ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΣΕ ΟΙΝΙΚΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ

Transcript

1 Τ.Ε.Ι. Καλαμάτας Σχολή: Τεχνολογίας Γεωπονίας Τμήμα: Τεχνολογία Γεωργικών Προϊόντων ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΣΕ ΟΙΝΙΚΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ Εισηγητής: Καπόλος Ιωάννης Καθηγητής Επιμέλεια : Αλετράς Γ εώργιος Σπουδαστής ΚΑΛΑΜΑΤΑ 2011

2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Εισαγωγή...1 Κεφάλαιο Η ιστορία του οίνου Παγκόσμια ιστορία του οίνου Ιστορία του οίνου στην Ελλάδα Χημική σύσταση σταφυλιού Σύσταση του βότρυ Σύσταση των γιγάρτων Σύσταση της φλούδας Σύσταση της σάρκας Κεφάλαιο Βήματα της οινοποίησης Οινοποιία Γλευκοποίηση Ζύμωση Οι εναλλακτικοί τύποι της οινοποίησης Λευκή οινοποίηση Ερυθρή οινοποίηση Ροζέ οινοποίηση Ειδικές οινοποιήσεις Εμφιάλωση Ωρίμανση&Εμφιάλωση Ονομασία&Ταξινόμηση...29 Κεφάλαιο Αντιοξειδωτικά Διαχωρισμός και μηχανισμοί δράσεις των αντιοξειδωτικών ουσιών Δράση των αντιοξειδωτικών... 37

3 3.4. Οι αντιοξειδωτικές δράσεις του οίνου Ελεύθερες ρίζες, αντιοξειδωτικά και υγεία Κεφάλαιο Μέθοδοι προσδιορισμού και διαχωρισμού των φαινολικών ενώσεων και της αντιοξειδωτικής ικανότητας Μέθοδος Folin- Ciocalteu Μέθοδος του δείκτη Υπερμαγγικού Καλίου (ΚΜηΟ,*) Μέθοδος DPPH Μέθοδος HPLC και μέθοδος TLC Μέθοδος FRAP Μέθοδος ABTS Μέθοδος ORAC Μέθοδος της χημειοφωταύγειας...59 Βιβλιογραφία II

4 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το κρασί, στενά δεμένο με τον άνθρωπο στο πέρασμα των αιώνων, κατέχει περίοπτη θέση σε πολλούς πολιτισμούς και θρησκείες. Ένα ποτό, συνδεδεμένο με την έννοια του μέτρου, την καλή σωματική και ψυχική κατάσταση, αλλά και με την έννοια της μακροζωίας. Οι γνωστοί γιατροί της αρχαιότητας, Ιπποκράτης και Γαληνός, το χρησιμοποιούσαν για θεραπευτικούς σκοπούς, κάνοντας το κρασί το παλιότερο γνωστό φάρμακο, εδώ και χρόνια. Οι χρήσεις του περιελάμβαναν αντισηψία των τραυμάτων και του δέρματος πριν από χειρουργικές επεμβάσεις, αλλά και την αποστείρωση του πόσιμου νερού. Ακόμη το χρησιμοποιούσαν ως καταπραϋντικό, υπνωτικό, αναισθητικό, διεγερτικό της όρεξης, τονωτικό, θεραπευτικό της αναιμίας, προστατευτικό της διάρροιας, αλλά και υπακτικό και διουρητικό. Οι ήρωες του Ομήρου έπιναν κρασί πριν φύγουν και όταν γύριζαν από τη μάχη, για να ξεδιψάσουν ή να πάρουν δυνάμεις και κουράγιο, επιση ραίνοντας έτσι την ψυχοσωματική επίδραση του κρασιού στον ανθρώπινο οργανισμό. Δεν πρέπει βέβαια να ξεχνάμε ότι το οινόπνευμα, το οποίο περιέχεται στο κρασί σε ποσοστό περίπου 12%, είναι υπεύθυνο στην περίπτωση κατάχρησης, όπως στον αλκοολισμό, για βλαβερές επιδράσεις στον ανθρώπινο οργανισμό. Προκαλεί άμεσες τοξικές βλάβες στον εγκέφαλο και τα νεύρα (οίδημα, εκφύλιση), στην καρδιά (μυοκαρδιοπάθεια), στο στομάχι (γαστρίτιδες), στο πάγκρεας (παγκρεατίτιδες), ενώ έμμεσα θεωρείται υπεύθυνο και για άλλες βλάβες που οφείλονται στην κακή, συνήθως, διατροφή των ατόμων που κάνουν κατάχρηση1. ι

5 Στο κρασί αποδίδονται από την αρχαιότητα ευεργετικές για την ανθρώπινη υγεία ιδιότητες, τις οποίες η σύγχρονη επιστημονική έρευνα τεκμηριωμένα αποδίδει στην αντίοξειδωτική δράση ορισμένων συστατικών του. Ως τέτοιες ουσίες με αντιοξειδωτική δράση έχουν χαρακτηριστεί οι πολυφαινόλες, τα φλαβονοειδή, το ασκορβικό οξύ, ορισμένες λιγνάνες, τα κιναμμωμικά οξέα κλπ. Από τις πολλές ευεργετικές για την υγεία ιδιότητες του οίνου, η ελαττωμένη θνησιμότητα από στεφανιαίες καρδιοπάθειες που παρουσιάζουν όσοι καταναλώνουν λογικές ποσότητες κρασιού είναι ένα επιδημιολογικό εύρημα που έχει παρατηρηθεί σε πολλές περιπτώσεις και μελετηθεί κατά κόρον. Αντίθετα δεν έχουν παρατηρηθεί αντίστοιχα ευρήματα όταν το δείγμα του πληθυσμού αναφέρεται σε ανθρώπους που καταναλώνουν άλλα, εκτός από το κρασί, οινοπνευματώδη. Η διαφοροποίηση αυτή μεταξύ κατανάλωσης κρασιού και άλλων οινοπνευματωδών ποτών, ήταν το έναυσμα στην πραγματοποίηση πολλών ερευνών για να πιστοποιηθεί ποιες από τις ενώσεις που περιέχονται στο κρασί είναι υπεύθυνες για τις ευεργετικές του ιδιότητες. Έτσι ευρέθη ότι από τις 300 οργανικές ενώσεις που περιέχονται στα κρασιά, υπεύθυνες για την δραστικότητα αυτή είναι οι πολυφαινολικές ενώσεις που παρουσιάζουν τη σημαντικότερη αντιοξειδωτική δραστικότητα. Γενικά οι πολυφαινόλες αυτές βρίσκονται κυρίως στο κέλυφος των καρπών των σταφυλιών και προσδίδουν γεύση, άρωμα και χρώμα στο κρασί, ενώ η τελική συγκέντρωσή τους είναι συνάρτηση της ποικιλίας, του τρόπου και των συνθηκών καλλιέργειας, παρασκευής και ωρίμανσής του κρασιού. Από τα πολυφαινολικά αυτά παράγωγα, η κατεχίνη, η επικατεχίνη, η κερκετίνη, η ρουτίνη και η trans-ρεσβερατρόλη είναι οι πλέον δραστικές αφού απεδείχθη ότι αποτρέπουν την οξείδωση της χαμηλής πυκνότητας χοληστερόλης (LDL - Low Density Cholesterol) αποτελεσματικότερα και 2

6 από την 2- τοκοφερόλη. Η οξείδωση αυτή της χοληστερόλης είναι υπεύθυνη για την εμφάνιση της αθηροσκλήρυνσης και των στεφανιαίων καρδιοπαθειών. Εκτεταμένες ιατρικές μελέτες έδειξαν ότι οι φαινόλες αυτές (σε καθαρή μορφή) ή σε εκχυλίσματα κόκκινων κρασιών διευκολύνουν τη 2 φλεβική κυκλοφορία παράγοντας οξείδια του αζώτου στο ενδοθύλιο Το κρασί είναι ένα αλκοολούχο ποτό, προϊόν της ζύμωσης των σταφυλιών ή του χυμού τους (μούστος). Ποτά παρεμφερή του κρασιού παράγονται επίσης από άλλα φρούτα ή άνθη ή σπόρους, αλλά η λέξη κρασί από μόνη της σημαίνει πάντα κρασί από σταφύλια. Το κρασί είναι ιδιαίτερου ενδιαφέροντος για διάφορους λόγους. Είναι αφενός, ένα δημοφιλές ποτό που συνοδεύει και ενισχύει ένα ευρύ φάσμα ευρωπαϊκών και μεσογειακών γεύσεων, από τις πιο απλές και παραδοσιακές ως τις πιο σύνθετες, και αφετέρου, αποτελεί σημαντικό γεωργικό προϊόν που αντικατοπτρίζει την ποικιλία του εδάφους και το κλίμα ενός τόπου. Το κρασί χρησιμοποιείται επίσης σε θρησκευτικές τελετές σε πολλούς πολιτισμούς ενώ το εμπόριο κρασιού είναι ιστορικής σπουδαιότητας για πολλές περιοχές. Σύμφωνα με έρευνες, έχει παρατηρηθεί ότι η μέτρια κατανάλωση του κρασιού σχετίσθηκε με λιγότερο κίνδυνο για ορισμένες ασθένειες όπως εγκεφαλικά επεισόδια, καρδιοπάθειες, καρκίνο του πνεύμονα, καρκίνο του άνω πεπτικού συστήματος και μικρότερη συχνότητα θανάτου. Το κρασί, όταν καταναλώνεται με μέτρο, έχει σίγουρα θετικές επιδράσεις στην υγεία. Όμως αυτοί που πίνουν κρασί είναι πιο ευτυχισμένοι, υγιέστεροι, πλουσιότεροι και σοφότεροι όχι μόνο λόγω του ότι πίνουν κρασί αλλά διότι έχουν καλύτερη ψυχολογική και νοητική λειτουργία και ψηλότερο κοινωνικό και οικονομικό επίπεδο. 3

7 Το κρασί έχει ευεργετικές επιδράσεις στον άνθρωπο διότι περιέχει τις πολυφαινόλες που είναι χαρακτηριστικές χρωστικές ουσίες που προέρχονται από τα σταφύλια. Οι πολυφαινόλες συμβάλλουν στην καταστολή δημιουργίας της αθηρωματικης πλάκας που στενεύει και αποφράσσει τις στεφανιαίες αρτηρίες της καρδίας προκαλώντας έμφραγμα 3. 4

8 Κεφάλαιο Η ιστορία του οίνου Η λέξη "κρασί" αντικατέστησε τη λέξη "οίνος" στους βυζαντινούς χρόνους και η αντικατάσταση αυτή επιταχύνθηκε ίσως από το ότι ο "οίνος" (όπως και ο "άρτος") αποτελούσε πλέον όρο του χριστιανικού λειτουργικού- θρησκευτικού λεξιλογίου, μετατράπηκε δηλαδή σε "λέξη ταμπού". Η λέξη κατάγεται, με μεσολάβηση των τύπων κρασίν<κρασίον, από τη λέξη κράσις=ανάμειξη, που με τη σειρά της είναι παράγωγο του ελληνικού θέματος κρα- (πρβλ. το ρήμα κεράννυμι=αναμειγνύω και το ουσ. κρατήρ=σκεύος ανάμειξης). Η ετυμολογία της λέξης αντανακλά τη συνήθεια των αρχαίων Ελλήνων να πίνουν το κρασί τους ανακατεμένο με, 4 νερό. Το αμπέλι, από το οποίο προέρχεται το κρασί, σύμφωνα με τους παλαιοντολόγους, έχει προϊστορία πολλών εκατομμυρίων ετών. Απολιθωμένα κλήματα ηλικίας 60 εκατομμυρίων ετών αποτελούν την αρχαιότερη επιστημονική απόδειξη της ηλικίας της αμπέλου Παγκόσμια ιστορία του οίνου Το κρασί, πριν ακόμα από την εποχή των παγετώνων, ευδοκιμούσε στην πολική ζώνη κυρίως στην Ισλανδία, στη Βόρεια Ευρώπη αλλά και τη βορειοδυτική Ασία. Οι παγετώνες περιόρισαν σημαντικά την εξάπλωσή του 5

9 και επέβαλαν κατά κάποιο τρόπο τη γεωγραφική απομόνωση πολλών ποικιλιών, μέρος των οποίων εξελίχθηκαν και σε διαφορετικά είδη. Στην πορεία των χρόνων, διάφοροι πληθυσμοί άγριων αμπέλων μετακινήθηκαν προς θερμότερες ζώνες, κυρίως προς την ευρύτερη περιοχή του νοτίου Καυκάσου. Στην περιοχή αυτή, μεταξύ Ευξείνου Πόντου, Κασπίας θάλασσας και Μεσοποταμίας, γεννήθηκε το είδος Άμπελος η οινοφόρος (λατ. Vitis vinifera, υποείδος caucásica) η οποία σε διάφορες ποικιλίες καλλιεργείται μέχρι σήμερα.. Πάντως, το πρώτο υπόλειμμα κρασιού σε δοχείο βρέθηκε, βάση των τελευταίων ανακαλύψεων, στην επαρχία Henan της Κίνας και έχει ηλικία ετών, ενώ τα προηγούμενα ευρήματα που βρέθηκαν στο Hajji Firuz Tepe του Ιράν ήταν ηλικίας και ετών5 6' Η διαδικασία της αμπελουργίας εικάζεται πως έχει τις ρίζες της στην αγροτική επανάσταση και τη μόνιμη εγκατάσταση πληθυσμών με σκοπό την καλλιέργεια, χρονολογείται δηλαδή γύρω στο π.χ. Από τους πρώτους γνωστούς αμπελοκαλλιεργητές θεωρούνται οι αρχαίοι Πέρσες, οι Σημιτικοί λαοί και οι Ασσύριοι. Μεταγενέστερα οι γνώσεις αμπελουργίας και οινοποιίας μεταφέρθηκαν στους Αιγύπτιους, τους λαούς της Φοινίκης και τους πληθυσμούς της Μ. Ασίας και του Ελλαδικού χώρου. Την ίδια εποχή υπάρχουν αναφορές για το κρασί και στην αρχαία Κίνα 5 6. Στους χρόνους μετά την κατάρρευση της Ρώμης, οι Ρωμαίοι κληρικοί και μοναχοί, που χρειάζονταν το κρασί και για λειτουργικούς σκοπούς, ήταν σε πολλές περιπτώσεις αυτοί που συνετέλεσαν στη διατήρηση της οινοποιητικής παράδοσης των τέως Ρωμαϊκών κτήσεων, όπως η Γαλλία, η Ισπανία και η περιοχή του Ρήνου στη Γερμανία. Ακόμη και σήμερα μερικοί ξακουστοί γαλλικοί αμπελώνες ανήκουν σε μοναστήρια 4. 6

10 Στο Βυζάντιο, οι μοναχοί διαδραμάτισαν σπουδαίο ρόλο, συν τοις άλλοις και για το λόγο ότι όλο και μεγαλύτερες καλλιεργήσιμες εκτάσεις περιέρχονταν στη μοναστηριακή και εκκλησιαστική περιουσία. Οι μοναχοί είχαν την άνεση να κατασκευάζουν μεγάλα, σύγχρονα για την εποχή οινοποιεία, να βελτιώνουν τις τεχνικές παραγωγής και την ποιότητα του κρασιού. Μεταξύ των πραγμάτων που άλλαξαν είναι και η συνήθεια των αρχαίων Ελλήνων της ανάμειξης του οίνου με νερό, που εγκαταλείφθηκε οριστικά Ιστορία του οίνου στην Ελλάδα Δεν είναι βεβαιωμένο από που διδάχθηκαν οι Έλληνες την οινοποιία. Το πιο πιθανό όμως είναι ότι ασχολούνταν με την αμπελοκαλλιέργεια πριν το 1700 π.χ. Πιθανοί δάσκαλοί τους οι ανατολικοί λαοί (Φοίνικες, Αιγύπτιοι). Άλλες αναφορές φέρουν το κρασί να έρχεται από τη Θράκη, λόγω και της ιστορίας μας που αναφέρει τη λατρεία του Διονύσου που θεωρούνταν θρακικής- μκρασιατικής προέλευσης. Απ όπου και αν έμαθαν την τέχνη της αμπελοκαλλιέργειας, οι Έλληνες αγάπησαν το κρασί. Βασιλείς, άρχοντες και απλός λαός το εκτιμούσαν ιδιαίτερα. Οι ποιητές το ύμνησαν. Δεν συνήθιζαν όμως να μεθούν, ούτε και είχαν σε ιδιαίτερη εκτίμηση τους μέθυσους. Ο «συμποσίαρχης», ο οποίος ήταν προϊστάμενος στρατιάς "κεραστών" και "οινοχόων", στα επίσημα συμπόσια, επέβλεπε τόσο το νέρωμα του κρασιού, αλλά και την ποσότητα του κρασιού που έπιναν οι παρευρισκόμενοι. Η διατήρηση μιας ήρεμης ατμόσφαιρας χωρίς παρεκτροπές, λόγω υπερβολικής οινοποσίας, ήταν ιδιαίτερα σημαντική 4,8. 7

11 Εικ. 1 Απεικόνιση νερώματος του κρασιού Έπιναν το κρασί με πολλούς τρόπους, με επικρατέστερο αυτόν της ανάμειξης του κρασιού με νερό 1:3 (ένα μέρος κρασιού, τρία μέρη νερού) ή 1:2. Υπήρχαν ειδικά σκεύη για την ανάμειξη (κρατήρες και κύαθοι, δηλ. μεγάλες, βαθιές κουτάλες), αλλά και για την ψύξη πριν την κατανάλωση. Η χρήση και πόση ανέρωτου κρασιού («άκρατος οίνος») θεωρούταν βαρβαρική συνήθεια και συνηθιζόταν μόνο από αρρώστους ή κατά τη διάρκεια ταξιδιού για τόνωση. Πρόσθεταν επίσης διάφορα μυρωδικά και μπαχαρικά, όπως μέλι, θυμάρι, μέντα, γλυκάνισο, πιπέρι ή σμύρνα. Η προσθήκη αψίνθου (η παρασκευή δηλ. Βερμούτ) ονομαζόταν Ιπποκράτειος Οίνος, μιας και ο Ιπποκράτης θεωρείται ο πρώτος που τη χρησιμοποίησε. Οι τεχνικές της εποχής δεν διαφέρουν πολύ από αυτές που χρησιμοποιούμε σήμερα, με υψηλές μάλιστα επιδόσεις. Κυκλοφορούσαν δε ειδικά βιβλία για το θέμα, όπως αυτό του Θεοφράστου, το οποίο μας δίνει ενδιαφέρουσες πληροφορίες. Οι Έλληνες, σε αντίθεση από τους Ρωμαίους, καλλιεργούσαν συνήθως το αμπέλι απλωμένο στη γη χωρίς υποστηρίγματα, τεχνική που ακόμη και σήμερα είναι σε χρήση σε κάποιες περιοχές της Ελλάδας (π.χ. στη Σαντορίνη). Γνώριζαν την τεχνική της παλαίωσης, με θαμμένα πιθάρια στο έδαφος και σφραγισμένα με γύψο και ρετσίνι. Κάπως έτσι θα πρέπει να ανακάλυψαν και την επίδραση του ρετσινιού στο κρασί. Οι πήλινοι αμφορείς οι οποίοι χρησιμοποιούντο για τη μεταφορά του 8

12 κρασιού ήταν αλειμμένοι με πίσσα για πλήρη στεγανοποίηση, και συχνά με σφραγίδα ή μπογιά σημείωναν την περιοχή προέλευσης, το έτος παραγωγής, τον οινοποιό, αλλά και τον εμφιαλωτή. Το εμπόριο του κρασιού υπήρξε μια από τις κύριες δραστηριότητες των αρχαίων Ελλήνων. Υπήρχαν νόμοι για την προστασία της ποιότητας του κρασιού, αλλά και νόμοι ενάντια στον ανταγωνισμό (στη Θάσο, υπήρχε σχετική νομοθεσία δήμευσης του κρασιού το οποίο μετέφεραν ξένα πλοία, όταν αυτά προσέγγιζαν το λιμάνι της). Τα πιο φημισμένα κρασιά ήταν αυτά του βορείου Αιγαίου: Λήμνος, Θάσος, Λέσβος, Χίος, Ικαρία και Σάμος. Μετά την κλασική εποχή απέκτησαν ιδιαίτερη φήμη τα κρασιά της Ρόδου, της Κω και των άλλων Δωδεκανήσων, της Θήρας, της Νάξου, της Κρήτης, αλλά και της Κύπρου Χημική σύσταση σταφυλιού Το σταφύλι αποτελείται από το βότρυ (τσαμπί), τα γίγαρτα (κουκούτσια), τη φλούδα (φλοιός) και τη σάρκα Σύσταση του βότρυ Η χημική σύσταση του βότρυ μοιάζει με αυτή του φύλλου. Είναι φτωχή σε σάκχαρα με σημαντική περιεκτικότητα σε εξουδετερωμένα οξέα, γιατί περιέχει μεγάλη ποσότητα ανόργανων ιόντων. Ο κυτταρικός χυμός έχει ρη μεγαλύτερο του 4 (ρη>4). Ο βότρυς είναι ιδιαίτερα πλούσιος σε πολυφαινόλες. Η συμμετοχή του βότρυ στην εκχύλιση έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση της ολικής οξύτητας και την αύξηση της ενεργού οξύτητας (ρη). Η περιεκτικότητα των βοτρύχων σε νερό εξαρτάται από το βαθμό της ωριμότητας, η οποία κυμαίνεται μεταξύ 65 και 80%, ενώ η περιεκτικότητα τους σε σάκχαρα δεν ξεπερνά τα 10/100θ. Οι ταννίνες κυμαίνονται μεταξύ 9

13 1,3 και 3,5% και οι αζωτούχες ύλες ανέρχονται σε 1-2 %. Ο βότρυς δίνει το 5-6% του βάρους του ως τέφρα, όπου παραπάνω από το μισό είναι άλατα του καλίου. Το βάρος του ποικίλει και αποτελεί το 2-7,5 % του συνολικού βάρους του σταφυλιού Σύσταση των γιγάρτων Κάθε ρώγα περιέχει συνήθως τέσσερα κουκούτσια. Αποτελούν το 3-6 % του συνολικού βάρους του σταφυλιού. Η σύσταση τους σε γραμμάρια ανά 100 γρ. είναι: - Νερό 25,0-45,0gr Σάκχαρα-πολυσακχαρίτες 34,0-3 6 ^ Έλαια 13,0-20,0 gr Τανίνες 4,0-6,0 gr Αζωτούχα συστατικά 4,0-6 ^ τ Ανόργανα συστατικά 2,0-4,0 gr Λιπαρά οξέα 1,0 gr Ορισμένα από τα συστατικά που βρίσκονται στην περιφέρεια, όπως τα φαινολικά, τα αζωτούχα και τα φωσφορούχα είναι ιδιαίτερα διαλυτά κατά τη διάρκεια της εκχύλισης. Ορισμένα συστατικά που βρίσκονται στο εσωτερικό του κουκουτσιού και κυρίως τα έλαια, είναι δυνατόν να υποβαθμίσουν την ποιότητα του κρασιού στην περίπτωση που εξαχθούν και διαλυθούν στο γλεύκος διότι θα μεταδώσει δυσάρεστη οσμή και γεύση. Για το λόγο αυτό πρέπει να αποφεύγεται το σπάσιμο των κουκουτσιών κατά τη διάρκεια των μηχανικών κατεργασιών του σταφυλιού. Τα έλαια του κουκουτσιού των σταφυλιών είναι εμπορικά εκμεταλλεύσιμα 9.Το ποσό των δεψικών υλών κυμαίνεται ανάλογα με το βαθμό της ωριμότητας και άλλων αιτίων από έτος σε έτος. Επιπλέον μέσα στα γίγαρτα υπάρχουν και άλλες γ ίο

14 πολυφαινολικές ενώσεις εκτός των τανινοειδών 10. Η τέφρα, τέλος, ανέρχεται σε 1,5-2%, από τα συστατικά της, από τα οποία, υπερισχύουν το ασβέστιο, το κάλιο και το φωσφορικό οξύ Σύσταση της φλούδας Το ποσό των φλοιών επί τοις εκατό του βάρους των ραγών ποικίλλει ανάλογα με την ποικιλία του αμπελιού και του βαθμού της ωριμότητας του σταφυλιού, η οποία κυμαίνεται συνήθως μεταξύ 7 και 12 %. Το ποσοστό του νερού ποικίλλει, συνήθως όμως κυμαίνεται σε ποσοστό %. Η φλούδα αποτελείται από την επιδερμίδα και μερικά στρώματα κυττάρων κάτω από αυτήν. Αποτελεί το 6-9 % του βάρους του σταφυλιού. Ο ρόλος της στην οινοποίηση είναι σημαντικός, αφού από τον τρόπο που θα μεταχειριστεί εξαρτάται κατά ένα μεγάλο μέρος το είδος του κρασιού που θα παραχθεί. Τα στρώματα των κυττάρων προς την επιδερμίδα είναι λεπτά και γίνονται παχύτερα προς το εσωτερικό. Τα σταφύλια που προορίζονται για οινοποίηση έχουν συνήθως σκληρή φλούδα και χυμώδη σάρκα, αντίθετα με τα επιτραπέζια που έχουν φλούδα λεπτή και σάρκα τραγανή. Η επιδερμίδα σχηματίζεται από ένα μόνο στρώμα κυττάρων. Το πάχος της εξαρτάται από την ποικιλία του αμπελιού και κυμαίνεται στα 1,5-3,8 ηι. Η επιδερμίδα καλύπτεται από μία κηρώδη ουσία, η οποία αποτελείται κατά τα 2/3 από ολεανικό οξύ και κατά το 1/3 από διάφορες άλλες ενώσεις, όπως αλκοόλες, λιπαρά οξέα, και αλδεϋδες. Αυτή η κηρώδης ουσία παρεμποδίζει την εξάτμιση του νερού της ρώγας. Είναι πλούσια σε κυτταρίνη, πηκτίνες και πρωτεΐνες. Περιέχει κυρίως κιτρικό και λίγο τρυγικό οξύ. Τα οξέα της φλούδας είναι εξουδετερωμένα σε μεγαλύτερο ποσοστό από τα οξέα της σάρκας. Η φλούδα, όπως και ο βότρυς, είναι πλούσια σε πολυφαινόλες 10. Οι ερυθρές ποικιλίες περιέχουν διπλάσια ποσότητα πολυφαινολών από αυτή 11

15 των λευκών ποικιλιών. Επίσης, η παρουσία αρωματικών ενώσεων είναι χαρακτηριστικό της φλούδας Σύσταση της σάρκας Η σάρκα είναι το πιο σημαντικό μέρος της ρώγας. Αποτελεί συνήθως το % όλου του βάρους των ρωγών, αλλά πολλές φορές και περισσότερο, μέχρι 90 % περίπου. Μεγαλύτερη φυσικά είναι η αναλογία του σαρκώματος στις ποικιλίες χωρίς γίγαρτα. Εκλεκτή ποικιλία σταφυλιών χωρίς γίγαρτα είναι η σουλτανίνα, η οποία καταναλώνεται είτε σε χλωρή κατάσταση ως επιτραπέζια, είτε κατόπιν αποξήρανσης. Η σάρκα αποτελείται από μεγάλα κύτταρα.το κύριο συστατικό του σαρκώματος είναι ο χυμός του, δηλαδή το γλεύκος, αποτελούμενο κυρίως από ζυμώσιμα σάκχαρα και οργανικά οξέα. Κάτω από τη λεπτή κυτταρική μεμβράνη υπάρχει ένας πολύ λεπτός ιστός κυτοπλάσματος με τον πυρήνα προς τα τοιχώματα και ολόκληρο το εσωτερικό του καταλαμβάνεται από τον κυτταρικό χυμό, το γλεύκος. Οι μεμβράνες των συνεχόμενων κυττάρων δεν είναι ενωμένες μεταξύ τους σε όλη την περιφέρεια, αλλά αφήνουν στις γωνίες μικρούς επικοινωνούντες χώρους, μέσα από τους οποίους γίνονται οι εναλλαγές αερίων με το εξωτερικό περιβάλλον. Τα κύτταρα που βρίσκονται αμέσως μετά τη φλούδα έχουν πολύ λεπτή μεμβράνη, η οποία διαλύεται με αποτέλεσμα να σχηματίζεται μια ζώνη χυμού. Προς το εσωτερικό τα κύτταρα έχουν πιο χοντρή μεμβράνη. Τα στερεά μέρη της σάρκας αποτελούνται από τα κυτταρικά τοιχώματα και τις αγγειώδεις δέσμες, μέσα από τις οποίες επικοινωνεί η ράγα με το υπόλοιπο φυτό. Τα στερεά αυτά μέρη αποτελούν το 0,5 % της σάρκας και συμμετέχουν στη δημιουργία της λάσπης του γλεύκους. Η σάρκα αποτελείται σχεδόν αποκλειστικά από κυτταρικό χυμό (γλεύκος)9. 12

16 Κεφάλαιο Τα βήματα της οινοποίησης Η οινοποίηση είναι μια φυσική διεργασία που πραγματοποιείται εδώ και χιλιάδες χρόνια. Οινοποιώ σημαίνει μετατρέπω το γλεύκος σε οίνο εφαρμόζοντας μια επιλεγμένη τεχνική. Πιο συγκεκριμένα, η τέχνη της οινοποίησης μπορεί να οριστεί ως η διαδικασία αφαίρεσης / εκχύλισης όλων των ποιοτικών στοιχείων που εμπεριέχει το σταφύλι, αλλά όχι εκείνων των ουσιών που θα είχαν αρνητικό αποτέλεσμα στην ποιότητα του κρασιού. Η οινοποίηση μαζί με το σταφύλι ορίζουν από κοινού την τελική ποιότητα του προϊόντος Οινοποιία Οι ρώγες του σταφυλιού, που αποτελεί και την πρώτη ύλη του κρασιού, περιέχουν σάκχαρα, οργανικά οξέα και νερό (πάνω από 70%). Η περιεκτικότητα σε αυτές τις ουσίες εξαρτάται κάθε φορά από την ποικιλία, το υπέδαφος, τις κλιματικές συνθήκες, αλλά και από την χρονική στιγμή της ωρίμανσης του σταφυλιού. Μετά την διαδικασία του τρύγου (συγκομιδής), ακολουθεί η γλευκοποίηση, η διαδικασία δηλαδή κατά την οποία εξάγεται το γλεύκος (ή συνήθως μούστος) από το σταφύλι. Το οινόπνευμα που περιέχει το κρασί παράγεται από τα σάκχαρα του μούστου με την αντίδραση της αλκοολικής ζύμωσης, που επιτελείται από ειδικά ένζυμα, τις ζυμάσες των ζυμομυκήτων. Οι ζυμομύκητες υπάρχουν 13

17 αδρανοποιημένοι στο φλοιό των σταφυλιών και καθώς έρχονται σε επαφή με το μούστο, πολλαπλασιάζονται και επιτελούν τη ζύμωση. Εκτός από αιθυλική αλκοόλη παράγεται και διοξείδιο του άνθρακα αλλά και μια σειρά δευτερευόντων προϊόντων και ενώσεων με καθοριστική σημασία πολλές φορές για την ποιότητα του οίνου. Η διαδικασία της ζύμωσης διαρκεί συνήθως 8-25 ημέρες. Είναι σύνηθες, να παρατείνεται ή να διακόπτεται η ζύμωση με τεχνητά μέσα, κυρίως μέσω της διατήρησης της θερμοκρασίας σε χαμηλά ή υψηλά επίπεδα αντίστοιχα. Ο χρόνος της ζύμωσης είναι καθοριστικός για το κρασί που θα παραχθεί τελικά. Επιπλέον γίνεται συνήθως λόγος για λευκή και ερυθρή οινοποίηση, ανάλογα με το χρώμα του παραγόμενού κρασιού Γλευκοποίηση Μετά τον τρύγο, τα σταφύλια πρέπει να μεταφερθούν χωρίς καθυστέρηση στο πατητήρι, όπου θα εξαχθεί το γλεύκος (μούστος) από τις ρώγες. Η έκθλιψη του μούστου μπορεί να γίνει με διάφορους μεθόδους. Παλαιότερα χρησιμοποιούσαν το παραδοσιακό πατητήρι όπου τα σταφύλια πατιούνται κυριολεκτικά από τους τρυγήτες, κάτι που σχεδόν έχει εκλείψει στην εποχή Εικ 2 παραδοσιακός τρόπος Εικ 3 πιεστήρι σταφυλιών 14

18 Πλέον έχουν αντικατασταθεί από διάφορα μηχανήματα (σπαστήρες), χειροκίνητα ή ηλεκτρικά, που συνήθως λειτουργούν συθλίβοντας το σταφύλι ανάμεσα σε περιστρεφόμενους κυλίνδρους. Υπάρχουν πιεστήρια τα οποία διαχωρίζουν αυτόματα το χυμό από τα στερεά μέρη της ρώγας, άπως γίνεται για το λευκό κρασί. Υπάρχουν τα παραδοσιακά πιεστήρια και τα πιο εξελιγμένα. Η παραδοσιακή πρέσσα αποτελείται συνήθως από μία βάση (ξύλινη ή σιδερένια) ένα σιδερένιο κοχλία στηριγμένο στο κέντρο της βάσης και ένα περικόχλιο που στρέφεται με μοχλό περί τον κοχλία. Το περικόχλιο κατεβαίνοντας πιέζει ένα σύνολο δοκών που έχουν τοποθετηθεί ανά ζεύγη κάθετα το ένα στο άλλο μεταφέροντας τέλος ομοιόμορφα την πίεση στα στέμφυλα τα οποία βρίσκονται σε ξύλινο κυλινδρικό περίβλημα. Το γλεύκος ρέει από τις σχισμές και το κάτω μέρος του κυλινδρικού περιβλήματος, ενώ τα στέμφυλα κρατούνται σε αυτό. Μία οριζόντια πρέσσα που εφαρμόζει πίεση και στις δύο άκρες, αντικαθιστά βαθμιαία την παραδοσιακή πρέσσα. Οι συνεχείς κοχλιωτές πρέσσες χρησιμοποιούνται ειδικά για τον αποστραγγιζόμενο πολτό. Η πρέσσα λνϋίπιεε που χρησιμοποιείται ευρέως για τους άσπρους μούστους, αποτελείται από έναν διάτρητο κύλινδρο που περιέχει έναν διογκώσιμο σωλήνα. Τα συνθλιμμένα σταφύλια εισάγονται στον κύλινδρο και ο σωλήνας όντας διογκωμένος πιέζει τα σταφύλια ενάντια στις πλευρές του περιστρεφόμενου κυλίνδρου και αναγκάζει το χυμό να εξαχθεί μέσω των διατρήσεων. Διάφορες συμπιέσεις μπορούν να γίνουν χωρίς εκτενή χειρωνακτική εργασία Π. Οι συνεχείς πρέσσες είναι περισσότερο αποτελεσματικές για την παραγωγή κόκκινων κρασιών, όπου ο φλοιός, οι σπόροι και ο χυμός ζυμώνονται ταυτόχρονα. Ο διαχωρισμός του χυμού είναι απλούστερη 15

19 διαδικασία. Η ζύμωση έχει ως αποτέλεσμα ο φλοιός να είναι λιγότερο ολισθηρός και η ποσότητα του χυμού που λαμβάνεται πολύ μεγαλύτερη σε σχέση με το μη ζυμωμένο μούστο. Κατά τη γλευκοποίηση, επιβάλλεται η αφαίρεση των κοτσανιών (αποβοστρύχωση) του σταφυλιού, καθώς είναι επιζήμια τόσο για την γεύση του τελικού κρασιού, όσο και για την υγεία του καταναλωτή. Στη συνέχεια ακολουθεί η τελική διαδικασία της ζύμωσης Π Ζύμωση Η θεμελιώδης αρχή πάνω στην οποία στηρίζεται η παρασκευή οίνου, οποιουδήποτε τύπου, είναι η μετατροπή σακχάρων του καρπού του σταφυλιού σε αιθυλική αλκοόλη και διοξείδιο του άνθρακα με τη βοήθεια μικροοργανισμών, σύμφωνα με το ακόλουθο σχήμα: 2 0 6Η » 2 0 2Η50Η Η διεργασία αυτή ονομάζεται αλκοολική ζύμωση και οι παράγοντες που επιδρούν σε αυτή είναι: Θερμοκρασία, Οξυγόνο, Περιεκτικότητα σε σάκχαρα, Περιεκτικότητα σε αιθυλική αλκοόλη, Οξύτητα, Ανόργανα άλατα, Διοξείδιο του θείου Αν αφεθεί το γλεύκος που πάρθηκε από έκθλιψη και πίεση σταφυλιών, σε κανονική θερμοκρασία, μετά από μικρό χρονικό διάστημα θα παρατηρηθεί μια σειρά φαινομένων που έχουν ως αποτέλεσμα την παρασκευή του κρασιού

20 Τα σάκχαρα του μούστου, η γλυκόζη και η φρουκτόζη, με τη διαδικασία της αλκοολικής ζύμωσης μετατρέπονται στο οινόπνευμα που περιέχει το κρασί. Η μετατροπή αυτή γίνεται με τη βοήθεια συγκεκριμένων μυκήτων, των ζυμομηκήτων, Saccharomyces, καθώς και των γενών Pichia, Kloeckera και Torulopsis. Οι ζυμομύκητες ήδη πριν τον τρύγο υπάρχουν αδρανοποιημένα (αφού δεν έχουν πρόσβαση στα σάκχαρα του χυμού) στο φλοιό των σταφυλιών και ενεργοποιούνται από τη γλευκοποίηση: έρχονται σε επαφή με το μούστο, εκεί πολλαπλασιάζονται και επιτελούν ζύμωση, κατα την οποία εκτός την αιθυλική αλκοόλη παράγεται CO2 και θερμότητα, γι αυτό κατά τη διάρκεια της ζύμωσης, το γλεύκος είναι ζεστό και κοχλάζει (από την παραγωγή φυσαλίδων CO2). Ο χρόνος ο οποίος απαιτείται για τη ζύμωση ποικίλει από 8-9 έως και 25 ημέρες και έχει σχέση με τα σάκχαρα που υπάρχουν, τη θερμοκρασία στην οποία πολλαπλασιάζονται οι μύκητες, το οξυγόνο και άλλους παράγοντες. Αυτή η διαφοροποίηση στη διάρκεια της ζύμωσης μας δίνει τα λεγάμενα «αρώματα ζύμωσης» 12. Όσον αφορά τα λευκά κρασιά οι οινοποιοί διατηρούν χαμηλή τη θερμοκρασία (15-20 C). Στα κόκκινα πραγματοποιείται σε δύο φάσεις, μια γρήγορη και δυνατή (με την παρουσία των «στεμφύλων», της φλούδας δηλαδή του σταφυλιού) και μια αργή χωρίς τα «στέμφυλα». Για τα γλυκά κρασιά, η ζύμωση διακόπτεται (είτε με θέρμανση >38-40 C, είτε με ψύξη < 6-7 C) και έτσι ένα μέρος των σακχάρων δεν διασπάται. Ένα άλλο είδος ζύμωσης η μυλογαλακτική ζύμωση, επιτρέπει σε ένα από τα οργανικά οξέα του σταφυλιού, το μηλικό οξύ, να μετατραπεί σε γαλακτικό. Το γαλακτικό οξύ, όντας λιγότερο όξινο από το μηλικό, μειώνει 17

21 την οξύτητα του κρασιού, πράγμα που είναι απαραίτητο στα ερυθρά κρασιά και όχι τόσο στα λευκά στα οποία επιθυμούμε μεγαλύτερη οξύτητα. Τα κυριότερα είδη σακχαρομυκήτων που συναντώνται κατά την παρασκευή του οίνου είναι: 1. Σακχαρομύκης ο ελλειψοειδής, που ονομάζεται έτσι λόγω του σχήματος του. Είναι ο σπουδαιότερος για την αλκοολική ζύμωση και κατέχει το μεγαλύτερο ποσοστό των ζυμομυκήτων που λαμβάνουν μέρος σε αυτή. 2. Σακχαρομύκης ο βραχύαιχμος, που ονομάζεται έτσι επειδή το κύτταρο του έχει οξείες άκρες (σχήμα λεμονιού). Συμμετέχει αρχικά στη ζύμωση, δεν αντέχει όμως πολύ στο αλκοολικό περιβάλλον στους 4-5 βαθμούς αλκοόλης παύει να αναπτύσσεται και καθιζάνει με την οινολάσπη. 3. Σακχαρομύκης ο παστεριανός. Έχει επίμηκες σχήμα και παρουσιάζει μεγαλύτερη αλκοολοανθεκτικότητα από το βραχύαιχμο, δε μπορεί όμως ούτε αυτός να συμπληρώσει τη ζύμωση του γλεύκους, ενώ λειτουργεί αρκετά πιο αργά από τον ελλειψοειδή. Οι σακχαρομύκητες απαντούν πάνω στα σταφύλια, οπότε και μεταφέρονται στο γλεύκος κατά την έκθλιψη τους. Μετά την αλκοολική ζύμωση παραμένουν στην οινολάσπη, οπότε και το μεγαλύτερο μέρος τους απομακρύνεται με τις μεταγγίσεις. Κατά την εποχή της ωρίμανσης του καρπού, οι σακχαρομύκητες βρίσκονται στα σταφύλια σε μεγάλη ποσότητα. Επειδή βρίσκονται στην εξωτερική επιφάνεια του φλοιού, σε περίπτωση δυνατής βροχής παρασύρονται από αυτή. Σε τέτοια περίπτωση νέοι μύκητες θα βρίσκονται πάνω στα σταφύλια μετά την πάροδο 2-3 ημερών. Παρά το γεγονός ότι είδη του Saccharomyces γενικά θεωρούνται πιο επιθυμητά για αποτελεσματική αλκοολική ζύμωση, είναι ζύμες από άλλα γένη που συνεισφέρουν στη γεύση, ιδιαίτερα στα αρχικά στάδια της 18

22 ζύμωσης. Η ζύμη Saccharomyces προτιμάται γιατί είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική στη μετατροπή της ζάχαρης σε αλκοόλ. Επίσης, είναι λιγότερο ευπαθής στην ανασταλτική λειτουργία του αλκοόλ. Υπό ευνοϊκές συνθήκες, ζύμες Saccharomyces παράγουν μέχρι 18% (κατά όγκο) αλκοόλ, άν και το σύνηθες όριο είναι 15 %- 16 % 13. Το επιλεγμένο είδος ζύμης επιτρέπεται να πολλαπλασιαστεί όσο το δυνατόν περισσότερο στον αποστειρωμένο χυμό σταφυλιών και να μεταφερθεί έπειτα σε μεγαλύτερα δοχεία, όπου συνεχίζει να αυξάνεται έως ότου επιτυγχάνεται ο επιθυμητός όγκος. Κατάλληλες ζύμες με τα απαιτούμενα γένη προστίθενται απευθείας ώστε να αποφευχθεί η προβληματική διαδικασία της ανάπτυξης και διατήρησης ενός είδους ζύμης. Χρησιμοποιείται 1-3 % καθαρής ζύμης ή ικανοποιητική ποσότητα πεπιεσμένης ζύμης, ώστε να προκύψει πληθυσμός μονάδων ανά m l. Ο έλεγχος της θερμοκρασίας κατά την αλκοολική ζύμωση είναι απαραίτητος ώστε: 1. Να διευκολύνει την ανάπτυξη της ζύμης. 2. Να εξαχθούν τα αρωματικά συστατικά και το χρώμα από τη φλούδα. 3. Να επιτραπεί η συσσώρευση των επιθυμητών παραπροϊόντων. 4. Να αποτραπεί η υπερβολική αύξηση της θερμοκρασίας που έχει ως αποτέλεσμα την καταστροφή των ζυμών. Η βέλτιστη θερμοκρασία για την ανάπτυξη των πιο κοινών ζυμών που χρησιμοποιούνται στην οινοποιία είναι περίπου 25 C. Στους μούστους κόκκινου κρασιού, η βέλτιστη εξαγωγή χρώματος ταυτόχρονα με την ανάπτυξη ζύμης εμφανίζεται στους 22 με 28 C περίπου. Η αλκοολική ζύμωση παράγει όμως θερμότητα και απαιτείται προσεκτικός έλεγχος της θερμοκρασίας για να αποτραπεί η αύξηση της θερμοκρασίας στα επίπεδα 19

23 περίπου των 3 0 ^ (όπου η ανάπτυξη της ζύμης είναι ιδιαίτερα περιορισμένη). Ο σύγχρονος έλεγχος θερμοκρασίας πραγματοποιείται με τη χρήση εναλλακτών θερμότητας. Η επαφή με τον αέρα πρέπει να περιοριστεί, ώστε να αποφευχθεί η οξείδωση κατά τη διάρκεια της ζύμωσης. Σε πολύ μεγάλα δοχεία ο όγκος του διοξειδίου του άνθρακα που αποβάλλεται είναι ικανός, ώστε να αποτρέψει την είσοδο του αέρα. Σε μικρά δοχεία τοποθετούνται παγίδες που αποτρέπουν την είσοδο του αέρα, αλλά ταυτόχρονα αποτρέπουν και την έξοδο του διοξειδίου του άνθρακα. Οι παγίδες αυτές είναι ιδιαίτερα χρήσιμες κατά τη διάρκεια των τελευταίων σταδίων της ζύμωσης, όπου τα επίπεδα του αποβαλλομένου διοξειδίου του άνθρακα είναι χαμηλά. Μετά τη ζύμωση μικρές ποσότητες διοξειδίου του θείου προστίθενται ώστε να αποτρέψουν την οξείδωση Οι εναλλακτικοί τύποι της οινοποίησης Οι διάφοροι τύποι της οινοποίησης είναι: 1. Η λευκή οινοποίηση. 2. Η ερυθρή οινοποίηση 3. Η ροζέ (ερυθρωπή) οινοποίηση Λευκή οινοποίηση Το πρώτο στάδιο της λευκής οινοποίησης είναι ο εκραγισμός, ο οποίος πραγματοποιείται στο εκραγιστήριο. Αυτό το μηχάνημα αποτελείται από ένα διάτρητο κύλινδρο που περιστρέφεται. Στο εσωτερικό του βρίσκεται ένας άξονας με πτερύγια που περιστρέφεται κι αυτός με αντίθετη όμως φορά. Εδώ διαχωρίζονται οι ράγες από τα κοτσάνια τους και περνούν από 20

24 τις τρύπες του κυλίνδρου, ενώ τα κοτσάνια βγαίνουν από το αντίθετο άκρο και απομακρύνονται. Στη συνέχεια οι ράγες περνούν ανάμεσα από τους κυλίνδρους του θλιπτηρίου, οι οποίοι επίσης περιστρέφονται. Η ταχύτητα και η μεταξύ τους απόσταση ρυθμίζονται ανάλογα με την ποικιλία των σταφυλιών και το βαθμό ωριμότητάς τους. Έτσι ενώ σπάζουν οι φλοιοί αποφεύγεται το σπάσιμο των κουκουτσιών που θα πρόσθετε στυφή γεύση στο κρασί. Με την σύνθλιψη των ραγών, απελευθερώνεται μέρος του χυμού τους. Οι ζύμες του φλοιού έρχονται σε επαφή με τον ίδιο το χυμό και η σταφυλομάζα που παραλαμβάνεται μ' αυτόν τον τρόπο οδηγείται για πίεση. Ένα σύγχρονο πνευματικό πιεστήριο παρέχει ήπια μεταχείριση στο σταφύλι. Η λειτουργία του βασίζεται στο γέμισμα φούσκας που βρίσκεται στο εσωτερικό του, με αέρα ή υγρό. Η σταφυλομάζα πιέζεται κατ' αυτόν τον τρόπο στα εσωτερικά τοιχώματα του κυλίνδρου και έτσι εξάγεται το υπόλοιπο του χυμού. Στη συνέχεια απομακρύνονται τα στέμφυλα και ο χυμός οδηγείται σε δεξαμενή όπου ψύχεται για κάποιο χρονικό διάστημα (συνήθως μία νύχτα περίπου). Αυτή είναι η διαδικασία της απολάσπωσης, κατά την οποία το ήδη ψυγμένο γλεύκος διαυγάζεται. Η διαύγαση επιτυγχάνεται από μόνη της με την κατακάθιση όλων των σωματιδίων που βρίσκονται σε αιώρηση στο μούστο και γίνεται πάντα πριν από την αλκοολική ζύμωση. Η διάρκειά της είναι από ώρες, ανάλογα με το ποσοστό λασπών 15. Τα κρασιά που προέρχονται από απολασπωμένα γλεύκη έχουν καθαρότερο άρωμα. Το χρώμα τους είναι πιο σταθερό και λιγότερο ευαίσθητο στις οξειδώσεις. Ο καθαρός πλέον χυμός μεταγγίζεται σε δεξαμενή όπου πραγματοποιείται η αλκοολική ζύμωση. Αμέσως μετά ακολουθεί η οινοποίηση, η διαδικασία δηλαδή μετατροπής του φρέσκου χυμού σταφυλιών (γλεύκους) σε κρασί. Αυτή προκαλείται από τις ζύμες - 21

25 μονοκύτταρους οργανισμούς που βρίσκονται στον φλοιό του σταφυλιού και έχουν πλέον περάσει στο σταφυλοπολτό. Η κυριότερη δουλειά των ζυμών είναι να μετατρέψουν το γλυκό χυμό του σταφυλιού και πιο συγκεκριμένα τα σάκχαρά του, σε αλκοόλη. Εναλλακτικά χρησιμοποιούνται επιλεγμένες ζύμες με τις οποίες εμβολιάζεται το γλεύκος, προκειμένου να υπάρχει καλύτερος έλεγχος της ζύμωσης και των επιθυμητών χαρακτηριστικών του κρασιού που θα παραχθεί9. Αν δε γίνει προσθήκη ζυμών από τον παραγωγό η αλκοολική ζύμωση λέγεται φυσική, ενώ αλλιώς ελεγχόμενη. Παρατηρείται ακόμη ότι κατά τη διάρκεια της αλκοολικής ζύμωσης αυξάνεται η θερμοκρασία του γλεύκους. Αυτό συμβαίνει γιατί οι ζύμες παράγουν ενέργεια. Στη λευκή οινοποίηση η δεξαμενή ψύχεται έτσι ώστε η θερμοκρασία της ζύμωσης να κυμαίνεται στους 18 0, αποσκοπώντας στην απόκτηση αρωμάτων με χαρακτήρα λουλουδιών και φρούτων, που θα χαρίσουν στο κρασί φρεσκάδα. Μετά το τέλος της αλκοολικής ζύμωσης, όταν δηλαδή το σύνολο των σακχάρων έχει μετατραπεί σε αλκοόλη, το κρασί μεταγγίζεται στις δεξαμενές αποθήκευσης Ερυθρή οινοποίηση Το πρώτο στάδιο της ερυθρής οινοποίησης, όπως και της λευκής, είναι ο εκραγισμός που πραγματοποιείται στο εκραγιστήριο. Οι ράγες διαχωρίζονται από τα κοτσάνια τους και περνούν από τις τρύπες του κυλίνδρου, ενώ τα κοτσάνια βγαίνουν από το αντίθετο άκρο και απομακρύνονται. Στη συνέχεια οι ράγες περνούν ανάμεσα από τους κυλίνδρους του θλιπτηρίου, οι οποίοι επίσης περιστρέφονται. Η ταχύτητα και η μεταξύ τους απόσταση ρυθμίζονται ανάλογα με την ποικιλία των σταφυλιών και το βαθμό ωριμότητάς τους. Έτσι ενώ σπάζουν οι φλοιοί αποφεύγεται το σπάσιμο των κουκουτσιών που θα πρόσθετε στυφή γεύση 22

26 στο κρασί. Με την σύνθλιψη των ραγών, απελευθερώνεται ο χυμός τους και όλος ο σταφυλοπολτός που δημιουργείται μεταφέρεται με τη βοήθεια μιας αντλίας στις ανοξείδωτες δεξαμενές. Εκεί ακολουθεί η διαδικασία της οινοποίησης, η διαδικασία δηλαδή μετατροπής του φρέσκου χυμού σταφυλιών (γλεύκους) σε κρασί. Αυτή προκαλείται από τις ζύμες, μονοκύτταρους οργανισμούς που βρίσκονται στον φλοιό του σταφυλιού και έχουν πλέον περάσει στο σταφυλοπολτό. Εναλλακτικά χρησιμοποιούνται επιλεγμένες ζύμες με τις οποίες εμβολιάζεται το γλεύκος, προκειμένου να υπάρχει καλύτερος έλεγχος της ζύμωσης και των επιθυμητών χαρακτηριστικών του κρασιού που θα παραχθεί. Αν δε γίνει προσθήκη ζυμών από τον παραγωγό η αλκοολική ζύμωση λέγεται φυσική, ενώ αλλιώς ελεγχόμενη. Η κυριότερη δουλειά των ζυμών είναι να μετατρέψουν το γλυκό χυμό του σταφυλιού και πιο συγκεκριμένα τα σάκχαρά του, σε αλκοόλη. Ταυτόχρονα απελευθερώνεται διοξείδιο του άνθρακα που δημιουργεί φυσαλίδες. Αυτές ανεβάζουν τους φλοιούς στην επιφάνεια των δεξαμενών όπου σχηματίζουν πυκνό καπέλο 9. Οι ερυθρές χρωστικές ουσίες στις οποίες οφείλεται το κόκκινο χρώμα του κρασιού βρίσκονται στο εσωτερικό των φλοιών του σταφυλιού. Μόνο η επαφή του χυμού με το φλοιό, στη σωστή θερμοκρασία και για συγκεκριμένο χρόνο, δίνει το ποθητό αποτέλεσμα του χρωματισμού του. Για το λόγο αυτό, παίρνεται ο χυμός από τον πυθμένα της δεξαμενής και ανακυκλώνεται από την κορυφή της. Με αυτόν τον τρόπο, ή και άλλους, διαβρέχονται τα στέμφυλα. Ρυθμίζοντας λοιπόν το χρόνο της εκχύλισης, παρέχεται το επιθυμητό χρώμα. Στα ερυθρά κρασιά ο χρόνος εκχύλισης μπορεί να διαρκέσει από ελάχιστες μέρες έως και αρκετές εβδομάδες. Παρατηρείται ακόμη ότι κατά τη διάρκεια της αλκοολικής ζύμωσης αυξάνεται η θερμοκρασία του 23

27 γλεύκους. Αυτό συμβαίνει γιατί οι ζύμες παράγουν ενέργεια. Σκοπός είναι να διατηρηθεί η θερμοκρασία ζύμωσης στο όριο των που είναι ιδανική για την παραγωγή των ερυθρών οίνων, καθώς είναι επιτρεπτή η παραλαβή των συστατικών που διαφοροποιούν τη γεύση των κόκκινων κρασιών, διατηρώντας συγχρόνως τη φρεσκάδα των αρωμάτων τους. Έτσι είναι απαραίτητο να ψυχθούν οι δεξαμενές είτε με βρέξιμο και κρύο νερό είτε με το να τοποθετηθούν στο εσωτερικό τους ψυκτικά στοιχεία. Μόλις ο χυμός αποκτήσει το επιθυμητό χρώμα και γευστικό χαρακτήρα απομακρύνεται από τους φλοιούς και μεταφέρεται σε άλλη δεξαμενή (η πίεση των φλοιών στο πιεστήριο δίνει το λεγόμενο κρασί πίεσης, που είναι κατά κανόνα χαμηλότερης ποιότητας, αν και κάποτε μέρος του χρησιμοποιούνταν για ανάμιξη με το κρασί πρώτης ποιότητας). Σε αυτό το σημείο τελειώνει η αλκοολική ζύμωση και ξεκινά η μηλογαλακτική. Η δεύτερη ονομάζεται ζύμωση, αν και προκαλείται από βακτήρια, σε αντίθεση με την αλκοολική ζύμωση που πραγματοποιείται από τις ζυμομύκητες. Στη φάση αυτή, το μηλικό οξύ μετατρέπεται σε γαλακτικό, μια αλλαγή που μαλακώνει το κρασί, μειώνει δηλαδή τον άγουρο χαρακτήρα του και βοηθά στην ωρίμανσή του. 2.Ι.4.3. Ροζέ (ερυθρωπή) οινοποίηση Τα ροζέ κρασιά παράγονται - όπως και τα λευκά - με μοναδική διαφορά τη σύντομη επαφή του χυμού με τα στέμφυλα, ούτως ώστε να αποκτήσει ένα απαλό ροζέ και όχι ένα σκούρο ερυθρό χρώμα. Η ανάμιξη λευκού και ερυθρού οίνου για την παραγωγή ροζέ, δεν επιτρέπεται σε καμιά περίπτωση (με εξαίρεση την παραγωγή της σαμπάνιας)9. 24

28 2.Ι.4.4. Ειδικές οινοποιήσεις Οι ειδικές οινοποιήσεις για την παραγωγή είναι: Αφρωδών οίνων, Γλυκών οίνων, Οίνων τύπου nouveau, Αρωματισμένων οίνων. 1) Αφρώδεις οίνοι Χαρακτηριστικό γνώρισμα των οίνων της κατηγορίας αυτής είναι η παραγωγή αφρού, που προκαλείται κατά το άνοιγμα της φιάλης από την έκλυση του διοξειδίου του άνθρακα. Το διοξείδιο του άνθρακα προέρχεται είτε από την αλκοολική ζύμωση, είτε προστίθεται στον οίνο κατά την εμφιάλωση. Έτσι οι οίνοι διακρίνονται σε φυσικούς αφρώδεις και τεχνητούς αφρώδεις οίνους, αντίστοιχα. Στην κατηγορία των φυσικών αφρωδών οίνων ανήκουν η σαμπάνια (champagne), οι αφρώδεις οίνοι που παρασκευάζονται με την παραδοσιακή μέθοδο της Σαμπάνιας, οι αφρώδεις οίνοι που παράγονται σε κλειστές δεξαμενές, οι αφρώδεις οίνοι Asti spumante και οι ημιαφρώδεις οίνοι. 2) Γλυκείς οίνοι Γλυκείς οίνοι ονομάζονται εκείνοι στους οποίους η αλκοολική ζύμωση δεν ολοκληρώθηκε και άφησε αζύμωτη μια ποσότητα σακχάρων. Ανάλογα με την ποσότητα των αζύμωτων σακχάρων, οι οίνοι αυτοί διακρίνονται σε: Ημίξηρους (όταν περιέχουν σάκχαρα από 2,0-18,0 g/l). Ημίγλυκους (όταν περιέχουν σάκχαρα 14,0-40,0 g/l). Γλυκούς (όταν περιέχουν σάκχαρα πάνω από 40,0 g/l). Σε γενικές γραμμές, η διαδικασία παραγωγής γλυκών οίνων είναι ίδια με την ερυθρή και τη λευκή οινοποίηση μέχρι το στάδιο διακοπής της 25

29 ζύμωσης. Η διακοπή της ζύμωσης γίνεται είτε μόνη της λόγω σχηματισμού υψηλής ποσότητας αλκοόλης (πάνω από 14,0% vol) - και προκύπτουν οίνοι φυσικώς γλυκοί, είτε με την εφαρμογή διαφόρων τεχνικών, όπως προσθήκη οινοπνεύματος (αλκοόλης 96,0% vol), και προκύπτουν οίνοι γλυκοί φυσικοί. 3) Οίνοι τύπου nouveau Τα κρασιά που χαρακτηρίζονται ως nouveau έχουν ιδιαίτερα αρωματικά και γευστικά χαρακτηριστικά, παράγονται συνήθως με συγκεκριμένη μέθοδο οινοποίησης και προορίζονται να καταναλωθούν άμεσα. Τα κρασιά που ανήκουν σε αυτήν την κατηγορία έχουν ως πιο σημαντικό προσόν τους το άρωμά τους. Επίσης είναι μαλακά και ευκολόπιστα κρασιά, με ελάχιστες τανίνες. Ο αρωματικός και γευστικός αυτός χαρακτήρας προέρχεται από τον τρόπο οινοποίησής τους, την ανθρακική εκχύλιση. Κατά την κλασική ανθρακική εκχύλιση, τα τσαμπιά των σταφυλιών μπαίνουν ολόκληρα σε δεξαμενές που κλείνουν ερμητικά και πολλές φορές περιέχουν ήδη διοξείδιο του άνθρακα. Η ζύμωση αρχίζει μέσα στη ράγα (ενδοκυτταρική), που διογκώνεται με αποτέλεσμα το χρώμα του κρασιού να εμπλουτίζεται με χρωστικές από το εσωτερικό και όχι μόνο στη φλούδα της ράγας. Μετά από μία εβδομάδα, συλλέγεται ο ελαφρά ζυμωμένος χυμός, πραγματοποιείται συμπίεση των σταφυλιών και συνεχίζεται, η ζύμωση, ώστε ο χυμός να γίνει κρασί16. 4) Αρωματισμένοι οίνοι Οι αρωματισμένοι οίνοι είναι οίνοι γλυκοί διαφόρων τύπων στους οποίους έχουν προστεθεί φυσικές αρωματικές ουσίες φυτικής προέλευσης, σε αναλογίες μη επιβλαβείς για την υγεία του καταναλωτή 17. Η περιεκτικότητα των αρωματισμένων οίνων σε αλκοόλη κυμαίνεται από 15 έως 18 % vol, όταν πρόκειται για οίνους που διεγείρουν την όρεξη και 26

30 από 18 έως 23 % vol, όταν πρόκειται για οίνους που διευκολύνουν την πέψη. Ως πιο αντιπροσωπευτικός τύπος αρωματικών οίνων θεωρείται ο οίνος βερμούτ Εμφιάλωση Αφού γίνουν οι κατάλληλες ενέργειες και έλεγχος του κρασιού με σταθεροποίηση, διαύγαση με κολλάρισμα και φιλτράρισμα ακολουθεί η εμφιάλωση. Το κρασί μετά από την παλαίωσή του (όταν αυτή πραγματοποιείται), προετοιμάζεται για την εμφιάλωση, η οποία αποτελεί μια σχετικά απλή, μηχανική διαδικασία. Στις σύγχρονες γραμμές εμφιάλωσης υπάρχει ένα αυτόματο πλυντήριο φιαλών, ένα σύστημα γεμίσματος με κρασί, ένα πωματιστικό μηχάνημα και ένα σύστημα ετικετοκόλλησης και εγκιβωτισμού. Η φιάλη, ο φελλός, η ετικέτα και το καψύλιο είναι μια ολόκληρη σειρά από προϊόντα που συμβάλλουν στην τελική εμφάνιση - στο ντύσιμο του κρασιού 14. Εικόνες 4,5: Η διαδικασία εμφιάλωσης (γέμισμα - ετικετάρισμα) 27

31 Ωρίμανση&Παλαίωση Πολλά κρασιά βελτιώνονται στην ποιότητα κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης σε βαρέλια και μπουκάλια. Τέτοια κρασιά φθάνουν τελικά στην ακμή τους και με περαιτέρω ωρίμανση αρχίζουν να υποβαθμίζονται. Κατά τη διάρκεια της περιόδου ωρίμανσης ή πεπαλαίωσης, η οξύτητα μειώνεται, πρόσθετη λεύκανση και σταθεροποίηση συμβαίνουν καθώς ανεπιθύμητες ουσίες καθιζάνουν και τα διάφορα συστατικά του κρασιού σχηματίζουν σύνθετες ενώσεις έχοντας επιπτώσεις στη γεύση και το άρωμα. Τα λευκά, τα ροζέ και τα ελαφρά ερυθρά κρασιά, συνήθως καταναλώνονται νωρίς, χωρίς να περάσουν από βαρέλι, προκειμένου να απολαύσουμε τη φρεσκάδα των πρωτογενών αρωμάτων και την ποικιλία της τους. Αντίθετα, τα μεγάλα σε ηλικία λευκά κρασιά και τα περισσότερα ερυθρά απαιτούν παλαίωση προκειμένου να απαλύνει η πολύ τονισμένη οξύτητα τους και να εξευγενιστούν οι επιθετικές τανίνες τους αντίστοιχα 11,18 Εικ 6: Διάφοροι μέθοδοι παλαίωσης με βαρέλια (αριστερά) και με μπουκάλια (δεξιά) Τα κρασιά ωριμάζουν συνήθως σε ξύλινα δοχεία φτιαγμένα από βελανιδιά, επιτρέποντας στο οξυγόνο να εισέρχεται και στο νερό και το αλκοόλ να διαφεύγουν. Τα εκχυλίσματα από το ξύλο συμβάλλουν στη γεύση. Η υγρασία έχει επιπτώσεις στο είδος των συστατικών που δραπετεύουν, με το 28

32 αλκοόλ να γίνεται πιο συμπυκνωμένο στα κρασιά που αποθηκεύονται υπό συνθήκες χαμηλής υγρασίας και να μειώνεται με την υψηλή υγρασία. Με την απελευθέρωση του νερού και του αλκοόλ, μειώνεται ο όγκος, αφήνοντας κενό μέχρι το στόμιο, ή έλλειμμα, τα οποία αντισταθμίζονται από την προσθήκη περισσότερου από το ίδιο κρασί από ένα άλλο κιβώτιο. Η παλαίωση του κρασιού συνεχίζεται και στη φιάλη, η οποία ονομάζεται αναγωγική, αφού ο φελλός εξασφαλίζει την απουσία του οξυγόνου. Σε αυτή τη φάση, που μπορεί να διαρκέσει από μήνες έως πολλά χρόνια, αναπτύσσεται το μπουκέτο του κρασιού Ονομασία&Ταξινόμηση Τα κρασιά είτε ονομάζονται από την ποικιλία σταφυλιών τους είτε από τον τόπο παραγωγής τους. Ιστορικά, τα κρασιά από την Αυστραλία, τις Ηνωμένες Πολιτείες Αμερικής και τη Γερμανία ονομάστηκαν αποκλειστικά από την ποικιλία σταφυλιών τους, ενώ κρασιά από τη Γαλλία, την Ισπανία, την Ιταλία ή την Ελλάδα προσδιορίστηκαν κυρίως από το γεωγραφικό τόπο παραγωγής τους. Σημαντικό διακριτικό κάθε κρασιού είναι και το χρώμα του. Τα κρασιά διακρίνονται γενικά σε λευκά, κόκκινα και ροζέ. Είναι λανθασμένη η γενικευμένη άποψη πως το χρώμα του σταφυλιού καθορίζει και το χρώμα του κρασιού. Στην πραγματικότητα οι χρωστικές ουσίες του σταφυλιού περιέχονται στα στερεά μέρη του (στέμφυλα) και επομένως το χρώμα του σταφυλιού παρέχει το χρώμα του κρασιού μόνο αν και τα στερεά του μέρη συμμετέχουν στη διαδικασία της ζύμωσης. Ο μούστος τόσο των κόκκινων όσο και των ανοιχτόχρωμων ποικιλιών διαθέτει το ίδιο ανοιχτό χρώμα. Έτσι, κόκκινο κρασί παράγεται από ποικιλίες κόκκινων (ή μαύρων) σταφυλιών με την προϋπόθεση ότι τα στερεά τους μέρη συμμετέχουν στη 29

33 ζύμωση, ενώ λευκά κρασιά μπορούν να παραχθούν από οποιαδήποτε ποικιλία εφόσον τα στερεά μέρη των σταφυλιών διαχωριστούν στη διαδικασία της ζύμωσης. Τα ροζέ κρασιά, παράγονται όπως και τα κόκκινα, με τη διαφορά ότι τα στερεά μέρη των σταφυλιών παραμένουν στη ζύμωση για ένα πολύ σύντομο χρονικό διάστημα, συνήθως μικρότερο από μία ημέρα. Τα κρασιά ταξινομούνται ακόμα με το έτος της συγκομιδής σταφυλιών (τρύγος). Συνήθως παράγονται από σταφύλια της συγκομιδής ενός έτους και χρονολογούνται με βάση το έτος αυτό. Επιπλέον υπάρχουν κάποιες ειδικές κατηγορίες κρασιών όπως είναι ο αφρώδης οίνος, ο οποίος περιέχει και το διοξείδιο του άνθρακα ("ανθρακικό'ή που παράγεται κατά τη διάρκεια της ζύμωσης. Το διοξείδιο αυτό δεν εισάγεται επιπρόσθετα στο μπουκάλι εμφιάλωσης, όπως γίνεται στα αναψυκτικά καθώς αυτή η μέθοδος απαγορεύεται. Για τον εγκλωβισμό του διοξειδίου στη φιάλη χρησιμοποιούνται διάφορες μέθοδοι, είτε μέσω της εμφιάλωσης του κρασιού πριν ολοκληρωθεί η ζύμωση, είτε μέσω της ολοκλήρωσης της ζύμωσης σε αεροστεγείς δεξαμενές. Εκλεκτότερο παράδειγμα αφρώδους οίνου είναι η γαλλική Σαμπάνια

34 Τα κρασιά μπορούν να ταξινομηθούν επίσης ως ξηρά, γλυκά ή ημίγλυκα. Η γλυκύτητα των κρασιών μπορεί να μετρηθεί κατά τη διαδικασία της συγκομιδής αν και στην πράξη καθορίζεται από το ποσό της ζάχαρης που παραμένει στο κρασί μετά από τη ζύμωση. Έτσι, το ξηρό κρασί δεν περιέχει υπόλοιπο ζάχαρης

35 Κεφάλαιο Αντιοξειδωτικά Τα αντιοξειδωτικά είναι ουσίες που εμποδίζουν ή επιβραδύνουν την οξείδωση των συστατικών των τροφίμων η οποία προκαλείται από το ατμοσφαιρικό οξυγόνο. Τα περισσότερα αντιοξειδωτικά είναι αρωματικές ενώσεις, που διαθέτουν μια τουλάχιστον ελεύθερη υδροξυλική ή αμινική ομάδα. Οι σημαντικότερες ενώσεις που προστίθενται στα τρόφιμα ανήκουν στις πολυκυκλικές φαινόλες, με μία ή περισσότερες υδροξυλομάδες. Τα αντιοξειδωτικά χρησιμοποιούνται κυρίως σε συνδυασμό με τους λεγάμενους συνεργούς σταθεροποιητές και συμπλοκοποιητές. Τα μίγματα αυτά συντελούν στην ενεργοποίηση και τη βελτίωση της αντιοξειδωτικής δράσης, στη διεύρυνση της εφαρμογής των αντιοξειδωτικών σε περισσότερες κατηγορίες τροφίμων, καθώς και στην ευκολότερη χρησιμοποίησή τους. Στην κατηγορία των συνεργών ουσιών ανήκουν διάφορες χημικές ενώσεις, όπως τα οξέα και τα άλατα 19. Τα αντιοξειδωτικά ανάλογα με τον τρόπο δράσης τους, μπορούν να χωριστούν στις εξής κατηγορίες: > Πρωτογενή αντιοξειδωτικά: Είναι συνήθως φαινολικές ενώσεις, που οδηγούν στον τερματισμό των αλυσιδωτών αντιδράσεων ελεύθερων ριζών. Στις αντιδράσεις αυτές παίζουν το ρόλο του δότη ηλεκτρονίων. Παραδείγματα πρωτογενών αντιοξειδωτικών αποτελούν οι φυσικές και συνθετικές τοκοφερόλες, το ΒΗΑ 32

36 (βουτυλιωμένη υδροξυανισόλη), το ΒΗΤ (βουτιλιωμένο υδροξυτολουόλιο), το ΤΒΗξ) (ίείτ-βουτυλο-υδροκινόνη), κ.α. > Δευτερογενή αντιοξειδωτικά: Η δράση τους επικεντρώνεται στη διάσπαση των υδροϋπεροξειδίων των λιπιδίων (προϊόντα οξείδωσης) προς σταθερά τελικά προϊόντα, που δεν λαμβάνουν μέρος σε αλυσιδωτές αντιδράσεις. Τέτοια αντιοξειδωτικά είναι το διαρυλο-θειοδιπροπιονικό οξύ και ο αντίστοιχος εστέρας. > Ενώσεις που απομακρύνουν το οξυγόνο: Τα αντιοξειδωτικά αυτά αντιδρούν με το οξυγόνο και σχηματίζοντας ενώσεις με αυτό, εμποδίζουν την αντίδραση με τα λιπίδια που αποτελεί έναρξη της αυτοξείδωσης. Την ικανότητα αυτή παρουσιάζουν αντιοξειδωτικά όπως το ασκορβικό οξύ (βιταμίνη (Γ), ο παλμιτικός εστέρας, το ερυθορβικό οξύ και τα άλατα του με νάτριο, κ.α 21. > Ενώσεις που δημιουργούν ενεργειακά σύμπλοκα (συνεργιστικές ενώσεις): Οι ενώσεις που ανήκουν σε αυτή την κατηγορία σχηματίζουν χημικά σύμπλοκα με μεταλλικά ιόντα, όπως του χαλκού και του σιδήρου. Με τον τρόπο αυτό δεσμεύουν σωματίδια που δρουν ως εκκινητές της οξείδωσης. Παραδείγματα αποτελούν το κιτρικό οξύ, τα αμινοξέα, το αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (ΕϋΤΑ), κ.α. Ωστόσο για να εκδηλωθεί η αντιοξειδωτική τους δράση, πρέπει να χρησιμοποιηθούν σε συνδυασμό με άλλο αντιοξειδωτικό Διαχωρισμός και μηχανισμοί δράσεις των αντιοξειδωτικών ουσιών Τα αντιοξειδωτικά ανάλογα με το μηχανισμό δράσης τους διακρίνονται στις ακόλουθες κατηγορίες: 33

37 > Πρωτοταγή αντιοξειδωτικά Τα πρωτοταγή αντιοξειδωτικά διακόπτουν τις αντιδράσεις διάδοσης των ελεύθερων ριζών παρέχοντας άτομα υδρογόνου στις ελεύθερες ρίζες. Σε αυτή την κατηγορία εντάσσονται οι φαινολικές ενώσεις. Παραδείγματα πρωτογενών αντιοξειδωτικών αποτελούν η ΒΗΑ (βουτυλιωμένη υδροξυανισόλη), το ΒΗΤ (βουτυλιωμένο υδροξυτολουόλιο), η TBHQ (διτριτ-βουτυλουδροκινόνη), o PG (προπυλικός εστέρας γαλλικού οξέος), οι φυσικές και συνθετικές τοκοφερόλες, καφεϊκό οξύ, καρνοσόλη, ροσμαρινικό οξύ κ.ά.23. Όσον αφορά στα φαινολικά αντιοξειδωτικά δρούν μέσω του μηχανισμού ελεύθερων ριζών. Αντιδρούν με αυτές και σχηματίζουν ενώσεις που δεν έχουν την τάση να δίνουν νέες ελεύθερες ρίζες. Η δράση τους αυξάνεται όταν χρησιμοποιηθούν σε συνδυασμό. Το φαινόμενο αυτό λέγεται συνέργεια ή συνεργισμός ή συνεργιστική δράση 24. Συνοπτικά, ο μηχανισμός με τον οποίο δρούν τα φαινολικά αντιοξειδωτικά δίνεται με τις ακόλουθες αντιδράσεις: R + AH >RH + Α RO + Α Η»ROH + A ROO + AH >ROOH + Α R + A >RA RO + A > ROA ROO + A' >ROOA > Αευτεροταγή αντιοξειδωτικά Σε αυτή την κατηγορία ανήκουν κάποιες ομάδες αντιοξειδωτικών με 22 διαφορετικές ιδιότητες και είναι " : 34

38 1. Ενώσεις που δημιουργούν γηλικά σύμπλοκα (συνεργιστικές ενώσεις). Οι ενώσεις αυτές σχηματίζουν χηλικά σύμπλοκα με μεταλλικά ιόντα, όπως αυτά του χαλκού και του σιδήρου. Με τον τρόπο αυτό δεσμεύουν σωματίδια που δρουν ως εκκινητές της οξείδωσης. Παραδείγματα αποτελούν το κιτρικό οξύ, τα αμινοξέα, το αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA), κ.ά. Ωστόσο για να εκδηλωθεί η αντιοξειδωτική τους δράση, πρέπει να χρησιμοποιηθούν σε συνδυασμό με κάποιο άλλο αντιοξειδωτικό. 2. Ενώσεις που απομακρύνουν το οξυγόνο. Οι ενώσεις αυτές αντιδρούν με το οξυγόνο, σχηματίζοντας ενώσεις με αυτό, εμποδίζουν την αντίδρασή του με τα λιπίδια που αποτελεί έναρξη της αυτοξείδωσης. Την ικανότητα αυτή παρουσιάζουν αντιοξειδωτικά όπως το ασκορβικό οξύ (βιταμίνη C), ο παλμιτικός του εστέρας, το ερυθορβικό οξύ και τα άλατά του με νάτριο, κ.ά. 3. Τα ανανωνικά, τα οποία αναγεννούν φαινόλες και εμφανίζουν το φαινόμενο του συνεργισμού. Το ασκορβικό οξύ, με τη μορφή εστέρων με λιπαρά οξέα (για να είναι λιποδιαλυτό) πιστεύεται ότι αναγεννά τα φαινολικά αντιοξειδωτικά, παρέχοντας υδρογόνο στις φαινόξυ-ρίζες και έτσι έχει μία έμμεση δράση ως αντιοξειδωτικό. Ως, αναγωγικό, το ασκορβικό οξύ μεταφέρει άτομα υδρογόνου στις κινόνες, που σχηματίζονται στην ενζυμική αμαύρωση των φαινολικών ουσιών και αυτό παρέχει μία προστασία στις πρόσφατα κομμένες επιφάνειες των φρούτων και λαχανικών Οι αποσβεστές διηνεοαένου (sinslet) οξυγόνου, οι οποίοι απενεργοποιούν το μονήρες οξυγόνο. Εδώ ανήκουν οι τοκοφερόλες και το β-καροτένιο. 5. EvCvua. Αυτά δρουν είτε απομακρύνοντας το εν διαλύσει οξυγόνο, είτε απομακρύνοντας συστατικά του τροφίμου που μπορούν να οξειδωθούν εύκολα. Παραδείγματα για την κατηγορία αυτή αποτελούν αντίστοιχα η 35

39 οξειδάση της γλυκόζης, η υπεροξειδάση της δισμουτάσης, η καταλάση και η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης. 6. Η μεθυλοσιλικόνη και οι στερόλεε με αιθυλιδενική πλευρική αλυσίδα, όπως το πολυδιμεθυλοσιλοξάνιο, εμποδίζουν τον οξειδωτικό πολυμερισμό σε θερμαινόμενα έλαια. 7. Τέλος σε αυτή την κατηγορία ανήκουν τα αντιοξειδωτικά με πολλαπλή ή μη πλήρως γνωστή δράση. Τέτοια είναι τα φωσφολιπίδια και τα προϊόντα των αντιδράσεων Maillard. Τα αντιοξειδωτικά με βάση την προέλευσή τους διακρίνονται σε: > Συνθετικά αντιοξειδωτικά: τα αντιοξειδωτικά αυτά συντίθενται βιομηχανικά. Πολλά από αυτά, αν και παρουσιάζουν ακόμη και έντονη αντιοξειδωτική δράση, δεν χρησιμοποιούνται ως πρόσθετα τροφίμων, λόγω των αρνητικών επιπτώσεων τους στον ανθρώπινο οργανισμό. Συνθετικά αντιοξειδωτικά που επιτρέπονται ως πρόσθετα τροφίμων είναι το ΒΗΤ, το ΒΗΑ, το Trolox, το PG το TBHQ 21.Τα συνθετικά αντιοξειδωτικά μέσα χρησιμοποιούνται σε πολλούς κλάδους της βιομηχανίας. Στην κατηγορία των τροφίμων και των ειδών διατροφής τα αντιοξειδωτικά επιβραδύνουν την αυτοξείδωση των λιπών και προστατεύουν μ'αυτόν τον τρόπο την επιβλαβή επίδραση του οξυγόνου στα λίπη, τα καροτινοειδή, τις λιποδιαλυτές βιταμίνες A και Ε και σε άλλα συστατικά των τροφίμων. > Φυσικά αντιοξειδωτικά: η πλειοψηφία των φυσικών αντιοξειδωτικών είναι φαινολικές ενώσεις οι οποίες χωρίζονται σε τρεις κατηγορίες: τις τοκοφερόλες, τα φλαβονοειδή, και τα φαινολικά οξέα

40 3.3. Δράση των αντιοξειδωτικών Η δράση των αντιοξειδωτικών στηρίζεται στην απομάκρυνση ή την εξουδετέρωση των ROO και R' ελεύθερων ριζών και σε ορισμένες περιπτώσεις στην πλήρη αναστολή της οξείδωσης (στα σουλφονικά, στη διάσπαση από τα υπεροξείδια). Επειδή τα περισσότερα αντιοξειδωτικά δημιουργούν αλυσιδωτές αντιδράσεις, επιταχύνουν την παραγωγή ελεύθερων ριζών ROO και R, με τη δημιουργία μιας ανενεργού και αντιοξειδωτικής ελεύθερης ρίζας. Η απενεργοποίηση και η αναστολή της δράσης της ελεύθερης ρίζας συντελεί στην άρση της αλυσιδωτής αντίδρασης και στην παραγωγή σταθερών προϊόντων, μέσω διμερισμού. Η άμεση αντίδραση του αντιοξειδωτικού (ΑΗ) με ένα υπόστρωμα ελεύθερης ρίζας R, δίνεται από την αντίδραση: R + ΑΗ > RH + Α Επιγραμματικά αποδεικνύεται, πως όλοι οι αναστολείς της οξείδωσης πρέπει αφ ενός να είναι ενεργοί, ώστε να αντιδρούν με τις ελεύθερες ρίζες και να διασπάσουν την αλυσίδα και αφετέρου μεταφορικά ενεργά, για να αποφευχθεί η άμεση αντίδραση του οξυγόνου με την ανταλλασσόμενη ελεύθερη ρίζα. Η μεγάλη δραστικότητα των αντιοξειδωτικών, σε συνδυασμό με τις υψηλές συγκεντρώσεις κατά τη φάση της διάδοσης, μπορεί για παράδειγμα να οδηγήσει στη λειτουργία των αντιοξειδωτικών ως μεταφορέων και κατά συνέπεια στη δράση τους ως προοξειδωτικά 24. Όλοι αυτοί οι παράγοντες καθιστούν ολοφάνερο πως, η προσθήκη των αντιοξειδωτικών πρέπει να γίνεται πολύ πριν από το στάδιο της προαγωγής (διάδοση). Αν όμως στο υπόστρωμα αυξηθεί η συγκέντρωση των ελεύθερων ριζών, τότε το προστιθέμενο αντιοξειδωτικό ανταποκρίνεται γρήγορα και θα 37

41 καταναλωθεί, οπότε είναι πλέον αδύνατον να επιβραδυνθεί με παρεμβολή η πρόοδος της αλυσιδωτής αντίδρασης Οι αντιοξειδωτικές δράσεις του οίνου Τα συστατικά του οίνου είναι δυνατόν να διακριθούν σε τρεις μεγάλες κατηγορίες α) το νερό, β) τα οργανικά συστατικά γ) τα ανόργανα συστατικά. Στα οργανικά συστατικά του συγκαταλέγονται τα φαινολικά συστατικά, τα οποία αποτελούν και τις αντιοξειδωτικές του ουσίες. Οι ουσίες αυτές επηρεάζουν το χρώμα των οίνων, συμμετέχουν στη διαμόρφωση ορισμένων χαρακτηριστικών τους (στυφάδα, τραχύτητα), προσφέρουν στους οίνους αντιοξειδωτική και αντιμικροβιακή προστασία και παίζουν αποφασιστικό ρόλο στην παλαίωση και στις διάφορες τεχνολογικές επεξεργασίες (π.χ. κολλάρισμα). Προέρχονται από το φλοιό και τα κουκούτσια των σταφυλιών και τους βλαστούς του κλήματος. Το σύνολο του φαινολικού περιεχομένου αποτελείται από το άθροισμα των ανθοκυανινών, των φλαβονολών, των παραγώγων του υδροξυκινναμικού οξέος και μονομερών της γλαβαν όλης. Το σύνολο των φαινολικών οξέων, ελεύθερων ή με μορφή ενώσεων, φτάνει τα ιτ^/τ στους ερυθρούς οίνους, ενώ στους λευκούς περιορίζεται στα π^/τ 26. Φαινόλες Τα φαινολικά είναι σημαντικά για τον οίνο, γιατί έχουν αντιβιοτικές και αντισηπτικές ιδιότητες (βενζοικό οξύ, σαλικυλικό οξύ) και χρησιμοποιούνται για τη συντήρηση τροφίμων. Ενδέχεται τα οξέα αυτά να 38

42 παίζουν κάποιο ρόλο στη μικροβιολογική κατάσταση του οίνου, έναντι κυρίως των βακτηρίων26. Μερικά από τα φαινολικά, κυρίως εκείνα που έχουν 2 φαινολικά -ΟΗ σε θέση ορθό-(καφεικό και γαλλικό), έχουν την ιδιότητα να οξειδώνονται εύκολα και να οδηγούν σε θέση κινόνης. Οι κινόνες έχουν φαιά απόχρωση και θεωρείται ότι παίζουν κάποιο ρόλο στην οξειδωτική μετατροπή του χρώματος των λευκών γλευκών και οίνων σε καστανό. Κατά τη διάρκεια της γήρανσης τα φαινολικά οξέα υδρολύονται και περνούν σε ελεύθερη μορφή. Τα βενζοικά οξέα δε βρίσκονται ελεύθερα στο σταφύλι, αλλά με μορφή σύνθετων χημικών ενώσεων άγνωστης μέχρι τώρα δομής. Ωστόσο στις ενώσεις αυτές φαίνεται να συμμετέχουν και ανθυοκυάνες. Μερική αποδόμηση των ανθοκυανών με αλκοολική σαπωνοποίηση συντελεί στην εμφάνιση ελευθέρων βενζοικών οξέων. Έπειτα, τα παράγωγα του υδροξυκινναμικού οξέος δεν περιέχονται ελεύθερα στα σταφύλια και στους οίνους, αλλά με μορφή ενώσεων με τις ανθοκυάνες και με το τρυγικό οξύ, με το οποίο δίνουν τα παράγωγα, π- κουμαριλοτρυγικό, καφειλοτρυγικό και φαιρουλοτρυγικό. Η τυροσόλη, η φαινυλοαιθανόλη και η τρυπταφόλη συμμετέχουν στη διαμόρφωση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών του οίνου. Τέλος τα ερυθρά κρασιά περιέχουν φαινόλες σε σημαντικά υψηλότερες συγκεντρώσεις από τα λευκά κρασιά Εξαίρεση αποτελούν το γεντισικό και το φερουλικό οξύ. Σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις της τελευταίας ένωσης είναι χαρακτηριστικό του κρασιού Riesling 26. Σε μια έρευνα που πραγματοποιήθηκε για να βρεθεί η συγκέντρωση transρεσβερατρόλης στα ελληνικά παραγόμενα κρασιά, επιλέχθηκαν τριάντα ελληνικά κρασιά, 15 κόκκινα και 15 λευκά, που προέρχονται από εγχώριες 39

43 (Ελληνικές) και / ή Γαλλικές ποικιλίες, εξετάστηκαν για το περιεχόμενό τους σε ΐταηε- ρεσβερατρόλη, χρησιμοποιώντας την μέθοδο με μια άμεση έγχυση - ΗΡΙΧ, με βάση τις υφιστάμενες μεθόδους ελαφρώς τροποποιημένη. Τα κρασιά αγοράστηκαν από ένα τοπικό κατάστημα (Κηφισιά, Αθήνα) και διατηρήθηκαν σε 3 0 στο σκοτάδι έως ότου αναλυθούν. Ο μέσος όρος της ΐταηε-ρεσβερατρόλη ς σε λευκά κρασιά ήταν, όπως αναμενόταν, σημαντικά χαμηλότερη από εκείνο των ερυθρών οίνων. Όσον αφορά τα κόκκινα κρασιά, η συγκέντρωση της ουσίας αυτής φαίνεται να ποικίλλει σημαντικά, δεδομένου ότι εξαρτάται από διάφορους παράγοντες, όπως η ποικιλία, το κλίμα και τις τεχνικές οινοποίησης. Σε λευκά κρασιά, η ίτεηε-ρεσβερατρόλη βρίσκεται σε χαμηλά επίπεδα. Το γεγονός αυτό παρέχει αποδείξεις για το χαμηλό δυναμικό της λευκής ελληνική ποικιλίας να συνθέσει αυτή την φυτοαλεξίνη. Έχει διαπιστωθεί ότι η μέτρια κατανάλωση αλκοόλ έχει σημαντική προστατευτική επίδραση, λόγω των πολυφαινολών,στο καρδιαγγειακό σύστημα. Έχει παρατηρηθεί μείωση των ασθενειών σχεδόν στο 20-30%. Εργαστηριακές δοκιμές έχουν δείξει ότι η ρεσβερατρόλη έχει σημαντικές 98 αντιπηκτικές και αντιφλεγμονώδεις δράσεις. Η ρεσβερατρόλη (ΙΐνΤ) παρουσιάζει ισχυρή αντιοξειδωτική δράση, δηλαδή εξουδετερώνει οξυγονούχες ρίζες και οξειδωτικές ενώσεις που παράγονται στους διάφορους ιστούς ή κυκλοφορούν στο πλάσμα του αίματος. Με βάση αυτή την ιδιότητα έχουν γίνει πολυάριθμες έρευνες για την ΙΓνΎ και παράγωγά της με περισσότερα υδροξύλια Από την άποψη αυτή η ΙΌ/Τ διαθέτει καρδιοπροστατευτικές ιδιότητες. Στη διάρκεια ερευνών τέθηκε το ερώτημα εάν μπορούσαν να επωφεληθούν από την καρδιοπροστατευτική δράση του κόκκινου κρασιού 40

44 χωρίς να χρειάζεται να πιούν ούτε καν ένα ποτήρι; Και όμως, με πρόσφατες έρευνες, κάτι τέτοιο μπορεί να γίνει πραγματικότητα σύντομα χάρη σε αμερικανούς επιστήμονες που κατάφεραν να συνθέσουν τα χημικά που προέρχονται από τη ρεσβερατρόλη, την ουσία η οποία πιστεύεται ότι χαρίζει στο κρασί την ισχυρή αντιοξειδωτική δράση του. Τα χημικά αυτά έχουν την ικανότητα να «πολεμούν» πολλές και σοβαρές νόσους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Τα φυτά παράγουν από τη ρεσβερατρόλη μια τεράστια ποικιλία χημικών που ονομάζονται πολυφαινόλες προκειμένου να προστατεύονται από τους εισβολείς και κυρίως τους μύκητες. Μπορεί η ποικιλία των παραγόμενων ουσιών να είναι μεγάλη ωστόσο η ποσότητα του κάθε χημικού είναι πολύ μικρή με αποτέλεσμα να είναι πολύ δύσκολο για τους επιστήμονες να απομονώσουν και να χρησιμοποιήσουν αυτές τις ουσίες. Παράλληλα η ασταθής φύση της ρεσβερατρόλης καθιστούσε μέχρι σήμερα άκαρπες τις προσπάθειες δημιουργίας νέων ουσιών στο εργαστήριο με βάση το συγκεκριμένο χημικό. Ο Σκοτ Σνάιντερ από το Πανεπιστήμιο Κολούμπια στη Νέα Υόρκη και οι συνεργάτες του βρήκαν μια λύση σε αυτά τα προβλήματα, όπως αναφέρουν με δημοσίευσή τους στην επιθεώρηση «Nature»: επέτυχαν να δημιουργήσουν πολυφαινόλες από ουσίες που μοιάζουν, αλλά είναι ελαφρώς διαφορετικές από τη ρεσβερατρόλη. Αυτές οι διαφορές, αν και μικρές, κάνουν την όλη διαδικασία πολύ ευκολότερη. Με βάση τα εναλλακτικά «υλικά», οι ερευνητές κατάφεραν να δημιουργήσουν δεκάδες φυσικές πολυφαινόλες, συμπεριλαμβανομένης της vaticanol C, η οποία είναι γνωστό ότι εξολοθρεύει τα καρκινικά κύτταρα 32. Σύμφωνα με μια έρευνα σχετικά με την επίδραση των αρχών των πολυφαινολικών στα χαρακτηριστικά των αντιοξειδωτικών στα παλαιά 41

45 κόκκινα κρασιά, επιχειρήθηκε να επιτευχθεί όχι μόνο μια συνολική εκτίμηση της συνολικής συγκέντρωσης φαινόλης, αλλά και ο προσδιορισμός των συνολικών φλαβονολών και η συνολική ανθοκυανίνη, οι οποίες αντιπροσωπεύουν τις μεγαλύτερες τάξεις φλαβονοειδών στους ερυθρούς οίνους, και την αντιστοιχία τους με ορισμένες αντιπροσωπευτικές αντιοξειδωτικές παραμέτρους. Οι αναλύσεις που έγιναν με ΗΡΙ,Ο αποκάλυψαν ότι η εξέχουσα πολυφαινολική ένωση είναι το γαλλικό οξύ, καφταρικό οξύ, και το ρ-κουταρικό οξύ, αν και η κατεχίνη, η επικατεχίνη, η κερκετίνη, και η μαλβιδίνη διαπιστώθηκε ότι βρίσκονται σε επίπεδα που δεν μπορούν να αγνοηθούν. Προσπάθειες να συσχετιστούν οι αρχές των φαινολών με τις αντιοξειδωτικές παραμέτρους, ωστόσο, δεν ανταποκρίνεται με επιτυχία. Οι συντελεστές συσχέτισης που βρέθηκαν ήταν υπερβολικά χαμηλοί για να στηρίξουν τις παραδοχές ότι τα συστατικά αυτά επηρεάζουν άμεσα τις αντιοξειδωτικές συμπεριφορές των οίνων. Η πολυπλοκότητα της σύνθεσης στο κόκκινο κρασί δεν επιτρέπει τη διάκριση της κατηγορίας των ενώσεων που καθορίζουν την αντιοξειδωτική κατάσταση της ηλικίας στους ερυθρούς οίνους, αλλά οι αναλύσεις ΗΡΙΧ προβλέπουν την συνολική σύνθεση των οίνων και έδωσαν πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με τις μείζονες πολυφαινόλες, και διαπιστώθηκε ότι είναι μάλλον απίθανο ότι οι επιμέρους πολυφαινόλες μπορεί να είναι σε θέση να επηρεάσουν άμεσα την αντιοξειδωτική συμπεριφορά των οίνων 33,34 Φλαβονόλε Στις φλαβονοειδείς φαινόλες περιλαμβάνονται οι φλαβονόλες που έχουν ανοιχτό κίτρινο χρώμα και αφθονούν στα κουκούτσια, οι φλαβονόλες-3 (κατεχίνες), που υπάρχουν κυρίως στη φλούδα και στα κουκούτσια και οι φλαβονοδιόλες 3,4 (λευκοανθοκυάνες ή προκυανιδίνες), που υπάρχουν στη 42

46 φλούδα και κυρίως στα κουκούτσια. Επειδή οι φλαβονοειδείς φαινόλες βρίσκονται στο εσωτερικό του φλοιού και στα κουκούτσια, ενώ σε κανονικές συνθήκες δεν υπάρχουν στους λευκούς οίνους. Ανθοκυάνες Οι ανθοκυάνες είναι ερυθρές χρωστικές του σταφυλιού, οι οποίες εκτός από ελάχιστες περιπτώσεις, βρίσκονται μόνο στο φλοιό των ρογών. Από χημική άποψη είναι παράγωγα του φαινυλο - 2 βενζοπυριλίου, το μόριο του οποίου παρουσιάζει κάποια ιδιαιτερότητα. Η ιδιαιτερότητά του είναι ότι περιέχει σε μορφή θετικού ιόντος έναν οξυγονούχο ετεροκυκλικό δακτύλιο, το πυρόλιο, που επιτρέπει το σχηματισμό αλάτων με τα ανιόντα. Από το μόριου του φαίνυλο -2 βενζοπυριλίου προκύπτουν οι διάφορες ανθοκυανίδες του σταφυλιού. Η μαλβιδίνη είναι η σημαντικότερη από άποψη ποσότητας χρωστικής των ερυθρών σταφυλιών και γι αυτό ονομάζεται και οινιδίνη. Αντίθετα, η πελαργονιδίνη δεν περιέχεται καθόλου σε αυτά. Οι χρωστικές που συναντιούνται στη φύση δεν είναι ανθοκυανίδίνες, αλλά ενώσεις αυτών με ένα ή δυο μόρια κάποιου σακχάρου και ονομάζονται ανθοκυανίνες (ή ανθοκυάνες ). Στις ανθοκυάνες των σταφυλιών το σάκχαρο που συμμετέχει στο σχηματισμό του μορίου τους είναι η γλυκόζη. Έτσι, ανάλογα με τη θέση στην οποία προσκολλάται η γλυκόζη στο μόριο της ανθοκυανιδίνης σχηματίζονται οι μονογλυκοζίτες και οι διγλυκοζίτες. Ταννίνες Οι ταννίνες είναι προϊόντα πολύ μερισμού των απλών φαινολών. Το μοριακό τους βάρος κυμαίνεται μεταξύ 500 και Αν τα μόρια των ταννινών είναι πολύ μικρά δεν υπάρχουν αρκετές ενεργές θέσεις και έτσι οι ενώσεις που σχηματίζονται με τις πρωτεΐνες είναι ασταθείς. Αλλά και στην 43

47 περίπτωση που τα μόρια των ταννινών είναι υπερβολικά μεγάλα, τότε αυτά δεν μπορούν να πλησιάσουν αρκετά τις πρωτεΐνες και παρεμποδίζεται έτσι ο σχηματισμός ενώσεων. Επίσης η ιδιαίτερη στυφή γεύση ορισμένων οίνων οφείλεται στην παρουσία ορισμένων τανινών (μοριακό βάρος: ). Οι "επιθετικές" αυτές ταννίνες έχουν την ιδιότητα να ενώνονται με τις πρωτεΐνες και να εξαφανίζονται, ενώ οι " μη επιθετικές " δεν ενώνονται με τις πρωτεΐνες και παραμένουν στον οίνο. Ανάλογα με τη δομή των μορίων τους, οι ταννίνες διακρίνονται στις υδρολυμένες και στις συμπυκνωμένες. Οι υδρολυμένες ταννίνες αποτελούνται από ένα γλυκοσίδιο πάνω στο οποίο προσκολλούνται διάφορες φαινολικές ενώσεις, όπως το γαλλικό και το ελλαγικό οξύ. Επιπλέον, οι υδρολυμένες ταννίνες δεν περιέχονται στα σταφύλια αλλά είναι δυνατόν να βρεθούν σε οίνους, γιατί αποτελούν τις κύριες εμπορικές ταννίνες, που χρησιμοποιούνται στις διάφορες κατεργασίες αυτών. Οι συμπυκνωμένες ταννίνες είναι οι φυσικές ταννίνες των σταφυλιών και των οίνων και προέρχονται από τον πολυμερισμό της φλαβονόλης - 3 (κατεχίνη) και κυρίως της φλαβονοδιόλης - 3,4 (λευκοκιανιδίνη). Οι τελευταίες δεν είναι ταννίνες, αλλά μόρια που θα συμπυκνωθούν για να δώσουν ταννίνες. Οι συνηθισμένες φυσικές ταννίνες του σταφυλιού απαρτίζονται από τις φλαβονάλες, οι οποίες είναι ολιγομερή, που περιλαμβάνουν 2 μέχρι 10 ή 12 στοιχειώδη μόρια. Η διαφορά που υπάρχει ανάμεσα στις κατεχίνες και στις λευκοκυανιδίνες οφείλεται στο γεγονός ότι οι πρώτες μετά από θέρμανση στους και σε όξινο περιβάλλον, μετατρέπονται κατά 100% σε φλοιοβένιο (προϊόν με καστανόμαυρο χρώμα), και οι δεύτερες μετατρέπονται κατά 80% σε φλοιοβένιο και κατά 20% σε κυανιδίνη, η οποία είναι μια ανθοκυάνη 44

48 ερυθρού χρώματος. Στην τελευταία αντίδραση στηρίζεται ο ποσοτικός προσδιορισμός των ταννινών. Οι ταννίνες των σταφυλιών βρίσκονται στα στερεά μέρη τους και παραλαμβάνονται είτε με εκχύλιση είτε με συμπίεση. Από την ποσότητα των ταννινών που περιέχεται στο σταφύλι ένα ελάχιστο ποσοστό μεταφέρεται στον οίνο. Το ποσοστό αυτό από μετά από τις μειώσεις που παθαίνει από τα διάφορα φαινόμενα στους ερυθρούς οίνους κυμαίνεται μεταξύ 1,5 και 4 g / ί, ενώ στους λευκούς οίνους μεταξύ 40 και 200 mgfl. Οι ταννίνες χαρακτηρίζονται για την αντιοξειδωτική τους δράση με την οποία προστατεύονται οι ερυθροί οίνοι από τις επιδράσεις του οξυγόνου. Επίσης διακρίνονται για τις ενώσεις που σχηματίζουν με το Εε, λόγω των 2 ΟΗ που βρίσκονται στη θέση ορθό- του πλάγιου δακτυλίου (κατεχολική θέση). Οι ενώσεις αυτές συμμετέχουν στο σιδηρικό θόλωμα των οίνων και στο οξειδωτικό μαύρισμα διαφόρων φρουτοχυμών που είναι ανεπιθύμητο 26. Από την ποικιλία των σταφυλιών, τις κλιματολογικές συνθήκες και το είδος της οινοποίησης εξαρτάται και η ανομοιογένεια της υφής των ταννινών. Οι ερυθροί οίνοι δεν αντέχουν στην παλαίωση. Η ύπαρξη μικρών μόνο μορίων οφείλεται στο σύντομο χρόνο εκχύλισης, που γι αυτόν τον τύπο οίνων αποβλέπει περισσότερο στην παραλαβή χρώματος δηλαδή ανθοκυανών Ελεύθερες ρίζες, αντιοξειδωτικά και υγεία Σε κάθε βιολογικό σύστημα πρέπει να διατηρείται η ισορροπία μεταξύ του σχηματισμού και της απομάκρυνσης των δραστικών ειδών οξυγόνου (ΔΕΟ). Έχει υπολογισθεί ότι περίπου ελεύθερες ρίζες τη μέρα «Βομβαρδίζουν» κάθε κύτταρο μας. Η αύξηση των οξειδώσεων των ΔΕΟ οδηγεί τα κύτταρα σε μία κατάσταση που λέγεται οξειδωτικό στρες και είναι 45

49 παράγοντας πρόκλησης ασθενειών. Λόγω της συνεχούς έκθεσης σε ΔΕΟ και για την πρόληψη του οξειδωτικού στρες, ο οργανισμός μας, όπως όλα τα φυτά και τα ζώα, έχει αναπτύξει για προστασία διάφορους αντιοξειδωτικούς μηχανισμούς στους οποίους παίρνουν μέρος αντιοξειδωτικές ουσίες. Γενικά χαρακτηρίζουμε ως αντιοξειδωτική ουσία κάθε ουσία η οποία βρίσκεται σε μικρές συγκεντρώσεις σε σύγκριση με το υπόστρωμα που οξειδώνεται και η οποία καθυστερεί σημαντικά ή αποτρέπει την οξείδωση του υποστρώματος αυτού. Ως ελεύθερη ρίζα ορίζεται κάθε είδος ατόμου ή χημικής ένωσης που έχει την ικανότητα ανεξάρτητης ("ελεύθερης") ύπαρξης και μπορεί να περιέχει ένα ή και περισσότερα ασύζευκτα ηλεκτρόνια. Οι ελεύθερες ρίζες είναι ασταθείς και ιδιαίτερα δραστικές ενώσεις. Αρχικά δημιουργείται με κάποιο τρόπο μία ελεύθερη ρίζα (έναρξη). Τα κυριότερα από τα αρχικά προϊόντα της αυτοξείδωσης είναι τα υδροϋπεροξείδια. Αυτά στη συνέχεια δίνουν νέες ρίζες υπεροξειδίων, άλλα υδροϋπεροξείδια και νέες ρίζες από το υδρογοανθρακικό τμήμα του μορίου (διάδοση). Με τον τρόπο αυτό οι αντιδράσεις των ελεύθερων ριζών τείνουν να είναι αλυσιδωτές αναγεννώντας συνέχεια νέα άτομα ή ενώσεις με ασύζευκτα ηλεκτρόνια. Η αντίδραση θα σταματήσει όταν όλες οι ελεύθερες ρίζες αντιδράσουν προς προϊόντα που δεν παρέχουν πλέον νέες ελεύθερες ρίζες. Τα αντιοξειδωτικά γενικά λειτουργούν με δύο τρόπους: (1) είτε παρεμποδίζουν τη δημιουργία ΔΕΟ, (2) είτε σταματούν τη διάδοση των ελεύθερων ριζών που προκαλείται από τις αλυσιδωτές αντιδράσεις. Επίσης είναι δυνατόν η παρουσία κάποιου αντιοξειδωτικού (για παράδειγμα της βιταμίνης Ο) να συμβάλλει στη διατήρηση της αντιοξειδωτικής δράσης κάποιου άλλου αντιοξειδωτικού, όπως της τοκοφερόλης. Στην περίπτωση 46

50 αυτή έχουμε συνεργατική δράση των δύο αντιοξειδωτικών και λέμε ότι η βιταμίνη Ο έχει συν-αντιοξειδωτική δράση. Μπορούμε επίσης να διαφοροποιήσουμε τα αντιοξειδωτικά ανάλογα με την προέλευση τους και τη χημική τους σύσταση. Έτσι υπάρχουν ενδογενείς αντιοξειδωτικές ουσίες και αντιοξειδωτικά τα οποία προσλαμβάνει ο οργανισμός μας με την τροφή 37. Τα ενδογενή αντιοξειδωτικά διακρίνονται σε ουσίες: (α) μεγάλου Μοριακού Βάρους (ΜΒ) και (β) μικρού ΜΒ. Στην πρώτη κατηγορία περιλαμβάνονται ένζυμα, όπως η δισμουτάση του υπεροξειδίου, η καταλάση, η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης, η παραοξονάση και το πρωτεάσωμα τα οποία ελαττώνουν τη δημιουργία ΔΕΟ μέσω της απομάκρυνσης δυνητικών οξειδωτικών ή μετατρέποντας ΔΕΟ σε σχετικά σταθερές χημικές ενώσεις. Στην κατηγορία αυτή περιλαμβάνονται επίσης διάφορες πρωτεΐνες του πλάσματος (αίμα) όπως η αλβουμίνη, η σερουλοπλασμίνη, η τρανσφερίνη και η αιμογλοβίνη, οι οποίες δεσμεύουν μεταλλικά ιόντα και ως εκ τούτου περιορίζουν τη δημιουργία ελεύθερων ριζών μέσω αντιδράσεων που καταλύονται από μέταλλα. Τα μικρού ΜΒ ενδογενή αντιοξειδωτικά υποδιαιρούνται περαιτέρω σε λιποδιαλυτά αντιοξειδωτικά μικρά χημικά μόρια, όπως η τοκοφερόλη (βιταμίνη Ε), τα καροτενοειδή, η χολερυθρίνη, ορισμένες κινόνες και πολυφαινόλες και σε υδατοδιαλυτά μόρια, όπως το ασκορβικό οξύ (βιταμίνη Ο), το ουρικό οξύ και ορισμένες πολυφαινόλες. Τα κυριότερα αντιοξειδωτικά της διατροφής αποτελούν λιποδιαλυτές και υδατοδιαλυτές φυτικές ενώσεις όπως η τοκοφερόλη, το β-καροτένιο, το λυκοπένιο, η βιταμίνη Ο, η λουτεΐνη και διάφορες πολυφαινόλες 37. Σύμφωνα με επιδημιολογικές και εργαστηριακές έρευνες, βρέθηκε πού οφείλεται η ευεργετική δράση του κρασιού. Οι επιστήμονες, λοιπόν, 47

51 διαπίστωσαν ότι η ουσία που δρα προστατευτικά στα αγγεία και στην καρδιά είναι κυρίως η αιθυλική αλκοόλη. Η ουσία αυτή βελτιώνει το λιπιδαιμικό προφίλ του καταναλωτή κρασιού, αυξάνοντας την «καλή» χοληστερόλη (HDL) και μειώνοντας την «κακή» χοληστερόλη ( LDL). Επομένως βοηθά στη μείωση του κινδύνου αθηροσκλήρωσης. Επίσης, η αιθυλική αλκοόλη δρα αγγειοδιασταλτικά. Διαστέλλει τα αγγεία, έχει μια χαλαρωτική δράση στα αγγεία της καρδιάς, του εγκεφάλου αλλά και περιφερειακά, έτσι βοηθάει στην καλύτερη παροχή αίματος. Η ρεσβερατρόλη είναι μέλος της οικογένειας των πολυφαινολών, που ονομάζονται βινιφερίνες και αποτελεί συστατικό της φλούδας των κόκκινων σταφυλιών. Επειδή ο μούστος των κόκκινων σταφυλιών αφήνεται να ζυμωθεί περισσότερες ώρες μαζί με τις φλούδες των σταφυλιών, σε σύγκριση με το μούστο των λευκών σταφυλιών, το κόκκινο κρασί περιέχει περισσότερη ρεσβερατρόλη. Η έρευνα έδειξε ότι, παρά το γεγονός ότι οι Γάλλοι καταναλώνουν πολλά κεκορεσμένα λιπαρά με τη δίαιτά τους, εν τούτοις δεν εμφανίζουν τόσο μεγάλη συχνότητα καρδιαγγειακών παθήσεων. Το γεγονός αυτό ονομάστηκε Γαλλικό Παράδοξο και έχει αποδοθεί στα αντιλιπιδαιμικά αποτελέσματα της μέτριας κατανάλωσης κόκκινου κρασιού38. Το κόκκινο κρασί περιέχει και μεγάλο ποσοστό ουσιών που χαρακτηρίζονται από μεγάλη αντιοξειδωτική δράση (πολυφαινόλες), οι οποίες βρίσκονται και στα φρούτα και τα λαχανικά. Οι ουσίες αυτές - ανάμεσά τους και η ρεσβερατρόλη που έχει βρεθεί ότι μειώνει τα επίπεδα της ομοκυστεϊνης, η οποία υπάρχει σε υψηλά επίπεδα σε καρδιαγγειακά νοσήματα- δεσμεύουν και εξουδετερώνουν τις ελεύθερες ρίζες οξυγόνου που είναι τοξικοί παράγοντες. 48

52 Οι ελεύθερες ρίζες δρουν στα αγγεία και προδιαθέτουν για την ανάπτυξη αθηροσκλήρωσης και στεφανιαίας νόσου. Οι αντιοξειδωτικές ουσίες ανταγωνίζονται, δεσμεύουν και εξουδετερώνουν τις βλαπτικές ελεύθερες ρίζες και το κρασί (ιδιαίτερα το κόκκινο) περιέχει πολλές από τις ευεργετικές αυτές ουσίες. Όμως, σύμφωνα με μεγάλη μερίδα επιστημόνων, η κύρια δράση του κρασιού δεν οφείλεται στις αντιοξειδωτικές ουσίες αλλά καθαρά στην αλκοόλη που περιέχει. Άλλοι πάλι υποστηρίζουν ότι η ευεργετική δράση του κόκκινου κρασιού οφείλεται στις πολλές αντιοξειδωτικές ουσίες που περιέχει και όχι μόνο στην αιθυλική αλκοόλη. Ωστόσο η υπερβολική κατανάλωση αλκοόλ μπορεί να βλάψει τον καρδιακό μυ, να αυξήσει την αρτηριακή πίεση και να οδηγήσει σε πρόσληψη βάρους και φυσικά στον θάνατο, γιατί ας μη ξεχνάμε ότι η χώρα μας έχει την υψηλότερη θνησιμότητα από τροχαία ατυχήματα στην Ευρώπη και το μεγαλύτερο ποσοστό τους οφείλεται στη χρήση οινοπνευματωδών ποτώ ν31. 49

53 Κεφάλαιο Μέθοδοι προσδιορισμού και διαχωρισμού των φαινολικών ενώσεων και της αντιοξειδωτικής ικανότητας Έχουν αναπτυχθεί ποικίλες μέθοδοι για τον προσδιορισμό της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας διαφόρων βιολογικών δειγμάτων, όπως το πλάσμα ή ο ορός, το κρασί, τα φρούτα και τα λαχανικά, ή ζωικοί ιστοί. Οι μέθοδοι αυτοί είναι απαραίτητοι λόγω: (α) της δυσκολίας της μέτρησης κάθε αντιοξειδωτικού συστατικού ξεχωριστά και (β) των πιθανών αλληλεπιδράσεων μεταξύ των διαφόρων αντιοξειδωτικών συστατικών σε πολύπλοκα βιολογικά δείγματα. Ο προσδιορισμός της αντιοξειδωτικής δράσης ενός δείγματος περιλαμβάνει κυρίως την ικανότητα του δείγματος να δώσει ηλεκτρόνια (ή άτομα υδρογόνου) σε ένα ειδικό ΔΕΟ (δραστικό είδος οξυγόνου) ή σε κάθε δέκτη ηλεκτρονίων. Το προϊόν της αντίδρασης αυτής μετράται τελικά με μία αναλυτική μέθοδο όπως αυτές που αναφέρθηκαν στην περίπτωση προσδιορισμού των ΔΕΟ. Παρακάτω αναφέρονται μερικές από τις σπουδαιότερες μεθόδους μέτρησης ΤΟ αντιοξειδωτικής δράσης Μέθοδος ΡοΗπ- ΟίοοΒίίειι Είναι μία φωτομετρική τεχνική που εφαρμόζεται για τον προσδιορισμό του ολικού φαινολικού περιεχομένου σε φυσικά προϊόντα και βασίζεται στην αναγωγική δράση, παρουσία πολυφαινολικών ομάδων. Η μέθοδος 50

54 είναι εξαιρετικά χρήσιμη αφού επιτρέπει την εκτίμηση του συνόλου των πολυφαινολικών συστατικών ενός φυσικού προϊόντος, συμπεριλαμβανομένων και αυτών που δεν έχουν μέχρι σήμερα ταυτοποιηθεί. Η μέθοδος βασίζεται σε χρωματομετρική οξειδοαναγωγική αντίδραση με την οποία προσδιορίζεται το συνολικό φαινολικό περιεχόμενο του δείγματος, χωρίς διαχωρισμό μεταξύ μονομερών, διμερών και μεγαλύτερων φαινολικών συστατικών. Το αντιδραστήριο ΤΟ είναι διάλυμα σύνθετων πολυμερών ιόντων που σχηματίζονται από φωσφο-μολυβδαινικά και φωσφοβολφραμικά ετεροπολυμερή οξέα. Τα φαινολικά ιόντα οξειδώνονται με ταυτόχρονη αναγωγή των ετεροπολυμερών οξέων: Ρ2Ψ > Η4Ρ2Ψ , Η2Ρ2Μο > Η6Ρ2Μο Το προϊόν είναι σύμπλεγμα μολυβδαινίου-βολφραμίου (Μο-\ ) χαρακτηριστικής μπλε χρώσης που απορροφά στο ορατό (725ηιη). Η αλκαλικότητα ρυθμίζεται με κορεσμένο διάλυμα Νε2<203 (35%, \ν/ν) που δεν διαταράσσει τη σταθερότητα του ΤΟ και του προϊόντος της αντίδρασης αφενός, αφετέρου αποτελεί προϋπόθεση παρουσίας των φαινολικών ιόντων40. Γενικά, οι φαινόλες που καθορίζονται από τον δείκτη ΤΟ εκφράζονται πολύ συχνά σε ισοδύναμα γαλλικού οξέος26,41. Η μέθοδος αυτή προσδιορίζει τις ολικές φαινολικές ενώσεις ενός δείγματος και είναι η πλέον αποδεκτή. Βασίζεται στην οξείδωση των φαινολικών ενώσεων σε αλκαλικό περιβάλλον με μίγμα φωσφοροβολφραιμικού (Η3ΡΨ12040) και φωσφορομολυβδαινικού οξέος (Η3ΡΜο12Ο40). Κατά την αντίδραση οι φαινολικές ομάδες οξειδώνονται σε ομάδες με δομή κινόνης και τα οξέα φωσφοροβολφραιμικού και φωσφορομολυβδαινικού ανάγονται σε οξείδια βολφραιμίου (Ψ8023) και μολυβδαινίου (Μ ο023) μπλε χρώματος. Γενικά, οι φαινόλες που 51

55 καθορίζονται από τον δείκτη FC εκφράζονται πολύ συχνά σε ισοδύναμα γαλλικού οξέος 26,40. Δεδομένου ότι η μέθοδος αυτή μετράει το σύνολο των φαινολών η επιλογή του γαλλικού οξέος ως πρότυπο βασίζεται στη διαθεσιμότητα μιας καθαρής και σταθερής ουσίας, και το γαλλικό οξύ τηρεί και τους δυο αυτούς παράγοντες και είναι σχετικά φθηνό. Επίσης έχει εξεταστεί η σταθερότητα των πρότυπων διαλυμάτων Trolox και έχει αποδειχτεί ότι αυτά χάνουν λιγότερο από το 5% της αξίας του σε χρονικό διάστημα άνω των δυο εβδομάδων, όταν διατηρούνται στεγανά κλεισμένα στο ψυγείο. Εκτός από το αντιδραστήριο Trolox έχει βρεθεί ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί και το γαλλικό οξύ. Σύμφωνα με έρευνες που έχουν γίνει, τα αντιδραστήρια Trolox και γαλλικό οξύ, σαν πρότυπα αντιδραστήρια σ'αυτή τη μέθοδο, είναι παρόμοια θεωρώντας ότι το Trolox είναι μια μονοφαινόλη και το Γαλλικό Οξύ μια τριφαινόλη Μέθοδος του δείκτη υπερμαγγικού Καλίου (ΚΜη04) Όπως και η μέθοδος Follin-Ciocalteu έτσι και αυτή προσδιορίζει τις ολικές φαινολικές ουσίες σε ένα δείγμα. Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην οξείδωση των φαινολικών ουσιών από το υπερμαγγανικό κάλιο, στη θερμοκρασία του περιβάλλοντος. Το τέλος της αντίδρασης σημειώνεται με την αλλαγή του χρώματος του δείκτη carmin-indigo, από το κυανό στο κίτρινο. Ο δείκτης αυτός οξειδώνεται πριν από ορισμένα συστατικά του δείγματος, αλλά μετά από τις φαινολικές ουσίες. Η αλλαγή του χρώματός του συμπίπτει με το τέλος της οξείδωσης των φαινολικών ουσιών, έτσι ώστε να αποφεύγεται παραπέρα κατανάλωση (ΚΜηθ4) για οξείδωση άλλων διαφόρων συστατικών του δείγματος26. 52

56 Μέθοδος DPPH Η μέθοδος DPPH (1,1-διφαίνυλο-2-πικρύλοϋδράζυλο) είναι μία μέθοδος εκτίμησης του πολυφαινολικού περιεχομένου που βασίζεται στη μέτρηση της ικανότητας δέσμευσης ελεύθερων ριζών 1,1 -διφαίνυλο-2- πικρύλοϋδράζυλο (DPPH). Στην ικανότητα αυτή των πολυφαινολών, αποδίδεται η αντιοξειδωτική τους δράση, με αποτέλεσμα η μέθοδος αυτή να δίνει μετρήσεις της συνολικής αντιοξειδωτική ς ικανότητας των πολυφαινολών. Αποτελεί in vitro τεχνική και πλεονεκτεί ως προς το ότι η δέσμευση των ελεύθερων ριζών του DPPH από τις πολυφαινόλες του δείγματος και η φασματοφωτομέτρηση του συνολικού διαλύματος αντίδρασης (π.χ. εκχύλισμα-dpph) δεν είναι χρονοβόρες διαδικασίες. Οι φωτομετρήσεις πραγματοποιούνται περίπου μία ώρα μετά την παρασκευή του διαλύματος στα nm. Υψηλή αντιοξειδωτική ικανότητα συνεπάγεται αυξημένη δέσμευση των ελευθέρων (κατά τα άλλα σταθερών) ριζών του DPPH., παραγωγή ανοιχτόχρωμου προϊόντος (από ιώδες σε ανοιχτό κίτρινο) και κατά επέκταση μειωμένη τιμή απορρόφησης. Η ικανότητα αυτή του δεσμευτικού παράγοντα στηρίζεται στην προσφορά ενός ατόμου υδρογόνου κάθε φορά, γεγονός που οδηγεί σε αύξηση του βαθμού δέσμευσης ελευθέρων ριζών 40,43. Τα αποτελέσματα εκφράζονται σε ισοδύναμα Trolox (μονάδες συγκέντρωσης) συνήθως σε mmol/ Μέθοδος HPLC και μέθοδος TLC Οι πλέον χρησιμοποιούμενες τεχνικές διαχωρισμού, ταυτοποίησης και ποσοτικού προσδιορισμού των φαινολικών ουσιών των τροφίμων είναι η χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC) και η υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC). 53

57 H HPLC ονομάζεται η μέθοδος χρωματογραφίας στήλης, η οποία εκτελείται με τη βοήθεια ενός συγκροτήματος οργάνων (συσκευή υγρού χρωματογράφου). Ως κινητή φάση χρησιμοποιούνται διαλύτες (οργανικοί, νερό, ρυθμιστικά διαλύματα και άλλα) υπό ελεγχόμενη πίεση, ενώ η στατική φάση αποτελείται από πυριτική πηκτή ή από πολυμερείς ενώσεις. Ανάλογα με το είδος της στατικής φάσης, η μέθοδος HPLC αποδίδει χρωματογραφικούς διαχωρισμούς σύμφωνα με τις αρχές προσρόφησης ή της κατανομής ή συνδυασμού αυτών, ή της ιοντοανταλλαγής ή τέλος της μοριακής διήθησης 44. Η HPLC χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό πολύπλοκων ανόργανων και οργανικών μιγμάτων καθώς και στην ποιοτική και ποσοτική ανάλυση. Είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για το διαχωρισμό και την ανάλυση μιγμάτων μοριακών, ή ιοντικών ενώσεων με χαμηλές τάσεις ατμών καθώς και θερμικά ασταθών ενώσεων, που δεν μπορούν να εξαερωθούν χωρίς να διασπαστούν. Σε αντίθεση με την αέρια χρωματογραφία, χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό μιγμάτων ουσιών μεγάλου μοριακού βάρους και πολικότητας, προσδιορίζοντας σε ιόντα ποσότητες της τάξης του ppb. Η μέθοδος HPLC έχει πολύ μεγάλη εφαρμογή στην ανάλυση βιολογικών και φαρμακευτικών μιγμάτων καθώς και των μεταβολιτών τους. Στην ποσοτική ανάλυση χρησιμοποιούνται οι ίδιες τεχνικές με την αέρια χρωματογραφία.33. Στην HPLC μπορούν να συμπεριληφθούν και να εφαρμοστούν όλα τα είδη που λαμβάνουν χώρα στους χρωματογραφικούς διαχωρισμούς, με την κατάλληλη χρήση υλικού πληρώσεως της στήλης και του διαλύτη έκλουσης. Η HPLC υπερέχει της TLC επειδή επιτυγχάνονται αποτελεσματικότεροι διαχωρισμοί ώστε να είναι δυνατή μια καλύτερη ποιοτική ανάλυση. Σ αυτή συμβάλλουν σημαντικά: α) οι χρησιμοποιούμενες στήλες silica για τον διαχωρισμό μη πολικών φαινολών με ισοκρατική έκλουση και αντίστροφης 54

58 φάσης για τον διαχωρισμό πολικών φαινολών με την βαθμωτή έκλουση, και β) ο συνηθέστερος χρησιμοποιούμενος ανιχνευτής υπεριώδους, αφού όλες οι φαινολικές ενώσεις εμφανίζουν ένα ή περισσότερα μέγιστα απορρόφησης στην περιοχή από τα 230 μέχρι τα 290nm. Η χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC) είναι μια σημαντική τεχνική διαχωρισμού φαινολικών συστατικών και ανίχνευσης μεταξύ αυτών που εμφανίζουν αντιοξειδωτικές ιδιότητες. Ο διαχωρισμός γίνεται σε πλάκες με στατική φάση κυτταρίνη, πολυαμίδιο και συνηθέστερα silica gel, ενώ ως σύστημα ανάπτυξης μίγματα διαφόρων διαλυτών. Για την επιλογή των καταλληλότερων από αυτά λαμβάνεται υπόψη η πολικότητα των συστατικών των οποίων επιδιώκεται ο διαχωρισμός. Επειδή ελάχιστες φαινολικές ενώσεις είναι έγχρωμες και επομένως απευθείας ανιχνεύσιμες πάνω στην πλάκα, συνήθως η τελευταία παρατηρείται στο υπεριώδες φως και ψεκάζεται με διάφορα αντιδραστήρια. Η εμφάνιση φθορισμού και χαρακτηριστικών χρώσεων αποτελεί ένδειξη παρουσίας φαινολικών ενώσεων με ιδιαίτερα δομικά χαρακτηριστικά ή και αντιοξειδωτική δράση Μέθοδος FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) Η δοκιμή FRAP (ferric reducing antioxidant power) είναι μία γρήγορη και άμεση φασματοφωτο μετρική μέθοδος υπολογισμού της συνολικής αντιοξειδωτική ς δύναμης (αναγωγικής ικανότητας) ενός φυτικού εκχυλίσματος και στηρίζεται στην αναγωγή, κάτω από όξινες συνθήκες, του συμπλόκου Fe+ -τριπυρίδυλο-τριαζίνη (Fe+ -ΤΡΤΖ) σε δισθενή μορφή, που αποκτά έντονο μπλε χρώμα και απορροφά στα 593 nm.45 Οι συνθήκες της δοκιμής ευνοούν την αναγωγή του τρισθενούς συμπλόκου από το σύνολο των αντιοξειδωτικών ουσιών που βρίσκονται στο διάλυμα δοκιμής46. 55

59 Το ποσοστό της μείωσης του ferrylmetmyoglobin που καθορίζεται φασματοσκοπικά στην ορατή περιοχή, προτάθηκε για να χαρακτηρίζει την αντιοξειδωτική ικανότητα των φλαβονοειδών. Ωστόσο, η ερώτηση για τη σχέση μεταξύ της μεθόδου FRAP και της αντιοξειδωτικής ικανότητας παραμένει ανοιχτή 46. Η μέθοδος αυτή θεωρείται μια οικονομική και αξιόπιστη μέθοδος αλλά έχει το μειονέκτημα ότι δεν προσδιορίζει τις θειολικές ομάδες σαν αντιοξειδωτικά. Όμως επειδή δεν υπάρχουν αντιοξειδωτικές θειόλες σε διαιτητικά φυτά και στα παράγωγά τους, παρά μόνο στο σκόρδο, η μέθοδος FRAP μπορεί να χρησιμοποιηθεί για μέτρηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας σε φυτικό υλικό 47 Τα αποτελέσματα συνήθως εκφράζονται ως 48 ισοδύναμα βιταμίνης C Μέθοδος ABTS Η δοκιμή ABTS είναι πιθανώς η επικρατέστερη και συχνότερα χρησιμοποιούμενη μεταξύ δοκιμών για τον προσδιορισμό της αντιοξειδωτικής ικανότητας στα τρόφιμα. Η μέθοδος αυτή βασίζεται στον έλεγχο του αποχρωματισμού του ριζικού κατιόντος ABTS+ που παράγεται από την οξείδωση του αντιδραστηρίου 2,2'azinobis-(3-ethylbenzothiaziline- 6sulfonate) (ABTS). Η οξείδωση προκαλείται από την προσθήκη ενός χημικού οξειδωτικού παράγοντα (π.χ. K2S208). To ABTS+ παρουσιάζει μια ισχυρή απορρόφηση στα nm και μπορεί να καθοριστεί εύκολα φασματοφωτομετρικά. Ελλείψει φαινολικών ουσιών, το ABTS+ είναι σταθερό, αλλά όταν αντιδρά με ένα δότη χ-ατόμων, όπως οι φαινολικές ουσίες, μετατρέπεται σε μια "μη χρωματισμένη" μορφή, η οποία προσδιορίζεται φασματοφωτομετρικά. Επομένως, όταν η συγκέντρωση των φαινολικών ουσιών είναι μεγαλύτερη η μη χρωματισμένη μορφή του 56

60 ABTS+ θα είναι πιο έντονη, δηλαδή θα έχουμε πιο έντονο αποχρωματισμό. Η ποσότητα του ABTS+ που καταναλώνεται λόγω της αντίδρασης με τις φαινολικές ουσίες εκφράζεται σε ισοδύναμα Trolox (μονάδες συγκέντρωσης) ή και σε ισοδύναμα γαλλικού οξέος και εκφράζει την αντιοξειδωτική ικανότητα του δείγματος49. Το ABTS+ μπορεί να παραχθεί είτε από χημική αντίδραση π.χ. με οξείδιο του μαγγανίου (IV) (Μ η02), με υπερθεϊικό κάλιο (K2S208) ή από ενζυμικές αντιδράσεις (π.χ. μεθμυοσφαιρίνη, αιμοσφαιρίνη). Γενικά η χημική αντίδραση απαιτεί πολύ χρόνο (μέχρι και 16 ώρες για την παραγωγή υπερθεϊικού καλίου) ή υψηλές θερμοκρασίες, ενώ οι ενζυμικές αντιδράσεις είναι ταχύτερες και οι συνθήκες αντίδρασης ηπιότερες. Η μέγιστη απορρόφηση του ABTS+ αποδείχτηκε ότι είναι σε μήκη κύματος 415, 645, 734 και 815nm. Τα μήκη κύματος, τα οποία επιλέχτηκαν από τους περισσότερους ερευνητές για να ελέγξουν φασματοφωτομετρικά την αντίδραση μεταξύ των αντιοξειδωτικών και του ABTS+ είναι 415 και 734nm Μέθοδος ORAC (Oxygen Radial Absorbance Capacity) Είναι μία μέθοδος προσδιορισμού της αντιοξειδωτικής ικανότητας. Χρησιμοποιεί μία «γ ε ν ν ή τ ρ ια» ελευθέρων ριζών, μέσω θερμικής αποσύνθεσης μίας αζωτοένωσης, ώστε να δώσει μία σταθερή ροή υπεροξυλο-ριζών σε ένα κορεσμένο διάλυμα αέρα. Τα αντιοξειδωτικά συναγωνίζονται με το υπόστρωμα για τις ρίζες και εμποδίζουν ή επιβραδύνουν την οξείδωση του υποστρώματος. Σύμφωνα με την πρότυπη μορφή αυτής της μεθόδου, ο ρυθμός της υπεροξείδωσης που προκαλείται από την ένωση 2,2 -diazobis (2-amidinopropane) dihydrochloride (ΑΑΡΗ ή ΑΒΑΡ) ρυθμίζεται μέσω της απώλειας του φθορισμού της β-ρε είναι μία 57

61 ένδειξη φθοράς από την αντίδρασή της με την υπεροξυλο-ρίζα. Συνήθως η χρονική υστέρηση που προκαλείται από το δείγμα συγκρίνεται με αυτή που προκαλείται από το διάλυμα Trolox. Η ένταση του φθορισμού ( nm) μετρείται για 35min σε ρη=7,4 και στους 37oC 48. Η δοκιμασία μετρά την οξειδωτική υποβάθμιση του φθορισμού μόριο (είτε β-φυκοερυθρίνη ή φλουορεσκεΐνη ) αφού αναμειχθούν με ελεύθερων ριζών γεννήτριες, όπως αζω-πρωτεργάτη ενώσεις. Οι Αζο-εμπνευστές θεωρείται για την παραγωγή του peroxyl ριζοσπαστική με θέρμανση, η οποία βλάπτει το φθορίζον μόριο, με αποτέλεσμα την απώλεια του φθορισμού. Τα αντιοξειδωτικά θεωρείται ότι προστατεύουν το φθορίζον μόριο από το οξειδωτικό εκφυλισμό. Ο βαθμός προστασίας είναι ποσοτικά με τη χρήση φθοριόμετρο. Φλουορεσκεΐνη χρησιμοποιείται σήμερα περισσότερο ως μια φθορίζουσα καθετήρα. Εξοπλισμός που μπορεί αυτόματα τη μέτρηση και τον υπολογισμό της χωρητικότητας είναι διαθέσιμα στο εμπόριο (Biotek, Roche Diagnostics). Η ένταση φθορισμού μειώνει την οξειδωτική έσοδα εκφυλισμό, και αυτή η ένταση είναι συνήθως καταγράφεται για 35 λεπτά μετά την προσθήκη του αζω-ιδρυτής (ελεύθερων ριζών γεννήτρια). Μέχρι στιγμής, ΑΑΡΗ (2,2 azobis (2-3ηιΐ(ϋηο-προπανίου) διυδροχλωρική) είναι ο μοναδικός των ελεύθερων ριζών που χρησιμοποιείται γεννήτρια. Η εκφύλιση (ή αποσύνθεση) του φλουορεσκεΐνης επιμετράται ως η παρουσία των αντιοξειδωτικών επιβραδύνει την φθορισμού αποσύνθεση. Οι καμπύλες Decay (ένταση φθορισμού έναντι του χρόνου) που καταγράφεται και η περιοχή μεταξύ των δύο καμπύλών αποσύνθεση (με ή χωρίς αντιοξειδωτικό) υπολογίζεται48. Ένα από τα οφέλη από τη χρήση της μεθόδου ORAC για την αξιολόγηση αντιοξειδωτική ικανότητα ουσίες»είναι ότι λαμβάνει υπόψη τα δείγματα με 58

62 ή χωρίς φάσεις υστέρησεις των ικανοτήτων αντιοξειδωτική τους. Αυτό είναι ιδιαίτερα ευεργετικό για τη μέτρηση τρόφιμα και τα συμπληρώματα που περιέχουν σύνθετα συστατικά με διάφορες αργή και ενεργούν γρήγορα αντιοξειδωτικά, καθώς και τα συστατικά με τα συνδυασμένα αποτελέσματα που δεν μπορούν να προ-υπολογιστεί. Μειονεκτήματα της μεθόδου αυτής είναι: 1) μόνο η αντιοξειδωτική δράση συγκεκριμένων (πιθανότατα κυρίως peroxyl) ριζών μετριέται, 2) η φύση της επιζήμιας αντίδρασης δεν χαρακτηρίζεται, 3) δεν υπάρχουν αποδείξεις ότι οι ελεύθερες ρίζες εμπλέκονται σε αυτή την αντίδραση και 4) δεν υπάρχει καμία απόδειξη ότι ORAC έχει βιολογική σημασία μετά την κατανάλωση οποιασδήποτε τροφής. Αρκετές αλλαγές στη μέθοδο ORAC έχουν προταθεί. Οι περισσότερες από αυτές χρησιμοποιούν την ίδια αρχή (π.χ. μέτρηση της ΑΑΡΗ-ριζική ζημία μεσολάβηση του fuorescein) Ωστόσο τα ηλεκτρόνια παραμαγνητικού συντονισμού (EPR) με βάση τη μέθοδο ORAC μετρά άμεσα τη μείωση επιπέδου της ΑΑΡΗ - ριζοσπαστικής λόγω της δράσης των αντιοξειδωτικών, 50 ουσιών Μέθοδος της χημειοφωταύγειας Με τον όρο χημειοφωταύγεια, καλείται κάθε διαδικασία που αφορά στην εκπομπή ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας (συνήθως στην ορατή ή κοντά στην υπέρυθρη περιοχή), που παράγεται από μια ουσία, μέσω μιας χημικής αντίδρασης. Στις αντιδράσεις της μεθόδου χημειοφωταύγειας γενικά, ένα από τα προϊόντα της αντίδρασης βρίσκεται σε διεγερμένη ηλεκτρονικά κατάσταση, το οποίο παράγοντας φώς, μεταπίπτει στη θεμελιώδη 59

63 κατάσταση. Η ένταση της εκπομπής, είναι συνάρτηση της συγκέντρωσης των χημικών ενώσεων που συμμετέχουν στην αντίδραση χημειοφωταύγειας. Εικ 8 χημενοφωταύγεια Συνεπώς, η μέτρηση της έντασης της εκπεμπόμενης ακτινοβολίας μπορεί να χρησιμοποιηθεί για αναλυτικούς σκοπούς 51. Η χημειοφωταύγεια κατέχει μια εξέχουσα θέση ανάμεσα σε άλλες φασματοφωτομετρικές τεχνικές, λόγω της ευαισθησίας και της επιλεκτικότητας που παρουσιάζει εξής: Γ Λ. Η τεχνική αυτή χαρακτηρίζεται από τα Δεν απαιτεί εξωτερική πηγή φωτός (τεχνική σκοτεινού πεδίου), επομένως, εξασφαλίζει μείωση των σημάτων θορύβου και βελτίωση των ορίων ανίχνευσης (10 έως 100 φορές χαμηλότερα όρια ανίχνευσης από άλλες τεχνικές φωταύγειας). > Απαιτεί μόνο έναν ανιχνευτή φωτός, όπως ένας φωτοπολλαπλασιαστής. Δεν απαιτεί μονοχρωμάτορα και συχνά δεν απαιτεί ούτε φίλτρο. Παρόλα αυτά, πρέπει να αναφερθεί ότι υπάρχουν και κάποιοι περιορισμοί στην ανάλυση χημειοφωτάγειας51, όπως είναι οι παρακάτω: 60