Πρώτη μορφή ζωής στο πλανήτη με ηλικία 3,5-4 δις ετών. Βιομάζα 25 φορές > της βιομάζας των ζώων

Transcript

1 Μικροοργανισμοί Ορισμός Πρώτη μορφή ζωής στο πλανήτη με ηλικία 3,5-4 δις ετών Βιομάζα 25 φορές > της βιομάζας των ζώων Προκαρυωτικοί-Ευκαρυωτικοί

2 Μικροβιολογία Ασχολείται με τη δομή, θρέψη, αναπαραγωγή, κληρονομικότητα, χημική δραστηριότητα, προσδιορισμό, αναγνώριση και την κατανομή όλων των μικροοργανισμών Βασική επιστήμη (χημικά και φυσικά πρότυπα των πορειών της ζωής) Εφαρμοσμένη βιολογική επιστήμη (διαχειρίζεται σημαντικά βιολογικά προβλήματα της Ιατρικής, Γεωργίας και Βιομηχανίας) Διάκριση σε: Ιολογία, Βακτηριολογία, Μυκητολογία, Μικροβιολογία Περιβάλλοντος, Μικροβιακή Γενετική και Μοριακή Μικροβιολογία

3 Ιστορία Μικροβιολογίας Αριστοτέλης: Θεωρία αυτόματης γένεσης 100 πχ. Lucretius: οι ασθένειες οφείλονται σε αόρατα έμβια όντα μΧ. Antony van Leeuwenhoek: παρατηρεί τα πρώτα μικροσκοπικά δείγματα Redi: οι μεγάλοι ζώντες οργανισμοί δεν προέρχονται αυτόματα από μη ζώντες οργανισμούς 1864 Pasteur: «δεν υπάρχουν γνωστές συνθήκες οι οποίες να επιτρέπουν στα μικροσκοπικά όντα να γεννιούνται χωρίς την ύπαρξη πανομοιότυπων γονικών όντων

4 Ιστορία Μικροβιολογίας (συνέχεια) Χρυσή Εποχή της Μικροβιολογίας Koch: ανακαλύπτει πολλά παθογόνα βακτήρια (βακτήριο του άνθρακα), αποδεικνύει την εξειδίκευση των μικροβίων για την πρόκληση συγκεκριμένων ασθενειών και ανακαλύπτει πολλές χρήσιμες μικροβιακές τεχνικές και την χρήση του άγαρ Ehrlich: Έρευνα στις χρωστικές και προτείνει τη χρώση βακτηρίων για καλύτερη μικροσκοπική παρατήρηση Lister: Ασηψία και τεχνική ανοσοποίησης Fleming: Ανακάλυψη πενικιλλίνης 1941 Beadle και Tatum: Ύπαρξη μεταλλαγμένων στελεχών 1943 Avery, MacLeod και McCarty: DNA γενετικό υλικό των οργανισμών Μικροοργανισμοί πρότυπο εργαλείο Γενετικής και Βιολογικών φαινομένων

5 Η συμβολή των μικροοργανισμών στο πλανήτη γή Πληθυσμοί Ενδιαίτημα Κοινωνίες Επίδραση μικροοργανισμών στον άνθρωπο Θετικές και αρνητικές επιδράσεις Έλεγχος μολυσματικών ασθενειών AIDS, καρκίνος Επίδραση μικροοργανισμών στη γεωργία Σχέση μικροοργανισμών στους κύκλους θρέψης φυτών (αζώτου, άνθρακα, θείου) Σχέση μικροοργανισμών με τις πορείες πέψης των μηρυκαστικών ζώων Πρόκληση ασθενειών στα φυτά

6 Η συμβολή των μικροοργανισμών στο πλανήτη γή (συνέχεια) Επίδραση μικροοργανισμών στη Βιομηχανία Τροφίμων Επιβλαβής δράση Οικονομικές απώλειες (φθορές, διατήρηση) Ωφέλιμη δράση Ζυμώσεις Παραγωγή ουσιών (κιτρικό, αμινοξέα) Επίδραση μικροοργανισμών στην ανακύκλωση του νερού Βιολογικός καθαρισμός

7 Η συμβολή των μικροοργανισμών στο πλανήτη γή (συνέχεια) Βιοεξυγείανση Χρήση μικροοργανισμών στη διαδικασία αποικοδόμησης των ρυπαντών (Bacillus, Pseudomonas) Παραγωγή ενζύμων που διασπούν ρυπαντές, ή διάσπαση ρυπαντών για παραγωγή ενέργειας Μικροοργανισμοί και ενέργεια Φωτοσύνθεση Μικροβιακή βιομάζα ως βιοκαύσιμο

8 Η συμβολή των μικροοργανισμών στο πλανήτη γή (συνέχεια) Βιοτεχνολογία και μέλλον Εφαρμογές των γενετικών διαδικασιών όπου δημιουργούνται καινούργιοι μικροοργανισμοί ικανοί να παράγουν ειδικά προϊόντα μεγάλης εμπορικής αξίας (ινσουλίνη, εμβόλια ηπατίτιδας Β, ελονοσίας, γρίπης)

9 Στοιχειώδης Βιοχημεία του Μικροβιακού Κυττάρου Τα βασικά σωματίδια είναι: ηλεκτρόνιο (-1) πρωτόνιο (+1) Νετρόνιο Συνδυασμοί τους σχηματίζουν τα άτομα Άτομα είναι τα μικρότερα συστατικά ενός χημικού συνδυασμού και στη φύση υπάρχουν 92 (καλούνται στοιχεία) Στα κύτταρα υπάρχουν μόνο 6 στοιχεία σε μεγάλες ποσότητες: H, O, C, N, P, S.

10 Στοιχειώδης Βιοχημεία του Μικροβιακού Κυττάρου Τα άτομα ενώνονται μεταξύ τους με δεσμούς και δημιουργούν τα μόρια. Ομοιοπολικοί (όταν τα ηλεκτρόνια είναι ισότιμα μοιρασμένα ανάμεσα στα άτομα) Ετεροπολικοί (όταν τα ηλεκτρόνια δεν είναι ισότιμα μοιρασμένα ανάμεσα στα άτομα) Δεσμοί υδρογόνου (μεταξύ Η και Ο ή Η και Ν). Ασθενείς δεσμοί που όμως όταν δημιουργούνται μεταξύ των μακρομορίων η σταθερότητα του μορίου αυξάνεται πολύ.

11 Στοιχειώδης Βιοχημεία του Μικροβιακού Κυττάρου Τα κύτταρα περιέχουν 70-90% κβ. νερό και μέσα στο νερό λαμβάνουν χώρα όλες οι βιοχημικές αντιδράσεις. Το νερό παίρνει μέρος σε όλες τις βιοχημικές αντιδράσεις (υδρολύσεις) Η ζωή ξεκίνησε από το νερό και όπου υπάρχει νερό (ακόμα και 350 C) υπάρχουν μικροοργανισμοί

12 Μόρια του κυττάρου Μακρομόρια Μονομερή Πολυσακχαρίτες Λιπίδια Νουκλεϊκά οξέα Πρωτεϊνες Σάκχαρα Λιπαρά οξέα Νουκλεοτίδια αμινοξέα

13 Υδατάνθρακες C:H:O 1:2:1 πχ σάκχαρα Οι κοινοί περιέχουν 4, 5, 6, και 7 άτομα C Πολυσακχαρίτες Μονομερή που ενώνονται με γλυκοσιδικούς δεσμούς Συνδυάζονται και με άλλα μόρια όπως Πρωτεϊνες (γλυκοπρωτεϊνες) Λιπίδια (γλυκολιπίδια)

14 Λιπαρά οξέα Διακρίνουμε υδρόφιλες και υδρόφοβες περιοχές Κορεσμένα (στεαρικό)-ακόρεστα (ολεϊκό) Απλά λιπίδια αποτελούνται μόνο από λιπαρά οξέα Σύμπλοκα λιπίδια (φωσφολιπίδια)

15 Νουκλεϊκά Οξέα DNA δεσοξυροβονουκλεϊκό οξύ Περιέχει τη γενετική πληροφορία RNA ριβονουκλεϊκό οξύ Ενδιάμεσο μόριο μεταφοράς της γενετικής πληροφορίας Αποτελούνται από πεντόζη (ριβόζη ή δεσοξυριβόζη), βάση αζώτου και ένα φωσφορικό μόριο Μονομερή: νουκλεοτίδια Πουρίνες (αδενίνη, γουανίνη) Πυριμιδίνες (κυτοσίνη, ουρακίλη, θυμίνη)

16 DNA πάντα δίκλωνο (ιοί) RNA πάντα μονόκλωνο (ιοί) Αναδιπλώσεις - δευτεροταγής δομή mrna messenger trna transfer rrna ribosomal Πρωτεϊνες Αμινοξέα Πεπτιδικοί δεσμοί Καταλυτικές - Δομικές

17

18 Θεμελιώδεις αρχές κυτταρικής ζωής Στη Βιολογία ισχύει ο θεμελιώδης νόμος της Φυσικής «τα μόρια και τα άτομα διευθετούνται με τυχαίο τρόπο» Στοιχεία: C, H, O, N, S, P Ενέργεια από το περιβάλλον Έλλειψη της = κυτταρικός θάνατος

19 Θεμελιώδεις αρχές κυτταρικής ζωής (Συνέχεια) Το πρώτο κύτταρο προήλθε από το συνδυασμό κάποιων στοιχείων, τα οποία μέσω διαφόρων χημικών αντιδράσεων είχαν σαν αποτέλεσμα τη δημιουργία μιας "μη κυτταρικής δομής» από την οποία προήλθε η προ-κυτταρική δομή

20 Τα βασικά χαρακτηριστικά του ζώντος κυττάρου Θεμελιώδεις αρχές της ζωής 1. Θρέψη του κυττάρου: Πρόσληψη χημικών συστατικών από το περιβάλλον και έκκριση προϊόντων του κυττάρου στο περιβάλλον 2. Αύξηση και αναπαραγωγή του κυττάρου: Χημικά συστατικά του περιβάλλοντος μετατρέπονται σε κυτταρικά συστατικά κάτω από τον έλεγχο των γονικών κυττάρων 3. Διαφοροποίηση: Μια μορφή διαφοροποίησης σε ένα μονοκύτταρο μικροοργανισμό είναι η δομή του σπορίου, συνήθως σαν στάδιο του κύκλου αύξησης του μικροοργανισμού

21 Τα βασικά χαρακτηριστικά του ζώντος κυττάρου Θεμελιώδεις αρχές της ζωής 4. Χημική σηματοδότηση: Τα κύτταρα επικοινωνούν ή αλληλεπιδρούν κυρίως μέσω χημικών ουσιών που απελευθερώνονται ή προσλαμβάνονται από αυτά 5. Εξέλιξη: Τα κύτταρα εξελισσόμενα εμφανίζουν σταδιακά νέες βιολογικές ιδιότητες. Τα φυλογενετικά δένδρα παρουσιάζουν την εξελικτική σχέση και συγγένεια μεταξύ των κυττάρων

22 Θεωρίες εξέλιξης μικροοργανισμών (Λινναίος) Φυτά Μύκητες Ζώα Πρώτιστα (Haeckel) (ευκαρυωτικά φύκη και πρωτόζωα) Προκαρυωτικά (βακτήρια) Προγονικές μορφές

23 Μέχρι το 1977: προκαρυωτικοί = πρόγονοι όλων των οργανισμών (προ-) Βάσει του rrna που μεταλλάσσεται αργά: Βακτήρια Αρχαιοβακτήρια Ευκαρυωτικά Κοινός πρόγονος Αρχή ζωής

24 Θεωρίες εξέλιξης μικροοργανισμών (Συνέχεια) Ενδοσυμβιοτική Θεωρία Νεότερα -πρεσβύτερα ευκαρυωτικά Βακτήρια (χλωροπλάστες, μιτοχόνδρια)

25 Ταξινόμηση μικροοργανισμών (Λινναίος) Λατινική γλώσσα Δύο ονόματα: Γένος (με κεφαλαίο το πρώτο γράμμα) Είδος (με μικρό το πρώτο γράμμα) Είτε με italics είτε υπογραμμίζονται Το όνομα του γένους τη πρώτη φορά που αναφέρεται στο κείμενο είναι ολόκληρο. Στη συνέχεια συντομεύεται με το πρώτο γράμμα, τελεία και το όνομα του είδους. Staphylococcus aureus S. aureus Το όνομα συνήθως δίνει κάποια χαρακτηριστικά

26 Κανόνες Ταξινόμησης 1. Χρήση όλης της υπάρχουσας πληροφορίας 2. Εφαρμογή κοινής λογικής σε κάθε βήμα 3. Χρήση ελάχιστου αριθμού βιοδοκιμών όπου: 1. Καθαρή καλλιέργεια 2. Καθορισμός θρεπτικών απαιτήσεων 3. Μικροσκοπική εξέταση 4. Εξέταση αυξητικών παραγόντων

27 Μικροβιακό κύτταρο Δομές: Ευκαρυωτική-Προκαρυωτική Και οι δυο δομές έχουν παρόμοια χημική σύσταση και χρησιμοποιούν τις ίδιες χημικές αντιδράσεις για μεταβολισμό, αποθήκευση ενέργειας και σύνθεση πρωτεϊνών Διαφέρουν ως προς τη δομή κυτταρικού τοιχώματος και μεμβρανών και τη παρουσία οργανιδίων Στα προκαρυωτικά το DNA δεν καλύπτεται από μεμβράνη και δεν σχετίζεται με ιστόνες Στα προκαρυωτικά (κυτταρικό τοίχωμαπεπτιδογλυκάνη) και συνήθως διαιρούνται με διχοτόμηση

28 Προκαρυωτικό κύτταρο-μορφολογικά χαρακτηριστικά Μέγεθος: 0,5-1,0 μm πλάτος / 2,0-100 μm μήκος. Το μέγεθος μεταβάλλεται κατά τη διάρκεια του κύκλου αύξησης Σχήμα: Κόκκοι-βάκιλλοι-σπειρίλλια Διάταξεις βακτηριακών κυττάρων

29 Χημική Σύσταση Προκαρυωτικών Νερό: 70-85% επί του νωπού βάρους του κυττάρου

30 DNA 3-4% RNA 10-20% Πρωτεϊνες 50% Πολυμερή τοιχώματος 20% Λιπίδια 10% C 50% O 20% N 10-15% H 10% P 2-6% S Μικρό ποσοστό H 2 O 70-85%

31 Δομή Το βακτηριακό κύτταρο αποτελείται από διαφορετικές δομές που λειτουργούν συγχρόνως. Κάποιες είναι κοινές για όλα τα είδη, κάποιες υπάρχουν μόνο σε κάποια είδη και κάποιες υπάρχουν μόνο κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες περιβάλλοντος. Κυτόπλασμα με DNA, ριβοσώματα, αποταμιευτικά υλικά και άλλα κυτταρικά έγκλειστα πλασματική μεμβράνη

32 Μαστίγια, ινίδια, κροσσοί Έξω από το κυτταρικό τοίχωμα Μαστίγια: Λεπτές, νηματοειδείς μορφές από τη κυτταρική μεμβράνη διαμέσου του κυτταρικού τοιχώματος. Προφέρουν κίνηση Ινίδια και κροσσοί: Λεπτότερα, μικρότερα, πιο ευθύγραμμα και περισσότερα από τα μαστίγια. Χρησιμοποιούνται για προσκόλληση. Κυρίως στα Gram-. Παράγοντας F (δότες-δέκτες βακτηριακής σύζευξης).

33 Κυτταρικό τοίχωμα Προσδίδει στερεότητα στο κύτταρο Απαραίτητο για τη κυτταρική διαίρεση και αύξηση του κυττάρου Διαφέρει σε πάχος από βακτήριο σε βακτήριο (ταξινόμηση). Περίεχει ένα πολυμερές που λέγεται πεπτιδογλυκάνη (μουρεϊνη) και που είναι αδιάλυτο, πολύ δυνατό και άκαμπτο Φράγμα για κάποιες ουσίες ενώ επιτρέπει την είσοδο θρεπτικών συστατικών

34 Κυτταρικό τοίχωμα (συνέχεια) Με βάσει το πάχος του τα βακτήρια χωρίζονται σε δύο ομάδες: Gram+: περισσότερη πεπτιδογλυκάνη (= ή > του 50%). Εμπεριέχονται και πολυσακχαρίτες και τειχικά οξέα) Gram-: λεπτότερο τοίχωμα (με λιποπολυσακχαρίτες) που όμως καλύπτεται από εξωτερική μεμβράνη

35 Χρώση κατά Gram: Τα κύτταρα βάφονται με κρυσταλλικό ιώδες και ιώδιο. Αποχρωματίζονται με αλκοόλη. Όταν ένα αρνητικό κατά Gram βακτήριο εκπλυθεί με αλκοόλη τα λιπίδια της εξωτερικής μεμβράνης διαλύονται και απομακρύνονται Αποσταθεροποίηση εξωτερικής μεμβράνης και αύξηση διαπερατότητας της. Το σύμπλοκο κρυσταλλικού ιώδους και ιωδίου εκπλένεται. Αποχρωματισμός κυττάρου

36 Γλυκοκάλυκας (κάψα) Αποτελείται από πολυμερή Λειτουργίες: προσκόλληση βακτηρίου σε επιφάνειες, προστασία από αφυδάτωση και δράση ιών Συγκρατεί μεγάλη ποσότητα νερού Κάψα: όταν έχει συγκροτημένη δομή και καλή επαφή με κυτταρικό τοίχωμα Βλέννα: όταν είναι λεπτό, χαλαρό, υδατοδιαλυτό στρώμα

37 Κυτοπλασματική μεμβράνη Μεταξύ τοιχώματος και κυτοπλάσματος Αποτελείται από δύο στρώματα 2-3nm και ένα 4-5nm Χημική σύσταση: Λιπίδια (20-50% ουδέτερα και φωσφολιπίδια), πρωτεϊνες (50%) και εξόζες (3-30%)

38 Κυτοπλασματική μεμβράνη (συνέχεια) Μεταφορά ουσιών Διαβάθμιση συγκέντρωσης ή ηλεκτρικού δυναμικού Ενεργός μεταφορά Λειτουργίες: Εκλεκτική πρόσληψη ή αποβολή ουσιών Ένζυμα που εμπλέκονται στη παραγωγή ενέργειας (ATP) και σύνθεση κυτταρικού τοιχώματος Σύνθεση μεμβρανικών πρωτεϊνών, εκκριτικών πρωτεϊνών, λιπιδίων Συμμετέχει στο διαχωρισμό του DNA, μεταφορά ηλεκτρονίων κατά την αναπνοή και φωτοσύνθεση

39 Μεσοσωμάτια Μεμβρανώδη σωμάτια που περιβάλλονται από απλή μεμβράνη που είναι προεκτάσεις της κυτοπλασματικής μεμβράνης Έρχονται σ επαφή με τη κυτοπλασματική μεμβράνη και το χρωμόσωμα: Λαμβάνουν μέρος στο διπλασιασμό του DNA Συμμετέχουν στη κυτταρική διαίρεση

40

41 Έγκλειστα κυτοπλάσματος Μεταχρωματικοί κόκκοι Μεγάλα σε μέγεθος έγκλειστα που χρωματίζονται κόκκινα με μπλε χρωστικές. Αποθέματα P, πηγές ενέργειας Χαρακτηριστικοί για το Corynebacterium diphtheriae όπου έχουν διαγνωστική σημασία Κόκκοι πολυσακχαρικής φύσης Από γλυκογόνο ή άμυλο Με ιώδιο χρωματίζονται καφεκόκκινο ή μπλε αντίστοιχα

42 Έγκλειστα κυτοπλάσματος (συνέχεια) Λιπιδικά έγκλειστα Στα γένη Mycobacterium, Bacillus, Azotobacter κ.α. Κοινό για τα βακτήρια έγκλειστο το πολυ-βυδροξυβουτυρικό οξύ (αποταμιευτικό προϊόν) Έγκλειστα θείου Τα θειοβακτήρια αποκτούν ενέργεια με την οξείδωση του θείου και των ενώσεων του Οι κόκκοι θείου είναι γι αυτά ενεργειακά αποθέματα

43 Έγκλειστα κυτοπλάσματος (συνέχεια) Καρβοξυσώματα Πολυεδρικά ή εξαγωνικά έγκλειστα που περιέχουν το ένζυμο ριβουλο 1,5-διφωσφορική καρβοξυλάση Απαραίτητο στα βακτήρια που χρησιμοποιούν το CO 2 σαν πηγή άνθρακα Κυστίδια αερίου Σε βακτήρια του υδάτινου περιβάλλοντος Ρόλος: Διατήρηση της άνωσης των κυττάρων ώστε το κύτταρο να παραμένει στο σωστό βάθος στο νερό και να προσλαμβάνουν ικανές ποσότητες οξυγόνου, φωτός και θρεπτικών

44 Αδρανείς σχηματισμοί: Ενδοσπόρια Σπόρια ή κύστεις που δημιουργούνται εντός του κυττάρου Αποκλειστικά στα βακτήρια Μεταβολικά ανενεργείς σε δυσμενείς συνθήκες περιβάλλοντος (ξηρασία, υψηλές θερμοκρασίες) Σε ευνοϊκές συνθήκες περιβάλλοντος βλαστάνουν και ακολουθούν το κύκλο ζωής ενός κανονικού κυττάρου Συνήθως στα γένη Bacillus και Clostridium Παχύ τοίχωμα και διαθλαστικά Μικρότερη κυτταρική υγρασία και μεγάλες ποσότητες διπικολινικού οξέως Δοκιμασία για ενδοσπόρια: 80 ο C για 10 min. 30 ο C για 24 h. Αποικίες= ενδόσπόρια

45 Βακτηριακή πυρηνική περιοχή Αποτελείται από το DNA που καταλαμβάνει συγκεκριμένη περιοχή στο κυτόπλασμα (δεν είναι διάχυτο παντού) Σε μη αυξανόμενο κύτταρο είναι περίπου σφαιρικό Σε αυξανόμενο κύτταρο είναι μια ακανόνιστου σχήματος μάζα DNA από την οποία εκτείνονται θηλιές στο κυτόπλασμα Το πυρηνικό υλικό διαιρείται πριν από το κύτταρο

46 Χημική δομή-διπλασιασμός του DNA Ο διπλασιασμός του DNA γίνεται ημισυντηρητικά Ο διπλασιασμός του DNA είναι μήνυμα για κυτταροδιαίρεση Η ολοκλήρωση του εγκάρσιου τοιχώματος είναι μήνυμα για νέα διαίρεση του DNA Κάθε βακτήριο έχει ένα γονότυπο που αποτελείται από το DNA του κυττάρου και τα πλασμίδια (πιθανά ολική κληρονομήσιμη πληροφορία) Φαινότυπος εξαρτάται από το ποσοστό του γενετικού υλικού που έχει εκφραστεί κάτω από τις συγκεκριμένες συνθήκες περιβάλλοντος Ένας γονότυπος έχει πολλούς φαινότυπους

47 Χημική δομή-διπλασιασμός του DNA (συνέχεια) Αλλαγές στο γενετικό υλικό συμβαίνουν σπάνια (1 στο εκατομμύριο) Υπάρχουν τεχνικές στο εργαστήριο (ακτινοβολία, ακτίνες Χ, χημικές ουσίες, χρήση αντιβιοτικών, προσβολή του βακτηρίου από ιό) που αυξάνουν το ποσοστό Η μεταλλαγή είναι μια αλλαγή στη νουκλεοτιδική ακολουθία ενός γονιδίου. Κληρονομήσιμη Ο ανασυνδυασμός είναι η πορεία που οδηγεί σε νέο συνδυασμό γονιδίων ενός χρωμοσώματος. Γενετικά στοιχεία που βρίσκονται σε δύο διαφορετικά γονιδιώματα έρχονται σ επαφή και ενώνονται δίδοντας ένα νέο συνδυασμό γονιδίων

48 Χημική δομή-διπλασιασμός του DNA (συνέχεια) Τρόποι ανασυνδυασμού: Μεταγωγή (μέσω ιών) Μετασχηματισμό (ευκολότερα μεταφέρεται το χρωμοσωμικό απ ότι το πλασμιδιακό DNA Σύζευξη (απαιτείται κυτταρική επαφή) Παράγοντας F δότες-δέκτες

49 Χημική δομή-διπλασιασμός του DNA (συνέχεια) Οι προκαρυωτικοί οργανισμοί μπορεί να περιέχουν: Χρωμόσωμα: Εξαιρετικά μακρύ, διπλό, κυκλικό μόριο DNA Πλασμίδιο: Σχετικά κοντό, ευθύ ή κυκλικό μόριο DNA Ιό: Απλό ή διπλό DNA ή RNA Μεταθετικά στοιχεία: Διπλό μόριο DNA πάντα εντός ενός άλλου μορίου DNA

50 Πλασμίδια Συνήθως κυκλικά (σπανίως ευθύγραμμα) μόρια DNA Περιέχουν γονίδια Υπάρχουν και αντιγράφονται ανεξάρτητα από το υπόλοιπο DNA, αλλά συγχρόνως με αυτό Έχουν βρεθεί στους περισσότερους μικροοργανισμούς και σε λίγους μόνο ευκαρυωτικούς Περισσότερα από ένα πλασμίδια στο κύτταρο Επίσωμα: πλασμίδιο ενσωματωμένο στο χρωμόσωμα που έχει χάσει την ικανότητα της αυτόνομης αντιγραφής του

51 Πλασμίδια Φέρουν γονίδια που: Ελέγχουν την αντιγραφή τους στο κύτταροξενιστή Επιτρέπουν τη μεταφορά των πλασμιδίων από το ένα κύτταρο στο άλλο Αγνώστων χαρακτηριστικών Διαφέρουν από τους ιούς: Δεν προκαλούν βλάβη στα κύτταρα-ξενιστές (αντίθετα είναι ωφέλιμα) Δεν έχουν εξωτερική μορφή ενώ οι ιοί έχουν

52 Συνεισφορά πλασμιδίων στην Οικολογία Πολλές φαινοτυπικές λειτουργίες οφείλονται στα πλασμίδια Πρώτες ενδείξεις μετά τη χρήση αντιβιοτικώνπλασμίδια R Πρωταρχικό ρόλο στην αναδιοργάνωση του γενετικού υλικού των βακτηρίων και οδηγεί στη διασπορά γονιδίων ανάμεσα σε άτομα του ίδιου ή και διαφορετικού πληθυσμού Διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην επιβίωση του οργανισμού κάτω από συνθήκες πίεσης

53

54 Ευκαρυωτικό Κύτταρο Φύκη, πρωτόζωα, μύκητες, ζώα, φυτά Οι τρεις πρώτες ομάδες ανήκουν στους μικροοργανισμούς Πολυπλοκότερο του προκαρυωτικού Μέγεθος: Μεγάλη διακύμανση στο μέγεθος (διάμετρος= μm) Το μεγαλύτερο μέγεθος δίνει στο κύτταρο της μεγαλύτερης προσαρμοστικότητας αφού υπάρχει διαθέσιμος χώρος για το γενετικό υλικό και τα ένζυμα Σχήμα: Ποικίλει από απλό σφαιρικό, ωοειδές έως και νηματοειδές

55 Ευκαρυωτικό Κύτταρο (συνέχεια) Χημική σύσταση Παρόμοια με αυτήν του προκαρυωτικού Δομή Βασική διαφορά η ύπαρξη περιβάλλονται από μεμβράνη οργανιδίων που Μικρονημάτια: διαμέτρου 4-7nm διάχυτα στο κυτόπλασμα ή οργανωμένα. Σημαντικά για τη κίνηση και τις αλλαγές του σχήματος Μικροσωλινίσκοι: Νηματοειδή οργανίδια, λεπτά, διαμέτρου 25nm, πρωτεϊνικής φύσης. Ρόλο στη διατήρηση του κυτταρικού σχήματος, κίνηση και ενδοκυτταρική μεταφορά ουσιών

56 Ευκαρυωτικό Κύτταρο (συνέχεια) Ενδοπλασματικό δίκτυο: Δίκτυο μεμβρανών που δημιουργούν σακκίδια. Δύο τύποι: τραχύ και λείο. Σημαντικό για τη μεταφορά πρωτεϊνών, λιπιδίων και ίσως και άλλων ουσιών μέσα στο κύτταρο. Τα λίπη και οι πρωτεϊνες συντίθενται από ένζυμα που σχετίζονται με το Ε.Δ. και οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες συντίθενται στα ριβοσώματα του τραχέως Ε.Δ.

57 Ευκαρυωτικό Κύτταρο (συνέχεια) Σύμπλοκο Σύστημα Golgi: Μεμβρανώδες σύστημα που δημιουργεί σακκίδια χωρισμένα μεταξύ τους όπου δεν υπάρχουν ριβοσώματα. Σε όλα σχεδόν τα ευκαρυωτικά. Σε μερικούς μύκητες, όπου δεν είναι πολύ καλά δομημένο. Αποθηκεύονται ουσίες που προορίζονται για έκκριση και συμμετέχει στη δημιουργία μεμβρανών. Στους μύκητες προσφέρει υλικό για την επέκταση του κυτταρικού τοιχώματος και την επάκρια αύξηση των υφών Σχετίζεται με το λείο Ε.Δ. τόσο δομικά όσο και λειτουργικά

58 Ευκαρυωτικό Κύτταρο (συνέχεια) Λυσοσωμάτιο και Εδοκύτωση: Συντίθενται από το σύστημα Golgi και το Ε.Δ. Σφαιρικά και περιβάλλονται από απλή μεμβράνη Περιέχουν πεπτικά ένζυμα μακρομορίων (ενδοκύτωση) Ευκαρυωτικά ριβοσώματα: 80S ριβόσωμα διμερές από 60S υποομάδα και 40S. Κάποια ενωμένα με το τραχύ Ε. Δ. Διαφέρουν από τα 70S ριβοσώματα των προκαρυωτικών (αντιβιοτικά) Συμβάλλουν στη πρωτεϊνοσύνθεση

59 Ευκαρυωτικό Κύτταρο (συνέχεια) Μιτοχόνδρια: Υπάρχουν στα περισσότερα ευκαρυωτικά Κύκλος τρικαρβοξυλικού οξέως, αναγέννηση του ATP μέσω μεταφοράς ηλεκτρονίων, οξειδωτική φωσφορυλίωση Αποτελούνται από εξωτερική διπλή μεμβράνη, ριβοσώματα, DNA,μεγάλους κρυστάλλους Ca 3 (PO 4 ) 2. Το DNA τους είναι κυκλικό Χλωροπλάστες: Υπάρχουν στα φύκη και περιέχουν χρωστικές όπως χλωροφύλλη, καροτένια κλπ Χρησιμοποιούν το φως για να μετατρέψουν το CO 2 και το H 2 O σε υδατάνθρακες και Ο 2 (φωτοσύνθεση) Συνηθως ωοειδείς και περιέχουν DNA, ριβοσώματα, λιπίδια, άμυλο

60 Ευκαρυωτικό Κύτταρο (συνέχεια) Ευκαρυωτικός πυρήνας και κυτταρική διαίρεση: Κέντρο ελέγχου και γενετικής πληροφορίας Περιβάλλεται από πυρηνική μεμβράνη μέσα στην οποία υπάρχουν τα χρωμοσώματα Στη πυρηνική μεμβράνη υπάρχουν πόροι από όπου γίνεται επικοινωνία πυρήνα-κυτοπλάσματος (RNA) Πορείες μίτωσης και μείωσης απαραίτητες για σωστή χρωμοσωμική σύνθεση θυγατρικών κυττάρων Απλοειδής αριθμός χρωμοσωμάτων χαρακτηριστικός του είδους αλλά υπάρχουν ζύμες πολυπλοειδείς ή ανευπλοειδείς.

61 Ευκαρυωτικό Κύτταρο (συνέχεια) Ευκαρυωτικός πυρήνας και κυτταρική διαίρεση: Ανασυνδυασμός κατά την αναπαραγωγή Εναλλαγή απλοειδούς-διπλοειδούς γενεάς σύνηθες στους μύκητες Συνολική γενετική πληροφορία του ευκαρυωτικού προέρχεται: Χρωμόσωμα, πλασμίδια, μιτοχόνδρια/χλωροπλάστες, ιό, μεταθετά στοιχεία Κύτταρα όπως οι ζύμες Saccharomyces cerevisiae διαιρούνται με εκβλάστηση ενώ οι μυκητιακές υφές με επάκρια αύξηση

62 Ευκαρυωτικό Κύτταρο (συνέχεια) Κυτταρικό τοίχωμα: Πολλά ευκαρυωτικά κύτταρα δεν έχουν τοίχωμα Άλλα (φύκη, μύκητες) έχουν άκαμπτο τοίχωμα από πολυσακχαρίτες (γλυκάνη, χιτίνη, κυτταρίνη). Στα κύτταρα αυτά δεν επιτρέπεται η φαγοκύττωση έτσι τα μόνα θρεπτικά συστατικά που δέχονται είναι διαλυτές ουσίες που διέρχονται μέσα από το κυτταρικό τοίχωμα Πλεονεκτήματα του τοιχώματος: οι υφές των μυκήτων διατρυπούν τους ιστούς του ξενιστή ή δεν δημιουργούνται οσμωτικά προβλήματα

63

64 Βιολογία των Ιών Ενδείξεις για την ύπαρξη ιών λόγω της μόλυνσης που προκαλούν στα ανώτερα ζώα και φυτά Προσπάθειες για τον έλεγχο της ασθένειας ευλογιά ξεκίνησαν στη Κίνα πριν από 2000 χρόνια. Το 1885 ο Pasteur αναπτύσσει το εμβόλιο της λύσσας Η ιολογία των φυτών άρχισε το 1886 όταν ο Mayer ανακάλυψε τη μολυσματική φύση της μωσαϊκής του καπνού Το 1892 ο Ivanovski αναφέρει ότι ο παράγοντας της μωσαϊκής του καπνού μπορεί να περνά μέσα από μικροβιοκρατικά φίλτρα Το 1898 οι Loeffler και Frosch αποδεικνύουν ότι ο παράγοντας που προκαλεί τον αφθώδη πυρετό στα βοωειδή διέρχεται μέσω ηθμού και με το διήθημα μολύνονται υγιή ζώα.

65 Βιολογία των Ιών Το 1935 κρυσταλλώνεται ο ιός της μωσαϊκής του καπνού και παράλληλα με τη χρήση ηλεκτρονικού μικροσκοπίου αποδείχθηκε πως οι ιοί είναι συμπλέγματα νουκλεϊκών οξέων και πρωτεϊνών και η μορφολογία των πρωτεϊνών του καψιδίου ποικίλει Σήμερα γνωρίζουμε ότι οι ιοί παρασιτούν σε όλα τα είδη οργανισμών

66 Ορισμός Αντιπροσωπεύουν το όριο ανάμεσα στους ζώντες οργανισμούς και στις μη ζωντανές δομές Το νουκλεϊκό τους οξύ δεν δρα συνεχώς γι αυτό και χρησιμοποιούμε τους όρους λειτουργικά ενεργοί ή αδρανείς Virus: λατινικά το δηλητήριο Virion: το μολυσματικό σωματίδιο του ιού Χαρακτηριστικά: σύσταση, απλή οργάνωση, μηχανισμός αναπαραγωγής

67 Βακτήρια Rickettsiae Ιοί Ενδοκυτταρικά παράσιτα Κυτοπλασματική μεμβράνη Αγενής αναπαραγωγή Διηθητά μέσω <2nm πόρους Ύπαρξη DNA και RNA Μεταβολισμός/αναγέννηση ATP + +/- - Ριβοσώματα Ευαισθησία στα αντιβιοτικά Ευαισθησία στις ιντερφερόνες - - +

68 Γενικά χαρακτηριστικά Υπάρχουν σε όλες τις μορφές ζωής Υποχρεωτικά παράσιτα άρα ανίκανα να αναπτυχθούν σε θρεπτικά υποστρώματα Ξεχωρίζουν από: το μέγεθος: μικρότεροι από τα βακτήρια. Ορατοί μόνο με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο το περιεχόμενο νουκλεϊκό οξύ: Μόνο ένα τύπο νουκλεϊκού οξέως (DNA ή RNA) που περικλείεται σ ένα πρωτεϊνικό μανδύα ή περίβλημα (envelope)

69 Γενικά χαρακτηριστικά τις μεταβολικές ιδιότητες: Δεν έχουν μεταβολικούς μηχανισμούς. Χρησιμοποιούν την ενέργεια και το σύστημα παραγωγής πρωτεϊνών του ξενιστή για την αναπαραγωγή τους. Διακρίνονται δύο μορφές: ενδοκυτταρική και εξωκυτταρική (πακέτο γονιδίων)

70 Χημική σύσταση Νουκλεϊκό οξύ: είτε DNA είτε RNA μονόκλωνο ή δίκλωνο, ευθύ ή κυκλικό (1-50%). Μπορεί να περιέχουν από 3 γονίδια μέχρι και 400. Σε μερικούς ιούς το γενετικό υλικό είναι τεμαχισμένο. Πρωτεϊνη: Συνήθως αποτελεί το μεγαλύτερο τμήμα του ιού (50-90%). Ρόλος της η προστασία του γενετικού υλικού και φέρει υποδοχείς για τη προσκόλληση του ιού στο ξενιστικό κύτταρο Εκτός από τις δομικές πρωτεϊνες μερικοί ιοί περιέχουν ένζυμα (λυσοζύμη) που διευκολύνουν την είσοδο του νουκλεϊκού οξέως του ιού στο κύτταρο ή πολυμεράσες Οι μεγαλύτεροι ιοί έχουν επί πλέον λιπίδια με τα οποία σχηματίζουν ένα στρώμα λιπιπρωτεϊνης

71 Δομή ιών Το σωματίδιο του ιού αποτελείται από νουκλεϊκό οξύ που περιβάλλεται από πρωτεϊνικό κάλυμμα το καψίδιο. Το νουκλεϊκό οξύ μαζί με το καψίδιο αποτελούν το νουκλεοκαψίδιο. Σε μερικούς ιούς το νουκλοκαψίδιο περιβάλλεται από τον μανδύα. Μερικοί ιοί έχουν πιο πολύπλοκη δομή (κεφαλή, ουρά)

72 Αντιγραφή ιών Αντιγράφονται μόνο σε ζωντανά κύυταρα «Αντιγραφή» γιατί η πορεία πολλαπλασιασμού τους είναι διαφορετική απ εκείνη των κυττάρων Ο τρόπος εισόδου διαφέρει από ιό σε ιό Το καψίδιο δεν εισέρχεται στο ξενιστικό κύτταρο Μελετήθηκαν ουσιαστικά οι βακτηριοφάγοι αλλά ο τρόπος αντιγραφής είναι παρόμοιος σε όλους του ιούς Ο χρόνος που απαιτείται για να ολοκληρωθεί ο βιολογικός κύκλος του ιού είναι min ως και 6-40 hr

73 Αντιγραφή ιών Οι φάσεις της πορείας αντιγραφής του ιού είναι: Προσρόφηση Διείσδυση Ενδοκυτταρική ανάπτυξη Πρώϊμα στάδια αντιγραφής Αντιγραφή νουκλεϊκού οξέως του ιού Σύνθεση πρωτεϊνών του ιού Συναρμολόγηση Ωρίμανση και απελευθέρωση των νέων ιών Λύση του ξενιστικού κυττάρου

74 Ιοί βακτηρίων: Βακτηριοφάγοι ή φάγοι Κύκλοι: Λυτικός ( φάγοι λοιμογόνοι) Λυσιγενείας (φάγοι υπολοιμογόνοι) Βιοδοκιμή της παρουσίας των φάγων Εμφάνιση διαφανών περιοχών σε στερεοποιημένη καλλιέργεια βακτηρίων: πλάκα. Ισχύει για τους λυτικούς μόνο φάγους.

75

76 Φυτικοί ιοί Λιγότερο μελετημένοι Δύσκολο να απομονωθούν ώστε να μελετηθούν Αρκετοί μεταφέρονται με έντομα και μελετώνται σε ιστοκαλλιέργειες εντόμων Ιός μωσαϊκής του καπνού (TMV) Απομονώνεται από πρωτοπλάστες φυτικών κυττάρων

77 Μορφολογία του σωματιδίου φυτικού ιού Αρκετοί έχουν ελικοειδές εύκαμπτο ή άκαμπτο καψίδιο (TMV), άλλοι εικοσαεδρικό Οι περισσότεροι έχουν ένα τύπο πρωτεϊνης και είναι RNA ιοί

78 Αντιγραφή φυτικών ιών Το γενετικό υλικό Με RNA-εξαρτώμενη RNA πολυμεράση που αντιγράφει το ιϊκό RNA ή Με ιϊκή-ειδική RNA αντιγραφάση Η πρωτεϊνη του καψιδίου δημιουργείται βάσει του γονιδιώματος του ιού Η συναρμολόγηση του ιού είναι αυτόματη διαδικασία

79 Μετάδοση φυτικών ιών Μεταδίδονται σε μεγάλες αποστάσεις μέσω του αγγειώδους ιστού Εξάπλωση γίνεται κυρίως μέσω: τραυμάτων φυτικού ιστού γύρη νηματώδεις Έντομα (αφίδες) Μόλυνση προφανής από τις κηλίδες στους φυτικούς ιστούς (έλλειψη χλωροφύλλης) TMV: μεταφέρεται από κύτταρο σε κύτταρο. Απαιτούνται ειδικές πρωτεϊνες. Μηχανισμός δράσης όχι καλά μελετημένος.

80 Ζωϊκοί ιοί Η είσοδος του ιού γίνεται με ενδοκύττωση (ολόκληρος ο ιός εισέρχεται στο ξενιστικό κύτταρο). Ο διαχωρισμός του γενετικού υλικού από το καψίδιο γίνεται εντός του ξενιστού. RNA ιοί Ρετροϊοί με διαδοχική φάση αντιγραφής RNA και DNA και υπεύθυνοι για διάφορα είδη καρκίνου και AIDS DNA ιοί Αντιγραφή διαμερισματοποιημένη Αντιγραφή DNA (από τη ξενιστική DNA-πολυμεράση) και μεταγραφή RNA γίνεται στο πυρήνα. Ακολουθούν οι μετατροπές στο RNA ώστε να γίνει «ώριμο RNA» Μετάφραση στο κυτόπλασμα

81 Αντιγραφή ζωϊκών ιών Ίδια στάδια με αυτά των βακτηριοφάγων (8-40 ώρες) 1. Μελέτη σε ιστοκαλλιέργειες Πολλοί ιοί έχουν ένα μόνο είδος ξενιστικού κυττάρου ή περιορισμένο αριθμό ξενιστικών κυττάρων στα οποία μπορούν να πολλαπλασιαστούν Η κυτταρική ευαισθησία του ξενιστή επηρεάζεται από: παρουσία υποδοχέων του ιού πάνω στη μεμβράνη ικανότητα του κυττάρου να λειτουργήσουν οι κατάλληλες πορείες μέχρι να αρχίσει η αντιγραφή του ιού

82 Μέσο αναπαραγωγής ζωϊκών ιών (για παραγωγή αντιγόνων και διάγνωση της ασθένειας) η καλλιέργεια ζωϊκών ιστών Εύχρηστες όσες περιέχουν ενεργά πολλαπλασιαζόμενα ιστοκύτταρα Συνήθως ιστοί ζώου εν ζωή ή που μόλις έχει νεκρωθεί Επεξεργασμένοι με ελαφρά πρωτεολυτικά ένζυμα (αποδιοργάνωση αλλά ζωντανά) Καλλιέργεια (σε ειδικά τρυβλία) σε θρεπτικά υποστρώματα με αντιβιοτικά Προσκόλληση στην επιφάνεια του τρυβλίου και ανάπτυξη σε monolayer κυττάρων Πιθανόν να υπάρχουν ιοί σε λανθάνουσα κατάσταση σε τέτοιες καλλιέργειες

83 2. Χρήση ζώων Η μόλυνση αναγνωρίζεται από χαρακτηριστικά σημάδια και συμπτώματα της ασθένειας Ευαισθησία στη μόλυνση Πιθανότητα λανθάνουσας μόλυνσης με τον ίδιο ή άλλο ιό (λανθάνοντες ιοί που διεγείρονται) Τρόπος εμβολιασμού Ευρέως διαδεδομένος ξενιστής ζωϊκών ιών το αναπτυσσόμενο έμβρυο κότας όπου αναπτύσσονται και κάποιοι ιοί θηλαστικών και στους οποίους το κοτόπουλο δεν είναι ευαίσθητο

84 Προσρόφηση Προσκόλληση συγκεκριμένης πρωτεϊνης του ιού σε αντίστοιχη συγκεκριμένη θέση (υποδοχέα/πρωτεϊνη ή γλυκοπρωτεϊνη) του ξενιστικού κυττάρου Στο μηχανισμό της προσρόφησης στηρίζονται σκευάσματα ενάντια της μόλυνσης από τον ιό

85 Διείσδυση Στους ιούς με μανδύα γίνεται με: Ενδοκύττωση: η κυτοπλασματική μεμβράνη αναδιπλώνεται δημιουργώντας κενοτόπια που εγκλωβίζουν στοιχεία από το εξωτερικό του κυττάρου. Δυνατόν να εγκλωβιστεί και ιός. Εάν υπάρχει καψίδιο διαλύεται μαζί με το περιεχόμενο του κενοτοπίου και ελευθερώνεται το νουκλεϊκό οξύ. Σύντηξη του μανδύα με την κυτοπλασματική μεμβράνη και απελευθέρωση του καψιδίου στο κυτόπλασμα (HIV)

86 Ενδοκυτταρική ανάπτυξη Διαχωρισμός ιϊκού νουκλεϊκού οξέως από το καψίδιο Με τη χρήση λυσοσωμικών ενζύμων

87 DNA ιοί Βιοσύνθεση του ιϊκού DNA Το DNA των ζωϊκών ιών (συνήθως διπλασιάζεται στο πυρήνα χρησιμοποιώντας τα ιϊκά ένζυμα ενώ οι πρωτεϊνες συνθέτονται στο πρωτόπλασμα με ένζυμα του ξενιστικού κυττάρου

88 Ιοί papova (papovavirures): Δεν υπάρχουν ένζυμα στο σωματίδιο του ιού. Αναγκαστικά χρησιμοποιεί τα ξενιστικά. Δίκλωνο κυκλικό DNA. Πχ. SV40 ογκοιός. Ιοί έρπητα (herpesviruses): Δίκλωνο ευθύ DNA. Κυστώδης πυρετός κρυώματος, αφροδισιακός έρπης, ανεμοβλογιά, έρπης ζωστήρ, λοιμώδης μονοπυρήνωση κ.α. Μερικοί ιοί έρπητα προκαλούν καρκίνο Η σύνθεση του DNA γίνεται στο πυρήνα, όπου συντίθεται και όλο το νουκλεοκαψίδιο. Ο μανδύας του ιού αποκτάται κατά την εκβλάστηση του νέου σωματιδίου του ιού από τη πυρηνική μεμβράνη

89 Ιοί pox: Μεγάλη ομάδα και μεγάλου μεγέθους ιοί. Δίκλωνο DNA, πρωτεϊνούχο διπλό στρώμα, άλλα πρωτεϊνικά στρώματα και μεμβρανικό κάλυμμα. Αντιγράφονται στο κυτόπλασμα. Είσοδος με φαγοκύτωση. Απελευθέρωση με τη λύση του κυττάρου. Smallpox προσβάλλει μόνο ανθρώπους και πιθήκους. Ο ιός pox προσβάλλει βοοειδή, λαγούς, πρόβατα. Κοινά αντιγόνα. Αδενοιοί (adenoviruses): Ευθύ δίκλωνο DNA που αντιγράφεται στο πυρήνα. Ελαφρά αναπνευστικά προβλήματα.

90 RNA ιοί Picornaviruses +RNA +/-RNA +RNA ιϊκή αντιγραφάση (ιϊκό) αντιγραφόμενη μορφή πρωτεϊνες (ξενιστής-πρωτεϊνάσες καψιδίου ιός)

91 RNA ιοί Ρεοϊοί πρωτεϊνες +/-RNA +mrna μεταγραφάσες αντιγραφάση +/-RNA (ιϊκό)

92 RNA ιοί Ιοί με αρνητικό μονόκλωνο RNA (ιλαράς, παρωτίτιδας) ιϊκή μεταγραφάση -RNA ιϊκή αντιγραφάση +mrna +/-RNA πρωτεϊνες -RNA (ιϊκό)

93 RNA ιοί Ρετροϊοί (Rous sarcoma, HIV) RNA εξαρτώμενη DNA πολυμεράση +RNA -DNA +/-DNA Αντίστροφη Αντιγραφάση μεταγραφάση μεταγραφή +RNA +mrna πρωτεϊνη

94 Ρετροϊοί Χαρακτηριστικό τους η αντίστροφη μεταγραφάση που διεξάγει την αντίδραση: RNA DNA Αρχικά συνθέτει ένα συμπληρωματικό κλώνο DNA που στη συνέχεια αντιγράφεται για το σχηματισμό του δίκλωνου μορίου DNA. Το ιϊκό DNA ενσωματώνεται στο ξενιστικό και ποτέ δεν αποκόπτεται από το ξενιστικό χρωμόσωμα. Επειδή η ενσωμάτωση είναι μέρος του κύκλου της ζωής των ιών, η συχνότητα της είναι πολύ ψηλή και μπορεί να συμβεί σ οποιαδήποτε θέση του χρωμοσώματος.

95 Ωρίμανση και Απελευθέρωση Συναρμολόγηση του πρωτεϊνικού καψιδίου Απόκτηση (σε πολλούς) του λιποπρωτεϊνικού μανδύα όπου: Οι πρωτεϊνες συντίθενται από τον ιό Οι υδατάνθρακες και τα λίπη από τη κυτοπλασματική μεμβράνη του ξενιστή. Ο μανδύας περιβάλλει το καψίδιο κατά τη πορεία της εκβλάστησης

96 Συσχέτιση ιών και πλασμιδίων-ογκογόνοι ιοί Οι κακοήθεις όγκοι (καρκινώματα) μπορεί να προκύψουν με διαφορετικούς τρόπους. Ανεξάρτητα από την ογκογόνο διαδικασία, η τελική κακοήθης αύξηση κατευθύνεται από το DNA των ελεύθερα πολλαπλασιαζομένων κυττάρων. Η μετατροπή του κυττάρου σε καρκινικό οφείλεται σε μετασχηματισμό ή επαναπροσανατολισμό του DNA. Ο παράγοντας που ενεργοποιεί το πολλαπλασιασμό των κυττάρων είναι ένα γονιδιακό προϊόν.

97 Σχηματισμός φυτικών όγκων Παρουσιάζονται σε πολλά φυτά (στο 50% που έχουν εξεταστεί) και μειώνουν τη ροή των θρεπτικών μέσα στο φυτό Αποκαλούνται: καρκίνος του βλαστού (crown galls) και Καρκίνος ρίζας (root galls) Μόλυνση με Agrobacterium tumefaciens Περίτριχα μαστιγωτό, Gram -, βακτήριο του εδάφους που μοιάζει με Rhizobium. Μόλυνση από πληγές Πολλαπλασιασμός στους μεσοκυττάριους χώρους Τα μολυσματικά στελέχη έχουν το Ti πλασμίδιο

98 Σχηματισμός φυτικών όγκων Μετά τη μόλυνση του φυτού από το μολυσματικό βακτήριο τα πλασμίδια ενσωματώνονται στο φυτικό χρωμοσωμικό DNA Ευθύνεται για τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό κυττάρων (όγκος) Μετάδοση σε άλλα φυτά με μεταμόσχευση τμήματός του. Μετά τον ογκογονικό μετασχηματισμό βακτήριο και πλασμίδιο μπορεί να καταστραφούν Το πλασμιδιακό DNA είναι υπεύθυνο για τη παραγωγή των οπινών (οκτοπίνη και νοπαλίνη), αμινοξέων που χρησιμοποιούνται ως πηγές αζώτου μόνο από το βακτήριο

99 Σχηματισμός φυτικών όγκων Το Ti πλασμίδιο χρησιμοποιείται ως φορέας για τη μεταφορά εξωγενούς DNA στα φυτά. Το γονίδιο που καθορίζει την ανάπτυξη του όγκου αποκόπτεται από το πλασμίδιο και αντικαθίσταται με άλλα γονίδια Τα γονίδια του ξένου DNA προφανώς συμπεριφέρονται ως επικρατή γονίδια

100 Σχηματισμός ζωϊκών όγκων από ιούς Οι μελέτες γίνονται σε ιστοκαλλιέργειες που χάνουν την ιδιότητα να αυξάνονται σε monolayer παρουσία ογκογόνων ιών. Ο SV40 και οι Polyoma ιοί(dna ιός) μπορούν να ενσωματώσουν το DNA τους στο γονιδίωμα του ξενιστή. Το μετασχηματισμένο αυτό ξενιστικό DNA προκαλεί το σχηματισμό όγκων όταν ενίεται σε πειραματόζωα. RNA ιοί (ρετροιοί) και ο Rous sarcoma ιός στα κοτόπουλα

101 Ταξινόμηση ιών Αρχικά βασίστηκε στις ασθένειες που προκαλούν. Σήμερα, υπάρχει διεθνές σύστημα ταξινόμησης των ιών στο οποίο φέρουν λατινικό όνομα Εύκολος διαχωρισμός είναι η διαίρεση τους σε DNA (κυρίως βακτηριοφάγοι και οι μεγάλοι ιοί ζώων) και RNA (ιοί φυτών, μικροί ιοί ζώων και λίγοι βακτηριοφάγοι) ιούς

102 Ιοειδή Γυμνά μόρια RNA υπεύθυνα για κάποιες ασθένειες φυτών (πατάτες, κίτρα, αγγούρια, χρυσάνθεμα, κοκκοφοίνικες και άλλα φυτά) Κυκλικά, μονόκλωνα RNA κατά 10 φορές μικρότερα από το πιο μικρό γνωστό ιικό RNA. Περιέχονται περίπου αντίγραφα σε κάθε μολυσμένο κύτταρο Δεν είναι γνωστός ο μολυσματικός τους μηχανισμός

103 ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΘΡΕΨΗ

104 Η χημική σύσταση του κυττάρου προσδιορίζει ως ένα βαθμό και τις βασικές θρεπτικές του απαιτήσεις: 70-90% νωπού βάρους νερό C, O, N, H, P, S συστατικά των υδατανθράκων, λιπιδίων, πρωτεϊνών, νουκλεϊκών οξέων και K, Ca, Mg, Fe, Cl αποτελούν το 95% του ξηρού βάρους των κυττάρων

105 C Όλες οι οργανικές ουσίες περιέχουν C με εξαίρεση το CO 2. Ο C αποτελεί το σκελετό των υδατανθράκων, πρωτεϊνών και λιπιδίων (ενέργεια και δομικά συστατικά του κυττάρου) Ως προς τις απαιτήσεις τους για άνθρακα οι μικροοργανισμοί διακρίνονται σε αυτότροφους και ετερότροφους

106 N Δεύτερο σημαντικό στοιχείο. Βασικό συστατικό των αμινοξέων (πρωτεϊνες) Ως προς τις απαιτήσεις τους για άζωτο τα βακτήρια διακρίνονται σε: Αυτά που μπορούν να χρησιμοποιούν το ατμοσφαιρικό (αέριο άζωτο) με τη διαδικασία της δέσμευσης αζώτου π.χ. Rhizobium, Azotobacter, Clostridium Αυτά που χρησιμοποιούν ανόργανες πηγές αζώτου (νιτρικά και νιτρώδη) Αυτά που απαιτούν το άζωτο σε οργανικές ενώσεις (αμινοξέα, πεπτίδια)

107 O Πολλά μεταβολικά συστήματα των μικροοργανισμών απαιτούν οξυγόνο για τη λειτουργία της αερόβιας αναπνοής. Βάσει των απαιτήσεων τους για O 2, οι μικροοργανισμοί διακρίνονται σε: Αερόβιους που χρησιμοποιούν το μοριακό οξυγόνο και παράγουν περισσότερη ενέργεια (υποχρεωτικά αερόβιοι, δυνητικά αναερόβιοι) Αναερόβιους που δεν χρησιμοποιούν το μοριακό οξυγόνο (υποχρεωτικά αναερόβιοι, αεροανθεκτικά αναερόβιοι, μικροαερόφιλοι) Υπεροξειδικές ρίζες υπεροξεδική δισμουτάση H 2 O 2 καταλάση [OH - ]

108 P Συστατικό νουκλεϊκών οξέων, φωσφολιπιδίων, πρωτεϊνών, συμπαραγόντων ενζύμων, και άλλων κυτταρικών δομών. Όλοι σχεδόν οι μικροοργανισμοί χρησιμοποιούν ανόργανα φωσφορικά άλατα σαν πηγές P που αφομοιώνουν άμεσα.

109 S Απαραίτητο για αμινοξέα, υδατάνθρακες, βιοτίνη, θειαμίνη. Μερικοί μικροοργανισμοί χρησιμοποιούν τα θειικά άλατα σαν πηγή θείου, άλλοι απαιτούν ανηγμένες μορφές θείου (κυστεϊνη)

110 K: απαιτείται για την ενεργότητα ενζύμων όπως εκείνων που εμπλέκονται στη πρωτεϊνοσύνθεση Ca: συμβάλλει στη θερμική ανθεκτικότητα των ενδοσπορίων Mg: συμπαράγοντας σε πολλά ενζυμικά συστήματα και σταθεροποιεί τα ριβοσώματα και τις κυτταρικές μεμβράνες Fe: μέρος των κυτοχρωμάτων και συμπαράγοντας ενζύμων και πρωτεϊνών που μεταφέρουν e -.

111 Ιχνοστοιχεία: Ni, Mn, Co, Cu, Mo, Zn Απαραίτητα σε πολύ μικρές ποσότητες για τη θρέψη. Συμπαράγοντες σε βασικά ενζυμικά σύμπλοκα

112 Αυξητικοί παράγοντες: Αμινοξέα (για σύνθεση πρωτεϊνών) Πουρίνες-πυριμιδίνες (για σύνθεση νουκλεϊκών οξέων) Βιταμίνες (συνθέτουν μέρος ή ολόκληρους ενζυμικούς παράγοντες)

113 ΚΑΤΗΓΟΡΙΕΣ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΑΝΑΛΟΓΑ ΜΕ ΤΟΝ ΤΡΟΠΟ ΘΡΕΨΗΣ

114 Ως προς τη πηγή άνθρακα Αυτότροφοι: που χρησιμοποιούν ως μόνη ή κύρια πηγή άνθρακα το CO 2 και χρησιμοποιούν ως κύρια πηγή ενέργειας το φως Ετερότροφοι: που χρησιμοποιούν οργανικές ενώσεις ως κύρια πηγή άνθρακα Όλες οι οργανικές ενώσεις μπορούν να χρησιμοποιηθούν σαν πηγές άνθρακα ή και ενέργειας από κάποιο μικροοργανισμό, π.χ. Pseudomonas: χρησιμοποιεί >100 οργανικές ενώσεις Μεθανογενή βακτήρια: πηγές άνθρακα μόνο μεθάνιο και αλκοόλη Ακτινομύκητες: άμυλο, γλυκόλη, παραφίνη, ελαστικά Κυτταρινολυτικά βακτήρια: μόνο κυτταρίνη

115 Ως προς τη πηγή ενέργειας Δύο πηγές ενέργειας: φως και οξείδωση οργανικών και ανόργανων ουσιών Φωτοτροφικοί Χημειότροφοι Χημειοοργανότροφοι (οργανικές ουσίες) Χημειολιθότροφοι (ανόργανες ουσίες)

116 Ως προς τη πηγή H + ή και ηλεκτρονίων Λιθότροφοι: αναγωγικές ανόργανες ουσίες σαν πηγή ηλεκτρονίων Οργανότροφοι: οργανικές ουσίες οι δότες ηλεκτρονίων ή ατόμων H +

117 Συνδυασμός απαιτήσεων σε C, ενέργεια, H + ή και e - 1. Φωτολιθοτροφικοί αυτότροφοι ή φωτοαυτότροφοι: χρησιμοποιούν το φως ως πηγή ενέργειας και το CO 2 ως πηγή άνθρακα 2. Φωτοοργανοτροφικοί ετερότροφοι ή φωτοετερότροφοι: φωτοσυνθετικοί που χρησιμοποιούν οργανικές ουσίες ως δότη e - και ως πηγή C I. Φωτοαυτότροφοι οργανισμοί: H + ως δότη e - 3. Χημειολιθοτροφικοί αυτότροφοι: οξειδώνουν αναγωγικές ανόργανες ενώσεις (Fe, N, S) για ενέργεια και e - I. Μυξότροφα:οργανικές και ανόργανες πηγές ενέργειας 4. Χημειοοργανοτροφικοί ετερότροφοι ή χημειοετερότροφοι: χρησιμοποιούν οργανικές ουσίες σαν πηγές ενέργειας, H +, e - και C. Συνήθως το ίδιο υλικό ικανοποιεί όλες τις απαιτήσεις.

118 Μικροβιολογικά Θρεπτικά Υποστρώματα Κάθε υγρό ή στερεό μέσο το οποίο μπορεί να καλύψει τις ανάγκες ενός μικροβιακού κυττάρου. Περιέχει απαραίτητα νερό, πηγή C, πηγή ενέργειας, πηγή N και πηγή αλάτων. Συχνά η πηγή C και N είναι η ίδια χημική ουσία

119 Κατηγορίες Μικροβιολογικών Θ. Υ. Ι. Ως προς τη χημική σύσταση (γνωστή ή άγνωστη) Χημικώς ορισμένα Θ. Υ. ή συνθετικά Υ. : Η χημική τους σύσταση είναι πλήρως γνωστή. Σύνθετα ή εμπειρικά Θ. Υ. (ή και πολύπλοκα ή φυσικά): Η σύστασή τους άγνωστη. Πλούσια σε θρεπτικά συστατικά και συνήθως καλύπτουν τις θρεπτικές απαιτήσεις πολλών διαφορετικών μικροοργανισμών π.χ. πεπτόνες, εκχύλισμα κρέατος, εκχύλισμα ζύμης (θρεπτικός ζωμός, TSB, MacConkey)

120 Κατηγορίες Μικροβιολογικών Θ. Υ. ΙI. Ως προς το είδος των μικροοργανισμών που αναπτύσσονται σ αυτά Εκλεκτικά Θ.Υ.: Ευνοούν την αύξηση συγκεκριμένων μ/ο. Χολικά άλατα, φουξίνη, κρυσταλλικό ιώδες αναστέλλουν τα Gram + ευνοώντας την αύξηση των Gram βακτηρίων π. χ. MacConkey. Διαγνωστικά Θ.Υ.: Δυνατός ο διαχωρισμός ανάμεσα σε ομάδες π. χ. αιματούχο, MacConkey.

121 Κατηγορίες Μικροβιολογικών Θ. Υ. ΙΙΙ. Ως προς το αν υποστηρίζεται περισσότερο η αύξηση των βακτηρίων ή των μυκήτων Για μύκητες: ph 3,8-5,6 και συνήθως σάκχαρα ~4% Για βακτήρια: ph 6,5-7,5

122 Κατηγορίες Μικροβιολογικών Θ. Υ. ΙV. Ως προς το αν είναι υγρά ή στερεά Υγρά Θ.Υ.: τα Θ. Υ. λόγω της χημικής τους σύστασης είναι συνήθως υγρά Στερεά Θ.Υ.: στερεοποίηση των υγρών Θ.Υ. γίνεται με τη προσθήκη του πολυσακχαρίτη agar σε συγκεντρώσεις 1-2% (συνήθως 1,8%). Εκχύλισμα φυκών που στερεοποιείται στους ο C και επανυγροποιείται στους ο C

123 Κατηγορίες Μικροβιολογικών Θ. Υ. V. Ως προς το αν υποστηρίζεται η αύξηση των αναερόβιων μ/ο Ανάπτυξη στον πυθμένα του σωλήνα Προσθήκη αναγωγικού παράγοντα στο υγρό Θ.Υ. δεσμευέι το διαλυμένο O 2 με αποτέλεσμα να μην είναι πλέον διαθέσιμο στους μ/ο. Για αρχαιοβακτήρια που παράγουν μεθάνιο: Το Θ.Υ. βράζει για την εξαέρωση του διαλυμένου O 2 και κατά την καλίέργεια χρησιμοποιείται συνεχής ροή N 2 για να απομακρύνεται το μεθάνιο ενώ στο υλικό υπάρχει κυστεϊνη σαν αναγωγικός παράγοντας Αναερόβιοι κλίβανοι, αναερόβιες γυάλες

124 Κατηγορίες Μικροβιολογικών Θ. Υ. VΙ. Θ.Υ. εμπλουτισμού Υλικά που ευνοούν την αύξηση του συγκεκριμένου είδους και όχι άλλων Όταν ο μ/ο βρίσκεται σε μικρή συγκέντρωση στο περιβάλλον Salmonella

125 Κατηγορίες Μικροβιολογικών Θ. Υ. VIΙ. Θ. Υ. για μικροβιολογικές βιοδοκιμές Π.χ. αντίσταση σε αντιβιοτικά ή ύπαρξη αντιβιοτικών σε ορούς ή άλλα υγρά

126 Κατηγορίες Μικροβιολογικών Θ. Υ. VIIΙ. Θ. Υ για τον προσδιορισμό και ταυτοποίηση των μ/ο Υπάρχουν εκατοντάδες τυποποιημένα Υ. στο εμπόριο π.χ. Σύστημα API, Sensititer, Enterotube. Πλαστική επιφάνεια με πολλούς μικρούς σωλήνες, ο καθένας με διαφορετικό Θ.Υ. λυοφιλιομένο που ενυδατώνεται όταν προστεθεί η υγρή καλλιέργεια. Μετά την ανάπτυξη αξιολογείται το αποτέλεσμα.

127 Η μικροβιακή αύξηση και η κινητική της Αύξηση είναι η μεγέθυνση της μάζας μέρους ή όλου του ζωντανού οργανισμού, που επιτυγχάνεται δια μέσου της σύνθεσης των μακρομορίων Ο Monod έθεσε τις θεμελιώδεις αρχές της μικροβιακής αύξησης Η σύνθεση και η δομή ενός μικροοργανισμού και οι φυσιολογικές του ικανότητες επηρεάζονται οριστικά από τη μέθοδο αύξησης και τις περιβαλλοντικές συνθήκες Οι γενικές αρχές της αύξησης σε όλους τους μονοκύτταρους οργανισμούς είναι κοινοί, ανεξάρτητα αν είναι ευκαρυωτικοί ή προκαρυωτικοί.

128 Βασικές αρχές της αύξησης σε κλειστά (batch) και σε ανοικτά ή συνεχή συστήματα αύξησης Κλειστά συστήματα: Αρχικά υπάρχει περίσσεια όλων των απαραίτητων για την αύξηση θρεπτικών. Για ένα διάστημα η αύξηση προχωρά με το μέγιστο ρυθμό. Ανοικτά συστήματα: Γίνονται συνεχείς ή ασυνεχείς προσθήκες και αφαιρέσεις. Οι πληθυσμοί αυξάνονται με ρυθμούς μικρότερους του μεγίστου κάτω από περιοριστικές συνθήκες υποστρώματος.

129 Κλειστός Κύκλος Αύξησης της Καλλιέργειας Λανθάνουσα Επιτάχυνσης Εκθετική Επιβράδυνσης Στασιμότητας Θανάτου Log CFU/ml Time

130 Διαύξηση Καμπύλη δύο φάσεων ή το φαινόμενο διπλού κύκλου αύξησης όταν το Θ.Υ. περιέχει μίγμα πηγών άνθρακα. Π.χ. μίγμα γλυκόζης και σορβιτόλης πρώτα χρησιμοποιείται η γλυκόζη. Όταν όλη η γλυκόζη θα έχει μεταβολιστεί τότε παράγονται τα ένζυμα μεταβολισμού της σορβιτόλης

131 Μικροβιακή Καλλιέργεια Δοχείο καλλιέργειας + θρεπτικό υπόστρωμα + εμβόλιο μ/ου = μικροβιακή καλλιέργεια του συγκεκριμένου μ/ού Δοχείο καλλιέργειας = γυάλινη κωνική φιάλη, τρυβλίο Petri, δοκιμαστικός σωλήνας, σωλήνας γενικής χρήσεως με βιδωτό πώμα κλπ. Εμβόλιο μ/ο = μικρή ποσότητα εναιωρήματος κυττάρων μ/ου που μεταφέρεται άσεπτα σε καθαρό Θ.Υ.

132 Απομόνωση μ/ου σε καθαρή καλλιέργεια Στο φυσικό περιβάλλον έχουμε μικτούς πληθυσμούς μ/ών. Κάθε κύτταρο που θα βρεθεί σε αποστειρωμένο στερεό Θ.Υ. θα αναπτύξει μία αποικία με τα μορφολογικά χαρακτηριστικά του κυττάρου του μ/ού. Πρώτες απομονώσεις καθαρής καλλιέργειας από Koch

133 Μέθοδοι δημιουργίας καθαρής καλλιέργειας Μέθοδος διαδοχικών αραιώσεων Μέθοδος παράλληλων γραμμών σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα Διασπορά των μ/ών σε τρυβλίο Petri στην επιφάνεια του άγαρ Αραίωση του εμβολίου με θρεπτικό υπόστρωμα σε τρυβλίο (ενσωμάτωση στο υγρό άγαρ)

134 Μορφολογία και αύξηση αποικιών Βάσει της συνολικής εμφάνισης και μορφής της αποικίας σε στερεό Θ.Υ. γίνεται ένας κατ αρχήν προσδιορισμός του μ/ού. Σήμερα εξυπηρετεί πολύ η χρήση του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σαρώσεως για τη δομή των αποικιών. Στην αποικία: ταχύτερη αύξηση συναντάμε στη περιφέρεια. Στο κέντρο βρίσκονται τα πρώτα κύτταρα που δημιουργήθηκαν και τα οποία είναι πιο πυκνά. Αποτέλεσμα να μεγαλώνουν πιο αργά (δύσκολη διάχυση θρεπτικών ουσιών, δημιουργία τοξικών μεταβολιτών)

135 Εκτίμηση μικροβιακού πληθυσμού Βάσει: 1. Αλλαγές στον αριθμό των κυττάρων 2. Συγκέντρωση βιομάζας (O.D. του εναιωρήματος των κυττάρων, του ξηρού βάρους της βιομάζας ανά ml καλλιέργειας Η μέθοδος που χρησιμοποιείται εξαρτάται από το είδος του μικροοργανισμού που εξετάζεται

136 Ολικός αριθμός κυττάρων (άμεση μικροσκοπική καταμέτρηση) Καταμέτρηση κυττάρων στο κοινό μικροσκόπιο είτε σε στερεωμένο παρασκεύασμα είτε σε υγρό δείγμα καλλιέργειας σε ειδικές αντικειμενοφόρους πλάκες τις πλάκες τύπου Neubauer. Αυτές είναι χαραγμένες και σχηματίζουν μικρά τετράγωνα γνωστού όγκου όπου και καταμετρούνται οι μ/οί. Στη συνέχεια γίνεται αναγωγή ανά ml καλλιέργειας. Πλεονέκτημα το άμεσο αποτέλεσμα.

137 Μειονεκτήματα: 1. Δεν γίνεται διαχωρισμός νεκρών-ζωντανών κυττάρων 2. Μικρά κύτταρα δεν είναι ευδιάκριτα και μπορεί να μην καταμετρηθούν 3. Απαιτείται μικροσκόπιο αντίθεσης φάσεων όταν το δείγμα δεν είναι μόνιμο 4. Κύτταρα που κινούνται είναι δύσκολο να καταμετρηθούν 5. Απαιτείται υψηλή συγκέντρωση κυττάρων (~10 7 CFU/ml)

138 Coulter Counter: Ηλεκτρονικός καταμετρητής. Το εναιώρημα διέρχεται με πίεση από μικρή οπή και καταμετράται η αλλαγή στην ηλεκτρική αντίσταση με ηλεκτρόδια που υπάρχουν στις δυο πλευρές της οπής. Ακριβέστερα τα αποτελέσματα με τα μεγαλύτερα κύτταρα. Καταμέτρηση και νεκρών κυττάρων.

139 Εκτίμηση του αριθμού βιώσιμων κυττάρων Ο αριθμός των κυττάρων τα οποία είναι ικανά να διπλασιαστούν και να δώσουν νέα θυγατρικά κύτταρα, δηλαδή να δώσουν αποικίες στην επιφάνεια στερεού υποστρώματος. Γίνεται λοιπόν καταμέτρηση των αποικιών σε τρυβλίο με την προϋπόθεση ότι κάθε αποικία προκύπτει από ένα μόνο κύτταρο.

140 Μέθοδοι: Διασπορά Ενσωμάτωση Και στις δύο περιπτώσεις το δείγμα προέρχεται από εναιώρημα μ/ών και είναι γνωστού όγκου, συνήθως 0,1-1,0 ml. Ο αριθμός των παραγόμενων αποικιών δεν πρέπει να είναι μεγάλος, ώστε να είναι σωστή η καταμέτρηση (συνήθως ). Ο κίνδυνος στατιστικού σφάλματος είναι μεγάλος, γι αυτό και απαιτούνται πολλαπλοί σωλήνες στις κρίσιμες αραιώσεις. Συνήθως ο αριθμός βιώσιμων κυττάρων εκφράζεται σαν cfu/ml C: Colony F: Forming U: Units

141 Προσδιορισμός της συγκέντρωσης της βιομάζας Μέθοδοι: Ξηρή βιομάζα: Οι μ/οί συλλέγονται με φυγοκέντρηση ή διήθηση και ξηραίνονται στους ο C για h για τα βακτήρια ή 24 h για τους μύκητες, και το αποτέλεσμα εκφράζεται σε mg ξηρής βιομάζας ανά ml αρχικής καλλιέργειας. Εκτίμηση της πυκνότητας φωτομετρικά: Μέτρηση της πυκνότητας του εναιωρήματος καλλιέργειας και η βιομάζα εκφράζεται σε μονάδες οπτικής πυκνότητας (Optical Density = OD). Κατασκευή πρότυπης καμπύλης της σχέσης οπτικής πυκνότητας και αριθμού κυττάρων του μικροοργανισμού στον ίδιο χρόνο ανάπτυξης. Λιγότερο ευαίσθητη μέθοδος από τη μέθοδο καταμέτρησης των βιώσιμων κυττάρων αλλά είναι πιο εύκολη, λιγότερο δαπανηρή και δεν καταστρέφει το δείγμα. Χρησιμοποιείται πολύ, αλλά απαιτείται συνεχής έλεγχος των δειγμάτων.

142 Μέθοδος ηθμομεμβράνης (διήθηση) Χρήση μεμβρανών με πολύ μικρούς πόρους ώστε να συγκρατούνται τα βακτήρια. Οι ηθμοί τοποθετούνται στην επιφάνεια στερεών υποστρωμάτων και επωάζονται μέχρι να σχηματιστούν ευδιάκριτες αποικίες. Η καταμέτρηση των αποικιών συνεπάγεται τον αριθμό των μ/ών που εμπεριέχονται στο αρχικό δείγμα. Είναι δυνατόν να επιλεγούν εκλεκτικά υποστρώματα για την επιλογή συγκεκριμένων μ/ών. Μέθοδος εκλογής για το νερό.

143 Χρήση μεθόδου για άμεση καταμέτρηση των μ/ών Διήθηση μέσω μεμβράνης, χρώση του φίλτρου με μαύρη χρωστική για καλό φόντο και στη συνέχεια χρώση των βακτηρίων με φθορίζουσα χρωστική (acridine orange) και καταμέτρηση σε μικροσκόπιο φθορισμού. Συνήθως οι τιμές που λαμβάνονται με τη μέθοδο αυτή είναι υψηλότερες από τις τιμές που λαμβάνονται με από τις μεθόδους καταμέτρησης ζώντων μ/ών.

144 Έλεγχος μικροβιακής αύξησης Ένα μόνο κύτταρο E. coli σε λιγότερο από 48 h αυξανόμενο εκθετικά παράγει βιομάζα μεγαλύτερη από τη μάζα της γης. Στη φύση η μικροβιακή αύξηση ελέγχεται με την εξάντληση θρεπτικών στοιχείων. Στα τρόφιμα είναι αναγκαίος ο έλεγχός της. Ο έλεγχος των μ/ών άρχισε να απασχολεί τον άνθρωπο από την εποχή του Lister (18..) όταν και εισήχθη η έννοια της μείωσης των μικροβιακών μολύνσεων στον άνθρωπο.

145 Επιτυγχάνεται με: Αναστολή Της γρήγορης αύξησης των βακτηρίων με βακτηριοστατικά Πλήρη καταστροφή του οργανισμού Στέρηση της μικροβιακής αναπαραγωγικής ικανότητας (αποστείρωση) με βακτηριοκτόνα Ο έλεγχος μπορεί να γίνει με φυσικές (θερμότητα, χαμηλές θερμοκρασίες, ξήρανση, οσμωτική πίεση, διήθηση και ακτινοβολία) ή χημικές (διαφορετικές ομάδες ενώσεων οι οποίες έχουν την δυνατότητα να καταστρέψουν τους μικροοργανισμούς ή να μειώσουν την αύξησή τους πάνω σε διάφορα αντικείμενα) μεθόδους. Από τη λίθινη εποχή χρησιμοποιείται η ξήρανση και το αλάτισμα των τροφίμων.

146 Η δράση των διαφόρων αντιμικροβιακών παραγόντων εξαρτάται από: Το είδος των μ/ών Pseudomonas και ενδοσπόρια ανθεκτικά σε φυσικούς παράγοντες και αντιβιοτικά Τη φυσική κατάσταση των μ/ών Ενδοσπόρια ανθεκτικότερα των κυττάρων που εκβλαστάνουν Το οργανικό υλικό του περιβάλλοντος των μ/ών Οργανική ύλη στο περιβάλλον του μ/ού τον προστατεύει από χημικές αντιμικροβιακές ουσίες π.χ. στα τρόφιμα (κρέμα γάλακτος αποβουτυρωμένο γάλα) Το ph Σε όξινες συνθήκες τα βακτήρια είναι πιο ευαίσθητα στη θερμότητα ή σε αντισηπτικές χημικές ουσίες.

147 Στόχος πολλών αντιμικροβιακών παραγόντων είναι η κυτοπλασματική μεμβράνη. Καταστροφή λιπιδίων ή πρωτεϊνών της προκαλεί τη λύση του κυττάρου. Άλλοι αντιμικροβιακοί παράγοντες αναστέλλουν ένζυμα. Αναστολή ενζύμων σημαίνει άμεσο κυτταρικό θάνατο.

148 Έλεγχος της μικροβιακής αύξησης με φυσικές μεθόδους Θερμότητα: ο σημαντικότερος παράγοντας που επηρεάζει την αύξηση και βιωσιμότητα των μ/ών. Γι αυτό και χρησιμοποιείται ευρέως ως παράγοντας αποστείρωσης (οικονομική και εύκολη μέθοδος). Μεγάλη διακύμανση στις Τ που μπορούν να επιβιώσουν οι μ/οί. Θερμικό σημείο θανάτου (Thermal Death Point TDP): η χαμηλότερη Τ στην οποία όλοι οι μ/οί που βρίσκονται σε ένα υδάτινο εναιώρημα θανατώνονται σε 10 min. Θερμικό χρόνος θανάτου (Thermal Death Time TDT): ο ελάχιστος χρόνος που απαιτείται για να θανατωθούν όλα τα βακτήρια μιας υγρής καλλιέργειας σε συγκεκριμένη Τ.

149 Έλεγχος της μικροβιακής αύξησης με φυσικές μεθόδους Δεκαδική μείωση του χρόνου (Decimal Reduction Time DRT ή τιμή D): ο χρόνος σε min όπου νεκρώνεται το 90% των βακτηρίων σε συγκεκριμένη Τ. Το DRT είναι πολύ χρήσιμη παράμετρος στη κονσερβοποιϊα. Η αποστείρωση ενός πληθυσμού θα κρατήσει περισσότερο αν η Τ είναι χαμηλότερη. Πάντα προσδιορίζεται ο χρόνος, η Τ και το αν η αποστείρωση είναι υγρή ή ξηρή.

150 Υγρή θερμότητα: Νεκρώνει λόγω της κροκίδωσης των πρωτεϊνών, που προκαλείται από τη γεφύρωση των δεσμών H που δημιουργούν η τρισδιάστατη δομή των πρωτεϊνών στο χώρο. Π.χ. βράσιμο 100 ο C για 10 min σκοτώνει βλαστικές μορφές βακτηρίων, μύκητες και τα σπόρια τους και πολλούς ιούς. Τα ενδοσπόρια και κάποιοι ιοί δεν καταστρέφονται. Κάποια ενδοσπόρια δεν καταστρέφονται ούτε σε 20 h στους 100 o C. Παρ όλα αυτά το ολιγόλεπτο βράσιμο χρησιμοποιείται για ασφαλή χρήση φαγητού και νερού.

151 Υγρή θερμότητα υπό πίεση: Επιτυγχάνει θερμοκρασίες άνω των 100 ο C. Χρησιμοποιείται συνήθως το αυτόκαυστο σε πίεση 15 psi και στους 121 ο C. Όσο υψηλότερη η πίεση στο αυτόκαυστο τόσο υψηλότερη και η θερμοκρασία. Η αποστείρωση στο αυτόκαυστο είναι πιο αποδοτική βρίσκονται σε άμεση επαφή με τον ατμό ή περιέχονται σε μικρού όγκου υδατικό διάλυμα. Ο ατμός με πίεση 15 psi (121 ο C) καταστρέφει όλους τους μ/ούς σε 15 min. Δεν πρέπει να εγκλωβίζεται αέρας στο δοχείο γιατί ο αέρας αυτός δεν μπορεί να αντικατασταθεί με ατμό. Χρησιμοποιείται για αποστείρωση Θ.Υ., οργάνων, ρούχων, οργάνων ενδοφλέβιας χρήσης, διαλυμάτων, συριγγών, οργάνων μεταγγίσεων και πολλών άλλων υλικών που αντέχουν σε ψηλές Τ και πιέσεις.