοί της. [15] [ΙΙ] Μονομερή, διμερή και εξαμερή ινσουλίνης Μετά την αποκοπή της αλληλουχίας-σήματος, το μόριο μεταφέρεται στο σύστημα Golgi όπου παρουσία ψευδαργύρου (Zn) σχηματίζει εξαμερή προϊνσουλίνης. Ο σχηματισμός των εξαμερών (εικόνα 15) προστατεύει τα μόρια από την ενζυμική αποικοδόμηση. Το περιεχόμενο των β κυττάρων σε Zn είναι από τα πιο υψηλά στο ανθρώπινο σώμα, κάτι που υποδηλώνει πως ο Zn είναι απαραίτητος για την αποθήκευση και έκκριση της ινσουλίνης. 20

22 Εικόνα 15: Το εξαμερές της ινσουλίνης. Διακρίνονται στο κέντρο τα ιόντα Zn συνδεόμενα με τρεις κυστεΐνες το καθένα (πηγή: :Human-insulin-hexamer-3D-ribbons.png). Στη συνέχεια, με τη δράση ενδοπεπτιδασών αποκόπτεται το πεπτίδιο C κι έτσι σχηματίζεται η ώριμη μορφή της ινσουλίνης, με τις αλυσίδες Α και Β που απομένουν, να συνδέονται μεταξύ τους με δισουλφιδικούς δεσμούς. Η ινσουλίνη που παράγεται έχει 35 λιγότερα αμινοξέα, 4 τα οποία απομακρύνονται μαζί και τα υπόλοιπα 31 που συνιστούν το πεπτίδιο C. Η ινσουλίνη και το ελεύθερο πεπτίδιο C πακετάρονται στο σύστημα Golgi σε εκκριτικά κοκκία τα οποία συσσωρεύονται στο κυτταρόπλασμα. Ο σχηματισμός των αποθηκευτικών κυστιδίων συμπίπτει με τη μεταμόρφωση της προϊνσουλίνης σε ινσουλίνη με πρωτεολυτική αποκοπή του πεπτιδίου C από ενδοπεπτιδάσες. Η αποκοπή αυτού του τμήματος μειώνει τη διαλυτότητα του εξαμερούς και αυτό οδηγεί στην κρυστάλλωσή του. Το εξαμερές είναι μία μη δραστική μορφή, κατάλληλη για την αποθήκευση και πρέπει να μετατραπεί σε μονομερές για να αποκτήσει τη βιολογική δραστικότητα. Όταν τα β κύτταρα των νησίδων δέχονται το κατάλληλο ερέθισμα, τότε η ινσουλίνη εκκρίνεται από αυτά μέσω εξωκυττάρωσης και διαχέεται στο αίμα των τριχοειδών των νησίδων. Επίσης και το C πεπτίδιο εκκρίνεται, αλλά δεν έχει γίνει γνωστή κάποια βιολογική του δράση. Καθώς η ινσουλίνη απελευθερώνεται από τα αποθηκευτικά κυστίδια στην κυκλοφορία του αίματος, οι μικροκρύσταλλοι συναντούν μια αύξηση στο ph από 5,5 σε 7,4. Την ίδια στιγμή, η συγκέντρωση του Zn μειώνεται και τα ιόντα Zn αποσυνδέονται από τα εξαμερή. Η αύξηση του ph προσδίδει αρνητικό φορτίο στις έξι κεντρικά τοποθετημένες γλουταμίνες. Αυτό, σε συνδυασμό με τη μειωμένη συγκέντρωση Zn και την αποσύνδεση των ιόντων του από το εξαμερές οδηγεί σε αποσταθεροποίηση των κρυστάλλων και διάσπαση των εξαμερών σε διμερή και μονομερή (εικόνα 16). [15] [18] [25] 21

23 Εικόνα 16: Το μονομερές της ινσουλίνης. Με πράσινο η αλυσίδα Α και με μπλε χρώμα απεικονίζεται η αλυσίδα Β (κωδικός στην Protein Data Bank: 9INS) Εικόνα 17: Δομή της εξαμερικής μορφής της ινσουλίνης. Αποτελείται από δύο αλυσίδες, την Α (21 αμινοξέα) επάνω αριστερά με μπλε χρώμα και την αλυσίδα Β (31 αμινοξέα) η οποία απεικονίζεται με το μωβ χρώμα επάνω δεξιά. Η αλυσίδα Α περιέχει ένα δισουλφιδικό δεσμό ανάμεσα στις CysA6 και CysA11 (κίτρινο χρώμα). Για το σχηματισμό του μονομερούς (μεσαίο τμήμα της εικόνας) οι δύο αλυσίδες συνδέονται με δύο δισουλφιδικές γέφυρες. Τα ιόντα Zn απεικονίζονται με κόκκινο χρώμα. Κάθε ένα από τα δύο αυτά ιόντα συνδυάζεται οκταεδρικά με τρεις HisB10 (πράσινο χρώμα). Στην εικόνα φαίνεται μόνο το ένα από τα δύο ιόντα Zn. (Η εικόνα δημιουργήθηκε με το πρόγραμμα PYMOL). 22

24 Σε τι εξυπηρετεί η εξαμερής διαμόρφωση Πιθανότατα, η εξαμερής μορφή εξυπηρετεί τις παρακάτω λειτουργίες: i. Τα ιόντα Zn 2+ και Ca 2+ του εξαμερούς δημιουργούν μια δομή η οποία προστατεύει κάποια τμήματα της πολυπεπτιδικής αλυσίδας από την πρωτεολυτική διάσπαση ενζύμων, κρύβοντάς τα ανάμεσα στις υπομονάδες του εξαμερούς και αφήνοντας το πεπτίδιο C εκτεθειμένο στη δράση ενζύμων όπως η θρυψίνη και οι καρβοξυπεπτιδάσες. ii. Η αλλαγή στη διαλυτότητα κατά τη μετατροπή του εξαμερούς προϊνσουλίνης σε εξαμερές ινσουλίνης και η επακόλουθη κρυστάλλωσή του, παρέχει επιπλέον προστασία στις νεοσυντιθέμενες αλυσίδες ινσουλίνης και αποχωρίζει την προϊνσουλίνη από την ινσουλίνη καθώς συμβαίνει η μετατροπή. iii. Μελέτες in vitro έχουν δείξει ότι το εξαμερές της ινσουλίνης είναι πολύ πιο σταθερό στην χημική και/ή φυσική αποικοδόμηση, σε σχέση με το μονομερές. Συμπερασματικά, ο σχηματισμός του εξαμερούς και η κρυστάλλωσή του σταθεροποιούν την ινσουλίνη προστατεύοντάς την από την αποικοδόμηση μέσα στα αποθηκευτικά κυστίδια. [18] T 6, T 3 R 3 και R 6 διαμορφώσεις της ινσουλίνης Η δομή της ινσουλίνης περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1969 και ονομάστηκε 2Zn λόγω των δύο ιόντων ψευδαργύρου που προσδένονταν στο εξαμερές. Σε αυτή τη μορφή τα δύο ιόντα ψευδαργύρου συνδυάζονται οκταεδρικά με τρεις ιστιδίνες (his) της θέσης 10 των Β αλυσίδων και τρία μόρια νερού. Αργότερα, ο Schlichtkrull βρήκε και μια μορφή με τέσσερα ιόντα ψευδαργύρου και ονομάστηκε 4Zn. Οι κρύσταλλοι με τα 4 ιόντα δημιουργήθηκαν όταν η συγκέντρωση των ιόντων χλωριούχου ασβεστίου στο διάλυμα ήταν 6% ή περισσότερο. Οι δομικές διαφορές ανάμεσα στους 2Zn και 4Zn κρυστάλλους εντοπίζονται στο Ν τελικό άκρο της Β αλυσίδας. Στους 2Zn κρυστάλλους τα πρώτα 8 κατάλοιπα έχουν μια εκτεταμένη (extended) διαμόρφωση, ενώ στα τρία από τα έξι μονομερή στους 4Zn κρυστάλλους τα ίδια κατάλοιπα έχουν μια ελικοειδή διαμόρφωση (helical). Τα υπόλοιπα τρία μονομερή έχουν εκτεταμένη διαμόρφωση. Μια τρίτη μορφή είναι τα έξι μονομερή να έχουν μια συνεχόμενη ελικοειδή διαμόρφωση στο Ν τελικό άκρο της Β αλυσίδας από το κατάλοιπο Β1 έως το Β19. 23

25 Το 1989 οι Kaarshom et al. πρότειναν τη χρήση των όρων Τ και R για να περιγράψουν τη διαμόρφωση των δομών της ινσουλίνης εκτός από το περιεχόμενό της σε Zn. H T 6 έχει και στα έξι μονομερή σε εκτεταμένη μορφή τα κατάλοιπα Β1 - Β8 της Β αλυσίδας, η T 3 R 3 έχει τρία μονομερή με εκτεταμένη και τρία με ελικοειδή διάταξη και η R 6 έχει και στα έξι μονομερή ελικοειδή διάταξη των καταλοίπων Β1 Β8 των αμινοξέων. (εικόνα 18) Εικόνα 18: Οι τρεις διαφορετικές δομικές διαμορφώσεις της ινσουλίνης. a) R 6 κατάσταση, τα κατάλοιπα Β1 - Β8 έχουν ελικοειδή διαμόρφωση και στα έξι μονομερή. b) Τ 3 R 3, τρία μονομερή έχουν εκτεταμένη διαμόρφωση ενώ στα υπόλοιπα τρία τα κατάλοιπα Β4 - Β8 έχουν ελικοειδή διαμόρφωση και Β1 - Β3 εκτεταμένη διαμόρφωση. c) η Τ 6 χαρακτηρίζεται από μια εκτεταμένη διαμόρφωση των καταλοίπων Β1 - Β8 σε όλα τα μονομερή. Στις εικόνες a c με κόκκινο έχει επισημανθεί η μία από τις Β αλυσίδες κάθε εξαμερούς. Στην εικόνα d, οι τρεις διαφορετικές διαμορφώσεις της Β αλυσίδας βρίσκονται η μία επάνω στην άλλη για να γίνει ευδιάκριτη η διαφορά τους. R 6 : λευκό, T 3 R 3 : πορτοκαλί και με μπλε η Τ 6 (πηγή: INSULIN POLYMORPHISM, Crystallographic characterization of insulin microcrystals, Mathias Norrman, Molecular Biophysics Lund University, 2007). 24

26 Οι τρεις διαφορετικές αλλοστερικές καταστάσεις επηρεάζουν τη σταθερότητα του εξαμερούς. Στην Τ 6, η εκτεταμένη διαμόρφωση του Ν τελικού άκρου της Β αλυσίδας εκθέτει τα ιόντα Zn στο περιβάλλον διάλυμα. Έτσι ο ψευδάργυρος μπορεί να διαχυθεί εύκολα από το εξαμερές. Στην R 6 κατάσταση, η ελικοειδής αναδίπλωση του Ν τελικού άκρου της Β αλυσίδας προστατεύει τα ιόντα Zn από το περιβάλλον. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα η R 6 κατάσταση να είναι η πιο σταθερή. Η R 6 κρυσταλλώνεται παρουσία φαινόλης και φαινολικών παραγώγων. Η T 3 R 3 είναι πιο σταθερή από την T 6 και προκύπτει υπό την παρουσία υψηλής συγκέντρωσης χλωρίου ή θειοκυανίου. Σε αυτό τον τύπο εξαμερούς μπορεί να υπάρξει ένας διαφορετικός αριθμός ιόντων Zn ανά εξαμερές, με διαφορετικό συνδυασμό. [15] [19] [21] [ΙΙΙ] Το γονίδιο της ινσουλίνης Το υπεύθυνο γονίδιο για την κωδικοποίηση της ινσουλίνης είναι το γονίδιο INS (εικόνα 19) το οποίο βρίσκεται στο 11ο χρωμόσωμα στον άνθρωπο. Εικόνα 19: Το γονίδιο INS υπεύθυνο για τη σύνθεση της ινσουλίνης (πηγή: Η ενδογενής παραγωγή ινσουλίνης ρυθμίζεται σε αρκετά βήματα του μονοπατιού σύνθεσής της όπως: o κατά τη μεταγραφή του γονιδίου INS. o στη σταθερότητα και διάρκεια ζωής του mrna της. o κατά τη μετάφραση του mrna. o κατά τις μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις. [Ι] 25

27 Πολυμορφικότητα της ινσουλίνης Η πολυμορφικότητα ορίζεται ως η ικανότητα μιας ουσίας να υπάρχει σε δύο ή περισσότερες κρυσταλλικές φάσεις με διαφορετικές διατάξεις και διαμορφώσεις των μορίων. Είναι ένα συχνά παρατηρούμενο φαινόμενο το οποίο γίνεται εύκολα κατανοητό δεδομένων των δυσκολιών που υπάρχουν στον ακριβή έλεγχο της διαδικασίας της κρυστάλλωσης. Όσον αφορά τη φαρμακευτική βιομηχανία, η πολυμορφικότητα είναι ένας σημαντικός παράγοντας για αρκετούς λόγους. Για παράδειγμα, μια νέα κρυσταλλική μορφή μπορεί να σημαίνει πως υπάρχει η δυνατότητα να αναπτυχθεί μια νέα θεραπευτική πορεία. Η ινσουλίνη είναι μια πρωτεΐνη η οποία παρουσιάζει πολυμορφικότητα. [15] ΙΝΣΟΥΛΙΝΗ ΚΑΙ ΔΙΑΒΗΤΗΣ Η σπουδαιότερη μεταβολική νόσος η οποία σχετίζεται με την ινσουλίνη είναι χωρίς αμφιβολία ο σακχαρώδης διαβήτης (diabetes mellitus). Ο σακχαρώδης διαβήτης μπορεί να οφείλεται σε έλλειψη ινσουλίνης ή σε μειωμένη απόκριση στην ορμόνη αυτή. Υπάρχει μια διάκριση σε διαβήτη τύπου Ι (ή ινσουλινοεξαρτώμενο σακχαρώδη διαβήτη) και διαβήτη τύπου ΙΙ (ή μη ινσουλινοεξαρτώμενο ή ινσουλινοανεξάρτητο διαβήτη) ο οποίος είναι γνωστός και ως διαβήτης των ενηλίκων. Η διάκριση αυτή των δύο τύπων εξαρτάται από την ποσότητα της ινσουλίνης που εκκρίνεται από το πάγκρεας του εκάστοτε ασθενούς. Σακχαρώδης Διαβήτης Τύπου Ι Στον τύπο Ι σακχαρώδους διαβήτη, T1DM (εικόνα 20), η ινσουλίνη είναι ολοκληρωτικά (ή σχεδόν) απούσα από τις νησίδες του Langerhans και το πλάσμα και η θεραπεία με ινσουλίνη είναι απαραίτητη. Χαρακτηριστικό του είναι πως εμφανίζεται κατά την παιδική ηλικία. Ο τύπος αυτός είναι λιγότερο συνηθισμένος και οφείλεται στην ολική ή σχεδόν ολική καταστροφή των παγκρεατικών β κυττάρων από τα λευκά αιμοσφαίρια του ίδιου του οργανισμού. Πρόκειται δηλαδή για ένα αυτοάνοσο νόσημα κατά το οποίο τα λευκοκύτταρα επιτίθενται σε κύτταρα που αποτελούν κομμάτι του ίδιου του οργανισμού. Τα αίτια αυτής της αυτοάνοσης 26

28 απόκρισης δεν έχουν διευκρινισθεί. Ο έλεγχος του διαβήτη τύπου Ι περιλαμβάνει τη χορήγηση ινσουλίνης σε ενέσιμη μορφή. Αν γινόταν χορήγηση μέσω της πεπτικής οδού, αυτή δεν θα ήταν αποτελεσματική λόγω της δράσης των πεπτικών ενζύμων που θα την κατέστρεφαν. Γι' αυτό το λόγο γίνονται και προσπάθειες για εναλλακτικές θεραπευτικές οδούς (π.χ. Φάρμακα σε κρυσταλλική μορφή). Είναι επίσης πιθανό μελλοντικά η μεταμόσχευση φυσιολογικών κυττάρων νησίδων σε ασθενή με διαβήτη τύπου Ι να αποτελέσει μια αποτελεσματική θεραπεία. Είναι αναγκαίο να τονίσουμε πως χορήγηση ινσουλίνης με οποιονδήποτε τρόπο δεν αποτελεί θεραπεία για το διαβήτη, αλλά μια αγωγή η οποία πρέπει να επαναλαμβάνεται. Εικόνα 20: Σχηματική αναπαράσταση των γεγονότων που λαμβάνουν χώρα στην περίπτωση του διαβήτη τύπου Ι (πηγή: Εξαιτίας της ανεπάρκειας ινσουλίνης, ασθενείς στους οποίους δεν εφαρμόζεται κάποια αγωγή έχουν αυξημένα επίπεδα γλυκόζης στο αίμα τους. Αυτή η αύξηση συμβαίνει γιατί η γλυκόζη αποτυγχάνει να εισέλθει φυσιολογικά στα κύτταραστόχους της ινσουλίνης οπότε παραμένει στον εξωκυττάριο χώρο. Επιπλέον, το ήπαρ συνθέτει συνεχώς γλυκόζη μέσω της γλυκογονόλυσης και της γλυκονεογένεσης και την εκκρίνει στο αίμα. Χαρακτηριστικό των όσων νοσούν από αυτόν τον τύπο διαβήτη είναι η απώλεια βάρους. 27

29 Σακχαρώδης Διαβήτης Τύπου ΙΙ Στο σακχαρώδη διαβήτη τύπου ΙΙ, T2DM (εικόνα 21), η ινσουλίνη είναι συνήθως παρούσα στο πλάσμα σε σχεδόν φυσιολογικά επίπεδα ή λίγο πιο αυξημένη από τα φυσιολογικά όρια και η θεραπεία δεν περιλαμβάνει τη χορήγηση ινσουλίνης αν και περίπου στο 1/3 των ασθενών με T2DM μπορεί να είναι ωφέλιμη. Περίπου το 90% των διαβητικών ανήκουν σε αυτή την κατηγορία και είναι κυρίως υπέρβαρα άτομα καθώς δεν απεκκρίνουν αρκετή γλυκόζη με τα ούρα, κάτι το οποίο θα προκαλούσε απώλεια βάρους. Ο τύπος αυτός εμφανίζεται σε μεγαλύτερη ηλικία και όχι κατά την παιδική. Εικόνα 21: Σχηματική αναπαράσταση των γεγονότων που λαμβάνουν χώρα στην περίπτωση του διαβήτη τύπου ΙΙ (πηγή: Αρκετοί παράγοντες, τόσο γενετικοί όσο και τρόπου ζωής συνδυάζονται για να προκαλέσουν τελικά τον διαβήτη τύπου ΙΙ. Ένα βασικό πρόβλημα είναι η μειωμένη απόκριση των κυττάρων-στόχων στην ινσουλίνη, μία κατάσταση γνωστή ως ανοχή στην ινσουλίνη. Η παχυσαρκία παίζει μεγάλο προδιαθεσικό ρόλο στην ανοχή στην ινσουλίνη στον T2DM, αλλά και γενικά σε οποιοδήποτε άτομο διαβητικό ή όχι προκαλεί ως ένα βαθμό ανοχή στην ινσουλίνη κυρίως στα μυϊκά και στα κύτταρα του λιπώδους ιστού. Η παχυσαρκία προδιαθέτει την ανάπτυξη ινσουλινοαντοχής πιθανόν λόγω της παραγωγής από το λιπώδη ιστό ουσιών που 28

30 ελαττώνουν την ευαισθησία των κυττάρων στην ινσουλίνη. Άλλοι προδιαθεσικοί παράγοντες είναι η ηλικία και το οικογενειακό ιστορικό. Οι περισσότεροι ασθενείς με T2DM όχι μόνο εμφανίζουν ανοχή στην ινσουλίνη, αλλά επίσης έχουν πρόβλημα όσον αφορά την ικανότητα των β κυττάρων τους να εκκρίνουν την ορμόνη αυτή ως απόκριση σε αυξημένη συγκέντρωση γλυκόζης στο πλάσμα. Τα χαρακτηριστικά συμπτώματα της νόσου είναι η υπερβολική δίψα, η συχνοουρία και η πολυφαγία. Το πρώτο βήμα για τη θεραπεία είναι η αλλαγή του τρόπου ζωής με στόχο την απώλεια βάρους, την αύξηση της σωματικής άσκησης και την υιοθέτηση ενός προγράμματος υγιεινής διατροφής. [3] ΚΡΥΣΤΑΛΛΩΣΗ Ορισμός Ως κρυστάλλωση ορίζεται η απομάκρυνση ενός συστατικού από ένα διάλυμα με τη μορφή στερεών κρυσταλλικών σωματιδίων, των κρυστάλλων (εικόνα 22). Κρύσταλλος είναι το στερεό το οποίο αποτελείται από στοιχειώδη δομικά τμήματα (άτομα, μόρια ή ολόκληρες πρωτεΐνες), τακτοποιημένα σε μια σταθερή, τριπλή και περιοδική διάταξη. [11] Στην ιδανική περίπτωση, όλα τα μόρια εντός του κρυστάλλου θα είναι πανομοιότυπα. Μέσα στον κρύσταλλο, στο επαναλαμβανόμενο μοτίβο μορίων, κάθε ένα από αυτά αλληλεπιδρά με τα γειτονικά του με τον ίδιο τρόπο. Η τρισδιάστατη διάταξη των μορίων τα οποία χτίζουν τον κρύσταλλο σχηματίζει ένα πλέγμα (lattice). Οι θέσεις των μορίων σχετίζονται μεταξύ τους με παράγοντες συμμετρίας. Η μικρότερη μονάδα που μπορεί να επαναληφθεί στον κρύσταλλο με μετατοπίσεις και στις τρεις διαστάσεις, διατηρώντας παράλληλα τη δομή και το περιεχόμενό του, ονομάζεται μοναδιαία κυψελίδα (unit cell). [15] 29

31 Εικόνα 22: Κρύσταλλοι ινσουλίνης οι οποίοι έχουν συγκρυσταλλωθεί με τον προσδέτη 3,5- Dihydroxybenzoic acid (από τα πειράματα στο εργαστήριο). Η κρυστάλλωση των πρωτεϊνών είναι το βασικό βήμα της πρωτεϊνικής κρυσταλλογραφίας. Οι πρωτεΐνες, ως μακρομόρια, είναι πολύ ενδιαφέροντα φυσικοχημικά συστήματα οι ιδιότητες των οποίων ποικίλλουν ανάλογα με τις περιβαλλοντικές συνθήκες όπως είναι η θερμοκρασία, το ph, οι ιοντικές δυνάμεις. Είναι δομικά δυναμικά συστήματα. [6] Η γνώση της τρισδιάστατης δομής των πρωτεϊνικών μορίων είναι εξαιρετικής σημασίας για την κατανόηση της λειτουργίας τους και τον σχεδιασμό νέων φαρμάκων ή τη βελτιστοποίηση κάποιων παλαιότερων. Αυτή η γνώση μπορεί να αποκτηθεί μέσω κρυσταλλογραφικών μεθόδων οι οποίες περιγράφονται παρακάτω. Το πρώτο βήμα για αυτήν τη διαδικασία είναι η κρυστάλλωση του υπό μελέτη βιολογικού μακρομορίου. Οι σχηματιζόμενοι κρύσταλλοι αποτελούν τα απαραίτητα δείγματα για τον προσδιορισμό της τρισδιάστατης δομής αυτών των μορίων. [20] Αρχές της κρυστάλλωσης Οι αρχές της κρυστάλλωσης των μακρομορίων (πρωτεϊνών σε αυτή την περίπτωση), είναι ανάλογες με αυτές της κρυστάλλωσης των μικρών μορίων. Παρ όλα αυτά ο βαθμός δυσκολίας της κρυστάλλωσης των πρωτεϊνών είναι ασύγκριτα υψηλότερος σε σύγκριση με τα μικρά οργανικά μόρια. Τα πρωτεϊνικά μόρια συνήθως αποτελούνται από 50% περίπου διαλύτη, με αποτέλεσμα να είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα και ασταθή στις εξωτερικές περιβαλλοντικές επιδράσεις. Αυτό 30

32 συμβαίνει και εξαιτίας των ασθενών αλληλεπιδράσεων που αναπτύσσονται και συνδέουν μεταξύ τους τα πρωτεϊνικά μόρια στον κρύσταλλο. [14] Η κρυστάλλωση των μακρομορίων γενικά και των πρωτεϊνών ειδικότερα, αφορά τη συστηματική αναζήτηση των οριακών τιμών των παραμέτρων που έχουν επίδραση στο σχηματισμό των κρυστάλλων. Ανόργανα μόρια όπως είναι για παράδειγμα το NaCl, κρυσταλλώνονται πολύ εύκολα αλλά πιο πολύπλοκα μόρια όπως είναι οι πρωτεΐνες θα κρυσταλλωθούν μόνο κάτω από συγκριτικά μικρότερη διακύμανση των χημικών συνθηκών. Στην πραγματικότητα είναι δύσκολο να γίνει πρόβλεψη πριν το πείραμα αν θα αποκτηθούν επιτυχώς κρύσταλλοι ή όχι. Σκοπός είναι να βρεθεί μία ή περισσότερες ομάδες των παραμέτρων οι οποίες είναι κατάλληλες και οδηγούν στο στοιχειώδη έστω σχηματισμό κρυστάλλων. Ακολουθεί η βελτιστοποίησή τους ώστε να αποκτηθούν οι καλύτεροι δυνατοί κρύσταλλοι, ιδανικοί για ανάλυση με ακτίνες Χ. [5] [14] Οι πλέον κατάλληλες συνθήκες για την ανάπτυξη των κρυστάλλων είναι αυτές οι οποίες προκαλούν λίγη ή και καθόλου διαταραχή των ιδιοτήτων των πρωτεϊνικών μορίων. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα να χρησιμοποιείται ένα μέσο ανάπτυξης με σταθερή θερμοκρασία και εύρος ph [14] Δεδομένης της ασταθούς φύσης των πρωτεϊνικών μορίων και της ευαισθησίας τους στις αλλαγές στο φυσικό τους περιβάλλον, οι συνθήκες στις οποίες αναπτύσσονται οι κρύσταλλοι βρίσκονται μέσα σε ένα μικρό εύρος ph, θερμοκρασιών και ιοντικών δυνάμεων. Επιπλέον, οι κρύσταλλοι των μακρομορίων αποτελούνται από 25-90% από διαλύτη ο οποίος καταλαμβάνει το χώρο γύρω από τα πρωτεϊνικά μόρια και αποτελεί και αυτός όπως και τα ίδια τα μακρομόρια μέρος του κρυστάλλου. Συνεπώς οι κρύσταλλοι πρέπει να διατηρούνται σε επαφή με το μητρικό υγρό κατά τη διάρκεια της κρυστάλλωσης καθώς επίσης και κατά τη διάρκεια της συλλογής δεδομένων, ώστε να αποφευχθεί η αφυδάτωση η οποία με τη σειρά της θα οδηγούσε στην κατάρρευση της κρυσταλλικής δομής. Σαν σύνολο η διαδικασία της κρυστάλλωσης είναι πολυπαραμετρική και φυσικά η κρυστάλλωση των πρωτεϊνικών μορίων δεν αποτελεί εξαίρεση. [16] Υπάρχουν κάποιες διαφορές ανάμεσα στους κρυστάλλους των μικρομορίων και αυτούς των μακρομορίων. Οι πρώτοι έχουν μεγαλύτερες διαστάσεις, είναι περισσότερο σκληροί και ανθεκτικοί, έχουν ισχυρές οπτικές ιδιότητες και περιθλούν έντονα τις ακτίνες Χ. Αυτό συμβαίνει γιατί οι κρύσταλλοι των μικρομορίων παρουσιάζουν ισχυρές αλληλεπιδράσεις στο πλέγμα τους και υψηλής τάξης 31

33 διευθετήσεις μέσα σε αυτό. Αντίθετα, οι πρωτεϊνικοί κρύσταλλοι είναι μικρότεροι σε μέγεθος (1-100 μm), μαλακοί και εύθραυστοι. Έχουν ασθενείς οπτικές δυνάμεις και περιθλούν ασθενώς τις ακτίνες Χ. Επίσης, είναι ευαίσθητοι στη θερμοκρασία καθώς αυτή αποτελεί έναν παράγοντας που επηρεάζει τη διαλυτότητα των πρωτεϊνών. Θεωρητικά, καθώς η θερμοκρασία αυξάνεται το ίδιο συμβαίνει και με τη διαλυτότητα των πρωτεϊνών κι έτσι δε σχηματίζονται κρύσταλλοι, ενώ ενδεχομένως να διαλυθούν οι ήδη υπάρχοντες. Όταν οι κρύσταλλοι εκτεθούν σε ακτίνες Χ για μεγάλο χρονικό διάστημα αυτό μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα εκτεταμένη ζημιά σε αυτούς, λόγω των ασθενών δυνάμεων εντός του κρυσταλλικού πλέγματος. Επιπλέον, οι ακτίνες Χ μπορούν να παράγουν αρκετές ελεύθερες ρίζες οι οποίες έχουν την ικανότητα να προκαλέσουν συγκεκριμένες χημικές αλλαγές στα πρωτεϊνικά μόρια όπως για παράδειγμα τη διάσπαση των δισουλφιδικών δεσμών τους. [14] Η κρυστάλλωση των πρωτεϊνών από ένα διάλυμα είναι ένα αντιστρεπτό φαινόμενο που σχετίζεται με την ισορροπία και περιλαμβάνει τρία στάδια: την πυρήνωση (σχηματισμός μοριακών συσσωματωμάτων), την ανάπτυξη των κρυστάλλων και την παύση της. Επιτυγχάνεται όταν τα μόρια συσσωρεύονται με έναν τρόπο που χαρακτηρίζεται από μεγάλη τάξη, από την υγρή φάση (δηλαδή το διάλυμα) στη στερεή φάση (δηλαδή τον κρύσταλλο). Αυτό διαφέρει από φαινόμενα όπως η ιζηματοποίηση κατά την οποία τα μόρια αφήνουν με άτακτο τρόπο το διάλυμα και σχηματίζουν ένα άμορφο ίζημα. Ο σχηματισμός των κρυστάλλων συμβαίνει εξαιτίας της μείωσης της ελεύθερης ενέργειας του συστήματος, ενώ ο ταυτόχρονος σχηματισμός πολλών νέων χημικών δεσμών εκτοπίζει τη φθίνουσα εντροπία του συστήματος ώστε να δημιουργηθεί μια υψηλής οργάνωσης εσωτερική δομή. Γενικά, για να πραγματοποιηθεί κρυστάλλωση πρέπει το διάλυμα που προορίζεται για το σκοπό αυτό να βρίσκεται σε κατάσταση υπερκορεσμού. [5] [14] Κορεσμός διαλυμάτων Πριν συνεχίσουμε πρέπει να αναφερθούμε με λίγα λόγια στο τι είναι υπόκορο (ή υποκορεσμένο), τι κορεσμένο και τι υπέρκορο διάλυμα. Με τον όρο διαλυτότητα χαρακτηρίζεται η ικανότητα μιας χημικής ουσίας να διαλυθεί μέσα σε άλλη. Αυτή η ικανότητα προσδιορίζεται από τη μέγιστη ποσότητά της που μπορεί να διαλυθεί, σε καθορισμένη πάντα ποσότητα διαλύτη και σε ορισμένη θερμοκρασία. Το διάλυμα που περιέχει τη μεγαλύτερη δυνατή ποσότητα διαλυτής ουσίας καλείται 32

34 κορεσμένο διάλυμα (εικόνα 23) και αυτό στο οποίο επιτυγχάνεται διάλυση μιας ουσίας στον διαλύτη σε μεγαλύτερη ποσότητα από αυτήν που θα υποδείκνυε η υπό κανονικές συνθήκες διαλυτότητά της ονομάζεται υπέρκορο. Εικόνα 23: Κορεσμός διαλύματος (πηγή: 11-measuring-solubility/). Όταν το διάλυμα είναι κορεσμένο τότε μέσα σε αυτό υπάρχουν σε ισορροπία (σε ισοζύγιο) δύο φάσεις, η στερεή και μία που αποτελείται από μόρια ελεύθερα στο διάλυμα. Το σημείο της ισορροπίας αναφέρεται και ως το όριο διαλυτότητας της πρωτεΐνης και σηματοδοτεί και την απαίτηση σε ενεργειακά φαινόμενα που πρέπει να συμβούν ώστε να γίνει πυρήνωση. Η καμπύλη διαλυτότητας (εικόνα 24) χωρίζει την περιοχή της συγκέντρωσης σε υποκορεσμένη (κάτω από το όριο διαλυτότητας) και υπερκορεσμένη περιοχή (πάνω από το όριο διαλυτότητας). Στην υποκορεσμένη περιοχή η πρωτεΐνη δεν θα κρυσταλλωθεί ποτέ. Στο σημείο κορεσμού δεν παρατηρείται σχηματισμός δικτύου όσον αφορά το κομμάτι της στερεής φάσης γιατί οποιαδήποτε αύξηση της στερεής πρωτεΐνης τείνει να αντισταθμίζεται από διάλυσή της. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα να μη μπορούν να αναπτυχθούν ούτε κι εδώ κρύσταλλοι. Το σύστημα πρέπει να βρίσκεται σε μη ισορροπία (σε κατάσταση υπερκορεσμού) ώστε να δώσει τις κατάλληλες θερμοδυναμικές συνθήκες για κρυστάλλωση. Στο υπέρκορο διάλυμα, το οποίο αποτελεί μια θερμοδυναμικά ασταθή κατάσταση, αποσταθεροποιούνται οι 33

35 αλληλεπιδράσεις μεταξύ της πρωτεΐνης και του διαλύτη και γι αυτό σχηματίζονται οι κρύσταλλοι. Όταν το διάλυμα που μας ενδιαφέρει πρόκειται να σχηματίσει κρυστάλλους πρέπει να μεταβεί από την υποκορεσμένη ή κορεσμένη του κατάσταση σε φάση υπερκορεσμού, σύμφωνα με την οποία η επιστροφή του διαλύματος στην κατάσταση ισορροπίας ενισχύει το σχηματισμό των κρυστάλλων. Αν από ένα υποκορεσμένο διάλυμα απομακρύνεται σταδιακά ο διαλύτης με εξάτμιση, μειώνεται ή αυξάνεται η θερμοκρασία ελεγχόμενα ή αλλάζει κάποιος άλλος παράγοντας, τότε μπορεί να υπερνικηθεί το όριο διαλυτότητας και το διάλυμα να γίνει υπέρκορο. [6] [13] [14] Διάγραμμα φάσεων Στο διάγραμμα φάσεων (εικόνα 24), η περιοχή επάνω από την καμπύλη που δίνει το όριο διαλυτότητας, μπορεί να χωριστεί σε τρεις υποπεριοχές ανάλογα με το επίπεδο κορεσμού. Τη μετασταθερή ζώνη (metastable zone), την ασταθή ζώνη (labile zone) η οποία ονομάζεται και ζώνη πυρήνωσης και τη ζώνη ιζηματοποίησης (precipitation zone). Εικόνα 24: Απεικόνιση του διαγράμματος φάσεων κατά τα πειράματα κρυστάλλωσης. Η κόκκινη καμπύλη ορίζει το όριο διαλυτότητας (πηγή: 34

36 Στην τελευταία περίπτωση, η πρωτεΐνη δεν παραμένει στο διάλυμα αλλά υπάρχει ως άμορφο ίζημα ο σχηματισμός του οποίου υποδηλώνει ότι δε θα σχηματιστούν καθόλου κρύσταλλοι. [14] Στάδια κρυστάλλωσης Πυρήνωση Ο σχηματισμός ενός κρυστάλλου εξαρτάται αρχικά από το σχηματισμό ενός σταθερού πυρήνα, μια διαδικασία γνωστή ως πυρήνωση (nucleation), η οποία δεν είναι απαραιτητο ότι θα συμβεί αυθόρμητα αμέσως μετά την υπέρβαση του ορίου του κορεσμού. Αυτό συμβαίνει γιατί απαιτείται ενέργεια γι αυτή τη διεργασία. Η πυρήνωση μπορεί να είναι ομοιογενής ή πιο συχνά ετερογενής όταν περιλαμβάνει και ξένα σωματίδια όπως σκόνη. Ξεκινά με δύο ή περισσότερα μόρια να συναθροίζονται και να σχηματίζουν ένα κατάλληλο υπόβαθρο, επάνω στο οποίο μπορούν να επιστρατευτούν κι άλλα μεμονωμένα μόρια. Διαδοχική προσθήκη δείγματος χαρακτηριζόμενη από μια σειρά, μια τάξη, κάτω από συνθήκες υπερκορεσμού, οδηγεί στην ανάπτυξη τρισδιάστατων κρυστάλλων μέχρι να επιτευχθεί πάλι ισορροπία. Εικόνα 25: Σε αυτές τις εικόνες διακρίνεται αριστερά ένα άμορφο υλικό (είναι στο στάδιο της πυρήνωσης), στην κεντρική φωτογραφία φαίνεται ένα πολυκρυσταλλικό δείγμα και δεξιά απεικονίζεται ένας μονο-κρύσταλλος ο οποίος δημιουργήθηκε με την πάροδο του χρόνου. Η κυρίαρχη δύναμη πίσω από αυτή τη διαδικασία είναι ο σχηματισμός του μέγιστου δυνατού βαθμού διαμοριακών αλληλεπιδράσεων, όπως είναι οι δεσμοί υδρογόνου κι οι δυνάμεις van der Waals. Άπαξ και ένας σταθερός πυρήνας έχει σχηματισθεί σε ένα υπέρκορο διάλυμα και η κατάσταση αυτή του υπερκορεσμού συνεχίζεται, τότε αυτός θα συνεχίσει να μεγαλώνει μέχρι το σύστημα να επανέλθει σε ισορροπία. Με τον όρο σταθερός πυρήνας περιγράφεται ένα κανονικό (περιοδικό) 35

37 μόριο τέτοιου μεγέθους και φυσικής συνοχής ώστε να έχει την ικανότητα να επιστρατεύει νέα μόρια στις αυξανόμενου μεγέθους επιφάνειές του πιο γρήγορα από αυτά που χάνονται μέσα στο διάλυμα. Αντίθετα, οι ασταθείς (μη σταθεροί πυρήνες) αντί να συνεχίσουν να αναπτύσσονται μετά τη δημιουργία τους, επαναδιαλύονται τόσο γρήγορα όσο σχηματίστηκαν και τα συστατικά τους μόρια επιστρέφουν στο διάλυμα. [5] [6] [13] Ανάπτυξη των κρυστάλλων Όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως, οι δύο από τις τρεις περιοχές επάνω από την καμπύλη διαλυτότητας είναι γνωστές ως μετασταθής και ζώνη πυρήνωσης. Η μετασταθής περιοχή όπως δηλώνει και το όνομά της δεν μπορεί να υποστηρίξει το σχηματισμό σταθερών πυρήνων, γιατί εκεί η πιθανότητα είναι πολύ χαμηλή. Ωστόσο, αν ένας έτοιμος σταθερός κρυσταλλικός πυρήνας είναι ήδη παρών ή εισαχθεί σε αυτή την περιοχή, τότε υπάρχει η δυνατότητα να συνεχίσει να αναπτύσσεται. Σε αντίθεση με τη μετασταθή, η ζώνη πυρήνωσης (υψηλού υπερκορεσμού), διαφέρει γιατί εκεί μπορούν να σχηματισθούν αυθόρμητα σταθεροί πυρήνες και φυσικά να συνεχίσουν να αναπτύσσονται, καθώς η πιθανότητα πυρήνωσης είναι συνάρτηση του βαθμού κορεσμού. Επιπρόσθετα, επειδή οι πυρήνες είναι σταθεροί θα συσσωρεύουν μόρια εξαλείφοντας έτσι την υγρή φάση του διαλύτη μέχρι το σύστημα να περάσει μέσω της μετασταθούς περιοχής και τελικά να φτάσει στην κατάσταση κορεσμού. Με λίγα λόγια, η μετασταθής περιοχή μπορεί να υποστηρίξει την ανάπτυξη κρυστάλλων αλλά όχι το σχηματισμό πυρήνων και η ζώνη πυρήνωσης υποστηρίζει τόσο τη δημιουργία πυρήνων όσο και το σχηματισμό κρυστάλλων. Το εύρος της πυρήνωσης και της κρυστάλλωσης είναι συνάρτηση της απόστασης του διαλύματος από τη θέση ισορροπίας. Όσο πιο μακριά μέσα στη ζώνη πυρήνωσης βρίσκεται το διάλυμα τόσο περισσότεροι πυρήνες θα σχηματισθούν και τόσο πιο γρήγορα. Η γρήγορη αύξηση που εμφανίζεται σε πολύ υψηλές τιμές κορεσμού σχετίζεται με την εμφάνιση σφαλμάτων, μετατοπίσεων και ενσωμάτωση μη καθαρών και ανεπιθύμητων παραγόντων. Στη συνέχεια, η ανάπτυξη των κρυστάλλων επιβραδύνεται με την κίνηση του διαλύματος προς την ισορροπία. Αυτό οδηγεί σε ένα μεγάλο αριθμό πολύ μικρών και συχνά ατελών κρυστάλλων ακατάλληλων για περίθλαση. Επίσης, προωθείται ο σχηματισμός ιζήματος του διαλύματος που μειώνει τη διαλυτότητα της πρωτεΐνης (precipitate), παρά των 36

38 κρυστάλλων αφού η πυρήνωσή του ευνοείται σε καταστάσεις πολύ υψηλού υπερκορεσμού. Αντιστρόφως, όσο πιο κοντά είναι το σύστημα στη μετασταθή περιοχή τόσο λιγότεροι σταθεροί πυρήνες σχηματίζονται και τόσο πιο αργά και σταθερά προχωρά η κρυστάλλωση. Αυτή είναι και η επιθυμητή και ιδανική κατάσταση στην κρυστάλλωση των βιομακρομορίων, αφού οδηγεί σε ένα μικρό αριθμό μεγάλων κρυστάλλων της υψηλής ποιότητας που απαιτείται για την περίθλαση. Δεν πρέπει να ξεχνάμε βέβαια πως η συμπεριφορά του κάθε πρωτεϊνικού μορίου είναι μοναδική, γεγονός που μας δείχνει πως είναι δύσκολο να επιτευχθούν οι συνθήκες εκείνες που θα δώσουν ένα μικρό αριθμό μεγάλων κρυστάλλων. [5] [6] Παράγοντες που επηρεάζουν την κρυστάλλωση Η κρυστάλλωση των πρωτεϊνών επηρεάζεται από ένα πλήθος παραγόντων οι οποίοι δεν είναι ανεξάρτητοι ο ένας από τον άλλο και οι μεταξύ τους σχέσεις ίσως και να είναι πολύπλοκο να διακριθούν. Γενικά, η συγκέντρωση της πρωτεΐνης, το ph του ρυθμιστικού, η ιοντική ισχύς, η θερμοκρασία, ο χρόνος παραμονής, οι πρόσθετες ουσίες που συνδέονται με την πρωτεΐνη (ligands) και η καθαρότητά της είναι ορισμένοι από αυτούς τους παράγοντες. [14] Διαλυτότητα Όσο πιο διαλυτή είναι μια πρωτεΐνη, τόσο πιο μεγάλο είναι το καθαρό της φορτίο με την ελάχιστη διαλυτότητά της να απαντάται στο ισοηλεκτρικό σημείο. Το ισοηλεκτρικό σημείο (pi) μιας πρωτεΐνης είναι το ph εκείνο όπου το ολικό φορτίο της είναι ίσο με το μηδέν. Το καθαρό φορτίο είναι μηδέν και ως εκ τούτου είναι δυνατόν να γίνει πακετάρισμα στη στερεή κατάσταση (τον κρύσταλλο) λόγω των ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων, χωρίς τη συσσώρευση ενός καθαρού φορτίου υψηλής ενέργειας. Η διαλυτότητα μια πρωτεΐνης μεταβάλλεται σε συνάρτηση με την απόσταση των μονάδων ph από το ισοηλεκτρικό της σημείο, αν και οι περισσότερες κρυσταλλώνονται σε τιμές ph μεταξύ 6 και 8. Ωστόσο υπάρχουν και άλλες περιπτώσεις, όπως για παράδειγμα ένα θερμόφιλο ένζυμο το οποίο έχει pi στο ph=4.5 αλλά κρυσταλλώνεται σε ph=6.8. [4] [20] 37

39 Θερμοκρασία Η επίδραση της θερμοκρασίας στη διαλυτότητα των πρωτεϊνών χαρακτηρίζεται ως ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες, καθώς η αύξηση της θερμοκρασίας οδηγεί σε αύξηση της διαλυτότητας άρα μη κατάλληλες συνθήκες για κρυστάλλωση. Επομένως είναι απαραίτητο το δείγμα να μην εκτίθεται σε θερμοκρασιακές διακυμάνσεις. Οι πιο ευρέως χρησιμοποιούμενες θερμοκρασίες για πρωτεϊνική κρυστάλλωση είναι μεταξύ 4 και 20 ο C. Ευτυχώς σε ένα πείραμα κρυστάλλωσης ο έλεγχος της θερμοκρασίας είναι μια εύκολη διαδικασία και πραγματοποιείται με ακρίβεια (χρήση ψυχρών θαλάμων, θαλάμων επώασης θερμοκρασίας δωματίου, ανάλογα με τις επιθυμητές συνθήκες). Η θερμοκρασία μπορεί να επιδράσει με τέτοιο τρόπο, ώστε κρύσταλλοι οι οποίοι αναπτύσσονται σε δύο διαφορετικές θερμοκρασίες να έχουν και διαφορές στη μορφολογία τους. [14] Χρόνος Ο χρόνος είναι ένας άλλος παράγοντας που επηρεάζει την κρυστάλλωση. Μερικοί κρύσταλλοι χρειάζονται κάποιες ώρες για να αναπτυχθούν ενώ άλλοι εβδομάδες ή ακόμα και μήνες. Όταν ο κρύσταλλος φθάσει ένα συγκεκριμένο μέγεθος τότε αυθόρμητα θα σταματήσει να αναπτύσσεται. [14] ph Το ph του διαλύματος επηρεάζει το φορτίο των πλευρικών ομάδων των αμινοξέων από τα οποία αποτελείται η πρωτεΐνη και πολύ μικρές διακυμάνσεις σε αυτό μπορούν να κάνουν τη διαφορά ανάμεσα στην απόκτηση ή όχι κρυστάλλων. Μερικά από τα αμινοξέα της επιφάνειας της πρωτεΐνης όταν έλθουν σε επαφή με το διαλύτη όταν η πρωτεΐνη βρίσκεται σε άμορφη κατάσταση, θα χρειαστεί να αλληλεπιδράσουν με αυτόν ώστε να γίνει η έναρξη της κρυσταλλικής πυρήνωσης. [13] Ιοντική ισχύς Η ιοντική ισχύς του διαλύματος σχετίζεται με την προσθήκη ή όχι αλάτων. Τα άλατα αλληλεπιδρούν με τα μόρια νερού του διαλύματος καθώς με την εισαγωγή τους σε αυτό διίστανται. Έτσι δρουν ανταγωνιστικά με την πρωτεΐνη ως προς αυτό και μειώνουν τη διαλυτότητά της, οδηγώντας την έτσι στην πυρήνωση και κατ επέκταση στη δημιουργία κρυστάλλων. Η πρωτεΐνη μπορεί να θεωρηθεί σαν ένα ιόν 38

40 το οποίο αλληλεπιδρά με το περιβάλλον του δημιουργώντας διάφορους δεσμούς. Σε ένα υδατικό διάλυμα, κάθε τέτοιο ιόν περιβάλλεται από μια ιοντική ατμόσφαιρα η οποία επιδρά στις αλληλεπιδράσεις του με τα μόρια του νερού, επηρεάζοντας έτσι τη διαλυτότητα. [4] Καθαρότητα της πρωτεΐνης Η καθαρότητα της πρωτεΐνης είναι ακόμα μία σημαντική παράμετρος που πρέπει να λαμβάνεται υπ όψιν. Αυτή σχετίζεται με την απουσία κάποιου «μολυσματικού» παράγοντα από τους κρυστάλλους όπως για παράδειγμα σωματίδια σκόνης, μικρόβια, ξένη ή μετουσιωμένη πρωτεΐνη. Μη καθαροί πρωτεϊνικοί κρύσταλλοι δίνουν κακής ποιότητας δεδομένα περίθλασης ακτίνων Χ με συνέπεια να μην είναι δυνατή η απόκτηση της δομής της πρωτεΐνης κατά την επεξεργασία τους. [14] Η φύση της πρωτεΐνης Η φύση της ίδιας της πρωτεΐνης επίσης παίζει σημαντικό ρόλο στο αν αυτή θα μπορέσει να κρυσταλλωθεί ή όχι. Ορισμένες πρωτεΐνες μπορεί να έχουν ιδιότητες επιφάνειας τέτοιες ώστε να μη βοηθούν στο σχηματισμό κρυσταλλικών επαφών. Κάποιες φορές, αν και κρυσταλλώνεται, η ποιότητα των δεδομένων περίθλασης δεν είναι αρκετά καλή ώστε να δώσει τις απαραίτητες πληροφορίες για τη δομή. Αν παρ όλα αυτά είναι οπωσδήποτε επιθυμητή η κρυστάλλωση της συγκεκριμένης πρωτεΐνης, τότε ως λύση στο πρόβλημα είναι κάποιες ενέργειες όπως ελεγχόμενη πρωτεόλυση, μετάλλαξή της ή σχηματισμός συμπλόκων αυτής. [14] Οργανικοί διαλύτες Η παρουσία οργανικών διαλυτών τείνει στο να μειώνει τη διηλεκτρική σταθερά. Αυτό προκαλεί αύξηση της αλληλεπίδρασης μεταξύ των αντίθετα φορτισμένων περιοχών της επιφάνειας της πρωτεΐνης κι έτσι μείωση της διαλυτότητάς της. Γενικά, η διαλυτότητα μιας πρωτεΐνης μειώνεται υπό την παρουσία ενός οργανικού διαλύτη αν η θερμοκρασία μειώνεται. Συχνά οι οργανικοί διαλύτες μετουσιώνουν τις πρωτεΐνες. [4] 39

41 Η χημεία της κρυστάλλωσης Η φυσιολογική τάση οποιουδήποτε συστήματος κατευθύνεται προς την ισορροπία είναι να μεγιστοποιεί το βαθμό της αταξίας του, δηλαδή την εντροπία, απελευθερώνοντας μεμονωμένα συστατικά από το φυσικό και χημικό τους περιορισμό, δηλαδή από την τάξη στην οποία βρίσκονται. Ταυτόχρονα, υπάρχει και μια θερμοδυναμική απαίτηση για ελαχιστοποίηση της ελεύθερης ενέργειας του συστήματος. Αυτό επιτυγχάνεται με το σχηματισμό χημικών δεσμών και αλληλεπιδράσεων μεταξύ των μορίων. Καταλαβαίνουμε πως η συσσώρευση των μορίων σε ένα κανονικό πλέγμα μειώνει την κινητικότητά τους και την ελευθερία τους, κάτι που οδηγεί στο σχηματισμό και την ανάπτυξη των κρυστάλλων. Κάποιος μπορεί να αναρωτηθεί για ποιο λόγο τα πρωτεϊνικά μόρια τακτοποιούνται με περιοδικό τρόπο σε κρυσταλλικά πλέγματα ενώ θα μπορούσαν κάλλιστα να σχηματίσουν τυχαία άτακτα σύνολα (ιζήματα). Αυτό συμβαίνει για τον ίδιο λόγο για τον οποίο τα διαλυτά μόρια αφήνουν τη διαλυτή φάση εξ αρχής και αυτός είναι για να σχηματίσουν το μεγαλύτερο αριθμό των πιο σταθερών δεσμών για να ελαχιστοποιήσουν την ελεύθερη ενέργεια (ή ενθαλπία) του συστήματος. Ενώ τα ιζήματα αντιπροσωπεύουν μια στερεή κατάσταση χαμηλής ενέργειας σε ισορροπία με μια διαλυτή φάση, οι κρύσταλλοι είναι αυτοί οι οποίοι αντιπροσωπεύουν τη χαμηλότερη ελεύθερη ενέργεια (εικόνα 26). [6] Εικόνα 26: Η ενέργεια του συστήματος προς κρυστάλλωση σε συνάρτηση με το χρόνο και η πορεία δημιουργίας των κρυστάλλων (πηγή: courses/biophysics/crystallization/crystallization.htm). 40

42 Μέθοδοι κρυστάλλωσης Υπάρχουν πολλές μέθοδοι για την κρυστάλλωση των βιολογικών μακρομορίων (τουλάχιστον επτά πρακτικές μέθοδοι) και όλες έχουν ως στόχο να φέρουν τα διαλύματα σε κατάσταση υπερκορεσμού. Αυτές που χρησιμοποιούνται στις περισσότερες περιπτώσεις είναι η κρυστάλλωση μέσω διάχυσης υδρατμών (vapor diffusion), η κρυστάλλωση με διάλυση (dialysis) και η μέθοδος batch (batch crystallization). Κρυστάλλωση μέσω διάχυσης υδρατμών Σε αυτή τη μέθοδο, μια σταγόνα που περιέχει υπόκορο διάλυμα πρωτεΐνης, ρυθμιστικού και του παράγοντα ιζηματοποίησης (precipitant), εκτίθεται σε ένα δοχείο το οποίο περιέχει παρόμοια ρυθμιστικά και παράγοντα ιζηματοποίησης σε υψηλότερες συγκεντρώσεις (εικόνα 27). Η εξισορρόπηση μέσω εξάτμισης της σταγόνας και του περιεχομένου του δοχείου οδηγεί το διάλυμα της πρωτεΐνης να αγγίξει ένα επίπεδο υπερκορεσμού στο οποίο συμβαίνει πυρήνωση και μια αρχική ανάπτυξη κρυστάλλων. Μπορεί να διεξαχθεί ως hanging drop (στην οποία η σταγόνα με το διάλυμα της πρωτεΐνης αιωρείται πάνω από το περιεχόμενο του δοχείου) Εικόνα 27: Κρυστάλλωση με τη μέθοδο hanging drop της διάχυσης ατμών (πηγή: X-Ray Crystallography of Biomacromolecules, 2007). Επίσης, μπορεί να πραγματοποιηθεί και ως sitting drop, κατά την οποία η σταγόνα με το διάλυμα της πρωτεΐνης βρίσκεται σε ένα κράσπεδο υπερυψωμένο σε σχέση με την επιφάνεια των διαλυμάτων του δοχείου (εικόνα 28). [4] 41

43 Εικόνα 28: Sitting drop μέθοδος (πηγή: Κρυστάλλωση με διάλυση Στην κρυστάλλωση με τη μέθοδο της διάλυσης, η συγκέντρωση των μακρομορίων παραμένει σταθερή γιατί επιβάλλεται στα μόρια να παραμείνουν μέσα σε ένα καθορισμένο όγκο. Η σύσταση του διαλύματος αλλάζει με τη διάχυση των χαμηλού μοριακού βάρους συστατικών μέσω μιας ημιπερατής μεμβράνης (εικόνα 29). [4] Εικόνα 29: Κρυστάλλωση με τη μέθοδο της διάλυσης (πηγή: X-Ray Crystallography of Biomacromolecules, 2007). Κρυστάλλωση με τη μέθοδο batch Είναι απλή και ιδανική όταν χρειάζονται μεγάλες ποσότητες πρωτεϊνικών κρυστάλλων, όπως για παράδειγμα στην περίπτωση της περίθλασης ακτίνων Χ από πολυκρυσταλλικά υλικά (powder diffraction). [26] 42

44 Εικόνα 30: Κρυστάλλωση batch (πηγή: X-Ray Crystallography of Biomacromolecules, 2007). Στη μέθοδο κρυστάλλωσης batch όλα τα συστατικά αναμιγνύονται στις τελικές τους συγκεντρώσεις κατά την έναρξη του πειράματος σε ένα κλειστό δοχείο (π.χ. eppendorf) κι έτσι επιτυγχάνεται άμεσα ο υπερκορεσμός (εικόνα 30). Συνήθως σε αυτά τα πειράματα είναι υψηλότερη η συγκέντρωση του precipitant (του διαλύματος-παράγοντα με βασικό ρόλο τη μείωση της διαλυτότητας της πρωτεΐνης), αλλά επίσης μερικές φορές η συγκέντρωση της πρωτεΐνης. Εξαιτίας των υψηλότερων συγκεντρώσεων η κρυστάλλωση συχνά γίνεται μέσα σε μία νύχτα, αλλά αυτό δεν λειτουργεί για όλες τις πρωτεΐνες καθώς κάποιες σε καταστάσεις πίεσης όπως αυτή δίνουν κρυστάλλους ακατάλληλους για την περίθλαση ακτίνων Χ. Η μέθοδος batch μεταβάλλει τη διαλυτότητα της πρωτεΐνης και αλλάζει τις διηλεκτρικές ιδιότητες του μέσου με αποτέλεσμα να δημιουργείται ένα υπέρκορο περιβάλλον κατάλληλο για την ανάπτυξη κρυστάλλων. Στην περίπτωση που η πρωτεΐνη δε βρίσκεται σε κατάσταση υπερκορεσμού και αναμιγνύεται με τον παράγοντα ιζηματοποίησης, ο ρόλος αυτού είναι να μειώνει τη διαλυτότητά της αλληλεπιδρώντας και συλλαμβάνοντας μόρια νερού ώστε τελικά η πρωτεΐνη να μπορέσει να σχηματίσει τους κρυστάλλους. [4] Στην κρυστάλλωση με τη μέθοδο batch, μπορούν να θεωρηθούν πιθανές τρεις περιπτώσεις όπως φαίνεται στο διάγραμμα της εικόνας 31. Αν η συγκέντρωση της πρωτεΐνης είναι τέτοια ώστε το διάλυμα είναι υπόκορο (σημείο Α) τότε δεν πρόκειται να συμβεί κρυστάλλωση, εκτός κι αν αλλάξει κάποια άλλη παράμετρος όπως η θερμοκρασία. Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης μπορεί να ανήκει στην υπέρκορη περιοχή ανάμεσα στις καμπύλες διαλυτότητας και ιζηματοποίησης (σημείο 43

45 Β). Σε αυτή την περίπτωση το βέλος περιγράφει τη διακύμανση της απομένουσας συγκέντρωσης της πρωτεΐνης στο διάλυμα. Στην τελευταία περίπτωση (σημείο C), η πρωτεΐνη καθιζάνει αμέσως γιατί ο υπερκορεσμός είναι πολύ υψηλός. [7] Εικόνα 31: Σχηματικό διάγραμμα τη διαλυτότητας και της σχέσης ανάμεσα στη συγκέντρωση της πρωτεΐνης και του παράγοντα καθίζησης στη μέθοδο κρυστάλλωσης batch (πηγή: Arnaud Ducruix, Richard Giege, "Crystallization of Nucleic Acids and Proteins A Practical Approach", Second Edition). Γιατί χρησιμοποιούνται κρύσταλλοι Οι κρύσταλλοι χρησιμοποιούνται γιατί από τη στιγμή που αποτελούνται από ένα μεγάλο αριθμό μορίων διευθετημένων κανονικά, σκεδάζουν ισχυρά τις ακτίνες Χ. Η κρυσταλλική κατάσταση είναι η φυσική κατάσταση των στερεών. Τα βιολογικά μακρομόρια (όπως είναι οι πρωτεΐνες), έχουν πολύπλοκα σχήματα ώστε να μη μπορούν να πακεταριστούν καλά, αλλά είναι δυνατόν να σχηματίσουν καλούς κρυστάλλους με την προϋπόθεση ένα υγρό να συμπληρώσει τα κενά μεταξύ τους. [2] Δυσκολίες στην κρυστάλλωση των πρωτεϊνών Η κρυστάλλωση των πρωτεϊνών παρουσιάζει δυσκολίες για διάφορους λόγους. Πρώτα απ όλα έχουν μεγάλο μοριακό βάρος με αποτέλεσμα να μην είναι τόσο συμμετρικές και να μην κάνουν τόσες πολλές επαφές μέσα στο κρυσταλλικό πλέγμα. Οι κρύσταλλοι είναι μαλακοί και ευαίσθητοι σε μικρές αλλαγές των 44

46 εξωτερικών συνθηκών καθώς το περιεχόμενό τους σε διαλύτη αγγίζει το 50%. Αυτό το αποκαλούμενο μητρικό διάλυμα είναι απαραίτητο τόσο για να γεμίζει τα κενά ανάμεσα στα μόρια, όσο και για να προστατεύει τον κρύσταλλο από την επαναδιάλυσή του. [20] ΑΚΤΙΝΕΣ Χ Η περιοχή του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος που βρίσκεται μεταξύ υπεριώδους ακτινοβολίας και ακτινοβολίας γ ονομάζεται περιοχή ακτίνων Χ. Οι ακτίνες Χ ανήκουν στις ιονίζουσες ακτινοβολίες, αφού η ενέργειά τους είναι ικανή να προκαλέσει τον ιονισμό ατόμων και μορίων (εικόνα 32). Εικόνα 32: Το ηλεκτρομαγνητικό φάσμα. Διακρίνεται μεταξύ άλλων και η περιοχή των ακτίνων Χ με μήκος κύματος m (πηγή: ). Ακτίνες Χ με μήκη κύματος μεταξύ 0,1-100 Å περίπου (1Å = m ), παράγονται όταν ηλεκτρόνια υψηλής ενέργειας προσκρούουν στην επιφάνεια ενός 45

47 μετάλλου (στόχου) με μεγάλο ατομικό αριθμό. Τα ηλεκτρόνια αυτά διεγείρουν τα ηλεκτρόνια των εσωτερικών στιβάδων του μετάλλου προκαλώντας την απόσπασή τους. Το κενό αυτό στην εσωτερική στιβάδα του ατόμου καλύπτεται από ηλεκτρόνια εξωτερικών υψηλότερων ενεργειακά στιβάδων. Η επιπλέον ενέργεια, δηλαδή η ενεργειακή διαφορά των δύο στιβάδων ελευθερώνεται με την εκπομπή φωτονίων ακτίνων Χ. Το μήκος κύματος της εκπεμπόμενης ακτινοβολίας εξαρτάται από την ενέργεια των ηλεκτρονίων. Η κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ, χρησιμοποιεί ακτίνες Χ μήκους κύματος της τάξης του 1Å. Οι ακτίνες Χ ανακαλύφθηκαν το 1895 από τον Wilhelm Roentgen στο Πανεπιστήμιο του Wurzburg στη Γερμανία. Παρατήρησε πως μερικοί κρύσταλλοι του συμπλόκου Βαρίου με κυανιούχο λευκόχρυσο που βρισκόταν δίπλα σε ένα σωλήνα εκκένωσης, καλυμμένοι με μαύρο χαρτί άρχισαν να φθορίζουν όταν δημιουργήθηκε εκκένωση. Εξετάζοντας τις σκιές που δημιουργήθηκαν από τις ακτίνες, ο Roentgen εντόπισε την προέλευση των ακτίνων στα τοιχώματα του σωλήνα εκκένωσης. Η ονομασία ακτίνες Χ (άγνωστες) δόθηκε από την ερευνητική ομάδα του Roentgen καθώς αυτές είχαν ξεκάθαρες ομοιότητες με το φως αλλά δεν είχαν καμία παρόμοια ιδιότητα με αυτές της θεμελιωμένης κυματικής οπτικής, δηλαδή πόλωση, περίθλαση, ανάκλαση και διάθλαση. Για τη σημαντική αυτή ανακάλυψη, ο Roentgen τιμήθηκε με το πρώτο βραβείο Nobel Φυσικής το [2] [IV] ΣΥΓΧΡΟΤΡΟΝ Η ακτινοβολία σύγχροτρον (synchrotron) είναι ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία (φως) που εκπέμπεται από φορτισμένα σωματίδια (ηλεκτρόνια ή ποζιτρόνια) καθώς αυτά επιταχύνονται κινούμενα κατά μήκος καμπύλης τροχιάς με μεγάλη καμπυλότητα. Η όλη επιταχυντική φάση διαρκεί περίπου 1 δευτερόλεπτο, στο τέλος του οποίου εξέρχεται από το δακτύλιο μια ριπή ταχέων σωματιδίων. Αποκτούν πολύ υψηλότερες ενέργειες από εκείνες που αποκτούν σε άλλους επιταχυντές και κυμαίνονται από εκατοντάδες MeV (= ev) μέχρι αρκετές δεκάδες GeV (=10 9 ev). 46

48 Εικόνα 33: Το σύγχροτρον στη Grenoble της Γαλλίας (πηγή: Η θεωρητική μελέτη του φαινομένου της εκπομπής ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας από επιταχυνόμενα ηλεκτρόνια ξεκίνησε γύρω στο 1945, με την πρώτη παρατήρηση εκπομπής ακτινοβολίας σύγχροτρον να γίνεται το 1946 στα εργαστήρια της General Electric σε μια διάταξη ενέργειας 70 MeV. Είκοσι χρόνια αργότερα τέθηκε σε λειτουργία στο Πανεπιστήμιο του Wisconsic-Madison ο Tantalus, ο πρώτος δακτύλιος αποθήκευσης ηλεκτρονίων ενέργειας 240 MeV. Αυτή η διάταξη χαρακτηρίζεται ως δεύτερης γενιάς καθώς σε τέτοιες διατάξεις, ταχέως κινούμενα ηλεκτρόνια που έχουν προεπιταχυνθεί σε μια πηγή synchrotron (εικόνα 33) αποθηκεύονται και κινούνται σε κυκλικές τροχιές για αρκετές ώρες σε ένα δακτύλιο αποθήκευσης. Στα μέσα της δεκαετίας του 1990 προέκυψαν οι πηγές synchrotron τρίτης γενιάς, καθώς έγινε η εισαγωγή νέων παρεμβαλλόμενων διατάξεων οι οποίες βελτιστοποιούσαν τα χαρακτηριστικά της ακτινοβολίας. Συγκεκριμένα, τα ηλεκτρόνια επιταχύνονται σε σχετικιστικές ταχύτητες (πολύ κοντά στην ταχύτητα του φωτός) από ένα γραμμικό επιταχυντή (LINAC) (εικόνα 34). Εικόνα 34: Σχηματική αναπαράσταση μιας εγκατάστασης Synchrotron (πηγή: g-the-uks-largest-particle-accelerator/). 47

49 Κατόπιν επιταχύνονται μέχρι να φτάσουν αρκετά υψηλή ενέργεια σε έναν άλλο επιταχυντή (booster). Όταν επιτευχθεί η επιθυμητή ενέργεια (6 GeV στο ESRF), τα ηλεκτρόνια εισάγονται στον αποθηκευτικό δακτύλιο όπου κάτω από συνθήκες κενού θα ακολουθήσουν μια κλειστή τροχιά. [13] [V] [VI] Μέρη από τα οποία αποτελείται μια εγκατάσταση σύγχροτρον Ένα σύγχροτρον αποτελείται από τα εξής κύρια μέρη: από έναν αερόκενο δακτυλιοειδή θάλαμο, το δακτύλιο, μέσα στον οποίο κινούνται τα σωματίδια. Η ακτίνα καμπυλότητάς του μπορεί να μεταβάλλεται, όσο μεγαλύτερη είναι η ακτίνα τόσο μεγαλύτερη ταχύτητα μπορούν να αποκτήσουν τα σωματίδια. Εξαιτίας των διαστάσεών του, δεν είναι ποτέ τελείως αερόκενος. Για τη διατήρηση του κενού υπάρχει ένα προσαρμοσμένο σε αυτόν τον δακτύλιο σύστημα αγωγών το οποίο λειτουργεί συνέχεια. Γύρω από το δακτύλιο είναι τοποθετημένος ο μαγνήτης (ηλεκτρομαγνήτης) ο οποίος παράγει ένα κάθετο μαγνητικό πεδίο ως προς το επίπεδο του δακτυλίου και με ένταση τέτοια ώστε να διατηρούνται τα σωματίδια σε μια κυκλική τροχιά. από ηλεκτρομαγνήτες οι οποίοι προκαλούν την καμπύλωση της τροχιάς των σωματιδίων. από κοιλότητες που ονομάζονται αντηχεία και οι οποίες παράγουν ηλεκτρικά πεδία για την επιτάχυνση των σωματιδίων και από ένα βοηθητικό επιταχυντή ο οποίος εισάγει στο δακτυλιοειδή θάλαμο τα σωματίδια με πολύ υψηλές αρχικές ταχύτητες. Όταν μικρής μάζας σωματίδια, όπως τα ηλεκτρόνια, επιταχύνονται χάνουν πολύ περισσότερη ενέργεια σε ακτινοβολία σύγχροτρον απ ότι χάνουν τα βαριά σωματίδια (αυτό οφείλεται στο ότι ο ρυθμός εκπομπής ακτινοβολίας είναι αντιστρόφως ανάλογος της τέταρτης δύναμης της μάζας του σωματιδίου). Για το λόγο αυτό και χρησιμοποιούνται ηλεκτρόνια και όχι πρωτόνια για τη συλλογή της ενέργειας από ακτινοβολία σύγχροτρον. Τα ηλεκτρόνια ταξιδεύουν σε κύκλους ή ελίσσονται ανάμεσα σε μαγνήτες που ονομάζονται εκτροπείς ή κυματοειδείς μαγνήτες και εκπέμπουν εξαιρετικά έντονο φως σε κατεύθυνση εφαπτομενική με την τροχιά τους. 48

50 Αρχικά, η ακτινοβολία από σύγχροτρον ήταν περιορισμένη στις περιοχές του ορατού και πλησίον του ορατού φάσματος ακτινοβολίας. Η φασματική περιοχή διευρυνόταν σταδιακά και σήμερα απλώνεται από την υπέρυθρη μέχρι την ακτινοβολία γ για τους μεγαλύτερους δακτυλίους, με τη μεγαλύτερη συγκέντρωση φωτονίων στην περιοχή των ακτίνων Χ. Η πρόσβαση στις ακτίνες Χ υπήρξε ουσιαστικής σημασίας, καθώς το μήκος κύματος των ακτίνων Χ (0,01-10 nm) είναι συγκρίσιμο με τις διατομικές αποστάσεις κι έτσι είναι δυνατή η περίθλαση των ακτίνων Χ από δείγματα κρυστάλλων με αποτέλεσμα οι δομές τους να μπορούν να αναλυθούν στην ατομική κλίμακα. Οι ακτίνες Χ υψηλής ενέργειας που παράγονται από το σύγχροτρον μπορούν να χτυπήσουν και να «ανατινάξουν» τα ηλεκτρόνια στις εσωτερικές στιβάδες των ατόμων. Έτσι, τα εξωτερικά ηλεκτρόνια έρχονται να καλύψουν τα κενά που δημιουργήθηκαν και η διαδικασία αυτή έχει ως αποτέλεσμα την εκπομπή ακτινοβολίας η οποία με τη σειρά της αξιοποιείται για να εντοπιστεί το άτομο από το οποίο προήλθε. Στο τέλος της δέσμης βρίσκεται ο ανιχνευτής και τα ηλεκτρονικά συστήματα για τη λήψη της πληροφορίας (εικόνα 35) τα οποία πρέπει να καταγράψουν μεγάλες ποσότητες δεδομένων σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα. Εικόνα 35: Σχεδιάγραμμα από μία εγκατάσταση σύγχροτρον στο οποίο διακρίνονται οι δέσμες που εκτρέπονται από την πορεία τους και τα εργαστήρια με τον κατάλληλο εξοπλισμό τα οποία είναι χτισμένα στην πορεία των εκτρεπόμενων δεσμών (πηγή: 49

51 Ανάμεσα στα πολλά πεδία έρευνας που χρησιμοποιούν την ακτινοβολία σύγχροτρον, το καλύτερο παράδειγμα είναι η κρυσταλλογραφία πρωτεϊνών. Παράλληλα με τις γενομικές επιστήμες (μελέτη του γονιδιώματος) αναπτύσσεται και η πρωτεομική (μελέτη των πρωτεϊνών ενός ζωντανού οργανισμού). Η μελέτη των πρωτεϊνών ωστόσο είναι πιο πολύπλοκη και αυτό οφείλεται στο γεγονός πως η αλληλουχία των αμινοξέων δεν είναι αυτή που καθορίζει απαραίτητα και τις λειτουργίες της πρωτεΐνης, αλλά ο τρόπος αναδίπλωσής της στο χώρο δηλαδή η τρισδιάστατη δομή της. Στην πρωτεϊνική κρυσταλλογραφία, η ακτινοβολία σύγχροτρον παρουσιάζει αρκετά πλεονεκτήματα συγκρινόμενη με τις συμβατικές ακτίνες Χ και επιτρέπει τη μελέτη μικροσκοπικών κρυστάλλων. Επίσης, μπορούν να αναλυθούν μεγάλα πολύπλοκα συστήματα που αφορούν το DNA και το RNA μαζί με πρωτεΐνες (όπως για παράδειγμα ιοί και ριβοσώματα). Εάν κάποιος επιτύχει την κρυστάλλωση μιας μονάδας που είναι φτιαγμένη από μία πρωτεΐνη ιού και του αντισώματός της μπορεί ακόμη να μάθει πολλά για το σχήμα της θέσης ένωσής τους συμβάλλοντας έτσι στην ανακάλυψη και σύνθεση νέων φαρμάκων με τέλεια στόχευση στο συγκεκριμένο μικρόβιο άρα και με καλύτερα αποτελέσματα. [VI] [VII] Πλεονεκτήματα της ακτινοβολίας σύγχροτρον Γενικά τα κύρια χαρακτηριστικά και πλεονεκτήματα της ακτινοβολίας σύγχροτρον είναι τα παρακάτω: Έχει συνεχές φάσμα καλύπτοντας μια ευρεία περιοχή ενεργειών από τα υπέρυθρο ως τις ακτίνες Χ. Έχει υψηλή ένταση. Είναι παράλληλη δέσμη φωτός. [V] Πηγές ακτινοβολίας σύγχροτρον Στον αποθηκευτικό δακτύλιο τα ηλεκτρόνια θα κινούνται είτε σε ευθεία τροχιά είτε θα κάμπτουν την πορεία τους με τη βοήθεια μαγνητών. Ενώ αυτοί οι μαγνήτες εκλύουν χρησιμοποιήσιμο φως, το πιο έντονο φως αποκτάται από συσκευές (ID) οι οποίες παρεμβάλλονται στα ευθεία τμήματα. Αυτές οι συσκευές 50

52 χρησιμοποιούν ειδικούς μαγνήτες οι οποίοι παράγουν ένα ημιτονοειδές μαγνητικό πεδίο στο οποίο τα ηλεκτρόνια θα αποκτήσουν μια ημιτονοειδή τροχιά. Η οπτική της εκάστοτε δέσμης προσαρμόζεται στον τύπο των πειραμάτων που διεξάγονται. Για την περίθλαση ακτίνων Χ από πολυκρυσταλλικά υλικά, το σημαντικό στοιχείο είναι πως σε εγκαταστάσεις σύγχροτρον αποκτάται υψηλότερη γωνιακή ανάλυση σε σχέση με ένα συμβατικό σωλήνα παραγωγής ακτίνων Χ. Κάθε δέσμη έχει τα δικά της χαρακτηριστικά και για τη διεξαγωγή των συγκεκριμένων πειραμάτων χρησιμοποιήθηκε η ID31. [13] ID31 To ID31 είναι ένα σύστημα υψηλής ευκρίνειας του ESRF για περίθλαση ακτίνων Χ από πολυκρυσταλλικά υλικά. Οι κύριες ικανότητες του ID31 για περίθλαση ακτίνων Χ από πολυκρυσταλλικά υλικά πρωτεϊνών προέρχονται από τη δυνατότητά του να καταγράφει πρότυπα περίθλασης πολύ υψηλής γωνιακής ανάλυσης. Αυτό οδηγεί στην ικανότητα να διαχωρίζονται πολύ κοντινές αλλά όχι και απόλυτα επικαλυπτόμενες ανακλάσεις. Αυτό θα επιτρέψει υψηλή ανάλυση του αντιστρόφου πλέγματος, κάτι που είναι πολύ σημαντικό για την περίθλαση πολυκρυσταλλικών υλικών παρά για την περίθλαση σε μονοκρύσταλλο. Αυτή η μέθοδος απαιτεί μια μεγάλη δέσμη ικανή να χτυπάει ένα μεγάλο όγκο του δείγματος. Για το λόγο αυτό η οπτική του ID31 διατηρείται απλή, χωρίς οπτικές εστίασης. Οι ακτίνες Χ που παράγονται από κυματοειδείς μαγνήτες, καλύπτουν ένα ενεργειακό εύρος από 6 kev έως 60 kev. Η ακρίβεια του περιθλασίμετρου είναι σημαντική και γι αυτό το ID31 αποτελείται από δύο βαρέως τύπου τράπεζες που περιστρέφονται. Αυτός ο μηχανισμός είναι σταθερός, ακριβής και αξιόπιστος. Για την απόκτηση δεδομένων υψηλής ευκρίνειας από πολυκρυσταλλικά υλικά, η δέσμη χρησιμοποιεί εννέα ανιχνευτές. Πριν από κάθε ανιχνευτή υπάρχει ένας κρυσταλλικός αναλυτής πυριτίου (Si). Οι ανιχνευτές χωρίζονται μεταξύ τους και μετρούν εκ παραλλήλου την περιθλούσα ακτινοβολία σαν μια ολοκληρωμένη μονάδα. Όλες οι σαρώσεις του ανιχνευτή καταγράφονται ανεξάρτητα και αθροίζονται όλες μαζί στο τέλος κάθε μέτρησης εφόσον τα δεδομένα συμφωνούν απόλυτα μεταξύ τους. Αυτή η τεχνολογία μας επιτρέπει συλλογή καλής ποιότητας δεδομένων στην μικρότερη δυνατή χρονική διάρκεια έκθεσης του δείγματος στην ακτινοβολία. Το 51

53 τελευταίο είναι ένα ιδιαίτερα κρίσιμο σημείο ειδικά για βιολογικά/οργανικά δείγματα τα οποία έχουν πολύ μικρό χρόνο ζωής υπό την επίδραση της ισχυρής ακτινοβολίας σύγχροτρον. Το κύριο πλεονέκτημα του ID31 είναι η υψηλή ποιότητα των δεδομένων περίθλασης που απαιτείται για την επίλυση μιας δομής. Το κύριο μειονέκτημα είναι η υψηλή απαιτούμενη ποσότητα του δείγματος για την απόκτηση ενός περιθλασιγράμματος. Γι αυτό το λόγο, στα περισσότερα προγράμματα για πρωτεΐνες οι άλλες δέσμες χρησιμοποιούν ανιχνευτές δύο διαστάσεων οι οποίοι απαιτούν λιγότερο δείγμα και η απόκτηση των δεδομένων είναι πιο γρήγορη[13]. Παρ όλα αυτά, με τα σημερινά συστήματα δισδιάστατων ανιχνευτών η ποιότητα των δεδομένων είναι σημαντικά μειωμένη και σε πολλές περιπτώσεις ο πλήρης προσδιορισμός της δομής μιας πρωτεΐνης δεν είναι δυνατός. Συνεπώς η χρήση οργάνων υψηλής ευκρίνειας, όπως το ID31, παραμένει αδιαμφισβήτητα απαραίτητη. Εικόνα 36: Εικόνες του ID31. Επάνω αριστερά τα δύο κυκλικά περιθλασίμετρα, επάνω δεξιά με πορτοκαλί χρώμα είναι το ρομπότ που αλλάζει τα δείγματα και με κίτρινο είναι το τραπέζι διεξαγωγής των πειραμάτων. Κάτω είναι ο βραχίονας ανιχνευτής (πηγή: Etudes de diffraction de poudres de protéines, Yves Watier). 52

54 Εικόνα 37: Σχηματική αναπαράσταση του πολυαναλυτή εννέα καναλιών (πηγή: Etudes de diffraction de poudres de protéines, Yves Watier). ΠΕΡΙΘΛΑΣΗ ΑΚΤΙΝΩΝ Χ Περίθλαση είναι το φαινόμενο κατά το οποίο ακτινοβολία συγκεκριμένου μήκους κύματος εκτρέπεται από την ευθεία πορεία της όταν διαπεράσει αντικείμενα με περιοδικότητες συγκρίσιμες με το μήκος κύματός της. Όταν δέσμη ακτίνων Χ πέσει επάνω σε έναν κρύσταλλο διεγείρει τα άτομα αυτού προς εκπομπή σύμφωνης ακτινοβολίας προς όλες τις κατευθύνσεις. Τα κύματα που εκπέμπονται συμβάλλουν μεταξύ τους ενισχυτικά μόνο προς ορισμένες διευθύνσεις. Το φαινόμενο αυτό καλείται περίθλαση ακτίνων Χ από κρύσταλλο και ανάγεται στο πρόβλημα της αλληλεπίδρασης ακτίνων Χ και ύλης. Περίθλαση μιας ακτινοβολίας συμβαίνει όταν αυτή προσπέσει για παράδειγμα σε ένα φράγμα περίθλασης, ένα αντικείμενο με κανονικές εναλλαγές διαφανών και αδιαφανών λωρίδων. Σε αυτή την περίπτωση το διάγραμμα περίθλασης δημιουργείται από φως που διέρχεται μέσα από το φράγμα (εικόνα 38). Λόγω της κυματικής φύσης του φωτός, σύμφωνες δέσμες φθάνοντας στο ίδιο σημείο ακολουθώντας δύο ή περισσότερους δρόμους, συμβάλλουν. Συμβάλλουν δημιουργικά (ενισχυτική συμβολή) μόνο αν οι δρόμοι είναι ίσοι ή διαφέρουν ένα ακέραιο αριθμό μηκών κύματος λ. Εικόνα 38: Σχηματισμός διαγράμματος περίθλασης από φράγμα περίθλασης (πηγή: Θέματα Μοριακής Βιοφυσικής, Σταύρος Χαμόδρακας, Εκδόσεις ΣΥΜΜΕΤΡΙΑ 1993). 53

55 Αν μια δέσμη παράλληλων ακτίνων πέσει κάθετα σε ένα φράγμα περίθλασης με σταθερά d και οι διερχόμενες ακτίνες εστιασθούν με τη βοήθεια ενός φακού σε ένα πέτασμα, ένα διάγραμμα φωτεινών γραμμών δημιουργείται σε γωνίες θ που δίνονται από τη σχέση 2dsinθ=nλ, όπου το n παίρνει ακέραιες τιμές. Αφού το ημίτονο μιας γωνίας είναι πάντα μικρότερο ή ίσο του 1, τότε το γινόμενο nλ είναι πάντα μικρότερο του d. Οι ακτίνες Χ έχουν μήκη κύματος που κυμαίνονται συνήθως μεταξύ 0,1-10 Å και δεν είναι εφικτό να κατασκευαστεί μηχανικό φράγμα για την περίθλαση. Ο Laue το 1912 πρότεινε ότι μια σειρά ατόμων ενός κρυστάλλου θα μπορούσε να παίξει το ρόλο φράγματος περίθλασης για ακτίνες Χ. Πειράματα που πραγματοποιήθηκαν, απέδειξαν την ορθότητα της ιδέας αυτής. Γνωρίζοντας το d, μπορεί να υπολογιστεί το λ και ο κρύσταλλος να χρησιμοποιηθεί σαν φράγμα περίθλασης. [1] [2] [IV] Νόμος του Bragg Ας θεωρήσουμε ομάδα παράλληλων κρυσταλλικών επιπέδων με ίδιο περιεχόμενο ατόμων και πρόσπτωση δέσμης παράλληλων ομοφασικών ακτίνων Χ υπό γωνία θ (η γωνία που σχηματίζεται μεταξύ του επιπέδου και της δέσμης). Τα περιθλώμενα κύματα κατά τη διεύθυνση της διάδοσης έχουν επίσης την ίδια φάση (εικόνα 39). Το φαινόμενο είναι ανάλογο της ανάκλασης του ορατού φωτός κατά το οποίο η γωνία πρόσπτωσης είναι ίση με τη γωνία ανάκλασης. Εικόνα 39: Ο νόμος του Bragg. Απεικονίζονται με σειρά από αριστερά προς δεξιά, η ενισχυτική συμβολή των περιθλώμενων ακτίνων, η καταστρεπτική συμβολή και διαγραμματικά πως προκύπτει η εξίσωση Bragg (πηγή: και 54

56 Όπως φαίνεται στην εικόνα 39, το μέρος της δέσμης που περιθλάται από το δεύτερο επίπεδο διανύει μεγαλύτερη διαδρομή από εκείνη του πρώτου. Αν η διαφορά του δρόμου FB +B H = 2FB = 2dsinθ είναι ακέραιο πολλαπλάσιο του μήκους κύματος (nλ) τότε όλα τα περιθλώμενα κύματα αφού έχουν την ίδια φάση στο μέτωπο διάδοσης, συμβάλλουν ενισχυτικά. Έτσι προκύπτει η συνθήκη συμβολής των κυμάτων γνωστή και ως εξίσωση Bragg: nλ = 2dsinθ όπου: λ: μήκος κύματος, n: ακέραιος αριθμός, d: η απόσταση των παράλληλων επιπέδων, θ: γωνία πρόσπτωσης (ή γωνία περίθλασης) Για άλλες γωνίες, τα κύματα τα οποία προκύπτουν από διαδοχικά επίπεδα είναι εκτός φάσης κι έτσι συμβάλλουν καταστρεπτικά και δεν προκύπτει περιθλούσα ακτίνα με αυτή τη γωνία. Η εξίσωση Bragg βασικότατη στη μελέτη των κρυσταλλικών σωμάτων εκφράζει τη συνθήκη που πρέπει να ικανοποιείται για να προκύψει ανάκλαση. Είναι σημαντικό να σημειωθεί πως η γωνία περίθλασης θ είναι αντιστρόφως ανάλογη της μεταξύ των επιπέδων απόστασης d. Αυτό σημαίνει ότι μεγάλες μοναδιαίες κυψελίδες με μεγάλες αποστάσεις d δίνουν μικρές γωνίες περίθλασης και ως εκ τούτου παράγονται πολλές μετρήσιμες ανακλάσεις. Σε αντίθεση με αυτές, οι μικρές μοναδιαίες κυψελίδες δίνουν μεγάλες γωνίες περίθλασης παράγοντας λιγότερες μετρήσιμες ανακλάσεις. Όπως φαίνεται στην παραπάνω εικόνα, για γωνία πρόσπτωσης θ η διεύθυνση της ανακλώμενης σχηματίζει πάντα γωνία 2θ με τη διεύθυνση της προσπίπτουσας δέσμης. Αυτό σημαίνει ότι η ανακλώμενη δέσμη μπορεί να ανιχνευτεί σε θέση που αποκλίνει από την προσπίπτουσα κατά γωνία 2θ. [1] Η σφαίρα του Ewald Ο Ewald πρότεινε τη χρήση μιας απλής γεωμετρικής κατασκευής που βοηθά στην κατανόηση των επιπέδων Bragg τα οποία είναι στο σωστό προσανατολισμό ώστε να υποστούν περίθλαση (εικόνα 40). 55

57 Εικόνα 40: Η σφαίρα του Ewald. Σχεδιάζουμε μια σφαίρα με κέντρο Ο στο οποίο βρίσκεται ο κρύσταλλος και ακτίνα 1/λ. Τόσο η εισερχόμενη δέσμη ακτίνων Χ όσο και η περιθλούσα, βρίσκονται σε γωνία θ σε σχέση με ένα σύνολο επιπέδων Bragg του κρυστάλλου. Το σημείο εκείνο στο οποίο η ευθύγραμμη εισερχόμενη ακτίνα συναντά τη σφαίρα ανάκλασης ορίζεται ως η αρχή του αντιστρόφου πλέγματος. Η διαφορά ανάμεσα στην ευθεία πορεία της εισερχόμενης δέσμης και της περιθλούσας είναι κάθετη στο σύνολο επιπέδων Bragg. Στα δύο μικρά τρίγωνα που σχηματίζονται οι πλευρές που αντιστοιχούν στα δύο μισά της διαφοράς είναι ίσες με sinθ/λ που από το νόμο του Bragg (2dsinθ=λ) ισούται με 1/2d, άρα η διαφορά είναι ίση με 1/d. Για να παρατηρηθεί επομένως μια οποιαδήποτε ανάκλαση πειραματικά, ο κρύσταλλος θα πρέπει να περιστρέφεται κατά τέτοιο τρόπο ώστε το αντίστοιχο σημείο hkl του αντιστρόφου πλέγματος να πέσει επάνω στη σφαίρα ανάκλασης. Κάθε σημείο της σφαίρας του Ewald επαληθεύει την εξίσωση Bragg. [1] [2] [22] ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΚΡΥΣΤΑΛΛΟΓΡΑΦΙΑΣ Κρυσταλλογραφικό πλέγμα και θεμελιώδης κυψελίδα Όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως, οι κρύσταλλοι αποτελούνται από τριπλή, κανονική, περιοδική διευθέτηση ατόμων ή μορίων σχηματίζοντας έτσι το κρυσταλλικό πλέγμα (εικόνα 41). Η έννοια του ευθέως πλέγματος αναφέρεται στην τρισδιάστατη, περιοδική επανάληψη επιπέδων με διάφορο προσανατολισμό τα οποία τεμνόμενα μεταξύ τους σχηματίζουν διάφορα παραλληλεπίπεδα. Το ελάχιστο 56

58 παραλληλεπίπεδο που επαναλαμβανόμενο κατά τις τρεις διαστάσεις του χώρου δίνει ολόκληρο τον κρύσταλλο ονομάζεται θεμελιώδης ή μοναδιαία κυψελίδα (unit cell). Εικόνα 41: Η θεμελιώδης ή μοναδιαία κυψελίδα του κρυσταλλικού πλέγματος (πηγή: Η στοιχειώδης κυψελίδα ορίζεται από τις πλευρές a,b,c και τις μεταξύ τους γωνίες α,β,γ. Η γωνία α σχηματίζεται μεταξύ των πλευρών b και c, η β μεταξύ των a και c και η γ μεταξύ των a και b. Οι σταθερές α,β,γ,a,b,c ονομάζονται πλεγματικές σταθερές ή παράμετροι της κυψελίδας (εικόνα 42). [1] [2] Εικόνα 42: Οι παράμετροι της μοναδιαίας κυψελίδας (πηγή: Εκτός από τη μοναδιαία κυψελίδα η οποία αποτελείται από δύο ή περισσότερα μόρια συνδεόμενα με κάποιο συμμετρικό είδος διευθέτησης, υπάρχει και η ασύμμετρη κυψελίδα. Αυτή χρησιμοποιείται για να περιγράψει το βασικό μοτίβο της περιοδικής επανάληψης. Δηλαδή, αποτελεί το μικρότερο αριθμό συντεταγμένων των ατόμων που δεν συνδέονται μεταξύ τους με τη συμμετρία για την περιγραφή ενός μορίου. Για παράδειγμα στην περίπτωση του μορίου της εξαμερούς 57

59 ινσουλίνης η ασύμμετρη κυψελίδα της αποτελείται από μία αλυσίδα α και μία αλυσίδα β (στην ουσία το μονομερές της ινσουλίνης). [22] Κρυσταλλογραφικά επίπεδα Το κρυσταλλογραφικό επίπεδο είναι μία γεωμετρική σύμβαση που χρησιμοποιείται για να περιγράψει το φαινόμενο της περίθλασης από τα κρυσταλλικά πλέγματα, καθώς οι αλγεβρικές εξισώσεις που διέπουν τη διαδικασία της περίθλασης είναι δύσκολο να απεικονιστούν. Είναι σημαντικό να θυμόμαστε ότι δεν υπάρχει στην πραγματικότητα κρυσταλλογραφικό επίπεδο σε ένα κρύσταλλο και πως όταν γίνεται αναφορά σε αυτό είτε στον ενικό είτε στον πληθυντικό, αυτή αφορά μια σειρά η οποία αποτελείται από έναν άπειρο αριθμό επιπέδων. Μια οικογένεια κρυσταλλογραφικών επιπέδων ορίζεται ως ένα σύνολο επιπέδων τα οποία τέμνουν όλα τα σημεία του πλέγματος. Όλα τα επίπεδα της ίδιας οικογένειας είναι απαραίτητα: 1) παράλληλα μεταξύ τους και 2) ισαπέχουν. Η απόσταση μεταξύ γειτονικών επιπέδων καλείται απόσταση d. Μια οικογένεια κρυσταλλογραφικών επιπέδων περιγράφεται πλήρως με τη χρήση τριών ακέραιων αριθμών που ονομάζονται δείκτες Miller. [10] Δείκτες Miller Εκτός από τις πλεγματικές σταθερές υπάρχουν και οι δείκτες h,k,l. Αυτοί ονομάζονται δείκτες Miller, είναι απλοί ακέραιοι αριθμοί κι περιγράφουν κάθε κρυσταλλικό επίπεδο. Μπορούν να οριστούν ως εξής: h = a/x k = b/y l = c/z Εικόνα 43: Ορισμός των δεικτών Miller (πηγή: Μέθοδοι Κρυσταλλοδομής, Αναγνώστης Χ. Στεργίου, Εκδόσεις ΖΗΤΗ). 58

60 Όπου x,y,z είναι οι συντεταγμένες του επιπέδου ABC (εικόνα 43) ως προς την αρχή. Είναι οι συντεταγμένες των σημείων τομής του επιπέδου με τους άξονες a,b και c του κρυστάλλου. Από τον ορισμό αυτό προκύπτει ότι οι δείκτες των επιπέδων των παραλλήλων προς τους άξονες b και c, c και a, a και b είναι αντίστοιχα (h00), (0k0), (00l), ενώ παραλλήλων προς τους άξονες a,b και c είναι (0kl), (h0l) και (hk0) αντίστοιχα. Όταν ορίζεται ένα επίπεδο, οι αριθμοί τοποθετούνται μέσα σε παρένθεση. Οι δείκτες Miller ορίζουν και διευθύνσεις οι οποίες ωστόσο τοποθετούνται ανάμεσα σε αγκύλες. [1] Αντίστροφο πλέγμα Ο νόμος του Bragg κάνει ξεκάθαρο ότι υπάρχει μια σταθερή σχέση ανάμεσα στο μοτίβο των ανακλάσεων Bragg που αποκτάται κατά τη διάρκεια της περίθλασης ακτίνων Χ και της απόστασης των ατόμων στο κρυσταλλικό πλέγμα. Αυτή η σχέση μπορεί να προσδιορισθεί καλύτερα με τη χρήση της ιδέας του αντιστρόφου πλέγματος. Αυτός είναι ένας πραγματικός χώρος ο οποίος σχετίζεται αντίστροφα με τα σημεία του μικροσκοπικού κρυσταλλικού πλέγματος. Η αντίστροφη σχέση σημαίνει ότι μακροσκοπικές μετρήσεις που γίνονται σε απόσταση cm από τον κρύσταλλο, μπορούν απευθείας να σχετισθούν με τις μικροσκοπικές αποστάσεις στο κρυσταλλικό πλέγμα. Μπορούμε να φανταστούμε έναν κρύσταλλο που προκαλεί περίθλαση, να δημιουργεί ένα τρισδιάστατο μακροσκοπικό πλέγμα γύρω του. Για την καταγραφή των περιθλώμενων ακτίνων Χ στην περίπτωση που έχουμε ένα μόνο κρύσταλλο, αυτός θα πρέπει να μετακινείται κατά τέτοιο τρόπο ώστε τα διάφορα σύνολα επιπέδων του κρυσταλλικού πλέγματος να σχηματίζουν κατάλληλες γωνίες με την προσπίπτουσα δέσμη με αποτέλεσμα να ισχύουν οι συνθήκες για περίθλαση. Στην περίπτωση της περίθλασης από πολυκρυσταλλικά υλικά (powder diffraction), οι κρύσταλλοι είναι προσανατολισμένοι προς διάφορες κατευθύνσεις κι έτσι δε χρειάζεται η μετακίνηση όπως στην περίπτωση μονοκρυστάλλου. Σε κάθε περίπτωση, οι ανακλώμενες ακτίνες μπορούν να καταγραφούν σε ανιχνευτές. Ένα πλήρες διάγραμμα περίθλασης μπορεί να θεωρηθεί ότι αποτελείται από μια τρισδιάστατη διευθέτηση κηλίδων που σχηματίζουν ένα κανονικό πλέγμα. Ένα τρισδιάστατο διάγραμμα περίθλασης είναι δύσκολο να αναπαρασταθεί, αλλά μπορούμε να φανταστούμε ότι αποτελείται από ένα σύνολο δισδιάστατων 59

61 διαγραμμάτων που το καθένα τους είναι μια τομή του τρισδιάστατου διαγράμματος (εικόνα 44). Εικόνα 44: Διαγραμματική απεικόνιση της περίθλασης ακτίνων Χ από ένα κρύσταλλο και των κηλίδων που σχηματίζονται στον ανιχνευτή (πηγή: 0d/Data/data.html ). Κάθε κηλίδα του διαγράμματος αντιστοιχεί σε μια τριπλέτα αριθμών h, k και l (παράμετροι Miller). Από τις αποστάσεις μεταξύ των κηλίδων μπορούν να υπολογιστούν οι σταθερές της μοναδιαίας κυψελίδας με τη χρήση μαθηματικών σχέσεων. Ως συνέπεια του νόμου του Bragg υπάρχει μια αντίστροφη σχέση μεταξύ της γωνίας θ και της απόστασης d. Όσο μεγαλύτερες είναι οι περιοδικότητες του κρυσταλλικού πλέγματος, τόσο πλησιέστερα είναι οι γειτονικές κηλίδες στο διάγραμμα περίθλασης. Λόγω αυτής της αντίστροφης σχέσης μεταξύ των κηλίδων περίθλασης το πλέγμα των κηλίδων περίθλασης ονομάζεται αντίστροφο. Επειδή η μοναδιαία κυψελίδα για τους πρωτεϊνικούς κρυστάλλους είναι πολύ πιο μεγάλη σε σχέση με αυτή των μικρότερων μορίων, η απόσταση μεταξύ των σημείων που αντιστοιχούν στις ανακλάσεις Bragg είναι σημαντικά μικρότερη στα μοτίβα περίθλασης που απαντώνται από κρυστάλλους βιομακρομορίων. Η φύση του μοτίβου περίθλασης διέπεται από την τρισδιάστατη περιοδικότητα και οι θέσεις των σημείων περίθλασης εξαρτώνται από τις ιδιότητες του πλέγματος. Αυτή η διαδικασία μετατρέπει το ευθύ πλέγμα σε ένα σχετιζόμενο με αυτό, το αντίστροφο πλέγμα. Αυτή είναι μια σημαντική έννοια για τη μελέτη κρυσταλλικών πλεγμάτων και των ιδιοτήτων περίθλασής τους. Ευθύ και αντίστροφο πλέγμα σχετίζονται μέσω μετασχηματισμών Fourier. [5] [23 60

62 Κρυσταλλικά συστήματα και πλέγματα Bravais Ανάλογα με τις σχέσεις μεταξύ των πλεγματικών σταθερών, ο κρύσταλλος κατατάσσεται σε ένα από τα 14 μοτίβα συμμετρίας που υπάρχουν και ονομάζονται πλέγματα Bravais (Bravais lattices). Αυτά ανήκουν σε 7 κρυσταλλικά συστήματα όπως φαίνεται στην εικόνα που ακολουθεί: [1] Εικόνα 45: Τα 7 πλέγματα Bravais (πηγή: maine.edu/~amar/spring2012/crystal.html). Πιο αναλυτικά: 1. Το τρικλινές κρυσταλλικό σύστημα έχει τις πλευρές της μοναδιαίας κυψελίδας a,b,c άνισες μεταξύ τους και το ίδιο συμβαίνει και με τις γωνίες (εικόνα 45 ΣΤ). 2. Μια μονοκλινής μοναδιαία κυψελίδα έχει τρεις άνισες πλευρές, τις γωνίες β και γ ορθές (90 ο ) και η γωνία α έχει διάφορες τιμές (εικόνα 45 Ε). 61

63 3. Στην ορθορομβική συμμετρία οι πλευρές είναι άνισες μεταξύ τους, αλλά όλες οι γωνίες είναι ορθές (α=β=γ=90 ο ) (εικόνα 45 Γ). 4. Το ρομβοεδρικό σύστημα έχει τρεις γωνίες ίσες μεταξύ τους (και διαφορετικές των 90 ο ) και τρεις πλευρές ίσες (εικόνα 45 Δ). Ωστόσο, υπάρχει και η περίπτωση κατά την οποία το Ρομβοεδρικό σύστημα ερμηνεύεται με βάση τους άξονες του εξαγωνικού όπως φαίνεται στον παρακάτω πίνακα: Κρυσταλλικό Σύστημα Κυβικό Τετραγωνικό Ορθορομβικό Μονοκλινές Τρικλινές Εξαγωνικό Τριγωνικό ή Ρομβοεδρικό Σχέσεις μεταξύ των αξόνων και των γωνιών a = b = c, α = β = γ = 90 ο a = b >< c, α = β = γ = 90 ο a >< b >< c, α = β = γ = 90 ο a >< b >< c, α = γ = 90 ο, β >< 90 ο a >< b >< c, α >< 90 ο, β >< 90 ο, γ >< 90 ο a = b >< c, α = β = 90 ο, γ = 120 ο a = b = c, α = β = γ ή a = b >< c, α = β = 90 ο, γ = 120 ο (εξαγωνικοί άξονες) Πίνακας 1: Τα επτά κρυσταλλικά συστήματα (πηγή: Richard Tilley, Crystals and crystal structure). 5. Το τετραγωνικό σύστημα έχει δύο πλευρές ίσες (a=b ), την τρίτη διαφορετική και όλες τις γωνίες ίσες με 90 ο (εικόνα 45 Β). 62

64 6. Στην περίπτωση της εξαγωνικής συμμετρίας (εικόνα 45 Ζ) οι δύο πλευρές a και b είναι ίσες και οι δύο γωνίες α και β ορθές, ενώ η γωνία γ είναι ίση με 120 ο. 7. Τέλος, το κυβικό σύστημα έχει όλες τις πλευρές ίσες μεταξύ τους και όλες τις γωνίες ορθές (εικόνα 45 Α). [9] Είναι σημαντικό σε αυτό το σημείο να αναφέρουμε πως υπάρχουν 4 τύποι πλεγμάτων όπως φαίνεται στην παρακάτω εικόνα: Εικόνα 46: Οι 4 διαφορετικοί τύποι πλεγμάτων (πηγή: Τα απλά πλέγματα (συμβολίζονται με το γράμμα P). Σε αυτά ένα άτομο βρίσκεται σε κάθε κορυφή της μοναδιαίας κυψελίδας. Υπάρχουν 7 στο σύνολο, ένα για κάθε κρυσταλλικό σύστημα. Τα χωροκενρωμένα πλέγματα (συμβολίζονται με το Ι). Τα άτομα τοποθετούνται στις κορυφές της κυψελίδας και ένα επιπλέον άτομα τοποθετείται στο κέντρο της. Υπάρχουν 3 τέτοιου τύπου, για το κυβικό, το ορθορομβικό και το τετραγωνικό σύστημα. Τα ολοεδρικά κεντρωμένα πλέγματα συμβολίζονται με το γράμμα F και εκτός από τις κορυφές της κυψελίδας υπάρχουν και έξι επιπλέον άτομα τοποθετημένα στα κέντρα των έξι εδρών της. Το κυβικό και το ορθορομβικό σύστημα έχουν και τέτοιου τύπου πλέγματα. 63

65 Τέλος, υπάρχουν δύο εδροκεντρωμένα πλέγματα για τη μονοκλινή και ορθορομβική συμμετρία. Συμβολίζονται με το C και σε αυτά τα άτομα τοποθετούνται στις κορυφές της κυψελίδας και επιπλέον δύο άτομα τοποθετούνται στο κέντρο δύο συμμετρικών εδρών του. [9] [12] Τα 14 πλέγματα Bravais αποτελούν ένα ολοκληρωμένο σύνολο, χωρίς να υπάρχουν άλλες δυνατές διαμορφώσεις για ένα κρύσταλλο. [9] Point groups Οι κρύσταλλοι μπορούν να ταξινομηθούν με βάση τη συμμετρία μεταξύ των πλευρών τους. Σε αυτή την περίπτωση όμως θεωρούμε τον κρύσταλλο σαν ένα ενιαίο κομμάτι αγνοώντας τη δομή του κρυσταλλικού πλέγματος που τον συνθέτει. Κάθε κρύσταλλος μπορεί να αναγνωριστεί από την ομάδα παραγόντων συμμετρίας που τον διέπει. Ο παράγοντας συμμετρίας είναι μια μεταμόρφωση ενός αντικειμένου τέτοια ώστε η κατάσταση που προκύπτει ως αποτέλεσμα να μη μπορεί να διακριθεί από την αρχική. Αυτοί οι παράγοντες μπορούν να διαχωριστούν σε κανονικές περιστροφές γύρω από συγκεκριμένους άξονες και αυτές που περιλαμβάνουν εκτός από την περιστροφή και αναστροφή σε σχέση με ένα σημείο. Κάθε σύνολο τέτοιων παραγόντων συμμετρίας που χαρακτηρίζει ένα κρύσταλλο καλείται point group του κρυστάλλου. Από τη στιγμή που το point group του κρυστάλλου είναι και το point group του πλέγματος μέσα στον κρύσταλλο, είναι επιτρεπτοί μόνο οι παράγοντες συμμετρίας που είναι συμβατοί με τη μετατοπίσημη συμμετρία στις τρεις διαστάσεις. Έτσι, υπάρχει ένα σύνολο 32 κρυσταλλογραφικών point groups τα οποία διαχωρίζονται στα 7 κρυσταλλικά συστήματα. Με λίγα λόγια, τα point groups περιγράφουν η συμμετρία αντικειμένων με πεπερασμένες διαστάσεις και αναφέρονται εξίσου στη μορφολογία των κρυστάλλων ή στις μοριακές δομές. [12] [24] Κατηγορίες παραγόντων συμμετρίας Περιστροφή γύρω από έναν άξονα (rotation axes) κατά 360 ο /n. Κατάσταση η οποία περιορίζει τον αριθμό των περιστροφών που χρειάζονται για να επανέλθει το αντικείμενο στον αρχικό του προσανατολισμό σε n=1,2,3,4 ή 6. 64

66 Αναστροφή (inversion axes). Το ίδιο με την πρώτη περίπτωση, αλλά μετά την 360 ο /n περιστροφή, το αντικείμενο προβάλλεται μέσω μιας αναστροφής σε σχέση με έναν άξονα. Συμμετρία καθρέπτη (mirror plane). Συμβολίζεται με το γράμμα m και υπάρχει η σχέση αντικείμενου-ειδώλου. [22] Υπάρχουν επίσης και οι μικρό-μετατοπίσεις (όπως για παράδειγμα screw axis), που προκύπτουν από το συνδυασμό μιας περιστροφής η οποία ακολουθείται από μετατόπιση. [XI] Space groups (ομάδες συμμετρίας χώρου) Στα Μαθηματικά και τη Γεωμετρία το space group είναι μια ομάδα συμμετρίας η οποία χωρίζει το χώρο σε ευδιάκριτους επαναλαμβανόμενους τομείς. Περιγράφουν τη δομή τρισδιάστατων σχηματισμών. Όλα τα space group, 230 στο σύνολο, προκύπτουν από το συνδυασμό των 32 point group με τα 14 πλέγματα Bravais. Ωστόσο, από τα 230, μόνο τα 65 είναι αυτά που αναφέρονται σε πρωτεΐνες και αυτό συμβαίνει γιατί οι πρωτεΐνες είναι χειρόμορφα μόρια κι έτσι δεν είναι συμβατές με τη συμμετρία καθρέπτη ή τις συμμετρίες που περιλαμβάνουν και αναστροφή εκτός από περιστροφή. [22] [VIII] Το σύμβολο ενός space group, σύμφωνα με την ονομασία Hermann-Maguin, αποτελείται από δύο έως τέσσερεις χαρακτήρες οι οποίοι περιγράφουν πλήρως τη συμμετρία του. Το πρώτο γράμμα περιγράφει πάντα τον τύπο του πλέγματος Bravais, όπως για παράδειγμα στο space group Ι2 1 3, το Ι υποδηλώνει ένα χωροκεντρωμένο πλέγμα. Ο δεύτερος χαρακτήρας αμέσως μετά το σύμβολο του πλέγματος Bravais είναι χαρακτηριστικός της συμμετρίας σε σχέση με έναν βασικό άξονα της κυψελίδας. Ως βασικός άξονας για τα κρυσταλλικά συστήματα θεωρείται: 1. Τρικλινές : δεν έχει 2. Μονοκλινές : ο άξονας Β 3. Ορθορομβικό : ο άξονας C 4. Τετραγωνικό : ο άξονας C 5. Εξαγωνικό : ο άξονας C 6. Τριγωνικό : ο άξονας Α 7. Κυβικό : ο άξονας Α 65

67 Στο κυβικό, επειδή όλες οι πλευρές της κυψελίδας είναι ίσες μεταξύ τους, ως βασικός άξονας μπορεί να θεωρηθεί οποιοσδήποτε από τους τρεις. Ο δεύτερος χαρακτήρας λοιπόν μας δείχνει πόσες μοίρες περιστρέφεται η κυψελίδα γύρω από τον βασικό άξονα (360 ο /n). Για το παραπάνω παράδειγμα: n= 2. Σε πολλές περιπτώσεις, όπως και σε αυτή του παραδείγματος, ο δεύτερος χαρακτήρας έχει ακόμα έναν αριθμό ως δείκτη (n m ). Αυτός υποδηλώνει πως μετά από την περιστροφή κατά 360 ο /n ακολουθεί και μετατόπιση της κυψελίδας κατά m/n και κατά μήκος του άξονα σύμφωνα με τον οποίο έγινε και η περιστροφή (κατά ½ για το παράδειγμα του space group Ι2 1 3). [XI] [XII] Περίθλαση ακτίνων Χ από μονο-κρύσταλλο (single crystal) Προκειμένου να αποκτηθεί η μοριακή δομή, είναι απαραίτητη η χρήση ακτίνων Χ γιατί το μήκος κύματος αυτής της ακτινοβολίας είναι παρόμοιας τάξης με το μέγεθος των ατόμων και των μεταξύ τους δεσμών. Το μοτίβο περίθλασης που αποκτάται περιέχει την πληροφορία που χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό της μοριακής δομής. Ωστόσο, αυτό το μοτίβο είναι μια δισδιάστατη διάταξη σημείων συγκεκριμένης θέσης και έντασης. Για να μετατραπεί αυτό σε μια τρισδιάστατη δομή, είναι απαραίτητο να γίνει συλλογή ενός συνόλου δεδομένων από πολλά τέτοια μοτίβα από ένα κρύσταλλο. Τα ηλεκτρόνια των ατόμων είναι υπεύθυνα για την περίθλαση των ακτίνων Χ, λόγω αλληλεπίδρασης του ηλεκτρομαγνητικού κύματος των ακτίνων Χ και του ηλεκτρονίου. Από τη στιγμή που είναι τα ηλεκτρόνια υπεύθυνα για την περίθλαση, υπάρχει μια στενή σχέση ανάμεσα στην ένταση με την οποία περιθλάται η δέσμη των ακτίνων Χ και του ατομικού αριθμού (Ζ) του ατόμου που την περιθλά. Αυτό αναφέρεται σαν ατομικός παράγοντας σκέδασης f και σχετίζεται με τη γωνία πρόσπτωσης θ και το μήκος κύματος των ακτίνων Χ. Ο ατομικός παράγοντας σκέδασης είναι ένας μέσος όρος της έντασης των σκεδαζόμενων ακτίνων Χ από ένα άτομο και αυτής από ένα μεμονωμένο ηλεκτρόνιο, κάτω από τις ίδιες πειραματικές συνθήκες. Έτσι, η δομή που υπολογίζεται από τα μοτίβα περίθλασης είναι ένας χάρτης ηλεκτρονιακής πυκνότητας. [5] 66

68 Περίθλαση ακτίνων Χ από πολυκρυσταλλικά υλικά (Powder Diffraction) Η περίθλαση ακτίνων Χ από πολυκρυσταλλικά υλικά είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνική τα τελευταία χρόνια, για την απόκτηση της τρισδιάστατης δομής βιολογικών μακρομορίων και ιδιαίτερα πρωτεϊνών. Ένα πολυκρυσταλλικό δείγμα, στην ιδανική περίπτωση αποτελείται από ένα πολύ μεγάλο αριθμό τυχαία προσανατολισμένων μικροκρυστάλλων (εικόνα 47) με διαστάσεις περίπου 1-10 μm, οι οποίοι εκτίθενται την ίδια στιγμή στη δέσμη ακτίνων Χ. Ωστόσο, στην πραγματικότητα υπάρχουν πολλές δυσκολίες στην προετοιμασία του δείγματος όπως για παράδειγμα ο μικρός αριθμός κρυστάλλων ο οποίος δεν μπορεί να δώσει μια ξεκάθαρη εικόνα των ανακλάσεων. Ακόμα ένα πιθανό πρόβλημα είναι η ποιότητα των πολυκρυσταλλικών υλικών και αφορά την ανεπαρκή ανάπτυξη των κρυστάλλων με αποτέλεσμα να μην έχουν το κατάλληλο μέγεθος (μεγαλύτερο από το ιδανικό των 1-10 μm) κάτι που οδηγεί σε μη ακριβείς εντάσεις. [12] Οι αρχές της περίθλασης που έχουν περιγραφεί και αναφέρονται σε ένα κρύσταλλο, έχουν εφαρμογή και στην περίπτωση των πολυκρυσταλλικών υλικών. Ωστόσο, εξαιτίας του τυχαίου προσανατολισμού των μικροκρυστάλλων, υπάρχουν πολλά επίπεδα hkl τα οποία ταυτόχρονα ικανοποιούν το νόμο του Bragg. [12] Εικόνα 47: Εδώ διακρίνεται ένα δείγμα πολυκρυσταλλικών υλικών το οποίο εκτίθεται σε δέσμη ακτίνων Χ. Φαίνεται ο τυχαίος προσανατολισμός των κρυστάλλων καθώς και των ακτίνων που περιθλώνται (πηγή: 48): Η εικόνα που παίρνουμε στον ανιχνευτή μοιάζει με την παρακάτω (εικόνα 67

69 Εικόνα 48: Μοτίβο περίθλασης για πολυκρυσταλλικό υλικό (αριστερά) και μονοκρύσταλλο (δεξιά) Cr 2 O 3 (πηγή: ighpage4.php?p=1). Στο αριστερό τμήμα της εικόνας 48 φαίνονται οι ομόκεντροι κύκλοι που σχηματίζονται στον ανιχνευτή όταν η περίθλαση αφορά πολυκρυσταλλικά υλικά. Αυτό συμβαίνει γιατί ένας επαρκής αριθμός κρυστάλλων είναι παρών και εκτίθεται στη δέσμη των ακτίνων, με αποτέλεσμα όλα τα πιθανά προς ανάκλαση επίπεδα του κρυστάλλου να είναι ταυτόχρονα σε θέση κατάλληλα για περίθλαση. Αυτά τα ομόκεντρα δαχτυλίδια που είναι αποτέλεσμα επαλληλίας των μοτίβων περίθλασης από ένα πολύ μεγάλο αριθμό μεμονωμένων κρυστάλλων. Οι μεμονωμένες κουκίδες υπάρχουν σαν εικόνα στον ανιχνευτή όταν το δείγμα μας είναι ένας μονοκρύσταλλος. Κατά τη διάρκεια του σταδίου επεξεργασίας των δεδομένων, οι εντάσεις από αυτούς τους δακτυλίους ολοκληρώνονται και απεικονίζονται ως συνάρτηση της γωνίας 2θ (εικόνα 49). Το μοτίβο που προκύπτει είναι χαρακτηριστικό μιας συγκεκριμένης μορφής του κρυστάλλου. Εικόνα 49: Το διάγραμμα της έντασης σε σχέση με τη γωνία 2θ. Το συγκεκριμένο προέρχεται από δείγμα που παρασκευάστηκε στο εργαστήριο και πρόκειται για την περίπτωση συγκρυστάλλωσης ινσουλίνης με 4-(2-Pyridylazo)-Resorcinol σε ph=7,82. 68

70 κυψελίδας. Οι 2θ θέσεις των εντάσεων είναι ενδεικτικές των διαστάσεων της μοναδιαίας Παράγοντας δομής Παράγοντας δομής F hkl μιας ανάκλασης hkl καλείται ο λόγος του πλάτους της συνισταμένης των κυμάτων, που προκύπτει από τη συμβολή των κυμάτων των προερχόμενων από όλα τα άτομα της κυψελίδας κατά τη διεύθυνση της ανακλώμενης και σε απόσταση ίση με τη μονάδα, προς το πλάτος του κύματος που προκύπτει από ηλεκτρόνιο που βρίσκεται στην αρχή των αξόνων της κυψελίδας. Δίνεται από τη σχέση: ή Όπου: Ν: είναι το πλήθος των ατόμων της κυψελίδας f i : ο γνωστός ατομικός παράγοντας σκέδασης ο οποίος εξαρτάται από τον αριθμό των ηλεκτρονίων στα άτομα και από τη γωνία σκέδασης θ φ i = 2π(hx i + ky i + lz i ) H φ i εκφράζει τη φάση του κύματος που προκύπτει από το άτομο i κατά τη διεύθυνση της ανακλώμενης από το επίπεδο hkl δέσμης. Η φάση όπως είναι φανερό, εξαρτάται από τις συντεταγμένες x i, y i, z i του i ατόμου δηλαδή από τη θέση του ως προς το σύστημα των αξόνων της κυψελίδας. Η ένταση της σκεδαζόμενης ακτινοβολίας είναι ανάλογη του τετραγώνου του μέτρου του παράγοντα δομής, F(hkl) 2 [1] [IX] 69

71 ΦΑΡΜΑΚΑ ΣΕ ΜΙΚΡΟΚΡΥΣΤΑΛΛΙΚΗ ΜΟΡΦΗ Οι ασθενείς που πάσχουν από διαβήτη χρησιμοποιούν σε καθημερινή βάση ενέσεις ινσουλίνης. Για να υπάρχει ένα συνεχές και σταθερό επίπεδο συγκέντρωσης γλυκόζης στο αίμα, αλλά και για γρήγορη αντίδραση σε περιπτώσεις όπως μετά την κατανάλωση τροφής, τα φαρμακευτικά προϊόντα ινσουλίνης πρέπει να είναι τόσο μακράς δράσης (για τη διατήρηση ενός σταθερού επιπέδου), όσο και άμεσης δράσης. Αυτό στις περισσότερες περιπτώσεις επιτυγχάνεται χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικές φαρμακευτικές φόρμουλες. Οι άμεσης δραστικότητας αποτελούνται από ελεύθερη σε διάλυμα ινσουλίνη, ενώ η μακράς δραστικότητας από κρυστάλλους ινσουλίνης οι οποίοι χορηγούνται με υποδόριες ενέσεις. Η κρυσταλλική φύση και το μέγεθος των κρυστάλλων παίζουν σημαντικό ρόλο στη διάρκεια δράσης του φαρμάκου. Μετά τη χορήγηση, όταν οι κρύσταλλοι αρχίζουν να αποδιατάσσονται στα συστατικά τους εξαμερή, διμερή και μονομερή, αυτά αρχίζουν να διαχέονται μέσα από τα αιμοφόρα αγγεία. Εξαιτίας των διαφορετικών διαστάσεων, τα εξαμερή χρειάζονται περισσότερο χρόνο για τη διάχυσή τους σε σχέση με τα μονομερή και τα διμερή. Είναι πλέον σαφές ότι η κρυστάλλωση μπορεί να χρησιμοποιηθεί στη δημιουργία νέων φαρμάκων που η σύνθεση τους βασίζεται σε πρωτεΐνες. Κάποια από τα πλεονεκτήματα των μικροκρυσταλλικών φαρμάκων είναι: Καλύτερη σταθερότητα σε σχέση με τα φάρμακα σε μορφή διαλύματος και χαμηλότερο κόστος παραγωγής σε σύγκριση με άλλες διαδικασίες (π.χ. Protein lyophilization). Μεγαλύτερες συγκεντρώσεις και περιορισμένο ιξώδες. Πιο σταθερή διάχυση του φαρμάκου στον οργανισμό καθώς οι κρύσταλλοι διαλύονται βαθμιαία μέσα στο ανθρώπινο σώμα. Παρ όλα αυτά, σήμερα η Ινσουλίνη αποτελεί το μόνο φάρμακο που παράγεται σε μικροκρυσταλλική μορφή. Το γεγονός αυτό προκύπτει από τη γενική δυσκολία ανάπτυξης πρωτεϊνικών κρυστάλλων που ικανοποιούν τις φαρμακευτικές προδιαγραφές. Αυτό προϋποθέτει την ανάπτυξη μικρών και ομοιογενών, όσον αφορά το μέγεθος, κρυστάλλων (10 mm) για να είναι δυνατή η λήψη του φαρμάκου μέσω ένεσης. Επίσης, οι χημικές ουσίες που χρησιμοποιούνται στην κρυσταλλογέννεση πρέπει να είναι μη τοξικές και ήδη υπάρχουσες στο ανθρώπινο σώμα υπό φυσιολογικές συνθήκες (για παράδειγμα μια ποσότητα NaCl συγκέντρωσης 130 mm, ίσως να μην είναι αρκετή για την κρυστάλλωση μιας πρωτεΐνης). 70

72 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Στα πειράματα της παρούσας εργασίας, έγιναν κρυσταλλώσεις ανθρώπινης ινσουλίνης με οργανικές ουσίες οι οποίες αντιστοιχούν σε προσδέτες (ligands) και συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκαν οι εξής: 4-(2-Pyridylazo)-Resorcinol και 3,5- Dihydroxybenzoic acid. Στην ουσία δηλαδή έγιναν συγκρυσταλλώσεις. Οι προσδέτες δένουν σε συγκεκριμένα σημεία του μορίου της ινσουλίνης και αυτό έχει ως αποτέλεσμα να κρυσταλλώνεται με διαφορετικό τρόπο. Οι συγκρυσταλλώσεις έγιναν παρουσία Zn (για τη δημιουργία εξαμερών) και σε εύρος τιμών ph προκειμένου να μελετήσουμε την επίδραση αυτής της πολύ κρίσιμης παραμέτρου στις αναπτυχθείσες κρυσταλλικές δομές. Εικόνα 50: Αριστερά φαίνεται η στερεογεωμετρία του 3,5-Dihydroxybenzoic acid και δεξιά απεικονίζεται το 4-(2-Pyridylazo)-Resorcinol (πηγή: Παρασκευή ρυθμιστικών διαλυμάτων για κλίση ph Το πρώτο βήμα είναι η παρασκευή των ρυθμιστικών διαλυμάτων με κλίση ph ανάμεσα στις τιμές 4.00 και Τα ρυθμιστικά διαλύματα έχουν την ιδιότητα να διατηρούν σταθερό το ph τους, κάτι το οποίο είναι επιθυμητό στη διαδικασία της κρυστάλλωσης. Κατά προτίμηση το βήμα στην αύξηση του ph είναι 0.3 μονάδες και θέλουμε να παρασκευάσουμε 17 διαφορετικά ph. Χρειαζόμαστε τα παρακάτω διαλύματα: Διάλυμα KH 2 PO 4 *3H 2 O Na 2 HPO 4 *2H 2 O Όγκος V (ml) Συγκέντρωση c (M) 2 2 Μοριακό βάρος MW (gr/mol) 136, ,99 Πίνακας 2: Ποσότητες των διαλυμάτων που χρειαζόμαστε. 71

73 Με τη χρήση των τύπων: c = n/v (1) και n = m/mw (2) προκύπτει η μάζα που πρέπει να χρησιμοποιηθεί από την κάθε ουσία για να δημιουργηθεί το διάλυμά της: Ουσία KH 2 PO 4 *3H 2 O Na 2 HPO 4 *2H 2 O Μάζα (gr) 54, ,59 Πίνακας 3: Η μάζα των ουσιών που θα χρησιμοποιηθεί. KH 2 PO 4 *3H 2 O Σε ένα ποτήρι ζέσεως σε 200 ml dd H 2 O (διπλά απεσταγμένο νερό) προσθέτουμε τα 54,4344 gr KH 2 PO 4 *3H 2 O και αναδεύουμε μέχρι να διαλυθεί. Na 2 HPO 4 *2H 2 O 1) Σε ένα ποτήρι ζέσεως το οποίο βρίσκεται επάνω σε εστία θέρμανσης ανάδευσης και περιέχει μαγνήτη ανάδευσης, βάζουμε 50 ml dd H 2 O και προσθέτουμε σταδιακά τα 35,59 gr Na 2 HPO 4 *2H 2 O. 2) Καλύπτουμε με αλουμινόφυλλο το ποτήρι για να μην εξατμίζεται το νερό και τελικά βάζουμε και τον υπόλοιπο όγκο dd H 2 O μέχρι να συμπληρωθούν 100 ml. 3) Χωρίζουμε το διάλυμα σε δύο φιαλίδια falcon των 50 ml και μετράμε το ph το οποίο είναι ίσο με 8.8, αλλά επειδή το διάλυμα είναι ακόμα ζεστό υπολογίζεται πως θα μεταβληθεί στη συνέχεια. Εύρος ph Για να επιτύχουμε τις ενδιάμεσες τιμές ph (με βήμα 0.3), αναμιγνύουμε τα δύο διαλύματα. 1) Βάζουμε 100 ml από το διάλυμα KH 2 PO 4 σε ένα ποτήρι ζέσεως το οποίο περιέχει ένα μαγνήτη ανάδευσης. Στη συνέχεια τοποθετούμε το ποτήρι σε εστία για ανάδευση. 2) Προσαρμόζουμε στο ποτήρι τον ανιχνευτή του πεχαμέτρου για να βλέπουμε τις τιμές του ph και να απομακρύνουμε ποσότητα διαλύματος από αυτές που θέλουμε. 3) Προσθέτουμε 3-4 ml Na 2 HPO 4 κάθε φορά για να αυξάνουμε το ph με βήμα

74 4) Όταν το πεχάμετρο δείχνει τις επιθυμητές τιμές ph, με αυτόματη πιπέτα απομακρύνουμε από το ποτήρι ζέσεως 2-3 ml του διαλύματος και το φυλάσσουμε σε falcon των 15 ml. Παρατηρήσεις o Σε ph>5, χρειάζονται μεγαλύτερες ποσότητες από το Na 2 HPO 4 για την αύξηση του ph. o Μικρές ποσότητες (περίπου 300 λ) του KH 2 PO 4 στο Na 2 HPO 4 μείωσαν απότομα το ph και για το λόγο αυτό χάθηκε η επιθυμητή τιμή ph=8.50. Από αυτήν την διαδικασία προέκυψαν οι παρακάτω τιμές ph: τιμή ph την ημέρα τιμή ph την επόμενη τιμή ph μετά από δύο ημέρες παρασκευής ημέρα (κρυσταλλωμένο) Πίνακας 4: Οι τιμές του ph των διαλυμάτων που προέκυψαν. 73

75 Για τις κρυσταλλώσεις που έγιναν χρησιμοποιήθηκαν οι τιμές ph: 4.77, 5.07, 5.35, 6.57, 6.84 και Επίσης, επειδή θέλαμε και ένα ph γύρω στο 8.3 παρασκευάσαμε ένα ακόμα με τελικό ph=8.39. Παρασκευή ZnAc 2 Το διάλυμα αυτό προσφέρει τα ιόντα Zn που είναι απαραίτητα για το σχηματισμό των εξαμερών ινσουλίνης. Θέλουμε να παρασκευάσουμε 50 ml από αυτό το διάλυμα, με την ουσία να έχει τα χαρακτηριστικά που φαίνονται στον πίνακα 5: ZnAc 2 V (ml) 50 c (M) 0,01 MW (g/mol) 219,49 Πίνακας 5: Τιμές μοριακού βάρους, συγκέντρωσης και όγκου του ZnAc 2 Οπότε με τη χρήση των τύπων (1) και (2) προκύπτει πως πρέπει να διαλυθούν 109,74 mg ουσίας σε dd H 2 O. 1) Σε ένα falcon των 50 ml βάζουμε 20 ml dd H 2 O, προσθέτουμε τα 109,74 mg του ZnAc 2 και αναδεύουμε στη συσκευή vortex. 2) Στη συνέχεια προσθέτουμε dd H 2 O έως την ένδειξη των 50 ml και ανακινούμε. Προετοιμασία των διαλυμάτων των προσδετών (ligands) Για τα διαλύματα των ligands χρειαζόμαστε τελικό V = 1mL και c = 2M Προετοιμασία του διαλύματος 3,5 Dihydroxybenzoic acid Αυτή η οργανική ουσία έχει MW= 154,12 g/mol, οπότε με την εφαρμογή των τύπων (1) και (2) και έχοντας υπόψη μας τον τελικό V και c που θέλουμε να έχει το διάλυμα του προσδέτη θα χρησιμοποιηθούν: 3,5 Dihydroxybenzoic acid 0,30824 gr ή 308 mg Πίνακας 6: Η απαιτούμενη ποσότητα του 3,5 Dihydroxybenzoic acid. 74

76 Ως διαλύτης θα χρησιμοποιηθεί το DMSO 1) Σε ένα eppendorf βάζουμε την ποσότητα του προσδέτη και DMSO λιγότερο από την ένδειξη 1 ml, για να μπορέσει να γίνει καλά η διάλυσή του. 2) Αναδεύουμε με τη βοήθεια πιπέτας, αλλά και σε vortex μέχρι να διαλυθεί ο προσδέτης καλά. 3) Κατόπιν συμπληρώνουμε με DMSO μέχρι την ένδειξη 1 ml. Προετοιμασία του διαλύματος 4-(2-Pyridylazo)-Resorcinol Η συγκεκριμένη οργανική ουσία έχει MW = 215, 208 g/mol, οπότε με τη βοήθεια των τύπων (1) και (2) υπολογίζουμε ότι θα χρειαστούμε: 4-(2-Pyridylazo)-Resorcinol 0, gr ή 430 mg Πίνακας 7: Η απαιτούμενη ποσότητα του 4-(2-Pyridylazo)-Resorcinol. Ως διαλύτης θα χρησιμοποιηθεί και εδώ το DMSO Ζυγίζοντας την ποσότητα του προσδέτη, διαπιστώθηκε πως δεν επαρκούσε για 430 mg, οπότε αυτό που έγινε ήταν να μειωθεί η μάζα στο μισό της αρχικής. Οπότε τελικά προέκυψε: Αρχικά Τελικά V (ml) 1 2 C (M) 2 0,5 m (gr) 0, ,215 Πίνακας 8: Οι τελική ποσότητα που χρησιμοποιήθηκε από αυτόν τον προσδέτη για πρακτικούς λόγους. Προετοιμασία του διαλύματος ανθρώπινης ινσουλίνης Χρειαζόμαστε: Ομόλογο ανθρώπινης ινσουλίνης σε μορφή σκόνης Διάλυμα ZnAc 2 dd H 2 O φιαλίδιο falcon των 50 ml 75

77 Πορεία: 1) Ζυγίζουμε 527 mg ινσουλίνης και τα προσθέτουμε σε ένα falcon των 50 ml. 2) Προσθέτουμε 27,6 ml dd H 2 O και προσεκτικά διαλύουμε την ινσουλίνη με τη βοήθεια μιας σπάτουλας και ποτέ με ανάδευση σε vortex, γιατί θα προκαλέσουμε τη μετουσίωση της πρωτεΐνης. 3) Στη συνέχεια προσθέτουμε 3,192 ml από το ZnAc 2 0,01 M. 4) Βάζουμε 400 λ dd H 2 O για πρακτικούς λόγους (1λ = 10-6 L). Συγκρυστάλλωση ινσουλίνης με 3,5 Dihydroxybenzoic acid Χρειαζόμαστε: o το διάλυμα της ινσουλίνης που παρασκευάστηκε στο προηγούμενο βήμα o το διάλυμα του προσδέτη 3,5 Dihydroxybenzoic acid o διάλυμα NaSCN 1M o τα ρυθμιστικά διαλύματα των ph που έχουμε επιλέξει: o 4.77 o 5.35 o 5.67 o 5.97 o 6.57 o 7.12 o 7.76 o 8.68 o φιαλίδιο falcon των 15 ml Πορεία: 1) Από το προηγούμενο διάλυμα ινσουλίνης - ZnAc 2 παίρνουμε 7,5 ml και τα βάζουμε σε ένα falcon. 2) Προσθέτουμε 206 λ από το διάλυμα του προσδέτη 3,5 Dihydroxybenzoic acid και ανακινούμε ελαφρά με το χέρι. 3) Ακολουθεί αναμονή σε ηρεμία για τουλάχιστον 5 λεπτά, για να έχει το χρόνο ο προσδέτης να δέσει επάνω στο μόριο της ινσουλίνης. 4) Προσθήκη 103 λ από το NaSCN. 5) Το διάλυμα πρωτεΐνης προσδέτη είναι έτοιμο. 76

78 o Στη συνέχεια βάζουμε σε eppendorfs, από 1 ml από αυτό το διάλυμα πρωτεΐνης προσδέτη και προσθέτουμε από 250 λ από το κάθε ρυθμιστικό στο eppendorf με την αντίστοιχη ένδειξη ph. o Βάζοντας τις προγραμματισμένες ποσότητες από το διάλυμα πρωτεΐνης προσδέτη σε κάθε eppendorf, περίσσεψαν 730 λ. Σε αυτά προσθέσαμε 182,5 λ από το ρυθμιστικό με ph = o Όλα αυτά τα δείγματα φυλάσσονται σε θάλαμο θερμοκρασίας δωματίου. Συγκρυστάλλωση ινσουλίνης με 4-(2-Pyridylazo)-Resorcinol Χρειαζόμαστε: o διάλυμα ινσουλίνης - ZnAc 2 το οποίο παρασκευάζεται ως εξής: o διαλύουμε 534 mg ινσουλίνης σε 28 ml dd H 2 O o προσθέτουμε 3,238 ml ZnAc 2 0,01 M. o το διάλυμα του προσδέτη 4-(2-Pyridylazo)-Resorcinol o διάλυμα NaSCN 1M o τα ρυθμιστικά διαλύματα των ph που έχουμε επιλέξει: o 4.77 o 5.35 o 5.67 o 5.97 o 6.57 o 7.12 o 7.76 o 8.39 o φιαλίδιο falcon των 15 ml Πορεία: 1) Από το διάλυμα ινσουλίνης - ZnAc 2 βάζουμε 7,698 ml σε ένα falcon των 15 ml. 2) Προσθέτουμε 824 λ από το διάλυμα του προσδέτη 4-(2-Pyridylazo)-Resorcinol και ανακινούμε ελαφρά. 3) Αφήνουμε σε ηρεμία για 5 λεπτά. 4) Προσθήκη 103 λ από το NaSCN. 5) Το διάλυμα πρωτεΐνης προσδέτη είναι έτοιμο. 77

79 o Στη συνέχεια, όπως και στο προηγούμενο βήμα, βάζουμε σε eppendorfs, από 1 ml από αυτό το διάλυμα πρωτεΐνης προσδέτη και προσθέτουμε από 250 λ από το κάθε ρυθμιστικό στο eppendorf με την αντίστοιχη ένδειξη ph. o Τα δείγματα φυλάσσονται σε θάλαμο θερμοκρασίας δωματίου. Έκθεση των δειγμάτων σε ακτινοβολία σύγχροτρον Μέσα σε χρονικό διάστημα δύο ημερών από την πραγματοποίηση των πειραμάτων, είχαν σχηματιστεί οι κρύσταλλοι στα δείγματα. Οι κρύσταλλοι παρατηρήθηκαν με χρήση οπτικής μικροσκοπίας (εικόνα 22). Σε αυτό το στάδιο και μόνο με το οπτικό μικροσκόπιο δεν μπορεί να βγει κάποιο συμπέρασμα για το κρυσταλλογραφικό πλέγμα και το space group στο οποίο έχει κρυσταλλωθεί η ινσουλίνη. Επειδή λοιπόν με την εικόνα στο μικροσκόπιο και τη μορφολογία των κρυστάλλων δεν βγαίνει συμπέρασμα για την τρισδιάστατη δομή τους, οι κρύσταλλοι πρέπει να εκτεθούν σε ακτινοβολία σύγχροτρον. Για τον σκοπό αυτό η ομάδα μας πραγματοποίησε πειράματα στο ID31 εργαστήριο περίθλασης από πολυκρυσταλλικά υλικά του Ευρωπαϊκού Σύγχροτρον, ESRF (European Synchrotron Radiation Facility) στη Grenoble της Γαλλίας. Όπως έχει αναφερθεί και στην εισαγωγή, σε μια εγκατάσταση σύγχροτρον, ηλεκτρόνια κινούμενα σε κυκλική τροχιά με πολύ μεγάλες ταχύτητες (που πλησιάζουν την ταχύτητα του φωτός),εκτρέπονται από την πορεία τους με τη χρήση μαγνητών και αυτό έχει ως αποτέλεσμα να εκπέμπουν μια δέσμη η οποία καλύπτει όλο το φάσμα της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας. Στη συνέχεια, με τη βοήθεια ενός μονοχρωμάτορα επιλέγεται η επιθυμητή ακτινοβολία σε μήκος κύματος βέλτιστο για τον σκοπό του εκάστοτε πειράματος. Τα δείγματα εκτέθηκαν στα εξής μήκη κύματος λ: Ινσουλίνη με προσδέτη: λ (Å) 3,5 Dihydroxybenzoic acid 1,29992(3) 4-(2-Pyridylazo)-Resorcinol 1,29994(3) Πίνακας 9: Τα μήκη κύματος της ακτινοβολίας (περιλαμβάνεται και το σφάλμα). 78

80 Μετά την ολοκλήρωση της συλλογής των πειραματικών δεδομένων ακολουθεί η επεξεργασία τους με χρήση σειράς υπολογιστικών πακέτων. Τα πειραματικά δεδομένα απεικονίζουν το διάγραμμα της έντασης της ακτινοβολίας (Ι) σε συνάρτηση με τη γωνία 2θ και ενδεικτικά παρουσιάζουμε ένα από τα περίπου 100 διαφορετικά περιθλασιγράμματα που συλλέχτηκαν στην εικόνα 49. WinPLOTR Το WinPLOTR είναι ένα πρόγραμμα [27] το οποίο μας επιτρέπει να βλέπουμε το προφίλ ενός δείγματος (διάγραμμα έντασης σε συνάρτηση με τη γωνία 2θ εικόνα 49). Τα αρχεία πρέπει να είναι σε μορφή *xye και μας δίνεται η δυνατότητα να έχουμε μια εικόνα για τα όρια των τιμών 2θ για τα οποία έχουμε δεδομένα, καθώς και να κάνουμε και μια πρώτη προσέγγιση για το space group και το κρυσταλλογραφικό πλέγμα στο οποίο ανήκει το δείγμα, συγκρινόμενο με προφίλ από άλλα γνωστά δείγματα. Πρόγραμμα DASH - Indexing Μέθοδος Pawley Το πρώτο βήμα στην επεξεργασία των δεδομένων είναι η διαδικασία η οποία ονομάζεται Indexing. Αυτή έχει ως σκοπό την εύρεση των πλεγματικών σταθερών της θεμελιώδους κυψελίδας (πλευρές a,b,c και γωνίες α,β,γ) και του space group. Αυτό επιτυγχάνεται με τη χρήση ενός προγράμματος που ονομάζεται DASH [28] και χρησιμοποιεί τις δύο παρακάτω εξισώσεις για να εξάγει τα αποτελέσματα: Μέθοδος Pawley Από τη στιγμή που έχει πραγματοποιηθεί η διαδικασία του Indexing και έχουν προσδιοριστεί οι πλεγματικές σταθερές και το space group, έχουν αποκτηθεί επαρκή δεδομένα για να γίνει η επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων του υπό μελέτη μορίου. Μια από τις πιο συνηθισμένες μεθόδους για την επίτευξη της 79

81 βελτιστοποίησης των αποτελεσμάτων είναι η μέθοδος Pawley [29], στην οποία συνήθως οι παράμετροι της μοναδιαίας κυψελίδας, του σημείου μηδέν και των κορυφών μεταβάλλονται μέχρι να αποκτηθεί το καλύτερο δυνατό αποτέλεσμα σύμφωνα με τη μέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων. Στο τέλος της διαδικασίας είναι δυνατό να δει κανείς αν το υπό μελέτη δείγμα αποτελείται από μία κρυσταλλογραφική φάση και αν είναι καθαρό ή έχει και ξένα στοιχεία. Γενικά, αν το λεγόμενο fit στα δεδομένα είναι πολύ καλό, τότε μπορούμε να είμαστε σχεδόν σίγουροι πως τα χαρακτηριστικά του κρυστάλλου που έχουμε βρει είναι τα σωστά. Ο σκοπός της μεθόδου Pawley (Pawley fitting) στο DASH είναι να επιβεβαιώσει το παρατηρούμενο προφίλ από δεδομένα περίθλασης πολυκρυσταλλικών υλικών, απουσία ενός δομικού μοντέλου. Αυτό το επιτυγχάνει χρησιμοποιώντας: α) τη διαφορά μεταξύ πραγματικών δεδομένων και πειραματικών), β) ένα σύνολο παραμέτρων που περιγράφουν την κάθε κορυφή (peak shape), γ) το σημείο μηδέν (zero point) και τις πλεγματικές σταθερές και δ) την ένταση από τις μεμονωμένες ανακλάσεις. Το συνολικό fit ανάμεσα στο τελικά υπολογισμένο και στο παρατηρούμενο εκφράζεται από ένα σύνολο στατιστικών αριθμών που δείχνουν το κατά πόσο καλό fit έχει γίνει, μεταξύ των οποίων υπάρχει και η παράμετρος χ 2. Αν το fit που παρέχεται σε αυτό το στάδιο από το DASH και με βάση τη μέθοδο Pawley είναι αρκετά καλό, οι εντάσεις των ανακλάσεων μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε περαιτέρω επεξεργασία με προγράμματα για την επίλυση της τρισδιάστατης δομής του μορίου. [X] Πρόγραμμα DASH Πορεία: 1) Ανοίγοντας το πρόγραμμα εμφανίζεται το παρακάτω παράθυρο: Εικόνα 51: Το παράθυρο που εμφανίζεται κατά την έναρξη του προγράμματος DASH. 80

82 Πατάμε την επιλογή Next και στη συνέχεια καλούμαστε να επιλέξουμε το αρχείο που θέλουμε να αναλύσουμε (π.χ. τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την έκθεση σε ακτινοβολία σύγχροτρον του δείγματος συγκρυστάλλωσης ινσουλίνης - 3,5 Dihydroxybenzoic acid σε ph = 8.68 ) σε μορφή *xye και πατάμε Next. 2) Στο επόμενο βήμα πρέπει να επιλέξουμε το είδος της ακτινοβολίας που χρησιμοποιήθηκε. Επιλέγουμε Synchrotron και γράφουμε και το μήκος κύματος της ακτινοβολίας. Ωστόσο, το μήκος κύματος το έχουμε διαιρέσει με το 10, και είναι για παράδειγμα για το 4-(2-Pyridylazo)-Resorcinol λ=0,12999 Å και όχι 1,2999 Å, γιατί στη δεύτερη περίπτωση το πρόγραμμα θα χρειαζόταν πολλή ώρα για να προσαρμόσει τις εξισώσεις και να εξάγει αποτέλεσμα. Στην πραγματικότητα αυτός είναι ένας εύκολος τρόπος για να πραγματοποιήσουμε την αναζήτηση των πλεγματικών σταθερών στο 1/10 του τρισδιάστατου χώρου και συνεπώς ο απαιτούμενος χρόνος για αυτήν την υπολογιστική διαδικασία μειώνεται δραστικά. Αυτό που θα κάνουμε στο τέλος είναι να πολλαπλασιάσουμε τις πλεγματικές σταθερές (για τις πλευρές) με τον αριθμό 10 για να εξάγουμε τα πραγματικά μεγέθη. Εικόνα 52: Προσθήκη του μήκους κύματος της ακτινοβολίας στην οποία εκτέθηκε το δείγμα. Το μήκος κύματος για τα δείγματα ινσουλίνης με 3,5 Dihydroxybenzoic acid είναι λ = 1, Å και με 4-(2-Pyridylazo)-Resorcinol είναι λ = 1, Å. 81

83 3) Στο επόμενο βήμα, δίνουμε στο πρόγραμμα τα όρια των τιμών 2θ στα οποία θα επιλέξουμε τις κορυφές για να γίνει η επεξεργασία. Κατάλληλη είναι η περιοχή η οποία περιέχει κορυφές: Εικόνα 53: Στο κίτρινο πλαίσιο φαίνεται η περιοχή η οποία περιέχει τις περισσότερες και πιο μεγάλες κορυφές και επομένως είναι η κατάλληλη για να επιλέξουμε από αυτή τις κορυφές που θα λάβει υπόψη του το πρόγραμμα DASH. Στο πράσινο πλαίσιο οι κορυφές είναι πολύ μικρές και πολύ πυκνές οπότε δεν κάνουμε επιλογή από εκεί. Όπως φαίνεται στην παραπάνω εικόνα, η περιοχή η οποία βρίσκεται μέσα στο κίτρινο πλαίσιο είναι κατάλληλη για να επιλέξουμε από αυτή τις κορυφές που θα επεξεργαστεί το DASH, ενώ αντίθετα η περιοχή στο πράσινο πλαίσιο όχι. Το ελάχιστο όριο το θέτουμε στην τιμή 2θ λίγο πριν την πρώτη κορυφή και όχι από την αρχή του διαγράμματος όπου υπάρχει και εκεί το ένα σκέλος μιας κορυφής. Αυτό προέρχεται από το beam stop το οποίο παρεμβάλλεται ανάμεσα στη δέσμη της ακτινοβολίας σύγχροτρον και στον ανιχνευτή, ώστε να τον προστατέψει από την υψηλή ένταση της ακτινοβολίας της δέσμης που κινείται ευθύγραμμα. Εικόνα 54: Το παράθυρο επιλογής των ορίων των τιμών 2θ. 82

84 4) Στη συνέχεια, πατώντας Preview και μετά Apply, τα δεδομένα ευθυγραμμίζονται και η εικόνα είναι κάπως έτσι: Εικόνα 55: Το διάγραμμα είναι ευθυγραμμισμένο και περιλαμβάνει τις τιμές 2θ που επιλέξαμε στο προηγούμενο βήμα. 5) Πατώντας Next θα εμφανιστεί το παρακάτω: Εικόνα 56: Ελαχιστοποιούμε το παράθυρο που εμφανίζεται για να συνεχίσουμε. Σε αυτό το σημείο πρέπει να επιλέξουμε τις κορυφές που θέλουμε να λάβει υπόψη του το πρόγραμμα ούτως ώστε να μπορέσει να εξάγει τα αποτελέσματα. Οι κορυφές αυτές αντιστοιχούν στις ανακλάσεις από τα διάφορα κρυσταλλογραφικά επίπεδα. Ένα πλήθος μεταξύ 20 και 50 κορυφών θεωρείται αντιπροσωπευτικό. Προτιμάμε τις κορυφές που είναι πιο μεγάλες και μόνες τους, δεν υπάρχει δηλαδή επικάλυψη με άλλες πολύ κοντινές τους. 83

85 6) Με δεξί κλικ κάνουμε μεγέθυνση στην πρώτη κορυφή η οποία φαίνεται κάπως έτσι: Εικόνα 57: Μεγέθυνση της πρώτης κορυφής. Με το δεξί κλικ σύρουμε και επιλέγουμε μια περιοχή που γύρω από την κορυφή η οποία την περιλαμβάνει. Με τον κέρσορα στο ανώτερο άκρο της κορυφής, πατώντας Enter, προσπαθούμε να επιτύχουμε μια θέση της ευθείας όσο το δυνατόν πλησιέστερα σε αυτό το κορυφαίο σημείο: Εικόνα 58: Η επιλογή της κορυφής έχει γίνει και έχει εμφανιστεί μία ευθεία αριθμημένη η οποία πρέπει αν όχι να διέρχεται, να περνά όσο το δυνατόν πιο κοντά από το κορυφαίο σημείο της κορυφής. Κάνουμε την ίδια διαδικασία μέχρι να επιλέξουμε έναν επαρκή αριθμό κορυφών. Σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να υπάρχουν δύο κορυφές η μία πολύ κοντά στην άλλη. Τότε τις επιλέγουμε και τις δύο και με τον κέρσορα στην κορυφή της πρώτης πατάμε τον αριθμό 1 και στη δεύτερη πατάμε τον αριθμό 2 84

86 και μετά enter και για τις δύο ταυτόχρονα. Άσχετα με τους αριθμούς 1 και 2, η αρίθμηση θα συνεχιστεί κανονικά: Εικόνα 59: Δύο κορυφές πολύ κοντά η μία στην άλλη. Αν θέλουμε να αναιρέσουμε την επιλογή κάποιας κορυφής, με τον κέρσορα επάνω στο πλέγμα που έχει σχηματιστεί από την επιλογή της πατάμε το πλήκτρο delete. 7) Όταν έχει ολοκληρωθεί η διαδικασία της επιλογής των κορυφών η εικόνα στο DASH είναι η παρακάτω: Εικόνα 60:Η επιλογή των κορυφών έχει ολοκληρωθεί. 8) Συνεχίζοντας, από το παράθυρο DASH Wizard επιλέγουμε το Index pattern και μετά Next. Στο παράθυρο που προκύπτει θα επιλέξουμε όλα τα κρυσταλλικά πλέγματα (cubic, tetragonal, hexagonal, orthorhombic, monoclinic) εκτός από το triclinic το οποίο δεν είναι συνηθισμένο και θα πατήσουμε Run 85

87 Εικόνα 61: Στο κόκκινο πλαίσιο φαίνονται τα κρυσταλλικά συστήματα και εκεί είναι που κάνουμε την επιλογή ανάμεσα σε ποια να ψάξει το DASH να βρει αποτελέσματα. Θα βγουν αρκετά πιθανά αποτελέσματα και εμείς θα επιλέξουμε αυτό στο οποίο οι παράγοντες F και Μ (παράγοντες αξιοπιστίας) έχουν τις υψηλότερες τιμές. Στο παράδειγμα της παρακάτω εικόνας επιλέγεται το Hexagonal ως το κρυσταλλικό πλέγμα, γιατί οι παράγοντες αξιοπιστίας είναι οι πιο υψηλοί. Εικόνα 62: Στο παράδειγμα αυτό οι παράγοντες F και Μ που έχουν τις υψηλότερες τιμές αντιστοιχούν στο κρυσταλλικό σύστημα Hexagonal. Με ένα κλικ στο πλαίσιο αριστερά από αυτό που επιλέγουμε, κάνουμε εισαγωγή των αποτελεσμάτων στο διάγραμμα. Στο επάνω μέρος του διαγράμματος έχουν εμφανιστεί κάποιες γραμμές (εικόνα 63): 86

88 Εικόνα 63: Οι γραμμές επάνω από τις κορυφές αντιστοιχούν η κάθε μία από αυτές σε ένα επίπεδο με διαφορετικές τιμές hkl. Η κάθε μία από αυτές τις γραμμές αντιπροσωπεύει μία τριάδα αριθμών hkl (παράμετροι Miller), αντιστοιχεί δηλαδή σε ένα κρυσταλλογραφικό επίπεδο το οποίο έχει δώσει μια ανάκλαση στον ανιχνευτή. Μία επιβεβαίωση πως η επιλογή του πλέγματος Bravais που κάναμε είναι σωστή, είναι η ύπαρξη μιας τέτοιας γραμμής επάνω από κάθε κορυφή που έχουμε επιλέξει. Αν υπάρχει γραμμή επάνω από κορυφή που δεν έχουμε επιλέξει δεν υπάρχει πρόβλημα, το αντίστροφο όμως μας κάνει να επιστρέψουμε στο προηγούμενο βήμα και να επιλέξουμε κάποιο άλλο αποτέλεσμα. 9) Πατάμε Next 10) Σε αυτό το σημείο επιλέγουμε όπως φαίνεται και στην εικόνα 64, το κρυσταλλικό σύστημα που έχουμε από πριν και δοκιμάζουμε τα διάφορα space group που αντιστοιχούν σε αυτό. Όλα τα πιθανά, εκτός από αυτά που περιέχουν γράμματα (όπως για παράδειγμα το m το οποίο αντιστοιχεί στη συμμετρία καθρέπτη), γιατί αυτά δεν αναφέρονται σε χειρόμορφα μόρια όπως οι πρωτεΐνες. Επίσης μηδενίζουμε το zero point. Και σε αυτό το βήμα, σημαντικό ρόλο έχουν οι γραμμές που αντιστοιχούν στις παραμέτρους Miller. Αν το space group που επιλέγουμε είναι το σωστό, τότε υπάρχει μία τέτοια γραμμή που αντιστοιχεί σε κάθε κορυφή. Αν η επιλογή μας είναι λάθος, δεν συμβαίνει κάτι τέτοιο. 87

89 Εικόνα 64: Στο κίτρινο πλαίσιο φαίνεται η περιοχή στην οποία βάζουμε το κρυσταλλικό σύστημα που επιλέξαμε από τα αποτελέσματα του βήματος 8. Στο πράσινο πλαίσιο επιλέγουμε μεταξύ των διαφορετικών space group που αντιστοιχούν σε αυτό το κρυσταλλικό σύστημα και στο κόκκινο πλαίσιο προσέχουμε πάντα το zeropoint να είναι μηδενικό. 11) Πατώντας Next το παράθυρο που εμφανίζεται μας ενημερώνει πως θα αρχίσει η διαδικασία της βελτιστοποίησης των αποτελεσμάτων με την εφαρμογή της μεθόδου Pawley. 12) Next, και εμφανίζεται το παρακάτω Εικόνα 65: Από εδώ επιλέγουμε τους παράγοντες με βάση τους οποίους θέλουμε να γίνει η βελτιστοποίηση των αποτελεσμάτων σύμφωνα με τη μέθοδο Pawley (Pawley refinement). Σε αυτό το παράθυρο κάνουμε τους διάφορους συνδυασμούς για τη βελτιστοποίηση των δεδομένων. Μετά από κάθε κύκλο βελτιστοποίησης (αφού 88

90 επιλέξουμε με βάση ποιες παραμέτρους θέλουμε να γίνει η βελτιστοποίηση, πατάμε την επιλογή Refine ), κοιτάζουμε την τιμή του chi 2 και αν έχει μειωθεί σε σχέση με την τιμή του προηγούμενου κύκλου τότε την αποδεχόμαστε, αλλιώς την απορρίπτουμε και επιλέγουμε κάποιο διαφορετικό συνδυασμό μεταξύ των παραμέτρων. 13) Συνεχίζουμε με αυτό τον τρόπο μέχρι να αποκτήσουμε τη χαμηλότερη δυνατή τιμή του chi 2. Όταν γίνει αυτό σημειώνουμε την τιμή του, καθώς και το R wp και πατώντας Back στο παράθυρο που εμφανίζεται υπάρχει το κρυσταλλικό σύστημα, το space group του δείγματος, το zeropoint και οι πλεγματικές σταθερές της θεμελιώδους κυψελίδας. Σε αυτό το σημείο, πολλαπλασιάζουμε το αποτέλεσμα για τις πλευρές με τον αριθμό που είχαμε διαιρέσει το μήκος κύματος στο βήμα 2. 14) Πλέον έχουμε τα στοιχεία που χρειαζόμαστε, δηλαδή τις πλεγματικές σταθερές της θεμελιώδους κυψελίδας. PRODD Το πρόγραμμα PRODD έχει δημιουργηθεί με χρήση της γλώσσας προγραμματισμού PYTHON ( Χρησιμοποιείται για την εξαγωγή των εντάσεων της περιθλούσας ακτινοβολίας από τα δεδομένα περίθλασης χωρίς την χρήση δομικού μοντέλου μέσω της μεθόδου Pawley. Ένα από τα βασικά πλεονεκτήματα του προγράμματος είναι η χρήση πολλών περιθλασιγραμμάτων ταυτόχρονα το οποίο συχνά έχει ως αποτέλεσμα την εξαγωγή βέλτιστων τιμών των εντάσεων. Για τη λειτουργία του προγράμματος, απαραίτητο είναι ένα αρχείο.ccl το οποίο περιέχει όλες τις πληροφορίες που χρειάζεται το PRODD. [30] [31] Μορφή του.ccl αρχείου Ένα αρχείο.ccl έχει την παρακάτω μορφή: I NCYC 20 MCOR 0 PRIN 0 PRFO 0 PRPR 2 PRFC 2 ZBAK 0 FRIE 1 Z L SCAL

91 L SORC CN Z L PKCN *S1 TYPE 1 L RTYP L EXCL L EXCL L WGHT 3 L WVLN L ZERO L BACK L BACK L BACK L BACK L BACK L BACK L BACK L BACK L BACK L BACK L BACK L BACK L BACK L BACK L BACK L BACK L BACK L BACK L BACK L BACK L BACK Z L VARY *S1 ALL BACK L VARY *S1 ZERO 1 ** N Insulin ID31 C S GRUP I

92 L REFI DILS L PKFN *S1 TYPE 4 L PKFN SIGX E L PKFN GAMX E L PKFN SOVL E-02 L PKFN DOVL E-02 Z L VARY ALL CELL ZL VARY *S1 DOVL 1 *S1 SOVL 1 L VARY SIGX U L VARY GAMX X X DILS o Σε όποια σειρά βρίσκεται το γράμμα Ζ στην αρχή της, τότε αυτή αποτελεί σχόλιο και δεν υπεισέρχεται στην λειτουργία του προγράμματος. Αριθμός κύκλων I NCYC 20 MCOR 0 PRIN 0 PRFO 0 PRPR 2 PRFC 2 ZBAK 0 FRIE 1 Στο NCYC γράφουμε τον αριθμό των κύκλων που θέλουμε να κάνει το πρόγραμμα. Πόσες φορές δηλαδή να κάνει προσπάθειες για βελτιστοποίηση των αποτελεσμάτων. Ένας καλός αριθμός κύκλων είναι 20, αλλά εξαρτάται από το πώς μεταβάλλεται ο χ 2. Μπορεί να χρειάζονται περισσότεροι ή λιγότεροι. Όρια τιμών 2θ L RTYP Στο RTYP πρέπει να είναι πάντα ο αριθμός 2 πριν ξεκινήσουμε να λειτουργούμε το πρόγραμμα για ένα δείγμα. Μετά αυτός μεταβάλλεται, αλλά εμείς δεν επεμβαίνουμε πλέον. Δίπλα από τον αριθμό 2, θέτουμε τα όρια των θεωρητικών τιμών 2θ στα οποία το PRODD θα υπολογίσει τις θεωρητικές τιμές hkl. Τα όρια τα βλέπουμε από το WinPLOTR, από το ελάχιστο έως το μέγιστο άσχετα με την ποιότητα των κορυφών (σε αντίθεση με το DASH, εδώ βάζουμε ολόκληρο το εύρος των δεδομένων). L EXCL L EXCL

93 Εδώ θέτουμε τα όρια τα οποία αποκλείονται κάθε φορά από το πρόγραμμα. Στην επάνω σειρά βάζουμε το ελάχιστο όριο (εδώ λέει 1.5, συνήθως είναι 1.0) και στην κάτω στη θέση του 20.0 το ανώτερο όριο, το οποίο όμως κάθε φορά θα το αυξάνουμε ανάλογα και με τις υπόλοιπες τροποποιήσεις που θα κάνουμε στο αρχείο. Μήκος κύματος L WVLN Εδώ γράφουμε το μήκος κύματος της ακτινοβολίας, π.χ Å για το 4-(2-Pyridylazo)-Resorcinol. L ZERO Αυτό πρέπει να είναι 0 Τιμές 2θ L BACK L BACK L BACK L BACK L BACK L BACK L BACK L BACK o Στο πρώτο L BACK πρέπει να υπάρχει ο αριθμός 5. o Η μεσαία στήλη δείχνει τις τιμές 2θ με ελάχιστο και μέγιστο αυτά που έχουμε καθορίσει στο παραπάνω βήμα των ορίων των τιμών 2θ. o Η δεξιά στήλη είναι ο θόρυβος, η διαφορά δηλαδή ανάμεσα στα θεωρητικά και στα πραγματικά δεδομένα. o Αν έχουμε βάλει αρχικά ότι θέλουμε το PRODD να αγνοήσει τις γωνίες μεγαλύτερες από 3.0 για παράδειγμα, τότε πρέπει να βάλουμε ένα Ζ μπροστά από τις υπόλοιπες γωνίες μέχρι τη μεγαλύτερη. Έτσι το PRODD δεν θα τις λάβει υπόψη του. 92

94 Άλλες παράμετροι L VARY *S1 ALL BACK L VARY *S1 ZERO 1 ** N Insulin ID31 C S GRUP I 21 3 o Το L VARY *S1 ZERO 1 αρχικά το κλείνουμε με ένα Ζ. o Η σειρά που ξεκινά με Ν περιέχει όλα τα χαρακτηριστικά του δείγματος, όπως εδώ για παράδειγμα αναγράφεται η πρωτεΐνη ινσουλίνη και το ID31. Μπορούμε να γράψουμε οποιαδήποτε αναγνωριστική πληροφορία αφορά το δείγμα. o Στη σειρά που ξεκινά με το C γράφουμε τις πλεγματικές σταθερές του δείγματος που έχουμε βρει από το DASH για να τις βελτιστοποιήσει το PRODD. (οι πλευρές πρέπει να έχουν 6 δεκαδικά ψηφία και οι γωνίες 5 δεκαδικά ψηφία. Αν δεν υπάρχουν συμπληρώνουμε με μηδενικά). Στο S GRUP I 21 3 γράφουμε το space group το οποίο επίσης έχουμε βρει από το DASH, με κενά ανάμεσα στους χαρακτήρες. (το space group R3 γράφεται ως Ρ3). L VARY ALL CELL ZL VARY *S1 DOVL 1 *S1 SOVL 1 L VARY SIGX U L VARY GAMX X X DILS Εδώ κλείνουμε με ένα Ζ τα: L VARY ALL CELL, L VARY SIGX U, L VARY GAMX X Οι X DILS είναι παράμετροι για τη βελτιστοποίηση των ελάχιστων τετραγώνων. Πορεία επεξεργασίας με το PRODD Όπως προαναφέρθηκε, για το PRODD χρησιμοποιείται η γλώσσα python για να δίνονται οι διάφορες εντολές. Η python είναι μια φιλική προς τον χρήστη γλώσσα προγραμματισμού η οποία μας δίνει τεράστιες δυνατότητες. Η διαδικασία που 93

95 ακολουθούμε για ένα εύρος τιμών 2θ (για παράδειγμα αρχίζουμε με τις γωνίες ) είναι να επιτρέπουμε την σταδιακή μεταβολή των παραμέτρων (ξεκινώντας με το L VARY *S1 ZERO 1 διαγράφοντας το Ζ στην αρχή της εντολής). Δίνουμε την εντολή για να πραγματοποιηθούν οι κύκλοι βελτιστοποίησης. Συνεχίζουμε με το L VARY ALL CELL και δίνουμε την εντολή για να γίνει η βελτιστοποίηση. Κατόπιν βελτιστοποιούμε το σχήμα των προσομοιωμένων κορυφών περίθλασης με χρήση των εντολών L VARY GAMX X και L VARY SIGX U. Έχει ολοκληρωθεί ο πρώτος κύκλος επεξεργασίας. Αυτό που κάνουμε στη συνέχεια είναι να ανοίγουμε μία μία τις γωνίες (αφαιρώντας το Ζ μπροστά από τη στήλη τους και βάζοντάς τες και στο όριο μέχρι το οποίο θέλουμε να υπολογίσει). Επαναλαμβάνουμε την παραπάνω διαδικασία με σταδιακή αύξηση του εύρους τιμών 2θ. Όταν τελειώσει αυτή η διαδικασία, εξάγουμε από το αρχείο.ccl το zeropoint και από το αρχείο.lis που έχει δημιουργηθεί όλα τα υπόλοιπα, δηλαδή τις πλεγματικές σταθερές (a,b,c,α,β,γ), το chi 2 και το R wp. 94

96 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Κρύσταλλοι Μέσα στις επόμενες δύο ημέρες που ακολούθησαν τα πειράματα της κρυστάλλωσης, οι κρύσταλλοι είχαν σχηματιστεί. Οπότε και έγινε η παρατήρηση σε οπτικό μικροσκόπιο (μεγέθυνση 40) για όλα τα δείγματα κρυστάλλων ινσουλίνης με τους δύο διαφορετικούς προσδέτες. Όπως διαπιστώθηκε κατά την διάρκεια των πειραμάτων στο ESRF, ένας περιορισμένος αριθμός κρυσταλλικών δειγμάτων αντιστοιχεί σε άλας που είχε χρησιμοποιηθεί στο στάδιο της κρυστάλλωσης και όχι σε κρυσταλλικά πολύμορφα ινσουλίνης. Επίσης σε συγκεκριμένες περιπτώσεις οι συνθήκες κρυστάλλωσης δεν απέδωσαν κρυσταλλικά αλλά άμορφα δείγματα. Οι συνθήκες αυτές αντιστοιχούν σε χαμηλές τιμές ph (~ 4-5) οι οποίες αποκλίνουν σημαντικά από το ισοηλεκτρικό σημείο της ινσουλίνης (ph ~ 5.5) στην περιοχή του οποίου συνήθως αναπτύσσονται ευκολότερα κρύσταλλοι πρωτεϊνών. [4] Όπως έχει αναφερθεί και προηγουμένως, από τη μορφολογία των κρυστάλλων δεν μπορούμε να βγάλουμε συμπέρασμα για τα κρυσταλλογραφικά χαρακτηριστικά τους (την τρισδιάστατη δομή τους σε ατομικό επίπεδο). Αυτό είναι κάτι που αποκτάται μόνο με τα πειράματα που ακολούθησαν και αφορούσαν την έκθεση των κρυστάλλων στην ακτινοβολία σύγχροτρον. Είναι αξιοσημείωτο να αναφέρουμε πως οι κρύσταλλοι μετά την έκθεσή τους στις ακτίνες Χ καταστρέφονται και η καταστροφή είναι μη αντιστρεπτή. Η μελέτη της καταστροφικής επίδρασης της ακτινοβολίας σε κρυστάλλους βιολογικών μακρομορίων και οι σχετικοί μηχανισμοί που συμβάλλουν στην μη αντιστρεπτή καταστροφή του κρυσταλλογραφικού πλέγματος αποτελούν αντικείμενο έρευνας προσελκύοντας ιδιαίτερο ενδιαφέρον παγκοσμίως. [32] Κρύσταλλοι ινσουλίνης με 3,5-Dihydroxybenzoic acid Ακολουθούν οι εικόνες των κρυστάλλων που αναπτύχθηκαν κατά την διάρκεια της συγκρυστάλλωσης ανθρώπινης ινσουλίνης με τον προσδέτη 3,5- Dihydroxybenzoic acid. (εικόνες 66 και 67) 95

97 Εικόνα 66: Oι κρύσταλλοι ινσουλίνης-3,5-dihydroxybenzoic acid στα ph Εικόνα 67: Οι κρύσταλλοι ινσουλίνης-3,5-dihydroxybenzoic acid στα ph

98 Κρύσταλλοι ινσουλίνης με 4-(2-Pyridylazo)-Resorcinol Εικόνα 68: Κρύσταλλοι ινσουλίνης-4-(2-pyridylazo)-resorcinol στα ph Εικόνα 69: Κρύσταλλοι ινσουλίνης-4-(2-pyridylazo)-resorcinol στα ph

99 Αποτελέσματα από το ESRF Όπως προαναφέραμε σε κάποιες περιπτώσεις δειγμάτων είχε κρυσταλλωθεί άλας και όχι ινσουλίνη. Επίσης κυρίως σε χαμηλά ph, τα οποία απέχουν από το ισοηλεκτρικό σημείο, δεν πήραμε κατάλληλα αποτελέσματα με τη χρήση των συγκεκριμένων πρωτοκόλλων. Ένα δείγμα το οποίο είναι άμορφο και δεν δίνει αποτελέσματα έχει την παρακάτω μορφή: Εικόνα 70: Τα αποτελέσματα στο WinPLOTR από την περίθλαση στους κρυστάλλους ινσουλίνης-3,5-dihydroxybenzoic acid σε ph=5.35. Αντίθετα, ένα δείγμα που μας δίνει κατάλληλα για επεξεργασία αποτελέσματα είναι όπως στην εικόνα 53. Από τα δείγματα που προετοιμάστηκαν στο εργαστήριο πήραμε τα εξής αποτελέσματα σχετικά με τον κρυσταλλικό ή μη χαρακτήρα τους: ph με 3,5-Dihydroxybenzoic acid ως προσδέτη, η ινσουλίνη: με 4-(2-Pyridylazo)-Resorcinol ως προσδέτη, η ινσουλίνη: 4.77 δεν κρυσταλλώθηκε δεν κρυσταλλώθηκε 5.35 δεν κρυσταλλώθηκε δεν κρυσταλλώθηκε 5.67 Κρυσταλλώθηκε δεν κρυσταλλώθηκε 5.97 Κρυσταλλώθηκε δεν κρυσταλλώθηκε 6.57 Κρυσταλλώθηκε κρυσταλλώθηκε 7.12 Κρυσταλλώθηκε κρυσταλλώθηκε 7.76 Κρυσταλλώθηκε κρυσταλλώθηκε 8.39 (όχι δείγμα με αυτό το ph) κρυσταλλώθηκε 8.68 Κρυσταλλώθηκε (όχι δείγμα με αυτό το ph) Πίνακας 10: Πίνακας που δείχνει σε ποια pη προέκυψαν κρύσταλλοι της ινσουλίνης. 98

100 Αποτελέσματα από το DASH Το πρώτο πρόγραμμα που χρησιμοποιήθηκε για τη διαδικασία του Indexing ήταν το DASH και έδωσε αποτελέσματα για τις πλεγματικές σταθερές των κρυσταλλικών δειγμάτων τα οποία δίνονται παρακάτω: Από την ανάλυση στο DASH και για το 3,5-Dihydroxybenzoic acid ως προσδέτη, προέκυψαν: ph Κρυσταλλικό Space a (Å) b (Å) c (Å) α β Γ σύστημα group 5.67 Τριγωνικό R3 82, , , o 90 o 120 o 5.97 Τριγωνικό R3 82, , , o 90 o 120 o 6.57 Τριγωνικό R3 82, , , o 90 o 120 o 7.76 Τριγωνικό R3 80, , , o 90 o 120 o 8.68 Τριγωνικό R3 80, , , o 90 o 120 o Πίνακας 11: Οι πλεγματικές σταθερές και το space group για τα κρυσταλλικά δείγματα με προσδέτη το 3,5-Dihydroxybenzoic acid όπως προέκυψαν από το πρόγραμμα DASH. ph Όγκος μοναδιαίας κυψελίδας Rwp chi 2 Zeropoint , ,55 1,322-0, , ,89 1,643-0, , ,27 1,163-0, , ,16 1,278-0, , ,61 1,373-0,0034 Πίνακας 12: Τιμές των υπόλοιπων παραμέτρων των κρυσταλλικών δειγμάτων με προσδέτη το 3,5-Dihydroxybenzoic acid όπως προέκυψαν από το πρόγραμμα DASH. Οι τιμές του chi 2 είναι αποδεκτές καθώς πλησιάζουν τη μονάδα. Άρα υπάρχει μεγάλη αξιοπιστία στα αποτελέσματα του DASH. Τα δεδομένα που αντιστοιχούν στο δείγμα που κρυσταλλώθηκε σε ph=7.12 δεν αναλύθηκαν, διότι πρόκειται για μια περίπτωση συνύπαρξης περισσότερων της 99

101 μίας φάσης κάτι που αυξάνει το βαθμό δυσκολίας για το σωστό προσδιορισμό των επιμέρους χαρακτηριστικών. Συγκρίνοντας το διάγραμμα έντασης-2θ του κρυσταλλικού δείγματος με ph=7.12 με τα αντίστοιχα διαγράμματα των δειγμάτων με ph=6.57 και ph=7.76, διαπιστώθηκε πως κάποιες από τις κορυφές του 7.12 είναι κοινές με κορυφές του 6.57 ενώ άλλες είναι κοινές με κορυφές του Άρα στο δείγμα με αυτό το ph είναι πιθανό κάποιοι κρύσταλλοι να έχουν τις πλεγματικές σταθερές του δείγματος με ph=6.57 και κάποιοι άλλοι με τις σταθερές του δείγματος με ph=7.76. Παραπάνω βλέπουμε πως το space group είναι R3. Πρέπει να πούμε πως η κυψελίδα R είναι μοναδική στους εξαγωνικούς κρυστάλλους. Υπάρχουν δύο εσωτερικά σημεία (όπως φαίνεται στην εικόνα 71), τα οποία χωρίζουν τη διαγώνιο της κυψελίδας σε τρία ίσα τμήματα. Είναι το μόνο πλέγμα Bravais με περισσότερα του ενός εσωτερικά σημεία και χαρακτηρίζεται ως ρομβοεδρικό (R). Αυτή η διάταξη με τα δύο εσωτερικά σημεία επάνω στη διαγώνιο, βοηθά για την απεικόνιση της εξαγωνικής φύσης και της σχέσης που υπάρχει ανάμεσα στους ρομβοεδρικούς κρυστάλλους και στους κανονικούς τριγωνικούς ή εξαγωνικούς. [XIII] Εικόνα 71: Το πλέγμα R με τα δύο εσωτερικά σημεία του (πηγή: 100