Ниво редукованог глутатиона и активност глутатион-зависних ензима у кортиконуклеарним блоковима сочива особа са сенилном катарактом

Transcript

1 Srp Arh Celok Lek. 0 Sep-Oct;40(9-0): DOI: 0.98/SARH056K ОРИГИНАЛНИ РАД / ORIGINAL ARTICLE UDC: Ниво редукованог глутатиона и активност глутатион-зависних ензима у кортиконуклеарним блоковима сочива особа са сенилном катарактом Бојана Кисић, Дијана Мирић, Лепша Жорић, Александра Илић, Илија Драгојевић Институт за биохемију, Медицински факултет, Универзитет у Приштини са седиштем у Косовској Митровици; Клиника за очне болести, Медицински факултет, Универзитет у Приштини са седиштем у Косовској Митровици; Катедра за превентивну медицину, Медицински факултет, Универзитет у Приштини са седиштем у Косовској Митровици КРАТАК САДРЖАЈ Увод Ре ду ко ва ни глу та тион (GSH) у со чи ву има уло гу у за шти ти тиол-гру па про те и на со чи ва и као суп страт глу та тион-пе рок си да зе (GPx) и глу та тион-s-тран сфе ра зе (GST). Про те и ни ко ји са др же тиолгру пе су зна чај ни за нор мал ну функ ци ју епи те ла со чи ва, тј. ен зи ма Na-K-ATP-азе, чи ме ути чу на ће лиј ску про пу стљи вост. Од нос GSH и његовог оксидованог облика (GSSG) је нор мал но ви сок у со чи ву и дру гим тки ви ма ока за хва љу ју ћи глу та тион-ре докс ци клу су, ко ји је ло ка ли зо ван у епи те лу со чи ва и по вр шин ском кор тек су. Циљ ра да Циљ ис тра жи ва ња био је ис пи ти ва ње не ен зим ских чи ни ла ца ан ти ок си дант не за шти те: не про те ин ских и про те ин ских ти о ла, као и од ре ђи ва ње ак тив но сти глу та тион-за ви сних ен зи ма у кор ти ко ну кле ар ним бло ко ви ма со чи ва осо ба са се нил ном ка та рак том. Ме то де ра да Би о хе миј ска ис пи ти ва ња из вр ше на су на кор ти ко ну кле ар ним бло ко ви ма со чи ва 0 бо ле сни ка са ди јаг но зом се нил не ка та рак те. Пре ма сте пе ну зре ло сти ка та рак те, ис пи та ни ци су свр ста ни у гру пу са ca ta rac ta se ni lis in ci pi ens (4 бо ле сник) и у гру пу са ca ta rac ta se ni lis ma tu ra (60 бо ле сни ка). Кон цен тра ци ја GSH је од ре ђи ва на по мо ћу Ел ма но вог (El lman) ре а ген са, ак тивност GPx по мо ћу ку мол хи дро пе рок си да, а ак тив ност GST пра ће њем бр зи не ства ра ња конју га та глу та ти о на и -хлор-,4-ди ни тро бен зе на. Ре зул та ти Ре зул та ти по ка зу ју да је кон цен тра ци ја GSH зна чај но ве ћа у кор ти ко ну кле ар ним бло ко ви ма со чи ва с по чет ном ка та рак том у од но су на зре лу ка та рак ту (p<0,00). Ак тив ности ен зи ма GPx и GST би ле су зна чај но ве ће у кор ти ко ну кле ар ним бло ко ви ма со чи ва с по четном ка та рак том (p<0,00). С на пре до ва њем ка та рак те сма њу је се ко ли чи на рас по ло жи вог GSH, нео п ход ног за функ ци ју GPx и GST, па је и ак тив ност ових ен зи ма зна чај но сма ње на код зреле ка та рак те. За кљу чак Из ме ре на ма ња кон цен тра ци ја GSH и ак тив ност ан ти ок си дант них ен зи ма у кор ти кону кле ар ним бло ко ви ма со чи ва, на ро чи то код ка та рак те с ну кле ар ном ком по нен том, ука зу ју на осла бље ни ан ти ок си дант ни од го вор тки ва со чи ва то ком раз во ја се нил не ка та рак те. Кључ не ре чи: ка та рак та; ок си да тив ни стрес; глу та тион; ан ти ок си дан си УВОД Глав ни и не по сред ни узрок по ја ве и раз во ја ка та рак те још ни је по знат, али се ок си датив на оште ће ња то ком про це са ста ре ња у са вре ме ној ли те ра ту ри сма тра ју зна чај ним у ње ној ети о па то ге не зи []. Због по ло жа ја и би о ло шке функ ци је, оч но со чи во је током жи во та из ло же но удру же ном штет ном деј ству сун че вог зра че ња и ки се о ни ка ко ји узро ку ју мор фо ло шке и функ ци о нал не проме не (фо то ок си да тив ни стрес). Ап сорп цијом де ла ул тра љу би ча стог спек тра, со чи во шти ти ду бље струк ту ре ока од штет ног дејства овог де ла сун че вог зра че ња, при че му вре ме ном под ле же фо то ди на мич ким оштеће њи ма []. Мно га ис пи ти ва ња су по твр ди ла да је окси да тив на мо ди фи ка ци ја про те и на и ли пи да со чи ва глав ни ме та бо лич ки суп страт па толо шког по ре ме ћа ја код ху ма не ка та рак те стари јих осо ба [, 4]. Екс пе ри мен тал но је по каза но на кул ту ри ор га на да ка та рак ту мо же узро ко ва ти фо то хе миј ски иза зва но ства ра ње су пер ок сид-ра ди ка ла, хи дрок сил них ра дика ла и во до ник-пе рок си да (H ) []. Про те и ни, ко ји чи не 60% укуп не ма се со чи ва [5], по се ду ју број не сул фхи дрил не (-SH) гру пе, ко је су ве о ма осе тљи ве на окси да тив на оште ће ња [, 6]. Ок си да тив ном мо ди фи ка ци јом про те и на со чи ва ре ме ти се и њи хо ва функ ци ја, тј. сма њу је се или гу би ак тив ност ен зи ма и на ста ју агре га ти про те и на ве ли ке мо ле ку лар не ма се. Агрега ци ја про те и на со чи ва у на су мич но рас поде ље не мо ле ку ле ве ли ке мо ле ку лар не ма се ме ња гу сти ну про те и на у со чи ву, узро кују ћи ло кал не про ме не у ин дек су ре фракци је и по ве ћа но све тло сно ра се ја ње, као и за му ће ње у со чи ву за хва ће ном ка та рак том [6]. Ви сок ни во мо ди фи ко ва них про те и на код уз на пре до ва ле ка та рак те, у по ре ђе њу Correspondence to: Bojana KISIĆ Kozačinskog /4 000 Beograd Srbija bojanabk00@yahoo.com

2 564 Кисић Б. и сар. Ниво редукованог глутатиона и активност глутатион-зависних ензима у кортиконуклеарним блоковима сочива с нор мал ним со чи вом, го во ри у при лог то ме да су ове про ме не укљу че не у раз вој ка та рак те [7]. Пе рок си да ци ја ли пи да ће лиј ских мем бра на, ко ја се сма тра па то ге нет ским фак то ром ка та рак то ге не зе [8, 9], до во ди до по ре ме ћа ја ба ри јер не функ ци је мем бра не, што по сле дич но ме ња за пре ми ну ће ли је и структуру со чи ва, од го вор ну за ре фрак тер не про ме не удру же не с по чет ком ка та рак те. По да ци из ли те ра ту ре по ка зу ју да се то ком раз во ја ка та рак те на го ми ла ва ју у со чи ву и очној во ди ци про из во ди пе рок си да ци је ли пи да конју го вани ди е ни, ма лон ди ал де хид (MDA), 4-хи дрок си но не нал и дру ги, при че му на ста ли MDA мо же да ље да ре а гу је и ства ра агре га те са би о мо ле ку ли ма, про те и ни ма, ами ноки се ли на ма и фос фо ли пи ди ма [0,, ]. Три пеп тид-глу та тион (L-γ-глу та мил-l-ци сте и нилгли цин) се на ла зи у ви со кој кон цен тра ци ји у со чи ву (,4 μg/g те жи не), углав ном у ре ду ко ва ном об ли ку (GSH), ра ди за шти те и од бра не струк ту ра со чи ва од фо то ок си да тив ног оште ће ња []. Ак тив но шћу ен зима глу та тион-пе рок си да зе (GPx) и глу та тион-ре дук тазе кроз глу та тион-ре докс си стем одр жа ва се фи зи о лошки од нос GSH и његовог оксидованог облика (GSSG) [4]. Ак тив ност GPx по ка зу ју ен зи ми, ко ји ка та ли зу ју ре ак ци ју сма ње ња H или ор ган ских и ли пид них хидро пе рок си да у од го ва ра ју ћи ал ко хол, ко ри сте ћи GSH као до нор во до ни ка [5]. ЦИЉ РАДА Циљ ис тра жи ва ња би ло је ис пи ти ва ње не ен зим ских чи ни ла ца ан ти ок си да тив не за шти те, не про те ин ских и про те ин ских ти о ла, као и од ре ђи ва ње ак тив но сти глу та тион-за ви сних ен зи ма у кор ти ко ну кле ар ним блоко ви ма со чи ва осо ба са се нил ном ка та рак том. МЕТОДЕ РАДА Кли нич ко ис пи ти ва ње обухватило је 0 осо бу оболе лу од се нил не ка та рак те. Пре хи рур шке ин тер венци је ис пи та ни ци су под врг ну ти уоби ча је ном оф талмо ло шком пре гле ду оба ока. При том је око с по четном ка та рак том би ло кон трол но, на осно ву ко јег је од ре ђи ва на при мар на мор фо ло ги ја зре ле ка та рак те на дру гом оку. Сва ки ис пи та ник је под врг нут хи руршкој ин тер вен ци ји екс тра кап су лар не екс трак ци је с уград њом ин тра о ку лар ног со чи ва на јед ном оку, током ко је је узет кор ти ко ну кле ар ни блок со чи ва, ко ји је од мах на кон екс трак ци је уро њен у Харт ма нов (Hartmann) рас твор и за мр знут и чу ван на -0 C до ана ли зи ра ња. Све хе ми ка ли је ко ри шће не за пра вље ње рас тво ра би ле су pro analysi сте пе на чи сто ће. У хо мо ге на ти ма кор ти ко ну кле ар них бло ко ва со чи ва од ре ђи ва ни су неен зим ски чи ни о ци ан ти ок си да тив не за шти те: кон центра ци ја укуп них не про те ин ских и про те ин ских ти о ла (μmol/g те жи не) и ак тив ност ен зи ма ан ти ок си да тив не за шти те (U/g про те и на). Пр во, из ме ре на је те жи на узе тог кор ти ко ну кле арног де ла со чи ва (из ра же но у гра ми ма тки ва), а по том је из вр ше на хо мо ге ни за ци ја у пу фе ру 0,0 mol/l KPi, ph 7,4 са 0,4 mol/l KCl. Хо мо ге нат је цен три фу гиран де сет ми ну та на.500 обр та ја у ми ну ти, а би стар супер на тант је ко ри шћен за ана ли зе. Кон цен тра ци ја GSH у узор ку од ре ђи ва на је у реак ци ји [5,5'-ди ти о бис-(-ни тро бен зо е ве ки се ли не) DTNB] Ел ма нов (El lman) ре а генс, на кон укла ња ња про те и на пер хлор ном ки се ли ном [6]. Упо тре бом Елма но вог ре а ген са спек тро фо то ме триј ски је од ре ђи вана кон цен тра ци ја про те ин ских тиол-гру па [7]. Проте ин ске -SH гру пе ре ду ку ју DTNB, ства ра ју ћи жу то обо јен анјон 5-тио--ни тро бен зо е ве ки се ли не (TNB ). Ак тив ност GPx је од ре ђи ва на по мо ћу ку мол хи дро перок си да, као суп стра та, ме то дом Чи на (Chin) и са рад ника [8], а ак тив ност глу та тион-ре дук та зе (GR) ме то дом Глац леа (Glat zle) и са рад ни ка [9]. По овој ме то ди GR ка та ли зу је ре дук ци ју GSSG у при су ству NADPH + +H +. Ок си да ци ја NADPH + +H + се пра ти ме ре њем про ме не апсор бан се на 40 nm. Ак тив ност глу та тион-s-тран сфера зе (GST) од ре ђи ва на је пра ће њем бр зи не фор ми рања конју га та глу та ти о на и -хлор-,4-ди ни тро бен зе на (CDNB), спек тро фо то ме триј ски на 40 nm [0]. У об ра ди ре зул та та ко ри шће ни су де скрип тив ни ста ти стич ки па ра ме три: арит ме тич ка сре ди на и стандард на де ви ја ци ја (SD). Ис пи ти ва ње ста ти стич ке значај но сти раз ли ка из ме ђу сред њих вред но сти вр ше но је Сту ден то вим t-те стом и те стом ANO VA. Кри те ри јум за ста ти стич ку зна чај ност биле су вредности p<0,05, p<0,0 и p<0,00. За ста ти стич ку об ра ду по да та ка кори шће ни су софт вер ски про гра ми SPSS и IN STAT. РЕЗУЛТАТИ Би о хе миј ска ис пи ти ва ња вр ше на су на кор ти ко ну клеар ним бло ко ви ма со чи ва 0 опе ри са ног бо ле сни ка са ди јаг но зом се нил не ка та рак те, и то 46 же на и 55 му шка ра ца. Про сеч на ста рост ис пи та ни ка би ла је 7,5 го ди на (SD=7,98). Пре ма сте пе ну зре ло сти ка та рак те, бо ле сни ци су свр ста ни у две гру пе: са ca ta rac ta se ni lis in ci pi ens (4 ис пи та ник) и са ca ta rac ta se ni lis ma tu ra (60 ис пи та ника). У првој гру пи би ла су бо ле сни ка са суб капсу лар ном ка та рак том, де вет бо ле сни ка са суб кап сулар но-ну кле ар ном ка та рак том и де вет са ди јаг но зом ме шо ви те кор ти ко ну кле ар не ка та рак те. У другој гру пи би ло је 9 бо ле сни ка са зре лом ка та рак том ко ја је поче ла као суб кап су лар на, 5 са зре лом катарактом ко ја је по че ла као суб кап су лар но-ну кле ар на, 6 са зре лом катарактом ко ја је по че ла као кор ти ко ну кле ар на и 0 болесника са ди јаг но зом зре ле ка та рак те ко ја је по че ла као кор ти кал на. У кор ти ко ну кле ар ним бло ко ви ма со чи ва ис пи та ника с по чет ном се нил ном ка та рак том из ме ре на је значај но ве ћа кон цен тра ци ја и не про те ин ских (,6±0,9 µmol/g; p<0,00), и про те ин ских тиол-гру па (0,5±5,5 µmol/g; p<0,00), у од но су на кор ти ко ну кле ар не де ло ве doi: 0.98/SARH056K

3 Srp Arh Celok Lek. 0 Sep-Oct;40(9-0): со чи ва са зре лом ка та рак том (0,9±0, µmol/g; 54,8±9,7 µmol/g). Ис пи ти ва њем до би је них ак тив но сти ан ти окси дант них ен зи ма утвр ђе на је зна чај но ве ћа ак тив ност GPx (,4±,5 U/g; p<0,00), GR (,0±, U/g; p<0,00), као и GST (,4±, U/g; p<0,00) у кор ти ко ну кле ар ним бло ко ви ма со чи ва с по чет ном се нил ном ка та рак том. Ана ли зи ра њем од но са кон цен тра ци је не про те инских ти о ла и ак тив но сти GR у кор ти ко ну кле ар ним бло ко ви ма со чи ва па ци је на та са се нил ном ка та рак том утвр ђе на је зна чај на по зи тив на по ве за ност (r=0,67; p<0,0) (Гра фи кон ). Она је утврђена и из ме ђу концен тра ци је GSH и ак тив но сти GPx (r=0,655; p<0,0) (Гра фи кон ), као и из ме ђу кон цен тра ци је не про теин ских тиол-гру па и ак тив но сти GST (r=0,607; p<0,0) (Гра фи кон ). Из ме ре не кон цен тра ци је не про те ин ских и про теин ских -SH гру па у кор ти ко ну кле ар ним бло ко ви ма со чи ва с раз ли чи тим ти по ви ма по чет не ка та рак те да те су у та бе ли. Утвр ђе на је зна чај на раз ли ка концен тра ци је GSH (p<0,0) и кон цен тра ци је про те инских -SH гру па (p<0,0), за ви сно од ти па по чет не ката рак те. Зна чај но ве ћа кон цен тра ци ја GSH је из ме рена код по чет не суб кап су лар не у од но су на ме шо ви ту суб кап су лар но-ну клеар ну (p<0,05), као и у од но су на кор ти ко ну кле ар ни тип ка та рак те (p<0,0). Та ко ђе, у кор ти ко ну кле ар ним бло ко ви ма со чи ва с по чет ном суб кап су лар ном ка та рак том, кон цен тра ци ја про теин ских -SH гру па је била зна чај но ве ћа у од но су на по чет ну суб кап су лар но-ну кле ар ну (p<0,05) и у од но су на по чет ну ме шо ви то-кор ти ко ну кле ар ну ка та рак ту (p<0,0). Про сеч не из ме ре не ак тив но сти ан ти ок си дант них ен зи ма у кор ти ко ну кле ар ним бло ко ви ма со чи ва боле сни ка с раз ли чи тим ти по ви ма по чет не ка та рак те при ка за не су у та бе ли. Утвр ђе на је зна чај но ве ћа ак тив ност GPx код по чет не суб кап су лар не ка та рак те у од но су на суб кап су лар но-ну кле ар ну (p<0,00) и у од но су на по чет ну ме шо ви то-кор ти ко ну кле ар ну ката рак ту (p<0,00). Та ко ђе, код по чет не суб кап су лар не ка та рак те из ме ре не су зна чај но ве ће ак тив но сти GR (p<0,00) и GST (p<0,00) у од но су на по чет ну суб кап GPx (U/g протеина) Lens GPx (U/g proteina) GSH (μmol/g) Lens GSH (μmol/g) Графикон. Међусобни однос концентрације GSH и активности глутатион-пероксидазе (GPx)у кортиконуклеарним блоковима сочива са сенилном катарактом (y=0,00+0,0009x) Graph. Relationship of concentrations GSH and glutathione peroxidase (GPx) activities in corticonuclear lens blocks with age-related cataract (y= x) GR (U/g протеина) Lens GR (U/g proteina) 4 GST (U/g протеина) Lens GST (U/g proteina) GSH (μmol/g) Lens GSH (μmol/g) GSH (μmol/g) Lens GSH (μmol/g) Графикон. Међусобни однос концентрације редукованог глутатиона (GSH) и активности глутатион-редуктазе (GR) у кортиконуклеарним блоковима сочива са сенилном катарактом (y=0,0009+0,0009x). Graph. Relationship of concentrations glutathione (GSH) and glutathione reductase (GR) activities in corticonuclear lens blocks with age-related cataract (y= x). Графикон. Међусобни однос концентрације GSH и активности глутатион-s-трансферазе (GST) у кортиконуклеарним блоковима сочива са сенилном катарактом (y=0,0009+0,0006x) Graph. Relationship of concentrations GSH and glutathione S-transferase (GST) activities in corticonuclear lens blocks with age-related cataract (y= x)

4 566 Кисић Б. и сар. Ниво редукованог глутатиона и активност глутатион-зависних ензима у кортиконуклеарним блоковима сочива Табела. Неензимски чиниоци антиоксидантне заштите у кортиконуклеарним блоковима сочива с почетном катарактом Table. Nonenzymatic antioxidative defense factors in corticonuclear lens blocks with cataract incipiens Параметар Parameter Почетна субкапсуларна Cataract incipiens posterior subcapsular (N=) Почетна субкапсуларнонуклеарна Cataract incipiens nuclear-subcapsular (N=9) Почетна кортиконуклеарна Catarct incipiens cortical-nuclear (N=9) GSH (μmol/g).0±0.9.±0.6*.8±0.4** Протеинске -SH групе (μmol/g) Protein -SH group (μmol/g) 4.± ±8.6* 85.8±0.8** * p<0.05; ** p<0.0 N број испитаника; GSH редуковани глутатион N number of patients; GSH glutathione reduced Табела. Активности антиоксидантних ензима у кортиконуклеарним блоковима сочива с почетном катарактом Table. Antioxidant enzymes activity in corticonuclear lens blocks with cataract incipiens Параметар Parameter Почетна субкапсуларна Cataract incipiens posterior subcapsular (N=) Почетна субкапсуларнонуклеарна Cataract incipiens nuclear-subcapsular (N=9) Почетна кортиконуклеарна Catarct incipiens cortical-nuclear (N=9) GPx (U/g) 4.6±0.7.±0.5*.6±0.* GR (U/g) 4.0±0.7.9±0.7*.6±0.* GST (U/g).±0.6.6±0.7*.±0.* * p<0.00 GPx глутатион-пероксидаза; GR глутатион-редуктаза; GST глутатион-s-трансфераза GPx glutathione peroxidase; GR glutathione reductase; GST glutathione S-transferase Табела. Неензимски чиниоци антиоксидантне заштите у кортиконуклеарним блоковима сочива са зрелом катарактом Table. Nonenzymatic antioxidative defense factors in corticonuclear lens blocks with cataract matura Параметар Parameter субкапсуларна posterior subcapsular (N=9) субкапсуларнонуклеарна nuclear subcapsular (N=5) кортиконуклеарна cortical-nuclear (N=6) која је почела као кортикална Cataract matura began as cortical (N=0) GSH (μmol/g).0±0. 0.8±0. 0.8±0. 0.9±0. Протеинске -SH групе (μmol/g) Protein -SH group (μmol/g) 59.9± ± ± ±8. Табела 4. Активности антиоксидантних ензима у кортиконуклеарним блоковима сочива са зрелом катарактом Table 4. Antioxidant enzymes activity in corticonuclear lens blocks with cataract matura Параметар Parameter субкапсуларна posterior subcapsular (N=9) субкапсуларнонуклеарна nuclear subcapsular (N=5) кортиконуклеарна cortical-nuclear (N=6) која је почела као кортикална Cataract matura began as cortical (N=0) GPx (U/g).4±0.9.9±0.6*.4±0..8±0.5 GR (U/g).±0.6.±0.5*.±0.5*.7±0.5** GST (U/g).0±0.5.±0.4*.±0.5*.6±0.7 * p<0.00; ** p<0.05 doi: 0.98/SARH056K

5 Srp Arh Celok Lek. 0 Sep-Oct;40(9-0): су лар но-ну кле ар ну (p<0,00) и у од но су на по чет ну кор ти ко ну кле ар ну ка та рак ту (p<0,00). У кор ти ко ну кле ар ним бло ко ви ма со чи ва са зре лом се нил ном ка та рак том ана ли зом ва ри јан се ни је утвр ђена зна чај на раз ли ка из ме ре них кон цен тра ци ја не проте ин ских (p=0,), односно про те ин ских тиол-гру па (p=0,68) (Та бе ла ). У та бе ли 4 су да те про сеч не из ме ре не ак тив но сти ан ти ок си дант них ен зи ма у кор ти ко ну кле ар ним бло кови ма со чи ва са зре лом се нил ном ка та рак том. Из ме рена је зна чај но ве ћа ак тив ност GPx (p<0,00) и ак тивност GST (p<0,00) у кор ти ко ну кле ар ним бло ко ви ма со чи ва са зре лом ка та рак том, ко ја је по че ла као субкап су лар на у од но су на узор ке код ко јих је ка та рак та по че ла као суб кап су лар но-ну кле ар на (p<0,00), као ме шо ви то-кор ти ко ну кле ар на (p<0,00) и као кор тикал на (p<0,00). Ис пи ти ва њем ак тив но сти GR утвр ђе на је зна чај на раз ли ка (p<0,00) у за ви сно сти од ти па ко јим је ка тарак та по че ла. Зна чај но ве ћа ак тив ност GR из ме ре на је у кор ти ко ну кле ар ним бло ко ви ма со чи ва са зре лом ка та рак том ко ја је по че ла као суб кап су лар на у од но су на узор ке где је ка та рак та по че ла као суб кап су лар нону кле ар на (p<0,00), као ме шо ви то кор ти ко ну кле ар на (p<0,00) и као кор ти кал на (p<0,05), за тим у кор ти кону кле ар ним бло ко ви ма со чи ва са зре лом, за по че том као кор ти ко ну кле ар на, у од но су на узор ке код ко јих је ка та рак та по че ла као кор ти кал на (p<0,05). ДИСКУСИЈА Ис тра жи ва ња о ути ца ју ре ак тив них ки се о ни ко вих врста на по ја ву и раз вој се нил не ка та рак те ин тен зив но се ра де по след њих не ко ли ко де це ни ја. Се нил на ка тарак та се испољава у по зним го ди на ма, па се про це њу је да би се тро шко ви опе ра ци ја сма њи ли за 45% уко ли ко би се по ја ва овог обо ље ња мо гла од ло жи ти за де сет го ди на []. Ре ду ко ва ни глу та тион (GSH) у со чи ву има уло гу у за шти ти тиол-гру па про те и на со чи ва и као суп страт ен зи ма GPx и GST []. Про те и ни ко ји са др же тиолгру пе су зна чај ни за нор мал ну функ ци ју епи те ла сочи ва, тј. ен зи ма Na-K-ATP-азе, чи ме ути чу на ће лиј ску про пу стљи вост. Од нос GSH/GSSG је нор мал но ви сок у со чи ву и дру гим тки ви ма ока за хва љу ју ћи глу та тионре докс ци клу су, ко ји је ло ка ли зо ван у епи те лу со чива и по вр шин ском кор тек су [4]. Мем бра на со чи ва је не про пу стљи ва за GSH, али је про пу стљи ва за ње го в ок си до ва ни облик (GSSG), чи ја је кон цен тра ци ја у сочи ву по сле дич но ни ска. GSH, GPx, GR и NADPH + +H + чи не ан ти ок си дант ни си стем глу та ти о на, у ко јем су GR и NADPH + +H + нео п ход ни за ре дук ци ју ок си до ва ног глу та ти о на и ре ге не ра ци ју GSH. Ана ли зом из ме ре них кон цен тра ци ја GSH у кор ти ко ну кле ар ним бло ко ви ма со чи ва бо ле сни ка са се нил ном ка та рак том утвр ђе на је зна чај но ве ћа кон цен тра ци ја код по чет не (,6±0,9 µmol/g) у од но су на зре лу ка та рак ту (0,9±0, µmol/g) (p<0,00). Ови ре зул та ти су у скла ду с на ла зи ма дру гих ис тра жи ва ча ко ји су по ка за ли да се ни во ре ду ко ва ног глу та ти о на у со чи ву сма њу је с раз во јем ка та рак те [, ], као и да се с на пре до ва њем ка та рак те ка зре лој сма њу је ак тив ност GR и NADPH + H + за ви сних ен зи ма пен то зо фос фат ног пу та. Ова кве про ме не су ве ро ватно од раз ок си да ци о них про це са, по ја ча них ства ра њем ток сич них про из во да ли пид не пе рок си да ци је [8, 9, ], у од но су на осла бље ни ан ти ок си дант ни ка па цитет со чи ва за хва ће них ка та рак том. Та чан ме ха ни зам сма ње ња кон цен тра ци је GSH у со чи ву захваћеном катарактом још ни је до вољ но по знат. Не ка об ја шњења су да се GSH, као глав ни пред став ник не про те инских ти о ла, укљу чу је и тро ши у ок си до-ре дук ци о ним про це си ма у усло ви ма ви шка ок си ди са них суп стра та. Мо гу ћи раз лог по тро шње GSH то ком ок си да тив ног стре са је сте ње го ва кон вер зи ја у ок си до ва ни об лик, ко ји се да ље конју гу је с про те ин ским тиол-гру па ма, што до во ди до ства ра ња про теин-gsh ди сул фид них ве за. Ово фор ми ра ње ди сул фид них ве за из ме ђу про теи на (струк тур них и мем бран ских) сочива и глу та ти она то ком раз во ја ка та рак те до во ди до по тро шње GSH. Фор ми ра ње про теин-тиол ди сул фид них веза је про цес пре ко ко јег се про те ин ски ти о ли конју гу ју с не про те ин ским тиол-гру па ма, пре ко ди сул фид них ве за, што до во ди до ства ра ња про из во да ти па протеин-s-s-r. GSH мо же би ти R, ци стеин или ци сте амин. Овај про цес се од ви ја не ен зим ски и от кри вен је у мно гим тки ви ма људ ског ор га ни зма [4]. Везу ти па про теин-s-s-gsh пр ви је от крио у ка та ракт ном сочи ву Хар динг (Har ding) са са рад ни ци ма 970. го дине, док се про теин-s-s-ци сте а мин нај че шће на ла зи у со чи ви ма захваћеним катарактом код старијих људи. Везе ти па про теин-s-s-gsh се че шће ства ра ју с проте и ни ма ко ји су рас твор љи ви у во ди, док про дук ти про теин-s-s-ци стеин на ста ју с про те и ни ма ко ји ни су хи дро со лу бил ни. Раз ло зи ко ји до во де до конју га ци је не про те ин ских ти о ла с про те и ни ма су не до вољ но позна ти и, ра ди њи хо вог упо зна ва ња, ра ђе на су број на ис тра жи ва ња на со чи ви ма животиња. Та ко је из ла гање со чи ва па цо ва ве ћим кон цен тра ци ја ма H изазва ло сма ње ње кон цен тра ци је GSH и по ве ћа ње ко личи не про теин-s-s-gsh про из во да. Ове про ме не пра ти и сма ње ње кон цен тра ци је хи дро со лу бил них про те и на, по ве ћа ње про те и на не рас твор љи вих у во ди и по ја ва за му ће но сти со чи ва [4]. Мо гу ћи раз лог за сма ње ну ко ли чи ну GSH у со чиви ма ис пи та ни ка са се нил ном ка та рак том је и ма њак хек со зо мо но фос фат ног шан та, од го вор ног за син те зу NADPH + +H +, ко ји је ну жан за функ ци ју GR []. Ма ња кон цен тра ци ја GSH у со чи ви ма код ко јих је ка та рак том за хва ћен ну кле ар ни део со чи ва (Та бе ла ) мо же се об ја сни ти чи ње ни цом да је и у здра вом со чи ву кон цен тра ци ја GSH ма ња у ну кле ар ном де лу со чи ва у од но су на епи тел и кор ти кал ни део. По да ци из ли тера ту ре [] го во ре да је кон цен тра ци ја GSH око 80% ни жа у ну кле у су у по ре ђе њу с кор ти кал ним де лом сочи ва, а да ова раз ли ка по ста је још из ра же ни ја с го дина ма жи во та [4]. Сви ни (Swe e ney) и са рад ни ци [5] пр ви су ука за ли на стварање тзв. ба ри је ре у ху ма ном

6 568 Кисић Б. и сар. Ниво редукованог глутатиона и активност глутатион-зависних ензима у кортиконуклеарним блоковима сочива со чи ву иза зва не ста ро шћу, ко ја спре ча ва ми гра ци ју GSH из кор ти кал ног де ла со чи ва ка ну кле у су, што може би ти по тен ци јал ни ини ци јал ни фак тор за по ја ву се нил не ка та рак те код љу ди. Та ко ђе, утвр ђе но је да је ак тив ност ен зи ма хек со зо мо но фос фат ног шан та, ензи ма глу ко зо-6-фос фат де хи дро ге на зе, чак 90% ни жа у ну кле у су со чи ва у од но су на кор текс, док су ак тив ност GR и ни во NADPH + H + за 50% ни жи у ну кле ар ном де лу со чи ва. Ни зак ни во ан ти ок си дант не за шти те у ну кле усу со чи ва чи ни га по себ но осе тљи вим на ок си да тив на оште ће ња и по ја ву ка та рак те. Прет по ста вља се да се с го ди на ма жи во та сма њу је и син те за GSH у со чи ву, тач ни је сма њу је се ак тив ност ен зи ма γ-глу та мил-ци стеин син те та зе, нео п ход ног за син те зу глу та ти о на, што мо же би ти јед на од пре ди спози ци ја за раз вој ка та рак те [5, 6, 7]. Зна чај но ве ћа кон цен тра ци ја укуп них про те ин ских тиол-гру па из ме ре на је у со чи ви ма с по чет ном се нилном ка та рак том (0,5±5,5 µmol/g) у од но су на со чива са зре лом ка та рак том (54,8±9,7 µmol/g) (p<0,00). То ком раз во ја се нил не ка та рак те про гре сив но се сма њу је ко ли чи на тиол-гру па у кри ста ли ни ма, као ре зул тат од ви ја ња ла на ца ма кро мо ле ку ла про те ина и по сле дич не ок си да ци је ди сул фид них ве за. Ово сма ње ње кон цен тра ци је про те ин ских -SH гру па у ста ри јим со чи ви ма за ви си од рас по ло жи во сти GSH и GSH-за ви сних ен зи ма. Не ки ауто ри су утвр ди ли значај ну по ве за но ст ма ње кон цен тра ци је про те ин ских -SH гру па и ве ће кон цен тра ци је кар бо ни ла, на ста лих као по сле ди ца ок си да тив ног оште ће ња со чив них проте и на, у со чи ви ма из ло же ним акут ном ок си да тив ном стре су и по сле дич ној по ве ћа ној про из вод њи сло бодних ра ди ка ла [6]. Мем бран ске про те ин ске тиол-гру пе епи тел них ћели ја со чи ва, ко је су ва жне за ре гу ла ци ју тран спор та јона, ве о ма су осе тљи ве на ок си да тив ни напад, на ро чи то ка да је ни во уну тар ће лиј ског GSH сма њен. Оп ти мал на мем бран ска функ ци ја епи тел них ће ли ја со чи ва за ви си од ре ду ко ва ног ста ња про те ин ских -SH гру па. Гу битак мем бран ских -SH гру па и по сле дич но по ве ћа ње мем бран ске про пу стљи во сти, ко је на ста је као по следи ца ок си да тив ног оште ће ња, ве ро ват но је укљу че но у раз вој ка та рак те. Информациона РНК за син те зу GPx је от кри ве на у ху ма ном ци ли јар ном епи те лу, ода кле се лу чи у оч ну во ди цу [8]. Фи зи о ло шки зна чај овог ен зи ма је уклања ње H, ор ган ских и фос фо ли пид-хи дро пе рок си да. H мо же у при су ству ме та ла да иза зо ве про цес липид не пе рок си да ци је, па се сма тра да GPx има зна чај ну уло гу у ин хи би ци ји почетног ста ди ју ма пе рок си да ције ли пи да ће лиј ских мем бра на. Ре дук ци ја H у во ду глу та ти о ном ка та ли зо ва на је глу та тион-пе рок си да зом, а ре син те за GSH из ок си до ва ног облика је ка та ли зова на глу та тион-ре дук та зом, при че му је нео п хо дан NADPH + +H + на стао у пен то зном пу ту угље них хи дра та [9]. Ре зул та ти дру гих ис тра жи ва ња такође по ка зу ју да је у со чи ву осо ба са се нил ном ка та рак том ак тивност GPx зна чај но сма ње на у по ре ђе њу са здра вим со чи ви ма [8]. Ки не тич ка ис пи ти ва ња GPx по ка за ла су да ли пид ни хи дро пе рок си ди по сти жу за си ће ност ен зи ма већ при кон цен тра ци ји од око mmol, тј. да се Km GPx по сти же при кон цен тра ци ји ли пид них хи дропе рок си да од 0,44 mmol [8]. Због ова квих ки не тич ких свој ста ва, ак тив ност GPx је ве ро ват но заустављена код се нил не ка та рак те про из во ди ма пе рок си да ци је ли пида прин ци пом не ком пе ти тив не ин хи би ци је. Сма њена ак тив ност GPx у ка та ракт ном со чи ву мо же би ти и по сле ди ца сма ње не ко ли чи не рас по ло жи вог GSH или функ ци о нал не инак ти ва ци је ен зим ских мо ле ку ла, наста лих као ре зул тат струк тур них про ме на усло вље них ли пид ном пе рок си да ци јом. Со чи ва са се нил ном ка тарак том са др же ви ше ли пид них пе рок си да у оч ној води ци и у са мом тки ву со чи ва због сма ње не де ток си каци о не спо соб но сти, усло вље не сма ње ном ко ли чи ном GSH и сма ње ном ак тив но шћу GPx. Глу та тион-s-тран сфе ра за (GST) об у хва та по ро дицу мул ти функ ци о нал них ен зи ма чи ја је нај ва жни ја уло га у про це си ма де ток си ка ци је, ко ју оства ру ју ката ли шу ћи конју га ци ју глу та ти о на с ве ли ким бро јем елек тро фил них ток си на [0]. Нај ве ћа ак тив ност GST је у кор ти кал ном де лу здра вог со чи ва, док је мно го ма ња ак тив ност овог ен зи ма у ну кле у су со чи ва []. С об зи ром на функ ци ју GST, да ка та ли ше ре ак ције конју га ци је про из во да ли пид не пе рок си да ци је са GSH, чи ме се сма њу ју ток сич ност елек тро фил них једи ње ња и њи хо ва ре ак тив ност пре ма ну кле о фил ним гру па ма у би о ло шким ма кро мо ле ку ли ма, ло гич но је да је ак тив ност по ме ну тог ен зи ма ве ћа код ин ци пијент не ка та рак те, јер је на по чет ку раз во ја ка та рак те нај ин тен зив ни ји про цес пе рок си да ци је ли пи да, ко ји је или сам по кре тач про це са ка та рак то ге не зе, или је покренут ства ра њем ре ак тив них ки се о никових вр ста, а да ље сво јом про па га ци јом ути че на про ме не у сочи ву. Ве ро ват но је да су, ка ко про цес ка та рак то ге не зе на пре ду је, про ме не струк ту ра со чи ва све из ра же није, до ла зи до ис цр пљи ва ња ан ти ок си дант них ком понен ти, од ко јих је GSH нај ва жни ји. Ти ме се сма њу је и ко ли чи на рас по ло жи вог GSH, ко ји је нео п хо дан за функ ци ју ен зи ма GST, па је и ак тив ност са мог ен зима зна чај но сма ње на код зре ле ка та рак те (,4±, U/g;,4±0,7 U/g; p<0,00). То ком ис пи ти ва ња ак тив но сти GST у со чи ви ма за хва ће ним ка та рак том гру па аутора је при ка за ла да је ак тив ност GST со чи ва нај ве ћа у ста ро сној гру пи од 60. до 64. го ди не, а да се зна чај но сма њу је у со чи ви ма осо ба ста ри јих од 70 го ди на []. Ана ли зи ра њем ак тив но сти GR утвр ђе на је зна чајно ве ћа ак тив ност у со чи ви ма бо ле сни ка с по чет ном (,0±, U/g; p<0,00) у од но су на со чи ва са зре лом сенил ном ка та рак том (,6±0,7 U/g). Ови ре зул та ти су у скла ду с по да ци ма ко је су об ја ви ли дру ги ис тра жи вачи на кон упо ре ђи ва ња ак тив но сти GR у ка та ракт ним со чи ви ма и не про ме ње ним со чи ви ма осо ба ста ри је жи вот не до би []. GR има глав ну уло гу у одр жа вању тиол-гру па у со чи ву, што је ве ро ват но нај ва жни ја уло га овог ен зи ма у одр жа ва њу про вид но сти со чи ва. Мо гу ће је да сла би ја ак тив ност GR у од но су на нор малне ак тив но сти мо же би ти је дан од узро ка по ре ме ћа ја про вид но сти со чи ва. doi: 0.98/SARH056K

7 Srp Arh Celok Lek. 0 Sep-Oct;40(9-0): ЗАКЉУЧАК Утвр ђе на зна чај на по зи тив на ко ре ла ци ја из ме ђу концен тра ци је GSH и ак тив но сти ен зи ма глу та тион-перок си да зе, глу та тион-ре дук та зе и глу та тион-s-трансфе ра зе ука зу је на зна чај ну ан ти ок си дант ну уло гу реду ко ва ног глу та ти о на у ис пи ти ва ним кор ти ко ну клеар ним бло ко ви ма со чи ва. Из ме ре на ма ња кон цен траци ја GSH, као и ак тив ност ан ти ок си дант них ен зи ма, на ро чи то код ка та рак те с ну кле ар ном ком по нен том, ве ро ват но ука зу ју на од го вор со чив ног тки ва на по већа ни ин тен зи тет ок си да тив них про ме на то ком раз во ја ка та рак те. Ово та ко ђе по ка зу је да је на ру ше на ок сида тив на рав но те жа у кор ти ко ну кле ар ним бло ко ви ма ка та ракт них со чи ва и да GSH и GSH-за ви сни ен зи ми ан ти ок си дант ног си сте ма не ма ју спо соб ност пот пу не ели ми на ци је ок си да тив них фак то ра и пре вен ци је реак ци ја пе рок си да ци је то ком раз во ја се нил не ка та рак те. До би је ни ре зул та ти по др жа ва ју хи по те зу да сма ње ње ан ти ок си дант ног си сте ма од бра не у ста ри јим со чи вима, уз ве ће ства ра ње штет них ок си да тив них про из во да, мо гу би ти зна чај ни то ком раз во ја се нил не ка та рак те. ЛИТЕРАТУРА. Vinson JA. Oxidative stress in cataracts. Pathophysiology. 006; ():5-6.. Spector A, Wang GM, Wang RR, Li WC, Kleiman Nj. A brief photochemically induced photooxidative insult causes irreversibile lens damage and cataract. Mechanism of action. Exp Eye Res. 995; 60(5): Davies MJ, Truscott RJ. Photo-oxidation of protein and its role in cataractogenesis. J Photochem Photobiol B: Biology. 00; 6(- ): Babizhayev MA, Costa BE. Lipid peroxide and reactive oxygen species generating systems of the crystalline lens. Biochim Biophys Acta. 994; 5(): Andley UP. Crystallins in the eye: function and pathology. Prog Retin Eye Res. 007; 6(): Boscia F, Grattagliano I, Vendemiale G, Micelli-Ferrari T, Altomare E. Protein oxidation and lens opacity in humans. Invest Ophthalmol Vis Sci. 000; 4(9): MacCoss MJ, McDonald WH, Saraf A, Sadygov R, Clark JM, Tasto JJ, et al. Shotgun identification of protein modifications from protein complexes and lens tissue. Proc Nat Acad Sci. 00; 99(): Babizhayev MA. Failure to withstand oxidative stress induced by phospholipid hydroperoxides as a possible cause of the lens opacities in systemic diseases and ageing. Biochim Biophys Acta. 996; 5(): Donma O, Yorulmaz E, Pekel H, Suyugül N. Blood and lens lipid peroxidation and antioxidation status in normal individuals, senile and diabetic cataractous patients. Curr Eye Res. 00; 5(): Choudhary S, Srivastava S, Xiao T, Andley UP, Srivastava SK, Ansari NH. Metabolism of lipid derived aldehyde, 4-hydroxynonenal in human lens epithelial cells and rat lens. Invest Ophthalmol Vis Sci. 00; 44(6): Žorić L. Parameters of oxidative stress in the lens, aqueous humor and blood in patients with diabetes and senile cataracts. Srp Arh Celok Lek. 00; (-4):7-4.. Kisić B, Mirić D, Žorić L, Dragojević I, Stolić A. Uloga lipidne peroksidacije u patogenezi senilne katarakte. Vojnosanit Pregl. 009; 66(5):7-5.. Giblin FJ. Glutathione: a vital lens antioxidant. J Ocul Pharmacol Ther. 000; 6(): Lou MF. Thiol regulation in the lens. J Ocul Pharmacol Ther. 000; 6(): Yu H, Liu J, Lui X, Zang T, Luo G, Shen J. Kinetic studies on the glutathione peroxidase, activity of selenium-containing glutathione transferase. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 005; 4(): Dacie JV, Lewis SM. Practical Haematology: Estimation of Reduced Glutathione (GSH). 6th ed. London: Churchill Livingstone; 984. p Jocelyn PC. Spectrophotometric Assay of Tiols. Methods Enzymol. 987; 4: Chin PTY, Stults FH, Tapell AL. Purification of rat lung soluble glutathione peroxidase. Biochem Biophys Acta. 976; 445: Glatzle D, Vuillenmir JP, Weber F, Decker K. Glutatione reductase test with whole blood a convenient procedure for the assesment of the riboflavine status in humans. Experimentia. 974; 0(6): Habig WH, Pabst MJ, Jakoby WB. Glutatione-S-transferases. J Biol Chem. 974; 49: Taylor A, Jacques PF, Epstein EM. Relations among aging, antioxidant status, and cataract. Am J Clin Nutr. 995; 6(Suppl): Gartaganis SP, Georgakopoulos CD, Patsoukis NE, Gotsis SS, Gartaganis VS, Georgiou CD. Glutathione and lipid peroxide changes in pseudoexfoliation syndrome. Curr Eye Res. 005; 0(8): Yan H, Harding JJ, Xing K, Lou MF. Revival of glutathione in human cataractous and clear lens extracts by thioredoxin and thioredoxin reductase, in conjunction with α-crystallin or thioltransferase. Curr Eye Res. 007; (5): Truscott RJW. Age-related nuclear cataract: a lens transport problem. Ophthalmic Res. 000; : Sweeney MH, Truscot RJ. An impediment to glutathione diffusion in older normal human lenses: a possible precondition for nuclear cataract. Exp Eye Res. 998; 67(5): Michael R, Bron AJ. The ageing lens and cataract: a model of normal and pathological ageing. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 0; 66(568): Rachdan D, Lou MF, Harding JJ. Glutathione reductase from human cataract lenses can be revived by reducing agents and by a molecular chaperone, alpha-crystallin. Curr Eye Res. 005; 0(0): Coca-Prados M, Escribano J, Ortego J. Differential gene expression in the human ciliary epithelium. Prog Retin Eye Res. 999; 8(): Linetsky M, Chemoganskiy VG, Hu F, Ortwerth BJ. Effect of UVA light on the activity of several aged human lens enzymes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 00; 44(): Wang L, Chen Y, Sternberg P, Cai J. Essential roles of the PI kinase/ Akt pathway in regulating Nrf-dependent antioxidant functions in the RPE. Invest Ophthalmol Vis Sci. 008; 49(4): Sireesha R, Laxmi SG, Mamata M, Reddy PY, Goud PU, Rao PV, et al. Total activity of glutathione-s-transferase (GST) and polymorphisms of GSTM and GSTT genes conferring risk for the development of age related cataracts. Exp Eye Res. 0; 98:

8 570 Кисић Б. и сар. Ниво редукованог глутатиона и активност глутатион-зависних ензима у кортиконуклеарним блоковима сочива Reduced Glutathione Level and GSH-Dependent Enzyme Activities in Corticonuclear Blocks of Lenses in Patients with Senile Cataract Bojana Kisić, Dijana Mirić, Lepša Žorić, Aleksandra Ilić, Ilija Dragojević Institute of Biochemistry, Faculty of Medicine, Priština, Settlement Kosovska Mitrovica; Clinic for Eye Diseases, Faculty of Medicine, Priština, Settlement Kosovska Mitrovica; Institute of Preventive Medicine, Faculty of Medicine, University of Priština, Settlement Kosovska Mitrovica SUMMARY Introduction Reduced compound glutathione (GSH) in the lens has the function to protect the thiol group of lens proteins, and as a substrate of glutathione peroxidase (GPx) and glutathione S-transferase (GST). Protein containing thiol groups is significant for the normal function of lens epithelium, i.e. enzymes Na-K-ATP-ase, thus influencing cell permeability. The relationship GSH/GSSG (oxidized glutathione) is normally high in the lens and other ocular tissue owing to the glutathioneredox cycle, which is localized in the lens epithelium and cortex surface. Objective The aim of the study was to investigate non-enzymic factors of the antioxidant protection of non-protein and protein tiol, as well as to determine glutathione-dependent enzyme activity in the corticonuclear blocks of lenses in patients with senile cataract. Methods Biochemical studies of lens were carried on 0 patients with senile cataract. According to cataract maturity degree, the patients were classified into two groups: senile incipient cataract (N=4) and mature senile cataract (N=60). GSH concentration was determined by Ellman s reagent. GPx activity was assayed with cumene hydroperoxide, and that of glutathione S-transferase by follow-up of glutathione conjugation and -chloro-.4-dinitrobenzene rates. Results A significantly higher GSH concentration was found in the corticonuclear blocks of lenses with initial as related to mature cataract (p<0.00). The activity of enzyme GPx and GST was considerably higher in the corticonuclear blocks of lenses with initial cataract (p<0.00). With cataract progression, the quantity of available GSH, necessary for GPx and GST functioning, declined, so that the activity of these enzymes was also significantly decreased in mature cataract. Conclusion The determined lower GSH concentration and antioxidant enzyme activity in corticonuclear blocks of lenses, particularly in cataract with a nuclear component, indicate the weakened antioxidant response of lens tissue during the development of senile cataract. Keywords: cataract; oxidative stress; glutathione; antioxidants Примљен Received: /0/0 Прихваћен Accepted: /0/0 doi: 0.98/SARH056K