Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit

Transcript

1 Δεκέμβριος 2010 Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit Έκδοση 1 24 Διαγνωστικό προïόν in vitro ποσοτικού προσδιορισμού Για χρήση με όργανα QIAsymphony SP/AS και Rotor-Gene Q EL QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D Hilden, Γερμανία R EL Sample & Assay Technologies

2 Τεχνολογίες δείγματος και ανάλυσης της QIAGEN Η QIAGEN είναι ο πρωτεύων προμηθευτής τεχνολογιών δειγμάτων και εξετάσεων όσον αφορά την απομόνωση και ανάλυση κάθε βιολογικού δείγματος. Τα υψηλής ποιότητας προϊόντα μας και η άριστη εξυπηρέτηση εξασφαλίζουν επιτυχία από την προετοιμασία του δείγματος μέχρι τα αποτελέσματα. Η QIAGEN θέτει πρότυπα: στον καθαρισμό DNA, RNA και πρωτεϊνών στα συστήματα αναλύσεων νουκλεϊκών οξέων και πρωτεϊνών στην έρευνα microrna και RNAi στην αυτοματοποίηση τεχνολογιών δειγμάτων και αναλύσεων Αποστολή μας είναι η διασφάλιση των δικών σας επιτυχιών και επιτευγμάτων. Για περισσότερες πληροφορίες, επισκεφθείτε μας στην ιστοσελίδα

3 Περιεχόμενα Περιεχόμενα του κιτ 5 Σύμβολα 5 Φύλαξη 6 Προβλεπόμενη χρήση 6 Περιορισμοί χρήσης του προϊόντος 6 Τεχνική υποστήριξη 7 Πληροφορίες ασφαλείας 7 Ποιοτικός έλεγχος 8 Εισαγωγή 9 Αρχή λειτουργίας 9 Πληροφορίες παθογόνων μικροοργανισμών 9 Χαρακτηριστικά απόδοσης 10 Ροή εργασίας 19 Εξοπλισμός και αντιδραστήρια που παρέχονται στο χρήστη 25 Σημαντικές σημειώσεις 27 Γενικές προφυλάξεις 27 Συλλογή, φύλαξη και μεταφορά δειγμάτων 27 Γρήγορο ξεκίνημα στα όργανα QIAsymphony SP/AS 29 Προετοιμασία του υλικού δείγματος 33 Προετοιμασία μειγμάτων φορέα RNA (CARRIER) ρυθμιστικού διαλύματος AVE (AVE) για δείγματα πλάσματος 33 Χρήση εσωτερικού μάρτυρα 33 Σετ μαρτύρων ανάλυσης και σετ παραμέτρων ανάλυσης 35 Εκτελέσεις πολλαπλής ανάλυσης 36 Αποδόσεις νουκλεϊκών οξέων 37 Φύλαξη νουκλεϊκών οξέων 37 Ρύθμιση του κατωφλίου για την ανάλυση PCR 37 Ποσοτικοποίηση 37 Πρωτόκολλα Απομόνωση DNA στο QIAsymphony SP 39 Προετοιμασία ανάλυσης στο QIAsymphony AS 49 PCR και ανάλυση δεδομένων στο Rotor-Gene Q 57 Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/2010 3

4 Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων 68 Βιβλιογραφία 75 Πληροφορίες παραγγελίας 76 4 Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/2010

5 Περιεχόμενα του κιτ artus CMV QS-RGQ Kit (24) Αρ. καταλόγου Αριθμός αντιδράσεων 24 Μπλε CMV RG Master 3 x 300 μl Kϊτρινο CMV Mg-Sol* 600 μl Κόκκινο CMV QS 1 (1 x 10 4 αντίγραφα/µl) 200 μl Κόκκινο CMV QS 2 (1 x 10 3 αντίγρ./µl) 200 μl Κόκκινο CMV QS 3 (1 x 10 2 αντίγρ./µl) 200 μl Κόκκινο CMV QS 4 (1 x 10 1 αντίγρ./µl) 200 μl Πράσινο CMV IC 1000 μl Λευκό Νερό (βαθμού PCR) 1000 μl Εγχειρίδιο 1 * Διάλυμα μαγνησίου Πρότυπο ποσοτικοποίησης. Εσωτερικός μάρτυρας. Σύμβολα <N> Περιέχει αντιδραστήρια που επαρκούν για <Ν> δοκιμασίες Ημερομηνία λήξης In vitro διαγνωστικό ιατροτεχνολoγικό προϊόν Αριθμός καταλόγου Αριθμός παρτίδας Αριθμός υλικού Συστατικά Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/2010 5

6 Περιεχόμενα Αριθμός Περιορισμοί θερμοκρασίας Νόμιμος κατασκευαστής Ανατρέξτε στις πληροφορίες του εγχειριδίου Σημαντική σημείωση Φύλαξη Τα συστατικά του artus CMV QS-RGQ Kit θα πρέπει να φυλάσσονται στους 20 C και είναι σταθερά μέχρι την ημερομηνία λήξης που αναγράφεται στην ετικέττα. Η επαναλαμβανόμενη απόψυξη και κατάψυξη (>2 φορές) θα πρέπει να αποφεύγεται διότι μπορεί να επιφέρει έκπτωση της ευαισθησίας της ανάλυσης. Προβλεπόμενη χρήση Το artus CMV QS-RGQ Kit είναι ένα σύστημα πολλαπλασιασμού νουκλεϊκών οξέων in vitro, για τον ποσοτικό προσδιορισμό του DNA του κυτταρομεγαλοϊού (CMV) σε ανθρώπινο EDTA πλάσμα ή ανθρώπινο EDTA ολικό αίμα. Αυτό το κιτ διαγνωστικής δοκιμασίας χρησιμοποιεί την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και είναι διαμορφωμένο για χρήση με τα όργανα QIAsymphony SP/AS και RotorGene Q. Το artus CMV QS-RGQ Kit προορίζεται για τη χρήση σε συνδυασμό με κλινικές εμφανίσεις και άλλες εργαστηριακές εξετάσεις για την πρόγνωση ασθενειών. Περιορισμοί χρήσης του προϊόντος Η χρήση όλων των αντιδραστηρίων επιτρέπεται αποκλειστικά για in vitro διαγνωστικούς σκοπούς. Το προϊόν πρέπει να χρησιμοποιείται μόνο από ειδικά καταρτισμένο και εκπαιδευμένο προσωπικό στις in vitro διαγνωστικές διαδικασίες (EN375). Η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου είναι απολύτως απαραίτητη, για την επίτευξη άριστων αποτελεσμάτων της PCR. 6 Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/2010

7 Δώστε προσοχή στις ημερομηνίες λήξης που αναγράφονται στο κουτί και στις ετικέττες όλων των συστατικών. Μη χρησιμοποιείτε τα συστατικά μετά την ημερομηνία λήξης τους. Αν και σπάνιες, οι μεταλλάξεις εντός των εξαιρετικά συντηρημένων περιοχών του ιικού γονιδιώματος που καλύπτονται από τους εκκινητές και/ή του ανιχνευτή του κιτ, μπορούν να έχουν ως αποτέλεσμα χαμηλότερες ποσοτικές τιμές ή αδυναμία ανίχνευσης της παρουσίας του ιού στις περιπτώσεις αυτές. Η εγκυρότητα και η απόδοση της σχεδίασης της δοκιμασίας ανάλυσης αναθεωρούνται κατά τακτά διαστήματα. Τεχνική υποστήριξη Στην QIAGEN είμαστε υπερήφανοι για την ποιότητα και τη διαθεσιμότητα της τεχνικής υποστήριξής μας. Τα Τμήματα Τεχνικής Εξυπηρέτησης της εταιρείας μας έχουν στελεχωθεί με έμπειρους επιστήμονες που διαθέτουν μακρόχρονη πρακτική και θεωρητική εμπειρία και τεχνογνωσία σε θέματα τεχνολογιών δείγματος και ανάλυσης και στη χρήση των προϊόντων QIAGEN. Μη διστάσετε να επικοινωνήσετε μαζί μας εάν έχετε οποιεσδήποτε ερωτήσεις ή αντιμετωπίσετε δυσκολίες με το artus CMV QS-RGQ Kit ή τα προϊόντα QIAGEN γενικά. Οι πελάτες της QIAGEN αποτελούν μία πολύτιμη πηγή πληροφοριών για τις προχωρημένες ή εξειδικευμένες χρήσεις των προϊόντων μας. Οι πληροφορίες αυτές είναι χρήσιμες τόσο για άλλους επιστήμονες όσο και για τους ερευνητές της QIAGEN. Σας ενθαρρύνουμε επομένως να επικοινωνήσετε μαζί μας εάν έχετε οποιεσδήποτε προτάσεις σχετικά με την απόδοση προϊόντων ή νέες εφαρμογές και τεχνικές. Για θέματα τεχνικής υποστήριξης και περαιτέρω πληροφορίες, επισκεφθείτε το Κέντρο Τεχνικής Υποστήριξης στην ιστοσελίδα ή επικοινωνήστε τηλεφωνικά με κάποιο από τα Τμήματα Τεχνικής Εξυπηρέτησης της QIAGEN ή με τους τοπικούς αντιπροσώπους (βλ. οπίσθιο εξώφυλλο ή επισκεφθείτε την ιστοσελίδα Πληροφορίες ασφαλείας Όταν εργάζεστε με χημικά θα πρέπει πάντοτε να φοράτε προστατευτική ποδιά εργαστηρίου, γάντια μίας χρήσης και προστατευτικά γυαλιά. Για περισσότερες πληροφορίες παρακαλείστε να ανατρέξετε στα σχετικά δελτία δεδομένων ασφάλειας υλικών (MSDSs). Αυτά τα δελτία είναι διαθέσιμα στο διαδίκτυο σε εύχρηστη μορφή PDF, στην ιστοσελίδα όπου και μπορείτε να βρείτε, να προβάλλετε και να εκτυπώσετε τα δελτία MSDS για κάθε κιτ και συστατικό των κιτ της QIAGEN. Για πληροφορίες ασφαλείας για το QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit, βλέπε Εγχειρίδιο QIAsymphony DSP Virus/Pathogen. Για πληροφορίες ασφαλείας για το QIAsymphony DNA Mini Kit, βλέπε Εγχειρίδιο QIAsymphony Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/2010 7

8 DNA. Για πληροφορίες ασφαλείας σχετικές με τα όργανα, βλέπε το εγχειρίδιο χρήσης του σχετικού οργάνου. Απορρίψτε τα απόβλητα δειγμάτων και αναλύσεων σύμφωνα με τις εκάστοτε τοπικές διατάξεις ασφαλείας. Πληροφορίες επείγουσας ανάγκης 24ωρης διαθεσιμότητας Πληροφορίες επείγουσας ιατρικής ανάγκης διατίθενται στα Αγγλικά, Γαλλικά και Γερμανικά όλο το 24ώρο από το: Κέντρο Δηλητηριάσεων (Poison Information Center) στο Mainz της Γερμανίας Τηλ.: Ποιοτικός έλεγχος Σε συμμόρφωση με το πιστοποιημένο με ISO Σύστημα Διαχείρισης Ποιότητας της QIAGEN, κάθε παρτίδα του artus CMV QS-RGQ Kit ελέγχεται ως προς τις προκαθορισμένες προδιαγραφές για την διασφάλιση ομοιογενούς ποιότητας των προϊόντων. 8 Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/2010

9 Εισαγωγή Το artus CMV QS-RGQ Kit αποτελεί ένα σύστημα έτοιμο για χρήση για την ανίχνευση DNA του CMV μέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR) σε όργανα Rotor Gene Q με προετοιμασία δείγματος και ανάλυσης με χρήση των οργάνων QIAsymphony SP/AS. Το CMV RG Master περιλαμβάνει αντιδραστήρια και ένζυμα για τον ειδικό πολλαπλασιασμό μίας περιοχής 105 bp του γονιδιώματος CMV και για την απευθείας ανίχνευση του ειδικού προϊόντος ενίσχυσης (αμπλικόνιο) στο κανάλι φθορισμού Cycling Green του Rotor-Gene Q. Επιπλέον, το artus CMV QS-RGQ Kit περιλαμβάνει ακόμη ένα ετερόλογο σύστημα ενίσχυσης για τη διαπίστωση τυχόν αναστολής της PCR. Αυτή ανιχνεύεται ως εσωτερικός μάρτυρας (IC) στο κανάλι φθορισμού Cycling Yellow του RotorGene Q. Το όριο ανίχνευσης της ανάλυσης PCR του ιού CMV δεν μειώνεται. Παρέχονται εξωτερικοί θετικοί μάρτυρες (CMVQS 1 4), οι οποίοι καθιστούν δυνατό τον προσδιορισμό της ποσότητας του ιικού DNA. Για περισσότερες πληροφορίες, βλέπε Ποσοτικοποίηση, σελίδα 37. Αρχή λειτουργίας Η ανίχνευση παθογόνων μικροοργανισμών με την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) βασίζεται στην ενίσχυση ειδικών περιοχών του γονιδιώματος του παθογόνου μικροοργανισμού. Στην PCR πραγματικού χρόνου, το προϊόν της ενίσχυσης ανιχνεύεται με φθορίζουσες χρωστικές. Αυτές είναι συνήθως συνδεδεμένες με ανιχνευτές ολιγονουκλεοτιδίων που προσδένονται ειδικά στο ενισχυμένο προϊόν. Η παρακολούθηση των εντάσεων φθορισμού κατά τη διάρκεια της εκτέλεσης της PCR (δηλ. σε πραγματικό χρόνο), επιτρέπει την ανίχνευση και την ποσοτικοποίηση του συσσωρευόμενου προϊόντος χωρίς να χρειάζεται να ανοιχτούν ξανά τα σωληνάρια αντίδρασης μετά το πέρας της εκτέλεσης της PCR.* Πληροφορίες παθογόνων μικροοργανισμών Ο ανθρώπινος κυτταρομεγαλοϊός (CMV) ανευρίσκεται στο αίμα, στους ιστούς και σχεδόν σε όλες τις εκκρίσεις των προσβεβλημένων ατόμων. Ο ιός μπορεί να μεταδοθεί στοματικά, με τη σεξουαλική επαφή, με μετάγγιση αίματος ή μεταμόσχευση οργάνων, ενδομήτρια ή περιγεννητικά. Η λοίμωξη με τον ιό CMV είναι συνήθως ασυμπτωματική, ακολουθούμενη από εφ όρου ζωής παραμονή του ιού στον οργανισμό. Εάν εκδηλωθούν συμπτώματα, σε εφήβους ή ενήλικες, μοιάζουν με εκείνα της μονοπυρήνωσης με πυρετό, ασθενή ηπατίτιδα και γενικευμένη αδιαθεσία. Έχουν παρατηρηθεί βαριές λοιμώξεις από CMV, ιδιαίτερα σε ασθενείς που προσβλήθηκαν ενδομήτρια και σε ανοσοκατασταλμένους ασθενείς. * Mackay, I.M. (2004) Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 10, 190. Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/2010 9

10 Χαρακτηριστικά απόδοσης Αναλυτική ευαισθησία-πλάσμα Το όριο ανίχνευσης της ανάλυσης όσον αφορά τον καθαρισμό (όριο ευαισθησίας) αξιολογήθηκε για το artus CMV QS-RGQ Kit με χρήση θετικών στον CMV κλινικών δειγμάτων σε συνδυασμό με την εκχύλιση στο όργανο QIAsymphony SP. Για το πλάσμα, η αναλυτική ευαισθησία όσον αφορά τον καθαρισμό του artus CMV QS-RGQ Kit προσδιορίσθηκε με χρήση μίας σειράς αραιώσεων του ιού της CMV από 1000 έως την ονομαστική τιμή 0,316 CMV αντιγράφων/ml με εμβολιασμό σε κλινικά δείγματα πλάσματος. Αυτά τα δείγματα υποβλήθηκαν σε εκχύλιση DNA με χρήση του QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit σε συνδυασμό με το πρωτόκολλο Cellfree1000 (όγκος εκχύλισης: 1 ml, όγκος έκλουσης: 60 µl). Καθεμιά από τις 10 αραιώσεις αναλύθηκε με το artus CMV QS-RGQ Kit σε 4 διαφορετικές ημέρες, σε 4 εκτελέσεις με 8 θυγατρικούς κλώνους έκαστη. Τα αποτελέσματα καθορίστηκαν μέσω ανάλυσης probit. Μία γραφική αναπαράσταση της ανάλυσης probit παρουσιάζεται στην Εικόνα 1. Το όριο ανίχνευσης της ανάλυσης για τον καθαρισμό του artus CMV QS-RGQ Kit σε συνδυασμό με το Rotor-Gene Q, είναι 42,5 αντίγραφα/ml (p = 0,05). Αυτό συνεπάγεται ότι η πιθανότητα ανίχνευσης 42,5 αντιγράφων/ml, είναι 95% % Αναλογίες Proportions ,63 ~ 42, αντίγραφα/ml copies/ml (95%) (95%) (29,4 70,2 ( αντίγραφα/ml) copies/ml) log (dose) (δόση) Εικόνα 1. Ανάλυση probit: πλάσμα, CMV (Rotor-Gene Q). Αναλυτική ευαισθησία λαμβάνοντας υπόψη τον καθαρισμό (πλάσμα, με τη χρήση του QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit) του artus CMV QS-RGQ Kit στο όργανο Rotor-Gene Q. 10 Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/2010

11 Ειδικότητα-πλάσμα Η ειδικότητα του artus CMV QS-RGQ Kit εξασφαλίζεται κατά κύριο λόγο με την επιλογή των εκκινητών και των ανιχνευτών καθώς και με την επιλογή αυστηρών συνθηκών αντίδρασης. Οι εκκινητές και οι ανιχνευτές έχουν ελεγχθεί με βάση την ανάλυση σύγκρισης αλληλουχίας, όσον αφορά τυχόν ομολογίες με άλλες αλληλουχίες αναφερόμενες σε τράπεζες γονιδίων. Με αυτόν τον τρόπο έχει ελεγχθεί η ανιχνευσιμότητα όλων των σχετικών στελεχών. Επιπλέον,η ειδικότητα αξιολογήθηκε με τη χρήση 100 διαφορετικών δειγμάτων πλάσματος τα οποία ήταν αρνητικά στον CMV. Αυτά δεν εμφάνισαν κανένα σήμα με τους ειδικούς για τον CMV εκκινητές και ανιχνευτές που περιέχονται στο CMV RG Master. Μία ενδεχόμενη διασταυρωμένη αντίδραση του artus CMV QS-RGQ Kit, εξετάστηκε με τη χρήση της ομάδας ελέγχου που αναφέρεται στον Πίνακα 1 (παρακάτω). Κανένας απο τους εξεταζόμενους παθογόνους παράγοντες δεν προκάλεσε αντίδραση. Καμμία διασταυρωμένη αντίδραση δεν εμφανίστηκε με μικτές λοιμώξεις. Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/

12 Πίνακας 1. Ειδικός έλεγχος του κιτ με δυνητικά διασταυρωμένης αντίδρασης παθογόνους παράγοντες. Ομάδα ελέγχου Ανθρώπινος ερπητοϊός 1 (Ιός απλού έρπητα 1) Ανθρώπινος ερπητοϊός 2 (Ιός απλού έρπητα 2) Ανθρώπινος ερπητοϊός 3 (Ιός ανεμοβλογιάς-έρπητα ζωστήρα) Ανθρώπινος ερπητοϊός 4 (Ιός Epstein-Barr) CMV (Cycling Green)) Εσωτερικός μάρτυρας (Cycling Yellow)) Ανθρώπινος ερπητοϊός 6A + Ανθρώπινος ερπητοϊός 6B + Ανθρώπινος ερπητοϊός 7 + Ανθρώπινος ερπητοϊός 8 (ερπητοϊός σχετιζόμενος με το σάρκωμα Kaposi) + Ιός ηπατίτιδας Α + Ιός ηπατίτιδας B + Ιός ηπατίτιδας C + Ανθρώπινος μη ανοσοποιητικός ιός 1 + Ανθρώπινος ιός Τ-κυτταρικής λευχαιμίας τύπος 1 + Ανθρώπινος ιός Τ-κυτταρικής λευχαιμίας τύπος 2 + Ιός Δυτικού Νείλου + Εντεροϊός + Παρβοϊός B Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/2010

13 Γραμμικό εύρος-πλάσμα Το γραμμικό εύρος για τον καθαρισμό του artus CMV QS-RGQ Kit προσδιορίσθηκε με ανάλυση μίας σειράς αραιώσεων υλικού ιού του CMV από 1,00 x 10 8 αντίγραφα/ml έως 3,16 x 10 1 αντίγραφα/ml. Ο καθαρισμός διεξήχθη σε θυγατρικούς κλώνους (n = 4 για συγκεντρώσεις 1,00 x 10 7 αντίγραφα/ml, n = 8 για συγκεντρώσεις <1,00 x 10 7 αντίγραφα/ml) με χρήση του QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Kit σε συνδυασμό με το πρωτόκολλο Cellfree1000 (όγκος εκχύλισης: 1 ml, όγκος έκλουσης: 60 µl). Καθένα από τα δείγματα αναλύθηκε με το artus CMV QS-RGQ Kit. Το γραμμικό εύρος για τον καθαρισμό του artus CMV QS-RGQ Kit προσδιορίσθηκε ότι καλύπτει για το πλάσμα συγκεντρώσεις από 7,94 x 10 1 αντίγραφα/ml έως 1,00 x 10 8 αντίγραφα/ml (Εικόνα 2, σελίδα 14). Ανθεκτικότητα-πλάσμα Η επικύρωση της ανθεκτικότητας επιτρέπει τον καθορισμό του συνολικού ποσοστού αποτυχίας του artus CMV QS-RGQ Kit. Για την επικύρωση της ανθεκτικότητας εμβολιάσθηκαν 100 CMV αρνητικά δείγματα πλάσματος με 130 αντίγραφα/ml του CMV (περίπου τριπλάσια συγκέντρωση του αναλυτικού ορίου ανίχνευσης). Ύστερα από εκχύλιση με χρήση του QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit σε συνδυασμό με το πρωτόκολλο Cellfree1000_DSP για πλάσμα (όγκος εκχύλισης: 1 ml, όγκος έκλουσης: 60 µl), τα δείγματα αυτά αναλύθηκαν με το artus CMV QS-RGQ Kit. Επιπλέον, η ανθεκτικότητα του εσωτερικού μάρτυρα αξιολογήθηκε με καθαρισμό και ανάλυση των 100 εμβολιασμένων δειγμάτων πλάσματος. Δεν παρατηρήθηκαν αναστολές. Συνεπώς, η ανθεκτικότητα του artus CMV QS-RGQ Kit είναι 99%. Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/

14 log10 υπολογιζόμενη συγκέντρωση log 10 estimated (αντίγραφα/ml) concentration (copies/ml) y = 1,0521x x 0, R 2 = 0, log 10 ονομαστική log 10 nominal συγκέντρωση concentration (αντίγραφα/ml) (copies/ml) Εικόνα 2. Γραμμικό εύρος του artus CMV QS-RGQ Kit (πλάσμα). Υπολογισμός του γραμμικού εύρους. Η ευθεία γραμμή προσδιορίσθηκε με γραμμική παλινδρόμηση των log 10 υπολογιζόμενων συγκεντρώσεων με τις log 10 ονομαστικές συγκεντρώσεις. Η εξίσωση της γραμμής παλινδρόμησης περιλαμβάνεται στην εικόνα. Αναλυτική ευαισθησία-ολικό αίμα Το όριο ανίχνευσης της ανάλυσης όσον αφορά τον καθαρισμό (όριο ευαισθησίας) αξιολογήθηκε για το artus CMV QS-RGQ Kit με χρήση θετικών στον CMV κλινικών δειγμάτων σε συνδυασμό με την εκχύλιση στο όργανο QIAsymphony SP. Για το ολικό αίμα, η αναλυτική ευαισθησία όσον αφορά τον καθαρισμό του artus CMV QS-RGQ Kit προσδιορίσθηκε με χρήση μίας σειράς αραιώσεων του ιού της CMV από 1000 έως την ονομαστική τιμή 3,16 CMV αντιγράφων/ml με εμβολιασμό σε κλινικά δείγματα ολικού αίματος. Αυτά τα δείγματα υποβλήθηκαν σε εκχύλιση DNA με χρήση του QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Mini Kit σε συνδυασμό με το πρωτόκολλο VirusBlood200 (όγκος εκχύλισης: 200 ml, όγκος έκλουσης: 60 µl). Καθεμιά από τις 8 αραιώσεις αναλύθηκε με το artus CMV QS-RGQ Kit σε 3 διαφορετικές ημέρες, σε 6 εκτελέσεις με 11 θυγατρικούς κλώνους έκαστη. Τα αποτελέσματα καθορίστηκαν μέσω ανάλυσης probit. Μία γραφική αναπαράσταση της ανάλυσης probit παρουσιάζεται στην Εικόνα 3. Το όριο ανίχνευσης της ανάλυσης για τον καθαρισμό του artus CMV QS-RGQ Kit σε συνδυασμό με το Rotor-Gene Q, είναι 164,55 αντίγραφα/ml (p = 0,05). Αυτό συνεπάγεται ότι η πιθανότητα ανίχνευσης 164,55 αντιγράφων/ml, είναι 95%. 14 Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/2010

15 1.0 95% 0.8 Αναλογίες Proportions , ~ 164,55 ~ αντίγραφα/ml copies/ml (95%) (95%) 82,01 636,34 αντίγραφα/ml) ( copies/ml) log log (δόση) (dose) Εικόνα 3. Ανάλυση probit:ολικό αίμα, CMV (Rotor-Gene Q). Αναλυτική ευαισθησία λαμβάνοντας υπόψη τον καθαρισμό (ολικό αίμα, με τη χρήση του QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Mini Kit) του artus CMV QS-RGQ Kit στο όργανο Rotor-Gene Q. Ειδικότητα ολικό αίμα Η ειδικότητα του artus CMV QS-RGQ Kit εξασφαλίζεται κατά κύριο λόγο με την επιλογή των εκκινητών και των ανιχνευτών καθώς και με την επιλογή αυστηρών συνθηκών αντίδρασης. Οι εκκινητές και οι ανιχνευτές έχουν ελεγχθεί με βάση την ανάλυση σύγκρισης αλληλουχίας, όσον αφορά τυχόν ομολογίες με άλλες αλληλουχίες αναφερόμενες σε τράπεζες γονιδίων. Με αυτόν τον τρόπο έχει ελεγχθεί η ανιχνευσιμότητα όλων των σχετικών στελεχών. Επιπλέον,η ειδικότητα αξιολογήθηκε με τη χρήση 100 διαφορετικών δειγμάτων ολικού αίματος τα οποία ήταν αρνητικά στον CMV. Αυτά δεν εμφάνισαν κανένα σήμα με τους ειδικούς για τον CMV εκκινητές και ανιχνευτές που περιέχονται στο CMV RG Master. Μία ενδεχόμενη διασταυρωμένη αντίδραση του artus CMV QS-RGQ Kit, εξετάστηκε με τη χρήση της ομάδας ελέγχου που αναφέρεται στον Πίνακα 1 (βλέπε σελίδα 12). Κανένας απο τους εξεταζόμενους παθογόνους παράγοντες δεν προκάλεσε αντίδραση. Καμμία διασταυρωμένη αντίδραση δεν εμφανίστηκε με μικτές λοιμώξεις. Γραμμικό εύρος-ολικό αίμα Το γραμμικό εύρος για τον καθαρισμό του artus CMV QS-RGQ Kit προσδιορίσθηκε με ανάλυση μίας σειράς αραιώσεων υλικού ιού του CMV από 5,00 x 10 7 έως 1,00 x 10 2 αντίγραφα/ml στο ολικό αίμα. Ο καθαρισμός Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/

16 διεξήχθη σε θυγατρικούς κλώνους (n = 4 για συγκεντρώσεις 1,00 x 10 7 αντίγραφα/ml, n = 8 για συγκεντρώσεις <1,00 x 10 7 αντίγραφα/ml) με χρήση του QIAsymphony DNA Mini Kit σε συνδυασμό με το πρωτόκολλο VirusBlood200 (όγκος εκχύλισης: 200 µl, όγκος έκλουσης: 60 µl). Καθένα από τα δείγματα αναλύθηκε με το artus CMV QS-RGQ Kit. Το γραμμικό εύρος για τον καθαρισμό του artus CMV QS-RGQ Kit προσδιορίσθηκε ότι καλύπτει συγκεντρώσεις από 1,00 x 10 3 αντίγραφα/ml έως 5,00 x 10 7 αντίγραφα/ml για το ολικό αίμα (Εικόνα 4). log10 υπολογιζόμενη συγκέντρωση (αντίγραφα/ml) log 10 estimated concentration (copies/ml) y y = 1,0514x x 0, RR 2 2 = = 0, log log 10 ονομαστική 10 nominal concentration συγκέντρωση (copies/ml) (αντίγραφα/ml) Εικόνα 4. Γραμμικό εύρος του artus CMV QS-RGQ Kit (ολικό αίμα). Υπολογισμός του γραμμικού εύρους. Η ευθεία γραμμή προσδιορίσθηκε με γραμμική παλινδρόμηση των log 10 υπολογιζόμενων συγκεντρώσεων με τις log 10 ονομαστικές συγκεντρώσεις. Η εξίσωση της γραμμής παλινδρόμησης περιλαμβάνεται στην εικόνα. Ανθεκτικότητα-ολικό αίμα Η επικύρωση της ανθεκτικότητας επιτρέπει τον καθορισμό του συνολικού ποσοστού αποτυχίας του artus CMV QS-RGQ Kit. Για την επικύρωση της ανθεκτικότητας εμβολιάσθηκαν 100 CMV αρνητικά δείγματα ολικού αίματος με 500 αντίγραφα/ml του CMV (περίπου τριπλάσια συγκέντρωση του αναλυτικού ορίου ανίχνευσης). Ύστερα από εκχύλιση με χρήση του QIAsymphony DNA Mini Kit σε συνδυασμό με το πρωτόκολλο VirusBlood200 για ολικό αίμα, τα δείγματα αυτά αναλύθηκαν με το artus CMV QS-RGQ Kit. Επιπλέον, η ανθεκτικότητα του εσωτερικού μάρτυρα αξιολογήθηκε με καθαρισμό και ανάλυση των 100 εμβολιασμένων δειγμάτων ολικού αίματος. Δεν παρατηρήθηκαν αναστολές. Συνεπώς, η ανθεκτικότητα του artus CMV QS- RGQ Kit είναι 99%. 16 Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/2010

17 Ακρίβεια Τα δεδομένα ακρίβειας του artus CMV QS-RGQ Kit παρέχουν τη δυνατότητα καθορισμού της ολικής διακύμανσης της ανάλυσης. Η ολική διακύμανση αποτελείται από τη μεταβλητότητα εντός της ανάλυσης (intra-assay), (μεταβλητότητα πολλαπλών αποτελεσμάτων δειγμάτων της ίδιας συγκέντρωσης, στα πλαίσια ενός πειράματος), τη μεταβλητότητα μεταξύ διαφορετικών αναλύσεων (inter-assay), (μεταβλητότητα πολλαπλών αποτελεσμάτων της ανάλυσης που παρήχθησαν σε διαφορετικά όργανα του ίδιου τύπου από διαφορετικούς χειριστές εντός του ίδιου εργαστηρίου) και τη μεταβλητότητα μεταξύ των παρτίδων (inter-batch), (μεταβλητότητα πολλαπλών αποτελεσμάτων της ανάλυσης με χρήση περισσότερων παρτίδων). Τα ληφθέντα δεδομένα χρησιμοποιήθηκαν για τον καθορισμό της τυπικής απόκλισης, της διακύμανσης και του συντελεστή μεταβλητότητας για το συγκεκριμένο παθογόνο παράγοντα και την PCR εσωτερικού μάρτυρα. Τα αναλυτικά δεδομένα ακρίβειας του artus CMV QS-RGQ Kit (χωρίς εξέταση του καθαρισμού) συλλέχθηκαν με χρήση του πρότυπου ποσοτικοποίησης της χαμηλότερης συγκέντρωσης (QS 4, 10 αντίγραφα/µl). Η δοκιμασία εκτελέστηκε με 8 θυγατρικούς κλώνους. Τα δεδομένα ακρίβειας υπολογίστηκαν με βάση τις τιμές C T των καμπυλών πολλαπλασιασμού (C T : κύκλος κατωφλίου, βλέπε Πίνακα 2, παρακάτω). Επιπλέον, τα δεδομένα ακρίβειας για τα ποσοτικά αποτελέσματα σε αντίγραφα/µl προσδιορίσθηκαν με χρήση των αντίστοιχων τιμών C T (Πίνακας 3, σελίδα 19). Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, η γενική στατιστική διασπορά οποιουδήποτε δείγματος με την αναφερθείσα συγκέντρωση είναι 1,21% (C T ) ή 14,38% (συγκέντρωση) και 1,93% (C T ) για την ανίχνευση του εσωτερικού μάρτυρα. Αυτές οι τιμές βασίζονται στο σύνολο όλων των μεμονωμένων τιμών της καθορισμένης μεταβλητότητας. Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/

18 Πίνακας 2. Δεδομένα ακρίβειας με βάση τις τιμές C T Μεταβλητότητα εντός της ανάλυσης: CMV QS 4 Μεταβλητότητα εντός της ανάλυσης: Εσωτερικός μάρτυρας Μεταβλητότητα μεταξύ αναλύσεων: CMV QS 4 Μεταβλητότητα μεταξύ αναλύσεων: Εσωτερικός μάρτυρας Μεταβλητότητα μεταξύ παρτίδων: CMV QS 4 Μεταβλητότητα μεταξύ παρτίδων: Εσωτερικός μάρτυρας Ολική διακύμανση: CMV QS 4 Ολική διακύμανση: Εσωτερικός μάρτυρας Τυπική απόκλιση Διακύμανση Συντελεστής μεταβλητότητας (%) 0,17 0,03 0,57 0,31 0,10 1,16 0,38 0,14 1,27 0,47 0,22 1,77 0,33 0,11 1,10 0,53 0,28 2,02 0,36 0,13 1,21 0,51 0,26 1,93 18 Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/2010

19 Πίνακας 3. Δεδομένα ακρίβειας με βάση τα ποσοτικά αποτελέσματα (σε αντίγραφα/µl) Μεταβλητότητα εντός της ανάλυσης: CMV QS 4 Μεταβλητότητα μεταξύ αναλύσεων: CMV QS 4 Μεταβλητότητα μεταξύ παρτίδων: CMV QS 4 Ολική διακύμανση: CMV QS 4 Τυπική απόκλιση Διακύμανση Συντελεστής μεταβλητότητας (%) 1,34 1,80 13,30 1,54 2,38 15,25 1,46 2,12 14,41 1,45 2,11 14,38 Αναπαραγωγιμότητα Τα δεδομένα αναπαραγωγιμότητας παρέχουν τη δυνατότητα τακτικής αξιολόγησης της απόδοσης του artus CMV QS-RGQ Kit καθώς και μία σύγκριση της αποτελεσματικότητας με άλλα προϊόντα. Αυτά τα δεδομένα αποκτώνται από τη συμμετοχή σε καθιερωμένα προγράμματα επάρκειας. Διασταυρούμενη επιμόλυνση Η απουσία διασταυρούμενης επιμόλυνσης μεταξύ δειγμάτων για τη συνολική ροή εργασίας αποδείχθηκε με την ενδεδειγμένη ανίχνευση όλων των γνωστών θετικών και αρνητικών δειγμάτων σε εναλλάξ θέσεις (διάταξη τύπου σκακιέρας) για επιλεγμένο σύστημα artus QS-RGQ. Ροή εργασίας Η ροή εργασίας QIAsymphony RGQ αρχίζει με τον καθαρισμό των νουκλεϊκών οξέων από δείγματα ανθρώπινου πλάσματος ή ολικού αίματος στο όργανο QIAsymphony SP. Τα εκλούσματα που περιέχουν καθαρισμένα νουκλεϊκά οξέα από τη διαδικασία προετοιμασίας των δειγμάτων, μεταφέρονται στη μονάδα QIAsymphony AS, η οποία εκτελεί την προετοιμασία της ανάλυσης (Εικόνα 5). Κατόπιν αυτού, οι αναλύσεις μεταφέρονται στο όργανο Rotor-Gene Q για PCR και ανάλυση δεδομένων (Εικόνα 6). Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/

20 Η επισκόπηση της ροής εργασίας παρέχεται στις σελίδες Για περισσότερες πληροφορίες ανατρέξτε στα αναλυτικά πρωτόκολλα του παρόντος εγχειριδίου (σελίδες 39, 49 και 57). Εικόνα 5. Αυτόνομος (Walkaway) αυτοματισμός σε όργανα QIAsymphony SP/AS. Τα δείγματα, τα αντιδραστήρια και τα αναλώσιμα φορτώνονται στα αντίστοιχα συρτάρια. Κατόπιν αυτού, η προετοιμασία των δειγμάτων και της ανάλυσης είναι εντελώς αυτοματοποιημένη στα όργανα QIAsymphony SP/AS. 20 Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/2010

21 Εικόνα 6. Μεταφορά των δειγμάτων στο Rotor-Gene Q. Ύστερα από την προετοιμασία των δειγμάτων και της ανάλυσης, οι αντιδράσεις φορτώνονται στο στροφέα 72 φρεατίων του Rotor-Gene Q για ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο. Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/

22 Επισκόπηση ροής εργασίας QIAsymphony RGQ QIAsymphony SP Φορτώστε το συρτάρι Waste (Απόβλητα). Τοποθετήστε τη θήκη έκλουσης στο συρτάρι «Eluate» (Έκλουσμα). Ανεξάρτητη λειτουργία Ολοκληρωμένη λειτουργία Τοποθετήστε τη θήκη έκλουσης στην υποδοχή 1. Τοποθετήστε τη θήκη έκλουσης με τον προσαρμογέα, συμπεριλαμβανομένου του πλαισίου μεταφοράς στην υποδοχή 1. Φορτώστε το συρτάρι Reagents and Consumables (αντιδραστήρια και αναλώσιμα). Φορτώστε το συρτάρι Sample (Δείγμα). Ορίστε μία εκτέλεση/παρτίδα χρησιμοποιώντας τη διεπαφή χρήστη προετοιμασίας δειγμάτων. Εκκινήστε το πρωτόκολλο. Όταν ολοκληρωθεί η επεξεργασία των δειγμάτων, αφαιρέστε με το χέρι τη θήκη έκλουσης από το συρτάρι Eluate (ανεξάρτητη λειτουργία) ή εκτελέστε απευθείας μεταφορά της θήκης έκλουσης στο QIAsymphony AS μέσω της μονάδας μεταφοράς (ολοκληρωμένη λειτουργία). Ανεξάρτητη λειτουργία Ολοκληρωμένη λειτουργία Αφαιρέστε τη θήκη έκλουσης από την υποδοχή στην οθόνη αφής και στη συνέχεια ανοίξτε το συρτάρι Eluate και αφαιρέστε με το χέρι τη θήκη έκλουσης. Πατήστε Transfer (Μεταφορά) για να μεταφέρετε τη θήκη έκλουσης από το QIAsymphony στο QIAsymphony AS. Καταφόρτωση του αρχείου αποτελεσμάτων QIAsymphony SP. 22 Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/2010

23 QIAsymphony AS Μεταβείτε στη διεπαφή χρήστη προετοιμασίας ανάλυσης στην οθόνη αφής. Εκκινήστε τη διαδικασία ορισμού της ανάλυσης. Ανεξάρτητη λειτουργία Ολοκληρωμένη λειτουργία Πατήστε New (Νέο). Εμφανίζεται ένα μήνυμα που σας ρωτά αν θέλετε να χρησιμοποιήσετε τη θήκη έκλουσης ως θήκη δείγματος. Πατήστε Yes (Ναι) για επιβεβαίωση. Ορίστε μία εκτέλεση ανάλυσης. Οι οθόνες που εμφανίζονται στην οθόνη αφής, σας καθοδηγούν βήμα-βήμα κατά τη διαδικασία ορισμού της ανάλυσης. Φορτώστε στα συρτάρια Eluate and Reagents (Έκλουσμα και αντιδραστήρια) και Assays (Αναλύσεις) τα αντίστοιχα δείγματα, αντιδραστήρια και αναλώσιμα. Για αναλυτικές πληροφορίες σχετικές με τη φόρτωση ανατρέξτε στην οθόνη Loading Information (Πληροφορίες φόρτωσης). Εναλλακτικά, πατήστε Queue (Ουρά) και καταφορτίστε το αρχείο πληροφοριών φόρτωσης. Εκκινήστε την εκτέλεση της ανάλυσης. Μετά το τέλος της εκτέλεσης, αφαιρέστε τις αναλύσεις. Προς το σκοπό αυτό, πατήστε Remove (Αφαίρεση) και στη συνέχεια αφαιρέστε με το χέρι τη (τις) θήκη(ες) ανάλυσης από το συρτάρι Assays. Μεταφέρετε τη (τις) θήκη(ες) ανάλυσης στο Rotor-Gene Q. Καταφορτίστε το αρχείο αποτελεσμάτων QIAsymphony AS και το αρχείο κυκλοποιητή. Μεταφέρετε το αρχείο κυκλοποιητή στο Rotor-Gene Q. Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/

24 Rotor-Gene Q Επιλέξτε ή δημιουργήστε ένα προφίλ θερμοκρασίας. Επιλέξτε το Start Run. Μόλις ολοκληρωθεί η εκτέλεση, προχωρήστε σε ανάλυση των αποτελεσμάτων. Συντήρηση Εκτελέστε τις ενδεδειγμένες διαδικασίες συντήρησης για το QIAsymphony SP/AS και το Rotor-Gene Q σύμφωνα με τα εγχειρίδια χρήσης των οργάνων. Βλέπε κεφάλαιο 8 του Εγχειριδίου χρήσης Γενική περιγραφή QIAsymphony SP/AS και το κεφάλαιο 9 του Εγχειριδίου χρήσης Rotor-Gene Q για περισσότερες λεπτομέρειες σχετικές με τις απαιτούμενες διαδικασίες καθημερινής, τακτικής και εβδομαδιαίας συντήρησης. 24 Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/2010

25 Εξοπλισμός και αντιδραστήρια που παρέχονται στο χρήστη Όταν εργάζεστε με χημικά θα πρέπει πάντοτε να φοράτε προστατευτική ποδιά εργαστηρίου, γάντια μίας χρήσης και προστατευτικά γυαλιά. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στα σχετικά δελτία δεδομένων ασφαλείας υλικού (MSDSs), τα οποία και είναι διαθέσιμα από τον προμηθευτή του προϊόντος. Πιπέτες (ρυθμιζόμενες)* και αποστειρωμένα ρύγχη πιπέτας με φίλτρο Αναδευτήρας τύπου vortex* Φυγόκεντρος Benchtop* με στροφέα για σωληνάρια αντίδρασης 2 ml με δυνατότητα φυγοκέντρησης στα 6800 x g Για προετοιμασία δειγμάτων Όργανο QIAsymphony SP (αρ. κατ )* QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit (αρ. κατ ) για δείγματα πλάσματος ή QIAsymphony DNA Mini Kit (αρ. κατ ) για δείγματα ολικού αίματος Προσαρμογείς για το QIAsymphony SP: Θήκη μικροσωληναρίων έκλουσης QS (προσαρμογέας ψύξης, EMT, v2, Qsym, αρ. κατ ) Ένθετο σωληναρίου 3B (ένθετο, 2.0ml v2, samplecarr. (24), Qsym, αρ. κατ ) Αναλώσιμα υλικά για το QIAsymphony SP: Φύσιγγες προετοιμασίας δείγματος, 8 φρεατίων (αρ. κατ ) Καλύμματα 8 ράβδων (αρ. κατ ) Ρύγχη φίλτρου, 1500 µl (αρ. κατ ) Ρύγχη φίλτρου, 200 µl (αρ. κατ ) Μικροσωληνάρια έκλουσης CL (αρ. κατ ) Σακούλες απόρριψης ρυγχών (αρ. κατ ) Μικροσωληνάρια 2,0 ml τύπου Η ή μικροσωληνάρια 2,0 ml τύπου Ι (Sarstedt, αρ. κατ και , για χρήση με δείγματα και εσωτερικούς μάρτυρες * Βεβαιωθείτε πως τα όργανα έχουν ελεγχθεί και βαθμονομηθεί σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/

26 Για προετοιμασία ανάλυσης Όργανο QIAsymphony AS (αρ. κατ )* Προσαρμογείς και υποδοχές αντιδραστηρίων για το QIAsymphony AS: Υποδοχή αντιδραστηρίου 1 QS (προσαρμογέας ψύξης, υποδοχή αντιδραστηρίου 1, Qsym, αρ. κατ ) Υποδοχή αντιδραστηρίου 2 QS (προσαρμογέας ψύξης, υποδοχή αντιδραστηρίου 2, Qsym, αρ. κατ ) Σωληνάρια ταινιών RG 72 QS (προσαρμογέας ψύξης, σωληνάρια ταινιών RG 72, Qsym, αρ. κατ ) Αναλώσιμα υλικά για το QIAsymphony AS: Σωληνάρια και καπάκια ταινιών, 0,1 ml (αρ. κατ ) Σωληνάρια, κωνικά, 2 ml, Qsym AS (αρ. καταλ )* ή μικροσωληνάρια 2,0 ml τύπου I (Sarstedt, αρ. κατ , Σωληνάριο, κωνικό, 5 ml, Qsym AS (αρ. κατ ) ή σωληνάρια με επίπεδη βάση από PP (Sarstedt, αρ. κατ , Φιάλες αντιδραστηρίων, 30 ml, QSym AS (αρ. κατ ) Για PCR Μικροσωληνάρια έκλουσης CL (αρ. κατ ) Ρύγχη φίλτρου, 1500 µl (αρ. κατ ) Ρύγχη φίλτρου, 200 µl (αρ. κατ ) Ρύγχη φίλτρου, 50 µl (αρ. κατ ) Σακούλες απόρριψης ρυγχών (αρ. κατ ) Όργανο Rotor-Gene Q 5plex HRM* Λογισμικό Rotor-Gene Q έκδοση 2.02 ή νεότερη * Βεβαιωθείτε πως τα όργανα έχουν ελεγχθεί και βαθμονομηθεί σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ρωτήστε σχετικά με τη διαθεσιμότητα. 26 Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/2010

27 Σημαντικές σημειώσεις Γενικές προφυλάξεις Ο χρήστης θα πρέπει πάντοτε να λαμβάνει υπόψη του τα εξής: Χρήση στείρων ρυγχών πιπέτας με φίλτρο. Κατά την εκτέλεση χειροκίνητων σταδίων, διατηρείτε τα σωληνάρια κλειστά όταν αυτό είναι δυνατό και αποφεύγετε τη επιμόλυνση. Αποψύχετε σχολαστικά όλα τα συστατικά σε θερμοκρασία δωματίου (15 25 C) πριν από την έναρξη της εκάστοτε ανάλυσης. Μετά την απόψυξη, αναμίξτε τα συστατικά (με επαναλαμβανόμενη αναρρόφηση και έγχυση με πιπέτα ή με παλμική ανάδευση (vortex) και φυγοκεντρήστε σύντομα. Βεβαιώνεστε ότι δεν υπάρχει αφρός ή φυσαλίδες στα σωληνάρια αντίδρασης. Μη αναμειγνύετε συστατικά από κιτ με διαφορετικούς αριθμούς παρτίδας Βεβαιώνεστε ότι οι απαιτούμενοι προσαρμογείς έχουν προψυχθεί στους 2 8 C. Εργάζεστε γρήγορα και διατηρείτε τα αντιδραστήρια PCR σε πάγο ή στη μονάδα ψύξης πριν από τη φόρτωση. Προχωρείτε χωρίς διαλείμματα από το ένα βήμα της ροής εργασίας στο επόμενο. Το διάστημα μεταφοράς μεταξύ κάθε μονάδας δεν πρέπει να υπερβαίνει τη μία ώρα (QIAsymphony SP προς QIAsymphony AS προς Rotor-Gene Q). Συλλογή, φύλαξη και μεταφορά δειγμάτων Όλα τα δείγματα πρέπει να αντιμετωπίζονται ως δυνητικώς μολυσματικά υλικά. Μόνο τα ακόλουθα υλικά δειγμάτων επιτρέπονται, για τα οποία πρέπει να τηρούνται αυστηρά οι παρακάτω κανόνες και ειδικές οδηγίες που αφορούν στη συλλογή, στη μεταφορά και στη φύλαξη. Η εσωτερική πιστοποίηση του artus CMV QS-RGQ Kit διεξήχθη με χρήση δειγμάτων EDTA ανθρώπινου πλάσματος και δειγμάτων EDTA ανθρώπινου ολικού αίματος. Άλλα υλικά δειγμάτων δεν έχουν πιστοποιηθεί. Χρησιμοποιείτε αποκλειστικά το συνιστώμενο κιτ απομόνωσης DNA (βλέπε Πρωτόκολλο: Απομόνωση DNA στο QIAsymphony SP, σελίδα 39) για την προετοιμασία των δειγμάτων. Κατά τη χρήση ορισμένων υλικών δειγμάτων πρέπει να τηρούνται αυστηρά συγκεκριμένες οδηγίες σχετικές με τη συλλογή, τη μεταφορά και την φύλαξη. Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/

28 Συλλογή δειγμάτων Κάθε αιμοληψία προκαλεί τραυματισμό των αιμοφόρων αγγείων (αρτηριών, φλεβών, τριχοειδών αγγείων). Πρέπει να χρησιμοποιούνται αποκλειστικά αβλαβή και αποστειρωμένα υλικά. Για την αιμοληψία διατίθενται κατάλληλα αναλώσιμα. Για την παρακέντηση φλεβών δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται υπερβολικά λεπτές τριχοειδείς βελόνες. Η λήψη φλεβικού αίματος πρέπει να πραγματοποιείται σε κατάλληλα μέρη της καμπής του αγκώνα, του αντιβραχιόνιου ή της ράχης του καρπού. Το αίμα πρέπει να λαμβάνεται με πρότυπα σωληνάρια δειγματοληψίας (κόκκινο πώμα, Sarstedt ή αντίστοιχο σωληνάριο άλλου κατασκευαστή). Πρέπει να λαμβάνεται όγκος 5 10 ml αίματος EDTA. Τα σωληνάρια πρέπει να αναδεύονται με ανατροπή αμέσως μετά τη δειγματοληψία (8 x, χωρίς ανάδευση). Δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται ηπαρινισμένα ανθρώπινα δείγματα (βλέπε Παρεμβαλλόμενες ουσίες πλάσμα και Παρεμβαλλόμενες ουσίες ολικό αίμα παρακάτω). Αποθήκευση δειγμάτων Για το πλάσμα, το πλήρες αίμα πρέπει να διαχωρίζεται σε πλάσμα και κυτταρικά συστατικά με φυγοκέντρηση για 20 λεπτά στα x g εντός 6 ωρών. Το απομονωμένο πλάσμα πρέπει να μεταφερθεί σε αποστειρωμένα σωληνάρια από πολυπροπυλένιο.η ευαισθησία της ανάλυσης μπορεί να περιορισθεί εάν καταψύχετε τα δείγματα ως συνήθη διαδικασία ή τα αποθηκεύετε για παρατεταμένο χρονικό διάστημα. Μεταφορά δειγμάτων Το υλικό των δειγμάτων θα πρέπει κατ' αρχήν να μεταφέρεται σε άθραυστο δοχείο μεταφοράς. Κατ' αυτόν τον τρόπο μπορεί να αποτραπεί ο εν δυνάμει κίνδυνος επιμόλυνσης λόγω διαφυγής του δείγματος. Τα δείγματα θα πρέπει να μεταφέρονται σύμφωνα με τις τοπικές και εθνικές οδηγίες για τη μεταφορά παθογόνων υλικών.* Τα δείγματα πρέπει να αποστέλλονται εντός 6 ωρών. Δεν συνιστάται να αποθηκεύετε τα δείγματα στο χώρο στον οποίο έχουν συλλεχθεί. Παρέχεται η δυνατότητα ταχυδρομικής αποστολής των δειγμάτων με τήρηση των νομικών διατάξεων για τη μεταφορά παθογόνων υλικών. Συνιστούμε τη μεταφορά υλικών μέσω ιδιωτικής υπηρεσίας ταχυμεταφορών. Τα δείγματα αίματος πρέπει να αποστέλλονται ψυχόμενα (2 8 C) και εκείνα του διαχωρισμένου πλάσματος σε κατάψυξη ( 15 έως 30 C). *. International Air Transport Association (IATA). Dangerous Goods Regulations. 28 Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/2010

29 Παρεμβαλλόμενες ουσίες πλάσμα Υψηλές τιμές λευκωματίνης ( 6 g/dl), χολερυθρίνης ( 30 mg/dl), λιπιδίων (τριγλυκερίδια 1 g/dl) και αιμολυτικών δειγμάτων (αιμοσφαιρίνη 2 g/dl) δεν επηρεάζουν το σύστημα. Η ηπαρίνη επηρεάζει την PCR. Δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται δείγματα τα οποία έχουν συλλεχθεί σε σωληνάρια που περιέχουν ηπαρίνη ως αντιπηκτικό. Επίσης δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται δείγματα ασθενών που υποβάλλονται σε αγωγή με ηπαρίνη. Παρεμβαλλόμενες ουσίες ολικό αίμα Υψηλές τιμές χολερυθρίνης ( 30 mg/dl), λιπιδίων (τριγλυκερίδια 1 g/dl) και ανθρωπίνου γενομικού DNA ( 3 µg/ml) δεν επηρεάζουν το σύστημα. Η ηπαρίνη επηρεάζει την PCR. Δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται δείγματα τα οποία έχουν συλλεχθεί σε σωληνάρια που περιέχουν ηπαρίνη ως αντιπηκτικό. Επίσης δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται δείγματα ασθενών που υποβάλλονται σε αγωγή με ηπαρίνη. Γρήγορο ξεκίνημα στα όργανα QIAsymphony SP/AS Κλείστε όλα τα συρτάρια και τα καλύμματα. Ενεργοποιήστε τα όργανα QIAsymphony SP/AS και περιμένετε έως ότου εμφανιστεί η οθόνη «Sample Preparation» (Προετοιμασία δειγμάτων) και ολοκληρωθεί η διαδικασία αρχικοποίησης. Συνδεθείτε με το όργανο (τα συρτάρια απασφαλίζονται). Φόρτωση φυσίγγων αντιδραστηρίων (RC) στο συρτάρι Reagents and Consumables (Αντιδραστήρια και αναλώσιμα) Τα αντιδραστήρια για τον καθαρισμό των νουκλεϊκών οξέων περιέχονται σε μία καινοτομική φύσιγγα αντιδραστηρίων (RC) (βλέπε Εικόνα 7). Κάθε περιέκτης της φύσιγγας αντιδραστηρίων(rc) περιέχει ένα συγκεκριμένο αντιδραστήριο, όπως μαγνητικά σωματίδια, ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης ή ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης. Οι μερικώς χρησιμοποιημένες φύσιγγες αντιδραστηρίων (RC) μπορούν να σφραγιστούν ξανά με χρήση των ταινιών σφράγισης επαναληπτικής χρήσης για μετέπειτα χρήση, αποτρέποντας έτσι την παραγωγή αποβλήτων από περίσσειες αντιδραστηρίων στο τέλος της διαδικασίας καθαρισμού. Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/

30 Κάλυμμα διάτρησης (PL) Ράφι ενζύμων (ER) Υποδοχές για βιδωτά καπάκια από σωληνάρια ενζύμων Ταινία σφράγισης για επαναληπτική χρήση Περιέκτης μαγνητικών σωματιδίων Πλαίσιο με περιέκτες αντιδραστηρίων Στήριγμα φύσιγγας αντιδραστηρίων Εικόνα 7. Φύσιγγα αντιδραστηρίων QIAsymphony (RC). Η φύσιγγα αντιδραστηρίων (RC) περιέχει όλα τα αντιδραστήρια που απαιτούνται για τη διαδικασία καθαρισμού. Πριν από την έναρξη της διαδικασίας, βεβαιωθείτε πως τα μαγνητικά σωματίδια είναι πλήρως ανακατανεμημένα. Αφαιρέστε τον περιέκτη των μαγνητικών σωματιδίων από το πλαίσιο της φύσιγγας αντιδραστηρίων, αναδεύστε το έντονα σε αναδευτήρα vortex για τουλάχιστον 3 λεπτά και τοποθετήστε τον ξανά στο πλαίσιο της φύσιγγας αντιδραστηρίων πριν από την πρώτη χρήση. Τοποθετήστε τη φύσιγγα αντιδραστηρίων (RC) στο στήριγμα της φύσιγγας αντιδραστηρίων. Τοποθετήστε το ράφι ενζύμων (ER) στο στήριγμα της φύσιγγας αντιδραστηρίων. Πριν χρησιμοποιήσετε φύσιγγα αντιδραστηρίων (RC) για πρώτη φορά, τοποθετήστε το κάλυμμα διάτρησης (PL) επάνω στη φύσιγγα αντιδραστηρίων (RC) (Εικόνα 8). Το κάλυμμα διάτρησης (PL) είναι αιχμηρό. Να είστε προσεκτικοί κατά την τοποθέτησή του στη φύσιγγα αντιδραστηρίων (RC). Βεβαιωθείτε πως το κάλυμμα διάτρησης (PL) έχει τοποθετηθεί επάνω στη φύσιγγα αντιδραστηρίων (RC) με το σωστό προσανατολισμό. Μετά την αφαίρεση περιέκτη των μαγνητικών σωματιδίων και το άνοιγμα των σωληναρίων του ραφιού ενζύμων (τα βιδωτά καπάκια μπορούν να αποθηκευθούν στις ειδικές υποδοχές, βλέπε Εικόνα 5), η φύσιγγα αντιδραστηρίων (RC) φορτώνεται στο συρτάρι Reagents and Consumables. 30 Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/2010

31 Κάλυμμα διάτρησης (PL) Εικόνα 6. Εύκολη διάταξη της τράπεζας εργασίας με τις φύσιγγες αντιδραστηρίων (RC). Οι μερικώς χρησιμοποιημένες φύσιγγες αντιδραστηρίων (RC) μπορούν να φυλαχθούν έως την επόμενη χρήση τους. Βλέπε Φύλαξη στο Εγχειρίδιο QIAsymphony DSP Virus/Pathogen ή στο Εγχειρίδιο QIAsymphony DNA. Φόρτωση πλαστικών υλικών στο συρτάρι Reagents and Consumables Οι φύσιγγες προετοιμασίας δειγμάτων, τα περιβλήματα 8 ράβδων (αμφότερα προτοποθετημένα σε κουτιά μονάδων) και τα αναλώσιμα ρύγχη φίλτρου (ρύγχη των 200 µl σε μπλε θήκες, ρύγχη των 1500 µl σε μαύρες θήκες) φορτώνονται στο συρτάρι «Reagents and Consumables». Βεβαιωθείτε πως τα καλύμματα των κουτιών μονάδων έχουν αφαιρεθεί πριν από την φόρτωση των κουτιών μονάδων στο συρτάρι Reagents and Consumables. Τα ρύγχη διαθέτουν φίλτρα για τη μείωση του κινδύνου διασταυρούμενης επιμόλυνσης. Οι υποδοχές των θηκών των φίλτρων στην τράπεζα εργασίας QIAsymphony SP δέχονται και τους δύο τύπους θηκών φίλτρων. Κατά τη σάρωση υλικών, το QIAsymphony SP θα αναγνωρίσει τον τύπο των ρυγχών που φορτώθηκαν κατά τη σάρωση υλικών. Μην επαναπληρώνετε με το χέρι τις θήκες ρυγχών ή τα κουτιά μονάδων για τις φύσιγγες προετοιμασίας δειγμάτων ή των περιβλημάτων 8-ράβδων πριν από την έναρξη και άλλης εκτέλεσης πρωτοκόλλου. Το QIAsymphony SP μπορεί να χρησιμοποιήσει μερικώς χρησιμοποιημένες θήκες ρυγχών και κουτιά μονάδων. Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/

32 Φόρτωση του συρταριού Waste (Απόβλητα) Οι φύσιγγες προετοιμασίας δειγμάτων και τα περιβλήματα 8 ράβδων που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια μίας εκτέλεσης τοποθετούνται σε άδεια κουτιά μονάδων στο συρτάρι Waste. Βεβαιωθείτε πως το συρτάρι «Waste» περιέχει επαρκή αριθμό άδειων κουτιών μονάδων για τα πλαστικά απόβλητα που συσσωρεύονται κατά την εκτέλεση του πρωτοκόλλου. Βεβαιωθείτε πως τα καλύμματα των κουτιών έχουν αφαιρεθεί πριν από την φόρτωση των κουτιών μονάδων στο συρτάρι Waste. Εάν χρησιμοποιείτε κουτιά περιβλημάτων 8 ράβδων για τη συλλογή χρησιμοποιημένων φυσίγγων προετοιμασίας δειγμάτων και περιβλημάτων 8 ράβδων, βεβαιωθείτε πως έχει αφαιρεθεί το διαχωριστικό κουτιών. Στην πρόσθια πλευρά του διαμερίσματος Waste θα πρέπει να προσαρτηθεί σακούλα για τα μεταχειρισμένα ρύγχη φίλτρου. Το σύστημα δεν ελέγχει την παρουσία σακούλας απόρριψης ρυγχών. Βεβαιωθείτε πως η σακούλα απόρριψης ρυγχών έχει προσαρτηθεί σωστά προτού ξεκινήσετε μια εκτέλεση πρωτοκόλλου. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στα εγχειρίδια χρήσης που συνοδεύουν το όργανο. Αδειάζετε τη σακούλα ρυγχών το αργότερο μετά από την επεξεργασία 96 δειγμάτων για την αποφυγή εμπλοκής των ρυγχών. Ένας περιέκτης αποβλήτων συλλέγει τα υγρά απόβλητα που δημιουργούνται κατά τη διαδικασία καθαρισμού. Το συρτάρι «Waste» μπορεί να κλείσει μόνο εφόσον ο περιέκτης αποβλήτων βρίσκεται στη θέση του. Απορρίψτε τα υγρά απόβλητα σύμφωνα με τους εκάστοτε τοπικούς κανονισμούς ασφαλείας και προστασίας του περιβάλλοντος. Μην αποστειρώνετε σε αυτόκαυστο τη γεμάτη με απόβλητα φιάλη. Αδειάζετε τη φιάλη αποβλήτων το αργότερο μετά από την επεξεργασία 96 δειγμάτων. Φόρτωση του συρταριού Eluate Φορτώστε την απαιτούμενη θήκη έκλουσης στο συρτάρι «Eluate» Χρησιμοποιήστε το Elution slot 1 (υποδοχή έκλουσης 1) με τον αντίστοιχο προσαρμογέα ψύξης. Για ολοκληρωμένη λειτουργία, τοποθετήστε τη θήκη έκλουσης με τον προσαρμογέα, συμπεριλαμβανομένου του πλαισίου μεταφοράς στην υποδοχή 1. Σάρωση υλικού Πριν από την έναρξη εκτελέσεων, το όργανο ελέγχει εάν έχουν φορτωθεί επαρκείς ποσότητες αναλώσιμων στα αντίστοιχα συρτάρια, για την/τις παρτίδα/-ες που πρόκειται να εκτελεστούν. 32 Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/2010

33 Προετοιμασία του υλικού δείγματος Το QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit είναι κατάλληλο για χρήση με ανθρώπινα δείγματα πλάσματος και το QIAsymphony DNA Mini Kit είναι κατάλληλο για χρήση με ανθρώπινα δείγματα ολικού αίματος. Αποφύγετε τη δημιουργία αφρού μέσα ή επάνω στα δείγματα. Τα δείγματα θα πρέπει να αποκτούν θερμοκρασία περιβάλλοντος (15 25 C) πριν από την έναρξη της εκτέλεσης. Προετοιμασία μειγμάτων φορέα RNA (CARRIER) ρυθμιστικού διαλύματος AVE (AVE) για δείγματα πλάσματος Ο φορέας RNA (CARRIER) πρέπει να χρησιμοποιείται όταν γίνεται χρήση του. QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit. Για την προετοιμασία του πρωτογενούς διαλύματος φορέα RNA (CARRIER), προσθέστε 1350 µl ρυθμιστικού διαλύματος AVE (AVE) (διατίθεται σε φιαλίδια των 2 ml) στο σωληνάριο που περιέχει 1350 µg λυοφιλοποιημένου φορέα RNA (CARRIER), ώστε να λάβετε διάλυμα συγκέντρωσης 1 µg/µl. Αραιώστε σχολαστικά το φορέα RNA (CARRIER), διαμοιράστε σε κλάσματα κατάλληλου όγκου, και φυλάξτε τα στους 2 8 C για έως και 2 εβδομάδες. Υπολογισμός του όγκου μείγματος φορέα RNA (CARRIER) ανά σωληνάριο Ο ελάχιστος όγκος μείγματος φορέα RNA (CARRIER) ρυθμιστικού διαλύματος AVE (AVE) πρέπει να περιλαμβάνει επαρκή πρόσθετο όγκο για το συνυπολογισμό απώλειας υγρού λόγω των διανομών με πιπέτα και της εξάτμισης. Για τους όγκους που πρέπει να χρησιμοποιούνται για ανάλυση με το artus CMV QS-RGQ Kit, βλέπε Πίνακα 4. Τα σωληνάρια που περιέχουν μείγματα φορέα RNA (CARRIER) ρυθμιστικού διαλύματος AVE (AVE) και εσωτερικού μάρτυρα τοποθετούνται σε φορέα σωληναρίων. Ο φορέας σωληναρίων που περιέχει το μείγμα/-τα φορέα RNA (CARRIER) ρυθμιστικού διαλύματος AVE (AVE) πρέπει να τοποθετείται στην υποδοχή A του συρταριού δειγμάτων. Ανά παρτίδα μπορούν να χρησιμοποιηθούν έως και 8 σωληνάρια του μείγματος. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν μέχρι και 24 σωληνάρια ανά εκτέλεση 4 παρτίδων. Χρήση εσωτερικού μάρτυρα Ένας εσωτερικός μάρτυρας (CMV IC) παρέχεται με το artus CMV QS-RGQ Kit. Με τη βοήθειά του, ο χρήστης παρακολουθεί τη διαδικασία απομόνωσης DNA και ελέγχει τυχόν αναστολή της PCR. Εάν ο CMV και ο EBV αναλύονται στην ίδια εκτέλεση PCR στο Rotor-Gene Q (βλέπε Εκτελέσεις πολλαπλής ανάλυσης, σελίδα 36), Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/

34 χρησιμοποιήστε τον CMV IC για όλα τα δείγματα και όχι τον EBV RG IC που περιλαμβάνεται στο artus EBV QS-RGQ Kit. Ο ίδιος CMV IC θα πρέπει να χρησιμοποιείται για την προετοιμασία ανάλυσης των μαρτύρων της PCR (βήμα 13 στο πρωτόκολλο της προετοιμασίας ανάλυσης, σελίδα 51). Η χρήση του QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit ή του QIAsymphony DNA Mini Kit σε συνδυασμό με το artus CMV QS-RGQ Kit απαιτεί την εισαγωγή του εσωτερικού μάρτυρα (CMV IC) στη διαδικασία καθαρισμού για την παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της προετοιμασίας των δειγμάτων και της μεθόδου καθοδικής ροής. Για δείγματα πλάσματος, οι εσωτερικοί μάρτυρες πρέπει να προστίθενται στο μείγμα φορέα RNA (CARRIER) ρυθμιστικού διαλύματος AVE (AVE) και ο συνολικός όγκος του μείγματος εσωτερικού μάρτυρα φορέα RNA (CARRIER) ρυθμιστικού διαλύματος AVE (AVE) παραμένει 120 µl. Για δείγματα ολικού αίματος, οι εσωτερικοί μάρτυρες πρέπει να διαλύονται σε ρυθμιστικό διάλυμα ΑΤΕ. Ανά δείγμα προστίθεται ο συνολικός όγκος 60 µl μείγματος εσωτερικού μάρτυρα ρυθμιστικού διαλύματος ΑΤΕ. Για τη συγκεκριμένη εφαρμογή, προσθέστε τον εσωτερικό μάρτυρα στην απομόνωση όπως περιγράφεται στον Πίνακα 4. Αυτό συνεπάγεται την προσθήκη του εσωτερικού μάρτυρα στην απομόνωση σε αναλογία 0,1 μl ανά 1 μl όγκου έκλουσης. Συνιστούμε την προετοιμασία φρέσκων δειγμάτων για κάθε εκτέλεση πριν από τη χρήση. 34 Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/2010

35 Πίνακας 4. Προετοιμασία εσωτερικού μάρτυρα φορέα RNA (CARRIER) Δείγματα πλάσματος Δείγματα ολικού αίματος Συστατικό Όγκος (µl) Όγκος (µl) Βασικό διάλυμα φορέα 5 0 RNA (CARRIER) Εσωτερικός μάρτυρας* 9 9 Ρυθμιστικό διάλυμα AVE Ρυθμιστικό διάλυμα ΑΤΕ 0 51 Τελικός όγκος ανά δείγμα (εξαιρουμένου του νεκρού όγκου) Τελικός όγκος για n δείγματα (n x 120) (n x 60) * Ο υπολογισμός της ποσότητας του εσωτερικού μάρτυρα βασίζεται στους αρχικούς όγκους έκλουσης (90 µl). Ο πρόσθετος κενός όγκος εξαρτάται από τον τύπο του χρησιμοποιούμενου σωληναρίου δείγματος. Μη γεμίζετε περισσότερo από 1,92 ml (ανταποκρινόμενα κατά το μέγιστο σε 13 ή 26 δείγματα: ο όγκος αυτός είναι ειδικά για μικροσωληνάρια 2,0 ml τύπου H και μικροσωληνάρια 2.0 ml τύπου I, Sarstedt αρ. κατ και ). Απαιτείται μείγμα εσωτερικού μάτυρα ανταποκρινόμενο σε 3 πρόσθετα δείγματα (δηλαδή, 360 µl: ο όγκος αυτός είναι ειδικά για μικροσωληνάρια 2,0 ml τύπου H και μικροσωληνάρια 2.0 ml τύπου I, Sarstedt αρ. κατ και ). Απαιτείται μείγμα εσωτερικού μάτυρα ανταποκρινόμενο σε 4 πρόσθετα δείγματα (δηλαδή, 240 µl: ο όγκος αυτός είναι ειδικά για μικροσωληνάρια 2,0 ml τύπου H και για μικροσωληνάρια 2.0 ml τύπου I, Sarstedt αρ. κατ και ). Σετ μαρτύρων ανάλυσης και σετ παραμέτρων ανάλυσης Τα σετ μαρτύρων ανάλυσης αποτελούν συνδυασμό ενός πρωτοκόλλου και πρόσθετων παραμέτρων, όπως π.χ. εσωτερικού μάρτυρα, για τον καθαρισμό δειγμάτων στο QIAsymphony SP. Για κάθε πρωτόκολλο έχει προ-εγκατασταθεί ένα προκαθορισμένο σετ μαρτύρων ανάλυσης. Εάν ο CMV και ο EBV αναλύονται στην ίδια εκτέλεση PCR στο Rotor-Gene Q (βλέπε Εκτελέσεις πολλαπλής ανάλυσης, παρακάτω), χρησιμοποιήστε για τον καθαρισμό του δείγματος το κατάλληλο CMV σετ μαρτύρων ανάλυσης. Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/

36 Τα σετ παραμέτρων ανάλυσης αποτελούν συνδυασμό ενός ορισμού ανάλυσης με πρόσθετες καθορισμένες παραμέτρους, όπως είναι ο αριθμός θυγατρικών κλώνων και ο αριθμός προτύπων ανάλυσης, για την προετοιμασία της ανάλυσης στο QIAsymphony AS. Εκτελέσεις πολλαπλής ανάλυσης Σε μερικές περιπτώσεις, είναι δυνατή η ανάλυση ενός μόνο δείγματος για περισσότερα από ένα παθογόνα στην ίδια PCR εντός της ροής εργασίας του QIAsymphony RGQ. Αυτό αναφέρεται ως εκτέλεση πολλαπλής ανάλυσης. Για μια εκτέλεση πολλαπλής ανάλυσης πρέπει να εκπληρωθούν αρκετές προϋποθέσεις. Το artus CMV QS-RGQ Kit μπορεί να χρησιμοποιηθεί μαζί με το artus EBV QS-RGQ Kit (αρ. κατ ) σε μια εκτέλεση πολλαπλής ανάλυσης, εάν εκπληρωθούν οι ακόλουθες προϋποθέσεις. Προετοιμασία δείγματος στο QIAsymphony SP Για τον καθαρισμό των δειγμάτων που ελέγχονται για τον CMV και EBV χρησιμοποιώντας το ίδιο έκλουσμα, χρησιμοποιήστε τον CMV IC για όλα τα δείγματα και όχι τον EBV RG IC που συμπεριλαμβάνεται στο artus EBV QS- RGQ Kit. Για τον καθαρισμό του δείγματος, χρησιμοποιήστε το κατάλληλο σετ μαρτύρων ανάλυσης CMV. Προετοιμασία ανάλυσης στο QIAsymphony AS Για κατάλληλη ποσοτικοποίηση καθώς και για βάσιμη πληροφορία που δίνεται από τον εσωτερικό μάρτυρα, για την προετοιμασία και των δύο αναλύσεων πρέπει ο εσωτερικός μάρτυρας να αντιστοιχεί με τον ένα που χρησιμοποιείται για την προετοιμασία του δείγματος (CMV IC). Χρησιμοποιήστε τον CMV IC από τον ίδιο αριθμό παρτίδας για και για τις δύο προετοιμασίες δείγματος και για την προετοιμασία ανάλυσης των μαρτύρων της PCR (βήμα 13 στο πρωτόκολλο προετοιμασίας ανάλυσης, σελίδα 51). Μη χρησιμοποιείτε έναν CMV IC με διαφορετικό αριθμό παρίδας. PCR στο Rotor-Gene Q Λόγω των διαφορών στις εντάσεις φθορισμού, όταν χρησιμοποιούνται 2 διαφορετικές αναλύσεις σε μια εκτέλεση πολλαπλής ανάλυσης, είναι απαραίτητο η εκτέλεση βαθμονόμισης κέρδους ξεχωριστά για κάθε σύστημα ανίχνευσης artus, πριν αρχίσετε την εκτέλεση PCR (βήματα 9 15 στο πρωτόκολλο PCR, σελίδες 62 65). 36 Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/2010

37 Αποδόσεις νουκλεϊκών οξέων Τα εκλούσματα που προετοιμάστηκαν με φορέα RNA (CARRIER) μπορεί να περιέχουν πολύ μεγαλύτερη ποσότητα φορέα RNA (CARRIER) απ ότι τα νουκλεϊκά οξέα-στόχοι. Συνιστούμε τη χρήση μεθόδων ποσοτικής ενίσχυσης για τον καθορισμό των αποδόσεων. Φύλαξη νουκλεϊκών οξέων Για βραχυπρόθεσμη φύλαξη έως και 24 ώρες, συνιστούμε τη φύλαξη κεκαθαρμένων νουκλεϊκών οξέων στους 2 8ºC. Για μακροπρόθεσμη φύλαξη πέραν των 24 ωρών, συνιστούμε τη φύλαξη στους 20ºC. Ρύθμιση του κατωφλίου για την ανάλυση PCR Οι καλύτερες δυνατές ρυθμίσεις του κατωφλίου για ένα δεδομένο συνδυασμό του οργάνου Rotor-Gene Q και του artus QS-RGQ Kit μπορεί να ορισθεί εμπειρικά με την εξέταση κάθε μεμονομένου συνδυασμού, δεδομένου ότι είναι μια σχετική τιμή που εξαρτάται από την ολική διαγνωστική ροή εργασίας. Ως σημείο εκκίνησης, για την ανάλυση της πρώτης εκτέλεσης PCR, το κατώφλι μπορεί να ορισθεί σε μια προκαταρκτική τιμή 0,04 αλλά η τιμή αυτή θα πρέπει να τελειοποιηθεί σε μια συγκριτική ανάλυση των επομένων εκτελέσεων της ροής εργασίας. Το κατώφλι πρέπει να ρυθμιστεί χειρoκίνητα ακριβώς παραπάνω από σήμα υπόβαθρου των αρνητικών μαρτύρων και των αρνητικών δειγμάτων. Η μέση τιμή του κατωφλίου που υπολογίζεται από τα πειράματα αυτά είναι συνήθως η πιθανή εργασία για την πλειοψηφία των μελοντικών εκτελέσεων αλλά ο χειριστής θα πρέπει ωστόσο να αναθεωρεί την παραγώμενη τιμή κατωφλίου σε τακτά χρονικά διαστήματα. Η τιμή κατωφλίου είναι συνήθως του εύρους 0,03 0,05 και πρέπει να στρογγυλοποιείται όχι περισσότερο από τρία δεκαδικά ψηφία. Ποσοτικοποίηση Τα πρότυπα ποσοτικοποίησης (CMV QS 1 4) στο artus CMV QS-RGQ Kit αντιμετωπίζονται ως προηγουμένως καθαρισμένα δείγματα και χρησιμοποιείται ο ίδιος όγκος (20 µl). Για να δημιουργήσετε μία πρότυπη καμπύλη σε όργανα Rotor-Gene Q θα πρέπει να χρησιμοποιήσετε και τα 4 πρότυπα ποσοτικοποίησης και να τα ορίσετε στο πλαίσιο διαλόγου Edit Samples (Επεξεργασία δειγμάτων) στο όργανο Rotor-Gene Q ως πρότυπα με τις συγκεκριμένες συγκεντρώσεις (βλέπε εγχειρίδιο χρήσης του οργάνου). Τα πρότυπα ποσοτικοποίησης ορίζονται ως αντίγραφα/µl. Η παρακάτω εξίσωση πρέπει να χρησιμοποιηθεί για τη μετατροπή των τιμών που προσδιορίζονται με χρήση της πρότυπης καμπύλης σε αντίγραφα/ml του υλικού δείγματος: Εγχειρίδιο artus CMV QS-RGQ Kit 12/