Υπό: Παύλου Κορδοπάτη & Βασιλικής Μαγκαφά ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ ΚΑΙ ΧΗΜΕΙΑΣ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ ΚΑΙ ΧΗΜΕΙΑΣ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ (Ο ΗΓΟΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΩΝ ΑΣΚΗΣΕΩΝ) Υπό: Παύλου Κορδοπάτη & Βασιλικής Μαγκαφά ΠΑΤΡΑ 2005

2 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Το παρόν τεύχος αποτελεί έναν πρόδρομο οδηγό ορθής διεξαγωγής των Εργαστηριακών Ασκήσεων οι οποίες αποτελούν και το ουσιαστικό περιεχόμενο του μαθήματος "Μεθοδολογία Απομόνωσης και Ταυτοποίησης Φυσικών Προϊόντων ΙI". Οι Εργαστηριακές Ασκήσεις στο ευρύτερο πεδίο των Φυσικών Προϊόντων αποτελούν βασική εκπαίδευση των φοιτητών του Τμήματος Φαρμακευτικής και όχι μόνον. Το είδος και ο αριθμός των επελέγησαν με γνώμονα την ανάγκη ισορρόπησης μεταξύ της σημασίας των βασικών πειραμάτων απομόνωσης και ταυτοποίησης φυσικών προϊόντων αφενός και των χρονικών περιορισμών τους οποίους θέτει το Πρόγραμμα Σπουδών αφετέρου. Η Φύση αποτελεί πλούσια πηγή φυσικών προϊόντων με ποικίλη βιολογική δράση. Ως εκ τούτου η απομόνωση χρωστικών, αρωμάτων, ευφραντικών ουσιών και ουσιών φαρμακευτικής σημασίας από εύκολα διαθέσιμες πηγές, όπως και κυρίως τα φυτά, είναι δραστηριότητες τόσο παλαιές όσο το ανθρώπινο είδος και κατά συνέπεια απλές αλλά και σημαντικές. Ιδιαίτερος στόχος του συγκεκριμένου εργαστηριακού μαθήματος είναι η μύηση των φοιτητών σε ασφαλή και υπεύθυνο τρόπο εργασίας, γεγονός το οποίο αποτελεί απαραίτητη προϋπόθεση για τη συνεργασία μεταξύ των μελών μιας επιστημονικής ομάδος. Προς την κατεύθυνση αυτή συμβάλλει η βαθιά γνώση της Χημείας στην οποία στηρίζονται οι Εργαστηριακές Ασκήσεις, του ορθού τρόπου διεξαγωγής αυτών, της επικινδυνότητας των χρησιμοποιουμένων αντιδραστηρίων και του τρόπου εξουδετέρωσης και ασφαλούς αποθήκευσής τους. Από τη θέση αυτή εκφράζονται θερμές ευχαριστίες προς τους υποψηφίους ιδάκτορες κ. Ευάγγελο Μπισύρη και κ. Σπυρίδωνα Παπαζαχαρία για την πολύτιμη βοήθειά τους στη διαμόρφωση του τελικού κειμένου, το οποίον και τίθεται στην κρίση των φοιτητών μας. Οι παρατηρήσεις των τελευταίων θα μας είναι ιδιαίτερα χρήσιμες. Πάτρα, Φεβρουάριος 2005 Παύλος Κορδοπάτης Βασιλική Μαγκαφά

3 ΑΠΟΣΠΑΣΜΑ ΠΡΟΕΔΡΙΚΟΥ ΔΙΑΤΑΓΜΑΤΟΣ ΥΠ' ΑΡΙΘ. 51/Φ.Ε.Κ. 38/ ΔΙΕΞΑΓΩΓΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΩΝ ΑΣΚΗΣΕΩΝ ΣΤΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ ΚΑΙ ΧΗΜΕΙΑΣ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ Α. Γενικά 1. Οι Εργαστηριακές ασκήσεις γίνονται με σκοπό να εξοικειωθούν οι εκπαιδευόμενοι με εργαστηριακές τεχνικές και μεθοδολογία. Επιδιώκεται η κατανόηση του τρόπου με τον οποίο: α) τεκμηριώνεται βιβλιογραφικά κάθε πείραμα που προγραμματίζεται β) καταστρώνεται η εκτέλεσή του γ) χρησιμοποιούνται οι απαραίτητες συσκευές και όργανα δ) επεξεργάζονται, παρασκευάζονται ή και απομονώνονται τα τελικά προϊόντα ε) εκτιμάται ποσοτικά ένα φυσικό μέγεθος και στ) ελέγχονται τα αποτελέσματα. 2. Οι ημέρες και οι ώρες των ασκήσεων των φοιτητών καθορίζονται σύμφωνα με το πρόγραμμα σπουδών. Η ώρα προσέλευσης και αποχώρησης των φοιτητών πρέπει να τηρείται επακριβώς. Ανώτατο όριο καθυστέρησης 10 λεπτά κατά την προσέλευση. Η αποχώρηση γίνεται με τη λήξη του εργαστηριακού χρόνου ή άλλως μετά την ολοκλήρωση της άσκησης. 3. Δεν επιτρέπεται η απομάκρυνση των φοιτητών από το Εργαστήριο την ώρα της άσκησης εκτός αν δοθεί άδεια από τον υπεύθυνο του Εργαστηρίου.

4 4. Η ομαλή λειτουργία του Εργαστηρίου δεν πρέπει να διακόπτεται καθ όλη τη διάρκεια του ακαδημαϊκού έτους. Προς το σκοπό αυτό: α) Τα μέλη ΔΕΠ αποφεύγουν να απασχολούν τους φοιτητές για εξετάσεις προόδου κ.α., κατά τις ώρες των εργαστηριακών ασκήσεων β) Οι φοιτητές αποφεύγουν να κάνουν συνελεύσεις ή να απασχολούν γενικά τους ασκούμενους κατά τη διάρκεια της άσκησής τους στο Εργαστήριο. Σε ειδικές περιπτώσεις οι εκπρόσωποι των φοιτητών έρχονται σε συνεννόηση με τον υπεύθυνο του Εργαστηρίου δύο τουλάχιστον ημέρες πριν. Β. Μελέτη, Εξέταση και Διεξαγωγή Ασκήσεων 1. Απαραίτητη προϋπόθεση για την εκδήλωση του αποτελέσματος τμηματικών ή πτυχιακών εξετάσεων είναι η επιτυχής ολοκλήρωση όλων των εργαστηριακών ασκήσεων που προβλέπονται από το πρόγραμμα σπουδών. 2. Ο αριθμός των επιτρεπομένων απουσιών δεν μπορεί σε καμιά περίπτωση να υπερβαίνει το 10% του αριθμού των εργαστηριακών ασκήσεων. Φοιτητής του οποίου οι απουσίες ξεπερνούν το ποσοστό αυτό υποχρεώνεται να επανασκηθεί την επόμενη χρονιά σε χρόνο που καθορίζεται από το Εργαστήριο, ανάλογα με την ευχέρεια άσκησης φοιτητών που έχει. 3. Ο ασκούμενος φοιτητής οφείλει να γνωρίζει το θεωρητικό μέρος της άσκησης προετοιμαζόμενος κατάλληλα, εφόσον έχει ενημερωθεί από το προσωπικό του Εργαστηρίου. Ο τρόπος εκτίμησης της θεωρητικής και πρακτικής απόδοσης κάθε φοιτητή καθώς και η βαθμολογία του καθορίζονται από το Εργαστήριο. Γ. Παραλαβή Υλικού, Αντιδραστηρίων και Οργάνων 1. Τα όργανα, τα σκεύη και τα αντιδραστήρια για τις ασκήσεις διατίθενται από το Εργαστήριο. 2. Οι ασκούμενοι φοιτητές υποχρεώνονται μετά το πέρας των εργαστηριακών ασκήσεων να παραδώσουν το εργαστηριακό υλικό στην κατάσταση που το παρέλαβαν.

5 3. Τα όργανα δεν χρησιμοποιούνται από τους φοιτητές πριν δοθούν οδηγίες από τα μέλη ΔΕΠ και ΕΔΤΠ, είναι ιδιαίτερα προσεκτικοί κατά τη χρήση τους και αναφέρουν κάθε τυχόν βλάβη στους υπευθύνους. Μετά το πέρας της άσκησης τα όργανα καθαρίζονται και τακτοποιούνται σύμφωνα με τις οδηγίες του προσωπικού του Εργαστηρίου. 4. Σε περίπτωση απώλειας εργαστηριακού υλικού ή θραύσεως υάλινου σκεύους εξ υπαιτιότητας των, οφείλουν να το αντικαταστήσουν. Δ. Τάξη και Καθαριότητα Για την ομαλή και απρόσκοπτη λειτουργία του Εργαστηρίου πρέπει να τηρούνται οι παρακάτω όροι: 1. Δεν επιτρέπεται η παρουσία ξένων προσώπων στο Εργαστήριο κατά τη διάρκεια των ασκήσεων. 2. Οι φοιτητές προσέρχονται φορώντας άσπρη εργαστηριακή μπλούζα. 3. Δεν επιτρέπεται το κάπνισμα από οποιονδήποτε ευρισκόμενο στον Εργαστηριακό χώρο. 4. Δεν επιτρέπεται η λήψη τροφών και ποτών ως και η διατήρησή τους στον Εργαστηριακό χώρο. 5. Κάθε φοιτητής οφείλει να διατηρεί την εργαστηριακή θέση του απολύτως εν τάξει και καθαρή. 6. Οι φοιτητές οφείλουν να ακολουθούν τις οδηγίες του προσωπικού προς τους διαφόρους χειρισμούς. 7. Οι φοιτητές δεν επιτρέπεται να εκτελούν πειράματα ή μετρήσεις που δεν περιλαμβάνονται στο πρόγραμμα ή δεν έχουν υποδειχθεί από τους υπευθύνους του Εργαστηρίου. 8. Η απόρριψη των αχρήστων ουσιών (στερεών ή υγρών), γίνεται σύμφωνα με τις οδηγίες των υπευθύνων.

6 Ε. Ασφάλεια Φοιτητών Η ασφάλεια των ασκουμένων αποτελεί πρώτιστο μέλημα των υπευθύνων του Εργαστηρίου με την προϋπόθεση ότι οι ασκούμενοι φοιτητές έχουν πλήρη γνώση της άσκησης πριν την έναρξη του Εργαστηρίου και τηρούν τους βασικούς κανόνες ασφαλείας όπως συνοψίζονται κατωτέρω: α) Εργασία με Τοξικές Ουσίες: Όλες οι χημικές ουσίες που χρησιμοποιούνται για την άσκηση των φοιτητών πρέπει να θεωρούνται επικίνδυνες για την υγεία και να μεταχειρίζονται ανάλογα. Κατά τη χρήση τους πρέπει να αποφεύγεται η επαφή με το δέρμα ή το αναπνευστικό σύστημα. Κανόνες Προφύλαξης από Τοξικές Ουσίες i. Εργασίες με πτητικές τοξικές ουσίες γίνονται υποχρεωτικά σε απαγωγούς οι οποίοι λειτουργούν κανονικά. ii. Ελέγχονται πάντα και με ιδιαίτερη προσοχή οι στρόφιγγες αερίων. Οι αντίστοιχοι σωλήνες παροχής αερίου πρέπει να είναι σε πολύ καλή κατάσταση. iii. Δεν χρησιμοποιούνται σιφώνια με το στόμα για την αναρρόφηση τοξικών διαλυμάτων ή ουσιών. Τα κατάλληλα όργανα παρέχονται από το Εργαστήριο. iv. Συνιστάται στους φοιτητές να έχουν στη θέση τους μια καθαρή πετσέτα, χαρτοπετσέτες και σαπούνι. v. Οι ασκούμενοι φοιτητές (αυτονόητα και το υπεύθυνο προσωπικό του Εργαστηρίου) πρέπει να γνωρίζουν αν οι χημικές ουσίες που χρησιμοποιούνται είναι τοξικές και σε ποιο βαθμό. vi. Η βοήθεια σε περίπτωση ατυχήματος πρέπει να είναι άμεση. vii. Κατά την εργασία με ιδιαίτερα τοξικές ουσίες χρησιμοποιούνται προστατευτικά γάντια και γυαλιά τα οποία διατίθενται από το Εργαστήριο.

7 β) Εργασία με Εύφλεκτες Ουσίες: i. Δεν πρέπει να υπάρχουν λύχνοι αναμμένοι χωρίς λόγο. ii. Δεν επιτρέπεται να υπάρχουν στους χώρους των Εργαστηρίων μεγάλες ποσότητες διαλυτών. iii. Τηρούνται σχολαστικά οδηγίες που δίνονται για τον τρόπο θέρμανσης και χειρισμού εύφλεκτων ουσιών (υδρόλουτρα, μανδύες, κ.λ.π.). iv. Ο μεγαλύτερος κίνδυνος από ατυχήματα με εύφλεκτες ουσίες οφείλεται στην έλλειψη της απαραίτητης προσοχής και τάξης, τόσο στην εργαστηριακή θέση όσο και κατά τη διάρκεια των ασκήσεων. Εύφλεκτες ουσίες δεν επιτρέπεται να μένουν πάνω στον πάγκο, όταν οι ασκούμενοι φοιτητές εργάζονται και προπαντός όταν υπάρχουν λύχνοι αναμμένοι. v. Στις αίθουσες ασκήσεων πρέπει να υπάρχουν πυροσβεστικά σημεία με πυροσβεστήρες. γ) Υποχρεώσεις Προσωπικού i. Οι υπεύθυνοι των ασκήσεων υποχρεώνονται να προσέρχονται τουλάχιστον 10 λεπτά πριν από την έναρξη των ασκήσεων και μαζί με το ΕΔΤΠ θα πρέπει να έχουν φροντίσει για την προπαρασκευή των αντιδραστηρίων και οργάνων, ώστε απρόσκοπτα να αρχίζει η άσκηση των φοιτητών σε καθορισμένη ώρα. ii. Σε όλη τη διάρκεια των ασκήσεων οι υπεύθυνοι των ασκήσεων οφείλουν να παρευρίσκονται στο Εργαστήριο. Οι φοιτητές σε καμιά περίπτωση δεν μένουν μόνοι τους ασκούμενοι.

8 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΑΠΟΣΠΑΣΜΑ ΠΡΟΕΔΡΙΚΟΥ ΔΙΑΤΑΓΜΑΤΟΣ (Εργαστηριακές Ασκήσεις) ΕΝΟΤΗΤΑ Α ΑΡΧΕΣ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΑΣΚΗΣΗ 1. ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ (HPLC) ΕΝΟΤΗΤΑ Β ΣΥΝΘΕΣΗ ΕΣΤΕΡΩΝ ΑΣΚΗΣΗ 1. ΣΥΝΘΕΣΗ ΟΞΙΚΟΥ ΙΣΟΠΕΝΤΥΛΕΣΤΕΡΑ ΑΣΚΗΣΗ 2α. ΣΥΝΘΕΣΗ ΣΑΛΙΚΥΛΙΚΟΥ ΜΕΘΥΛΕΣΤΕΡΑ ΑΣΚΗΣΗ 2β. ΥΔΡΟΛΥΣΗ ΣΑΛΙΚΥΛΙΚΟΥ ΜΕΘΥΛΕΣΤΕΡΑ ΕΝΟΤΗΤΑ Γ ΣΤΕΡΟΕΙΔΗ ΑΣΚΗΣΗ 1. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΧΟΛΗΣΤΕΡΟΛΗΣ ΑΠΟ ΠΕΤΡΕΣ ΧΟΛΗΣ ΑΣΚΗΣΗ 2a. ΣΥΝΘΕΤΙΚΗ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 5α, 6β-ΔΙΒΡΩΜΟΧΟΛΗΣΤΕΡΟΛΗΣ ΑΣΚΗΣΗ 2β. ΣΥΝΘΕΤΙΚΗ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΧΟΛΗΣΤΕΡΟΛΗΣ ΑΠΟ 5α, 6β- ΔΙΒΡΩΜΟΧΟΛΗΣΤΕΡΟΛΗ ΕΝΟΤΗΤΑ Δ ΤΕΡΠΕΝΙΑ ΑΣΚΗΣΗ 1. ΑΝΑΓΩΓΗ ΜΟΝΟΤΕΡΠΕΝΙΩΝ & ΑΡΩΜΑΤΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΜΕ ΑΛΔΕΫΔΟΜΑΔΑ ΑΣΚΗΣΗ 2. ΟΞΕΙΔΩΣΗ ΜΟΝΟΤΕΡΠΕΝΙΩΝ ΜΕ ΔΕΥΤΕΡΟΤΑΓΗ ΥΔΡΟΞΥΛΟΜΑΔΑ ΕΝΟΤΗΤΑ Ε ΑΛΚΑΛΟΕΙΔΗ ΑΣΚΗΣΗ 1. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΝΙΚΟΤΙΝΗΣ ΑΠΟ ΚΑΠΝΟ ΑΣΚΗΣΗ 2α. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΠΙΠΕΡΙΝΗΣ ΑΠΟ ΜΑΥΡΟ ΠΙΠΕΡΙ ΑΣΚΗΣΗ 2β. ΥΔΡΟΛΥΣΗ ΠΙΠΕΡΙΝΗΣ ΑΣΚΗΣΗ 3. ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΛΕΠΤΗΣ ΣΤΟΙΒΑΔΑΣ ΑΛΚΑΛΟΕΙΔΩΝ ΕΝΟΤΗΤΑ ΣΤ ΠΕΠΤΙΔΙΚΗ ΣΥΝΘΕΣΗ ΑΣΚΗΣΗ 1. ΣΥΝΘΕΤΙΚΗ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ Ν α -ΠΡΟΣΤΑΤΕΥΜΕΝΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΑΣΚΗΣΗ 2. ΣΥΝΘΕΤΙΚΗ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΚΑΡΒΟΞΥ-ΠΡΟΣΤΑΤΕΥΜΕΝΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΑΣΚΗΣΗ 3. Σ ΥΝΘΕΤΙΚΗ ΠΑΡΑΚΕΥΗ ΔΙΠΕΠΤΙΔΙΟΥ ΑΣΚΗΣΗ 3α. Σ ΥΝΘΕΤΙΚΗ ΠΑΡΑΚΕΥΗ ΔΙΠΕΠΤΙΔΙΟΥ ΣΕ ΥΓΡΗ ΦΑΣΗ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ ΤΩΝ ΦΩΣΦΟΝΙΚΩΝ ΚΑΙ ΟΥΡΟΝΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΑΣΚΗΣΗ 3β. ΣΥΝΘΕΣΗ ΔΙΠΕΠΤΙΔΙΟΥ ΣΕ ΣΤΕΡΕΗ ΦΑΣΗ ΕΝΟΤΗΤΑ Ζ ΕΝΖΥΜΑ ΑΣΚΗΣΗ 1. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΕΜΟΥΛΣΙΝΗΣ ΑΠΟ ΓΛΥΚΑ ΑΜΥΓΔΑΛΑ i iii

9 ΕΝΟΤΗΤΑ Η ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΥΣ ΑΣΚΗΣΗ 1. ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ ΥΠΕΡΥΘΡΟΥ ΑΣΚΗΣΗ 2. ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ ΠΥΡΗΝΙΚΟΥ ΜΑΓΝΗΤΙΚΟΥ ΣΥΝΤΟΝΙΣΜΟΥ (ΝΜR) ΠΡΟΣΑΡΤΗΜΑ

10 ΕΝΟΤΗΤΑ Α ΑΡΧΕΣ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ Ο καθορισμός της δομής και η μελέτη των ιδιοτήτων μιας ουσίας προϋποθέτουν την απομόνωσή της σε καθαρή κατάσταση. Για τον καθαρισμό των οργανικών ενώσεων υπάρχουν διάφορες μέθοδοι, όπως η ανακρυστάλλωση, η απόσταξη, η εξάχνωση κ.α. Για το διαχωρισμό όμως ουσιών με παραπλήσια δομή χρησιμοποιείται κυρίως η μέθοδος της χρωματογραφίας η οποία είναι όχι μόνο αποτελεσματική αλλά και εύκολη και γρήγορη. Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στη διαφορετική κατανομή των συστατικών ενός μίγματος μεταξύ δύο φάσεων, μιας ακίνητης (stationary phase) και μιας κινητής (mobile phase). Η κινητή φάση μετακινεί τα συστατικά του μίγματος επί της ακίνητης με διαφορετική ταχύτητα. Μια ουσία, η οποία συγκρατείται ισχυρότερα από την ακίνητη φάση, μετακινείται με μικρότερη ταχύτητα από κάποια άλλη, η οποία συγκρατείται λιγότερο ισχυρά. Επειδή τα μόρια του μίγματος κατανέμονται συγχρόνως και στις δύο φάσεις αποκαθίσταται μια δυναμική ισορροπία για κάθε κατηγορία μορίων. Η κατανομή των μορίων ενός δείγματος μεταξύ των δύο φάσεων εξαρτάται από μια σταθερά ισορροπίας, η οποία ονομάζεται συντελεστής κατανομής κ. Οι συγκεντρώσεις της ουσίας στις δύο φάσεις και ο συντελεστής κατανομής συνδέονται μεταξύ τους με τη σχέση κ=c A /C B, όπου C A η συγκέντρωση της ουσίας στην ακίνητη φάση και C B η συγκέντρωση της ουσίας στην κινητή φάση. Ανάλογα με τη φυσική κατάσταση της κινητής και της ακίνητης φάσης διακρίνονται τα παρακάτω είδη χρωματογραφίας:

11 1. Αέρια χρωματογραφία (GC, κινητή φάση αέριο), η οποία διακρίνεται σε δυο κατηγορίες: Χρωματογραφία αερίου-στερεού (GSC, ακίνητη φάση στερεό) Χρωματογραφία αερίου-υγρού (GLC, ακίνητη φάση υγρό, προσροφημένο επί κατάλληλου αδρανούς στερεού υλικού) 2. Υγρή χρωματογραφία (LC, κινητή φάση υγρό), η οποία διακρίνεται σε δύο κατηγορίες: Χρωματογραφία υγρού-στερεού (LSC, ακίνητη φάση στερεό) Χρωματογραφία υγρού-υγρού (LLC, ακίνητη φάση υγρό προσροφημένο επί κατάλληλου στερεού υλικού) Στην ενότητα αυτή θα αναπτυχθούν μόνο οι αρχές της υγρής χρωματογραφίας. Στην υγρή χρωματογραφία ανάλογα με το μηχανισμό κατανομής των ουσιών του μίγματος μεταξύ των φάσεων διακρίνονται τα εξής είδη: Χρωματογραφία προσρόφησης (adsorption chromatography) Στη μέθοδο αυτή ως ακίνητη φάση χρησιμοποιείται κατάλληλο στερεό υλικό με προσροφητικές ικανότητες, ενώ ως κινητή υγρό. Ο διαχωρισμός των συστατικών ενός μίγματος στηρίζεται στην εκλεκτική προσρόφηση των συστατικών του επί της ακίνητης φάσης. Όταν το υγρό κινείται επί της επιφανείας της ακίνητης φάσης, τότε για κάθε συστατικό του μίγματος αποκαθίσταται μια δυναμική ισορροπία προσρόφησης-εκρόφησης μορίων. Μόρια τα οποία προσροφώνται ισχυρότερα μετακινούνται με μικρότερη ταχύτητα επί της ακίνητης φάσης με αποτέλεσμα τον διαχωρισμό τους από κάποια άλλα τα οποία προσροφώνται λιγότερο ισχυρά. Τα πιο γνωστά προσροφητικά υλικά, με ισχυρή προσροφητική ικανότητα, είναι το τριοξείδιο του αργιλίου (Alumina) και το διοξείδιο του πυριτίου (Silica gel). Άλλα υλικά, με μικρότερη προσροφητική ισχύ, είναι το οξείδιο του μαγνησίου (Magnesia), το ανθρακικό ασβέστιο, η κυτταρίνη κ.ά. Τα ισχυρά προσροφητικά υλικά (π.χ. Alumina, Silica gel) συγκρατούν ισχυρότερα τα συστατικά ενός μίγματος (ισχυρότερα τα πολικά σε σχέση με τα μη πολικά) απ ότι τα λιγότερο ισχυρά προσροφητικά υλικά. Όσον αφορά την κινητή φάση υπάρχει δυνατότητα επιλογής μεταξύ αρκετών διαλυτών. Η ισχύς έκλουσης ενός διαλύτη εξαρτάται τόσο από την ακίνητη φάση όσο και από τη φύση των ουσιών οι οποίες εκλούονται. Ένας πολικός διαλύτης με μεγάλη ικανότητα μετακίνησης (π.χ. ακετονιτρίλιο, αιθανόλη, μεθανόλη) μετακινεί ταχύτερα τα

12 συστατικά του μίγματος απ ότι κάποιος άλλος με μικρότερη πολικότητα (π.χ. διχλωρομεθάνιο, οξικός αιθυλεστέρας, τολουόλιο, πετρελαϊκός αιθέρας, εξάνιο). Σε πολλές περιπτώσεις χρησιμοποιούνται μίγματα διαλυτών ή και σειρές από μίγματα με σειρά αυξανόμενης πολικότητας (βαθμίδωση ισχύος εκλούσεως). Χρωματογραφία κατανομής (partition chromatography) Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στη διαφορετική κατανομή των συστατικών ενός μίγματος μεταξύ δύο μη αναμειγνυόμενων υγρών, λόγω διαφορετικής διαλυτότητας. Το ένα υγρό αποτελεί την κινητή φάση, ενώ η ακίνητη φάση αποτελείται από ένα λεπτό στρώμα του άλλου υγρού το οποίο βρίσκεται στην επιφάνεια ενός αδρανούς στερεού υλικού όπως, γη διατόμων, διοξείδιο του πυριτίου, στερεά υλικά πολυσακχαριτικής φύσεως (Sephadex) κ.ά. Από τους διαλύτες οι οποίοι θα επιλεγούν ο περισσότερο πολικός (συνήθως νερό) προσροφάται αρχικά στην επιφάνεια του στερεού υλικού (κορεσμός) και εν συνεχεία προστίθεται η κινητή φάση. Χρωματογραφία ιονανταλλαγής (ion-exchange chromatography) Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό ιονισμένων ουσιών. Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στην εκλεκτική επιβράδυνση των ιονισμένων σωματιδίων του μίγματος λόγω ανταλλαγής τους με ιόντα της στατικής φάσης. Η κινητή φάση μπορεί να είναι νερό ή υδατικό διάλυμα οξέος, βάσεως και άλατος, ή κάποιο ρυθμιστικό διάλυμα. Η ακίνητη φάση είναι συνήθως πολυμερές το οποίο φέρει όξινους ή βασικούς υποκαταστάτες σε ορισμένες θέσεις του (ιονανταλλακτική ρητίνη). Η επιλογή της ιονανταλλακτικής ρητίνης καθώς και της κινητής φάσης εξαρτάται από τη φύση των προς διαχωρισμό ιονισμένων ουσιών. Η χρωματογραφία ιονανταλλαγής χρησιμοποιείται ευρέως για τον προσδιορισμό ιχνοποσοτήτων ανιόντων και κατιόντων σε μια ποικιλία δειγμάτων, όπως νερά, εκχυλίσματα εδαφών, τρόφιμα, βιομηχανικά και περιβαλλοντικά δείγματα, κ.ά. Χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού (molecular exclusion chromatography) ή χρωματογραφία διηθήσεως πηκτής (gel filtration chromatography) Σε αυτό το είδος της χρωματογραφίας ως ακίνητη φάση χρησιμοποιούνται πηκτές (γέλες, gels) από ορισμένα διασυνδεόμενα πολυμερή, τα οποία φέρουν διάφορες ομάδες (υδροξυλομάδες, αμιδικές ομάδες, ακετυλιωμένες υδροξυλομάδες κ.ά.). Τέτοια υλικά είναι τα πολυμερή της δεξτράνης (Sephadex G), της αγαρόζης (Sepharose B), του πολυακρυλαμιδίου (Bio-Gel P) κ.ά. Οι ομάδες αυτές έχουν τη

13 δυνατότητα προσρόφησης διαφόρων διαλυτών. Η προσρόφηση αυτή επιφέρει διόγκωση των κόκκων του gel, μέσω διάνοιξης της δομής των διασυνδεόμενων πολυμερών αλυσίδων, με αποτέλεσμα να δημιουργούνται στους κόκκους πόροι διαφόρων μεγεθών. Έτσι, αν χρησιμοποιηθεί ένα τέτοιο υλικό ως ακίνητη φάση και ως κινητή φάση κάποιος κατάλληλος διαλύτης ή μίγμα διαλυτών μπορεί να γίνει κλασμάτωση των ουσιών ενός μίγματος με βάση το μέγεθος των μορίων του. Τα μεγάλα μόρια που δεν χωρούν στους πόρους ελίσσονται μεταξύ των κόκκων και εκλούονται πρώτα, ενώ τα μικρότερα μόρια τα οποία εισχωρούν στους πόρους κινούνται με μικρότερες ταχύτητες. Η ικανότητα των πηκτών μοριακού αποκλεισμού να κατακρατούν ουσίες μικρού μοριακού βάρους αξιοποιείται για την απομάκρυνση μικρομοριακών αντιδραστηρίων και προϊόντων από μεγαλομόρια, μετά από κάποια χημική αντίδραση ή στάδιο καθαρισμού. Χρωματογραφία συγγενείας (affinity chromatography) Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην εξειδικευμένη αλληλεπίδραση μεταξύ μιας ουσίας, η οποία έχει ακινητοποιηθεί στη στερεή στατική φάση, και ενός μόνο συστατικού από ένα πολύπλοκο μίγμα. Έτσι, όταν το διάλυμα του μίγματος διαβιβασθεί σε ένα τέτοιο υλικό, θα κατακρατηθεί μόνο το ένα συστατικό, εξαιτίας της εξειδικευμένης αντιδράσεως του με τη στατική φάση, ενώ τα άλλα συστατικά θα εκλουσθούν. Εν συνεχεία, το συστατικό το οποίο έχει συγκρατηθεί εκλούεται με την προσθήκη ενός υγρού το οποίο αλλάζει τις συνθήκες έτσι ώστε να εξασθενήσει η σύνδεση του συνδεδεμένου συστατικού. Η τεχνική αυτή βρίσκει εφαρμογή κυρίως σε διαχωρισμούς ουσιών βιοχημικού ενδιαφέροντος. Η υγρή χρωματογραφία ανάλογα με την εφαρμοζόμενη πειραματική τεχνική διακρίνεται σε χρωματογραφία στήλης και επίπεδη χρωματογραφία (σε χαρτί ή λεπτή στοιβάδα). Κατά την τεχνική της επίπεδης χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδας (Thin Layer Chromatography, TLC) η ακίνητη φάση επιστρώνεται με κατάλληλο τρόπο επάνω σε γυαλί ή φύλλο πλαστικού ή αλουμινίου (φορέας επίστρωσης). Το πάχος επίστρωσης μπορεί να είναι από 0.15 mm μέχρι 2 mm. Ως υλικά επίστρωσης είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν διοξείδιο του πυριτίου (Silica gel), τριοξείδιο του αργιλίου (Alumina), κυτταρίνη σε μορφή σκόνης ή ακόμα και ρητίνες με όξινες ή βασικές ομάδες. Τα υλικά αυτά είναι συνήθως αναμεμιγμένα με μικρή ποσότητα γύψου (10-

14 15%) για καλύτερη προσκόλληση πάνω στο φορέα επίστρωσης. Όταν πρόκειται να διαχωριστούν σχετικώς μη πολικά μόρια όπως, υδρογονάνθρακες, αιθέρες, αλδεΰδες, κετόνες κ.ά. ως υλικό επίστρωσης προτιμάται η Alumina, ενώ για τον διαχωρισμό περισσότερο πολικών μορίων όπως, αλκοολών, καρβοξυλικών οξέων, αμινών, κ.ά., η Silica gel. Ως κινητή φάση (διαλύτης ανάπτυξης) χρησιμοποιούνται διάφοροι διαλύτες (διχλωρομεθάνιο, εξάνιο, τολουόλιο, οξικός αιθυλεστέρας, πετρελαϊκός αιθέρας, ακετόνη, μεθανόλη κ.ά.) ή και μίγματα διαλυτών. Όταν ο διαλύτης ανάπτυξης είναι οργανικός διαλύτης ή μίγμα οργανικών διαλυτών τότε ο διαχωρισμός των συστατικών του δείγματος γίνεται κυρίως βάσει του μηχανισμού προσρόφησης, ενώ στην περίπτωση όπου ο διαλύτης περιέχει και νερό τότε ταυτόχρονα με τα φαινόμενα προσρόφησης παρατηρούνται και φαινόμενα κατανομής σε μεγάλο βαθμό. Για την ανίχνευση των κηλίδων των δειγμάτων χρησιμοποιούνται: 1. Φυσικές μέθοδοι, όπως η υπεριώδη ακτινοβολία (χρησιμοποιούνται ειδικές πλάκες φθορίζουσες στο υπεριώδες φως οπότε στις θέσεις όπου υπάρχει ουσία η οποία απορροφά εμφανίζονται σκούρες κηλίδες) 2. Χημικές μέθοδοι, όπως ο ψεκασμός με ειδικά αντιδραστήρια, όταν οι ουσίες οι οποίες χρωματογραφούνται μπορούν να δώσουν έγχρωμα παράγωγα με τα αντιδραστήρια αυτά και η έκθεση σε χώρο ο οποίος περιέχει ατμούς ενός αερίου αντιδραστηρίου, π.χ. ΝΗ 3, I 2, Η 2 S. Μερικά παραδείγματα αντιδραστηρίων εμφάνισης κηλίδων δίνονται στον Πίνακα I Πίνακας Ι. Αντιδραστήρια ανίχνευσης διαφόρων ενώσεων Σύστημα ανίχνευσης Κατηγορία ενώσεων Παρατηρούμενο χρώμα Ατμοί αμμωνίας Φαινόλες Κηλίδες διαφόρων χρωμάτων Ατμοί HCl Αρωματικές αμίνες Κηλίδες διαφόρων χρωμάτων 0.5 % υδατικό διάλυμα PdCl 2 με λίγες σταγόνες π. HCl Ουσίες οι οποίες περιέχουν θείο και σελήνιο Κόκκινες και κίτρινες κηλίδες 0.5% 2,4-δινιτροφαινυλυδραζίνη σε 2Μ HCl Αλδεΰδες και κετόνες Κόκκινες και κίτρινες κηλίδες 0.3% νινυδρίνη σε βουτανόλη-1 με 3% οξικό οξύ και θέρμανση στους 125 C Αμινοξέα και αμίνες Μπλε, κόκκινες και κίτρινες κηλίδες 50% H 2 SO 4 και θέρμανση στους 150 C Γενική χρήση Μαύρες κηλίδες Διάλυμα ανισαλδεΰδης-θειϊκού οξέος και θέρμανση στους 110 C Γενική χρήση Μαύρες κηλίδες

15 Ο βαθμός συγκράτησης μιας ουσίας στην επίπεδη χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας εκφράζεται με τον παράγοντα επιβράδυνσης R f, ο οποίος ορίζεται ως ο λόγος της αποστάσεως που κινήθηκε η ουσία προς την απόσταση που κινήθηκε ο διαλύτης. Η απόσταση που κινήθηκε ο διαλύτης μετριέται από τη θέση του μετώπου, ενώ η απόσταση του δείγματος μετριέται από το κέντρο της κηλίδας ή από το σημείο που αντιστοιχεί στη μέγιστη πυκνότητά της. Η τιμή του R f επηρεάζεται από πολλούς παράγοντες, όπως π.χ. από τη σύσταση του διαλύτη αναπτύξεως, από τη φύση του υλικού επίστρωσης, κ.ά. Σε καθορισμένες όμως συνθήκες αποτελεί χαρακτηριστική σταθερά και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ταυτοποίηση μιας άγνωστης ουσίας, συγκρίνοντας την τιμή του R f αυτής με τις τιμές των R f γνωστών ουσιών στις ίδιες συνθήκες. Υπολογισμός της τιμής του R f Συμπερασματικά η χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας είναι γρήγορη και απλή μέθοδος και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως τεχνική καθοδήγησης για: τον έλεγχο της καθαρότητας μιας ενώσεως (εμφάνιση μιας ή περισσοτέρων κηλίδων σε διαφορετικά χρωματογραφήματα με διαφορετικούς διαλύτες ανάπτυξης) ή της πολυπλοκότητας ενός μίγματος τον έλεγχο της αποτελεσματικότητας των εφαρμοζομένων μεθόδων διαχωρισμού και καθαρισμού μιας ενώσεως

16 τον καθορισμό των ιδανικών συνθηκών για τον καλύτερο διαχωρισμό των συστατικών ενός μίγματος σε μεγάλη κλίμακα (π.χ. με υγρή χρωματογραφία στήλης) την ποιοτική μελέτη της πορείας μιας χημικής αντίδρασης και τον καθορισμό των βέλτιστων συνθηκών πραγματοποιήσεως αυτής για την ταυτοποίηση φαρμάκων, εκχυλισμάτων φυτών και βιοχημικών παρασκευασμάτων ή για την ανίχνευση νοθειών και μολύνσεων τροφίμων H παλαιότερη και πιο συνηθισμένη χρωματογραφική μέθοδο υγρής χρωματογραφίας, είναι η χρωματογραφία στήλης. Ανάλογα με τους χρωματογραφικούς μηχανισμούς διαχωρισμού, οι οποίοι λαμβάνουν χώρα, διακρίνονται τα παρακάτω είδη χρωματογραφίας στήλης: Χρωματογραφία προσροφήσεως (adsorption chromatography) Χρωματογραφία κατανομής (partition chromatography) Χρωματογραφία ιονανταλλαγής (ion-exchange chromatography) Χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού (molecular exclusion chromatography) Χρωματογραφία συγγένειας (affinity chromatography) Οι αρχές των μεθόδων αυτών έχουν αναφερθεί παραπάνω. Στην κλασσική υγρή χρωματογραφία η χρησιμοποιούμενη στήλη είναι υάλινος σωλήνας, ο οποίος φέρει πορώδες διάφραγμα στην μια του άκρη. Ως εναλλακτική λύση χρησιμοποιείται προχοΐδα και αντί για πορώδες διάφραγμα τοποθετείται υαλοβάμβακας ο οποίος συγκρατεί στοιβάδα άμμου 3 mm. Χρωματογραφική στήλη

17 Η ροή της κινητής φάσεως μέσα από τη στήλη πετυχαίνεται συνήθως με σιφωνισμό του διαλύτη από μια δεξαμενή, η οποία βρίσκεται υψηλότερα από τη στήλη. Η κατάλληλη ταχύτητα ροής εξαρτάται από τη διάμετρο της στήλης και την επιδιωκόμενη διαχωριστικότητα. Για τον καλύτερο έλεγχο της ταχύτητας ροής μπορούν να χρησιμοποιηθούν περισταλτικές αντλίες χαμηλής πιέσεως. Για την εύρεση του κατάλληλου συστήματος έκλουσης γίνονται δοκιμές με τη μέθοδο της χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδας. Για να επιτευχθεί καλός διαχωρισμός θα πρέπει τα R f των συστατικών του μίγματος να διαφέρουν τουλάχιστον κατά Σύστημα Α (ακατάλληλο για έκλουση της στήλης) Σύστημα Β (κατάλληλο για έκλουση της στήλης) Επιλογή συστήματος έκλουσης μιας χρωματογραφικής στήλης για το διαχωρισμό μίγματος δύο συστατικών Όταν οι ενώσεις του δείγματος είναι έγχρωμες, τότε είναι δυνατή η παρακολούθηση του διαχωρισμού με γυμνό μάτι και η συλλογή των κατάλληλων κλασμάτων. Στην περίπτωση όπου οι ουσίες είναι άχρωμες συλλέγονται κλάσματα συγκεκριμένου όγκου. Μετά τη συλλογή των κλασμάτων γίνεται ανάλυση αυτών για να προσδιοριστεί σε ποια από αυτά υπάρχει ουσία. Ένας απλός και γρήγορος τρόπος ελέγχου της καθαρότητας των κλασμάτων αποτελεί η χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας. Έλεγχος της καθαρότητας των κλασμάτων μιας χρωματογραφικής στήλης με TLC

18 Τα τελευταία χρόνια εκτός από την απλή χρωματογραφία στήλης χρησιμοποιείται ευρέως η χρωματογραφία στήλης με πίεση (flash column chromatography). Η τεχνική αυτή απαιτεί λιγότερο χρόνο και είναι περισσότερο αποτελεσματική. Αυτό οφείλεται στη χρησιμοποιούμενη σίλικα, η οποία είναι λεπτότερη και επιτρέπει καλύτερη προσρόφηση, ενώ η εφαρμογή της πιέσεως αυξάνει την ικανότητα διαχωρισμού μειώνοντας το χρόνο έκλουσης και περιορίζοντας την εξάπλωση των ζωνών των συστατικών του δείγματος. Στην περίπτωση αυτή ο διαχωρισμός των συστατικών ενός μίγματος μπορεί να επιτευχθεί και όταν τα R f αυτών διαφέρουν λιγότερο από 0.2. Η κλασική χρωματογραφία στήλης χρησιμοποιείται ευρέως στην προκατεργασία πολύπλοκων δειγμάτων, τα οποία χρειάζονται προκαταρκτικό διαχωρισμό, πριν αναλυθούν με μία ενόργανη αναλυτική τεχνική. Εξαιτίας των χρησιμοποιούμενων στηλών (σχετικά μεγάλης διαμέτρου και πληρωμένες με μεγάλης διαμέτρου σωματίδια πληρωτικού υλικού) και των μικρών ταχυτήτων ροής της κινητής φάσεως, ο χρόνος ο οποίος απαιτείται για ένα διαχωρισμό με την κλασική χρωματογραφία στήλης είναι σχετικά μεγάλος. Με την ανάπτυξη της υγρής χρωματογραφίας υψηλής αποδόσεως (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) οι χρόνοι διαχωρισμού μειώθηκαν σημαντικά. Κατά την τεχνική αυτή το υλικό πληρώσεως της στήλης είναι λεπτότατου διαμερισμού (σωματίδια πολύ μικρής διαμέτρου) και έχει υψηλή σφαιρική κανονικότητα έτσι, ώστε να επιτυγχάνονται μεγάλου βαθμού ομοιομορφία και πυκνότητα πληρώσεως. Η υψηλή πυκνότητα πληρώσεως όμως με αυτά τα πολύ μικρά σωματίδια μειώνει τη ταχύτητα ροής της κινητής φάσεως μέσα από τη στήλη (μεγάλη αντίσταση μεταφοράς) και για να επιτευχθεί μία λογική ταχύτητα ροής απαιτείται η εφαρμογή υψηλής πιέσεως στην κινητή φάση. Τα βασικά τμήματα μιας συσκευής HPLC είναι: 1) σύστημα παροχής κινητής φάσεως, 2) σύστημα εισαγωγής δείγματος, 3) στήλη, 4) ανιχνευτής και 5) καταγραφέας.

19 Το σύστημα παροχής κινητής φάσεως αποτελείται από μία αντλία υψηλής πιέσεως και ένα σύστημα για τη βαθμιαία αλλαγή της συστάσεως της κινητής φάσεως. Όταν η κινητή φάση έχει σταθερή σύσταση έχουμε ισοκρατική έκλουση (isocratic elution), ενώ όταν μεταβάλλεται βαθμιαία έχουμε βαθμιδωτή έκλουση (gradient elution). Για την επίτευξη της βαθμιδωτής εκλούσεως, απαιτείται μια μονάδα προγραμματισμού και ελέγχου του συστήματος παροχής. Οι χρησιμοποιούμενοι διαλύτες πρέπει να είναι διαφορετικής πολικότητας (πλήρως αναμίξιμοι), ή διαλύματα διαφορετικού ph, ή διαφορετικής ιονικής ισχύος ή συγκεντρώσεως κάποιου άλατος, ανάλογα με το είδος του επιδιωκόμενου μηχανισμού διαχωρισμού. Οι χρησιμοποιούμενοι διαλύτες πρέπει επίσης να είναι υψηλής καθαρότητας και πριν τη χρήση τους διηθούνται από ειδικά φίλτρα υπό κενό και απαερώνονται. Το σύστημα εισαγωγής δείγματος (injector) είναι μια περιστρεφόμενη βαλβίδα υψηλής πιέσεως, με βρόχο δείγματος. Στη θέση φορτώσεως η κινητή φάση προωθείται προς τη στήλη χωρίς να περνά από το βρόχο ο οποίος έχει πληρωθεί με το προς ανάλυση διάλυμα του δείγματος, ενώ στη θέση εισαγωγής η κινητή φάση παρασύρει ποσοτικά τον όγκο του δείγματος και τον προωθεί προς τη στήλη. Οι χρησιμοποιούμενοι ανιχνευτές πρέπει να έχουν υψηλή ευαισθησία ικανοποιητικού κατώτατου ορίου ανίχνευσης, χαμηλά επίπεδα θορύβου, να μην επηρεάζονται από μεταβολές της θερμοκρασίας και της ταχύτητας ροής του υγρού εκλούσεως κ.ά.. Οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενοι ανιχνευτές είναι οι διαφορικοί ανιχνευτές δείκτη

20 διαθλάσεως, οι ανιχνευτές υπεριώδους-ορατού, οι ανιχνευτές φθορισμού, οι ανιχνευτές υπερύθρου, οι ηλεκτροχημικοί ανιχνευτές. Η τεχνική HPLC μπορεί να χρησιμοποιηθεί για διαχωρισμούς βασισμένους σε προσρόφηση, κατανομή, ιονανταλλαγή και μοριακό αποκλεισμό, ενώ για κάθε μία εφαρμογή διατίθενται από διάφορες παρασκευάστριες εταιρείες οι κατάλληλες στήλες. Οι χρησιμοποιούμενες στήλες είναι ευθύγραμμοι σωλήνες από χάλυβα, οι οποίες αγοράζονται έτοιμες από τις διάφορες παρασκευάστριες εταιρείες. Εξαιτίας των υψηλών πιέσεων που ασκούνται (μέχρι 5000 p.s.i) τα κλασσικά υλικά πληρώσεως των στηλών, όπως Sephadex και Sepharose, δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν. Έτσι στην HPLC χρησιμοποιούνται συνήθως πολυμερή διοξειδίου του πυριτίου (silica) ή αλουμίνας (alumina). Στην περίπτωση εκείνη, όπου η στατική φάση είναι πολικότερη από την κινητή φάση και τα πολικότερα συστατικά του δείγματος προσκολλώνται ισχυρότερα στην στατική φάση και επομένως εκλούονται αργότερα από τα λιγότερο πολικά συστατικά, η τεχνική ονομάζεται υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης κανονικής φάσεως (Normal Phase High Performance Liquid Chromatography). Κατά την τεχνική αυτή ο χρόνος έκλουσης (t R ) των συστατικών μπορεί να μεταβληθεί μεταβάλλοντας την πολικότητα του διαλύτη έκλουσης. Στην περίπτωση εκείνη, όπου η στατική φάση είναι λιγότερο πολική από την κινητή φάση και τα πολικότερα συστατικά του δείγματος προσκολλώνται ασθενέστερα στην στατική φάση και επομένως εκλούονται γρηγορότερα από τα λιγότερο πολικά συστατικά, η τεχνική ονομάζεται υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης ανάστροφης φάσεως (Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography, RP-HPLC). Κατά την RP-HPLC χρησιμοποιούνται υλικά πληρώσεως (κυρίως μικροπορώδη σωματίδια πηκτής διοξειδίου του πυριτίου) με χημικά συνδεδεμένες στατικές φάσεις (chemically bonded stationary phases). Τα σωματίδια αυτά είναι συνήθως διαμέτρου 5 10 μm με πόρους 20 nm και διαθέτουν μεγάλη επιφάνεια επαφής στην οποία συνδέονται ομοιοπολικά οι στατικές φάσεις (αλκυλομάδες και άλλες δραστικές ομάδες). Στατικές φάσεις αλκυλομάδων με αλυσίδες C 8 Η 17 (octyl) και C 18 Η 37 (octadecyl) δεσμευμένες στη silica είναι ευρέως διαδεδομένες και βρίσκουν εφαρμογές σε διαχωρισμούς αμινοξέων, πεπτιδίων, πρωτεϊνών, βιταμινών, λιπών, στεροειδών, αντιβιοτικών, νουκλεοτιδίων, σακχάρων κ.ά. Κατά την RP-HPLC

21 η ισχύς έκλουσης αυξάνει με την παράλληλη μείωση της πολικότητας του διαλύτη, διότι έτσι ελαττώνεται η συγκράτηση μιας ουσίας στη στατική φάση. Στην περίπτωση ουσιών που μπορούν να υποστούν ιονισμό, μια αλλαγή στο ph μπορεί να επηρεάσει την συγκράτηση και την εκλεκτικότητά τους. Σε ένα καλό χρωματογραφικό σύστημα αναλύσεως πρέπει να επιτυγχάνεται διαφορετική ταχύτητα μετακινήσεως των ζωνών των συστατικών, λόγω του διαφορετικού βαθμού συγκρατήσεως τους στη στατική φάση. Συχνά είναι αναγκαίο να εκτελεσθεί μία προκαταρκτική χρωματογραφική κλασμάτωση ενός μείγματος πολλών συστατικών και να ακολουθήσει ανάλυση κάθε κλάσματος με την HPLC. Στο παρακάτω σχήμα παρουσιάζεται ένα χρωματογράφημα HPLC στο οποίο είναι σχεδιασμένη η απόκριση του ανιχνευτή έναντι του χρόνου. Χρωματογράφημα HPLC, όπου t o χρόνος που χρειάζεται το μέτωπο του διαλύτη για να εξέλθει από τη στήλη και t R ο χρόνος συγκράτησης της ουσίας που εκλούεται Γενικά, ο διαχωρισμός μιας συγκεκριμένης ουσίας εξαρτάται από το μοριακό βάρος, τη διαλυτότητα και τη χημική της δομή. Τα κριτήρια για την επιλογή διαλύτη κατάλληλου για έκλουση εξαρτώνται από τις φυσικοχημικές ιδιότητες του δείγματος και της εκλουστικής ικανότητας του διαλύτη. Τέλος η συνδυασμένη τεχνική υγρής χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας (LC- MS) χαρακτηρίζεται από εξαιρετική ευαισθησία, εκλεκτικότητα και αξιοπιστία. Η τεχνική LC-MS χρησιμοποιείται για την ταυτοποίηση ουσιών σε πολύπλοκα βιολογικά δείγματα.

22 ΑΣΚΗΣΗ 1 ΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟ ΟΣΗΣ (HPLC) Η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) μπορεί να χρησιμοποιηθεί για το διαχωρισμό και την ποιοτική και ποσοτική ανάλυση πολύπλοκων μειγμάτων ουσιών ποικίλης προελεύσεως. Αποτελεί την τεχνική επιλογής σε πολλά προβλήματα φαρμακευτικής ανάλυσης και χρησιμοποιείται ευρέως στην ανάλυση βιολογικών δειγμάτων, τα οποία περιέχουν τα φυσιολογικά συστατικά, τα χορηγούμενα φάρμακα και τους μεταβολίτες τους. Για την ποσοτική ανάλυση χρησιμοποιούνται καμπύλη αναφοράς, μέθοδος εσωτερικού προτύπου, χρήση σχετικής επιφάνειας κορυφών. Στην συγκεκριμένη άσκηση η τεχνική της HPLC θα χρησιμοποιηθεί για τον διαχωρισμό και την ταυτοποίηση των συστατικών δύο αιθέριων ελαίων, λεμονιού και κάρου. Το αιθέριο έλαιο από το περικάρπιο του λεμονιού (Citron limon) περιέχει 94% (+)- λεμονένιο, 4% κιτράλη (55% γερανιάλη και 45% νεράλη), κιτρονελλάλη, οξικό γερανυλεστέρα και άλλους εστέρες. Στη φαρμακευτική, το έλαιον λεμονιού χρησιμοποιείται ως βελτιωτικό γεύσεως. Το μεγαλύτερο μέρος της παραγωγής χρησιμοποιείται από τις βιομηχανίες τροφίμων και τις αρωματοποιίες. CH 3 C O H O C H CH 3 O H 3 C CH 2 H 2 C CH 3 (+)-Λεμονένιο Γερανιάλη Νεράλη (+)-Καρβόνη Ο καρπός κάρου (Carvi fructus) περιέχει 5-7% αιθέριο έλαιο σε ειδικές κοιλότητες. Το έλαιο αποτελείται σε ποσοστό 50% από (+)-καρβόνη, ενώ το υπόλοιπο είναι κυρίως (+)-λεμονένιο.

23 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ Πειραματική πορεία Σε ογκομετρικές φιάλες των 10 ml ετοιμάζονται τα δείγματα Α, Β, Γ, Δ, Χ & Ψ. Το δείγμα Α περιέχει 150 μl S(-)-Λεμονενίου σε 10 ml MeOH, το δείγμα Β 150 μl R(+)- Λεμονενίου σε 10 ml MeOH, το δείγμα Γ 25 μl R(-) Καρβόνης σε 10 ml MeOH, το δείγμα Δ 20 μl Κιτράληs σε 10 ml MeOH, το δείγμα Χ αιθέριο έλαιο από περικάρπιο λεμονιού και το δείγμα Ψ αιθέριο έλαιο καρπού κάρου. 50 μl από κάθε διάλυμα εισάγεται στη στήλη του χρωματογράφου και χρωματογραφείται ακολουθώντας τις παρακάτω χρωματογραφικές συνθήκες: Αναλυτική στήλη: C 18 Nucleosil, 150 x 4.6 mm, 5 μm Σύστημα: έκλουσης: σύστημα διαλυτών μεταβαλλόμενης σύστασης CH 3 CN/H 2 O (από 25% CH 3 CN έως 45% CH 3 CN για 5 min, από 45% CH 3 CN έως 100% CH 3 CN για 25 min, από 100% CH 3 CN έως 100% CH 3 CN για 2 min και από 100% CH 3 CN έως 25% CH 3 CN για 5 min) σε 0,05% CF 3 COOH/H 2 O Ταχύτητα ροής: 1ml/min Ανιχνευτής: UV/Vis (215 nm, 230 nm, 254 nm) Οι χρόνοι συγκράτησης (t R ) για τις ενώσεις Α, Β, Γ και Δ για το παραπάνω χρωματογραφικό σύστημα είναι αντίστοιχα: t RΑ = min, t RΒ = min, t RΓ =15.93 min, t RΔ = min ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. D.L. Paiva, G.M. Lampman and G.S. Kriz Introduction to Organic Laboratory Techniques, Second Edition Saunders college publishing, New York (1998) 2. L. M. Harwood, C.J. Moody and J. M. Percy Experimental Organic Chemistry, Second Edition Blackwell Science Ltd, London (1999) 3. R.L. Pecsok, L.D. Shields, T. Cairns and I.G. McWilliam, Σύγχρονες Μέθοδοι στη Χημική Ανάλυση, (Απόδοση στα Ελληνικά Σταύρος Βολιώτης), Εκδόσεις Γ. Α. Πνευματικός, Αθήνα (1980) 4. Θ. Π. Χατζηιωάννου και Μ. Α. Κουπάρη, Ενόργανη Ανάλυση, Εκδόσεις Δ. Μαυρομμάτη, Αθήνα (1990) 5. Δ. Παπαϊωάννου, Γ. Σταυρόπουλος και Θ. Τσεγενίδης Σημειώσεις Πειραματικής Οργανικής Χημείας, Εκδόσεις Πανεπιστημίου Πατρών, Πάτρα (1996)

24 ΕΝΟΤΗΤΑ Β ΣΥΝΘΕΣΗ ΕΣΤΕΡΩΝ Οι εστέρες είναι μια κατηγορία οργανικών ενώσεων πολύ διαδεδομένη στη φύση, με γενικό τύπο: O C R OR' Πολλοί πτητικοί εστέρες έχουν έντονη, ευχάριστη οσμή και άρωμα φρούτων. Σε πολλές περιπτώσεις το χαρακτηριστικό άρωμα φρούτων και ανθέων οφείλεται σε έναν εστέρα χαμηλού μοριακού βάρους ή σ ένα μίγμα ενώσεων στις οποίες υπερισχύει ένας εστέρας. Χαρακτηριστικά παραδείγματα μερικών τέτοιων εστέρων παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Οι εστέρες αυτοί χρησιμοποιούνται συχνά στη βιομηχανία τροφίμων ως πρόσθετα σε επιδόρπια και ροφήματα για να προσδώσουν σε αυτά χαρακτηριστικό άρωμα και γεύση. Αν και οι εστέρες έχουν ευχάριστη οσμή και γεύση χρησιμοποιούνται σπανίως ως συστατικά ακριβών αρωμάτων. Το γεγονός αυτό οφείλεται στην εύκολη υδρόλυση της εστερικής ομάδας από τον ιδρώτα. Τα οργανικά οξέα τα οποία προκύπτουν από την υδρόλυση δεν έχουν ευχάριστο άρωμα όπως οι εστέρες από τους οποίους προέρχονται. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί το βουτυρικό οξύ (οσμή ταγγισμένου βουτύρου) το οποίο σχηματίζεται από την υδρόλυση του βουτυρικού μεθυλεστέρα (άρωμα μήλου) και του βουτυρικού αιθυλεστέρα (άρωμα ανανά).

25 Πίνακας 1. Δομές και ονομασίες ορισμένων εστέρων Ονομασία Δομή Σ.Ζ ( C) Άρωμα Οξικός O προπυλεστέρας H 3 C C OCH 2 CH 2 CH 3 Βουτυρικός O μεθυλεστέρας H 3 CH 2 CH 2 C C OCH 3 Βουτυρικός O αιθυλεστέρας H 3 CH 2 CH 2 C C OCH 2 CH 3 Προπιονικός O ισοβουτυλεστέρας H 3 CH 2 C C OCH 2 CH 3 Οξικός O ισοπεντυλεστέρας H 3 C C OCH 2 CH 2 CH(CH 3 ) 2 Οξικός βενζυλεστέρας O H 3 C C O H 3 C Αχλάδι Μήλο 121 Ανανάς Ρούμι Μπανάνα Αχλάδι Ροδάκινο Φράουλα Οξικός οκτυλεστέρας H 3 C O C O(CH 2 ) 7 CH Πορτοκάλι Σαλικυλικός μεθυλεστέρας O C OCH 3 OH 222 Wintergreen (γωλθερία η Κατακλινής) ΑΣΚΗΣΗ 1 ΣΥΝΘΕΣΗ ΟΞΙΚΟΥ ΙΣΟΠΕΝΤΥΛΕΣΤΕΡΑ Ο οξικός ισοπεντυλεστέρας (banana oil) έχει έντονο άρωμα μπανάνας όταν είναι αμιγής, ενώ σε διάλυμα έχει άρωμα αχλαδιού. Χρησιμοποιείται ως πρόσθετο σε διάφορα τρόφιμα. Ο οξικός ισοπεντυλεστέρας αποτελεί επίσης το κύριο συστατικό μιας φερομόνης αφύπνισης των μελισσών. Παρασκευάζεται με απευθείας εστεροποίηση της ισοπεντυλαλκοόλης με περίσσεια οξικού οξέος παρουσία π.η 2 SΟ 4 ως καταλύτη (Σχ.1). O H 3 CC OH CH 3 O HOH 2 CH 2 C CHCH 3 H 3 C C OCH 2 CH 2 CH(CH 3 ) 2 H 2 O Οξικό οξύ Ισοπεντυλαλκοόλη Οξικός ισοπεντυλεστέρας

26 ΜΙΓΜΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ Οξικό οξύ Ισοπεντυλαλκοόλη Θειϊκό οξύ (ως καταλύτης) Βράσιμο ΜΙΓΜΑ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ Οξικός ισοπεντυλεστέρας Οξικό οξύ (που δεν αντέδρασε) Ισοπεντυλαλκοόλη (που δεν αντέδρασε) Θειϊκό οξύ Νερό Παραπροϊόντα Υδατική φάση Πλύσιμο Οργανική φάση Οξικό οξύ (ως άλας) Θειϊκό οξύ (ως άλας) Νερό Οξικός ισοπεντυλεστέρας Ισοπεντυλαλκοόλη Νερό (ίχνη) Παραπροϊόντα Ξήρανση Στερεό υπόλειμμα Οξικός ισοπεντυλεστέρας Ισοπεντυλαλκοόλη Παραπροϊόντα Απόσταξη Λοιπά κλάσματα Οξικός ισοπεντυλεστέρας Σχήμα 1. Σχηματικό Διάγραμμα Παρασκευής Οξικού Ισοπεντυλεστέρα

27 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ Όργανα και σκεύη Συσκευή απόσταξης Σφαιρικές φιάλες Ογκομετρικοί κύλινδροι Διαχωριστική χοάνη Κωνικές φιάλες Ποτήρια ζέσεως Ηλεκτρικός μανδύας Ψυκτήρες Υλικά και αντιδραστήρια AcOH Ισοπεντυλαλκοόλη π. H 2 SO 4 Na 2 SO 4 CH 2 Cl 2 NaHCO 3 NaCl Πειραματική πορεία Σε εσμυρισμένη σφαιρική φιάλη των 100 ml προστίθενται 11 ml (100 mmol) ισοπεντυλαλκοόλης, 14 ml (250 mmol) παγόμορφου οξικού οξέος και 1ml π. H 2 SO 4. Αφού προστεθούν πέτρες βρασμού και προσαρμοστεί στη φιάλη κάθετος ψυκτήρας, το μίγμα θερμαίνεται σε υδρόλουτρο για 45 min [Σχήμα Π4α]. Μετά το τέλος του βρασμού το μίγμα, αφού ψυχθεί σε θερμοκρασία δωματίου, μεταφέρεται σε διαχωριστική χοάνη [Σχήμα Π6], στην οποία προστίθενται 30 ml κεκορεσμένου διαλύματος χλωριούχου νατρίου και 60 ml διχλωρομεθανίου. Το περιεχόμενο της χοάνης αναταράσσεται και αφήνεται σε ηρεμία. Η διαχωριζόμενη υδατική φάση αποχύνεται σε ποτήρι ζέσεως, ενώ η οργανική διατηρείται στη χοάνη και πλένεται προσεκτικά με κεκορεσμένο διάλυμα όξινου ανθρακικού νατρίου (40 ml) με τη διαχωριστική χοάνη να διατηρείται ανοικτή μέχρι να σταματήσει ο αναβρασμός. Στη συνέχεια πωματίζεται, αναταράσσεται, αναστρέφεται και ανοίγεται η στρόφιγγα για τη διαφυγή (προς τα άνω) του εκλυόμενου αερίου. Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται άλλες δύο φορές. Μετά την κατεργασία με το διάλυμα του όξινου ανθρακικού νατρίου, η οργανική φάση πλένεται με νερό (2 40 ml) και μετά το διαχωρισμό της μεταφέρεται σε μικρή κωνική φιάλη όπου ξηραίνεται με προσθήκη άνυδρου Na 2 SO 4. Το προϊόν μεταφέρεται δια διηθήσεως με πτυχωτό ηθμό εντός Η αντίδραση πραγματοποιείται στην εστία Εάν η στοιβάδα του εστέρα δε διαχωρίζεται, τότε προστίθεται στη διαχωριστική χοάνη μικρή ποσότητα χλωριούχου νατρίου

28 υάλινου χωνιού [Σχήμα Π8] σε εσμυρισμένη σφαιρική φιάλη των 100 ml και παραλαμβάνεται με απλή απόσταξη [Σχήμα Π10]. Σ.Ζ. 142 C ΑΣΚΗΣΗ 2α ΣΥΝΘΕΣΗ ΣΑΛΙΚΥΛΙΚΟΥ ΜΕΘΥΛΕΣΤΕΡΑ Ο οξικός σαλικυλεστέρας απομονώθηκε για πρώτη φορά το 1843 με εκχύλιση των φύλλων του φυτού wintergreen (Gaultheria procumbens) ή από το φλοιό σημύδας. Γρήγορα βρέθηκε ότι το παράγωγο αυτό όταν λαμβάνεται από το στόμα έχει αναλγητικές και αντιπυρετικές ιδιότητες ταυτόσημες με εκείνες του σαλικυλικού οξέος, ενώ η εφαρμογή του πάνω στο δέρμα προκαλεί αίσθημα ανακούφισης. Λόγω της ιδιότητας αυτής χρησιμοποιείται κυρίως σε παρασκευάσματα εντριβών για την ανακούφιση των μυϊκών πόνων και των αρθριτικών. Επίσης λόγω του διαπεραστικού ευχάριστου αρώματός του χρησιμοποιείται σε μικρή έκταση και ως πρόσθετο σε διάφορα εμπορικά προϊόντα, όπως ζαχαρωτά, τσίχλες, οδοντόπαστες. Παρασκευάζεται με την εστεροποίηση του σαλικυλικού οξέος με περίσσεια μεθανόλης παρουσία π. Η 2 SΟ 4 ως καταλύτη (Σχ.2). O OH OH Σαλικυλικό οξύ CH 3 OH O O CH 3 H 2 O OH Σαλικυλικός μεθυλεστέρας

29 ΜΙΓΜΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ Σαλικυλικό οξύ Μεθανόλη Θειϊκό οξύ (ως καταλύτης) Βράσιμο ΜΙΓΜΑ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ Σαλικυλικός μεθυλεστέρας Σαλικυλικό οξύ (που δεν αντέδρασε) Μεθανόλη (που δεν αντέδρασε) Θειϊκό οξύ Νερό Παραπροϊόντα Υδατική φάση Πλύσιμο Οργανική φάση Σαλικυλικό οξύ (ως άλας) Θειϊκό οξύ (ως άλας) Νερό Σαλικυλικός μεθυλεστέρας Μεθανόλη Νερό (ίχνη) Παραπροϊόντα Ξήρανση Στερεό υπόλειμμα Σαλικυλικός μεθυλεστέρας Μεθανόλη Παραπροϊόντα Απόσταξη Λοιπά κλάσματα Σαλικυλικός μεθυλεστέρας Σχήμα 2. Σχηματικό Διάγραμμα Παρασκευής Σαλικυλικού Μεθυλεστέρα

30 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ Όργανα και σκεύη Συσκευή απόσταξης Σφαιρικές φιάλες Ογκομετρικοί κύλινδροι Διαχωριστική χοάνη Κωνικές φιάλες Ποτήρια ζέσεως Ηλεκτρικός μανδύας Ψυκτήρες Υλικά και αντιδραστήρια Σαλικυλικό οξύ MeOH π. H 2 SO 4 Na 2 SO 4 CH 2 Cl 2 NaHCO 3 NaCl Πειραματική πορεία Σε εσμυρισμένη σφαιρική φιάλη των 100 ml προστίθενται 25 ml μεθανόλης και 9,7 g σαλικυλικού οξέος. Το μίγμα αναδεύεται και θερμαίνεται ελαφρά μέχρι να διαλυθεί το σαλικυλικό οξύ. Εν συνεχεία προστίθενται προσεκτικά 1ml π.h 2 SO 4. Αφού προστεθούν πέτρες βρασμού και προσαρμοστεί στη φιάλη κάθετος ψυκτήρας, το μίγμα βράζεται για 45 min σε ηλεκτρικό μανδύα [Σχήμα Π3α]. Μετά το τέλος του βρασμού το μίγμα, αφού ψυχθεί σε θερμοκρασία δωματίου, μεταφέρεται σε διαχωριστική χοάνη [Σχήμα Π6], στην οποία προστίθενται 30 ml κεκορεσμένου διαλύματος χλωριούχου νατρίου και 60 ml διχλωρομεθανίου. Το περιεχόμενο της χοάνης αναταράσσεται και αφήνεται σε ηρεμία. Ο διαχωριζόμενη οργανική φάση διατηρείται στη χοάνη, ενώ η υδατική φάση αποχύνεται σε ποτήρι ζέσεως. Η φάση του εστέρα πλένεται προσεκτικά με κεκορεσμένο διάλυμα όξινου ανθρακικού νατρίου (40 ml), ενώ η διαχωριστική χοάνη διατηρείται ανοικτή μέχρι να σταματήσει ο αναβρασμός. Στη συνέχεια πωματίζεται αναταράσσεται, αναστρέφεται και ανοίγεται η στρόφιγγα για τη διαφυγή (προς τα άνω) του εκλυόμενου αερίου. Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται άλλες 2 φορές. Μετά την κατεργασία με το διάλυμα του όξινου ανθρακικού νατρίου η οργανική φάση πλένεται με νερό (2 40 ml) και μετά το διαχωρισμό της (εάν η στοιβάδα του εστέρα δεν διαχωρίζεται τότε προστίθεται στη διαχωριστική χοάνη μικρή ποσότητα χλωριούχου νατρίου) μεταφέρεται σε μικρή κωνική φιάλη και ξηραίνεται με προσθήκη άνυδρου Na 2 SO 4.

31 Το προϊόν μεταφέρεται δια διηθήσεως με πτυχωτό ηθμό εντός υάλινου χωνιού [Σχήμα Π8] σε εσμυρισμένη σφαιρική φιάλη των 100 ml και παραλαμβάνεται με απόσταξη, υπό κενό [Σχήμα Π13]. Σ.Ζ 222 C ΑΣΚΗΣΗ 2β Υ ΡΟΛΥΣΗ ΣΑΛΙΚΥΛΙΚΟΥ ΜΕΘΥΛΕΣΤΕΡΑ OH COOCH 3 1. NaOH 2. H OH COOH MeOH Σαλικυλικός μεθυλεστέρας Σαλικυλικό οξύ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ Όργανα και σκεύη Σφαιρικές φιάλες Ογκομετρικοί κύλινδροι Υδατόλουτρο Διάταξη διηθήσεως Ψυκτήρας Ηλεκτρικός μανδύας Ποτήρια ζέσεως Υλικά και αντιδραστήρια Σαλικυλικός μεθυλεστέρας ΝαΟΗ 1 Μ H 2 SO 4 Πειραματική πορεία Σε μια σφαιρική φιάλη των 100 ml, η οποία περιέχει 1,5 g σαλικυλικού μεθυλεστέρα, προστίθενται 3 g ΝαΟΗ διαλυμένα σε 20 ml Η 2 Ο. Αφού προστεθούν πέτρες βρασμού και προσαρμοστεί στη φιάλη κάθετος ψυκτήρας, το μίγμα βράζεται για 45 min [Σχήμα Π3α]. Μετά το τέλος του βρασμού το μίγμα, αφού ψυχθεί σε θερμοκρασία

32 δωματίου, μεταφέρεται σε ποτήρι ζέσεως των 100 ml και οξινίζεται προσεκτικά, υπό ψύξη, με 1Μ Η 2 SΟ 4. Το σχηματιζόμενο σαλικυλικό οξύ παραλαμβάνεται με διήθηση, υπό κενό, σε ηθμό με πορώδες (Νο.2) [Σχήμα Π16β] και ανακρυσταλλώνεται με βραστό νερό. Σ.Τ ºC Rf (A) 0.70 (A) CH 2 Cl 2 :MeOH 95:5 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Donald L. Pavia, Gary M. Lampman, George S. Kriz and Randall G. Engel, ORGANIC LABORATORY TECHNIQUES, 1 st Edition, Harcourt Brace & Company, Philadelphia (1998). 2. John W. Lehman, OPERATIONAL ORGANIC CHEMISTRY, 3 rd Edition, prentice Hall,Inc., New Jersey (1999).

33 ΕΝΟΤΗΤΑ Γ ΣΤΕΡΟΕΙ Η Τα στεροειδή είναι μια σημαντική κατηγορία φυσικών προϊόντων των οποίων οι δομές έχουν ως βάση το σκελετό του υδρογονωμένου τετρακυκλικού περυδροκυκλοπεντανοφαινανθρενίου Α Β Γ Δ Περυδρο-κυκλοπεντανο-Φαινανθρένιο Τα στεροειδή είναι πολύ διαδεδομένα στη φύση και απαντώνται τόσο σε φυτικούς όσο και σε ζωικούς οργανισμούς. Είναι δυνατόν να προέλθουν βιοσυνθετικά από τα τριτερπένια λανοστερόλη (στα ζώα) και κυκλοαρτενόλη (στα φυτά). Τα στεροειδή σχηματίζονται από τα συγκεκριμένα τριτερπένια με απώλεια τριών μεθυλουποκαταστατών από τον ανθρακικό σκελετό και ενός μικρότερου τμήματος της πλευρικής αλυσίδας.

34 H 3 C H H 3 C H CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 H CH 3 H H HO H 3 C H CH 3 HO H 3 C H CH 3 Λανοστερόλη Κυκλοαρτενόλη Ειδικά τα στεροειδή των ζωικών οργανισμών συμμετέχουν σε πολλές σημαντικές βιολογικές λειτουργίες. Οι ορμόνες του φύλου των θηλαστικών, οι στερόλες, τα χολικά οξέα, η βιταμίνη D, οι ορμόνες των επινεφριδίων (κορτικοστεροειδή), οι καρδιακοί γλυκοζίτες ανήκουν στην κατηγορία των στεροειδών. Τα στεροειδή τα οποία απαντούν στη φύση, συνήθως είναι ενωμένα με οξυγόνο στον C 3. Επίσης τα περισσότερα στεροειδή είναι υποκατεστημένα με μεθυλομάδες στις θέσεις C 10 και C 13, ενώ στον C 17 υπάρχει κάποιος υποκαταστάτης που είναι αλκύλιο ή άλλη ομάδα. Τα φυτικά στεροειδή αποτελούν την κυριότερη πηγή στεροειδών φαρμάκων. Ένα μικρό ποσοστό παρασκευάζεται από ζωικά στεροειδή και η ολική σύνθεση είναι συμφέρουσα μόνο στην περίπτωση ορισμένων αρωματικών στεροειδών και των 19-νορ-στεροειδών, όπως η νορεθιστερόνη. ΑΣΚΗΣΗ 1 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΧΟΛΗΣΤΕΡΟΛΗΣ ΑΠΟ ΠΕΤΡΕΣ ΧΟΛΗΣ Ένα από τα πιο διαδεδομένα στεροειδή είναι η χοληστερόλη η οποία απαντάται σε όλους τους ιστούς των θηλαστικών ως συστατικό των κυτταρικών μεμβρανών. H χοληστερόλη αποτελεί την πρώτη ύλη για τη σύνθεση των χολικών οξέων, των ορμονών του φύλου και των επινεφριδίων. Η χοληστερόλη ήταν το πρώτο στεροειδές το οποίο απομονώθηκε και μελετήθηκε. Βέβαια εξαιτίας της πολύπλοκης δομής της πέρασαν περίπου 160 χρόνια από την

35 ανακάλυψή της (1770) για να προσδιοριστεί η δομή αυτή (1932). Επιπλέον, επειδή η χοληστερόλη περιέχει οκτώ ασύμμετρα κέντρα και επομένως υπάρχουν 2 8 =256 δυνατά στερεοϊσομερή της, απαιτήθηκαν άλλα 23 χρόνια (1955) για να προσδιοριστεί η τρισδιάστατη δομή της. Η δομή της περιλαμβάνει στον C 3 μία υδροξυλομάδα (βδιάταξης) και ένα διπλό δεσμό μεταξύ των θέσεων C 5 και C 6. Η χοληστερόλη και τα χολικά οξέα καλύπτουν ως πρώτες ύλες το 10% περίπου της παγκοσμίου παραγωγής στεροειδών. Τα επίπεδα της χοληστερόλης στο αίμα εξαρτώνται τόσο από τις διατροφικές συνήθειες του ατόμου όσο και από διάφορους φυσιολογικούς παράγοντες. Πιστεύεται ότι τα υψηλά επίπεδα χοληστερόλης σχετίζονται με την εμφάνιση της αθηροσκλήρωσης (πάθηση των μεγάλων αρτηριών, η οποία χαρακτηρίζεται από την εναπόθεση λιποειδών και το σχηματισμό αθηρωματικών πλακών κάτω από τον έσω χιτώνα τους). H 3 C CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 H H HO H Χοληστερόλη Η χοληστερόλη είναι δυνατόν να απομονωθεί από πέτρες χολής (πολτοποιημένες) χρησιμοποιώντας θερμό αιθέρα. Μαζί με τη χοληστερόλη εκχυλίζονται και άλλα τρία στεροειδή τα οποία συνυπάρχουν σε μικρές ποσότητες (0.1-3%). Τα στεροειδή αυτά παρουσιάζουν παρόμοια διαλυτότητα με τη χοληστερόλη και έτσι δεν είναι δυνατόν να διαχωριστούν με κρυστάλλωση. Ένα από τα στεροειδή αυτά είναι η χοληστανόλη. Τα άλλα δύο είναι η 7-δεϋδρο-χοληστερόλη, η οποία περιέχει δύο διπλούς δεσμούς μεταξύ των ατόμων άνθρακα 5 & 6 και 7 & 8, και η Δ 7 -χοληστεν-3β-όλη η οποία περιέχει έναν διπλό δεσμό μεταξύ των ατόμων άνθρακα 7 και 8.

36 H 3 C CH 3 8 H CH 3 H CH 3 CH 3 HO Χοληστανόλη ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ Όργανα και σκεύη Κωνικές φιάλες Oγκομετρικοί κύλινδροι Διαχωριστική χοάνη Διάταξη διηθήσεως Υάλινο χωνί Ατμόλουτρο Υλικά και αντιδραστήρια Πέτρες χολής Αιθέρας Μεθανόλη Πειραματική πορεία 2 g πολτοποιημένες πέτρες χολής τοποθετούνται σε μια κωνική φιάλη των 25 ml. Στη φιάλη προστίθενται 10 ml αιθέρα και το μίγμα θερμαίνεται σε ατμόλουτρο [Σχήμα Π4α], ενώ συγχρόνως αναδεύεται. Κατόπιν το καφεκίτρινο διάλυμα, ενώ είναι ακόμα ζεστό, διηθείται μέσω πτυχωτού ηθμού, o οποίος έχει διαβραχεί με αιθέρα, εντός υάλινου χωνιού [Σχήμα Π8]. Η φιάλη και ο ηθμός ξεπλένονται με μικρή ποσότητα αιθέρα. Το διήθημα αραιώνεται με 10 ml μεθανόλης, αποχρωματίζεται και κατόπιν θερμαίνεται σε ατμόλουτρο [Σχήμα Π4α]. Εν συνεχεία το διάλυμα διηθείται, ενώ είναι ακόμα ζεστό, σε θερμό υάλινο χωνί με πτυχωτό ηθμό [Σχήμα Π15]. Το διήθημα ξαναθερμαίνεται και προστίθεται στάγδην νερό μέχρι εμφανίσεως ενός θολώματος. Με ψύξη του διαλύματος αποβάλλεται η χοληστερόλη, η οποία διηθείται, υπό κενό, σε ηθμό με πορώδες (Νο.2) [Σχήμα Π16β], εκπλένεται με κρύα μεθανόλη και αφήνεται να ξηραθεί, επί αρκετή ώρα, Το στερεό το οποίο διηθείται είναι ένα προϊόν μεταβολισμού της αιμοσφαιρίνης, η χολερυθρίνη. Για τον αποχρωματισμό προστίθεται στο διάλυμα ενεργός άνθρακας και το μίγμα διηθείται, υπό κενό, μέσω ηθμού με πορώδες (Νο.3) ο οποίος περιέχει λεπτό στρώμα γης διατόμων (Celite) [Σχήμα Π16β].

37 επάνω στον ηθμό. Συλλέγονται περίπου 1.5 g ακάθαρτης χοληστερόλης (Σ.Τ o C). Καθαρή χοληστερόλη απομονώνεται με βρωμίωση και κατόπιν αποβρωμίωση αυτής. ΑΣΚΗΣΗ 2α ΣΥΝΘΕΤΙΚΗ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 5α,6β- ΙΒΡΩΜΟΧΟΛΗΣΤΕΡΟΛΗΣ Ο καθαρισμός της χοληστερόλης από τα άλλα στεροειδή τα οποία τη συνοδεύον κατά την απομόνωσή της είναι δυνατόν να επιτευχθεί χημικά με βρωμίωση. Η χοληστερόλη μετατρέπεται σε διβρωμο-χοληστερόλη με την προσθήκη Br 2 στο διπλό δεσμό της, ενώ η χοληστανόλη που δεν έχει διπλό δεσμό δεν αντιδρά με το Br 2. Τέλος τα άλλα δύο στεροειδή η 7-δεϋδρο-χοληστερόλη και Δ 7 -χοληστεν-3β-όλη βρωμιώνονται πιο δύσκολα λόγω στερεοχημικής παρεμποδίσεως. HO 2 1 Me H H Me H Me Br 2 Me Me HO Me H H Br Br Me H Me Me Me Χοληστερόλη 5α, 6β-Διβρωμοχοληστερόλη ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ Όργανα και σκεύη Σφαιρικές φιάλες Ογκομετρικοί κύλινδροι Ατμόλουτρο Κωνικές φιάλες Συσκευή διηθήσεως Υλικά και αντιδραστήρια Χοληστερόλη Άνυδρο οξικό νάτριο Διαιθυλαιθέρας Οξικό οξύ Βρώμιο