ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

Transcript

1 ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Χρήση της πίσσας Πάφου (Pistacia terebinthus) ως υπόστρωμα ακινητοποίησης του Lactobacillus casei για την παραγωγή γαλακτοκομικών προϊόντων ΒΑΣΙΛΙΚΗ ΣΧΟΙΝΑ ΧΗΜΙΚΟΣ, M.Sc. ΠΑΤΡΑ 2014

2

3 DEPARTMENT OF CHEMISTRY PhD THESIS Use of pissa Pafou (Pistacia terebinthus) as immobilization support of Lactobacillus casei for the production of dairy products VASILIKI SCHOINA CHEMIST, M.Sc. PATRAS 2014

4 iv

5 στην οικογένειά μου με αγάπη v

6 vi

7 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΚΑΝΕΛΛΑΚΗ ΜΑΡΙΑ, Καθηγήτρια Χημείας και Βιοτεχνολογίας Τροφίμων, Τμήμα Χημείας Πανεπιστημίου Πατρών. (Επιβλέπουσα) ΚΟΥΤΙΝΑΣ Α. ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ, Ομότιμος Καθηγητής Χημείας και Βιοτεχνολογίας Τροφίμων, Τμήμα Χημείας Πανεπιστημίου Πατρών. ΣΟΥΠΙΩΝΗ ΜΑΓΔΑΛΗΝΗ, Επίκουρος Καθηγήτρια Χημείας, Τμήμα Χημείας Πανεπιστημίου Πατρών. vii

8 THREE-MEMBER ADVISORY COMMITTEE KANELLAKI MARIA, Professor of Food Chemistry and Biotechnology, Department of Chemistry, University of Patras. (Supervisor) KOUTINAS A. ATHANASIOS, Emeritus Professor of Food Chemistry and Biotechnology, Department of Chemistry, University of Patras. SOUPIONI MAGDALINI, Assistant Professor of Chemistry, Department of Chemistry, University of Patras. viii

9 ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΚΑΝΕΛΛΑΚΗ ΜΑΡΙΑ, Καθηγήτρια Χημείας και Βιοτεχνολογίας Τροφίμων, Τμήμα Χημείας Πανεπιστημίου Πατρών. (Επιβλέπουσα) ΚΟΥΤΙΝΑΣ Α. ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ, Ομότιμος Καθηγητής Χημείας και Βιοτεχνολογίας Τροφίμων, Τμήμα Χημείας Πανεπιστημίου Πατρών. (Μέλος της Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής) ΣΟΥΠΙΩΝΗ ΜΑΓΔΑΛΗΝΗ, Επίκουρος Καθηγήτρια Χημείας, Τμήμα Χημείας Πανεπιστημίου Πατρών. (Μέλος της Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής) ΔΕΜΕΡΤΖΗΣ ΠΑΝΑΓΙΩΤΗΣ, Καθηγητής Χημείας, Τμήμα Χημείας Πανεπιστημίου Ιωαννίνων. KOΥΡΚΟΥΤΑΣ ΙΩΑΝΝΗΣ, Επίκουρος Καθηγητής Εφαρμοσμένης Βιοτεχνολογίας, Τμήμα Μοριακής Βιολογίας και Γενετικής Δημοκρίτειου Πανεπιστημίου Θράκης. ΜΠΕΚΑΤΩΡΟΥ ΑΡΓΥΡΩ, Επίκουρος Καθηγήτρια Χημείας και Βιοτεχνολογίας Τροφίμων, Τμήμα Χημείας Πανεπιστημίου Πατρών. ΠΑΠΑΜΙΧΑΗΛ ΕΜΜΑΝΟΥΗΛ, Καθηγητής Χημείας, Τμήμα Χημείας Πανεπιστημίου Ιωαννίνων. ix

10 x

11 Η εκπόνηση της διδακτορικής διατριβής υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα Κρατικών Υποτροφιών (Ι.Κ.Υ.) xi

12 xii

13 Η έγκριση της διδακτορικής διατριβής από την εξεταστική επιτροπή δεν υποδηλώνει την αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα (Ν. 5343/1932, άρθρο 202) xiii

14 xiv

15 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων του Τμήματος Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών. Πρόκειται για τη μελέτη χρήσης της πίσσας Πάφου, ως υπόστρωμα ακινητοποίησης κυττάρων του μικροοργανισμού Lactobacillus casei, στην παρασκευή γαλακτοκομικών προϊόντων. Η εργασία πραγματοποιήθηκε στα πλαίσια χορήγησης υποτροφίας από το Ίδρυμα Κρατικών Υποτροφιών (Ι.Κ.Υ.) και στα πλαίσια χορήγησης τριετούς εκπαιδευτικής άδειας από τον φορέα εργασίας μου (Γενικό Χημείο του Κράτους). Θα ήθελα να ευχαριστήσω για τη πολύτιμη βοήθειά τους και καθοδήγηση στη διάρκεια εκπόνησης της διατριβής την επιβλέπουσα καθηγήτρια κ. Κανελλάκη Μαρία, τον ομότιμο καθηγητή κ. Κουτίνα Αθανάσιο και την επίκουρο καθηγήτρια κ. Σουπιώνη Μαγδαληνή, που αποτελούν μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής. Ιδιαίτερα εκτιμώ την κατανόηση εκ μέρους της κ. Κανελλάκη αναφορικά με τη καθυστέρηση στη συγγραφή της διατριβής. Ευχαριστώ θερμά όλα τα μέλη της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής, τον καθηγητή κ. Δεμερτζή Παναγιώτη, τον επίκουρο καθηγητή κ. Κουρκουτά Ιωάννη, την επίκουρο καθηγήτρια κ. Μπεκατώρου Αργυρώ και τον καθηγητή κ. Παπαμιχαήλ Εμμανουήλ. Ευχαριστώ πολύ για τη βοήθειά τους και την ηθική στήριξη τον επίκουρο καθηγητή Χημείας κ. Συμεόπουλο Βασίλειο και τον ομότιμο καθηγητή Χημείας κ. Ιωάννου Παναγιώτη. Ευχαριστώ για τη πολύτιμη συνεργασία τους και τη φιλία τους κατά τη διάρκεια εκπόνησης της διδακτορικής διατριβής όλη την ομάδα του Εργαστηρίου Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων του Τμήματος Χημείας, η οποία αποτελούταν από τον Θεόδωρο Αγγελόπουλο, τον Βασίλη Γκανάτσιο, τη Δήμητρα Δημητρέλου, τον Μιχαήλ Καλλή, τον Παναγιώτη Κανδύλη, την Ελευθερία Κατεχάκη, τον Νικόλαο Κοψαχείλη, τον Χαρίλαο Παπαποστόλου, τον Ιωάννη Σερβετά, τον Κωνσταντίνο Σιδέρη, τον Κωνσταντίνο Συνγκιρίδη, την Κωνσταντίνα Τσαούση και τον Mrinal Nishant Kumar. Επιπλέον ένα μεγάλο ευχαριστώ στον φίλο Βασίλη Αναγνωστόπουλο και στη φίλη Αθηνά Βλάχου και στον Αριστείδη Γκολφινόπουλο που εκπόνησαν τη διδακτορική τους διατριβή στο Εργαστήριο Πυρηνικής Χημείας του Τμήματος Χημείας. Ακόμη ευχαριστώ τη φίλη και υποψήφια διδάκτωρ Αντωνία Τέρπου με την οποία συνεργαστήκαμε κατά την εκπόνηση της μεταπτυχιακής της εργασίας και τις Μαρία Αθανασίου και Βασιλική Παυλογιάννη, με τις οποίες είχα μία πολύ καλή συνεργασία κατά τη διάρκεια εκπόνησης των διπλωματικών τους εργασιών. Ευχαριστώ τις συμφοιτήτριές μου και φίλες μου Διαλεκτή Μπαλλή, την Ευαγγελία Σακκούλη, την Ευγενία Σακελλαράκη, την Ευαγγελία Μήτση και τη φίλη Χαραλαμπία Αρκουλή για τη στήριξή τους. xv

16 Ένα μεγάλο ευχαριστώ στη φίλη μου Λουλούδα Μποσνέα, που ήταν από την πρώτη ημέρα μαζί μου στο εργαστήριο και με καθοδήγησε υποδειγματικά στο χώρο των γαλακτοκομικών προϊόντων και στην πολύ καλή φίλη που απέκτησα το χρόνο που ήμουν στο Πανεπιστήμιο, την Αγγέλικα-Ιωάννα Γιαλλελή. Ήταν πάντα εκεί όταν την χρειαζόμουν. Τις ευχαριστώ και τις δύο μέσα από την καρδιά μου. Ευχαριστώ την αδελφή μου Δήμητρα και την καλή συνάδελφο και φίλη Ιωάννα Γκέργκη που με παρότρυναν να συμμετάσχω στις εξετάσεις για την απόκτηση υποτροφίας από το Ίδρυμα Κρατικών Υποτροφιών, το οποίο αποτέλεσε εφαλτήριο για την εκπόνηση της διδακτορικής διατριβής. Ένα τεράστιο ευχαριστώ για τη συνεχή στήριξή τους οφείλω στους συναδέλφους μου στη Χημική Υπηρεσία Μετρολογίας στο Γενικό Χημείο του Κράτους. Στην Ευγενία Λαμπή, στον Ηλία Κακουλίδη, στον Χαράλαμπο Αλεξόπουλο, στην Παναγιώτα Γιαννικοπούλου και στην Αλεξάνδρα Γεωργοπούλου. Μπορώ να πω, χωρίς υπερβολή, ότι το μεγαλύτερο κομμάτι της διδακτορικής διατριβής γράφτηκε χάρη στη δική τους προτροπή. Τέλος, ευχαριστώ τη μητέρα μου που ήταν πάντοτε στο πλευρό μου, με στήριζε και πίστευε πάντα στις δυνατότητές μου, τις αδελφές μου, τον γαμπρό μου και τα ανηψάκια μου για την αγάπη τους. Ολοκληρώνοντας τη διδακτορική μου διατριβή, τολμώ να πω ότι είμαι πολύ τυχερή που έζησα αυτή την εμπειρία. xvi

17 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στο εισαγωγικό μέρος της διδακτορικής διατριβής δίνονται στοιχεία που αφορούν στο γάλα, στα ζυμωμένα γαλακτοκομικά προϊόντα, στα νέα τρόφιμα, στις μεθόδους ακινητοποίησης κυττάρων μικροοργανισμών και στη πίσσα Πάφου (Pistacia terebinthus). Οι κύριοι στόχοι της διατριβής έγκεινται στη παραγωγή ακινητοποιημένου βιοκαταλύτη σε πίσσα Πάφου και στη χρήση του για παραγωγή γαλακτοκομικών προϊόντων. Συγκεκριμένα μελετήθηκε η επίδραση της παρουσίας του ακινητοποιημένου βιοκαταλύτη στα φυσικοχημικά, μικροβιολογικά και οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των παραγόμενων προϊόντων. Στο πειραματικό μέρος της διδακτορικής διατριβής αναφέρονται οι μέθοδοι παραγωγής των προϊόντων και οι μέθοδοι και οι αναλυτικές τεχνικές που χρησιμοποιήθηκαν για τη παρακολούθηση αναλυτικών παραμέτρων των γαλακτοκομικών προϊόντων. Διαπιστώθηκε η καταλληλότητα του ακινητοποιημένου βιοκαταλύτη ως προς τη πρόσδοση εξαιρετικών οργανοληπτικών χαρακτηριστικών στα παραγόμενα προϊόντα. Η πίσσα Πάφου, που αποτελεί το υπόστρωμα ακινητοποίησης περιέχει τερπένια, ουσίες που τη καθιστούν υπόστρωμα που αποδίδει ευχάριστο άρωμα όταν προστίθεται σε τρόφιμα. Περιέχει επίσης φαινόλες, που λόγω της αντιμικροβιακής τους δράσης προστατεύουν από αλλοίωση τα παραγόμενα με αυτή προϊόντα. Mελετήθηκε η παραγωγή γιαουρτιών με τη χρήση ελεύθερων και ακινητοποιημένων κυττάρων Lactobacillus casei σε πίσσα Πάφου. Τα υψηλά ποσοστά επιβίωσης των ακινητοποιημένων κυττάρων Lactobacillus casei (>10 6 ) προσδίδουν στα γιαούρτια τον χαρακτηρισμό προβιοτικού τροφίμου. Προβιοτικά επίσης χαρακτηρίζονται τα λευκά τυριά άλμης, τα τυριά τυρογάλακτος και τα ροφήματα τυρογάλακτος που παρασκευάστηκαν με χρήση ακινητοποιημένων κυττάρων Lactobacillus casei σε πίσσα Πάφου. Όλα τα παραγόμενα προϊόντα παρουσίασαν καλά φυσικοχημικά και μικροβιολογικά χαρακτηριστικά, με πλήρη απουσία εμφάνισης παθογόνων μικροοργανισμών κατά τη διάρκεια αποθήκευσής τους στους 4 C. 1

18 ABSTRACT In the introductory section of the dissertation data is given concerning milk, fermented milk products, novel foods, methods of cell immobilization and pissa Pafou (Pistacia terebinthus resin). The main objectives of the dissertation include the production of immobilized biocatalyst in pissa Pafou and its use to the production of dairy products. More specifically, the effect of immobilized biocatalyst to the physicochemical, microbiological and sensory characteristics of the dairy products was studied. The methods of dairy products production, the analytical methods and analytical techniques used to measure and evaluate the analytical parameters of dairy products are given in the experimental section of the dissertation. The suitability of the immobilized biocatalyst, regarding the excellent sensory features conferred to the products, was ascertained. Pissa Pafou, the substrate of immobilization, contains terpenes which are responsible for the attributed dinstict aroma of the food containing pissa Pafou. Furthermore, the phenolic component of pissa Pafou has antimicrobial attributes that help the products produced with pissa Pafou to have the minimum spoilage. The production of yogurt with the use of free and immobilized cells of Lactobacillus casei in pissa Pafou was studied. The high levels of the immobilized cells survival (>10 6 ) suggest that yogurts can be clearly characterized as probiotic. In the same way, the feuture of probiotic is given to the white brine cheeses, the whey cheeses and the whey beverages produced by the use of immobilized cells of Lactobacillus casei in pissa Pafou. The products presented good physicochemical and microbiological features with a total absence of pathogenic microorganisms during the time of their maintenance at 4 C. 2

19 ΛΕΞΕΙΣ-ΚΛΕΙΔΙΑ Pistacia terebinthus, πίσσα Πάφου, ακινητοποίηση, L. casei, γαλακτοκομικά προϊόντα, GC/MS KEYWORDS Pistacia terebinthus, pissa Pafou, immobilization, L. casei, dairy products, GC/MS 3

20 ΛΙΣΤΑ ΣΥΝΤΟΜΕΥΣΕΩΝ B. animalis ssp. Lactis. Bifidobacterium animalis ssp Lactis B. lactis Bifidobacterium lactis B. bifidum Bifidobacterium bifidum B. infantis Bifidobacterium infantis C. difficile Clostridium difficile E. aerogenes Enterobacter aerogenes E. coli Escherichia coli L. casei Lactobacillus casei L. monocytogenes Listeria monocytogenes L. acidophilus Lactobacillus acidophilus L. brevis Lactobacillus brevis L. buchneri Lactobacillus buchneri L. delbrueckii subsp. bulgaricus Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus L. fermentum Lactobacillus fermentum L. kefirafaciens Lactobacillus kefirafaciens L. lactis Lactobacillus lactis L. plantarum Lactobacillus plantarum L. reuteri Lactobacillus reuteri L. rhamnosus Lactobacillus rhamnosus L. salivarius Lactobacillus salivarius S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae S. enteritidis Salmonella enteritidis S. thermophilus Streptococcus thermophilus St. aureus Staphylococcus aureus 4

21 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ, ΣΧΗΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΕΙΚΟΝΩΝ ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ Πίνακας 1. Μέση χημική σύσταση του γάλακτος αγελάδας, αίγας, προβάτου και γυναίκας (g/100ml) Πίνακας 2. Ημερήσιες ανάγκες του ανθρώπου σε ορισμένα θρεπτικά συστατικά και ποσοστό καλύψεώς τους από το γάλα αγελάδας Πίνακας 3. Τυπική σύσταση γλυκού και όξινου τυρογάλακτος Πίνακας 4. Θρεπτική αξία τυριού φέτα και σκληρού τυριού συγκριτικά με τα αυγά και το κρέας Πίνακας 5. Παραδείγματα λειτουργικών τροφίμων και αντίστοιχες πιθανές ευεργετικές επιδράσεις, από την κατανάλωσή τους, στον ανθρώπινο οργανισμό Πίνακας 6. Εμπορικά προϊόντα προβιοτικών τροφίμων Πίνακας 7. Παραδείγματα ακινητοποίησης προβιοτικών κυττάρων σε πολυμερή Πίνακας 8. Χαρακτηριστικά παραδείγματα χρήσης ακινητοποιημένων προβιοτικών κυττάρων στη παραγωγή τροφίμων Πίνακας 9. Ταξινόμηση των τερπενίων Πίνακας 10. Παραδείγματα άκυκλων μονοτερπενίων σε φυτά Πίνακας 11. Παραδείγματα μονοκυκλικών μονοτερπενίων σε φυτά Πίνακας 12. Παραδείγματα δικυκλικών μονοτερπενίων σε φυτά Πίνακας 13. Τιμή ph, τιτλοδοτούμενη οξύτητα, λακτόζη, γαλακτόζη και γαλακτικό οξύ παραγόμενων γιαουρτιών συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Πίνακας 14. Πληθυσμοί ολικής μεσόφιλης χλωρίδας (ΟΜΧ), S. thermophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. casei, κολοβακτηρίων, εντεροβακτηρίων, ζυμών-μυκήτων, σταφυλόκοκκων και σαλμονέλλας στα παραγόμενα γιαούρτια συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C (log cfu/g) 5

22 Πίνακας 15. Τερπενικά συστατικά γιαουρτιού (στο % του συνόλου των προσδιοριζόμενων τερπενίων), που έχει παρασκευαστεί με προσθήκη 0,3 g ακινητοποιημένου βιοκαταλύτη σε 100 g προϊόντος με χρήση της τεχνικής SPME GC/MS Πίνακας 16. Χαρακτηριστικό άρωμα και κατώφλι αντίληψης ορισμένων μονοτερπενίων Πίνακας 17. Προκαταρκτική οργανοληπτική αξιολόγηση γιαουρτιών Πίνακας 18. Τιμή ph, τιτλοδοτούμενη οξύτητα παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Πίνακας 19. Υπολειπόμενη λακτόζη παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Πίνακας 20. Υγρασία και τέφρα παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Πίνακας 21. Ολική πρωτεΐνη παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Πίνακας 22. Πληθυσμοί ολικής μεσόφιλης χλωρίδας, λακτόκοκκων, λακτοβάκιλλων, L. casei, κολοβακτηρίων, εντεροβακτηρίων, ζυμών-μυκήτων, σταφυλόκοκκων όλων των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C (log cfu/g) Πίνακας 23. Προκαταρκτική οργανοληπτική αξιολόγηση λευκών τυριών άλμης Πίνακας 24. Τιμή ph, οξύτητα, λακτόζη τυριών τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Πίνακας 25. Πληθυσμοί ολικής μεσόφιλης χλωρίδας, λακτόκοκκων, ζυμών-μυκήτων, σταφυλόκοκκων, κολοβακτηρίων, εντεροβακτηρίων και του L. casei σε τυριά τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C (log cfu/g προϊόντος) Πίνακας 26. Τερπενικά συστατικά τυριών τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» (στο % του συνόλου των προσδιοριζόμενων τερπενίων), που έχει παρασκευαστεί με προσθήκη 0,5 g ακινητοποιημένου βιοκαταλύτη σε 100 g προϊόντος με χρήση της τεχνικής SPME GC/MS Πίνακας 27. Προκαταρκτική οργανοληπτική αξιολόγηση τυριών τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» 6

23 Πίνακας 28. Τιμή ph, οξύτητα, γλυκόζη, γαλακτόζη, αιθανόλη, άθροισμα λακτόζης και σουκρόζης παραγόμενων ροφημάτων συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C. Πίνακας 29. Πληθυσμοί γαλακτοβάκιλλων, ζυμών-μυκήτων, σταφυλόκκων, κολοβακτηρίων, εντεροβακτηρίων και σαλμονέλλας σε ροφήματα τυρογάλακτος συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C (log cfu/ml προϊόντος) Πίνακας 30. Τερπενικά συστατικά ροφήματος τυρογάλακτος (στο % του συνόλου των προσδιοριζόμενων τερπενίων), που έχει παρασκευαστεί με προσθήκη 0,6 g ακινητοποιημένου βιοκαταλύτη σε 100 ml προϊόντος με χρήση της τεχνικής SPME GC/MS Πίνακας 31. Προκαταρκτική οργανοληπτική αξιολόγηση ροφημάτων τυρογάλακτος ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΣΧΗΜΑΤΩΝ Σχήμα 1. Ζύμωση της γλυκόζης από οξυγαλακτικά βακτήρια Σχήμα 2. Πιθανοί μηχανισμοί δράσης των προβιοτικών Σχήμα 3. Μεταβολή της σκληρότητας της πίσσας Πάφου συναρτήσει της θερμοκρασίας Σχήμα 4. Μεταβολή της ρευστότητας της πίσσας Πάφου συναρτήσει της μεταβολής της θερμοκρασίας Σχήμα 5. Βιοσύνθεση τερπενίων σε φυτά Σχήμα 6. Πειραματική πορεία που ακολουθήθηκε κατά την εκπόνηση της διδακτορικής διατριβής Σχήμα 7. Μικροφωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σάρωσης (σε μεγενθύσεις 1700 και 6500) κυττάρων L. casei ακινητοποιημένων σε πίσσα Πάφου Σχήμα 8. Μεταβολή της τιμής του ph των παραγόμενων γιαουρτιών συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Σχήμα 9. Μεταβολή της οξύτητας των παραγόμενων γιαουρτιών συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Σχήμα 10. Μεταβολή του γαλακτικού οξέος των παραγόμενων γιαουρτιών συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C 7

24 Σχήμα 11. Μεταβολή της λακτόζης των παραγόμενων γιαουρτιών συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Σχήμα 12. Μεταβολή της γαλακτόζης των παραγόμενων γιαουρτιών συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Σχήμα 13. Μεταβολή της συναίρεσης των παραγόμενων γιαουρτιών συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Σχήμα 14. Μεταβολή του πληθυσμού κυττάρων L. casei στα παραγόμενα γιαούρτια συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Σχήμα 15. Βιωσιμότητα κυττάρων L. casei στα παραγόμενα γιαούρτια κατά τις εξήντα ημέρες αποθήκευσής τους στους 4 C Σχήμα 16. Οι κυριότερες αρωματικές ενώσεις που απαντώνται στο γιαούρτι Σχήμα 17. Κατανομή τερπενίων σε γιαούρτι που περιέχει πίσσα Πάφου Σχήμα 18. Μεταβολή της τιμής του ph των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Σχήμα 19. Μεταβολή της οξύτητας των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Σχήμα 20. Μεταβολή της υπολειπόμενης λακτόζης των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Σχήμα 21. Μεταβολή της υγρασίας των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Σχήμα 22. Μεταβολή της τέφρας των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Σχήμα 23. Μεταβολή της ολικής πρωτεΐνης των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Σχήμα 24. Μεταβολή της ολικής μεσόφιλης χλωρίδας των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Σχήμα 25. Μεταβολή των λακτόκοκκων των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C 8

25 Σχήμα 26. Μεταβολή των λακτοβάκιλλων των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Σχήμα 27. Μεταβολή των ζυμών-μυκήτων των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Σχήμα 28. Μεταβολή των σταφυλόκοκκων των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Σχήμα 29. Πληθυσμοί κυττάρων L. casei στα παραγόμενα λευκά τυριά άλμης κατά τις ενενήντα ημέρες αποθήκευσής τους στους 4 C Σχήμα 30. Βιωσιμότητα κυττάρων L. casei στα παραγόμενα λευκά τυριά άλμης κατά τις ενενήντα ημέρες αποθήκευσής τους στους 4 C Σχήμα 31. Μεταβολή της τιμής του ph τυριών τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Σχήμα 32. Μεταβολή της οξύτητας τυριών τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Σχήμα 33. Μεταβολή της υπολειπόμενης λακτόζης τυριών τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Σχήμα 34. Μεταβολή του πληθυσμού L. casei σε τυριά τυρογάλακτος κατά την αποθήκευσή τους στους 4 C για 20 ημέρες Σχήμα 35. Βιωσιμότητα L. casei σε τυριά τυρογάλακτος κατά την αποθήκευσή τους στους 4 C για 20 ημέρες Σχήμα 36. Κατανομή τερπενίων σε τυρί τυρογάλακτος που περιέχει πίσσα Πάφου Σχήμα 37. Κατανομή τερπενίων σε ρόφημα τυρογάλακτος που περιέχει πίσσα Πάφου ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΕΙΚΟΝΩΝ Εικόνα 1. Pistacia terebinthus Εικόνα 2. Πίσσα Πάφου Εικόνα 3. Ισοπρένιο (2-μέθυλο-1,3-βουταδιένιο) 9

26 10

27 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ... vii THREE-MEMBER ADVISORY COMMITTEE... viii ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ... ix ΠΡΟΛΟΓΟΣ... xv ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 1 ABSTRACT... 2 ΛΕΞΕΙΣ-ΚΛΕΙΔΙΑ... 3 KEYWORDS... 3 ΛΙΣΤΑ ΣΥΝΤΟΜΕΥΣΕΩΝ... 4 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ, ΣΧΗΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΕΙΚΟΝΩΝ... 5 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΓΑΛΑ ΚΑΙ ΤΥΡΟΓΑΛΑ Χημικές και φυσικές ιδιότητες του γάλακτος Θρεπτική αξία του γάλακτος Χημική σύσταση και χρήσεις του τυρογάλακτος ΜΙΚΡΟΧΛΩΡΙΔΑ ΤΟΥ ΕΝΤΕΡΟΥ ΟΞΥΓΑΛΑΚΤΙΚΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ Γαλακτοβάκιλλοι Lactobacillus casei ΖΥΜΩΜΕΝΑ ΓΑΛΑΚΤΟΚΟΜΙΚΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ Γιαούρτι Διαδικασία παρασκευής γιαουρτιού Τυρί και τυρί τυρογάλακτος Είδη και σύνθεση τυριών Διαδικασία παρασκευής τυριού Θρεπτική αξία τυριού Μικροβιολογία τυριών Μη αρχικές γαλακτικές καλλιέργειες στην τυροκομία Καλλιέργειες εκκίνησης στην τυροκομία Τυριά τυρογάλακτος Μυζήθρα

28 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 4.4. Ροφήματα τυρογάλακτος ΝΕΑ ΤΡΟΦΙΜΑ (Novel foods) Λειτουργικά τρόφιμα Παραδείγματα λειτουργικών τροφίμων Προβιοτικοί μικροοργανισμοί και προβιοτικά τρόφιμα Χαρακτηριστικά ιδανικών προβιοτικών μικροοργανισμών Ο ρόλος των προβιοτικών προϊόντων στην ανθρώπινη υγεία Τα προβιοτικά προϊόντα στην αγορά ΑΚΙΝΗΤΟΠΟΙΗΣΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Μέθοδοι ακινητοποίησης κυττάρων Προσρόφηση ή προσκόλληση σε επιφάνεια Εγκλεισμός σε μήτρα ή πολυμερικό πλέγμα Δημιουργία συσσωματωμάτων Μηχανική συγκράτηση Ενθυλάκωση Υποστρώματα για την ακινητοποίηση κυττάρων ΠΙΣΣΑ ΠΑΦΟΥ (Pistacia terebinthus) Το δέντρο τερέβινθος Χρήσεις της Pistacia terebinthus Ιδιότητες της πίσσας Πάφου ΤΕΡΠΕΝΙΑ Βιοσύνθεση τερπενίων Μονοτερπένια ΣΤΟΧΟΙ ΤΗΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ Β. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Όργανα-Συσκευές Παραγωγή βιομάζας του μικροοργανισμού L. casei Πίσσα Πάφου Ακινητοποίηση κυττάρων L. casei στην πίσσα Πάφου Ποιοτικός προσδιορισμός ακινητοποιημένων κυττάρων L. casei σε πίσσα Πάφου

29 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Ποσοτικός προσδιορισμός ακινητοποιημένων κυττάρων L. casei σε πίσσα Πάφου Παραγωγή γιαουρτιού με χρήση ακινητοποιημένων κυττάρων L. casei σε πίσσα Πάφου Παραγωγή λευκού τυριού άλμης με χρήση ακινητοποιημένων κυττάρων L. casei σε πίσσα Πάφου Παραγωγή τυριού τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» με χρήση ακινητοποιημένων κυττάρων L. casei σε πίσσα Πάφου Παραγωγή ροφημάτων τυρογάλακτος με χρήση ακινητοποιημένων κυττάρων L. casei σε πίσσα Πάφου Χημικές αναλύσεις που πραγματοποιήθηκαν στα παραγόμενα προϊόντα Προσδιορισμός της τιμής ph Προσδιορισμός τιτλοδοτούμενης οξύτητας Προσδιορισμός συναίρεσης σε γιαούρτια Προσδιορισμός γαλακτικού οξέος Προσδιορισμός σακχάρων Προσδιορισμός λίπους Προσδιορισμός τέφρας Προσδιορισμός υγρασίας Προσδιορισμός ολικής πρωτεΐνης με τη μέθοδο Kjeldahl Προσδιορισμός αιθανόλης Προσδιορισμός πτητικών συστατικών Μικροβιολογικές αναλύσεις Στατιστική επεξεργασία αποτελεσμάτων Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Ακινητοποίηση κυττάρων L. casei σε πίσσα Πάφου Ποιοτικός προσδιορισμός ακινητοποίησης κυττάρων L. casei σε πίσσα Πάφου με τη χρήση ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σάρωσης (SEM) Ποσοτικός προσδιορισμός ακινητοποίησης κυττάρων L. casei σε πίσσα Πάφου Γιαούρτια Φυσικοχημικά χαρακτηριστικά παραγόμενων γιαουρτιών Συναίρεση

30 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Μικροβιολογικό προφίλ παραγόμενων γιαουρτιών Αρωματικό προφίλ παραγόμενων γιαουρτιών Προκαταρκτική οργανοληπτική αξιολόγηση γιαουρτιών Συμπέρασμα για τα γιαούρτια Λευκά τυριά άλμης Φυσικοχημικά χαρακτηριστικά λευκών τυριών άλμης Μικροβιολογικό προφίλ λευκών τυριών άλμης Προκαταρκτική οργανοληπτική αξιολόγηση λευκών άλμης Συμπέρασμα για τα λευκά τυριά άλμης Τυρί τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» Φυσικοχημικά χαρακτηριστικά τυριών τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» Μικροβιολογικό προφίλ τυριών τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» Αρωματικό προφίλ τυριών τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» Προκαταρκτική οργανοληπτική αξιολόγηση τυριών τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» Συμπέρασμα για τα τυριά τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» Ροφήματα τυρογάλακτος Φυσικοχημικά χαρακτηριστικά ροφημάτων τυρογάλακτος Μικροβιολογικό προφίλ ροφημάτων τυρογάλακτος Αρωματικό προφίλ ροφημάτων τυρογάλακτος Προκαταρκτική οργανοληπτική αξιολόγηση ροφημάτων τυρογάλακτος Συμπέρασμα για τα ροφήματα τυρογάλακτος Δ. ΓΕΝΙΚΟ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ E. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Αναφορές σε διεθνή επιστημονικά περιοδικά Αναφορές σε ελληνική βιβλιογραφία Αναφορές σε ξένη βιβλιογραφία Αναφορές σε ιστοσελίδες του διαδικτύου

31 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 15

32 16 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

33 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. ΓΑΛΑ ΚΑΙ ΤΥΡΟΓΑΛΑ Ο Ελληνικός Κώδικας Τροφίμων, Ποτών και Αντικειμένων κοινής χρήσης στο άρθρο 80, 1 ορίζει ότι: «Γάλα» είναι το απαλλαγμένο από πρωτόγαλα προϊόν του ολοσχερούς, χωρίς διακοπή αρμέγματος υγιούς γαλακτοφόρου ζώου, που ζει και τρέφεται υπό υγιεινούς όρους και που δεν βρίσκεται σε κατάσταση υπερκόπωσης. Με τον όρο "γάλα" απλά, χωρίς να συνοδεύεται αυτό από κάποιο επίθετο, νοείται αποκλειστικά και μόνο το γάλα το οποίο: α) Προέρχεται από αγελάδα, β) Είναι νωπό, γ) Είναι πλήρες, δ) Δεν έχει υποστεί αφυδάτωση ή συμπύκνωση, ε) Δεν περιέχει άλλες ύλες που έχουν προστεθεί από έξω». Στην περίπτωση που το γάλα δεν προέρχεται από αγελάδα, θα πρέπει να προσονομάζεται με ένα από τους όρους "Κατσίκας", "Προβάτου", "Βουβάλου" ή "Ανάμικτο Προβάτου-Κατσίκας" (Ελληνικός Κώδικας Τροφίμων, Ποτών και Αντικειμένων κοινής χρήσης άρθρο 80, 2). Σύμφωνα με τον ορισμό που αποδίδουν στο γάλα οι οργανισμοί FAO 1 /WHO 2 (1999) 3 «γάλα είναι το φυσιολογικό έκκριμα του μαστού γαλακτοφόρων ζώων, που παίρνεται από μία ή δύο αμέλξεις, χωρίς να προστεθεί ή να αφαιρεθεί τίποτε και που προορίζεται για κατανάλωση ως γάλα σε υγρή μορφή είτε για περαιτέρω διαδικασία». Ως τυρόγαλα αναφέρεται το υδαρές μέρος του γάλακτος που απομένει μετά την αφαίρεση του πήγματος που προκύπτει από την πήξη του γάλακτος με χρήση οξέος ή με χρήση πρωτεολυτικών ενζύμων. 1 Οργανισμός Τροφίμων και Γεωργίας των Ηνωμένων Εθνών (Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO) 2 Παγκόσμιος οργανισμός υγείας, (World Health Organization, WHO) 3 Γενικό πρότυπο του Codex Alimentarius για τη χρήση των γαλακτοκομικών όρων (Codex General Standard for the use of dairy terms), (CODEX STAN ), 2.1 Σημειώνεται ότι ο Codex Alimentarius είναι ένα διεθνές όργανο το οποίο δημιουργήθηκε τo 1961 από τον Οργανισμό Τροφίμων και Γεωργίας των Ηνωμένων Εθνών (FAO) και τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (WHO) για να αναπτύξει πρότυπα (standards), κώδικες πρακτικής και κατευθυντήριες γραμμές για όλη τη διατροφική αλυσίδα, με σκοπό την προστασία της υγείας των καταναλωτών και την εξασφάλιση ορθών πρακτικών στο εμπόριο τροφίμων. Τα πρότυπα, οι κατευθυντήριες γραμμές και οι κώδικες πρακτικής που υιοθετεί η επιτροπή του Codex Alimentarius είναι προαιρετικά κείμενα, δεν αποτελούν νομοθετήματα και δεν περιέχουν προθεσμίες ή ημερομηνίες εφαρμογής ή εναρμόνισης, ούτε μπορεί η Επιτροπή του Codex Alimentarius να τα μετατρέψει σε δεσμευτική νομοθεσία. Ο ΕΦΕΤ (Ενιαίος Φορέας Τροφίμων), με την ΚΥΑ 349 ΦΕΚ183/Β'/ , ορίσθηκε ως Εθνικό Σημείο Επαφής του Codex Alimentarius στην Ελλάδα. 17

34 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ο τύπος και η σύνθεση του τυρογάλακτος έγκειται στην τεχνική πήξης του γάλακτος. Ο συνηθέστερος τύπος τυρογάλακτος προκύπτει από την επεξεργασία τυριού που υπόκειται σε πήξη με πυτιά. Ο τύπος αυτός ονομάζεται γλυκό τυρόγαλα διότι η πήξη λαμβάνει χώρα σε τιμή ph 6,5. Στην περίπτωση που η καζεΐνη του γάλακτος καθιζάνει με προσθήκη οργανικών ή ανόργανων οξέων, το λαμβανόμενο τυρόγαλα ονομάζεται όξινο και έχει τιμή ph <5 (Kosseva και συνεργάτες, 2009) Χημικές και φυσικές ιδιότητες του γάλακτος Το γάλα αποτελείται κυρίως από λίπη, πρωτεΐνες, λακτόζη και ανόργανα άλατα, τα οποία ανάλογα με την προέλευση του γάλακτος παρουσιάζουν σημαντικές διαφορές στην εκατοστιαία αναλογία τους (Πίνακας 1). Πίνακας 1. Μέση χημική σύσταση του γάλακτος αγελάδας, αίγας, προβάτου και γυναίκας (g/100ml) (Μάντης 2000) Είδος Συνολικά Πρωτεΐνες Λίπος Καζεΐνη γάλακτος στερεά ορού Λακτόζη Τέφρα Αγελαδινό 12,7 3,7 2,8 0,6 4,8 0,7 Γίδινο 13,2 4,5 2,5 0,4 4,1 0,8 Πρόβειο 19,3 7,4 4,6 0,9 4,8 1,0 Ανθρώπινο 12,4 3,8 0,4 0,6 7,0 0,2 Το λίπος του γάλακτος είναι μορφοποιημένο σε λιποσφαίρια, τα οποία στο μεγαλύτερο μέρος τους (95-96%) αποτελούνται από τριγλυκερίδια. Οι καζεΐνες αποτελούν το 75-80% των πρωτεϊνών του γάλακτος και με βάση τη διάταξη των αμινοξέων στο μόριό τους διακρίνονται σε as1, as2, β και κ-καζεΐνες. Είναι φωσφοπρωτεΐνες και καθιζάνουν ύστερα από οξίνιση του γάλακτος σε τιμή ph 4,6 και σε θερμοκρασία 20 C. Απαντούν στο γάλα σε μορφή συμπλόκων μορίων των as1-as2, β-και κ-καζεϊνών, τα οποία καλούνται μικέλλες και βρίσκονται σε κολλοειδή διασπορά στην υδάτινη φάση. Οι μικέλλες αποτελούνται κατά 93% από καζεΐνες και κατά το υπόλοιπο από ανόργανη ύλη. Κύριο συστατικό της ανόργανης ύλης αποτελούν ο φώσφορος και το ασβέστιο τα οποία απαντούν κυρίως με τη μορφή φωσφορικού ασβεστίου και συμβάλλουν στο σχηματισμό και τη διατήρηση του σχήματος των μικκελλών. 18

35 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι κυριότερες πρωτεΐνες που απομένουν στο τυρόγαλα, μετά από την καθίζηση των καζεϊνών είναι η οροαλβουμίνη, η λακταλβουμίνη, η β-λακτογλοβουλίνη και οι ανοσοσφαιρίνες. Η λακτόζη είναι το κύριο σάκχαρο του γάλακτος των θηλαστικών. Είναι ένας δισακχαρίτης που αποτελείται από ένα μόριο D-γλυκόζης και ένα μόριο D- γαλακτόζης, ενωμένα μεταξύ τους με β-1 4 γλυκοζιτικό δεσμό. Το γάλα περιέχει αρκετά μεταλλικά στοιχεία, είτε σε ιονική μορφή, είτε δεσμευμένα σε άλλα συστατικά είτε τέλος σε μορφή οργανικών η ανόργανων αλάτων. Από τα κατιόντα τα κυριότερα είναι το Ca 2+, το Na 2+, το Κ + και το Mg 2+, ενώ από τα ανιόντα το Cl - 3-, τα PΟ 4 και τα κιτρικά. Επιπλέον, περιέχει όλες σχεδόν τις βιταμίνες. Από τις λιποδιαλυτές βιταμίνες, η Α υπάρχει κυρίως ως εστέρας του παλμιτικού οξέος και η D ως μίγμα D2 και D3. Η βιταμίνη Ε απαντά κυρίως ως α-τοκοφερόλη και η βιταμίνη Κ ανευρίσκεται μόνο σε ίχνη. Από τις υδατοδιαλυτές βιταμίνες ανευρίσκονται στο γάλα οι: Β1 (θειαμίνη), Β2 (ριβοφλαβίνη), Β12, το νικοτινικό οξύ και το παντοθενικό οξύ. Στο γάλα απαντώται ενδογενώς και ορισμένα ένζυμα, εκ των οποίων τα πιο γνωστά είναι η υπεροξειδάση, η καταλάση, οι φωσφατάσες, οι λιπάσες και οι πρωτεάσες. Όσον αφορά στα φυσικά χαρακτηριστικά του γάλακτος, το χρώμα του είναι λευκωπό, λευκοκίτρινο ή κυανόλευκο ανάλογα με το είδος του ζώου και την ύπαρξη χρωστικών (οι οποίες προέρχονται από τη βοσκή των ζώων). Το χρώμα είναι αποτέλεσμα της σκέδασης και απορρόφησης του φωτός από τα λιποσφαιρίδια και τις μικέλλες της καζεΐνης. Το γάλα έχει γλυκίζουσα γεύση χωρίς ιδιαίτερη οσμή. Έχει πυκνότητα μεταξύ 1,029 g/ml και 1,039 g/ml στους 15 C, σημείο πήξεως μεταξύ του -0,53 C και -0,55 C και τιμή ph 6,5-6,75. 19

36 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.2. Θρεπτική αξία του γάλακτος Το γάλα αποτελεί μία από τις σημαντικότερες πηγές πρωτεϊνών υψηλής βιολογικής αξίας 4, ασβεστίου, φωσφόρου και βιταμινών. Ένα λίτρο γάλακτος μπορεί να καλύψει σημαντικό μέρος από τις ημερήσιες ανάγκες του ανθρώπου σε ορισμένα θρεπτικά συστατικά, όπως φαίνεται στον Πίνακα 2. Πίνακας 2. Ημερήσιες ανάγκες του ανθρώπου σε ορισμένα θρεπτικά συστατικά και ποσοστό καλύψεώς τους από το γάλα αγελάδας (Μάντης 2000) Συστατικά Ημερήσιες ανάγκες οργανισμού Ποσοστό καλύψεως ημερήσιων αναγκών θρεπτικών συστατικών με κατανάλωση ενός λίτρου γάλακτος παιδιά 5 ετών ενήλικες Παιδιά 5 ετών ενήλικες Ενέργεια 1500 cal 2800 cal 40% 22% Πρωτεΐνες 50 g 70 g 70% 45% Ασβέστιο 0,8 g 0,8 g >100% >100% Φώσφορος 0,8 g 1,0 g >100% >100% Σίδηρος 10 mg 15 mg 10% 6% Βιταμίνη Α U.I U.I. 40% 40% Βιταμίνη D 450 U.I. - 5% - Βιταμίνη B1 6 0,7 mg 1,5 mg 60% 30% Βιταμίνη B2 7 1,3 mg 2,5 mg >100% 60% Βιταμίνη PP 8 9,0 mg 15 mg 12% 8% Βιταμίνη C 50 mg 75 mg 40% 25% 4 Πρωτεΐνες που αποτελούνται κυρίως από απαραίτητα αμινοξέα (αμινοξέα που δε παράγονται από τον οργανισμό και πρέπει να λαμβάνονται μέσω της διατροφής) 5 Η μονάδα μέτρησης των βιταμινών Α και D είναι η Διεθνής Μονάδα (IU, international unit) και βασίζεται σε μία καθορισμένη βιολογική δραστικότητα των βιταμινών. Η δραστικότητα των βιταμινών Ε και Κ καθώς και εκείνη των υδατοδιαλυτών βιταμινών B και C εκφράζονται σε mg. 6 θειαμίνη 7 ριβοφλαβίνη 8 νιασίνη ή νικοτινικό οξύ ή βιταμίνη Β3 20

37 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.3. Χημική σύσταση και χρήσεις του τυρογάλακτος Το τυρόγαλα έχει πολύ υψηλές τιμές βιοχημικά απαιτούμενου οξυγόνου (BOD) που κυμαίνονται μεταξύ g/l, καθώς και χημικά απαιτούμενου οξυγόνου (COD) μεταξύ g/l, γεγονός που το καθιστά ρυπαντή του περιβάλλοντος όταν απορρίπτεται στο περιβάλλον χωρίς ειδική επεξεργασία (Guimarães και συνεργάτες, 2010). Σημειώνεται ότι οι μονάδες επεξεργασίας γάλακτος υποχρεούνται στη λειτουργία βιολογικού καθαρισμού στις εγκαταστάσεις τους σύμφωνα με το ΦΕΚ 192 /Β'/ Παρά το χαρακτηρισμό του ως ρυπαντή, το τυρόγαλα αποτελεί άριστο υπόστρωμα για την παραγωγή ποικίλων βιοπροϊόντων μέσω βιοτεχνολογικών εφαρμογών, δεδομένου ότι αποτελείται σε μεγάλο ποσοστό από λακτόζη, υδατοδιαλυτές βιταμίνες και πρωτεΐνες. Τα συστατικά αυτά είναι χρήσιμα για την ανάπτυξη μικροοργανισμών (Panesar και συνεργάτες, 2007). Σύμφωνα με την Kosseva και τους συνεργάτες της (2009), το 50% του τυρογάλακτος που παράγεται παγκοσμίως επεξεργάζεται κατάλληλα και μετατρέπεται σε διάφορα προϊόντα, εκ των οποίων το 45% χρησιμοποιείται απευθείας σε υγρή μορφή, το 30% σε μορφή σκόνης τυρογάλακτος, το 15% ως λακτόζη και παραπροϊόντα άνευ λακτόζης και το υπόλοιπο ως συμπυκνώματα πρωτεΐνης. Το τυρόγαλα έχει χρησιμοποιηθεί ως υπόστρωμα για παραγωγή πόσιμης και καύσιμης αλκοόλης (Athanasiadis και συνεργάτες, 2002 Kourkoutas και συνεργάτες, 2002 Petsas και συνεργάτες, 2002), παραγωγή γαλακτικού οξέος (Elezi και συνεργάτες, 2003 Kourkoutas και συνεργάτες, 2005), παρασκευή ζυμωμένου ροφήματος (Paraskevopoulou και συνεργάτες, 2003), παρασκευή ζύμης αρτοποιίας (Harta και συνεργάτες, 2004 Plessas και συνεργάτες, 2005 Plessas και συνεργάτες, 2007a,b), παραγωγή κιτρικού οξέος, βιοαερίου, μονοκυτταρικής πρωτεΐνης (Plessas και συνεργάτες, 2008), 21

38 ΕΙΣΑΓΩΓΗ καλλιέργεια προβιοτικών αρχικών καλλιεργειών και χρήση των καλλιεργειών αυτών σε ζυμούμενα προϊόντα γάλακτος (Kourkoutas και συνεργάτες, 2005) και στην ωρίμανση τυριών (Kourkoutas και συνεργάτες, 2006 Dimitrellou και συνεργάτες, 2007 Papavasiliou και συνεργάτες, 2008). Η χημική σύσταση του γλυκού και του όξινου τυρογάλακτος παρουσιάζεται στον Πίνακα 3. Πίνακας 3. Τυπική σύσταση γλυκού και όξινου τυρογάλακτος (Kosseva και συνεργάτες, 2009) Συστατικά Γλυκό τυρόγαλα (g/l) Όξινο τυρόγαλα (g/l) Ολικά στερεά 63,0-70,0 63,0-70,0 Λακτόζη 46,0-52,0 44,0-46,0 Πρωτεΐνη 6,0-10,0 6,0-8,0 Ασβέστιο 0,4-0,6 1,2-1,6 Φωσφορικά άλατα 1,0-3,0 2,0-4,5 Γαλακτικά άλατα 2,0 6,4 Χλωριούχα άλατα 1,1 1,1 22

39 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 2. ΜΙΚΡΟΧΛΩΡΙΔΑ ΤΟΥ ΕΝΤΕΡΟΥ Η μικροχλωρίδα του εντέρου αποτελείται από ωφέλιμα βακτήρια (γαλακτικά), και από βλαβερά βακτήρια (όπως το C. difficile). Τα ωφέλιμα και τα βλαβερά βακτήρια μπορούν να συνυπάρχουν, όμως τα ωφέλιμα επικρατούν σε υγιή άτομα. Μερικά είδη όπως ο L. acidophilus είναι μόνιμοι πληθυσμοί στο παχύ έντερο ενώ άλλα είδη όπως ο L. delbrueckii subsp. bulgaricus είναι προσωρινοί πληθυσμοί στο παχύ έντερο του ανθρώπου και απαιτείται η τακτική πρόσληψή τους από τις τροφές ή από διατροφικά συμπληρώματα. Η κύρια λειτουργία της γηγενούς μικροχλωρίδας του ανθρώπου είναι να ενισχύει το λειτουργικό φραγμό των βλεννογόνων επιφανειών. Οι επιθηλιακές βλεννογόνες επιφάνειες του γαστρεντερικού σωλήνα έρχονται σε επαφή με το εξωτερικό περιβάλλον και μέσω της διατροφής με τους εν δυνάμει παθογόνους μικροοργανισμούς. Έτσι τα γηγενή βακτήρια που υπάρχουν στο γαστρεντερικό σωλήνα εμποδίζουν την προσκόλληση των παθογόνων μικροοργανισμών στον οργανισμό (Κουτίνας και Κανελλάκη, 2009). Σύμφωνα με τον Salminen και τους συνεργάτες του (1996), η αλλαγή της μικροχλωρίδας του εντέρου λόγω ποικίλων παραγόντων όπως η ηλικία, το άγχος, η λήψη φαρμάκων και η κακή διατροφή μπορεί να οδηγήσει σε λοίμωξη από παθογόνους μικροοργανισμούς, σε ρευματοειδή αρθρίτιδα και σε αλλεργίες. Η πρόσληψη προβιοτικών βακτηρίων βοηθάει στην προστασία και στην αποκατάσταση της μικροχλωρίδας του εντέρου. 23

40 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 3. ΟΞΥΓΑΛΑΚΤΙΚΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ Τα οξυγαλακτικά βακτήρια είναι θετικά κατά Gram βακτήρια και ποικίλλουν σε μορφολογία από μακριά, λεπτά ραβδία μέχρι κοντούς κοκκοβάκιλλους, οι οποίοι συχνά σχηματίζουν αλυσίδες (Αγγελής, 2007). Ορισμένα είδη των οξυγαλακτικών βακτηρίων είναι αερόβια ενώ άλλα είναι αυστηρώς αναερόβια. Τα οξυγαλακτικά βακτήρια χαρακτηρίζονται γενικά ως μεσόφιλα, αλλά έχουν την ικανότητα να αναπτύσσονται σε θερμοκρασίες από 5 C έως 45 C. Η ιδανική τιμή ph για την ανάπτυξή τους είναι 5,5 με 5,8 ενώ κάποια είδη μπορούν να αναπτυχθούν και σε χαμηλότερη τιμή ph όπως το 3,2 ή σε υψηλότερη τιμή ph όπως το 9,6. Έχουν σύνθετες διατροφικές απαιτήσεις για αμινοξέα, πεπτίδια, βάσεις νουκλεοτιδίων, βιταμίνες, ανόργανα ιχνοστοιχεία, λιπαρά οξέα και σάκχαρα. Τα οξυγαλακτικά βακτήρια, με βάση τα τελικά προϊόντα καταβολισμού των σακχάρων μέσω της γαλακτικής ζύμωσης διαιρούνται σε δύο κατηγορίες, στα ομοζυμωτικά και στα ετεροζυμωτικά. Αρχικά, η λακτόζη εισέρχεται στο κυτταρόπλασμα των οξυγαλακτικών βακτηρίων μέσω της περμεάσης της λακτόζης και εκεί διασπάται από την β- γαλακτοσιδάση σε γλυκόζη και γαλακτόζη. Η γλυκόζη μετατρέπεται σε 6- φωσφορική γλυκόζη και εισέρχεται στη γλυκόλυση ή στη πορεία των φωσφορικών πεντοζών. Η γαλακτόζη μέσω της πορείας Leloir μετατρέπεται αρχικά σε 1- φωσφορική γαλακτόζη και στη συνέχεια σε 1-φωσφορική γλυκόζη, η οποία μετατρεπόμενη σε 6-φωσφορική γλυκόζη ακολουθεί τις ίδιες πορείες. Η πορεία που θα ακολουθηθεί σχετίζεται με τη φύση των οξυγαλακτικών βακτηρίων. Τα ομοζυμωτικά οξυγαλακτικά βακτήρια γλυκολύουν την γλυκόζη και παράγουν γαλακτικό οξύ μέσω της γλυκόλυσης. Συγκεκριμένα, η γλυκόζη μετατρέπεται αρχικά σε 6-φωσφορική γλυκόζη, μετά σε 6-φωσφορική φρουκτόζη και τελικά σε 1,6 διφωσφορική φρουκτόζη. Ακολουθεί διάσπαση της 1,6-διφωσφορικής φρουκτόζης σε δύο ισοτριόζες, την 3-φωσφογλυκεριναλδεύδη και την φωσφο-διυδροξυακετόνη, με τη δράση της 1,6-διφωσφορικής αλδολάσης. Η 3-φωσφογλυκεριναλδεύδη μετατρέπεται σε πυροσταφυλικό οξύ, το οποίο με το ένζυμο γαλακτική δεϋδρογονάση και με το συνένζυμο NADH 2 ανάγεται σε γαλακτικό οξύ (Σχήμα 1). Στη κατηγορία αυτή ανήκουν τα γένη Thermobacterium, Streptobacterium και 24

41 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ορισμένα στελέχη του Lactobacillus και Streptococcus (Stryer, 1997 Αγγελής, 2007 Kουτίνας και Κανελλάκη, 2009). Τα ετεροζυμωτικά οξυγαλακτικά βακτήρια, μετατρέπουν περίπου τη μισή ποσότητα της γλυκόζης σε γαλακτικό οξύ και την άλλη μισή σε CO 2, αιθανόλη και οξικό οξύ μέσω της πορείας των φωσφορικών πεντοζών. Πιο συγκεκριμένα, τα ετεροζυμωτικά βακτήρια οξειδώνουν τη 6-φωσφορική γλυκόζη προς 6-φωσφογλυκονικό οξύ και ακολουθεί αποκαρβοξυλίωση. Χρησιμοποιούν τη φωσφοροκετολάση και παράγουν ακέτυλοφωσφορικό οξύ και 3- φωσφογλυκεριναλδεύδη. Το ακέτυλοφωσφορικό οξύ, υπό αναερόβιες συνθήκες, μετατρέπεται σε αιθανόλη (Σχήμα 1). Στην κατηγορία αυτή ανήκουν τα γένη Betabacterium, Leuconostoc και μερικά στελέχη του Lactobacillus spp (Αγγελής, 2007). Γλυκόζη Ομοζυμωτικά βακτήρια Ετεροζυμωτικά βακτήρια Γλυκόζη-6-P Γλυκόζη-6-P CO 2 Φρουκτόζη-6-P 6-φωσφογλυκονικό οξύ 1,6 διφωσφορική φρουκτόζη 5-P-ριβουλόζη 5-P-ξυλουλόζη 3-P-γλυκεραλδεύδη P-διυδρόξυακετόνη 3-P γλυκεραλδεύδη Ακέτυλο-P οξύ Οξικό οξύ Η 2 Ο 2 πυροσταφυλικό οξύ Γαλακτικό οξύ Αιθανόλη 2 γαλακτικό οξύ Σχήμα 1. Ζύμωση της γλυκόζης από οξυγαλακτικά βακτήρια (τροποποιημένο από Caplice και Fitzgerald, 1999 Fugelsang και Edwards, 2007). 25

42 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 3.1. Γαλακτοβάκιλλοι Οι γαλακτοβάκιλλοι (βακτήρια του γένους Lactobacillus) ανήκουν στα οξυγαλακτικά βακτήρια. Είναι γηγενείς πληθυσμοί των βλεννογόνων επιφανειών του ανθρώπινου παχέος εντέρου και κόλπου (Κουτίνας και Κανελλάκη, 2009). Τα μέλη του γένους αυτού είναι ραβδία, που απαντούν κατά ζεύγη ή μικρές αλυσίδες, και σπανιότερα κοκκοβάκιλλοι. Είναι θετικά κατά Gram βακτήρια και συνήθως δεν έχουν τη δυνατότητα κίνησης (Αγγελής, 2007). Οι διατροφικές τους απαιτήσεις είναι σύνθετες και χαρακτηριστικές για τα διάφορα είδη και συμπεριλαμβάνουν αμινοξέα, πεπτίδια, παράγωγα νουκλεϊνικών οξέων, βιταμίνες, άλατα, λιπαρά οξέα, εστέρες λιπαρών οξέων και ζυμώσιμα σάκχαρα. Οι γαλακτοβάκιλλοι είναι προαιρετικά αναερόβια ή μικροαερόφιλα βακτήρια, αρνητικά σε καταλάση και δε διαθέτουν κυτοχρώματα. Το περιβάλλον ανάπτυξής τους είναι μεσόφιλο και ελαφρώς όξινο (ph 4,5-6,4). Το γένος αυτό περιλαμβάνει 106 αναγνωρισμένα είδη από τα οποία τα πιο γνωστά που έχουν απομονωθεί από το ανθρώπινο έντερο είναι τα εξής: τα L. acidophilus, L. salivarius, L. casei, L. plantarum, L. fermentum, L. reuteri και L. brevis (Vasiljevic και Shah, 2008). Οι γαλακτοβάκιλλοι διακρίνονται στις τρεις ακόλουθες κατηγορίες, ανάλογα με τα πρότυπα ζύμωσης που ακολουθούν: 1. Υποχρεωτικά ομοζυμωτικοί 2. Υποχρεωτικά ετεροζυμωτικοί 3. Προαιρετικά ετεροζυμωτικοί Οι υποχρεωτικά ομοζυμωτικοί γαλακτοβάκιλλοι μεταβολίζουν τα σάκχαρα (εξόζες) προς γαλακτικό οξύ μέσω της γλυκολυτικής οδού Embden-Meyerhof- Parnas. Σε αυτήν την περίπτωση το σάκχαρο μετατρέπεται σε ποσοστό της τάξης του 90% σε γαλακτικό οξύ. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν τα στελέχη των L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. lactis, L. acidophilus, L. delbrueckii και L. kefirafaciens. Οι υποχρεωτικά ετεροζυμωτικοί γαλακτοβάκιλλοι μεταβολίζουν τα σάκχαρα προς ίσες ποσότητες γαλακτικού οξέος, αιθανόλης και CO 2 μέσω της οδού των 26

43 ΕΙΣΑΓΩΓΗ φωσφορικών πεντοζών. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν τα στελέχη L. brevis και L. buchneri. Οι προαιρετικά ετεροζυμωτικοί γαλακτοβάκιλλοι ζυμώνουν τις εξόζες και παράγουν γαλακτικό οξύ. Ορισμένα είδη απουσία γλυκόζης στο υπόστρωμα παράγουν οξικό οξύ, αιθανόλη και μυρμικικό οξύ. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν τα στελέχη L. casei, L. rhamnosus και L. plantarum. Οι γαλακτοβάκιλλοι βρίσκουν πολλές εφαρμογές κυρίως στη βιομηχανία τροφίμων. Χρησιμοποιούνται στη παραγωγή ζυμωμένων τροφίμων φυτικής προελεύσεως, όπως ελιές και πίκλες, ή ζωϊκής προελεύσεως, όπως αλλαντικών, και γαλακτοκομικών προϊόντων. Χρησιμοποιούνται επίσης στη βιοτεχνολογική παραγωγή γαλακτικού οξέος το οποίο βρίσκει εφαρμογές ως πρόσθετο τροφίμων και ως πρώτη ύλη στην παραγωγή βιοπολυμερών (Αγγελής, 2007) Lactobacillus casei Ο L. casei είναι ένας θετικός κατά Gram μικροοργανισμός που ανήκει στο γένος των γαλακτοβάκιλλων. Τα κύτταρα του μικροοργανισμού έχουν ωοειδές σχήμα, με διαστάσεις 0,7-1,1 μm x 2,0-4,0 μm. Εμφανίζονται είτε μεμονωμένα, είτε σε ζεύγη είτε σε αλυσίδες. Βρίσκεται στα αναπαραγωγικά και εντερικά όργανα ανθρώπων και ζώων καθώς επίσης και σε εγκαταστάσεις παραγωγής ζυμωμένων γαλακτοκομικών προϊόντων. Ο L. casei διαθέτει έναν διαφορετικό τρόπο μεταφοράς και υδρόλυσης της λακτόζης συγκριτικά με άλλους λακτοβάκιλλους. Συγκεκριμένα η μεταφορά της λακτόζης πραγματοποιείται με φωσφορυλίωσή της μέσω ενός συστήματος φωσφοτρανσφεράσης. Η λακτόζη στη φωσφορυλιωμένη μορφή της υδρολύεται εντός του κυττάρου προς γλυκόζη και 6-P-γαλακτόζη με τη βοήθεια της γαλακτοϋδρολάσης που είναι μία β-d-φωσφορογαλακτοσιδάση (Αγγελής, 2007). Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι ο L. casei μεταβολίζει το 30% της λακτόζης για την παραγωγή 1,5% γαλακτικού οξέος (Rose, 1982). Ανήκει στους προαιρετικά ετεροζυμωτικούς μικροοργανισμούς. O L. casei έχει πλήθος εφαρμογών στη γαλακτοβιομηχανία, ως προβιοτική καλλιέργεια σε γαλακτοκομικά προϊόντα, ως αρχική καλλιέργεια για τη ζύμωση γάλακτος και ως ενισχυτής γεύσης σε ορισμένες ποικιλίες τυριών. 27

44 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 4. ΖΥΜΩΜΕΝΑ ΓΑΛΑΚΤΟΚΟΜΙΚΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ Η ζύμωση του γάλακτος για την παρασκευή γαλακτοκομικών προϊόντων ήταν γνωστή από την ελληνική αρχαιότητα και αποτελεί μέθοδο μακροπρόθεσμης συντήρησης αυτών των τροφίμων. Σύμφωνα με την ελληνική μυθολογία, η τέχνη της ζύμωσης του γάλακτος σε τυρί δόθηκε ως δώρο στους ανθρώπους από τους θεούς του Ολύμπου, οι οποίοι έστειλαν τον Αριστέα, γιο του θεού Απόλλωνα, να διδάξει στους ανθρώπους την τεχνολογία της παρασκευής τυριού. Σύμφωνα με τον Maher (2011) υπήρχε κατανάλωση γάλακτος και τυριού στην Ελλάδα από το 750 π.χ. Στην Οδύσσεια του Ομήρου (8 ος αιώνας π.χ.) γίνεται εκτεταμένη αναφορά στο τυρί που παρασκεύαζε ο κύκλωπας Πολύφημος (Σαμαρά και Τουπούζης, 2007). Ο Αθήναιος 9 (3 ος αιώνας μ.χ.) στο έργο του «Δειπνοσοφιστές» (Αθηναίου Δειπνοσοφισταί, 1836) κάνει λόγο για τον Αντιφάνη (408 π.χ.-334 π.χ.), κωμωδιογράφο της Μέσης Αττικής κωμωδίας, όπου στο έργο του «Παρασίτω» αναφέρει την κατανάλωση τυριού στο πρωινό. Επιπρόσθετα, ο Πλάτωνας στην «Πολιτεία» του (380 π.χ.) κάνει αναφορά στο τυρί (Ricotti, 2007). Ο Ηρόδοτος ( π.χ.) στο βιβλίο του Ιστορίαι, Βιβλίο Δ: Μελπομένη, (440 π.χ.) αναφέρει την παρασκευή ροφήματος από γάλα αλόγου, που καταναλωνόταν από τους Σκύθες (1). Εδώ και αιώνες η κατανάλωση του γάλακτος και των προϊόντων του συνηγορούν στη χρησιμότητά αυτών των προϊόντων. Με την πάροδο των χρόνων τεκμηριώθηκε η ευεργετική επίδραση των ζυμωμένων προϊόντων γάλακτος στην υγεία. Στις αρχές του 1900 ο Νομπελίστας Illya Metchnikoff παρατήρησε ότι ο μέσος όρος ζωής των Βουλγάρων βρισκόταν στα 87 έτη, κάτι εντελώς πρωτόγνωρο για εκείνη την εποχή, και επιπλέον ότι 4 στα 1000 άτομα στη Βουλγαρία ζούσαν πάνω από 100 έτη. Η κυριότερη διαφορά στον τρόπο διατροφής τους συγκριτικά με τη σημερινή δίαιτα ήταν η μεγάλη κατανάλωση ζυμωμένου γάλακτος (Vasiljevic και Shah, 2008). 9 Ο Αθήναιος (τέλος του 2ου αι. μ.χ./αρχές του 3ου αι. μ.χ.) ήταν αρχαίος Έλληνας φιλόσοφος και ρήτορας. Κυριότερο έργο του ήταν το τριαντάτομο «Δειπνοσοφισταί». 28

45 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ο Grigoroff το 1905 απομόνωσε από βουλγαρικό ξινόγαλα τον μικροοργανισμό L. delbrueckii subsp. bulgaricus και ταυτοποίησε τον S. thermophilus. Ακολούθησαν και άλλες έρευνες όπως αυτή του Minoru Shirota στην Ιαπωνία, ο οποίος αναγνώρισε τη σημαντικότητα της προληπτικής ιατρικής και της ρύθμισης της γαστροεντερικής μικροχλωρίδας (Vasiljevic και Shah, 2008). Το 1930, ο Minoru Shirota κατάφερε να απομονώσει και να καλλιεργήσει ένα είδος του Lactobacillus το οποίο ήταν ικανό να επιζεί στο πέρασμα διαμέσου του γαστρεντερικού σωλήνα. Η καλλιέργεια αυτή αναγνωρίστηκε ως L. casei, στέλεχος Shirota και ο Shirota την χρησιμοποίησε επιτυχώς για τη παραγωγή ζυμωμένου γαλακτοκομικού προϊόντος το οποίο ονομάστηκε «Yakult» και το οποίο κυκλοφόρησε από την ομώνυμη εταιρεία το Στα τέλη του 1950 και στις αρχές της δεκαετίας του 1960 αναζωπυρώθηκε το ενδιαφέρον για τα ζυμωμένα γαλακτοκομικά προϊόντα και εισήχθη ο όρος προβιοτικά τρόφιμα (Vasiljevic και Shah, 2008). Σήμερα, τα προβιοτικά τρόφιμα συμπεριλαμβάνονται στην κατηγορία των λειτουργικών τροφίμων Γιαούρτι Ο Ελληνικός Κώδικας Τροφίμων και Ποτών ( , άρθρο 82, 1) δίνει τον ακόλουθο ορισμό για το γιαούρτι: «Γιαούρτι (πλήρες ή κατά περίπτωση ημίαποβουτυρωμένο) (όνομα ζώου) χαρακτηρίζεται το προϊόν το οποίο προκύπτει μετά από πήξη αποκλειστικά και μόνο νωπού γάλακτος της αντίστοιχης προς την ονομασία φύσης και προέλευσης με την επίδραση καλλιέργειας ζύμης που προκαλεί ειδική γι αυτό ζύμωση». Σύμφωνα με τον Codex Alimentarius CODEX STAN , ως γιαούρτι ορίζεται το «πηγμένο γαλακτοκομικό προϊόν που παράγεται με γαλακτική ζύμωση του γάλακτος με τη δράση του L. delbrueckii subsp. bulgaricus και του S. thermophilus». 10 Βλέπε

46 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Διαδικασία παρασκευής γιαουρτιού Τα βασικά στάδια παρασκευής γιαουρτιού περιλαμβάνουν τη θέρμανση του γάλακτος, την προσθήκη οξυγαλακτικής καλλιέργειας, την επώαση, την πήξη και την ψύξη του τελικού προϊόντος. Αρχικά, το γάλα υφίσταται έντονη θερμική επεξεργασία στους 95 C για 5 min ή στους C για min. Ακολουθεί προσθήκη οξυγαλακτικής καλλιέργειας των μικροοργανισμών L. delbrueckii subsp. bulgaricus και S. thermophilus, οι οποίοι έχουν τα ακόλουθα χαρακτηριστικά (Κεχαγιάς 2011): Και οι δύο ζυμώνουν τη λακτόζη και παράγουν γαλακτικό οξύ. Ο S. thermophilus εμφανίζεται υπό την μορφή κόκκων, είναι θερμόφιλος, είναι αρκετά ευαίσθητος στα αντιβιοτικά, παράγει μέχρι 0,6% γαλακτικό οξύ και έχει μικρή πρωτεολυτική δραστικότητα. Ο L. delbrueckii subsp. bulgaricus εμφανίζεται υπό την μορφή ραβδίων, είναι θερμόφιλος, είναι λιγότερο ευαίσθητος στα αντιβιοτικά σε σύγκριση με τον S. thermophilus, παράγει γαλακτικό οξύ μέχρι 1,8% και έχει μεγαλύτερη πρωτεολυτική δραστικότητα από τον S. thermophilus. Επιπλέον, παράγει ακεταλδεΰδη, ουσία που προσδίδει το χαρακτηριστικό άρωμα στο γιαούρτι. Η σχέση μεταξύ των μικροοργανισμών L. delbrueckii subsp. bulgaricus και S. thermophilus στο γάλα είναι συνεργηστική. Αρχικά, ο L. delbrueckii subsp. bulgaricus διασπά την καζεΐνη σε πεπτίδια και αμινοξέα, τα οποία βοηθούν την ανάπτυξη του S. thermophilus. Στη συνέχεια, ο S. thermophilus παράγει μυρμηκικό οξύ και διοξείδιο του άνθρακα, τα οποία βοηθούν με τη σειρά τους στην ανάπτυξη του L. bulgaricus (Robinson, 2002). Μετά την προσθήκη της οξυγαλακτικής καλλιέργειας, ακολουθεί πήξιμο του γιαουρτιού με συνηθισμένη θερμοκρασία επώασης τους C για 2,5 με 3 h. Οι μικροοργανισμοί του γιαουρτιού ζυμώνουν τη λακτόζη προς γαλακτικό οξύ, γεγονός το οποίο προκαλεί πτώση της τιμής του ph του γάλακτος. Κατά την οξίνιση του γάλακτος έχουμε μια σταδιακή απομάκρυνση του ασβεστίου και του φωσφόρου από τις μικέλλες της καζεΐνης και μεταφορά τους στη διαλυτή φάση. Το γεγονός αυτό έχει ως αποτέλεσμα την έναρξη της αποσταθεροποίησης των καζεϊνών. Σε τιμές ph 5,2-5,3 αρχίζει η καθίζηση των καζεϊνών που ολοκληρώνεται 30

47 ΕΙΣΑΓΩΓΗ (με το σχηματισμό πήγματος) όταν η τιμή του ph φθάσει στο 4,6, που είναι το ισοηλεκτρικό σημείο των καζεϊνών. Η ψύξη είναι το τελευταίο στάδιο της επεξεργασίας του γάλακτος για την παρασκευή γιαουρτιού και αρχίζει με τη διακοπή της επώασης Θρεπτική αξία του γιαουρτιού Οι πρωτεΐνες που βρίσκονται στο γιαούρτι είναι περισσότερο αφομοιώσιμες από τον οργανισμό αφού έχουν υποστεί μεταβολές κατά το πήξιμο του γάλακτος. Στην καλύτερη αφομοιωσιμότητα των πρωτεϊνών από τον οργανισμό συμβάλλουν επίσης η χαμηλή τιμή ph του γιαουρτιού που επιταχύνει τη δράση των πεπτικών ενζύμων (πεψίνης) καθώς και η μερική πρωτεόλυση που έχουν υποστεί οι πρωτεΐνες από τα πρωτεολυτικά ένζυμα των μικροοργανισμών του γιαουρτιού. Υπάρχουν ενδείξεις ότι η πρόσληψη του ασβεστίου από τον οργανισμό διευκολύνεται από τη χαμηλή τιμή ph του γιαουρτιού. Το κολλοειδές φωσφορικό ασβέστιο που βρίσκεται στην καζεΐνη σε όξινο περιβάλλον μεταβάλλεται σε υδατοδιαλυτό και απορροφάται ευκολότερα από τον οργανισμό (Κεχαγιάς, 2011). Άλλες ευνοϊκές επιδράσεις στην υγεία είναι ότι με την κατανάλωση γιαουρτιού: i) παρεμποδίζεται η ανάπτυξη παθογόνων μικροοργανισμών στο πεπτικό σύστημα, ii) ενισχύεται το ανοσοποιητικό σύστημα, iii) αποκαθίσταται η ισορροπία της μικροχλωρίδας του εντέρου μετά από χορήγηση αντιβίωσης, iv) μειώνεται η πιθανότητα εμφάνισης καρκίνου, αφού έχει βρεθεί ότι οι μικροοργανισμοί του γιαουρτιού έχουν τη δυνατότητα διάσπασης τοξικών ουσιών Τυρί και τυρί τυρογάλακτος Ο Ελληνικός Κώδικας Τροφίμων και Ποτών ( , άρθρο 83, 1.1) ορίζει τα τυριά που παράγονται από γάλα και ωριμάζουν, ως «τα προϊόντα ωρίμανσης του πήγματος που είναι απαλλαγμένο από το τυρόγαλα, στον επιθυμητό κάθε φορά βαθμό και τα οποία παρασκευάστηκαν με την επενέργεια πυτιάς ή άλλων ενζύμων που δρουν ανάλογα σε γάλα (νωπό ή παστεριωμένο αγελάδος, προβάτου, κατσίκας, βουβάλου και μίγματα αυτών) ή σε μερικώς αποβουτυρωμένο γάλα ή σε μίγμα αυτών ή/και σε μίγματα αυτών με κρέμα γάλακτος (αφρόγαλα)». 31

48 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σύμφωνα με τον ορισμό του Codex Alimentarius (FAO/WHO, 1973) «Τυρί είναι το νωπό ή ώριμο προϊόν που προέρχεται από τη στράγγιση, ύστερα από πήξη του πλήρους, μερικώς αποβουτυρωμένου ή άπαχου γάλακτος ή βουτυρογάλακτος ή μίγματος ορισμένων ή όλων αυτών των προϊόντων». Σύμφωνα με τον Ελληνικό Κώδικα Τροφίμων και Ποτών ( , άρθρο 83, 3.1) ως τυριά τυρογάλακτος χαρακτηρίζονται τα τυριά, τα οποία λαμβάνονται με ισχυρή θέρμανση τυρογάλακτος (με ή χωρίς οξίνιση) και με ή χωρίς προσθήκη, α. γάλακτος (πρόσγαλα), β. γάλακτος και κρέμας γάλακτος (αφρόγαλα), γ. βρώσιμου χλωριούχου νατρίου, τα οποία μπορούν να διατεθούν νωπά (φρέσκα) [μερικά από αυτά μπορούν να διατεθούν και με μερική αφυδάτωση (ξερά) και άλλα κατόπιν ωρίμανσης] και των οποίων η υγρασία δεν υπερβαίνει το 70% Είδη και σύνθεση τυριών Σύμφωνα με τον Codex Alimentarius (Codex Stan CODEX GENERAL STANDARD FOR CHEESE), τα τυριά ταξινομούνται από πλευράς σκληρότητας, λιποπεριεκτικότητας και τρόπου ωρίμανσης ως ακολούθως: Τυριά με υγρασία μικρότερη του 51% χαρακτηρίζονται ως πολύ σκληρά, με υγρασία μεταξύ 49% και 56% σκληρά, με υγρασία μεταξύ 54% και 69% ημίσκληρα και με υγρασία μεγαλύτερη από 67% χαρακτηρίζονται ως μαλακά τυριά. Τυριά με λιποπεριεκτικότητα 11 μεγαλύτερη από 60% χαρακτηρίζονται ως πολύ λιπαρά, με λιποπεριεκτικότητα μεταξύ 45% και 60% ως πλήρους λιπαρότητας, μεταξύ 25% και 45% ως μέσης λιπαρότητας, μεταξύ 10% και 25% ως μερικώς αποβουτυρωμένα και με λιποπεριεκτικότητα μικρότερη του 10% χαρακτηρίζονται ως αποβουτυρωμένα. Ανάλογα με τον τρόπο ωρίμανσης των τυριών, αυτά χαρακτηρίζονται ως ωριμασθέντα, ωριμασθέντα με μύκητες, μη ωριμασθέντα (φρέσκα) και τυριά που ωριμάζουν και συντηρούνται σε άλμη. Η πιο γνωστή και διαδεδομένη κατηγορία τυριών είναι τα τυριά που παρασκευάζονται από γάλα το οποίο πήζει με τη δράση πυτιάς ή άλλων ενζύμων Λίπος στο ξηρό υπόλειμμα 12 Στο εμπόριο κυκλοφορεί φυτική πυτιά, που προέρχεται από τσουκνίδα, αγριαγκινάρα κ.ά. καθώς και μικροβιακή πυτιά που προέρχεται από διάφορα βακτήρια ή μύκητες. Συγκεκριμένα, αρκετά 32

49 ΕΙΣΑΓΩΓΗ που δρουν ανάλογα. Από το πήγμα που σχηματίζεται απομακρύνεται η υδατική φάση (τυρόγαλα), ανάλογα με το είδος του τυριού που πρόκειται να παρασκευαστεί (περισσότερο για την παρασκευή σκληρών τυριών και λιγότερο για την παρασκευή μαλακών). Το τυρόπηγμα, ανάλογα με το είδος του τυριού μπορεί να υποστεί ωρίμανση για να αποκτήσει τα επιθυμητά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά ή να μην υποστεί ωρίμανση και να καταναλωθεί φρέσκο Διαδικασία παρασκευής τυριού Η μετατροπή του γάλακτος σε τυρί μέχρι την τελική του μορφοποίηση περίπου μια μέρα ή λίγες μέρες μετά την παραγωγή του διέρχεται από μία σειρά φάσεων οι οποίες είναι οι εξής: προετοιμασία του γάλακτος (ποιοτικός έλεγχος, θερμική επεξεργασία), προσθήκη οξυγαλακτικής καλλιέργειας, πήξη του γάλακτος (με πυτιά ή με οξέα), διαίρεση του πήγματος, χειρισμός του τυροπήγματος (άμεση στράγγιση, θέρμανση, θερμική κατεργασία ώριμης τυρομάζας, πίεση τυριού), αλάτιση και ωρίμανση. Ανάλογα με το είδος του τυριού που παράγεται οι διάφορες φάσεις διαφέρουν μεταξύ τους ή και μπορεί να παραλειφθούν εντελώς (Ζερφυρίδης, 2001 Μάντης, 2000 Ανυφαντάκης, 2004). Το γάλα παστεριώνεται με τη μέθοδο HTST (High Temperature, Short Time) στους 72 C για 15 s. Σχετικά με τη θερμική επεξεργασία του γάλακτος για παρασκευή τυριών πρέπει να έχουμε υπόψη τα εξής: i) η θερμική επεξεργασία δεν πρέπει να είναι εντονότερη της παστερίωσης, γιατί μετουσιώνονται οι υδατοδιαλυτές πρωτεΐνες του γάλακτος και συγκεκριμένα η β-γαλακτογλοβουλίνη, η οποία αντιδρά με την κ-καζεΐνη και σχηματίζει σύμπλοκο που επηρεάζει δυσμενώς την αφυδάτωση του πήγματος και την υφή του τυριού στη συνέχεια, ii) με την παστερίωση του γάλακτος, παράλληλα με τους παθογόνους μικροοργανισμούς καταστρέφονται και τα υπόλοιπα βακτήρια που θα ήταν υπεύθυνα για την παραγωγή γαλακτικού οξέος από τη λακτόζη και το σχηματισμό της χαρακτηριστικής γεύσης του τυριού. Για το λόγο αυτό είναι απαραίτητη η προσθήκη οξυγαλακτικών καλλιεργειών στο γάλα που παστεριώνεται, iii) με την παστερίωση του γάλακτος ένα μέρος του διαλυτού διαδεδομένες είναι οι πρωτεϊνάσες από αγριαγκινάρα για την παρασκευή πορτογαλικών τυριών, όπως το Serra da Estrela. 33

50 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ασβεστίου αδιαλυτοποιείται, πράγμα που έχει ως αποτέλεσμα την επιμήκυνση του χρόνου πήξεως και την ελάττωση της συνεκτικότητας του τυροπήγματος. Το ασβέστιο ενισχύει τους υδρόφοβους δεσμούς που σχηματίζονται μεταξύ των καζεϊνών για τον σχηματισμό του πήγματος. Για το λόγο αυτό, στο γάλα που παστεριώνεται προστίθεται πριν την πήξη χλωριούχο ασβέστιο (Κεχαγιάς, 2011). Ο μηχανισμός πήξης του γάλακτος με την επίδραση της πυτιάς (χυμοσίνη) περιλαμβάνει το στάδιο της ειδικής πρωτεόλυσης και το μη ενζυμικό στάδιο. Κατά το στάδιο της ειδικής πρωτεόλυσης, η χυμοσίνη δρα εκλεκτικά πάνω σε ένα δεσμό της κ-καζεΐνης μέσα σε διάστημα λίγων λεπτών. Ο δεσμός που προσβάλλεται σπό τη χυμοσίνη είναι ο πεπτιδικός δεσμός μεταξύ φαινυλαλανίνης-μεθειονίνης στις θέσεις 105 και 106. Από την υδρόλυση παράγεται αδιάλυτη παρά-κ-καζεΐνη (παραμένει στο τυρόπηγμα) και ένα διαλυτό καζεϊνογλυκοπεπτίδιο (διαφεύγει στο τυρόγαλα), το οποίο περιέχει το 23-30% του ολικού αζώτου της κ-καζεΐνης. Κατά το δεύτερο μη ενζυματικό στάδιο, με τη βοήθεια των ιόντων ασβεστίου, οι αποσταθεροποιημένες λόγω υδρόλυσης της κ-καζεΐνης μικέλλες συνενώνονται και σχηματίζουν πρωτεϊνικό πλέγμα, στο οποίο εγκλωβίζονται τα υπόλοιπα συστατικά του γάλακτος και έτσι όλο το γάλα αποκτά μορφή πήγματος. Όταν ολοκληρωθεί η πήξη του γάλακτος το τυρόπηγμα διαιρείται σε κομμάτια σχήματος κύβου με ακμή 1-2 εκατοστά και αφήνεται σε ηρεμία για 10 λεπτά περίπου. Με τη διαίρεση του τυροπήγματος διευκολύνεται η έξοδος του τυρογάλακτος (αποβολή υγρασίας). Στη συνέχεια, το τυρόπηγμα μεταφέρεται σε καλούπια, γεγονός που ευνοεί τη στράγγιση και το σχηματισμό μικρών σχισμών μηχανικής προέλευσης. Τα καλούπια με το τυρόπηγμα μεταφέρονται ύστερα σε χώρο με θερμοκρασία 16 C, όπου παραμένουν για ώρες. Κατά την παραμονή τους αυτή αναστρέφονται περιοδικά για καλύτερη στράγγιση. Μετά τη στράγγιση και τη μορφοποίηση του τυριού ακολουθεί το αλάτισμα με προσθήκη κρυσταλλικού αλατιού κατά στρώσεις. Ακολούθως τα τεμάχια, αφού εκπλυθούν με άλμη τοποθετούνται σε λευκοσιδηρά δοχεία ή ξύλινα βαρέλια, καλύπτονται με άλμη 5-7% και παραμένουν προς ωρίμανση σε θερμοκρασία C για ημέρες περίπου. Μετά το χρονικό αυτό διάστημα τα τεμάχια τυριού μεταφέρονται σε ψυκτικούς θαλάμους θερμοκρασίας 3-4 C όπου παραμένουν για 1,5-2 μήνες ώστε να συμπληρωθεί η ωρίμανση. 34

51 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τέλος, το τυρί μεταφέρεται σε απολυμασμένα βαρέλια ή δοχεία στα οποία προστίθεται άλμη 6% μέχρι να καλυφθεί όλη η επιφάνεια του και είναι έτοιμο για διάθεση (Ζερφυρίδης, 2001 Μάντης, 2000) Θρεπτική αξία τυριού Το τυρί έχει υψηλή θρεπτική αξία. Ως τρόφιμο, το τυρί είναι εύπεπτο, συμπυκνωμένο και πλούσιο σε πρωτεΐνες με υψηλή βιολογική αξία 13. Επίσης περιέχει άλατα, είναι πλούσιο σε ασβέστιο, φωσφόρο, λιποδιαλυτές πρωτεΐνες και λίπος ενώ είναι φτωχό σε λακτόζη (μικρότερο του 1%) (Μάντης, 2000). Από τα συστατικά του γάλακτος, αυτά που μεταφέρονται κυρίως στο τυρί κατά την τυροκόμηση είναι το 74% της πρωτεΐνης (σχεδόν ολόκληρη η καζεΐνη) και το 92% του λίπους. Από τα άλλα συστατικά, ένα μέρος των υδατοδιαλυτών συστατικών παραμένει στο τυρί σε ποσοστά ανάλογα με την περιεκτικότητά του σε υγρασία. Το μεγαλύτερο ποσοστό της λακτόζης καταλήγει στο τυρόγαλα, εντούτοις η ποσότητα της λακτόζης που παραμένει στο πήγμα είναι αρκετή για να χρησιμοποιηθεί ως πηγή ενέργειας για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών του γάλακτος και την μετέπειτα μετατροπή της λακτόζης κυρίως σε γαλακτικό οξύ (Κεχαγιάς, 2011). Στον Πίνακα 4. δίνεται η θρεπτική αξία τυριού φέτας και σκληρού τυριού συγκριτικά με εκείνη του αυγού και του κρέατος. Πίνακας 4. Θρεπτική αξία τυριού φέτα και σκληρού τυριού συγκριτικά με τα αυγά και το κρέας (Ζερφυρίδης, 2001) Τρόφιμο (100g) Ενέργεια (Kcal) Πρωτεΐνη (g) Λίπος (g) Τυρί φέτα ,0 21,0 Τυρί σκληρό ,4 34,5 Αυγά ,3 10,9 Κρέας ,1 11,0 13 Υψηλής βιολογικής αξίας χαρακτηρίζονται οι πρωτεΐνες που το μόριό τους αποτελείται κατά βάση από απαραίτητα αμινοξέα 35

52 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Μικροβιολογία τυριών Μη αρχικές γαλακτικές καλλιέργειες στην τυροκομία Στα τυριά εντοπίζονται σημαντικοί πληθυσμοί μη αρχικών γαλακτικών μικροοργανισμών (NSLAB) 14. Αυτοί οι μικροοργανισμοί συναντώνται στα τυριά είτε λόγω επιμόλυνσης μετά την παστερίωση είτε προέρχονται από το γηγενή πληθυσμό του γάλακτος, επειδή ένα μέρος τους επιβιώνει της παστερίωσης. Σε ορισμένους τύπους τυριών, η παραγωγή γαλακτικού οξέος οφείλεται αποκλειστικά σε αυτή την κατηγορία μικροοργανισμών. Οι σημαντικότεροι μη αρχικοί γαλακτικοί μικροοργανισμοί είναι κυρίως γαλακτοβάκιλλοι (L. pseudoplantarum, L. rhamnosus, L. brevis), και πεδιόκοκκοι (όπως ο P. pentosaceus). Ο συνήθης πληθυσμός των γαλακτοβακίλλων στα τυριά κυμαίνεται από 10 4 ως 10 6 cfu g 1, λίγες μέρες μετά την παρασκευή των τυριών, και μπορεί να φθάσει από 10 7 ως 10 8 cfu g 1 μόλις μετά από λίγες εβδομάδες. Στη συνέχεια, τα επίπεδά τους παραμένουν σχετικά σταθερά κατά την ωρίμανση. Τα περισσότερα από αυτά τα βακτήρια είναι αλατοανθεκτικά και οξυάντοχα, συνεπώς μπορούν να αναπτυχθούν στη μήτρα των τυριών. Ως πηγή ενέργειας, εκτός από την υπολειπόμενη λακτόζη, χρησιμοποιούν και τις γλυκοπρωτεΐνες του γάλακτος Καλλιέργειες εκκίνησης στην τυροκομία Η πιο συνηθισμένη κατηγορία μικροοργανισμών που χρησιμοποιείται ως καλλιέργεια εκκίνησης στην τυροκομία είναι τα οξυγαλακτικά βακτήρια με κυριότερα τα γένη: Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus και Pediococcus. Προστίθενται σε παστεριωμένο γάλα για την έναρξη της τυροκόμησης (Varman και Sutherland, 2001 Κεχαγιάς, 2011). Κύριος ρόλος των καλλιεργειών εκκίνησης είναι η παραγωγή γαλακτικού οξέος από τη ζύμωση της λακτόζης. Το γαλακτικό οξύ είναι υπεύθυνο για το άρωμα του οξέος του τυριού πριν την ωρίμανση και είναι σπουδαίο για το σχηματισμό της τυρομάζας. Επιπροσθέτως, οι καλλιέργειες εκκίνησης παράγουν πτητικές εύοσμες 14 Non starter lactic acid bacteria (NSLAB) 36

53 ΕΙΣΑΓΩΓΗ πτητικές ενώσεις, όπως διακετύλιο και αλδεΰδες, και τα πρωτεολυτικά και λιπολυτικά ένζυμα που απελευθερώνουν συμβάλλουν στην ωρίμανση του τυριού. Στα λευκά τυριά άλμης, παραδοσιακά, χρησιμοποιείται ως καλλιέργεια εκκίνησης γιαούρτι (περιέχει τους θερμόφιλους μικροοργανισμούς S. thermophilus και L. delbrueckii subsp. bulgaricus). Η χρήση γιαουρτιού ενέχει τον κίνδυνο πιθανής επιμόλυνσης των παραγόμενων τυριών από ανεπιθύμητους μικροοργανισμούς. Οι εμπορικές καλλιέργειες εκκίνησης (έτοιμα εμπορικά σκευάσματα), που χρησιμοποιούνται από τα τυροκομεία και από τη βιομηχανία, αποτελούνται από ποικίλους συνδυασμούς θερμόφιλων και μεσόφιλων καλλιεργειών, ανάλογων με το τύπο του παραγόμενου τυριού Τυριά τυρογάλακτος Η παρασκευή των τυριών τυρογάλακτος βασίζεται στη μετουσίωση που υφίστανται οι υδατοδιαλυτές πρωτεΐνες του τυρογάλακτος (α-λακταλβουμίνη και β- λακτογλοβουλίνη), όταν το τυρόγαλα θερμαίνεται σε θερμοκρασίες πάνω από τους 85 C. Το σχηματισθέν πήγμα συλλέγεται και αποτελεί το τυρί τυρογάλακτος. Για τον εμπλουτισμό του τυριού τυρογάλακτος με πρωτεΐνη και λίπος, είναι δυνατή η προσθήκη γάλακτος ή λίπους γάλακτος στο τυρόγαλα πριν τη θέρμανσή του (Samelis και συνεργάτες, 2003). Στην Ελλάδα, τα πιο γνωστά τυριά τυρογάλακτος είναι η μυζήθρα, ο ανθότυρος και το μανούρι, τα οποία παράγονται από το τυρόγαλα που απομένει από την παρασκευή της φέτας ή σκληρών τυριών όπως το κεφαλοτύρι και η γραβιέρα. Η μέγιστη επιτρεπόμενη υγρασία για τη μυζήθρα είναι 70%, για τον ανθότυρο 70% και το μανούρι 60% και η ελάχιστη λιποπεριεκτικότητα σε ξηρή βάση είναι για τη μυζήθρα 50%, για τον ανθότυρο 65% και για το μανούρι 70% (Samelis και συνεργάτες, 2003). Τα τυριά τυρογάλακτος λόγω της υψηλής περιεκτικότητάς τους σε υγρασία, της χαμηλής συγκέντρωσής τους σε αλάτι και της τιμής ph κοντά στο 6, είναι επηρρεπή σε μικροβιολογική αλλοίωση και συνεπώς παρουσιάζουν μικρό χρόνο διατηρησιμότητας. 37

54 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Μυζήθρα Η μυζήθρα είναι ένα παραδοσιακό ελληνικό τυρί τυρογάλακτος, που παρασκευάζεται με θέρμανση του τυρογάλακτος στους C. Η θέρμανση συνοδευόμενη από συνεχή ανάδευση διαρκεί min. Όταν το τυρόγαλα αποκτήσει θερμοκρασία C μπορεί να γίνει προσθήκη γάλακτος (σε αναλογία 3-5%) για παρασκευή καλύτερης ποιότητας μυζήθρας. Προσθήκη αλατιού (1 1,5%) μπορεί να πραγματοποιηθεί κατά τη διάρκεια της θέρμανσης (Litopoulou-Tzanetaki και Tzanetakis, 2011) Ροφήματα τυρογάλακτος Η χρήση του τυρογάλακτος για την παρασκευή ροφημάτων ξεκίνησε τη δεκαετία του Ένα από τα παλαιότερα ροφήματα τυρογάλακτος είναι το Rivella που παρασκευάζεται στην Ελβετία (Jeličić και συνεργάτες, 2008). Μέχρι και σήμερα παρασκευάζεται μία μεγάλη ποικιλία από ροφήματα τυρογάλακτος, έχοντας ως αρχική ύλη γλυκό ή όξινο τυρόγαλα, αποπρωτεϊνωμένο τυρόγαλα, φρέσκο αραιωμένο τυρόγαλα, ζυμωμένο τυρόγαλα ή τυρόγαλα σε μορφή σκόνης. Επιπλέον, υπάρχουν ροφήματα τυρογάλακτος, όπως μπύρα και κρασί τυρογάλακτος και ροφήματα με χαμηλή περιεκτικότητα σε αλκοόλη (λιγότερο από 1,5%). Ο Singh και ο Singh (2012), έχουν προτείνει τη παρασκευή ροφήματος τυρογάλακτος που αποτελείται από πολτό μάγκου, σταθεροποιητή και ζάχαρη. Τα πρόσθετα συστατικά είναι απαραίτητα για να προσδώσουν στο ρόφημα επιθυμητές ιδιότητες, βελτιωμένη γεύση και για να δώσουν ενέργεια στον οργανισμό. Προτείνεται η κατανάλωση ροφήματος τυρογάλακτος από άτομα που ασχολούνται με επίπονη εργασία. Κατά τη διάρκεια επίπονης εργασίας και αθλητικών δραστηριοτήτων καταναλώνεται ενέργεια περίπου ίση με 20 με 30 KJ ανά min, οπότε για εργασία 30 min, απαιτείται συνολική ενέργεια 600 με 900 KJ. Επιπλέον, κατά τη διάρκεια έντονων δραστηριοτήτων, πραγματοποιείται απομάκρυνση από τον οργανισμό αλάτων νατρίου και καλίου, μέσω της εφίδρωσης. Ο Singh και ο Singh (2012) πρότειναν τη παρασκευή ροφήματος, το οποίο θα προσδίδει ενέργεια ίση με 300 KJ/100 ml ροφήματος. Μία ποσότητα

55 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ml ροφήματος θα είναι ικανό να δώσει την απαιτούμενη ενέργεια για εργασία 30 min. Ο Shukla και οι συνεργάτες του (2013) έχουν παρασκευάσει προβιοτικό ρόφημα τυρογάλακτος με χυμό ανανά. Ο L. acidophilus χρησιμοποιήθηκε ως προβιοτικός μικροοργανισμός. Το ρόφημα αποθηκεύτηκε στους 4 C για διάστημα 28 ημερών και διαπιστώθηκε ότι σε αυτό το χρονικό διάστημα ο πληθυσμός του L. acidophilus δεν μειώθηκε κάτω από 10 6 cfu/ml ροφήματος. 5. ΝΕΑ ΤΡΟΦΙΜΑ 15 (Novel foods) Μια νέα κατηγορία τροφίμων με ευεργετικές επιδράσεις στην ανθρώπινη υγεία λόγω της υψηλής περιεκτικότητας σε βιοενεργά συστατικά είναι τα «νέα τρόφιμα». Νέα τρόφιμα είναι τρόφιμα ή συστατικά τροφίμων που δεν έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως (για ανθρώπινη κατανάλωση) πριν από τον Μάϊο του (2). Αυτά τα τρόφιμα παράγονται: Με τρόπους που δεν έχουν χρησιμοποιηθεί ξανά στην παραγωγή τροφίμων (μεταβάλλοντας σημαντικά τη σύσταση ή και τη θρεπτική τους αξία 17 ), με γενετική μηχανική ή άλλου είδους βιοτεχνολογικές τεχνικές (Guerinot, 2000 Ye και συνεργάτες, 2000). Παράδειγμα νέων τροφίμων αποτελούν τα λειτουργικά τρόφιμα (Pouteau, 2002) Λειτουργικά τρόφιμα Ένα τρόφιμο χαρακτηρίζεται ως λειτουργικό όταν επηρεάζει θετικά μία ή περισσότερες σωματικές λειτουργίες πέραν από την κάλυψη διατροφικών αναγκών, με τέτοιο τρόπο ώστε είτε να βελτιώνει τη γενική κατάσταση της υγείας, είτε/και να μειώνει τον κίνδυνο εμφάνισης κάποιων ασθενειών (Ανυφαντάκης, 2004). 15 Νέα ή νεοφανή ή καινοτόμα τρόφιμα. 16 Ημερομηνία που τέθηκε σε ισχύ ο Κανονισμός ΕΚ 258/97, σχετικά με τα νέα τρόφιμα και τα νέα συστατικά τροφίμων. 17 Στις νέες μεθόδους παραγωγής τροφίμων συμπεριλαμβάνονται νέοι τύποι θερμικής επεξεργασίας, μη θερμικές μέθοδοι συντήρησης, νέες μέθοδοι ψύξης, λυοφιλίωση ή αφυδάτωση των τροφίμων, νέοι τύποι εξοπλισμού π.χ. βιοαντιδραστήρες και εφαρμογή νέων διεργασιών όπως η ενζυμική κατάλυση (Howlett και συνεργάτες, 2003) 39

56 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Παραδείγματα λειτουργικών τροφίμων Στην αγορά διατίθονται λειτουργικά τρόφιμα που χαρακτηρίζονται για την αντιοξειδωτική τους δράση, λειτουργικά τρόφιμα που περιέχουν ω-3 λιπαρά οξέα και προβιοτικά τρόφιμα. Η κατηγορία των λειτουργικών τροφίμων που διακρίνονται για την αντιοξειδωτική τους δράση αποτελείται πρωταρχικά από φαινόλες αλλά και από καροτενοειδή. Στην αγορά βρίσκονται επίσης και λειτουργικά τρόφιμα με φυτικές στερόλες (Πίνακας 5). Τα λειτουργικά τρόφιμα εμφανίζουν σημαντικές ευεργετικές επιδράσεις στον ανθρώπινο οργανισμό. Συγκεκριμένα, ο Shahidi (2012) αναφέρει ότι τα ω-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα, που βρίσκονται στα ιχθυέλαια, συμβάλλουν στη πρόληψη και θεραπεία της στεφανιαίας νόσου, της υπέρτασης, της αρθρίτιδας, των αυτοάνοσων διαταραχών και στη πρόληψη και θεραπεία της ψυχικής υγείας και των νευρικών λειτουργιών σε περιπτώσεις κατάθλιψης και σχιζοφρένειας. Επιπλέον συμβάλλουν στη πρόληψη του καρκίνου και θεωρούνται απαραίτητα για την φυσιολογική ανάπτυξη κυρίως του εγκεφάλου και του αμφιβληστροειδή χιτώνα του ματιού. Τα φυτικά τρόφιμα, όπως τα φρούτα, τα λαχανικά και τα δημητριακά αποτελούν πλούσια πηγή φαινολών με αντιοξειδωτική δράση. Ακόμη, σύμφωνα με τον Shahidi (2012), τα φύλλα των βατόμουρων αποτελούν εξαιρετική πηγή αντιοξειδωτικών και έχει βρεθεί ότι αναστέλλουν την έκφραση του ιού της ηπατίτιδας C. Παραδείγματα λειτουργικών τροφίμων με τα αντίστοιχα λειτουργικά τους συστατικά και τις αντίστοιχες πιθανές ευεργετικές επιδράσεις τους στον ανθρώπινο οργανισμό παρουσιάζονται στον Πίνακα 5. 40

57 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Πίνακας 5. Παραδείγματα λειτουργικών τροφίμων και αντίστοιχες πιθανές ευεργετικές επιδράσεις, από την κατανάλωσή τους, στον ανθρώπινο οργανισμό (3) Τρόφιμο Λειτουργικά συστατικά τροφίμου Πιθανή επίδραση του τροφίμου στον οργανισμό Καρότα, φρούτα, λαχανικά Καροτενοειδή Αδρανοποίηση των ελευθέρων ριζών, που μπορούν να βλάψουν τον οργανισμό Ντομάτα και παράγωγά της Καροτενοειδή Προστασία από καρκίνο του προστάτη Σιτηρά, προϊόντα ολικής άλεσης, φρούτα, λαχανικά Διαιτητικές φυτικές ίνες Προστασία προσβολής από καρκίνο του μαστού και του παχέος εντέρου Σολομός και άλλα ιχθυέλαια, αυγά Λιπαρά οξέα ω-3 Μείωση πιθανοτήτων προσβολής από καρδιαγγειακά νοσήματα. Βελτίωση λειτουργιών μνήμης, όρασης Φρούτα, τσάι, εσπεριδοειδή, λαχανικά Φαινόλες Αδρανοποίηση ελευθέρων ριζών, μείωση κινδύνου εμφάνισης καρκίνου Λιναρόσπορος, σίκαλη, λαχανικά Λιγνίνες Πρόληψη καρκίνου και νεφρικής ανεπάρκειας Βατόμουρα, κακάο, σοκολάτα Ταννίνες Βελτίωση της υγείας της ουροφόρου οδού. Προστασία από καρδιαγγειακά νοσήματα Καλαμπόκι, σόγια, σιτάρι Φυτικές στερόλες Μείωση των επιπέδων χοληστερόλης Γάλατα που έχουν υποστεί ζύμωση και γιαούρτια με προβιοτικές καλλιέργειες Προβιοτικά, πρεβιοτικά Βελτίωση της λειτουργίας του πεπτικού-εντερικού συστήματος Σόγια, όσπρια Φυτοοιστρογόνα Βελτίωση υγείας στην εμμηνόπαυση, προστασία από καρδιαγγειακά νοσήματα και είδη καρκίνου, προστασία υγείας οστών και του αμυντικού συστήματος 41

58 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 5.2. Προβιοτικοί μικροοργανισμοί και προβιοτικά τρόφιμα Σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας, ως προβιοτικοί μικροοργανισμοί ορίζονται «οι ζωντανοί μικροοργανισμοί, που όταν καταναλωθούν σε επαρκή ποσότητα, παρουσιάζουν οφέλη για την υγεία και για την αντιμετώπιση ορισμένων παθήσεων». Οι γαλακτοβάκιλλοι και τα bifidobacteria αποτελούν τους πιο χαρακτηριστικούς προβιοτικούς μικροοργανισμούς (Meurman και Stamatova, 2007). Υπάρχουν στα ζυμωμένα προϊόντα με τη μορφή ενεργών καλλιεργειών (Singh και συνεργάτες, 2011). Προκειμένου να χαρακτηριστεί ένα προϊόν ως προβιοτικό θα πρέπει να περιέχει τουλάχιστον 10 6 ζωντανά κύτταρα προβιοτικού μικροοργανισμού/g προϊόντος (Vasiljevic και Shah, 2008) Χαρακτηριστικά ιδανικών προβιοτικών μικροοργανισμών Για να προστεθεί ένας προβιοτικός μικροοργανισμός στα τρόφιμα και στα ποτά, με σκοπό να επιδράσει θετικά στον ανθρώπινο οργανισμό, θα πρέπει να πληροί τις ακόλουθες προϋποθέσεις: 1. Να είναι ασφαλής για ανθρώπινη κατανάλωση (Kopp-Hoolihan, 2001) Για δεκαετίες έχουν χρησιμοποιηθεί πολλά σε αριθμό γένη και στελέχη προβιοτικών από χιλιάδες υγιείς και μη ανθρώπους. Εντούτοις, σύμφωνα με τους Boyle και τους συνεργάτες του (2006), τα προβιοτικά παρά την εξαιρετική στο σύνολό τους συμπεριφορά, θα πρέπει να χρησιμοποιούνται με προσοχή από ορισμένες ομάδες ασθενών όπως είναι τα νεογνά που γεννιούνται πρόωρα ή που εμφανίζουν ανεπάρκεια του ανοσοποιητικού συστήματος. Η Ευρωπαϊκή αρχή για την ασφάλεια των τροφίμων (E.F.S.A.) 18 αναφέρει ότι το τεκμήριο αναγνωρισμένης ασφάλειας (QPS) 19 μπορεί να αποδοθεί μόνο σε μικροοργανισμούς αναγνωρίσιμους σε επίπεδο γένους που συνοδεύονται με ένα ιστορικό ασφαλούς χρήσης. Στο μέλλον, μοριακές τεχνικές μπορεί να ενισχύσουν 18 European Food Safety Authority 19 Ο όρος QPS (Qualified presumption of safety) αναφέρεται στον Εκτελεστικό κανονισμό (ΕΕ) αριθ. 562/2012 της Επιτροπής, της 27ης Ιουνίου

59 ΕΙΣΑΓΩΓΗ την ικανότητα εκτίμησης του κατά πόσο στελέχη μπορούν να επιφέρουν παθογένεια ή να μεταδώσουν αντοχή σε αντιβιοτικά (Quigley, 2010) 2. Να βρίσκεται σε επαρκή συγκέντρωση (Kopp-Hoolihan, 2001) 3. Να αποτελεί γηγενή συστατικό του ανθρώπινου γαστρεντερικού συστήματος (Sanders, 2003) 4. Να μπορεί να παραμένει στο έντερο, ακόμη και εάν δε δημιουργεί αποικίες (Amalaradjou και Bhunia, 2012) 5. Να είναι ανθεκτικός στις όξινες συνθήκες του στομαχιού, να είναι ανθεκτικός στις αλκαλικές συνθήκες του εντέρου και να είναι ανθεκτικός στα χολικά άλατα (Amalaradjou και Bhunia, 2012) 6. Να δρα ευεργετικά όταν βρίσκεται στο γαστρεντερικό σύστημα (Sanders, 2003) 7. Nα έχει αντιμικροβιακή δραστικότητα (Korpela και Saxein, 1999) 8. Να είναι σταθερός κατά την αποθήκευση και επεξεργασία του προϊόντος στο οποίο προστίθεται (Havenaar & Huis, 1999) Ο ρόλος των προβιοτικών προϊόντων στην ανθρώπινη υγεία Από τις αρχές του εικοστού αιώνα είχαν διαπιστωθεί τα οφέλη της κατανάλωσης προβιοτικών τροφίμων. Τα προβιοτικά προϊόντα μπορεί να έχουν αντιμικροβιακή, ανοσορρυθμιστική, αντικαρκινική, αντιδιαρροϊκή, αντιαλλεργική και αντιοξειδωτική δράση. Η αντιμικροβιακή δράση τους οφείλεται στην ικανότητα των προβιοτικών μικροοργανισμών να παράγουν βακτηριοσίνες, οι οποίες είναι ουσίες με αντιβακτηριδιακή δράση. Σύμφωνα με τον Kaur και τους συνεργάτες του (2002), η χορήγηση προβιοτικών προϊόντων αντισταθμίζει τα αρνητικά αποτελέσματα της χρήσης αντιβιοτικών 20, αφού επαναφέρει την ομαλή λειτουργία της μικροχλωρίδας του εντέρου, η οποία διαταράσσεται κατά την αγωγή με χορήγηση αντιβιοτικών. 20 Η ανακάλυψη της πενικιλλίνης από τον Alexander Fleming το 1928, αποτέλεσε ορόσημο στην ιατρική όσον αφορά στα αντιβιοτικά. Η χορήγηση αντιβιοτικών, όμως, πέρα από την αύξηση του προσδόκιμου ζωής (Kaur και συνεργάτες, 2002) προκαλεί διατάραξη της ομαλής λειτουργίας της μικροχλωρίδας του εντέρου (Singh και συνεργάτες, 2011) 43

60 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Επιπρόσθετα, τα προβιοτικά μπορούν να παράγουν βουτυρικό οξύ, το οποίο εξουδετερώνει τις καρκινογενείς ουσίες τις προερχόμενες από την τροφή και το οποίο συμβάλλει στον αυξημένο ανασχηματισμό των εντεροκυττάρων, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2. Ο ανοσορρυθμιστικός ρόλος των προβιοτικών προϊόντων συνίσταται σε πολλαπλές δράσεις με στόχο την ενίσχυση της άμυνας του οργανισμού. Έχει φανεί επίσης ότι τα προβιοτικά προϊόντα παρεμποδίζουν ή επιβραδύνουν την ανάπτυξη όγκων του εντέρου, καθώς οι προβιοτικοί μικροοργανισμοί που περιέχουν μπορούν να προσκολληθούν σε ορισμένα χημικά καρκινογόνα και να καταστείλουν τη δράση τους. Η αντιαλλεργική δράση τους οφείλεται στην ενδυνάμωση του εντερικού τοιχώματος και, επομένως, στη μείωση της επίδρασης των αλλεργιογόνων που προέρχονται από την τροφή. Ο Dugas και οι συνεργάτες του (1999) συνοψίζουν την ευεργετική επίδραση των προβιοτικών τροφίμων στα ακόλουθα σημεία: αυξημένη θρεπτική αξία (καλύτερη πέψη και καλύτερη απορρόφηση μεταλλικών στοιχείων και βιταμινών), ανακούφιση από τα συμπτώματα της δυσανεξίας στη λακτόζη, θετική επίδραση στη μικροχλωρίδα του εντέρου (στις περιπτώσεις λήψης αντιβιοτικών ή στις περιπτώσεις κολίτιδας προκαλούμενης από ακτινοβολία), πρόληψη εντερικών λοιμώξεων του ουροποιητικού συστήματος (προκαλούμενες από βακτήρια ή ιούς), ρύθμιση της σωστής λειτουργίας του εντέρου, βελτιστοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος, πρόληψη καρκίνου, καλύτερη ανάπτυξη οργανισμού, πρόληψη της οστεοπώρωσης, μείωση των καταβολικών προϊόντων που αποβάλλονται από τους νεφρούς και το ήπαρ, 44

61 ΕΙΣΑΓΩΓΗ πρόληψη αθηροσκλήρωσης (μείωση της χοληστερόλης στο πλάσμα του αίματος) και τέλος επίτευξη καλύτερης ποιότητας ζωής. Συναγωνιστικός αποκλεισμός παθογόνων μικροοργανισμών του εντέρου Αναστέλλουν την ανάπτυξη εν δυνάμει παθογόνων με την παραγωγή γαλακτικού οξέος, βακτηριοσίνης και τα λοιπά Τα προβιοτικά προσδένονται στην επιφάνεια των εντεροκυττάρων και ενεργοποιούν τη σύνθεση κυτοκίνης Αποκαθιστούν τη φυσιολογική εντερική μικροχλωρίδα κατά τη διάρκεια θεραπείας με αντιβιοτικά ΠΡΟΒΙΟΤΙΚΑ Παράγουν τοξικούς μεταβολίτες, όπως το υπεροξείδιο του υδρογόνου, που δρουν ενάντια στα παθογόνα Παραγωγή βουτυρικού οξέος συμβάλλει στον αυξημένο ανασχηματισμό των εντεροκυττάρων εξουδετερώνει τις καρκινογενείς ουσίες τις προερχόμενες από την τροφή, όπως είναι οι νιτροζαμίνες Σχήμα 2. Πιθανοί μηχανισμοί δράσης των προβιοτικών (Kaur και συνεργάτες, 2002) 45

62 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα προβιοτικά προϊόντα στην αγορά Τα προϊόντα που περιέχουν προβιοτικά βακτήρια απαντώνται σε δύο μορφές: στα συμπληρώματα διατροφής και στα τρόφιμα. Εκτιμάται ότι μόνο το 2008 η παγκόσμια αγορά προβιοτικών συμπληρωμάτων διατροφής (χάπια, κάψουλες) άγγιξε περίπου τα 1,5 δισεκατομμύρια δολλάρια (Champagne και συνεργάτες, 2011). Σύμφωνα με την ανασκόπηση του Siró και των συνεργατών του (2008), τα γαλακτοκομικά προϊόντα αποτελούν τα πιο αντιπροσωπευτικά προϊόντα προβιοτικών τροφίμων. Το 1999 είχαν σημειώσει πωλήσεις της τάξης των 1,35 δισεκατομμυρίων δολλαρίων και το 2004 πωλήσεις που κυμαίνονταν σε 31,1 δισεκατομμύρια δολλάρια, ποσό που αντιστοιχούσε σε περίπου 56% των πωλήσεων λειτουργικών τροφίμων παγκοσμίως. Η αγορά των λειτουργικών τροφίμων στην Ιαπωνία και στην Ευρώπη κυριαρχείται από προϊόντα που σχετίζονται με την υγεία του εντέρου, κυρίως προβιοτικά. Σημειώνεται ότι 379 στον αριθμό νέα προβιοτικά προϊόντα έκαναν την είσοδό τους στην παγκόσμια αγορά το Τα προβιοτικά βακτήρια προστέθηκαν αρχικά σε προϊόντα γιαουρτιού, με τα γαλακτοκομικά προϊόντα να αποτελούν το πιο αντιπροσωπευτικό προϊόν προβιοτικών τροφίμων. Οι κύριες αγορές των γαλακτοκομικών προβιοτικών τροφίμων είναι η Σκανδιναβία, η Ολλανδία, η Ελβετία, η Κροατία και η Εσθονία ενώ η Ελλάδα, η Γαλλία και η Ισπανία θεωρούνται ως αναπτυσσόμενες αγορές. Η Γερμανία, η Γαλλία, το Ηνωμένο Βασίλειο και η Ολλανδία αντιπροσωπεύουν περίπου τα δύο τρίτα του συνόλου των πωλήσεων των λειτουργικών γαλακτοκομικών προϊόντων στην Ευρώπη. Στην Κεντρική-Ανατολική Ευρώπη (όπως στη Δημοκρατία της Τσεχίας, στην Ουγγαρία, στη Ρουμανία), η αγορά των προβιοτικών κυριαρχείται από διεθνείς εταιρείες όπως είναι η Unilever και η Danone. Σήμερα τα προβιοτικά βακτήρια βρίσκονται όχι μόνο σε γαλακτοκομικά προϊόντα, αλλά και σε ένα μεγάλο αριθμό τροφίμων και ροφημάτων από χυμούς μέχρι δημητριακά. Ορισμένα εμπορικά παραδείγματα προβιοτικών τροφίμων παρουσιάζονται στον Πίνακα 6. Εκτιμάται ότι η βιομηχανία των προβιοτικών κατέχει το 10% της παγκόσμιας αγοράς των λειτουργικών τροφίμων, το οποίο μεταφράζεται σε 10 δισεκατομμύρια 46

63 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ευρώ για το έτος Δεδομένα μετά το 2008 δείχνουν ότι τα προϊόντα με προβιοτικά βακτήρια εμφανίζουν ποσοστό αύξησης του 25% στη Βόρεια Αμερική και στην Ανατολική Ευρώπη, ενώ οι μεγαλύτερες και πιο ώριμες (ως προς τα προβιοτικά) αγορές της Ασίας και της Δυτικής Ευρώπης συνεχίζουν να παρουσιάζουν αυξήσεις μεταξύ 5% και 8% ανά χρόνο. Συνεπώς, τα προϊόντα που περιέχουν προβιοτικά βακτήρια έχουν αξιοσημείωτη και αυξανόμενη οικονομική σημασία (Champagne και συνεργάτες, 2011). Σημειώνεται ότι το γιαούρτι είναι ένα από τα πιο δημοφιλή λειτουργικά προϊόντα (Granato και συνεργάτες, 2010). Αποτελεί ένα τυπικό τρόφιμο, το οποίο είναι γνωστό για τις θεραπευτικές του, τις θρεπτικές και οργανοληπτικές του ιδιότητες και το οποίο είναι το πιο δημοφιλές και προτιμώμενο μέσο μεταφοράς προβιοτικής καλλιέργειας στον ανθρώπινο οργανισμό (Cruz και συνεργάτες, 2012). Πρόσφατα, ο Saxelin και οι συνεργάτες του (2010) απέδειξαν ότι το γιαούρτι είναι το ίδιο αποτελεσματικό με τις κάψουλες όσον αφορά στη μεταφορά των προβιοτικών. Ο Ejtahed και οι συνεργάτες του (2011) θεωρούν ότι το προβιοτικό γιαούρτι μπορεί να βοηθήσει στη μείωση των παραγόντων κινδύνου της καρδιαγγειακής νόσου σε άτομα με διαβήτη τύπου δύο. Πραγματικά, η προσθήκη προβιοτικών στο γιαούρτι αποτελεί σημείο κοινού ενδιαφέροντος για τους παρασκευαστές και για τους καταναλωτές (Cruz και συνεργάτες, 2013). Όσον αφορά στα προβιοτικά γιαούρτια, οι γαλακτοβιομηχανίες βρίσκονται σε διαρκή αναζήτηση προστιθέμενης αξίας συστατικών που να μπορούν να προστεθούν σε αυτά, λόγω της συνεχόμενης αύξησης της δημοτικότητάς τους. Ταυτόχρονα λαμβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι οι καταναλωτές απαιτούν γευστικά υγιεινά τρόφιμα τα οποία να είναι επιπλέον φυσικά, συμπεραίνουμε ότι είναι σημαντική η προώθηση καινοτόμων ιδεών σχετικά με την ενίσχυση της γεύσης και του αρώματος των γιαουρτιών, ώστε περισσότεροι καταναλωτές να δελεαστούν στη δοκιμή νέων προϊόντων, γεγονός που θα οδηγήσει σε περαιτέρω ανάπτυξη της γαλακτοβιομηχανίας. 47

64 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Πίνακας 6. Εμπορικά προϊόντα προβιοτικών τροφίμων (Siró και συνεργάτες, 2008) Μάρκα προϊόντος/ Περιγραφή Παραγωγός Εμπορική ονομασία Actimel Προβιοτικό ρόφημα γιαουρτιού με καλλιέργειες L. casei Imunitass Danone, Γαλλία Activia Κρεμώδες γιαούρτι που περιέχει Bifidus ActiRegularis Danone, Γαλλία Gefilus Ένα ευρέως φάσμα LGG 21 προϊόντων Valio, Φινλανδία Hellus Γαλακτοκομικά προϊόντα που περιέχουν L. fermentum ME-3 Tallinna Piimatööstuse AS, Εσθονία Jovita Probiotisch Μίγμα από δημητριακά, φρούτα και προβιοτικό γιαούρτι H&J Bruggen, Γερμανία Pohadka Γιαούρτι γάλακτος με προβιοτικές καλλιέργειες Valašské Meziříčí Dairy, Δημοκρατία της Τσεχίας ProViva Δροσιστικός φυσικός χυμός φρούτου και γιαουρτιού σε ποικιλία γεύσεων Skåne mejerier, Σουηδία που περιέχει L. plantarum Rela Γιαούρτια, γάλα και χυμοί με L. reuteri Ingman Foods, Φινλανδία Revital Active Γιαούρτι και ρόφημα γιαουρτιού με προβιοτικά Olma, Δημοκρατία της Τσεχίας Snack Fibra Σνακς και μπάρες με φυσικές ίνες και έξτρα μεταλλικά στοιχεία και Celigüeta, Ισπανία βιταμίνες SOYosa Ποικιλία προϊόντων με βάση τη σόγια και τη βρώμη, που περιλαμβάνουν Bioferme, Φινλανδία ένα δροσιστικό ρόφημα και ένα προβιοτικό επιδόρπιο γιαουρτιού με σόγια και βρώμη Soytreat Προϊόν τύπου κεφίρ με έξι προβιοτικά Lifeway, ΗΠΑ Yakult Ρόφημα γάλακτος που περιέχει L. casei Shirota Yakult, Ιαπωνία Yosa Επιδόρπιο γιαουρτιού με βρώμη και με γεύση από φυσικά φρούτα και Bioferme, Φινλανδία μούρα που περιέχουν προβιοτικά βακτήρια (L. acidophilus, B. lactis) Vitality Γιαούρτι με πρεβιοτικά και προβιοτικά και ωμέγα-3 Müller, Γερμανία Vifit Ροφήματα γιαουρτιού με LGG, βιταμίνες και μεταλλικά στοιχεία Campina, Ολλανδία 21 Ο LGG είναι ο Lactobacillus rhamnosus ATCC

65 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 6. ΑΚΙΝΗΤΟΠΟΙΗΣΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Ακινητοποίηση βιοκαταλύτη (ενζύμου, πολυενζυμικού συστήματος ή και ολόκληρου κυττάρου) είναι ο περιορισμός του σε στερεά φάση, η οποία διακρίνεται από την κύρια υγρή φάση (ετερογενές σύστημα). Η στερεά φάση που φέρει τον βιοκαταλύτη, είναι καταλυτικά ενεργή και ονομάζεται βιοκαταλυτική στερεά φάση. Η ακινητοποίηση γίνεται με τέτοιον τρόπο, ώστε να επιτρέπεται η αμφίδρομη μεταφορά (π.χ. υποστρώματος, προϊόντος, οξυγόνου κ.λ.π.) μεταξύ βιοκαταλυτικής στερεάς φάσης και κύριας υγρής φάσης (Κλώνης, 1997). Το ενδιαφέρον για τους ακινητοποιημένους βιοκαταλύτες πηγάζει από το γεγονός ότι η τεχνολογία αυτή, γενικά, προσφέρει ορισμένες δυνατότητες, όπως: αύξηση της σταθερότητας του βιοκαταλύτη, εύκολο και άμεσο έλεγχο της αντίδρασης με απλή προσθήκη ή αφαίρεση βιοκαταλύτη, εύκολη και άμεση παραλαβή προϊόντος εφόσον ο βιοκαταλύτης και το προϊόν βρίσκονται σε διαφορετικές φάσεις, οικονομία αφού μετά το πέρας της αντίδρασης χρησιμοποιείται ο ίδιος ο βιοκαταλύτης πολλές φορές ακόμη, και συνεχή λειτουργία της βιοκαταλυτικής αντίδρασης Για να χρησιμοποιηθεί ένα υπόστρωμα ως φορέας ακινητοποίησης κυττάρων πρέπει: Να είναι άφθονο στη φύση Να έχει προσιτή τιμή Να διατηρεί τη ζωτικότητα των ακινητοποιημένων κυττάρων Να έχει μηχανική, βιοχημική και θερμική σταθερότητα Να είναι αναγεννήσιμο Να έχει μεγάλη ειδική επιφάνεια Να είναι αδιάλυτο στο υγρό της ζύμωσης Να έχει ενεργές ελεύθερες ομάδες για τη σύνδεση των κυττάρων Να μην αλλοιώνεται από τους μικροοργανισμούς 49

66 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 6.1. Μέθοδοι ακινητοποίησης κυττάρων Οι κυριότερες μέθοδοι ακινητοποίησης κυττάρων διακρίνονται σε χημικές και φυσικές. Στις χημικές τεχνικές ακινητοποίησης δημιουργείται χημικός ομοιοπολικός δεσμός είτε μεταξύ του υποστρώματος και των κυττάρων είτε μεταξύ των ίδιων των κυττάρων. Στις φυσικές τεχνικές ακινητοποίησης ανήκουν: α) προσρόφηση ή προσκόλληση στην επιφάνεια του φορέα, β) εγκλωβισμός σε τεχνητό μικροπεριβάλλον (πορώδες υλικό ή πολυμερικό πλέγμα), γ) δημιουργία συσσωματωμάτων από τα κύτταρα, και δ) μηχανική συγκράτηση (Κλώνης Ιωάννης, 1997 Junter και συνεργάτες, 2002) Προσρόφηση ή προσκόλληση σε επιφάνεια Η προσρόφηση των κυττάρων στην επιφάνεια του φορέα ακινητοποίησης μπορεί να γίνει με φυσική προσρόφηση των κυττάρων στην επιφάνεια του φορέα, με συγκράτηση μέσω δυνάμεων ηλεκτροστατικής φύσης (ιονικοί δεσμοί, δυνάμεις Van der Waals, δεσμοί υδρογόνου) ή ομοιοπολικών δεσμών που αναπτύσσονται μεταξύ των κυττάρων και της επιφάνειας του φορέα. Η ακινητοποίηση βιοκαταλύτη μέσω προσροφήσεως σε κατάλληλο φορέα αποτελεί την παλαιότερη τεχνική. Το κύριο μειονέκτημα της τεχνικής προσροφήσεως με ηλεκτροστατικές δυνάμεις είναι η ευκολία με την οποία τα κύτταρα διαφεύγουν από το φορέα. Συγχρόνως το ίδιο γεγονός αποτελεί και πλεονέκτημα της τεχνικής διότι η αναγέννηση του βιοκαταλυτικού φορέα είναι εύκολη και οικονομική (Κλώνης Ιωάννης, 1997). Ορισμένοι από τους φορείς που έχουν χρησιμοποιηθεί για αυτό το είδος ακινητοποίησης είναι διάφορα κυτταρινούχα υλικά, ανόργανα υλικά (όπως πολυγκροσκίτης, πορώδης πορσελάνη, πορώδες γυαλί) και η χημικά τροποποιημένη κυτταρίνη (Kourkoutas και συνεργάτες, 2004 Junter και συνεργάτες, 2002) Εγκλεισμός σε μήτρα ή πολυμερικό πλέγμα Με την μέθοδο ακινητοποίησης με εγκλωβισμό των κυττάρων πραγματοποιείται περιορισμός αυτών στο εσωτερικό της δομής πολυμερούς υλικού (πλέγματος) που αποτελεί τον φορέα. Το μειονέκτημα της τεχνικής του εγκλωβισμού είναι η μεγάλη πιθανότητα διαφυγής κυττάρων από το πλέγμα, πρόβλημα το οποίο 50

67 ΕΙΣΑΓΩΓΗ αντιμετωπίζεται με χημική σταθεροποίηση του βιοκαταλυτικού φορέα. Ακόμα, οι πόροι του φορέα πρέπει να έχουν τέτοιο μέγεθος ώστε να αμβλύνουν πιθανά φαινόμενα περιορισμού της μεταφοράς ουσιών λόγω του μοριακού τους μεγέθους. Γενικά, ο εγκλωβισμός θεωρείται ως η καταλληλότερη τεχνική για την ακινητοποίηση κυττάρων. Δύο τύποι πολυμερών υλικών που βρίσκουν ευρεία εφαρμογή στην τεχνική του εγκλωβισμού είναι το πολυακρυλαμίδιο και τα διάφορα φυσικά πολυμερή, πολυσακχαριδικής κυρίως συστάσεως με δυνατότητα σχηματισμού πηκτωμάτων. Χαρακτηριστικά παραδείγματα φυσικών πολυμερών που χρησιμοποιούνται στην τεχνική του εγκλεισμού είναι τα αλγινικά (όπως το αλγινικό ασβέστιο), το άγαρ, το κολλαγόνο, η ζελατίνη και η κ-καρραγενάνη (Κλώνης, 1997 Γιαννούλης και Κουτίνας, 2009) Δημιουργία συσσωματωμάτων Η δημιουργία συσσωματωμάτων από τα κύτταρα είναι άλλη μία μέθοδος ακινητοποίησης κυττάρων. Λόγω της μεγάλης μάζας του συσσωματώματος μπορούν να χρησιμοποιηθούν αντιδραστήρες που έχουν σχεδιαστεί για ακινητοποιημένα κύτταρα όπως γεμισμένης στήλης, ρευστομένης κλίνης και συνεχούς λειτουργίας με ανάδευση. Η δημιουργία συσσωματωμάτων από τα κύτταρα ζυμών είναι μία ιδιότητα που έχουν μόνο συγκεκριμένα στελέχη. Η δημιουργία συσσωματωμάτων μικροοργανισμών, οι οποίοι δεν σχηματίζουν από μόνοι τους συσσωματώματα, μπορεί να επιτευχθεί με προσθήκη διαφόρων αντιδραστηρίων τα οποία βοηθούν την όλη διεργασία Μηχανική συγκράτηση Η μηχανική συγκράτηση των κυττάρων μπορεί να επιτευχθεί είτε με τη χρήση μεμβράνης διαπίδυσης, είτε με ενθυλάκωση, είτε τέλος, με την ακινητοποίηση των κυττάρων στην επιφάνεια αλληλεπίδρασης δύο μη αναμίξιμων υγρών. Η τεχνική αυτή ακινητοποίησης χρησιμοποιείται όταν το τελικό προϊόν πρέπει να είναι απαλλαγμένο από κύτταρα ή από κάποιες μεγάλου μοριακού βάρους ενώσεις. Παρόλα αυτά η τεχνική αυτή είναι δύσκολο να επιτευχθεί και υπάρχει δυσκολία στη 51

68 ΕΙΣΑΓΩΓΗ μεταφορά των θρεπτικών ουσιών, ιδίως αυτών που δεν έχουν μεγάλη διαλυτότητα, από τον κύριο όγκο του διαλύματος στα κύτταρα (Karel και συνεργάτες, 1985) Ενθυλάκωση Η ενθυλάκωση, που είναι γνωστή και ως μικροενθυλάκωση, είναι μία τεχνική κατά την οποία τα κύτταρα βρίσκονται ελεύθερα και διαλυμένα σε εξαιρετικά μικρό όγκο υγρού, το οποίο περιορίζεται στο εσωτερικό ημιπερατής μεμβράνης που παίρνει τη μορφή μικροσφαιριδίου ή μικροκαψυλλίου. Συνεπώς, ο βιοκαταλυτικός φορέας αποτελείται από πληθυσμό ημιπερατών καψυλλίων, τα οποία στο εσωτερικό τους φέρουν κυτταρικό διάλυμα. Τα καψύλλια έχουν διάμετρο μm τα οποία ανάλογα με το μέγεθος των πόρων τους επιτρέπουν τη διέλευση μορίων μικρότερου μεγέθους όχι όμως και κυττάρων. Επιπροσθέτως η τεχνική αυτή παρουσιάζει ορισμένα πλεονεκτήματα, τα οποία είναι τα εξής: Μεγάλη ειδική επιφάνεια Υψηλή ταχύτητα μεταφοράς μάζας Υψηλό βαθμό συγκράτησης κυττάρων Δυνατότητα ταυτόχρονης ακινητοποίησης περισσότερων του ενός τύπου κυττάρων Από την άλλη πλευρά, τα κυριότερα μειονεκτήματα της μεθόδου ακινητοποίησης με μικροενθυλάκωση είναι η μειωμένη μηχανική σταθερότητα των καψυλλίων και η μεγάλη απώλεια της δραστικότητας των κυττάρων λόγω της επαφής του βιοκαταλύτη με οργανικούς διαλύτες, χημικά μονομερή και άλλα αντιδραστήρια κατά τη διαδικασία. Η μικροενθυλάκωση των κυττάρων πραγματοποιείται με διάφορες τεχνικές. Μία απλή τεχνική είναι η τεχνική του διαχωρισμού φάσεων, κατά την οποία υδατικό διάλυμα κυττάρων αναδεύεται έντονα με μη υδατοσυμβατό οργανικό διαλύτη που περιέχει διαλυμένο πολυμερές. Το γαλάκτωμα που σχηματίζεται αποτελείται από μικροσταγόνες που περιέχουν διαλυμένα κύτταρα. Στη συνέχεια, το γαλάκτωμα εισάγεται με έντονη ανάδευση σε διαφορετικό μη υδατοσυμβατό οργανικό διαλύτη στον οποίο το πολυμερές είναι αδιάλυτο. Ετσι, το πολυμερές συγκεντρώνεται γύρω 52

69 ΕΙΣΑΓΩΓΗ από τις μικροσταγόνες του κυτταρικού διαλύματος σχηματίζοντας μικροκαψύλλια ημιπερατής μεμβράνης (Κλώνης, 1997) Υποστρώματα για την ακινητοποίηση κυττάρων Διάφορα οργανικά ή ανόργανα υποστρώματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως φορείς ακινητοποίησης κυττάρων. Παραδείγματα αποτελούν φυσικά πολυμερή υλικά όπως είναι το πολυστυρένιο, τα κυτταρινούχα υπολείμματα βύνης, τα απολιγνιτοποιημένα κυτταρινούχα υλικά καθώς και διάφορα σύνθετα πολυμερή υλικά (πολυακριλαμίδιο) όπως και κάποια ανόργανα υλικά (γ-αλουμίνα, σφαιρίδια από ανοξείδωτο ατσάλι και σφαιρίδια πορώδους γυαλιού). Σύμφωνα με την ανασκόπηση του Soccol και των συνεργατών του (2010), ανάμεσα στα πολυμερή υλικά τα κατάλληλα για τρόφιμα που χρησιμοποιούνται ως υποστρώματα για την ακινητοποίηση κυττάρων βρίσκονται τα αλγινικά, η χιτοζάνη, η καρβοξυ-μέθυλο κυτταρίνη, η καραγεννάνη, η ζελατίνη και η πηκτίνη. Τα αλγινικά είναι το περισσότερο ευρέως χρησιμοποιούμενο υπόστρωμα ακινητοποίησης. Πρόκειται για έναν φυσικώς απαντώμενο πολυσακχαρίτη. Επιπλέον χρησιμοποιούνται για ακινητοποίηση μίγματα κ-καραγεννάνης και κόμμεως χαρουπιών, οξική φθαλική κυτταρίνη, χιτοζάνη και ζελατίνη. Αναφορά για τα υποστρώματα ακινητοποίησης δίνεται στον Πίνακα 7. Πέρα από τα πολυμερή υλικά ακινητοποίησης, ως υποστρώματα ακινητοποίησης που προορίζονται για χρήση σε τρόφιμα επιλέγονται κυρίως φυσικά προϊόντα όπως: φρούτα, δημητριακά, σταφίδες, γλουτένη, άμυλο και γενικά διάφορα υλικά που είναι άφθονα στη φύση, φθηνά και δεν επηρεάζουν τον μεταβολισμό των βακτηρίων (Kourkoutas και συνεργάτες 2004, 2005). Χαρακτηριστικά παραδείγματα χρήσης ακινητοποιημένων προβιοτικών κυττάρων στη παραγωγή τροφίμων παρουσιάζονται στον Πίνακα 8. 53

70 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Πίνακας 7. Παραδείγματα ακινητοποίησης προβιοτικών κυττάρων σε πολυμερή (Soccol και συνεργάτες, 2010) Βακτήρια Πολυμερές Λειτουργικότητα Αναφορά Bifidobacterium Bifidobacterium Bifidobacterium Bifidobacterium Bifidobacterium Bifidobacterium Bifidobacterium Bifidobacterium B. bifidum B. bifidum αλγινικά/γλυκερόλη καραγεννάνη/κόμμι χαρουπιών αλγινικά /χιτοζάνη αλγινικά /πηκτίνη/πρωτεΐνη τυρογάλακτος ανθεκτικό άμυλο κηρώδες άμυλο αραβοσίτου αλγινικά /άμυλο τροποποιημένο κηρώδες άμυλο αραβοσίτου αλγινικά k- καραγεννάνη παραγωγή βιομάζας σταθερό σε οξέα, σταθερό στην αποθήκευση σταθερό σε οξέα, σταθερό στην αποθήκευση σταθερό σε οξέα, σταθερό στην αποθήκευση σταθερό σε οξέα, σταθερό στην αποθήκευση σταθερό σε οξέα, σταθερό στην αποθήκευση σταθερό σε οξέα, σταθερό στην αποθήκευση σταθερό σε οξέα, σταθερό στην αποθήκευση και θερμοσταθερό Kebary και συνεργάτες, 1996 Doleyres και συνεργάτες, 2004, 2002 Lee και συνεργάτες, 2004 Guerin και συνεργάτες, 2003 Crittenden και συνεργάτες, 2001 O Riordan και συνεργάτες, 2001 Sultana και συνεργάτες, 2000 Kailasapathy και Chin 2000 O Riordan και συνεργάτες, 2001 Krasaekoopt και συνεργάτες, 2004 Dinakar και συνεργάτες, 1994 λυοφιλιωμένη σκόνη B. breve αλγινικά σταθερό σε οξέα Hansen και συνεργάτες, 2002 B. breve B. longum σκόνη λυοφιλιωμένης καλλιέργειας σταθερό στην αποθήκευση και θερμοσταθερό Picot και συνεργάτες, 2003a B. infantis κόμμι γελλάνης και κόμμι ξανθάνης σταθερό σε οξέα, σταθερό στην αποθήκευση Sun και Griffiths, 2000 B. lactis B. lactis (Bb-12) B. longum B. longum B. longum B. longum αλγινικά οξική φθαλική κυτταρίνη πρωτεΐνη τυρογάλακτος k- καραγεννάνη k- καραγεννάνη /κόμμι χαρουπιών αλγινικά σταθερό σε οξέα/χολικά άλατα Hansen και συνεργάτες, 2002 Favaro-Trindade και συνεργάτες, 2002 σταθερό σε οξέα Picot και Lacroix, 2004, 2003a, 2003b Adhikari και συνεργάτες, 2000, 2003 Maitrot και συνεργάτες, 1997 Krasaekoopt και συνεργάτες,

71 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Πίνακας 7. (συνέχεια) Βακτήρια Πολυμερές Λειτουργικότητα Αναφορά B. pseudolongum οξική φθαλική κυτταρίνη σταθερό σε οξέα/χολικά άλατα Lee και Heo, 2000 Lactobacillus L. acidophilus L. acidophilus LA14 and B. lactis BI07 L. acidophilus (La-05) L. acidophilus L. acidophilus L. rhamnosus καραγεννάνη αλγινικά αλγινικά /άμυλο καραγεννάνη / κόμμι χαρουπιών αλγινικά αλγινικά /κόμμι ξανθάνης οξική φθαλική κυτταρίνη αλγινικά σκόνη λυοφιλιωμένης καλλιέργειας αλγινικά παραγωγή βιομάζας σταθερό σε οξέα σταθερό σε οξέα, σταθερό στην αποθήκευση σταθερό σε οξέα σταθερό σε οξέα, σταθερό στην αποθήκευση σταθερό σε οξέα/χολικά άλατα σταθερό σε οξέα, σταθερό στην αποθήκευση και θερμοσταθερό θερμοσταθερό και σταθερό στην αποθήκευση σταθερό σε οξέα, σταθερό στην αποθήκευση Rao και συνεργάτες, 1989 Chandramouli και συνεργάτες, 2004 Sultana και συνεργάτες, 2000 Kailasapathy και Chin, 2000 Krasaekoopt και συνεργάτες, 2003 Klein και συνεργάτες, 1985 Chan και συνεργάτες, 2002 Favaro-Trindade και συνεργάτες, 2002 Albertini και συνεργάτες, 2010 Picot και Lacroix, 2003a Krasaekoopt και συνεργάτες, 2006 L. bulgaricus καραγεννάνη / κόμμι χαρουπιών παραγωγή βιομάζας Mokarram και συνεργάτες, 2009 Lactobacillus casei Lactobacillus casei καραγεννάνη / κόμμι χαρουπιών αλγινικά σταθερό σε οξέα σταθερό σε οξέα Adhikari και συνεργάτες, 2003 Ouellette και συνεργάτες, 1994 L. delbrueckii αλγινικά /λαούρυλοθειικό νάτριο παραγωγή βιομάζας Mandal και συνεργάτες, 2006 L. lactis ζελατίνη/2,4-διισοκυανικό τολουόλιο παραγωγή βιομάζας Hyndman και συνεργάτες, 1993 L. reuteri Ca-αλγινικό and k- καραγεννάνη αποθήκευση Mandal και συνεργάτες, 2006 P. acidilactici μικροκάψουλες καλαμποκιού και ελαιολάδου γαλακτοματοποιημένα με πεπτίδια σταθερό σε οξέα, σταθερό στην αποθήκευση Tsen και συνεργάτες,

72 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Πίνακας 8. Χαρακτηριστικά παραδείγματα χρήσης ακινητοποιημένων προβιοτικών κυττάρων στη παραγωγή τροφίμων (Mitropoulou, 2013) Ακινητοποίηση/φορέας Προβιοτικός μικροοργανισμός Προβιοτικό παραγόμενο Αναφορά ενθυλάκωσης τρόφιμο Ενθυλάκωση σε αλγινικά B. bifidum, B. infantis Μαγιονέζα Khalil και Mansour, 1998 Κομμάτια μήλου, κομμάτια L. casei ATCC 393 Ζυμωμένο γάλα Kourkoutas και συνεργάτες, 2005 κυδωνιού Μήλο, κομμάτια αχλαδιού L. casei ATCC 393 Τυρί Kourkoutas και συνεργάτες, 2006 Σφαιρίδια αλγινικού επικαλυμμένα με χιτοζάνη L. casei 01, L. acidophilus 547 Γιαούρτι Krasaekoopt και συνεργάτες, 2006 Ίνες L. rhamnosus E800, E522 L. acidophilus DD910 Χυμός μήλου, δημητριακά πρωινού με επικάλυψη σοκολάτας Saarela και συνεργάτες, 2006 Ενθυλάκωση σε αλγινικά-άμυλο παρουσία ασβεστίου B. lactis DD920 Γιαούρτι Kailasapathy, 2006 Μικροενθυλάκωση σε αλγινικά L. reuteri Λουκάνικα Muthukumarasamy και συνεργάτες, 2006 Πρωτεΐνη τυρογάλακτος L. rhamnosus R011 Μπισκότα, κατεψυγμένο χυμό από κράνμπερι, και χυμό λαχανικών Reid και συνεργάτες, 2007 Αλγινικό ασβέστιο L. acidophilus BCRC Ντοματοχυμός King και συνεργάτες,

73 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Πίνακας 8. (συνέχεια) Ακινητοποίηση/φορέας ενθυλάκωσης Προβιοτικός μικροοργανισμός Προβιοτικό παραγόμενο τρόφιμο Αναφορά Φλοιός των τροπικών φρούτων durian, mangosteen, και καρποί L. acidophilus FTDC 1331, 2631, 2333, 1733 και L. bulgaricus FTDC 0411 Γάλα σόγιας Teh και συνεργάτες, 2009 Αλγινικό ασβέστιο L. acidophilus ATCC 4356 Γιαούρτι Ortakci και Sert, 2012 Αλγινικό νάτριο L. casei NCDC 298 Συμβιωτική σοκολάτα γάλακτος Mandal και συνεργάτες, 2013 Φρούτα, κομμάτια βρώμης L. casei ATCC 393, L. delbrueckii ssp. bulgaricus Γιαούρτι Sidira και συνεργάτες, 2013 Σπόροι σίτου L. casei ATCC 393 Ζυμωμένο λουκάνικο [μη δημοσιευμένα αποτελέσματα] 57

74 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 7. ΠΙΣΣΑ ΠΑΦΟΥ (Pistacia terebinthus) Η πίσσα Πάφου αποτελεί ένα παραδοσιακό Κυπριακό προϊόν το οποίο παράγεται στην Κύπρο και ιδιαίτερα στη Πάφο. Στην εικόνα 1 φαίνεται το δέντρο Pistacia terebinthus και στην εικόνα 2 η πίσσα Πάφου. Εικόνα 1. Pistacia terebinthus (4) Εικόνα 2 Πίσσα Πάφου (5) Οι ρίζες καταγωγής της πίσσας Πάφου τοποθετούνται χρονολογικά στην αρχαιότητα (14 ο με 13 ο αιώνα π.χ.), αφού πίσσα Πάφου βρέθηκε μέσα σε αμφορές του ναυαγίου του Ουλουμπουρούν (Stern και συνεργάτες, 2008). Η πίσσα Πάφου αποτελεί μία ρητινώδη ουσία που εκκρίνεται από τον κορμό του δέντρου τερέβινθος. Η έκκριση αυτή προκαλείται από το χάραγμα του κορμού. Εμφανίζεται σαν δάκρυ στα χαραγμένα σημεία του δέντρου, έχει κρυσταλλική μορφή και ρέει κατά σταγόνες. Το χρώμα της εκκρινόμενης ρητίνης είναι κιτρινωπό. 58

75 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η επεξεργασία της πίσσα Πάφου είναι χρονοβόρα. Απαιτεί πλάσιμο της πίσσας σε ακανόνιστα σχήματα. Στη συνέχεια, η πίσσα ανοίγεται σε λωρίδες, τεμαχίζεται χειρονακτικά σε τετράγωνα κομμάτια και συσκευάζεται σε φακελάκια. Ολόκληρη η διαδικασία αυτή γίνεται βάση διαφόρων θερμοκρασιακών μεταβολών του υλικού με εμβάπτιση των χεριών του παραγωγού σε δύο δοχεία ζεστού και κρύου νερού ώστε να είναι εφικτή η διατήρηση του φυσικού υλικού στη περιοχή των θερμοκρασιών που γίνεται η μορφοποίησή του Το δέντρο τερέβινθος Το δέντρο τερέβινθος ανήκει στο γένος των Πιστακίων (Pistacia terebinthus) της οικογένειας των Ανακαρδιοειδών (Anacardiaceae). Στο γένος Pistacia ανήκουν τα εξής είδη: 1. Pistacia terebinthus: Μικρό φυλλοβόλο δένδρο ή θάμνος που βρίσκεται σε όλες τις παραμεσόγειες περιοχές μέχρι και την Πορτογαλία. Φύεται σε ξηρές βραχώδεις πλαγιές ή σε δάση με κωνοφόρα δέντρα (Ozcan και συνεργάτες 2009). 2. Pistacia lentiscus: Μικρό αειθαλές δένδρο ή θάμνος που ευδοκιμεί σε ξηρές και ανοιχτές περιοχές της Μεσογείου μέχρι και την Πορτογαλία. 3. Pistacia atlantica: Αυτό το είδος έχει περιορισμένη εξάπλωση στην βορειανατολική Ελλάδα, στη Τουρκία και στη Κριμαία. 4. Pistacia palestina: Αυτό το είδος συναντάται στις παραμεσόγειες περιοχές του Ισραήλ, της Συρίας και της Παλαιστίνης. 5. Pistacia vera: Είναι παρόμοιο με τα προηγούμενα και καλλιεργείται για τα βρώσιμα σπέρματά του στη Συρία, στη Μικρά Ασία και στη Βόρεια Ευρώπη. 6. Pistacia chinensis: Είναι φυλλοβόλο δένδρο που φτάνει μέχρι τα 20 μέτρα ύψος. Στην κεντρική Κίνα χρησιμοποιείται και ως καλλωπιστικό. Από τα είδη αυτά, η Pistacia terebinthus και η Pistacia lentiscus αποτελούν σημαντικές πηγές ρητίνης. 59

76 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 7.2. Χρήσεις της Pistacia terebinthus Τα είδη του γένους Pistacia παρουσιάζουν μία σειρά από φαρμακευτικές δράσεις. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιούνται στη θεραπεία του εκζέματος, ενάντια στη διάρροια, ενάντια στις λοιμώξεις του λαιμού, ενάντια στον ίκτερο, ενάντια στο άσθμα και ενάντια στον πόνο του στομάχου. Επιπλέον έχουν αντιφλεγμονώδη, αντιπυρετική, αντιβακτηριακή, θωρακική και διεγερτική δράση (Duru και συνεργάτες, 2003). Η Pistacia terebinthus χρησιμοποιείται ευρέως στην λαϊκή τουρκική ιατρική. Τα φύλλα της χρησιμοποιούνται για την αντιμετώπιση της ηλίασης και τα αποξηραμένα φρούτα της χρησιμεύουν ενάντια στο άσθμα (Tuzlaci και συνεργάτες, 2001). Η ρητίνη της Pistacia terebinthus (πίσσα Πάφου) χρησιμοποιείται ενάντια στο πεπτικό έλκος (Yeşilada και συνεργάτες, 1995), ενάντια στον πόνο του στομάχου (Tuzlaci και συνεργάτες, 2001), ενάντια στην ξηρότητα των χειλιών και έχει χρήση ως αντισηπτικό του αναπνευστικού συστήματος (Duru και συνεργάτες, 2003). Επιπλέον, χρησιμοποιείται ως υλικό πληρώσεως στην οδοντιατρική και στην παραγωγή οδοντόπαστων. Πέρα από τις φαρμακευτικές της ιδιότητες, η πίσσα Πάφου χρησιμοποιείται και στη βιομηχανία τροφίμων, ως πρόσθετη ύλη για την παρασκευή διαφόρων γλυκών, ζαχαρωτών και αρωματικών αρτοσκευασμάτων ενώ προσδίνει ένα ιδιαίτερο άρωμα σε πολλά είδη τροφίμων όπως στο τυρί Ιδιότητες της πίσσας Πάφου Η σκληρότητα, το κολλώδες, η ρευστότητα της πίσσας Πάφου έχουν μελετηθεί σε σχέση με τη θερμοκρασία. Όσον αφορά στη σκληρότητα, αυτή μειώνεται με την αύξηση της θερμοκρασίας και μάλιστα αξιοσημείωτο είναι το γεγονός πως και με μία μικρή μεταβολή της θερμοκρασίας η σκληρότητα μεταβάλλεται κατά πολύ, ιδίως σε περιοχές από 15 C έως 25 C. Ενδεικτικά αναφέρεται ότι η σκληρότητα του υλικού είναι περίπου 15 φορές μεγαλύτερη στους 15 C από ότι είναι στους 35 C (Σχήμα 3). 60

77 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σχήμα 3. Μεταβολή της σκληρότητας της πίσσας Πάφου συναρτήσει της θερμοκρασίας (6) Όσον αφορά στο κολλώδες της πίσσας Πάφου έχει διαπιστωθεί ότι σε θερμοκρασίες άνω των 35 C αυξάνεται αισθητά σε αντίθεση με τη συμπεριφορά του σε θερμοκρασίες κάτω των 30 C. Ακόμα, το υλικό ρέει πολύ καλά σε θερμοκρασίες άνω των 60 C. Σε θερμοκρασίες μεταξύ 40 C και 50 C η κατάσταση της πίσσας είναι ημιστερεή και το υλικό ρέει και αναδεύεται δύσκολα. Επίσης, σε πιο χαμηλές θερμοκρασίες κάτω των 40 C το υλικό βρίσκεται σε στερεή κατάσταση και δεν ρέει καθόλου ενώ μέχρι και τους 37 C αναδεύεται με πολύ μεγάλη δυσκολία. Τέλος σε θερμοκρασίες κάτω των 30 C το υλικό της πίσσας είναι ακατέργαστο. Στο Σχήμα 4 φαίνεται η μεταβολή της ρευστότητας της πίσσας Πάφου συναρτήσει της θερμοκρασίας. Σχήμα 4. Μεταβολή της ρευστότητας της πίσσας Πάφου συναρτήσει της μεταβολής της θερμοκρασίας (6) 61

78 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 8. ΤΕΡΠΕΝΙΑ Ο όρος τερπένια προέρχεται από την λέξη τερέβινθος (lat. Balsamum terebinthinae). Η τερέβινθος, η αποκαλούμενη «ρητίνη των κωνοφόρων δέντρων», είναι το παχύρευστο υγρό που ρέει από τη χάραξη του φλοιού κωνωφόρων δέντρων. Η τερέβινθος αποτελείται από ρητινικά οξέα και υδρογονάνθρακες, τα οποία χαρακτηρίζονταν αρχικά ως τερπένια. Παραδοσιακά, όλα τα φυσικά συστατικά που αποτελούνται από μονάδες ισοπροπενίου και που προέρχονται από φυτά, ονομάζονται τερπένια. Τα κωνοφόρα δέντρα, τα εσπεριδοειδή, ο κόλιανδρος, ο ευκάλυπτος, η λεβάντα, τα κρίνα, τα γαρύφαλλα, το κύμινο, είδη μέντας, τα τριαντάφυλλα, το δεντρολίβανο, το φασκόμηλο, το θυμάρι και πολλά άλλα φυτά ή μέρη αυτών είναι γνωστά για το ευχάριστο τους άρωμα, την πικάντική τους γεύση ή παρουσιάσουν συγκεκριμένες φαρμακολογικές δράσεις. Οι ιδιότητες αυτές είναι χαρακτηριστικές ιδιότητες των τερπενίων. Πολλά φυτά παράγουν πτητικά τερπένια για να προσελκύσουν συγκεκριμένα έντομα για επικονίαση ή για να απομακρύνουν ζώα που είναι δυνατό να χρησιμοποιήσουν τα φυτά αυτά ως τροφή. Κάποια λιγότερο πτητικά, αλλά με έντονα πικρή γεύση ή τοξικά τερπένια προστατεύουν τα φυτά από το να αποφευχθεί η κατανάλωσή τους από ζώα. Επιπλέον, τα τερπένια παίζουν το ρόλο ενώσεων που εκπέμπουν μηνύματα ή που ρυθμίζουν την ανάπτυξη των φυτών. Πολλά έντομα μεταβολίζουν τα τερπένια, που λαμβάνουν με τη τροφή από τα φυτά, σε ορμόνες και φερορμόνες. Οι φερορμόνες είναι ενώσεις που εκκρίνονται από τα έντομα με σκοπό την μεταξύ τους επικοινωνία (Breitmaier, 2006). Είναι γνωστά περισσότερα από τερπένια. Τα τερπένια ονομάζονται επίσης και τερπενοειδή. Στη φύση, τα τερπένια υπάρχουν με τη μορφή κυρίως υδρογονανθράκων, αλκοολών και των γλυκοζιτών τους, αιθέρων, αλδεϋδών, κετονών, καρβοξυλικών οξέων και εστέρων. Η βασική δομή των τερπενίων ακολουθεί τον κανόνα του ισοπρενίου, ο οποίος περιγράφτηκε από τους Ruzicka 22 και Wallach 23. Σύμφωνα με τον κανόνα του 22 O Otto Wallach ήταν Γερμανός χημικός. Του απονεμήθηκε το Νόμπελ Χημείας το Ο Leopold Ružička ήταν Κροάτης επιστήμονας. Του απονεμήθηκε το Νόμπελ Χημείας το

79 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ισοπρενίου, τα τερπένια θεωρείται ότι προέρχονται από συνένωση κεφαλής-ουράς μονάδων ισοπρενίου (2-μέθυλο-1,3-βουταδιένιο). Ο άνθρακας 1 ονομάζεται κεφαλή της ισοπρενικής μονάδας, ενώ ο άνθρακας 4 θεωρείται η ουρά της. Για παράδειγμα το μυρσένιο περιέχει δύο ισοπρενικές ομάδες ενωμένες κεφαλή με ουρά. Αντίστοιχα, το α-πινένιο περιέχει δύο ισοπρενικές μονάδες σε μία κυκλική δομή. Εικόνα 3. Ισοπρένιο (2-μέθυλο-1,3-βουταδιένιο) Τα τερπένια ανάλογα με τον αριθμό των ισοπρενικών μονάδων που περιέχουν διακρίνονται σε ημιτερπένια (C 5 H 8 ), μονοτερπένια (C 10 H 16 ), σεσκιτερπένια (C 15 H 24 ), διτερπένια (C 20 H 32 ), σεστερτερπένια (C 25 H 40 ), τριτερπένια (C 30 H 48 ), τετρατερπένια (C 40 H 64 ) και πολυτερπένια (C 5 Η 8 ) n με το n να είναι μεγαλύτερο του οκτώ (Breitmaier, 2006). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 9, τα μονοτερπένια που είναι ενώσεις με 10 άτομα άνθρακα αποτελούνται από δύο μονάδες ισοπρενίου, τα σεσκιτερπένια που έχουν 15 άτομα άνθρακα αποτελούνται από τρία μόρια ισοπρενίου κ.τ.λ.. Πίνακας 9. Ταξινόμηση των τερπενίων (McMurry, 2012) Αριθμός ατόμων Μονάδες Ταξινόμηση άνθρακα ισοπρενίου 10 2 Μονοτερπένιο 15 3 Σεσκιτερπένιο 20 4 Διτερπένιο 25 5 Σεστερτερπένιο 30 6 Τριτερπένιο 40 8 Τετρατερπένιο Τα μονοτερπένια και τα σεσκιτερπένια απαντούν κυρίως στα φυτά, ενώ τα υψηλότερης τάξης τερπένια απαντούν τόσο στα φυτά όσο και στα ζώα και πολλά παρουσιάζουν αξιόλογη βιολογική δραστικότητα (McMurry, 2012). Το τριτερπένιο 63

80 ΕΙΣΑΓΩΓΗ λανοστερόλη, για παράδειγμα, είναι η πρόδρομη ένωση από την οποία βιοσυντίθενται όλες οι στεροειδείς ορμόνες, ενώ το τετρατερπένιο β-καροτένιο αποτελεί την κύρια διατροφική πηγή της βιταμίνης Α Βιοσύνθεση τερπενίων Το ισοπρένιο δεν είναι η βιολογικά πρόδρομη ένωση των τερπενίων. Στη φύση για τη βιοσύνθεση των τερπενίων χρησιμοποιούνται δύο «ισοδύναμα ισοπρενίου», το πυροφωσφορικό ισοπεντενύλιο (IPP) και το πυροφωσφορικό διμεθυλαλλύλιο (DMAPP) (McMurry, 2012). Τα μόρια αυτά που περιέχουν πέντε άτομα άνθρακα προέρχονται από τη συμπύκνωση τριών μονάδων ακέτυλο CoA, μέσω της πορείας του μεβαλονικού οξέος (MVA) ή από ένωση πυροσταφυλικού οξέος με φωσφογλυκεραλδεΰδη μέσω της πορείας πυροσταφυλικού φωσφογλυκεραλδεύδης (MEP), όπως φαίνεται στο Σχήμα 5. Το πυροφωσφορικό διμεθυλαλλύλιο είναι ένα δραστικό αλκυλιωτικό μέσο σε αντιδράσεις τύπου SN 2, γιατί η πρωτοταγής αλλυλική πυροφωσφορική ομάδα αποτελεί καλή αποχωρούσα ομάδα. Η υποκατάστασή της από τον πυρηνόφιλο δεσμό C=C του πυροφωσφορικού ισοπεντενυλίου, ακολουθούμενη από απώλεια ενός πρωτονίου στο ενδιάμεσο καρβοκατιόν που σχηματίζεται, οδηγεί με σύζευξη κεφαλής-ουράς, στο σχηματισμό ενός μορίου με 10 άτομα άνθρακα, του πυροφοσφωρικού γερανυλίου (GPP). Η αντίστοιχη αλκοόλη, η γερανιόλη, είναι ένα τερπένιο με ευχάριστη οσμή που αποτελεί συστατικό του ροδελαίου. Το πυροφωσφορικό γερανύλιο αποτελεί την πρόδρομη ένωση βιοσύνθεσης όλων των μονοτερπενίων. Για παράδειγμα, το λεμονένιο, ένα μονοτερπένιο που απαντά σε αρκετά αιθέρια έλαια εσπεριδοειδών, σχηματίζεται από το πυροφωσφορικό γερανύλιο με cis-trans ισομερείωση του διπλού δεσμού, απόσπαση της πυροφωσφορικής ομάδας και τελικά αποβολή ενός πρωτονίου. Περαιτέρω αντίδραση του πυροφωσφορικού γερανυλίου με πυροφωσφορικό ισοπεντενύλιο οδηγεί στο σχηματισμό του πυροφωσφορικού φαρνεσυλίου (FPP), το οποίο περιέχει 15 άτομα άνθρακα και αποτελεί την πρόδρομη ένωση βιοσύνθεσης όλων των σεσκιτερπενίων. Η αντίστοιχη αλκοόλη, η φαρνεσόλη, απαντά στο αιθέριο έλαιο του κίτρου και του λεμονιού. 64

81 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Με περαιτέρω αντίδραση του πυροφωσφορικού φαρνεσυλίου με πυροφωσφορικό ισοπεντενύλιο σχηματίζονται αρχικά μονάδες με 20 και κατόπιν μονάδες με 25 άτομα άνθρακα, οι οποίες χρησιμεύουν ως πρόδρομες ενώσεις βιοσύνθεσης των διτερπενίων και των σεστερτερπενίων, αντίστοιχα. Ωστόσο, τα τριτερπένια δε σχηματίζονται από περαιτέρω αντίδραση με πυροφωσφορικό ισοπεντενύλιο, αλλά με αναγωγική σύζευξη ουράς με ουρά δύο μορίων πυροφοσφορικού φαρνεσυλίου, οπότε σχηματίζεται το σκουαλένιο με 30 άτομα άνθρακα. Το σκουαλένιο είναι η πρόδρομη ένωση από την οποία βιοσυντίθενται όλα τα τριτερπένια και τα στεροειδή. 65

82 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 3 ακέτυλο-συνένζυμο Α (C2) φωσφογλυκεραλδεύδη πυροσταφυλικό πορεία μεβαλονικού οξέος πορεία πυροσταφυλικούφωσφορικής γλυκεραλδεύδης πυροφωσφορικό ισοπεντενύλιο IPP (C5) πυροφωσφορικό διμεθυλαλλύλιο DMAPP (C5) IPP 2xIPP 3xIPP πυροφωσφορικό γερανύλιο πυροφωσφορικό φαρνεσύλιο πυροφωσφορικό γερανύλ γερανύλιο GPP (C10) FPP (C15) GGPP (C20) x2 Μονοτερπένια (C10) Σεσκιτερπένια (C15) Σκουαλένιο (C30) φυτοένιο (C40) Τριτερπένια (C30) Τετρατερπένια (C40) Σχήμα 5. Βιοσύνθεση τερπενίων σε φυτά (τροποποιημένο από Wink, 2010) 66

83 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 8.2. Μονοτερπένια Τα μονοτερπένια χωρίζονται σε τρεις κατηγορίες: τα άκυκλα μονοτερπένια, τα μονοκυκλικά μονοτερπένια και τα δικυκλικά μονοτερπένια (Finar, 1975). Στα άκυκλα μονοτερπένια ανήκουν τα: μυρσένιο, οκιμένιο, λιναλοόλη, γερανιόλη, κιτρονελλόλη, κιτρονελλάλη, ιονόνες, κιτράλη (Πίνακας 10). Το μυρσένιο απαντά στο έλαιο της λουίζας και της δάφνης. Το οκιμένιο απαντά στα φύλλα του βασιλικού. Η λιναλοόλη απαντά στο ροδέλαιο με την (+) μορφή της και με την (-) μορφή της απαντά στο έλαιο του πορτοκαλιού. Η γερανιόλη βρίσκεται σε πολλά αιθέρια έλαια, κυρίως στο ροδέλαιο. Οι ιονόνες βρίσκονται στο ροδέλαιο. Η κιτράλη (κιτράλη α και κιτράλη β) περιέχεται σε ποσοστό 60-80% στο έλαιο του λεμονόχορτου 24 και έχει την οσμή λεμονιού. 24 Το λεμονόχορτο είναι βότανο με άρωμα εσπεριδοειδών. 67

84 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Πίνακας 10. Παραδείγματα άκυκλων μονοτερπενίων σε φυτά (τροποποίηση από: Belitz, 2009 Finar, 1975) Άκυκλα μονοτερπένια μυρσένιο trans-οκιμένιο cis-οκιμένιο λιναλοόλη γερανιόλη κιτρονελλόλη κιτρονελλάλη α-ιονόνη β-ιονόνη κιτράλη α (γερανιάλη) κιτράλη β (νεράλη) 68

85 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Στα μονοκυκλικά μονοτερπένια ανήκουν τα: α-τερπινεόλη, καρβόνη, λεμονένιο, μενθόλη και μενθόνη, πουλεγόνη, πιπεριτόνη (Πίνακας 11). Η α-τερπινεόλη βρίσκεται σε λουλούδια, όπως ο νάρκισσος και η φρέζια, σε βότανα όπως το φασκόμηλο και η μαντζουράνα και στο έλαιο που υπάρχει στη φλούδα των λεμονιών. Η καρβόνη απαντάται στο κύμινο, στον άνηθο και στον δυόσμο. Το λεμονένιο απαντά στα έλαια λεμονιού και πορτοκαλιού με την (+) μορφή του, στη μέντα με την (-) μορφή και με τη μορφή (±) στο τερεβινθέλαιο. Η μενθόλη και η μενθόνη βρίσκονται στη μέντα. Η πουλεγόνη και η πιπεριτόνη βρίσκονται στο έλαιο του φυτού φλισκούνι (Finar, 1975 Sell 2003). Πίνακας 11. Παραδείγματα μονοκυκλικών μονοτερπενίων σε φυτά (τροποποίηση από: Belitz, 2009 Sell, 2003 Finar, 1975) Μονοκυκλικά μονοτερπένια α-τερπινεόλη καρβόνη λεμονένιο μενθόλη μενθόνη πουλεγόνη πιπεριτόνη 69

86 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα δικυκλικά μονοτερπένια χωρίζονται σε τρεις ομάδες: την ομάδα των θουγενίου και καρανίου, την ομάδα του πινανίου και την ομάδα των καμφανίου, ισοκαμφανίου, φενχονίου και ισοβορνυλενίου. Στα κυριότερα δικυκλικά μονοτερπένια συγκαταλέγονται η καμφορά, το οξικό ισοβορνύλιο, το α-πινένιο, το β-πινένιο, το θουγένιο, το 3-καρένιο και το καμφένιο (Πίνακας 12). Η καμφορά βρίσκεται στο έλαιο που εξάγεται από το ξύλο του καμφορόδεντρου. Επίσης απαντάται σε πολλά λουλούδια, όπως η λεβάντα και σε πολλά βότανα όπως το φασκόμηλο και το δεντρολίβανο. Το οξικό ισοβορνύλιο βρίσκεται σε βότανα, όπως το φασκόμηλο, το θυμάρι, ο βασιλικός και η ρίγανη και σε λουλούδια, όπως η βορόνια. Τα πινένια βρίσκονται στο τερεβινθέλαιο των κωνοφόρων δέντρων. Το θουγένιο βρίσκεται στο έλαιο των φύλλων του κέδρου και στο φασκόμηλο. Το 3- καρένιο απαντάται στα κωνοφόρα δέντρα, σε μπαχαρικά (όπως το μαύρο πιπέρι) και σε φρούτα, όπως το μάνγκο. Το καμφένιο απαντάται σε έλαιο φύλλων πολλών δέντρων με κύριο τον ευκάλυπτο και απαντάται ακόμη στο τζίτζερ και στο δεντρολίβανο (Sell 2003). 70

87 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Πίνακας 12. Παραδείγματα δικυκλικών μονοτερπενίων σε φυτά (τροποποίηση από: Belitz, 2009 Sell, 2003 Finar, 1975) Δικυκλικά μονοτερπένια καμφορά οξικό ισοβορνύλιο α-πινένιο β-πινένιο θουγένιο Δ-3-καρένιο καμφένιο 71

88 72 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

89 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 9. ΣΤΟΧΟΙ ΤΗΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ Η ανάγκη της αγοράς για καινοτόμα προϊόντα στον τομέα των προβιοτικών τροφίμων αποτέλεσε εφαλτήριο για την εκπόνηση της παρούσας διδακτορικής διατριβής, η οποία πραγματεύεται την παρασκευή προβιοτικών γαλακτοκομικών προϊόντων. Ιδιαίτερη έμφαση δίνεται στη χρήση της πίσσας Πάφου ως συστατικό των παραγόμενων προϊόντων. Η πίσσα Πάφου αποτέλεσε κατάλληλο υπόστρωμα για την ακινητοποίηση του μικροοργανισμού L. casei. Ο παραγόμενος βιοκαταλύτης προστέθηκε κατά τη παραγωγική διαδικασία γαλακτοκομικών προϊόντων και μελετήθηκε η επίδρασή του στα φυσικοχημικά και μικροβιολογικά συστατικά τους. Επιλέχθηκε η χρήση του στελέχους L. casei ATCC 393. Η επιλογή αυτή βασίστηκε σε in vitro μελέτες της βιωσιμότητας του στελέχους σε προσομοιωμένες συνθήκες του γαστρεντερικού σωλήνα (Choi και συνεργάτες, 2006) καθώς και σε in vivo επιβίωση του στελέχους (Foligne και συνεργάτες 2007 Sidira και συνεργάτες 2010 Saxami και συνεργάτες, 2012), που του αποδίδουν τον χαρακτηρισμό προβιοτικό. Γιαούρτι, λευκό τυρί άλμης, τυρί τυρογάλακτος και ρόφημα τυρογάλακτος είναι τα προϊόντα που παρήχθησαν. Κύριος στόχος της διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη της δυνατότητας χαρακτηρισμού των παραγόμενων προϊόντων ως προβιοτικά. Οι στόχοι της διδακτορικής διατριβής συνοψίζονται ως εξής: 1) παραγωγή νέων τύπου γαλακτοκομικών προϊόντων με τη χρήση ακινητοποιημένων κυττάρων L. casei σε πίσσα Πάφου ως πρόσθετη καλλιέργεια, 2) μελέτη της επιβίωσης της προβιοτικής πρόσθετης καλλιέργειας κατά την αποθήκευση των γαλακτοκομικών προϊόντων και 3) μελέτη της επίδρασης της πρόσθετης καλλιέργειας και της πίσσας Πάφου στα φυσικοχημικά, μικροβιολογικά και οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των γαλακτοκομικών προϊόντων κατά την αποθήκευσή τους. 73

90 74

91 Β. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 75

92 76 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

93 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 10. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ Σχήμα 6. Πειραματική πορεία που ακολουθήθηκε κατά την εκπόνηση της διδακτορικής διατριβής 77

94 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 11. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Όργανα-Συσκευές α. Ζυγός ακριβείας τεσσάρων δεκαδικών (A-220BC, Cobos precision, Spain) β. Επωαστικοί κλίβανοι (Incucell, MMM Medcenter, Müncen, Germany) γ. Φυγόκεντρος (3K12, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) δ. Ηλεκτρονικό πεχάμετρο της SENTRON (μοντέλο 1001) ε. Λυοφιλιωτής (Freezone 4.5, Labconco, Kansas City, Missouri) ζ. Μονάδα απόσταξης kjeldahl (Distillation Unit UDK 126, Velp Scientifica, Italy) η. Συσκευή χώνευσης kjeldahl (Digester DK6, Velp Scientifica, Italy) θ. Αέριος χρωματογράφος (GC-8A, Shimadzu Co., Kyoto, Japan) ι. Αέριος χρωματογράφος-φασματογράφος μάζας (μοντέλο Shimadzu GC-17A, MS QP5050, Kyoto, Japan) στ. Υγρός χρωματογράφος υψηλής απόδοσης (LC-9A, Shimadzu Co., Kyoto, Japan) Παραγωγή βιομάζας του μικροοργανισμού L. casei Στη παρούσα διδακτορική διατριβή έγινε χρήση του μικροοργανισμού L. casei ATCC Ο μικροοργανισμός εμβολιάστηκε σε 10 ml υγρό θρεπτικό μέσο MRS broth 26, επωάστηκε στους 37 C για h και αναπτύχθηκε. Στη συνέχεια έγινε εμβολιασμός του παραγόμενου μικροοργανισμού σε 100 ml υγρό θρεπτικό μέσο MRS broth και αφέθηκε για επώαση στους 37 C για h. Η διαδικασία αυτή επαναλήφθηκε σταδιακά σε υγρό θρεπτικό μέσο MRS broth των 200 ml, 500 ml και 1000 ml. Η παραγόμενη βιομάζα (7-8 g υγρής βιομάζας L. casei/l) παραλήφθηκε με φυγοκέντρηση για 10 min σε 5000 rpm στους 20 C. 25 Ο L. casei ATCC 393 παρελήφθηκε σε λυοφιλιωμένη μορφή από την Γερμανική εταιρεία DSMZ 26 Το MRS broth είναι ένα εμπορικό σκεύασμα που περιέχει εκχύλισμα ζύμης (0,50 % w/v), γλυκόζη (2 % w/v), KH 2 PO 4 (0,2 % w/v), K 2 HPO 4 (0,2 % w/v), οξικό νάτριο (0,50 % w/v), κιτρικό αμμώνιο (0,20 % w/v), Tween 80 (0,01 % w/v), MgSO 4.7H 2 O (0,01 % w/v) και MnSO 4. H 2 O (0,005 % w/v). Είναι κατάλληλο για την ανάπτυξη βακτηρίων του γένους Lactobacillus. Παρασκευάζεται με διάλυση εμπορικού στερεού παρασκευάσματος MRS broth σε νερό σύμφωνα με τις οδηγίες του παρασκευαστή. Το μίγμα αναδεύεται μέχρι πλήρους διαύγασης και αποστειρώνεται για 15 min στους 130 C και σε πίεση 1,5-2 atm σε αυτόκλειστο. Το ph του παραγόμενου θρεπτικού υγρού MRS broth ισούται με 6,2±0,2. 78

95 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Πίσσα Πάφου Το υπόστρωμα που χρησιμοποιήθηκε για την ακινητοποίηση κυττάρων L. casei ήταν η πίσσα Πάφου Ακινητοποίηση κυττάρων L. casei στην πίσσα Πάφου Ποσότητα 5 g πίσσας Πάφου (σε μικρά κομμάτια), τοποθετήθηκε σε ποτήρι ζέσεως που περιείχε 50 ml υγρής καλλιέργειας L. casei (ποσότητα 1 g βιομάζας περιεχόμενη σε 50 ml MRS broth), και επωάστηκε για h στους 27 C με ταυτόχρονη περιοδική ανάδευση. Στη συνέχεια το ζυμωμένο υγρό απομακρύνθηκε και ο παραγόμενος ακινητοποιημένος στη πίσσα Πάφου βιοκαταλύτης εκπλύθηκε με αποστειρωμένο διάλυμα ringer 28, ώστε να απομακρυνθούν τα κύτταρα του L. casei που δεν είχαν ακινητοποιηθεί στην πίσσα Πάφου. Ακολούθησε ψύξη στους -45 C (με ρυθμό ψύξης 3 C/min), λυοφιλίωση υπό κενό στα bar στους -45 C για 48 h και τέλος κονιοποίηση του παραχθέντος ακινητοποιημένου βιοκαταλύτη Ποιοτικός προσδιορισμός ακινητοποιημένων κυττάρων L. casei σε πίσσα Πάφου Ποσότητα από το λυοφιλιωμένο ακινητοποιημένο βιοκαταλύτη ( 11.4.) καλύφθηκε επιφανειακά με χρυσό για 3 min σε συσκευή Balzers SCD 004 Sputter Coater (για την αύξηση της ηλεκτρικής αγωγιμότητας) και λήφθηκε μικροφωτογραφία αυτού με χρήση ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σάρωσης Ποσοτικός προσδιορισμός ακινητοποιημένων κυττάρων L. casei σε πίσσα Πάφου Σε πλαστικό περιέκτη (που είχε ζυγιστεί σε ζυγό τριών δεκαδικών) ζυγίστηκε με ακρίβεια τριών δεκαδικών 1 g βιομάζας L. casei, προστέθηκε 50 ml θρεπτικού υγρoύ MRS broth και ακολούθησε προσθήκη 5 g πίσσας Πάφου, η οποία είχε προηγουμένως μετατραπεί σε μικρά κομμάτια και είχε ζυγιστεί με ακρίβεια τριών 27 Η πίσσα Πάφου λήφθηκε από εταιρεία παραγωγής πίσσας της Κύπρου. 28 Το διάλυμα ringer είναι ένα ισότονο διάλυμα χλωριούχων αλάτων (NaCl, ΚCl και CaCl 2 ) 29 Jeol model JSM

96 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ δεκαδικών. Για την ακινητοποίηση των κυττάρων L. casei στη πίσσα Πάφου, ο περιέκτης τοποθετήθηκε σε θερμοθάλαμο στους 27 C και αφέθηκε για διάστημα 24 h. Στη συνέχεια αποχύθηκε το ζυμωμένο θρεπτικό υγρό από τον περιέκτη και ακολούθησαν διαδοχικές εκπλύσεις της πίσσας Πάφου με τα ακινητοποιημένα σε αυτή κύτταρα L. casei με θρεπτικό υγρό MRS broth και ο περιέκτης τοποθετήθηκε σε λυοφιλιωτή για μία ημέρα. Ακολούθησε ζύγισή του, οπότε εξήχθη το βάρος της πίσσας Πάφου με τα ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei. Η ίδια πορεία ακολουθήθηκε χωρίς τη χρήση βιομάζας L. casei και εξήχθη το βάρος της πίσσας Πάφου μετά τη λυοφιλίωση που δεν είχε ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei. Από τη διαφορά του βάρους που προσδιορίστηκε στις δύο παραπάνω μετρήσεις προέκυψε το ποσοστό των ακινητοποιημένων σε πίσσα Πάφου κυττάρων L. casei Παραγωγή γιαουρτιού με χρήση ακινητοποιημένων κυττάρων L. casei σε πίσσα Πάφου Παρασκευάστηκαν παρτίδες γιαουρτιών με προσθήκη σε παστεριωμένο πρόβειο γάλα ακινητοποιημένων κυττάρων L. casei σε πίσσα Πάφου. Οι παρτίδες περιείχαν τον ακινητοποιημένο βιοκαταλύτη σε συγκεντρώσεις 0,3/0,6/1,2 g ανά 100 ml γάλακτος. Ο ακινητοποιημένος βιοκαταλύτης προστέθηκε σε γάλα (που βρισκόταν σε θερμοκρασία δωματίου) με ταυτόχρονη ανάδευσή του και στη συνέχεια προστέθηκε μίγμα των μικροοργανισμών S. thermophilus και L. delbrueckii subsp. bulgaricus (αναλογία 1:1). Το μίγμα επωάστηκε στους 45 ο C για 3-4 h, οπότε επήλθε πήξη του γάλακτος. Ακολούθησε ψύξη και αποθήκευση των παραγόμενων γιαουρτιών στους 4 C για διάστημα 60 ημερών. Για λόγους σύγκρισης παράλληλα με τις παραπάνω παρτίδες γιαουρτιών παρασκευάστηκαν και γιαούρτια χωρίς τη χρήση ακινητοποιημένου βιοκαταλύτη 80

97 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ καθώς και γιαούρτια με προσθήκη ελεύθερων κυττάρων του μικροοργανισμού L. casei (1 g βιομάζας 30 /100 ml γάλακτος) Παραγωγή λευκού τυριού άλμης με χρήση ακινητοποιημένων κυττάρων L. casei σε πίσσα Πάφου Ποσότητα παστεριωμένου πρόβειου γάλατος θερμάνθηκε στους 37 ο C και έγινε προσθήκη εμπορικής πυτιάς (0,01%). Το μίγμα έμεινε σε ηρεμία για 40 min στους 37 ο C μέχρι την πήξη του γάλακτος. Το παραγόμενο πήγμα διαιρέθηκε σε τετράγωνα κομμάτια των περίπου 5 cm και τοποθετήθηκε σε αποστειρωμένη τσαντίλα για στράγγιση με ταυτόχρονη απομάκρυνση του τυρογάλακτος. Πριν το πήγμα τοποθετηθεί σε καλούπι (για την απόκτηση του σχήματός του), έγινε προσθήκη του ακινητοποιημένου στη πίσσα Πάφου βιοκαταλύτη, ως πρόσθετη καλλιέργεια, σε συγκεντρώσεις 0,2/0,3/0,9 ανά 100 g πήγματος. Ακολούθησε ανάδευση του όλου για την επίτευξη ομοιογενούς κατανομής του ακινητοποιημένου βιοκαταλύτη σε όλη τη μάζα του πήγματος. Τα παραγόμενα λευκά τυριά άλμης αλατίστηκαν επιφανειακά την πρώτη ημέρα παρασκευής τους και τη δεύτερη ημέρα τοποθετήθηκαν μέσα σε αποστειρωμένο διάλυμα άλμης (7%) και παρέμειναν για διάστημα 90 ημερών στους 4 C. Για λόγους σύγκρισης παράλληλα με τις παραπάνω παρτίδες λευκών τυριών άλμης παρασκευάστηκαν και λευκά τυριά άλμης χωρίς τη χρήση ακινητοποιημένου βιοκαταλύτη καθώς και λευκά τυριά άλμης με προσθήκη ελεύθερων κυττάρων του μικροοργανισμού L. casei (1 g βιομάζας 31 /100 g πήγματος) Παραγωγή τυριού τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» με χρήση ακινητοποιημένων κυττάρων L. casei σε πίσσα Πάφου Σε παστεριωμένο πρόβειο γάλα προστέθηκε εμπορική πυτιά (0,01%) και το μίγμα αφέθηκε σε ηρεμία για 1 h, ώστε να παραχθεί το τυρόπηγμα. Στη συνέχεια, το πήγμα διαιρέθηκε σε τετράγωνα (ακμής περίπου 1 cm), αφέθηκε σε ηρεμία για 10 min και στη συνέχεια το πήγμα διηθήθηκε με τη βοήθεια τσαντίλας σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (18-22 C). Ακολούθησε θέρμανση με ρυθμό 1,5 C/min έως στους 30 που παρήχθηκε όπως φαίνεται στη που παρήχθηκε όπως φαίνεται στην

98 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 75 C κατόπιν με ρυθμό 1 C/min έως τους 90 C. Η συνολική διάρκεια της θέρμανσης ήταν 45 min. Μετά έγινε ρύθμιση της τιμής του ph σε τιμή μεταξύ 5,2 και 5,8 με προσθήκη διαλύματος κιτρικού οξέος 10%, ακολούθησε θέρμανση για 10 min στους 90 C, παραμονή για 20 min στο θερμό τυρόγαλα και στη συνέχεια απομακρύνθηκε η μετουσιωμένη πρωτεΐνη. Το μίγμα τοποθετήθηκε σε καλούπια και εφαρμόστηκε πίεση. Ακολούθησε προσθήκη του ακινητοποιημένου βιοκαταλύτη 0,5 g ανά 100 g πήγματος και ανάδευση του όλου για την επίτευξη ομοιογενούς κατανομής του ακινητοποιημένου βιοκαταλύτη σε όλη τη μάζα του παραγόμενου τυριού τυρογάλακτος. Για λόγους σύγκρισης παράλληλα με το παραπάνω τυρί τυρογάλακτος παρασκευάστηκε και τυρί τυρογάλακτος χωρίς τη χρήση ακινητοποιημένου βιοκαταλύτη καθώς και τυρί τυρογάλακτος με προσθήκη ελεύθερων κυττάρων του μικροοργανισμού L. casei (1 g βιομάζας 32 /100 g προϊόντος). Τέλος, τα παραγόμενα τυριά τυρογάλακτος μεταφέρθηκαν στους 4 C όπου παρέμειναν για διάστημα 20 ημερών Παραγωγή ροφημάτων τυρογάλακτος με χρήση ακινητοποιημένων κυττάρων L. casei σε πίσσα Πάφου Αποπρωτεϊνωμένο τυρόγαλα παστεριώθηκε στους 65 C για 30 min και αφέθηκε να έρθει σε θερμοκρασία 37 C. Το όλο φυγοκεντρήθηκε και στη συνέχεια διηθήθηκε από χάρτινο ηθμό. Στο διαυγές πλέον υγρό η τιμή του ph ρυθμίστηκε στην τιμή 3,9 με προσθήκη ποσότητας διαλύματος κιτρικού οξέος 33 10%. Ακολούθησε βρασμός στους 85 C και προσθήκη ζάχαρης σε ποσοστό 15% επί του υγρού. Το ρόφημα μοιράστηκε σε κύπελλα αποστειρωμένα και αφέθηκε να κρυώσει. Προστέθηκε ακινητοποιημένος βιοκαταλύτης σε συγκέντρωση 0,3/0,6/1,2 g ανά 100 ml ροφήματος με ταυτόχρονη ανάδευση. Για λόγους σύγκρισης παράλληλα με τα παραπάνω ροφήματα τυρογάλακτος παρασκευάστηκε και ρόφημα 32 που παρήχθηκε όπως φαίνεται στην Το κιτρικό οξύ χρησιμοποιείται ως αρωματικό και συντηρητικό σε τροφές και σε μη αλκοολούχα κυρίως ποτά 82

99 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ τυρογάλακτος με προσθήκη ελεύθερων κυττάρων του μικροοργανισμού L. casei (1 g βιομάζας 34 /100 ml προϊόντος) Χημικές αναλύσεις που πραγματοποιήθηκαν στα παραγόμενα προϊόντα Στα παραγόμενα γιαούρτια, στα λευκά τυριά άλμης, στα τυριά τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» και στα παραγόμενα ροφήματα τυρογάλακτος πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός της τιμής ph, προσδιορισμός της τιτλοδοτούμενης οξύτητας, της συγκέντρωσης υπολειπόμενων σακχάρων (λακτόζης, γλυκόζης, γαλακτόζης) και έγιναν μικροβιολογικές αναλύσεις. Το αρωματικό προφίλ προσδιορίστηκε στα παραγόμενα γιαούρτια, στα τυριά τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» και στα παραγόμενα ροφήματα τυρογάλακτος. Επιπλέον, στα λευκά τυριά άλμης έγινε προσδιορισμός λίπους, τέφρας, ολικής πρωτεΐνης και υγρασίας Προσδιορισμός της τιμής ph Η τιμή ph των προϊόντων (είτε αυτά βρίσκονταν σε υγρή είτε σε στερεή μορφή) προσδιορίστηκε απευθείας από τη μάζα τους με τη χρήση αυτόματου ηλεκτρονικού πεχαμέτρου Προσδιορισμός τιτλοδοτούμενης οξύτητας Για τα γιαούρτια, ποσότητα 10 g από κάθε δείγμα γιαουρτιού και 10 ml απεσταγμένου νερού αναμίχθηκαν και το μίγμα ογκομετρήθηκε με διάλυμα NaOH 0,1 Ν παρουσία δείκτη φαινολοφθαλεΐνης. Η οξύτητα του γιαουρτιού εκφράστηκε σε g γαλακτικού οξέος/ 100 g γιαουρτιού. Για τα τυριά, ποσότητα 20 g δείγματος τυριού (λευκού τυριού άλμης ή τυριού τυρογάλακτος) πολτοποιήθηκαν με θερμό νερό (40 C) για την παραγωγή τελικού όγκου 210 ml και στη συνέχεια το μείγμα διηθήθηκε μέσω διηθητικού ηθμού. Ποσότητα 25 ml από το παραπάνω διήθημα, που αντιστοιχεί σε 2,5 g τυριού, ογκομετρήθηκε με διάλυμα NaOH 0,1 Ν και δείκτη φαινολοφθαλεΐνης. Η οξύτητα του τυριού εκφράστηκε σε g γαλακτικού οξέος/ 100 g τυριού. 34 που παρήχθηκε όπως φαίνεται στην

100 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Για τα ροφήματα τυρογάλακτος, ποσότητα 10 ml από κάθε δείγμα ογκομετρήθηκε με διάλυμα NaOH 0,1 Ν παρουσία δείκτη φαινολοφθαλεΐνης. Η οξύτητα του ροφήματος τυρογάλακτος εκφράστηκε σε g γαλακτικού οξέος/ 100 g ροφήματος Προσδιορισμός συναίρεσης σε γιαούρτια Η συναίρεση των γιαουρτιών προσδιορίστηκε σύμφωνα με τους Keogh και O'Kennedy (1998) μετά από τροποποιήσεις. Συγκεκριμένα, 15 g δείγματος γιαουρτιού φυγοκεντρήθηκαν σε 350 g για 10 min στους 4 C. Το ποσοστό της συναίρεσης υπολογίστηκε από το λόγο της μάζας του τυρογάλακτος που διαχωρίστηκε από τη μάζα του γιαουρτιού κατά τη φυγοκέντρηση προς την αρχική μάζα του γιαουρτιού, πολλαπλασιασμένο επί Προσδιορισμός γαλακτικού οξέος Για τον προσδιορισμό γαλακτικού οξέος, ποσότητα 5 g δείγματος γιαουρτιού αραιώθηκε εώς τα 200 ml με απεσταγμένο νερό. Ακολούθησε ομογενοποίηση και φυγοκέντρηση του λαμβανόμενου υγρού σε 5000 rpm για 20 min. Στo ληφθέν υπερκείμενο υγρό προσδιορίστηκε το γαλακτικό οξύ. Ο προσδιορισμός του γαλακτικού οξέος έγινε με ιονανταλλακτική υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (ion-hplc) Shimadzu με αντλία υψηλής πίεσης τύπου LC-10A, με θερμοστατούμενο φούρνο CTO-10A και αγωγιμομετρικό ανιχνευτή CDD-6A. Η στήλη του συστήματος ήταν τύπου Shim-pack IC-A1. Η θερμοκρασία ρυθμίστηκε στους 40 C. Ως κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε διάλυμα 2,5 mm φθαλικού οξέος και 2,4 mm τριυδροξυμεθυλ-αμινομεθάνιο (ph 4,0) σε νερό υψηλής καθαρότητας με ρυθμό ροής 1,5 ml/min. Δείγμα ίσο με 0,25 ml αραιώθηκε στα 25 ml και διηθήθηκε από μικροφίλτρο 0,45 μm και 50 μl του διηθημένου δείγματος εισήχθησαν απευθείας στη στήλη. Η συγκέντρωση του γαλακτικού οξέος υπολογίστηκε με τη χρήση πρότυπης καμπύλης αναφοράς. 84

101 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Προσδιορισμός σακχάρων Για τον προσδιορισμό σακχάρων, τα δείγματα κατεργάστηκαν αρχικά ως ακολούθως: Ποσότητα 5 g δείγματος γιαουρτιού αραιώθηκε εώς τα 200 ml με απεσταγμένο νερό. Ακολούθησε ομογενοποίηση και φυγοκέντρηση του λαμβανόμενου υγρού σε 5000 rpm για 20 min. Στo ληφθέν υπερκείμενο υγρό προσδιορίστηκαν τα σάκχαρα. Ποσότητα 20 g δείγματος τυριού πολτοποιήθηκε με θερμό νερό (40 C) για την παραγωγή τελικού όγκου 210 ml και στη συνέχεια το μίγμα διηθήθηκε μέσω διηθητικού ηθμού και στο διήθημα προσδιορίστηκαν τα σάκχαρα. Όσον αφορά στα ροφήματα τυρογάλακτος, δεν απαιτήθηκε ειδική προεργασία του δείγματος. Στη συνέχεια, ποσότητα ίση με 0,5 ml από το υπερκείμενο υγρό που λήφθηκε μετά τη φυγοκέντρηση γιαουρτιού (όπως αναφέρθηκε παραπάνω) ή διηθήματος από διήθηση τυριού (όπως αναφέρθηκε παραπάνω) ή ροφήματος τυρογάλακτος αναμίχθηκε με ποσότητα 2,5 ml από διάλυμα 1% v/v 1-βουτανόλης (εσωτερικό πρότυπο) και το όλο αραιώθηκε με νερό υψηλής καθαρότητας στα 50 ml, έτσι ώστε να επιτευχθεί συγκέντρωση εσωτερικού προτύπου στο τελικό ενέσιμο διάλυμα ίση με 0,05% v/v. Στη συνέχεια, το τελικό διάλυμα διηθήθηκε με μικροφίλτρο 0,45 μm και 40 μl αυτού εισήχθησαν απευθείας στη στήλη υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης. Ο προσδιορισμός των σακχάρων πραγματοποιήθηκε με χρήση συστήματος υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC 35 ) της εταιρίας Shimadzu. Το σύστημα αυτό περιελάμβανε αντλία υψηλής πίεσης τύπου LC-9A, θερμοστατούμενο φούρνο CTO-10A και ανιχνευτή δείκτη διάθλασης RID-6A, συνδεδεμένο με ολοκληρωτή τύπου Shimadzu C-R6A. Χρησιμοποιήθηκε στήλη Shim-Pack SCR-101N 36, η οποία ήταν πακεταρισμένη με κατιονική ρητίνη. Ως κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε νερό υψηλής καθαρότητας (3D H 2 O) με ρυθμό ροής 0,8 ml/min και η θερμοκρασία του φούρνου ήταν ρυθμισμένη στους 60 C. Οι συγκεντρώσεις των σακχάρων προσδιορίστηκαν με χρήση προτύπων καμπυλών αναφοράς. 35 High Performance Liquid Chromatography 36 Στήλη Shim-Pack SCR-101N της SHIMADZU με διαστάσεις: 30 cm 7.9 mm i.d. 85

102 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Προσδιορισμός λίπους Ο προσδιορισμός του λίπους στα παραγόμενα λευκά τυριά άλμης πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο Soxhlet. Τοποθετήθηκαν σε φύσιγγα από πιεσμένο χαρτί 10 g δείγματος αφυδατωμένου τυριού και καλύφθηκαν με βαμβάκι. Η φύσιγγα τοποθετήθηκε σε εκχυλιστήρα συσκευής Soxhlet και ο ψυκτήρας συνδέθηκε με νερό συνεχούς ροής. Ζυγίστηκε με ακρίβεια ο υποδοχέας της συσκευής και συνδέθηκε η συσκευή σε υδρόλουτρο θερμοκρασίας 80 C. Προστέθηκε αιθέρας στον εκχυλιστήρα και έγιναν περίπου 20 σιφωνισμοί για 4 h, που είχαν ως αποτέλεσμα την εκχύλιση του λίπους με τη βοήθεια του αιθέρα στον υποδοχέα της συσκευής. Διακόπηκε η εκχύλιση, εξατμίστηκε ο αιθέρας και ζυγίστηκε ο υποδοχέας. Το ποσοστό του λίπους υπολογίστηκε επί ξηρού Προσδιορισμός τέφρας Ποσότητα 2 g από κάθε δείγμα τυριού τοποθετήθηκε σε προζυγισμένη κάψα. Τα δείγματα κάηκαν σε φλόγα και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε κλίβανο στους 550 C μέχρι την τεφροποίησή τους. Στη συνέχεια, όταν ήρθαν σε θερμοκρασία περιβάλλοντος ζυγίστηκαν μέχρι επιτεύξεως σταθερού βάρους. Υπολογίστηκε το ποσοστό της τέφρας επί ξηρού Προσδιορισμός υγρασίας Σε κάψα αλουμινίου, η οποία περιείχε άμμο και είχε ξηρανθεί στους 105 C ζυγίστηκαν 1,5 2,0 g τυριού (λευκού τυριού άλμης ή τυριού τυρογάλακτος). Ακολούθησε πολύ καλή ανάδευση του δείγματος με την άμμο και η κάψα τοποθετήθηκε σε κλίβανο στους 105 C για 2 h μέχρι επίτευξης σταθερού βάρους. Σημειώνεται ότι στα πρώτα 30 min το περιεχόμενο της κάψας ανακατευόταν συχνά για την αποφυγή επιφανειακής ξήρανσης που θα παρεμπόδιζε την περαιτέρω ξήρανση της μάζας. Η απώλεια βάρους της κάψας που περιέχει το δείγμα αντιστοιχεί στην υγρασία του δείγματος. 86

103 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Προσδιορισμός ολικής πρωτεΐνης με τη μέθοδο Kjeldahl Ποσότητα 1 g δείγματος τυριού τοποθετήθηκε σε σωλήνα πέψης με 3 g θειϊκού καλίου (K 2 SO 4 ), 0,33 g θειϊκού χαλκού (CuSO 4.5H 2 O) και 10 ml πυκνού θειϊκού οξέος (H 2 SO 4 ). Ο σωλήνας τοποθετήθηκε στη συσκευή πέψης 37 στους 425 C για 35 min. Μετά την παραπάνω επεξεργασία, ο σωλήνας πέψης μεταφέρθηκε σε μονάδα απόσταξης 38. Ως παραλήπτης του αποστάγματος χρησιμοποιήθηκε μία κωνική φιάλη που περιείχε 40 ml διαλύματος 0,1 Ν HCl. Στη συνέχεια, 60 ml διαλύματος NaOH 30% μεταφέρθηκαν αυτόματα στον σωλήνα χώνευσης και η απόσταξη ξεκίνησε. Η απόσταξη σταμάτησε όταν ο τελικός όγκος του αποστάγματος έφτασε στα 150 ml στον συλλέκτη. Το συλλεχθέν απόσταγμα ογκομετρήθηκε με διάλυμα 0,1 Ν NaOH παρουσία δείκτη ηλιανθίνης. Τελικά, τα προκύπτοντα g αζώτου πολλαπλασιάστηκαν με τον συντελεστή 6,38 και έτσι υπολογίστηκε το συνολικό ποσό των αζωτούχων υλών που περιέχονταν σε κάθε δείγμα τυριού. Το αποτέλεσμα εκφράστηκε ως g πρωτεΐνης/ 100 g τυριού επί ξηρού Προσδιορισμός αιθανόλης Δείγμα ροφήματος τυρογάλακτος διηθήθηκε με μικροφίλτρο 0,45 μm και 2 μl από το διήθημα εισήχθησαν απευθείας στη στήλη Porapac S 39 αέριου χρωματογράφου Shimadzu GC-8A. Ως φέρον αέριο χρησιμοποιήθηκε άζωτο με ροή 40 ml/min. Η θερμοκρασία του φούρνου ήταν ρυθμισμένη στους 120 C, αυξανόμενη στους 170 C με ρυθμό 10 C/min. Η θερμοκρασία του εισαγωγέα και του FID ανιχνευτή ήταν 210 C και 220 C, αντίστοιχα. Η συγκέντρωση της αιθανόλης προσδιορίστηκε με πρότυπη καμπύλη αναφοράς. 37 Digester DK6, Velp Scientifica, Italy 38 Distillation Unit UDK 126, Velp Scientifica, Italy 39 Στήλη Porapac S με διαστάσεις: 2 m, i.d. 0,125 in (Supelco, Bellefonte, PA, USA) 87

104 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Προσδιορισμός πτητικών συστατικών Για τον προσδιορισμό πτητικών συστατικών στα παραγόμενα προϊόντα χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της μικροεκχύλισης στερεάς φάσης (SPME 40 ) σε συνδυασμό με την αέριο χρωματογραφία/φασματοσκοπία μάζας (GC/MS 41 ). Ποσότητες ίσες με 7 g των παραγόμενων προϊόντων τοποθετήθηκαν σε κατάλληλα φιαλίδια υπερκείμενης φάσης (headspace vial) των 20 ml. Στα φιαλίδια προσαρμόστηκε ειδικό κάλυμμα (teflon-lined septum), διαμέσου του οποίου εισήχθη ειδική σύριγγα για SPME ανάλυση, η οποία έφερε ίνα 2 cm καλυμμένη με 50/30mm διβυνιλοβενζόλιο και ρητίνη Carboxen σε πολυδιμεθυλοσιλοξάνιο 42. Τα φιαλίδια με τα δείγματα θερμοστατήθηκαν στους 80 C για min. Οι προσροφημένες στην ίνα πτητικές ενώσεις προσδιορίστηκαν με αέριο χρωματογράφο Shimadzu GC-17A, που ήταν συνδεδεμένος με φασματογράφο μάζας MS QP5050. Χρησιμοποιήθηκε τριχοειδής στήλη Supelco CO Wax Ως φέρον αέριο χρησιμοποιήθηκε ήλιο με ροή 1,5 ml/min. Η θερμοκρασία του φούρνου προγραμματίστηκε αρχικά στους 35 C για 3 min, ακολούθησε αύξησή της με ρυθμό 5 C/min έως 110 C, μετά με ρυθμό 10 C/min αυξησή της έως 240 C και παραμονή στους 240 C για 10 min. Οι θερμοκρασίες του εισαγωγέα και του ανιχνευτή ήταν 280 C και 250 C, αντίστοιχα. Ο τρόπος λειτουργίας του φασματογράφου μάζας ήταν πρόσκρουσης ηλεκτρονίων (EI) 44, με την ενέργεια ορισμένη στα 70 ev και με εύρος μαζών m/z Η ταυτοποίηση των ενώσεων επιτεύχθηκε με δεδομένα φασματοσκοπίας μαζών από τις βιβλιοθήκες NIST107, NIST21 και SZTERP και με χρήση των δεικτών συγκράτησης kovats Μικροβιολογικές αναλύσεις Τα παραγόμενα προϊόντα υποβλήθηκαν σε μια διαδικασία προεργασίας πριν την πραγματοποίηση μικροβιολογικών αναλύσεων ως ακολούθως: 40 Solid phase microextraction 41 Gas chromatography/mass spectrometry 42 Divinylbenzene/Carboxen, Supelco, Bellefonte, PA, USA 43 Στήλη Supelco CO Wax-10 με διαστάσεις: 60 m, 0,32 mm i.d., 0,25 μm πάχος φιλμ 44 Electron impact 88

105 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Ποσότητα ίση με 10 g δείγματος γιαουρτιού ή 10 ml ροφήματος τυρογάλακτος τοποθετήθηκαν σε αποστειρωμένη σακούλα ομογενοποίησης, προστέθηκαν 90 ml αποστειρωμένου διαλύματος ringer και ακολούθησε ομογενοποίηση του γιαουρτιού ή του ροφήματος τυρογάλακτος σε ομογενοποιητή 45 για 210 s. Ποσότητα ίση με 10 g δείγματος τυριού (λευκού τυριού άλμης, τυριού τυρογάλακτος), τοποθετήθηκαν σε αποστειρωμένη σακούλα ομογενοποίησης, προστέθηκαν 90 ml αποστειρωμένου διαλύματος κιτρικού νατρίου 2% και ακολούθησε ομογενοποίηση του τυριού σε ομογενοποιητή για 210 s. Τα λαμβανόμενα ομογενοποιημένα δείγματα αραιώθηκαν με τη μέθοδο των διαδοχικών δεκαδικών αραιώσεων σε διάλυμα ringer και ακολούθησε ο προσδιορισμός μικροοργανισμών μετά από ανάπτυξή τους σε τρυβλία στα κατάλληλα θρεπτικά μέσα και κάτω από τις κατάλληλες κάθε φορά συνθήκες επώασης. Έγινε καταμέτρηση των σχηματιζόμενων αποικιών (το αποδεκτό εύρος καταμέτρησης αποικιών κυμαίνεται μεταξύ 30 και 300 τον αριθμό) και το αποτέλεσμα εκφράστηκε σε log cfu/ g προϊόντος. Πιο συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα θρεπτικά υλικά: Plate Count Agar (PCA) για τον προσδιορισμό της ολικής μεσόφιλης χλωρίδας με τη μέθοδο της ενσωμάτωσης και επώαση στους 30 C για 3 ημέρες. Violet red bile agar (VRBA) για τον προσδιορισμό των κολοβακτηρίων με τη μέθοδο της διπλής επίστρωσης και επώαση στους 30 C για 24 h. Violet red bile glucose agar (VRBGA) για τον προσδιορισμό των εντεροβακτηρίων με τη μέθοδο της διπλής επίστρωσης και επώαση στους 37 C για 24 h. M-17 agar για τον προσδιορισμό των λακτόκοκκων με τη μέθοδο της ενσωμάτωσης και επώαση στους 30 C για h. Baird Parker agar (BP) για τον προσδιορισμό των σταφυλόκοκκων με τη μέθοδο της επίστρωσης και επώαση στους 37 C για h. Brilliant Green agar (BG) για τον προσδιορισμό των σαλμονελλών με τη μέθοδο της επίστρωσης και επώαση στους 37 C για h. Potato Dextrose agar (PDA) για τον προσδιορισμό των ζυμών και των μυκήτων με τη μέθοδο της επίστρωσης και επώαση στους 30 C για 3-5 ημέρες. 45 Bagmixer 400P (Interscience) 89

106 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ MRS agar για τον προσδιορισμό των γαλακτικών βακτηρίων με τη μέθοδο της ενσωμάτωσης και επώαση στους 37 C για h. MRS agar παρουσία βανκομυκίνης 46 (στο MRS agar έχει προστεθεί σε ποσοστό 1% διάλυμα βανκομυκίνης συγκέντρωσης 0,05% w/v), για τον προσδιορισμό των κυττάρων L. casei με τη μέθοδο της ενσωμάτωσης και επώαση στους 37 C για h Στατιστική επεξεργασία αποτελεσμάτων Τα αποτελέσματα των αναλύσεων αποτελούν τον μέσο όρο τριών μετρήσεων και συνοδεύονται από την τυπική τους απόκλιση. Η ανάλυση διακύμανσης ANOVA χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των σημαντικών διαφορών των μέσων όρων των μετρήσεων. 46 Η βανκομυκίνη ανήκει στα γλυκοπεπτιδικά αντιβιοτικά 90

107 Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 91

108 92 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ

109 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 12. Ακινητοποίηση κυττάρων L. casei σε πίσσα Πάφου Ποιοτικός προσδιορισμός ακινητοποίησης κυττάρων L. casei σε πίσσα Πάφου με τη χρήση ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σάρωσης (SEM) Στο Σχήμα 7 φαίνονται ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε πίσσα Πάφου. Η φωτογραφία λήφθηκε με τη χρήση ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σάρωσης (SEM). (α) (*1700) (β) (*6500) Σχήμα 7. Μικροφωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σάρωσης (σε μεγενθύσεις 1700 και 6500) κυττάρων L. casei ακινητοποιημένων σε πίσσα Πάφου Ποσοτικός προσδιορισμός ακινητοποίησης κυττάρων L. casei σε πίσσα Πάφου Από τα πειράματα που διεξήχθηκαν προέκυψε ότι κατά μέσο όρο ακινητοποιούνται επιτυχώς 1,56 g κυττάρων του μικροοργανισμού L. casei σε 100 g πίσσας Πάφου (στα 5 g πίσσας ακινητοποιούνται 0,078 g υγρού μικροοργανισμού L. casei από το 1 g που προστέθηκε, δηλαδή στα 5 g πίσσας ακινητοποιείται ένα 7,8% κυττάρων L. casei σε υγρή μορφή). Επιπλέον προσδιορίστηκε ο αριθμός των κυττάρων L. casei που ακινητοποιούνται σε μία συγκεκριμένη ποσότητα πίσσας Πάφου. Συγκεκριμένα, ποσότητα 1 g ακινητοποιημένου βιοκαταλύτη προστέθηκε σε 9 ml διαλύματος ringer και ακολούθησε ανατάραξη του όλου σε ομογενοποιητή για 210 s. Έγινε προσδιορισμός των υπαρχουσών αποικιών στη πίσσα Πάφου με τη βοήθεια διαδοχικών δεκαδικών αραιώσεων σε διάλυμα ringer και ανάπτυξη σε τρυβλία σε θρεπτικό υλικό MRS agar στους 37 C για h. Προέκυψε ότι σε ποσότητα 1 g 93

110 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ακινητοποιημένου σε πίσσα Πάφου βιοκαταλύτη υπάρχουν αποικίες L. casei. Για απόδειξη της πλήρους αποκόλλησης των ακινητοποιημένων κυττάρων L. casei από την πίσσα Πάφου κατά την επεξεργασία με διάλυμα ringer, αποχύθηκε το διάλυμα της πρώτης ομογενοποίησης και προστέθηκε νέο διάλυμα ringer. Ακολούθησε ανατάραξη του όλου σε ομογενοποιητή για 210 s και στο προκύπτον υγρό δεν πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη αποικιών L. casei. 13. Γιαούρτια Η παρασκευή γιαουρτιών επιλέχθηκε να πραγματοποιηθεί με ταυτόχρονη προσθήκη της πρόσθετης καλλιέργειας του μικροοργανισμού L. casei με την αρχική καλλιέργεια των L. delbrueckii subsp. bulgaricus και S. thermophilus. Ο λόγος επιλογής της ταυτόχρονης προσθήκης αρχικής και πρόσθετης καλλιέργειας έγκειται στο γεγονός ότι η τεχνική αυτή είναι απλή και αρκετά διαδεδομένη στη βιομηχανία. Σημειώνεται ότι η πρόσθετη καλλιέργεια που χρησιμοποιήθηκε βρισκόταν υπό ακινητοποιημένη μορφή σε πίσσα Πάφου και για λόγους σύγκρισης και σε ελεύθερη μορφή. Κατά την αποθήκευση το γιαούρτι αποκτά χαμηλή τιμή ph, η οποία είναι ανασταλτικός παράγοντας για την ανάπτυξη μικροοργανισμών που δεν είναι οξυάντοχοι, όπως για παράδειγμα ο L. acidophilus και ο B. Bifidum (Shah και συνεργάτες, 1995). Σε αντίθεση, ο L. casei είναι ένας μικροοργανισμός ανθεκτικός σε χαμηλές τιμές ph και για αυτό ενδείκνυται η χρήση του ως πρόσθετης καλλιέργειας στην παραγωγή γιαουρτιών. Επιπλέον, πρόσφατα εκτιμήθηκαν οι προβιοτικές ιδιότητες των κυττάρων του μικροοργανισμού L. casei ATCC 393. Αποδείχτηκε η ικανότητα επιβίωσης του μικροοργανισμού διαμέσω του γαστρεντερικού σωλήνα, η ικανότητα προσκόλλησής του στο παχύ έντερο και η ικανότητά του να επιτυγχάνει ρύθμιση της εντερικής μικροχλωρίδας σε ποντίκια (Sidira και συνεργάτες, 2010 Saxami και συνεργάτες, 2012), γεγονός που το καθιστά άριστη επιλογή ως προβιοτικού μικροοργανισμού που μπορεί να προστεθεί σε τρόφιμα. 94

111 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Φυσικοχημικά χαρακτηριστικά παραγόμενων γιαουρτιών Τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των παραγόμενων γιαουρτιών παρουσιάζονται στον Πίνακα 13. Το χρησιμοποιούμενο γάλα για την παρασκευή των γιαουρτιών είχε τιμή ph ίση με 6,10, οξύτητα ίση με 0,19% και η συγκέντρωσή του σε λακτόζη ήταν ίση με 4,67%. Η πήξη του γάλακτος κατά τη διαδικασία παραγωγής γιαουρτιού επήλθε σε τιμή ph ίση με 4,6. Η μείωση της τιμής του ph και η αύξηση της οξύτητας κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης των γιαουρτιών είναι μία φυσική διαδικασία που προκαλείται από τη συνεχή παραγωγή γαλακτικού οξέος και άλλων οργανικών οξέων, οφειλόμενη στη δράση της καλλιέργειας εκκίνησης των L. delbrueckii subsp. bulgaricus και S. thermophilus. Από τον Πίνακα 13 φαίνεται ότι η τιμή του ph των παραγόμενων γιαουρτιών την πρώτη ημέρα αποθήκευσης βρισκόταν σε τιμές κυμαινόμενες από 4,1 με 4,4, μειωμένες από την τιμή 4,6, που είχαν όταν ολοκληρώθηκε η πήξη του γάλακτος. 95

112 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Πίνακας 13. Τιμή ph, τιτλοδοτούμενη οξύτητα, λακτόζη, γαλακτόζη και γαλακτικό οξύ παραγόμενων γιαουρτιών συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Είδος γιαουρτιού Μ Γιαούρτια μόνο με αρχική καλλιέργεια ΕΚ Γιαούρτια με ελεύθερα κύτταρα L. casei και αρχική καλλιέργεια ΑΚ0,3 Γιαούρτια με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε 0,3 g πίσσα Πάφου/100 ml γάλακτος και αρχική καλλιέργεια ΑΚ0,6 Γιαούρτια με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε 0,6 g πίσσα Πάφου /100 ml γάλακτος και αρχική καλλιέργεια ΑΚ1,2 Γιαούρτια με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε 1,2 g πίσσα Πάφου /100 ml γάλακτος και αρχική καλλιέργεια Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) Τιμή ph Τιτλοδοτούμενη Οξύτητα (g γαλακτικού οξέος/100g γιαουρτιού) Λακτόζη (g/100g γιαουρτιού) Γαλακτόζη (g/100g γιαουρτιού) Γαλακτικό Οξύ (g/100g γιαουρτιού) 1 4,35±0,03 0,90±0,05 2,50±0,11 0,83±0,07 0,79±0,05 3 4,00±0,03 1,04±0,06 2,46±0,12 0,96±0,08 0,97±0,06 7 4,02±0,03 1,06±0,06 2,43±0,12 0,99±0,08 1,06±0, ,00±0,02 1,26±0,07 2,43±0,12 1,05±0,08 1,13±0, ,97±0,02 1,33±0,08 2,34±0,10 1,07±0,10 1,23±0, ,85±0,02 1,46±0,09 2,27±0,09 1,19±0,10 1,29±0, ,70±0,02 1,50±0,09 2,12±0,10 1,35±0,12 1,43±0,07 1 4,06±0,02 1,13±0,07 2,53±0,11 0,52±0,05 1,05±0,05 3 3,98±0,02 1,16±0,07 2,33±0,11 0,56±0,05 1,05±0,05 7 3,97±0,03 1,20±0,07 2,03±0,10 0,60±0,05 1,06±0, ,85±0,02 1,46±0,08 2,00±0,09 0,62±0,04 1,37±0, ,81±0,02 1,49±0,09 1,91±0,08 0,63±0,05 1,45±0, ,79±0,02 1,60±0,10 1,84±0,08 0,70±0,06 1,59±0, ,62±0,02 1,64±0,10 1,81±0,09 0,79±0,07 1,63±0,10 1 4,22±0,03 0,94±0,06 2,51±0,12 0,30±0,03 0,73±0,04 3 4,14±0,03 1,08±0,06 2,48±0,11 0,40±0,04 0,94±0,06 7 4,14±0,02 1,11±0,07 2,38±0,11 0,43±0,03 0,97±0, ,13±0,02 1,10±0,06 2,36±0,12 0,45±0,04 1,11±0, ,11±0,03 1,40±0,08 2,30±0,11 0,49±0,04 1,30±0, ,10±0,02 1,49±0,09 2,25±0,09 0,70±0,06 1,41±0, ,98±0,02 1,57±0,09 2,08±0,08 0,70±0,05 1,48±0,07 1 4,38±0,03 0,95±0,06 2,50±0,10 0,33±0,03 0,70±0,04 3 4,36±0,03 0,95±0,06 2,39±0,10 0,34±0,03 0,90±0,05 7 4,36±0,03 1,00±0,07 2,35±0,12 0,43±0,04 0,97±0, ,32±0,03 1,07±0,07 2,30±0,10 0,43±0,04 0,99±0, ,23±0,02 1,36±0,08 2,31±0,11 0,48±0,04 1,27±0, ,18±0,03 1,50±0,09 2,30±0,09 0,68±0,06 1,47±0, ,14±0,02 1,54±0,09 2,06±0,09 0,69±0,06 1,51±0,08 1 4,43±0,03 0,92±0,06 2,57±0,10 0,19±0,02 0,79±0,05 3 4,34±0,03 0,93±0,06 2,45±0,12 0,25±0,02 0,95±0,06 7 4,30±0,03 0,91±0,05 2,39±0,11 0,27±0,02 0,95±0, ,24±0,03 1,02±0,06 2,37±0,12 0,35±0,03 0,97±0, ,20±0,02 1,35±0,09 2,35±0,12 0,45±0,04 1,24±0, ,11±0,02 1,62±0,10 2,31±0,11 0,55±0,05 1,50±0, ,01±0,02 1,65±0,10 2,02±0,09 0,67±0,06 1,58±0,08 96

113 Τιμή ph ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Το γιαούρτι με τα ελεύθερα κύτταρα L. casei παρουσίασε τις χαμηλότερες τιμές ph σε όλη τη διάρκεια αποθήκευσής του συγκριτικά με τα υπόλοιπα γιαούρτια (Πίνακας 13, Σχήμα 8). Μετά από 60 ημέρες αποθήκευσης, το γιαούρτι με τα ελεύθερα κύτταρα L. casei είχε την χαμηλότερη τιμή ph (3,62) συγκριτικά με τα υπόλοιπα γιαούρτια. Η τιμή του ph του γιαουρτιού που περιείχε μόνο την αρχική καλλιέργεια (κοντρόλ) παρουσίασε και αυτό χαμηλή τιμή μετά από 60 ημέρες αποθήκευσης. Εντούτοις, δε παρατηρήθηκε στατιστική διαφορά της τιμής του ph μεταξύ του κοντρόλ και του γιαουρτιού με τα ελεύθερα κύτταρα. Στην περίπτωση των γιαουρτιών με τα ακινητοποιημένα σε πίσσα Πάφου κύτταρα L. casei παρατηρήθηκε καθυστέρηση στη μείωση της τιμής του ph κατά την αποθήκευση συγκριτικά με τα γιαούρτια που παρασκευάστηκαν με προσθήκη ελεύθερων κυττάρων L. casei και του κοντρόλ (Πίνακας 13, Σχήμα 8). Παρολαυτά, οι τιμές ph των γιαουρτιών με τα ακινητοποιημένα σε πίσσα Πάφου κύτταρα L. casei κυμάνθηκαν σε αποδεκτά επίπεδα αναφορικά με την οργανοληπτική ποιότητα των γιαουρτιών (4,0-4,4). 4,5 4,4 4,3 4,2 4,1 4 3,9 3,8 3,7 3,6 3,5 M EK AK0,3 AK0,6 AK1, Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) Σχήμα 8. Μεταβολή της τιμής του ph των παραγόμενων γιαουρτιών συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C 97

114 Οξύτητα ( g γαλακτικού οξέος / 100 g γιαουρτιού) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Σε όλα τα γιαούρτια εμφανίστηκε το φαινόμενο της μετοξίνησης, χωρίς όμως να επηρεάζεται η βιωσιμότητα του L. casei, ο οποίος είναι ένας οξυάντοχος μικροοργανισμός. Ο χρόνος αποθήκευσης, όπως αναμενόταν, επηρεάζει σημαντικά τα επίπεδα της οξύτητας σε όλα τα δείγματα (Πίνακας 13, Σχήμα 9). 1,80 1,70 1,60 1,50 1,40 1,30 1,20 1,10 1,00 0,90 0,80 M EK AK0,3 AK0,6 AK1, Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) Σχήμα 9. Μεταβολή της οξύτητας των παραγόμενων γιαουρτιών συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Διαφορά ως προς το γαλακτικό οξύ απαντάται μεταξύ του γιαουρτιού που περιέχει ελεύθερα κύτταρα L. casei και του κοντρόλ, ενώ δεν απαντάται σημαντική διαφορά (P>0,05) μεταξύ των γιαουρτιών που περιέχουν ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei (ποσότητα 0,3 g, 0,6 g και 1,2 g σε πίσσα Πάφου). Στα παραγόμενα γιαούρτια, στις 60 ημέρες αποθήκευσης, το γαλακτικό οξύ κυμαινόταν σε αποδεκτά επίπεδα (1,43-1,63 g γαλακτικού οξέος ανά 100 g γιαουρτιού), όπως φαίνεται στον Πίνακα 13. Ο L. casei φαίνεται να παράγει επιπρόσθετα γαλακτικό οξύ στην περίπτωση που βρίσκεται σε ελεύθερη μορφή ενώ βραδύτεροι ρυθμοί παραγωγής γαλακτικού οξέος με αποτέλεσμα τη βραδύτερη αύξηση της οξύτητας παρατηρούνται στα γιαούρτια που περιέχουν τα ακινητοποιημένα κύτταρα (Σχήμα 9, Σχήμα 10). Η σκληρή και ιξώδης μορφή της πίσσας πιθανότατα να μην επιτρέπουν την ανταλλαγή θρεπτικών συστατικών και των παραπροϊόντων ζύμωσης μεταξύ των ακινητοποιημένων κυττάρων και του γιαουρτιού. 98

115 Λακτόζη (g / 100 g γιαουρτιού) Γαλακτικό οξύ (g/ 100 g γιαουρτιού) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 1,80 1,60 1,40 M EK AK0,3 AK0,6 AK1,2 1,20 1,00 0,80 0, Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) Σχήμα 10. Μεταβολή του γαλακτικού οξέος των παραγόμενων γιαουρτιών συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Όσον αφορά στη συγκέντρωση της υπολειπόμενης λακτόζης στα παραγόμενα γιαούρτια, αυτή παρουσίασε κατά την πρώτη ημέρα αποθήκευσης των προϊόντων μείωση από την τιμή 4,67% που είχε στο γάλα σε τιμές που κυμάνθηκαν μεταξύ 2,43% και 2,57% (Πίνακας 13, Σχήμα 11) και εξακολούθησε να μειώνεται στη διάρκεια των 60 ημερών αποθήκευσης. 2,80 2,60 2,40 2,20 M EK AK0,3 AK0,6 AK1,2 2,00 1,80 1,60 1, Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) Σχήμα 11. Μεταβολή της λακτόζης των παραγόμενων γιαουρτιών συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C 99

116 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Σημαντική διαφορά (P<0,05) ως προς την υπολειπόμενη λακτόζη παρατηρήθηκε μεταξύ του κοντρόλ και του γιαουρτιού με τα ελεύθερα κύτταρα L. casei. Επιπλέον, σημαντική διαφορά (P<0,05) καταγράφτηκε στο γιαούρτι με τα ελεύθερα κύτταρα L. casei συγκριτικά με τα γιαούρτια που περιείχαν ακινητοποιημένα κύτταρα σε πίσσα Πάφου. Τέλος, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στην συγκέντρωση της υπολειπόμενης λακτόζης στα γιαούρτια με διαφορετική ποσότητα ακινητοποιημένου βιοκαταλύτη (P>0,05). Η λακτόζη πιθανότατα να καταναλώνεται κατά προτίμηση από τα ελεύθερα κύτταρα του L. casei παρά από τα ακινητοποιημένα κύτταρα του L. casei. Πιστεύουμε ότι η πίσσα Πάφου συγκρατεί τα ακινητοποιημένα σε αυτή κύτταρα με τέτοιο τρόπο που μειώνεται ο μεταβολισμός τους λόγω μηχανικής πίεσης. Οι βραδύτεροι μεταβολικοί ρυθμοί επιτρέπουν στα κύτταρα του L. casei να παραμένουν περισσότερο ζωτικά μέσα στην πίσσα. Το ποσοστό της γλυκόζης σε όλη τη διάρκεια αποθήκευσης των γιαουρτιών βρισκόταν σε μηδενική τιμή. Εάν και ο μεταβολισμός της λακτόζης έδινε γαλακτόζη και γλυκόζη, η τελευταία μεταβολιζόταν απευθείας από τους μικροοργανισμούς αφήνοντας ως τελικό προϊόν μεταβολισμού της λακτόζης τη γαλακτόζη. Το γεγονός αυτό δικαιολογείται από την προτίμηση που δείχνουν οι μικροοργανισμοί να μεταβολίζουν με ταχύτερο ρυθμό τους μονοσακχαρίτες συγκριτικά με τους δισακχαρίτες. Παρόμοια συγκέντρωση γαλακτόζης (P>0,05) μετά την πρώτη ημέρα αποθήκευσης και μέχρι την εξηκοστή ημέρα αποθήκευσης είχαν τα παραγόμενα γιαούρτια που περιείχαν κύτταρα L. casei σε ελεύθερη ή σε ακινητοποιημένη μορφή, ενώ το κοντρόλ εμφάνισε στατιστικά μεγαλύτερη ποσότητα γαλακτόζης (P<0,05) συγκριτικά με τα υπόλοιπα γιαούρτια, λόγω απουσίας πρόσθετης καλλιέργειας (Σχήμα 12). 100

117 Γαλακτόζη (g/ 100 g γιαουρτιού) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0, Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) M EK AK0,3 AK0,6 AK1,2 Σχήμα 12. Μεταβολή της γαλακτόζης των παραγόμενων γιαουρτιών συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Συναίρεση Η συναίρεση είναι ο διαχωρισμός της υγρής φάσης από τη πηκτή του γιαουρτιού, η οποία μπορεί να προέλθει αυθόρμητα ή μετά από κόψιμο, ανάδευση ή φυγοκέντρηση του γιαουρτιού. Η συναίρεση αποτελεί ανεπιθύμητο χαρακτηριστικό του γιαουρτιού. Για μείωση της συναίρεσης γίνεται προσθήκη στερεών και σταθεροποιητών στο γάλα πριν λάβει χώρα η ζύμωση. Στο Σχήμα 13 παρουσιάζεται η συναίρεση των παραγόμενων γιαουρτιών κατά την αποθήκευσή τους στους 4 C για διάστημα 60 ημερών. Σε όλες τις περιπτώσεις οι τιμές της συναίρεσης είναι υψηλές, πιθανότατα λόγω της μη προσθήκης στερεών στο γάλα κατά την παραγωγική διαδικασία. 101

118 Συναίρεση (%) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 65,00 60,00 55,00 50,00 45,00 40, Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) M EK AK0,3 AK0,6 AK1,2 Σχήμα 13. Μεταβολή της συναίρεσης των παραγόμενων γιαουρτιών συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Η παρουσία L. casei σε ελεύθερη ή σε ακινητοποιημένη μορφή σε πίσσα Πάφου αυξάνει τη συναίρεση στα γιαούρτια συγκριτικά με το κοντρόλ (P<0,05). Παρόμοια αποτελέσματα δίνουν και ο Mani-López και οι συνεργάτες του (2014), όσον αφορά γιαούρτια με ελεύθερα κύτταρα προβιοτικών μικροοργανισμών και γιαούρτια χωρίς παρουσία προβιοτικών μικροοργανισμών. Ο Mani-López και οι συνεργάτες του (2014) μελέτησαν τη συναίρεση σε εμπορικά γιαούρτια και σε προβιοτικά γιαούρτια που παρασκεύασαν οι ίδιοι με χρήση διαφόρων συνδυασμών των προβιοτικών μικροοργανισμών L. acidophilus, L. reuteri και L. casei και διαπίστωσαν ότι τα γιαούρτια του εμπορίου παρουσίαζαν μικρότερη συναίρεση συγκριτικά με τα παραγόμενα από αυτούς προβιοτικά γιαούρτια. Τα προβιοτικά γιαούρτια παρουσίαζαν τιμές συναίρεσης μεγαλύτερες από 40%. Σημειώνεται ότι ούτε ο Mani-López και οι συνεργάτες του (2014) δεν πρόσθεσαν επιπρόσθετα στερεά στη μάζα των παραγόμενων γιαουρτιών. Η παρουσία στερεών (πρωτεΐνες τυρογάλακτος) στα γιαούρτια αυξάνει την αλληλεπίδραση μεταξύ των πρωτεϊνών που είναι υπεύθυνες για το τρισδιάστατο δίκτυο της πηκτής. Αποτέλεσμα είναι η αύξηση της σταθερότητας της δομής της πηκτής με άμεσο επακόλουθο τη μείωση της συναίρεσης στα γιαούρτια. Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι η ύπαρξη προβιοτικών βακτηρίων σε γιαούρτι οδηγεί σε λήψη προϊόντος με φτωχά δομικά χαρακτηριστικά, συμπεριλαμβανομένης της 102

119 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ υψηλής συναίρεσης, γιατί τα προβιοτικά βακτήρια αναπτύσσονται αργά στο γάλα λόγω μειωμένης πρωτεολυτικής δραστικότητας (Dave και Shah, 1998). Ο Amatayakul και οι συνεργάτες του (2006) ανέφεραν τιμές συναίρεσης μεγαλύτερες από 45% σε γιαούρτια που περιείχαν 9 και 14% ολικά στερεά και που είχαν ζυμωθεί με χρήση αρχικών καλλιεργειών που παρήγαγαν εξωπολυσακχαρίτες και ο González-Martínez και οι συνεργάτες του (2002) ανέφεραν συναίρεση μεταξύ 23 και 36% σε γιαούρτια στα οποία είχε προστεθεί πρωτεΐνη τυρογάλακτος Μικροβιολογικό προφίλ παραγόμενων γιαουρτιών Στον Πίνακα 14 παρουσιάζεται το μικροβιολογικό προφίλ των παραγόμενων γιαουρτιών κατά τις εξήντα ημέρες αποθήκευσής τους στους 4 C. Περιλαμβάνει τους πληθυσμούς της αρχικής καλλιέργειας L. delbrueckii subsp. bulgaricus και S. thermophilus, της πρόσθετης καλλιέργειας L. casei και ορισμένων μικροοργανισμών που δύνανται να προκαλέσουν αλλοίωση στο προϊόν κατά το χρόνο αποθήκευσής του. Ο πληθυσμός της αρχικής καλλιέργειας βρισκόταν σε τιμές μεγαλύτερες από 10 7 cfu/g προϊόντος σε όλα τα γιαούρτια στις 60 ημέρες αποθήκευσης και δε μεταβλήθηκε σημαντικά με το χρόνο αποθήκευσης. 103

120 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Πίνακας 14. Πληθυσμοί ολικής μεσόφιλης χλωρίδας (ΟΜΧ), S. thermophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. casei, κολοβακτηρίων, εντεροβακτηρίων, ζυμών-μυκήτων, σταφυλόκοκκων και σαλμονέλλας στα παραγόμενα γιαούρτια συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C (log cfu/g) Είδος γιαουρτιού Μ Γιαούρτια μόνο με αρχική καλλιέργεια ΕΚ Γιαούρτια με ελεύθερα κύτταρα L. casei και αρχική καλλιέργεια Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) ΟΜΧ S. thermophilus L. delbrueckii subsp. bulgaricus L. casei Κολοβακτηρίδια Εντεροβακτηρίδια Ζύμες- Μύκητες Σταφυλόκοκκοι 1 8,37±0,38 9,06±0,41 9,02±0, ,61±0,40 8,98±0,41 8,60±0, ,36±0,39 8,91±0,41 8,34±0, ,82±0,41 9,02±0,44 8,30±0, ,36±0,38 8,64±0,41 8,08±0, ,48±0,39 8,03±0,39 7,79±0, ,33±0,37 7,47±0,37 7,34±0, ,30±0, ,16±0,37 9,28±0,42 9,18±0,41 8,99±0, ,80±0,40 9,28±0,43 9,09±0,42 8,00±0, ,44±0,40 9,19±0,42 8,98±0,44 7,95±0, ,89±0,43 9,15±0,45 8,84±0,43 7,92±0, ,92±0,42 9,05±0,43 8,84±0,42 7,83±0, ,70±0,40 8,87±0,43 8,66±0,42 7,57±0, ,52±0,41 8,81±0,44 8,58±0,43 7,09±0, ,00±0, Σαλμονέλλα 104

121 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Πίνακας 14. συνέχεια Είδος γιαουρτιού AK0,3 Γιαούρτια με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε 0,3 g πίσσα Πάφου/100 ml γάλακτος και αρχική καλλιέργεια AK0,6 Γιαούρτια με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε 0,6 g πίσσα Πάφου/100 ml γάλακτος και αρχική καλλιέργεια AK1,2 Γιαούρτια με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε 1,2 g πίσσα Πάφου/100 ml γάλακτος και αρχική καλλιέργεια Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) ΟΜΧ S. thermophilus L. delbrueckii subsp. bulgaricus L. casei Κολοβακτηρίδια Εντεροβακτηρίδια Ζύμες- Μύκητες Σταφυλόκοκκοι 1 8,78±0,42 9,78±0,48 9,38±0,45 8,75±0, ,37±0,41 9,48±0,48 9,21±0,43 8,56±0, ,26±0,39 9,38±0,46 9,16±0,39 8,46±0, ,05±0,37 9,28±0,45 9,08±0,41 8,28±0, ,01±0,40 9,22±0,41 9,00±0,39 8,20±0, ,82±0,39 9,22±0,43 8,89±0,41 8,18±0, ,42±0,37 8,74±0,42 8,60±0,40 8,08±0, ,16±0,38 9,33±0,46 9,27±0,44 8,86±0, ,71±0,40 9,30±0,43 9,26±0,37 8,71±0, ,60±0,40 9,26±0,42 8,97±0,44 8,7±0, ,26±0,41 8,98±0,40 8,67±0,40 8,64±0, ,19±0,41 8,96±0,44 8,44±0,43 8,58±0, ,00±0,40 8,95±0,43 8,40±0,42 8,46±0, ,86±0,39 8,67±0,42 8,37±0,38 8,18±0, ,21±0,41 9,53±0,47 9,12±0,46 9,10±0, ,91±0,39 9,37±0,45 8,93±0,46 9,07±0, ,84±0,41 9,31±0,44 8,92±0,45 8,99±0, ,83±0,42 9,26±0,41 8,88±0,41 8,93±0, ,77±0,43 9,20±0,41 8,84±0,44 8,84±0, ,65±0,40 9,00±0,41 8,77±0,42 8,71±0, ,02±0,38 8,95±0,35 8,63±0,41 8,33±0, Σαλμονέλλα 105

122 L.casei (log cfu/g γιαουρτιού) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Ο L. casei έχει προστεθεί στο γιαούρτι υπό την μορφή ελεύθερων κυττάρων και με τη μορφή ακινητοποιημένων κυττάρων σε πίσσα Πάφου. Ο πληθυσμός του L. casei σε όλα τα γιαούρτια την πρώτη ημέρα αποθήκευσης κυμάνθηκε από 8,75 με 9,10 log cfu/g, ενώ μετά από 35 ημέρες αποθήκευσης ο πληθυσμός της πρόσθετης καλλιέργειας μειώθηκε και κυμάνθηκε από 7,57 με 8,71 log cfu/g και μετά από 60 ημέρες αποθήκευσης κυμάνθηκε από 7,09 σε 8,33 log cfu/g. Ο πληθυσμός του L. casei επηρεάστηκε σημαντικά από τον χρόνο αποθήκευσης των γιαουρτιών και από τη φύση του προστιθέμενου L. casei. Γιαούρτι με ελεύθερα κύτταρα παρουσίασε μικρότερο πληθυσμό L. casei από ότι τα γιαούρτια με ακινητοποιημένα κύτταρα (P<0,05). Η βιωσιμότητα του L. casei δεν επηρεάστηκε σημαντικά (P>0,05) από τη ποσότητα του προστιθέμενου ακινητοποιημένου βιοκαταλύτη. (Πίνακας 14, Σχήμα 14, Σχήμα 15). 12,00 ΕΚ ΑΚ0,3 ΑΚ0,6 ΑΚ1,2 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0, Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) Σχήμα 14. Μεταβολή του πληθυσμού κυττάρων L. casei στα παραγόμενα γιαούρτια συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C 106

123 Βιωσιμότητα L.casei (%) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ EK AK0,3 AK0,6 AK1, Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) Σχήμα 15. Βιωσιμότητα κυττάρων L. casei στα παραγόμενα γιαούρτια κατά τις εξήντα ημέρες αποθήκευσής τους στους 4 C Από τον Πίνακα 14 και το Σχήμα 14 φαίνεται ότι ο προστιθέμενος στα γιαούρτια L. casei παραμένει πάνω από τη συγκέντρωση 10 8 cfu/g προϊόντος, γεγονός που καθιστά τα παραγόμενα γιαούρτια προβιοτικά. Η διατήρηση του μεγάλου ποσοστού βιωσιμότητας του L. casei κατά τη διάρκεια 60 ημερών αποθήκευσης των γιαουρτιών οφείλεται στην ανθεκτικότητά του σε χαμηλές τιμές ph και στην ακινητοποίησή του στην πίσσα Πάφου. Στη βιβλιογραφία έχουν αναφερθεί περιπτώσεις μείωσης της επιβίωσης προβιοτικών μικροοργανισμών όταν βρίσκονται σε γιαούρτια με τη πάροδο του χρόνου αποθήκευσης. Τέτοιο παράδειγμα αποτελεί η εργασία των Anukam και Olise (2012). Οι Anukam και Olise (2012) μελέτησαν την επίδραση του μικροοργανισμού L. pentosus KCA1 στην παρασκευή γιαουρτιού, χωρίς την ακινητοποίηση του μικροοργανισμού σε κάποιο υπόστρωμα και διαπίστωσαν μείωση της βιωσιμότητάς του κατά την αποθήκευση. Συγκεκριμένα, σκοπός τους ήταν η διαπίστωση της ικανότητας παρασκευής προβιοτικού γιαουρτιού, που περιέχει τον προβιοτικό μικροοργανισμό L. pentosus KCA1 και η εύρεση της βιωσιμότητας του μικροοργανισμού σε διάστημα 63 ημερών αποθήκευσης στους 4 C. Από την πρώτη ημέρα αποθήκευσης εώς την 49 η ημέρα παρατήρησαν μείωση του προβιοτικού μικροοργανισμού κατά τρεις λογαριθμικούς κύκλους. Επιπρόσθετα στη βιβλιογραφία αναφέρονται και περιπτώσεις, όπου η χρήση νέων συστατικών σε γιαούρτια δεν ενισχύει αλλά ούτε παρεμποδίζει την επιβίωση των προβιοτικών μικροοργανισμών. Μη ανασταλτική δράση ως προς την επιβίωση των προβιοτικών μικροοργανισμών σε γιαούρτι που παρασκευάστηκε με χρήση αιθερίων 107

124 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ελαίων ανέφερε ο Illupapalayam και οι συνεργάτες του (2014). Συγκεκριμένα, ο Illupapalayam και οι συνεργάτες του (2014) διαπίστωσαν ότι η παρουσία των αιθερίων ελαίων καρδάμου, κανέλλας και μοσχοκάρυδου σε γιαούρτια δεν επηρέασε τον προβιοτικό πληθυσμό των L. acidophilus και B. αnimalis ssp.lactis, που είχε προστεθεί ως πρόσθετη καλλιέργεια κατά τη διάρκεια 4 εβδομάδων αποθήκευσης των γιαουρτιών. Όμοια αποτελέσματα έχουν δημοσιευτεί από τον Behrad και τους συνεργάτες του (2009), οι οποίοι απέδειξαν ότι ο L. acidophilus επιβιώνει σε γιαούρτια που περιέχουν καρυκεύματα (εκχύλισμα κανέλλας και γλυκόρριζας) σε επίπεδο μεταξύ 10 6 και 10 7 cfu/ml για 28 ημέρες αποθήκευσης. Όσον αφορά στην ανάπτυξη παθογόνων μικροοργανισμών στα παραγόμενα γιαούρτια, δεν υπήρξε ανάπτυξη σαλμονέλλας, σταφυλόκκοκων, εντεροβακτηρίων και κολοβακτηρίων κατά την αποθήκευσή τους. Σύμφωνα με τους Adams και Moss, 2008, το γιαούρτι δεν αποτελεί κατάλληλο υπόστρωμα για ανάπτυξη παθογόνων μικροοργανισμών, χάρη στην υψηλή του οξύτητα και στο χαμηλή τιμή του ph (συνήθως 3,8-4,2). Για το λόγο αυτό δεν έχουν παρατηρηθεί τροφικές δηλητηριάσεις από γιαούρτι (με εξαίρεση την τροφική αλλαντίαση του 1989 στο Ηνωμένο Βασίλειο, η οποία προκλήθηκε από γιαούρτι που περιείχε πάστα φουντουκιού, λόγω κακής θερμικής επεξεργασίας της περιεχόμενης πάστας φουντουκιού). Απεναντίας το ίδιο το γιαούρτι διαθέτει αντιμικροβιακές ιδιότητες. Ο Jay (2000) αναφέρει ότι ο Goel και οι συνεργάτες του (1971) εξέτασαν τις αντιμικροβιακές ιδιότητες του γιαουρτιού με εμβολιασμό των μικροοργανισμών E. aerogenes και E. coli σε εμπορικά σκευάσματα. Μελετήθηκε η επιβίωση των μικροοργανισμών αυτών κατά την αποθήκευση των προϊόντων στους 7,2 C. Παρατηρήθηκε σημαντική μείωση και των δύο κολοβακτηρίων στο γιαούρτι μετά από παρέλευση 24 ωρών ενώ μετά από αποθήκευση τριών ημερών δεν ανιχνεύτηκαν, γεγονός που τεκμηριώνει την αντιμικροβιακή δράση του γιαουρτιού. Επιπρόσθετα της αντιμικροβιακής φύσης του γιαουρτιού, η πίσσα Πάφου που χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα ακινητοποίησης των κυττάρων L. casei προστάτεψε από αλλοίωση τα παραγόμενα γιαούρτια, ενδεχομένως λόγω των πλούσιων φαινολικών της συστατικών, τα οποία παρουσιάζουν αντιμικροβιακή δράση. Βέβαια, το γιαούρτι αλλοιώνεται από μικροοργανισμούς όπως οι ζύμες και οι μύκητες. Σημαντικό ρόλο στην αλλοίωση παίζουν ζύμες όπως ο Kluyveromyces fragilis και στην 108

125 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ περίπτωση γιαουρτιών με φρούτα ο S. cerevisiae, καθώς και μύκητες που αναπτύσσονται στην επιφάνεια των γιαουρτιών όπως οι Mucor, Rhizopus, Aspergillus, Penicillium και Alternaria. Για καλής ποιότητας γιαούρτι θα πρέπει το προϊόν να περιέχει περισσότερα από 10 8 cfu/g προϊόντος καλλιέργεια εκκίνησης, λιγότερο από 1 κολοβακτηρίδιο/g προϊόντος, λιγότερο από 1 μύκητα/g προϊόντος και λιγότερες από 10 ζύμες/g προϊόντος (τα γιαούρτια με φρούτα δύναται να περιέχουν 100 ζύμες/g χωρίς αλλοίωση της ποιότητάς τους) (Adams και Moss, 2008). Υπό συνήθεις συνθήκες αποθήκευσης σε χαμηλές θερμοκρασίες, ο αναμενόμενος χρόνος ζωής για το γιαούρτι αγγίζει τις τριάντα ημέρες. Υπό διαφορετικές συνθήκες, παρατηρείται γρήγορη ανάπτυξη ζυμών, η οποία οδηγεί σε αλλοίωση του προϊόντος (Viljoen και συνεργάτες, 2003). Στα γιαούρτια που παρασκευάστηκαν μόνο με την αρχική καλλιέργεια και στα γιαούρτια που περιείχαν ελεύθερα κύτταρα L. casei εμφανίστηκαν ζύμες την εξηκοστή ημέρα αποθήκευσης ενώ στα γιαούρτια με ακινητοποιημένα L. casei δεν εμφανίστηκε ανάπτυξη ζυμών, λόγω πιθανότατα της αντιμικροβιακής δράσης της πίσσας Πάφου Αρωματικό προφίλ παραγόμενων γιαουρτιών Σύμφωνα με την ανασκόπηση των Routray και Mishra (2011), στα ζυμούμενα προϊόντα απαντάται ένας μεγάλος αριθμός πτητικών βακτηριακών μεταβολιτών, οι οποίοι συμβάλλουν στο άρωμα και στη γεύση τους. Ορισμένα από αυτά είναι παραπροϊόντα της γαλακτικής ζύμωσης. Το γαλακτικό οξύ θεωρείται ως η κυριότερη ουσία που συμβάλλει σημαντικά στη γεύση του γιαουρτιού. Στο γιαούρτι έχουν αναγνωριστεί περισσότερες από ενενήντα αρωματικές ουσίες. Μεταξύ αυτών, η ακεταλδεΰδη, η ακετόνη, η 3-υδρόξυ βουτανόνη, το διακετύλιο, το οξικό οξύ, το μυρμηγκικό οξύ, το βουτανοϊκό οξύ και το προπιονικό οξύ αποτελούν τα πιο σημαντικά αρωματικά συστατικά των γιαουρτιών (Σχήμα 16). Το κυρίως άρωμα του γιαουρτιού οφείλεται στην ακεταλδεΰδη. Οι Pette και Lolkema (1950) ήταν οι πρώτοι που υποστήριξαν ότι η ακεταλδεΰδη αποτελεί την κυρίως αρωματική ένωση του γιαουρτιού και μετά το 1970 προτάθηκε ότι η παραγωγή ενός γιαουρτιού με επιθυμητή γεύση απαιτεί την ύπαρξη υψηλής συγκέντρωσης ακεταλδεύδης. 109

126 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ακεταλδεύδη διακετύλιο προπιονικό οξύ οξικό οξύ ακετόνη 3-υδρόξυ βουτανόνη μυρμηγκικό οξύ βουτανικό οξύ διμέθυλο σουλφίδιο βενζαλδεύδη 2,3-πεντανοδιόνη Σχήμα 16. Οι κυριότερες αρωματικές ενώσεις που απαντώνται στο γιαούρτι (Routray και Mishra, 2011) Στη δεκαετία του 1950, τα γιαούρτια εμπλουτίστηκαν με χυμούς φρούτων και παρατηρήθηκε αύξηση της κατανάλωσής τους, λόγω της περισσότερο ευχάριστης γεύσης και του αρώματος που απέκτησαν. Τα μετέπειτα χρόνια, η γαλακτοβιομηχανία παρασκεύασε γιαούρτια σε μεγάλη ποικιλία γεύσεων και αρωμάτων. Σύμφωνα με τους Rashid και Thakur (2012), η προσθήκη φρούτων, προσθέτων γεύσης και γλυκαντικών στα γιαούρτια πραγματοποιείται για βελτίωση της γεύσης ή για να καλυφθεί σε ένα μέρος το χαρακτηριστικό άρωμα της ακεταλδεΰδης. Το μέλι μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα φυσικό συντηρητικό τροφίμων, λόγω των αντιμικροβιακών του ιδιοτήτων. Το μέλι σε συνδυασμό με το γάλα έχει εξαιρετική θρεπτική αξία και για αυτό προτείνεται η χρήση του ως κύρια πηγή τροφίμου για τα παιδιά. Οι Rashid και Thakur (2012) παρασκεύασαν γιαούρτια με προσθήκη μελιού σε διάφορες συγκεντρώσεις (5%, 10%, 15% και 20%) και κύριος στόχος τους ήταν η μελέτη επίδρασης του μελιού στη βιωσιμότητα της μικροβιακής χλωρίδας των γιαουρτιών και η μελέτη των χημικών και οργανοληπτικών τους χαρακτηριστικών. Διαπίστωσαν ότι το γιαούρτι που περιείχε μέλι σε ποσοστό 5% εμφάνισε τα καλύτερα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά συγκρινόμενο με τα μεγαλύτερα ποσοστά προσθήκης μελιού. 110

127 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Στο ίδιο μήκος κύματος κυμάνθηκε και η μελέτη του Illupapalayam και των συνεργατών του (2014), που πραγματεύεται την παρασκευή προβιοτικών γιαουρτιών με προσθήκη καρυκευμάτων. Συγκεκριμένα, πρόσθεσαν κάρδαμο, κανέλλα και μοσχοκάρυδο ταυτόχρονα με τη προσθήκη των μικροοργανισμών L. acidophilus ή B. animalis ssp. Lactis. Τα παραγόμενα γιαούρτια παρουσίασαν καλά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά με τον καλύτερο οργανοληπτικό χαρακτηρισμό να αποδίδεται στα γιαούρτια τα εμπλουτισμένα με κάρδαμο, ανεξάρτητα του προστιθέμενου μικροοργανισμού. Σε παραπλήσια λογική βασίστηκε και η παρασκευή γιαουρτιών στη παρούσα διδακτορική διατριβή με στόχο τη βελτίωση του αρώματος. Συγκεκριμένα, τα παραγόμενα γιαούρτια, εκτός από το κλασικό αρωματικό προφίλ, παρουσιάζουν και το αρωματικό προφίλ το οφειλόμενο στην περιεχόμενη πίσσα Πάφου. Το αρωματικό προφίλ των γιαουρτιών που περιέχουν πίσσα Πάφου πρόσθετα οφείλεται σε μονοτερπένια και οξυγονωμένα μονοτερπένια. Το % ποσοστό των ενώσεων αυτών στο σύνολό τους, όπως προέκυψε παρουσιάζονται στον Πίνακα 15. από τις αναλύσεις με SPME GC-MS, 111

128 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Πίνακας 15. Τερπενικά συστατικά γιαουρτιού (στο % του συνόλου των προσδιοριζόμενων τερπενίων), που έχει παρασκευαστεί με προσθήκη 0,3 g ακινητοποιημένου βιοκαταλύτη σε 100 g προϊόντος με χρήση της τεχνικής SPME GC/MS Ένωση Μέθοδος ταυτοποίησης Kovats Index Kovats Index βιβλιογραφίας γιαουρτι με ελεύθερα κύτταρα L. casei Γιαούρτι με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε πίσσα Πάφου Μονοτερπένια α-πινένιο KI, MS c Nd 61,1±4, h 1019 b καμφένιο KI, MS c Nd 0,6±0, j β-πινένιο KI, MS d Nd 1,6±0, b 3-καρένιο KI, MS e Nd 0,5±0, h β-μυρσένιο KI, MS c Nd 1,1±0, e 1158 j 2-καρένιο MS 1164 N.A. Nd 0,1±0,02 D-λεμονένιο KI, MS e Nd 2,9±0, g 1189 f 1198 b β-φυλλανδρένιο KI, MS e Nd 0,1±0,02 o-κυμένιο MS 1250 N.A. Nd 1,7±0,1 Οξυγονωμένα μονοτερπένια ευκαλυπτόλη KI, MS e Nd 0,4±0,02 τερπινολένιο KI, MS i Nd 3,0±0,1 καμφενόλη MS 1482 N.A. Nd 0,7±0,1 λιναλοόλη KI, MS a Nd 0,7±0, j οξικό βορνύλιο KI, MS i Nd 2,2±0,1 4 τερπινεόλη KI, MS b Nd 1,1±0, d πινοκαρβεόλη MS 1651 Ν.Α. Nd 1,5±0,1 βερβενόλη MS 1671 N.A. Nd 2,5±0,1 α-τερπινεόλη KI, MS i Nd 5,4±0, j 5,8,10εντεκτατριεν-3-όλη MS 1716 N.A. Nd 3,4±0,2 μελιλοτάλη MS 1783 N.A. Nd 0,4±0,1 μυρτενόλη KI, MS i Nd 3,0±0,1 p-συμεν-8-όλη KI, MS i Nd 6,0±0,3 MS: θετική επιβεβαίωση με φάσμα μάζας από τις βιβλιοθήκες NIST107, NIST21 και SZTERP, Nd: Μη ανιχνεύσιμο, N.A. Μη Διαθέσιμο, a : Shimoda και συνεργάτες (1995), b : Shiratsuchi και συνεργάτες (1993), c : Gardeli και συνεργάτες (2008), d : Hognadottir και συνεργάτες (2003), e : Prompona και συνεργάτες (2012), f : Kandylis και συνεργάτες (2010), g : Mallouchos και συνεργάτες (2007), h : Vichi και συνεργάτες (2007), i : Lee και συνεργάτες (2005), j : Goodner (2008). 112

129 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Στα παραγόμενα γιαούρτια με ακινητοποιημένα κύτταρα σε πίσσα Πάφου βρέθηκε ότι στο σύνολο των ολικών τερπενίων τα ολικά μονοτερπένια βρίσκονται σε ποσοστό 69,7% και τα ολικά οξυγονωμένα μονοτερπένια σε ποσοστό 30,3%. Στο Σχήμα 17 παρουσιάζεται η κατανομή των τερπενικών συστατικών γιαουρτιού που περιέχει 0,3 g ακινητοποιημένου βιοκαταλύτη σε 100 g προϊόντος. Από το Σχήμα 17 φαίνεται ότι η κυριότερη σε ποσοστό ένωση είναι το α-πινένιο (61% των ολικών προσδιοριζόμενων τερπενίων). α-πινένιο καμφένιο β-πινένιο 3-καρένιο β-μυρσένιο 2-καρένιο D-λεμονένιο β-φυλλανδρένιο ο-κυμένιο ευκαλυπτόλη τερπινολένιο καμφενόλη λιναλοόλη οξικό βορνύλιο 4 τερπινεόλη πινοκαρβεόλη βερβενόλη α-τερπινεόλη 5,8,10 εντεκατριέν-3-ολη μελιλοτάλη μυρτενόλη p-συμεν-8-όλη Σχήμα 17. Κατανομή τερπενίων σε γιαούρτι που περιέχει πίσσα Πάφου Τα μονοτερπένια, εκτός από τη συμβολή τους στο άρωμα του γιαουρτιού, εμπλέκονται στην αναστολή ανάπτυξης αλλοιογόνων μικροοργανισμών. Σύμφωνα με τον Kotan και τους συνεργάτες του (2007), τα οξυγονωμένα μονοτερπένια παρουσιάζουν αντιβακτηριακή δράση έναντι 63 βακτηριακών στελεχών. Επιπλέον, το έλαιο της Pistacia terebinthus (που περιέχει κυρίως α-πινένιο, β-πινένιο, λεμονένιο και α-τερπινεόλη) βρέθηκε ότι αναστέλλει την ανάπτυξη του παθογόνου μύκητα Rhizoctonia solani σε γεωργικά προϊόντα (Duru και συνεργάτες, 2003). Επομένως συμπεραίνεται ότι πιθανότατα τα προσδιοριζόμενα τερπένια της πίσσας Πάφου σε συνδυασμό με τις περιεχόμενες σε αυτή πολυφαινόλες ευθύνονται για την αναστολή ανάπτυξης παθογόνων βακτηρίων στα παραγόμενα γιαούρτια. Το χαρακτηριστικό άρωμα και το κατώφλι αντίληψης ορισμένων μονοτερπενίων που απαντώνται στην πίσσα Πάφου παρουσιάζονται στον Πίνακα

130 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Πίνακας 16. Χαρακτηριστικό άρωμα και κατώφλι αντίληψης ορισμένων μονοτερπενίων (Belitz, 2009) Ένωση Ποιότητα αρώματος Κατώφλι αντίληψης (μg/kg σε νερό) μυρσένιο βοτάνων, μεταλλικό 14 λιναλοόλη ανθέων 6 R(+)-λεμονένιο εσπεριδοειδών 200 R(-)-α-φυλλανδρένιο τερπενίων, φαρμάκων 500 S(+)-α-φυλλανδρένιο άνηθου 200 α-τερπινεόλη πασχαλιάς, ροδάκινου 330 1,8-κινεόλη μπαχαρικών, καμφοράς Προκαταρκτική οργανοληπτική αξιολόγηση γιαουρτιών Τα γιαούρτια που παρασκευάστηκαν απουσία πρόσθετης καλλιέργειας και τα γιαούρτια με προσθήκη κυττάρων L. casei (σε ελεύθερη ή ακινητοποιημένη μορφή σε πίσσα Πάφου) εξετάστηκαν ως προς τα οργανοληπτικά τους χαρακτηριστικά. Η αξιολόγηση πραγματοποιήθηκε σε γιαούρτια των 25 g μετά από μία εβδομάδα παρασκευής. Η οργανοληπτική αξιολόγηση διενεργήθηκε από 10 δοκιμαστές, στους οποίους ζητήθηκε να βαθμολογήσουν τα γιαούρτια σε κλίμακα από το 0 στο 10 (0 μη αποδεκτό, 10 εξαιρετικό) όσον αφορά τις ιδιότητες: άρωμα και γεύση. Οι δοκιμαστές χρησιμοποιούσαν νερό για ξέπλυμα του στόματός τους μεταξύ των δειγμάτων και δεν γνώριζαν την ταυτότητα των εξεταζόμενων δειγμάτων. Τα αποτελέσματα της οργανοληπτικής αξιολόγησης παρουσιάζονται στον Πίνακα 17. Προκύπτει ότι η χρήση των ακινητοποιημένων κυττάρων L. casei στην πίσσα Πάφου στην παρασκευή των γιαουρτιών επηρέασε σημαντικά (P < 0.05) τις προτιμήσεις των δοκιμαστών. Τα γιαούρτια με τα ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei στην πίσσα Πάφου λάβανε την υψηλότερη βαθμολογία συγκριτικά με τα γιαούρτια που δε περιείχαν πίσσα Πάφου. 114

131 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Πίνακας 17. Προκαταρκτική οργανοληπτική αξιολόγηση γιαουρτιών Είδος γιαουρτιού Γεύση Άρωμα Μ 8 7 Γιαούρτια μόνο με αρχική καλλιέργεια ΕΚ 9 8 Γιαούρτια με ελεύθερα κύτταρα L. casei και αρχική καλλιέργεια ΑΚ0, Γιαούρτια με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε 0,3 g πίσσα Πάφου /100 ml γάλακτος και αρχική καλλιέργεια ΑΚ0, Γιαούρτια με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε 0,6 g πίσσα Πάφου /100 ml γάλακτος και αρχική καλλιέργεια ΑΚ1,2 Γιαούρτια με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε 1,2 g πίσσα Πάφου /100 ml γάλακτος και αρχική καλλιέργεια Συμπέρασμα για τα γιαούρτια Η πίσσα Πάφου προσέδωσε ένα ευχάριστο άρωμα στα παραγόμενα γιαούρτια και βοήθησε στην καλύτερη επιβίωση των ακινητοποιημένων σε αυτή κυττάρων L. casei, διασφαλίζοντας τον χαρακτηρισμό των παραγόμενων γιαουρτιών ως προβιοτικά. 115

132 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 14. Λευκά τυριά άλμης Σύμφωνα με την ανασκόπηση του Gomes da Cruz και των συνεργατών του, 2009, το τυρί είναι τρόφιμο που αποτελεί πολύτιμο όχημα μεταφοράς προβιοτικών μικροοργανισμών στον ανθρώπινο οργανισμό. Η υψηλή τιμή του ph του τυριού δρα ρυθμιστικά έναντι στο όξινο περιβάλλον του γαστρεντερικού σωλήνα με αποτέλεσμα τα ενσωματωμένα στο τυρί προβιοτικά κύτταρα να επιβιώνουν καλύτερα κατά τη διέλευσή τους διαμέσου του γαστρεντερικού σωλήνα. Επιπλέον, η συμπαγής δομή του τυριού και η σχετικά υψηλή περιεκτικότητά του σε λίπος προσφέρουν επιπρόσθετη προστασία στα προβιοτικά βακτήρια, όταν βρίσκονται στο στομάχι. Η σωστή επιλογή του προβιοτικού μικροοργανισμού που θα προστεθεί στη μάζα του τυροπήγματος, παίζει καθοριστικό ρόλο στο βαθμό επιβίωσής του. Εν προκειμένω έγινε χρήση του μικροοργανισμού L. casei, ο οποίος χαρακτηρίζεται από προβιοτικές ιδιότητες, από ικανότητα επιβίωσης στη μάζα του τυριού κατά την ωρίμανση και ικανότητα επιβίωσης σε όξινο περιβάλλον (1,5% -2% οξύ) (Fellows, 2000). Ειδικότερα, ο L. casei ATCC 393 έχει χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή λευκού τυριού άλμης, λόγω των εξαιρετικών του τεχνολογικών ιδιοτήτων. Η ακινητοποίηση μάλιστα του μικροοργανισμού σε κομμάτια φρούτων (μήλο, αχλάδι) έδωσε υψηλούς ρυθμούς επιβίωσης συγκριτικά με τη χρήση ελευθέρων κυττάρων κατά τη διάρκεια της παραγωγής και της αποθήκευσης λευκού τυριού άλμης (Kourkoutas και συνεργάτες, 2006). Σημειώνεται ότι στην παραγωγική διαδικασία λευκού τυριού άλμης στην παρούσα διδακτορική διατριβή δεν πραγματοποιήθηκε προσθήκη αρχικής καλλιέργειας εκκίνησης και αντί αυτού προστέθηκε καλλιέργεια του μικροοργανισμού L. casei ως πρόσθετη καλλιέργεια. Την ίδια διαδικασία έχουν ακολουθήσει στην παραγωγή τυριού τύπου φέτας ο Kourkoutas και οι συνεργάτες του (2006) και η Dimitrellou και οι συνεργάτες της (2014). Η πήξη του γάλακτος πραγματοποιήθηκε με αποκλειστικά χρήση πυτιάς, αφού η διαδικασία αυτή αποτελεί κοινή πρακτική παρασκευής λευκών τυριών άλμης στην Ελλάδα. 116

133 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Παρασκευάστηκαν λευκά τυριά άλμης χωρίς κύτταρα L. casei και λευκά τυριά άλμης που περιείχαν κύτταρα L. casei σε ελεύθερη και ακινητοποιημένη μορφή. Το υπόστρωμα ακινητοποίησης των κυττάρων L. casei ήταν η πίσσα Πάφου Φυσικοχημικά χαρακτηριστικά λευκών τυριών άλμης Τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των λευκών τυριών άλμης μελετήθηκαν σε τακτά χρονικά διαστήματα για διάστημα ενενήντα ημερών αποθήκευσης. Παρατηρήθηκε ότι η τιμή του ph όλων των λευκών τυριών άλμης ακόμη και μετά από 90 ημέρες αποθήκευσης κυμάνθηκε σε σχετικά υψηλές τιμές από 4,80 έως 5,20 για την 90 η ημέρα (Πίνακας 18). Το γεγονός αυτό οφείλεται στη χρήση παστεριωμένου γάλακτος και στην απουσία αρχικής καλλιέργειας κατά τη διαδικασία παρασκευής. Η χρήση παστεριωμένου γάλακτος έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση της γηγενούς μικροχλωρίδας του γάλακτος και την αδρανοποίηση των λιπολυτικών και πρωτεολυτικών του ενζύμων, γεγονός που οδηγεί σε αργή παραγωγή οξέων και κατά συνέπεια σε αργή μείωση της τιμής του ph στα παραγόμενα προϊόντα (Ζερφυρίδης, 2001). Σημειώνεται ότι στη βιομηχανία κατά την παρασκευή τυριών από παστεριωμένο γάλα προστίθεται καλλιέργεια εκκίνησης για να επιτευχθεί γρήγορη μείωση της τιμής του ph που προστατεύει τα τυριά από την ανάπτυξη παθογόνων και αλλοιογόνων βακτηρίων. Η προσθήκη της καλλιέργειας L. casei είχε σημαντική επίδραση (P<0,05) στη τιμή του ph και στην οξύτητα των λευκών τυριών άλμης κατά την αποθήκευσή τους για 90 ημέρες. 117

134 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Πίνακας 18. Τιμή ph, τιτλοδοτούμενη οξύτητα παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Είδος λευκού τυριού άλμης ΜΤ Λευκό τυρί άλμης μόνο με πυτιά ΕΚΤ Λευκό τυρί άλμης με πυτιά και με ελεύθερα κύτταρα L. casei 0,2 ΑΚΤ Λευκό τυρί άλμης με πυτιά και με 0,2 g πίσσα Πάφου (με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei)/100 g τυριού 0,3 ΑΚΤ Λευκό τυρί άλμης με πυτιά και με 0,3 g πίσσα Πάφου (με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei) /100 g τυριού 0,9 ΑΚΤ Λευκό τυρί άλμης με πυτιά και με 0,9 g πίσσα Πάφου (με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei) /100 g τυριού Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) Τιμή ph Τιτλοδοτούμενη οξύτητα (g γαλακτικού οξέος/100g προϊόντος) 1 6,13±0,04 0,18±0, ,82±0,05 0,26±0, ,71±0,05 0,28±0, ,42±0,03 0,35±0, ,21±0,05 0,41±0, ,20±0,03 0,43±0,03 1 5,08±0,03 0,38±0, ,86±0,03 0,60±0, ,85±0,04 0,63±0, ,83±0,03 0,65±0, ,81±0,04 0,67±0, ,80±0,03 0,70±0,04 1 5,28±0,03 0,29±0, ,16±0,03 0,54±0, ,11±0,03 0,56±0, ,07±0,03 0,57±0, ,02±0,04 0,59±0, ,93±0,03 0,60±0,04 1 5,25±0,03 0,30±0, ,20±0,03 0,56±0, ,15±0,04 0,57±0, ,09±0,05 0,59±0, ,04±0,04 0,60±0, ,95±0,03 0,61±0,03 1 5,22±0,03 0,32±0, ,20±0,04 0,55±0, ,17±0,03 0,56±0, ,03±0,04 0,58±0, ,00±0,03 0,59±0, ,92±0,04 0,59±0,04 118

135 Τιμή ph ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Τα λευκά τυριά άλμης με κύτταρα L. casei (σε ελεύθερη ή σε ακινητοποιημένη μορφή σε πίσσα Πάφου) παρουσίασαν τιμή ph σημαντικά χαμηλότερη (P<0,05) συγκριτικά με το κοντρόλ (Σχήμα 18). Η τελική τιμή ph στο κοντρόλ στις 90 ημέρες αποθήκευσης ήταν 5,20 ενώ των λευκών τυριών άλμης με τα κύτταρα L. casei κυμαινόταν μεταξύ 4,80 και 4,95 (Πίνακας 18). 6,3 6,1 5,9 5,7 5,5 MΤ EKΤ 0,2AKΤ 0,3AKΤ 0,9AKΤ 5,3 5,1 4,9 4,7 4, Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) Σχήμα 18. Μεταβολή της τιμής του ph των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Στο Σχήμα 19 παρουσιάζεται η μεταβολή της οξύτητας των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους. Παρατηρείται ότι η οξύτητα στα λευκά τυριά άλμης με ελεύθερα κύτταρα L. casei ή ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε πίσσα Πάφου ήταν σημαντικά μεγαλύτερη (P<0,05) συγκριτικά με το κοντρόλ. Η τελική οξύτητα στο κοντρόλ στις 90 ημέρες αποθήκευσης ήταν 0,43%, ενώ των λευκών τυριών άλμης με τα κύτταρα L. casei (σε ελεύθερη ή σε ακινητοποιημένη μορφή σε πίσσα Πάφου) κυμαινόταν μεταξύ 0,59 και 0,70 (Πίνακας 18). 119

136 Οξύτητα (g/ 100 g λευκού τυριού άλμης) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 MΤ EΚΤ 0,2AKΤ 0,3AKΤ 0,9AKΤ Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) Σχήμα 19. Μεταβολή της οξύτητας των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Παραπλήσια αποτελέσματα παρουσίασε η Dimitrellou και οι συνεργάτες της, 2014, οι οποίοι προσδιόρισαν την τιμή του ph και τη συγκέντρωση γαλακτικού οξέος σε προβιοτικά λευκά τυριά άλμης που παρασκεύασαν με προσθήκη ελεύθερων κυττάρων L. casei ή με προσθήκη ακινητοποιημένων σε πρωτεΐνη τυρογάλακτος κυττάρων L. casei συγκριτικά με λευκά τυριά άλμης απουσία πρόσθετης καλλιέργειας. Βρήκαν ότι η τιμή του ph την 70 η ημέρα ωρίμανσης στο λευκό τυρί άλμης απουσία πρόσθετης καλλιέργειας ήταν σημαντικά υψηλότερη από την τιμή ph των προβιοτικών τυριών και η οξύτητα την 70 η ημέρα ωρίμανσης στο κοντρόλ βρέθηκε σημαντικά χαμηλότερη από την οξύτητα των προβιοτικών τυριών. Τα λευκά τυριά άλμης με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε πίσσα Πάφου παρουσίασαν μικρότερο ρυθμό μείωσης της τιμής του ph συγκριτικά με τα λευκά τυριά άλμης με ελεύθερα κύτταρα L. casei (Σχήμα 18). Όμοια εικόνα εμφανίζεται και στον ρυθμό αύξησης της οξύτητας (Σχήμα 19). Υποδηλώνεται ότι το υπόστρωμα ακινητοποίησης, η πίσσα Πάφου, μειώνει τη δυνατότητα μεταφοράς μάζας των κυττάρων L. casei. Το αντίθετο αποτέλεσμα έχει καταγραφεί στην περίπτωση ακινητοποίησης κυττάρων L. casei σε κομμάτια μήλου και σε πρωτεΐνη τυρογάλακτος. Συγκεκριμένα, ο Kourkoutas και οι συνεργάτες του (2006) παρασκεύασαν προβιοτικό λευκό τυρί άλμης με χρήση ελεύθερων κυττάρων L. casei και ακινητοποιημένων κυττάρων L. casei σε κομμάτια 120

137 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ μήλου και διαπίστωσαν ότι τα ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε μήλα επέδειξαν μεγαλύτερο ρυθμό μείωσης της τιμής του ph μετά από 71 ημέρες αποθήκευσης στους 4 C συγκριτικά με λευκό τυρί άλμης που παρήχθηκε με ελεύθερα κύτταρα L. casei. Επιπλέον, η Dimitrellou και οι συνεργάτες της (2014) έδειξαν ότι η χρήση ακινητοποιημένων κυττάρων L. casei σε πρωτεΐνη τυρογάλακτος στη παραγωγή λευκού τυριού άλμης τύπου φέτας είχε ως αποτέλεσμα υψηλότερες τιμές γαλακτικού οξέος και χαμηλότερη τιμή ph συγκριτικά με τα λευκά τυριά άλμης τύπου φέτας που παρασκευάστηκαν με χρήση ελεύθερων κυττάρων L. casei σε διάστημα 70 ημερών αποθήκευσης. Το διαφορετικό αποτέλεσμα ως προς τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά λευκών τυριών άλμης που παράγονται με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε διαφορετικά υποστρώματα δικαιολογείται από τη φύση του υποστρώματος ακινητοποίησης. Φαίνεται ότι η πίσσα Πάφου, εάν και αποτελεί προστατευτικό μέσο ακινητοποίησης ως προς τον L. casei, τον περιορίζει ως προς τη μεταφορά μάζας συγκριτικά με τα προαναφερόμενα υποστρώματα μήλων και πρωτεΐνης τυρογάλακτος. Τα τελευταία παρέχουν στα ακινητοποιημένα κύτταρα και θρεπτικά υλικά (όπως σάκχαρα) σε αντίθεση με τη πίσσα Πάφου. Παραπλήσιες τιμές ph (P>0,05) και οξύτητας (P>0,05) καταγράφονται στα λευκά τυριά άλμης που περιέχουν διαφορετικές ποσότητες πίσσας Πάφου με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei (Σχήμα 18, Σχήμα 19). Όσον αφορά στη λακτόζη, είναι γνωστό ότι κατά τη διαδικασία παρασκευής των λευκών τυριών άλμης, η μεγαλύτερη ποσότητα λακτόζης του γάλακτος απομακρύνεται από το τυρόπηγμα στο τυρόγαλα με αποτέλεσμα μικρή συγκέντρωση λακτόζης να ανιχνεύεται στα παραγόμενα τυριά. Επιπρόσθετα, η υπολειπόμενη λακτόζη του τυροπήγματος υφίσταται μερική μετατροπή σε γαλακτικό οξύ από τη δράση μικροοργανισμών του γάλακτος (παρουσία αρχικής καλλιέργειας εκκίνησης, ενδογενών μικροοργανισμών του γάλακτος ή πρόσθετης καλλιέργειας). Σημειώνεται ότι το γάλα που χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή των λευκών τυριών άλμης περιείχε 4,7 g λακτόζη/100 g γάλακτος, γαλακτόζη σε μηδενικό επίπεδο και μόλις 0,017 g γλυκόζη/100 g γάλακτος. 121

138 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Στα παραγόμενα λευκά τυριά άλμης η προσθήκη της καλλιέργειας L. casei δεν είχε σημαντική επίδραση (P>0,05) στη συγκέντρωση της λακτόζης κατά το χρόνο αποθήκευσης. Πίνακας 19. Υπολειπόμενη λακτόζη παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Είδος λευκού τυριού άλμης ΜΤ Λευκό τυρί άλμης μόνο με πυτιά ΕΚΤ Λευκό τυρί άλμης με πυτιά και με ελεύθερα κύτταρα L. casei 0,2 ΑΚΤ Λευκό τυρί άλμης με πυτιά και με 0,2 g πίσσα Πάφου (με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei)/100 g τυριού 0,3 ΑΚΤ Λευκό τυρί άλμης με πυτιά και με 0,3 g πίσσα Πάφου (με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei) /100 g τυριού 0,9 ΑΚΤ Λευκό τυρί άλμης με πυτιά και με 0,9 g πίσσα Πάφου (με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei) /100 g τυριού Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) Λακτόζη (g/100g λευκού τυριού άλμης) 1 1,82 ±0, ,14±0, ,92±0, ,71±0, ,63±0, ,40±0,02 1 1,45±0, ,66±0, ,47±0, ,33±0, ,22±0, ,11±0,01 1 1,66±0, ,91±0, ,80±0, ,56±0, ,30±0, ,23±0,01 1 1,64±0, ,90±0, ,82±0, ,60±0, ,29±0, ,24±0,01 1 1,67±0, ,90±0, ,78±0, ,54±0, ,32±0, ,26±0,01 122

139 Λακτόζη (g/ 100 g λευκού τυριού άλμης) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 2 1,8 1,6 1,4 1,2 MΤ EKΤ 0,2AKΤ 0,3AKΤ 0,9AKΤ 1 0,8 0,6 0,4 0, Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) Σχήμα 20. Μεταβολή της υπολειπόμενης λακτόζης των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Σημειώνεται, όμως ότι την 90 η ημέρα αποθήκευσης η υπολειπόμενη λακτόζη στο κοντρόλ ισούταν με 0,40%, ενώ στο λευκό τυρί άλμης με ελεύθερα κύτταρα L. casei ισούταν με 0,11% και στα λευκά τυριά άλμης με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε πίσσα Πάφου βρισκόταν σε τιμές μεταξύ 0,23 και 0,26% (Πίνακας 19, Σχήμα 20). Συνάγεται ότι η λακτόζη μεταβολίστηκε με γρηγορότερο ρυθμό στο λευκό τυρί με τα ελεύθερα κύτταρα L. casei, ακολούθησαν τα λευκά τυριά με τα κινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε πίσσα Πάφου και ο πιο αργός μεταβολισμός της λακτόζης πραγματοποιήθηκε στο κοντρόλ. Στα παραγόμενα λευκά τυριά άλμης στη διάρκεια αποθήκευσής τους δεν ανιχνεύτηκε γλυκόζη και γαλακτόζη, λόγω μεταβολισμού τους από την μικροβιακή χλωρίδα των προϊόντων. Στον Πίνακα 20 παρουσιάζεται η υγρασία και η τέφρα των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης κατά την αποθήκευσή τους στους 4 C. 123

140 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Πίνακας 20. Υγρασία και τέφρα παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Είδος λευκού τυριού άλμης ΜΤ Λευκό τυρί άλμης μόνο με πυτιά ΕΚΤ Λευκό τυρί άλμης με πυτιά και με ελεύθερα κύτταρα L. casei 0,2 ΑΚΤ Λευκό τυρί άλμης με πυτιά και με 0,2 g πίσσα Πάφου (με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei)/100 g τυριού 0,3 ΑΚΤ Λευκό τυρί άλμης με πυτιά και με 0,3 g πίσσα Πάφου (με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei) /100 g τυριού 0,9 ΑΚΤ Λευκό τυρί άλμης με πυτιά και με 0,9 g πίσσα Πάφου (με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei) /100 g τυριού Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) Υγρασία (%) Τέφρα (% επί ξηρού) 1 54,5±1,6 1,73±0, ,5±1,6 5,42±0, ,8±1,8 5,60±0, ,2±1,7 5,92±0, ,6±1,8 6,10±0, ,1±1,8 6,20±0, ,5±1,6 1,25±0, ,3±1,6 5,15±0, ,6±1,7 5,18±0, ,7±1,7 5,22±0, ,1±1,6 5,46±0, ,3±1,7 5,54±0, ,5±1,5 1,40±0, ,6±1,7 5,20±0, ,9±1,7 5,28±0, ,1±1,7 5,70±0, ,8±1,8 5,89±0, ,7±1,7 6,10±0, ,6±1,6 1,43±0, ,7±1,8 5,30±0, ,8±1,7 5,50±0, ,3±1,6 5,81±0, ,8±1,7 5,92±0, ,9±1,8 6,03±0, ,8±1,6 1,51±0, ,2±1,7 5,27±0, ,9±1,7 5,43±0, ,6±1,8 5,72±0, ,9±1,7 5,96±0, ,5±1,8 6,19±0,37 124

141 Υγρασία (%) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Σε όλα τα παραγόμενα λευκά τυριά άλμης παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση της υγρασίας τις πρώτες 15 ημέρες αποθήκευσής τους στους 4 C (Πίνακας 20). Η αύξηση της υγρασίας οφείλεται στη συντήρηση των τυριών σε άλμη από τη δεύτερη ημέρα παρασκευής τους. Η αύξηση της υγρασίας τυριών αποθηκευμένων σε άλμη είναι σύνηθες φαινόμενο (Litopoulou-Tzanetaki και συνεργάτες, 1993). Τις επόμενες ημέρες αποθήκευσης, η υγρασία δε μεταβλήθηκε σημαντικά. Οι τιμές της υγρασίας στα παραγόμενα λευκά τυριά άλμης επηρεάστηκαν σημαντικά (P<0,05) από την παρουσία κυττάρων L. casei. Τα λευκά τυριά άλμης με ελεύθερα ή ακινητοποιημένα κύτταρα σε πίσσα Πάφου παρουσιάζουν παρόμοια εικόνα (P>0,05) ως προς την περιεχόμενη υγρασία. Διαφορά στις τιμές της υγρασίας παρουσιάζει το λευκό τυρί άλμης που δεν έχει πρόσθετη καλλιέργεια συγκριτικά με τα λευκά τυριά άλμης με την πρόσθετη καλλιέργεια L. casei (P<0,05), εμφανίζοντας μεγαλύτερες τιμές υγρασίας (Σχήμα 21). Η αυξημένη υγρασία του κοντρόλ πιθανότατα να οφείλεται στη μεγαλύτερη τιμή ph (Lawrence και συνεργάτες, 1987). 62,5 60,5 58,5 56,5 54,5 52,5 50,5 48,5 MΤ EKΤ 0,2AKΤ 0,3AKΤ 0,9AKΤ Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) Σχήμα 21. Μεταβολή της υγρασίας των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C 125

142 Τέφρα (% επί ξηρού) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Η μεταβολή του ποσοστού της τέφρας των λευκών τυριών άλμης παρουσιάζεται στο Σχήμα 22. Από το Σχήμα 22 προκύπτει ότι μικρότερο ποσοστό τέφρας εμφάνισαν τα λευκά τυριά άλμης με την πρόσθετη καλλιέργεια L. casei, τα οποία είχαν χαμηλότερη τιμή ph συγκριτικά με το κοντρόλ. Το γεγονός αυτό ίσως να οφείλεται στο ότι η χαμηλή τιμή ph τυριών συνεπάγεται την πιο εύκολη απομάκρυνση τυρογάλακτος από τη μάζα τους, οδηγώντας σε μεγάλη απώλεια φωσφορικού ασβεστίου από τις μικέλλες της καζεΐνης με επακόλουθο τη μείωση της τέφρας (Lawrence και συνεργάτες, 1987). Την 15 η ημέρα αποθήκευσης παρατηρήθηκε αύξηση της τέφρας σε όλα τα παραγόμενα λευκά τυριά άλμης, πιθανότατα λόγω της απορρόφησης αλατιού στη μάζα τους και το υπόλοιπο χρονικό διάστημα το ποσοστό της τέφρας σχεδόν σταθεροποιήθηκε. Σε όλες τις περιπτώσεις στις πρώτες 15 ημέρες αποθήκευσης, με αύξηση της υγρασίας παρατηρήθηκε ταυτόχρονη αύξηση της τέφρας (Πίνακας 20). Η ακινητοποίηση των κυττάρων σε πίσσα Πάφου δεν επηρέασε το περιεχόμενο σε τέφρα των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης (P>0,05). 7,00 6,00 5,00 4,00 MΤ EΚΤ 3,00 0,2AKΤ 0,3AKΤ 2,00 0,9AKΤ 1, Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) Σχήμα 22. Μεταβολή της τέφρας των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C 126

143 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Στον Πίνακα 21 παρουσιάζεται η ολική πρωτεΐνη των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης κατά την αποθήκευσή τους στους 4 C. Πίνακας 21. Ολική πρωτεΐνη παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Είδος λευκού τυριού άλμης ΜΤ Λευκό τυρί άλμης μόνο με πυτιά ΕΚΤ Λευκό τυρί άλμης με πυτιά και με ελεύθερα κύτταρα L. casei 0,2 ΑΚΤ Λευκό τυρί άλμης με πυτιά και με 0,2 g πίσσα Πάφου (με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei)/100 g τυριού 0,3 ΑΚΤ Λευκό τυρί άλμης με πυτιά και με 0,3 g πίσσα Πάφου (με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei) /100 g τυριού 0,9 ΑΚΤ Λευκό τυρί άλμης με πυτιά και με 0,9 g πίσσα Πάφου (με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei) /100 g τυριού Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) Ολική πρωτεΐνη (% επί ξηρού) 1 40,1±0, ,8±0, ,9±0, ,8±0, ,2±0, ,5±0, ,9±0, ,4±0, ,3±0, ,1±0, ,9±0, ,1±0, ,7±0, ,8±0, ,6±0, ,6±0, ,4±0, ,0±0, ,0±0, ,9±0, ,7±0, ,5±0, ,1±0, ,5±0, ,0±0, ,5±0, ,1±0, ,9±0, ,2±0, ,8±0,64 127

144 Ολική πρωτείνη (% ίξηρού) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 41,0 39,0 37,0 35,0 33,0 31,0 29,0 27,0 25,0 MΤ EKΤ 0,2AKΤ 0,3AKΤ 0,9AKΤ Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) Σχήμα 23. Μεταβολή της ολικής πρωτεΐνης των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Οι τιμές της ολικής πρωτεΐνης σε όλα τα λευκά τυριά άλμης μειώθηκαν κατά την αποθήκευσή τους για 90 ημέρες (Πίνακας 21, Σχήμα 23), λόγω της πρωτεόλυσης και της διαφυγής υδατοδιαλυτών συστατικών στην άλμη. Παραπλήσια αποτελέσματα μείωσης της ολικής πρωτεΐνης παρουσίασε η Dimitrellou και οι συνεργάτες της (2010) για την περίπτωση λευκού τυριού τύπου φέτα χωρίς αρχική και χωρίς πρόσθετη καλλιέργεια, το οποίο αποθηκεύτηκε στους 4-6 C για διάστημα 70 ημερών. Σύμφωνα με την Sousa και τους συνεργάτες της (2001), κατά την πρωτεόλυση, οι πρωτεΐνες του τυροπήγματος υδρολύονται αρχικά σε μεγάλου μοριακού βάρους πεπτίδια από την πυτιά και την πρωτεϊνάση του γάλακτος. Στη συνέχεια, τα μεγάλα μοριακού βάρους πεπτίδια διασπώνται σε μικρότερα πεπτίδια με τη δράση των πρωτεασών των οξυγαλακτικών βακτηρίων και στη συνέχεια τα μικρότερα πεπτίδια με τη δράση των πεπτιδασών των οξυγαλακτικών και άλλων βακτηρίων μετατρέπονται σε ελεύθερα αμινοξέα. Τα σχηματιζόμενα αμινοξέα από την πρωτεόλυση μπορεί να αναχθούν και να σχηματιστούν οργανικά οξέα και αμμωνία ή να οξειδωθούν και να σχηματιστούν αμίνες και διοξείδιο του άνθρακα (Κεχαγιάς, 2011). 128

145 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Από το Σχήμα 23 φαίνεται ότι το λευκό τυρί άλμης που δε περιείχε L. casei παρουσίασε μεγαλύτερη συγκέντρωση ολικής πρωτεΐνης (P<0,05) συγκριτικά με τα λευκά τυριά άλμης που παρασκευάστηκαν με χρήση ελεύθερων ή ακινητοποιημένων κυττάρων. Ο επιπρόσθετος πληθυσμός του L. casei παρέχει με πρόσθετα πρωτεολυτικά ένζυμα το τυρόπηγμα και ως συνέπεια στο λευκό τυρί άλμης με ελεύθερα κύτταρα να παρουσιάζεται αυξημένη πρωτεόλυση (P<0,05) συγκριτικά με το κοντρόλ. Τα λευκά τυριά άλμης με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε πίσσα Πάφου παρουσίασαν μεγαλύτερες τιμές συγκέντρωσης ολικής πρωτεΐνης, συγκριτικά με τα τυριά που περιείχαν ελεύθερα κύτταρα L. casei, σε όλη τη διάρκεια αποθήκευσής τους. Τα ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε πίσσα Πάφου βρίσκονται σε υπόστρωμα που μειώνει τη μεταφορά μάζας και ως εκ τούτου μειώνεται η πρωτεολυτική τους δραστικότητα συγκριτικά με εκείνη των ελεύθερων κυττάρων (Πίνακας 21). Διαφορετικά αποτελέσματα ως προς την ολική πρωτεΐνη που οφείλονται στο διαφορετκό υπόστρωμα ακινητοποίησης κυττάρων παρουσίασε ο Kourkoutas και οι συνεργάτες του, Συγκεκριμένα, παρασκεύασαν λευκό τυρί με χρήση ελεύθερων κυττάρων L. casei και ακινητοποιημένων κυττάρων L. casei σε μήλο και σε αχλάδι. Τα λευκά τυριά με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε μήλο ή σε αχλάδι επέδειξαν μικρότερη ολική πρωτεΐνη συγκριτικά με τα τυριά που είχαν τα κύτταρα L. casei σε ελεύθερη μορφή. Πιθανότατα η ακινητοποίηση των κυττάρων L. casei σε τεμάχια φρούτων (μήλο ή αχλάδι) να δρα προστατευτικά ως προς τα πρωτεολυτικά ένζυμα των ακινητοποιημένων κυττάρων αναφορικά με την παρουσία άλατος, με συνέπεια η πρωτεόλυση να προχωράει χωρίς παρεμπόδιση. Η λιπόλυση αποτελεί μία βιοχημική διεργασία, η οποία πραγματοποιείται κατά την ωρίμανση του τυριού και αφορά τη διάσπαση τη γλυκεριδίων του λίπους του τυροπήγματος και τη παραγωγή λιπαρών οξέων. Σημαντικό ρόλο στη λιπόλυση παίζει η λιπάση του γάλακτος και τα λιπολυτικά ένζυμα της μικροβιακής χλωρίδας. Σημειώνεται ότι κατά την παστερίωση του γάλακτος η λιπάση του γάλακτος απενεργοποιείται σε μεγάλο βαθμό, με ένα μόνο μικρό μέρος της ενεργότητάς της να διατηρείται και να ανιχνεύεται σε τυριά από παστεριωμένο γάλα. Σύμφωνα μάλιστα με τον Chavarri και τους συνεργάτες του (1998) το 73-95% της ενεργότητας της λιπάσης του γάλακτος χάνεται μέσω της παστερίωσης. Ακόμη, τα γαλακτικά βακτήρια παρουσιάζουν ασθενή λιπολυτική δραστικότητα στο τυρί. 129

146 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Δεν αναμενόταν τα παραγόμενα λευκά τυριά άλμης να έχουν υποστεί σημαντική λιπόλυση κατά την αποθήκευσή τους, λόγω της χρήσης παστεριωμένου γάλακτος και τη μη χρήση αρχικής καλλιέργειας εκκίνησης. Η μέτρηση του λίπους την 90 η ημέρα αποθήκευσης έδειξε ότι το λευκό τυρί άλμης χωρίς πρόσθετη καλλιέργεια είχε τιμή ίση με 51,1±1,0, παραπλήσια με την τιμή λίπους σε εμπορικό τυρί φέτα. Σημειώνεται ότι το λίπος % επί ξηρού της εμπορικής φέτας ισούται με 53,0±1,8 (Kourkoutas, 2007). Στο λευκό τυρί άλμης με ελεύθερα κύτταρα L. casei το λίπος % επί ξηρού την 90 η ημέρα αποθήκευσης είχε τιμή ίση με 47,5±0,9 και στο λευκό τυρί άλμης με 0,2 g ακινητοποιημένων κυττάρων L. casei σε πίσσα Πάφου βρισκόταν στην τιμή 48,6±0,5. Φαίνεται ότι τα κύτταρα L. casei συνέβαλαν σε μία μείωση του λίπους, λόγω των λιπολυτικών τους ενζύμων. 130

147 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Μικροβιολογικό προφίλ λευκών τυριών άλμης Η εξέλιξη της μικροχλωρίδας των λευκών τυριών άλμης κατά την αποθήκευσή τους στους 4 C για διάστημα ενενήντα ημερών παρουσιάζεται στον Πίνακα 22. Σημειώνεται ότι στα παραχθέντα λευκά τυριά άλμης δεν προστέθηκε αρχική καλλιέργεια εκκίνησης. Ως πρόσθετη καλλιέργεια προστέθηκαν ελεύθερα κύτταρα L. casei ή ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε πίσσα Πάφου. Μελετήθηκε η επίδραση των κυττάρων L. casei και της πίσσας Πάφου στα μικροβιολογικά χαρακτηριστικά των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης. Παραπλήσια με την προσθήκη της πίσσας Πάφου σε τυρί, ο Smith-Palmer και οι συνεργάτες του (2001) πρόσθεσαν αιθέρια έλαια δάφνης, γαρυφάλλου, κανέλας και θυμαριού σε συγκέντρωση 1% σε μαλακά τυριά φιλαδέλφεια με χαμηλά και ολικά λιπαρά και μελέτησαν τη δράση τους ως πιθανά φυσικά συντηρητικά έναντι στο μικροοργανισμό L. monocytogenes και στον μικροοργανισμό S. enteritidis για διάστημα 14 ημερών. Διαπίστωσαν ότι στα χαμηλού λιποπεριεκτικότητας τυριά και τα τέσσερα προαναφερθέντα αιθέρια έλαια έδειξαν μείωση των πληθυσμών του L. monocytogenes και του S. enteritidis, ενώ στη περίπτωση των τυριών με ολικά λιπαρά αυτό επιτεύχθηκε με χρήση μόνο του αιθερίου ελαίου τριαντάφυλλου για τον L. monocytogenes και με χρήση των αιθερίων ελαίων δάφνης, γαρυφάλλου και κανέλας για τον S. enteritidis. Την πρώτη ημέρα αποθήκευσης των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης παρατηρήθηκε αυξημένος αριθμός μικροβιακού φορτίου, ο οποίος πιθανότατα να οφείλεται στην ανάπτυξη μη αρχικών καλλιεργειών, οι οποίες επιβίωσαν της παστερίωσης ή βρίσκονταν στον εξοπλισμό παραγωγής των τυριών (Stanton και συνεργάτες, 1998). Ο Stanton και οι συνεργάτες του (1998) παρατήρησαν αύξηση του αριθμού των μη αρχικών καλλιεργειών κατά τις πρώτες ημέρες ωρίμανσης του τυριού cheddar που παρασκεύασαν, οι οποίες έφταναν σε τιμές 10 7 με 10 8 cfu/g προϊόντος. Οι μη αρχικές καλλιέργειες στο ωριμασμένο τυρί αποτελούσαν την κυρίαρχη μικροχλωρίδα, εάν και στη συγκεκριμένη μελέτη είχε προστεθεί και αρχική καλλιέργεια εκκίνησης κατά τη παραγωγική διαδικασία. 131

148 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Πίνακας 22. Πληθυσμοί ολικής μεσόφιλης χλωρίδας (ΟΜΧ), λακτόκοκκων, λακτοβάκιλλων, L. casei, κολοβακτηρίων, εντεροβακτηρίων, ζυμών-μυκήτων, σταφυλόκοκκων όλων των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C (log cfu/g). Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) ΟΜΧ Λακτόκοκκοι Λακτοβάκιλλοι L. casei Κολοβακτηρίδια Εντεροβακτηρίδια Ζύμες- Μύκητες Σταφυλόκοκκοι ΜΤ Λευκό τυρί άλμης μόνο με πυτιά ΕΚΤ Λευκό τυρί άλμης με πυτιά και με ελεύθερα κύτταρα L. casei 0,2 ΑΚΤ Λευκό τυρί άλμης με πυτιά και με 0,2 g πίσσα Πάφου (με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei) /100 g τυριού 1 5,23±0,26 5,13±0,26 5,13±0, ,00±0,20 2,66±0, ,78±0,34 6,42±0,32 6,02±0, ,88±0,19 3,53±0, ,63±0,32 6,30±0,30 5,76±0, ,49±0,16 3,67±0, ,65±0,33 6,18±0,32 6,21±0, ,48±0,17 3,60±0, ,43±0,32 6,08±0,30 6,49±0, ,48±0,18 3,50±0, ,00±0,30 5,96±0,30 6,48±0, ,30±0,17 3,19±0,14 1 5,93±0,28 5,21±0,26 8,83±0,40 8,12±0, ,01±0,19 2,66±0, ,82±0,32 6,64±0,32 8,53±0,38 7,46±0, ,90±0,14 2,82±0, ,71±0,33 6,32±0,32 8,23±0,38 7,46±0, ,87±0,14 2,48±0, ,55±0,31 6,00±0,30 8,50±0,39 7,45±0, ,55±0,13 2,48±0, ,50±0,31 5,99±0,29 7,89±0,37 6,49±0, ,52±0,13 2,37±0, ,20±0,30 5,87±0,29 7,18±0,33 6,14±0, ,50±0,12 2,06±0,09 1 6,01±0,30 6,14±0,30 8,11±0,40 8,83±0, ,89±0,19 2,64±0, ,99±0,34 7,26±0,37 8,00±0,38 8,71±0, ,81±0,13 2,50±0, ,80±0,31 7,14±0,36 8,08±0,40 8,61±0, ,74±0,14 2,48±0, ,62±0,30 6,98±0,35 8,93±0,42 8,44±0, ,50±0,11 2,36±0, ,54±0,29 6,32±0,32 9,15±0,44 8,22±0, ,46±0,12 2,31±0, ,31±0,25 6,14±0,31 7,91±0,40 7,77±0, ,25±0,10 2,01±0,10 132

149 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Πίνακας 22. (συνέχεια) 0,3 ΑΚΤ Λευκό τυρί άλμης με πυτιά και με 0,3 g πίσσα Πάφου (με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei) /100 g τυριού 0,9 ΑΚΤ Λευκό τυρί άλμης με πυτιά και με 0,9 g πίσσα Πάφου (με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei) /100 g τυριού Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) ΟΜΧ Λακτόκοκκοι Λακτοβάκιλλοι L. casei Κολοβακτηρίδι α Εντεροβακτηρίδια Ζύμες-Μύκητες Σταφυλόκοκκοι 1 5,92±0,29 6,27±0,31 8,45±0,41 9,03±0, ,92±0,20 2,72±0, ,93±0,34 7,34±0,37 8,28±0,39 8,91±0, ,63±0,12 2,88±0, ,87±0,33 7,20±0,35 8,63±0,43 8,90±0, ,47±0,12 2,70±0, ,55±0,30 6,67±0,32 8,85±0,45 8,85±0, ,39±0,11 2,57±0, ,48±0,31 6,28±0,31 8,98±0,43 8,41±0, ,16±0,11 2,39±0, ,37±0,28 6,29±0,31 8,02±0,40 8,04±0, ,01±0,10 2,03±0,10 1 5,89±0,28 6,39±0,32 8,76±0,44 9,05±0, ,95±0,20 2,78±0, ,82±0,32 7,10±0,36 8,48±0,42 9,00±0, ,54±0,12 3,01±0, ,74±0,32 6,99±0,35 8,93±0,43 8,91±0, ,48±0,12 2,83±0, ,53±0,29 6,74±0,34 8,86±0,42 8,80±0, ,31±0,11 2,75±0, ,42±0,29 6,36±0,30 8,42±0,30 8,53±0, ,30±0,11 2,58±0, ,40±0,28 6,34±0,30 8,00±0,40 8,12±0, ,04±0,10 2,22±0,10 133

150 ΟΜΧ (log cfu/ g λευκού τυριού άλμης) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Στα παραγόμενα λευκά τυριά άλμης, η ολική μεσόφιλη χλωρίδα αυξήθηκε τις πρώτες 15 ημέρες αποθήκευσης και στη συνέχεια μειώθηκε (Σχήμα 24). Δεν σημειώθηκε σημαντική διαφορά (P>0,05) στον πληθυσμό της ολικής μεσόφιλης χλωρίδας σε όλα τα λευκά τυριά άλμης. 8,00 7,50 7,00 6,50 6,00 5,50 5,00 4, Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) MΤ EKΤ 0,2AKΤ 0,3AKΤ 0,9AKΤ Σχήμα 24. Μεταβολή της ολικής μεσόφιλης χλωρίδας των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Ο πληθυσμός των λακτόκοκκων σε όλα τα λευκά τυριά άλμης αυξήθηκε τις πρώτες 15 ημέρες αποθήκευσης και στη συνέχεια παρουσίασε μείωση (Σχήμα 25). Οι λακτόκοκκοι αποτελούν μέρος της μη αρχικής καλλιέργειας του γάλακτος, η οποία επιβιώνει της παστερίωσης. Η παρατηρούμενη μείωση των λακτόκοκκων μετά από 30 ημέρες αποθήκευσης μπορεί να αποδοθεί στην ευαισθησία που έχουν οι λακτόκοκκοι σε περιβάλλον με υψηλής περιεκτικότητα αλάτι. Παρόμοια αποτελέσματα μείωσης των λακτόκοκκων μετά την 15 η ημέρα ωρίμανσης σε λευκό τυρί άλμης τύπου φέτας αναφέρθηκαν από την Dimitrellou και τους συνεργάτες της (2014). 134

151 Λακτόκοκκοι (log cfu/ g λευκού τυριού άλμης) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 8 7,5 7 6,5 6 5,5 5 4, Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) MΤ EKΤ 0,2AKΤ 0,3AKΤ 0,9AKΤ Σχήμα 25. Μεταβολή των λακτόκοκκων των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Στο Σχήμα 26 παρουσιάζεται ο πληθυσμός των λακτοβάκιλλων κατά το χρόνο αποθήκευσης των λευκών τυριών άλμης. Στα λευκά τυριά άλμης με ελεύθερα κύτταρα L. casei παρατηρήθηκαν σημαντικά μεγαλύτεροι πληθυσμοί λακτοβάκιλλων (P<0,05) συγκριτικά με το κοντρόλ (Πίνακας 22). Τα λευκά τυριά άλμης με ελεύθερα κύτταρα L. casei εκτός από τη μη αρχική καλλιέργεια λακτοβάκιλλων που περιέχεται και στο κοντρόλ, περιέχουν και την προστιθέμενη καλλιέργεια του μικροοργανισμού L. casei. Παρόμοια αποτελέσματα παρουσίασε η Dimitrellou και οι συνεργάτες της (2014). Στα λευκά τυριά άλμης με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε πίσσα Πάφου παρατηρήθηκαν σημαντικά μεγαλύτεροι πληθυσμοί λακτοβάκιλλων (P<0,05) συγκριτικά με το κοντρόλ, παρέχοντας την ίδια εικόνα που έδωσαν και τα λευκά τυριά άλμης με ελεύθερα κύτταρα L. casei (Πίνακας 22). Ο πληθυσμός των λακτοβάκιλλων στα λευκά τυριά άλμης με τα ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε πίσσα Πάφου δεν επηρεάζεται σημαντικά από την ποσότητα του προστιθέμενου ακινητοποιημένου βιοκαταλύτη (P>0,05). Σημειώνεται ότι σε όλα τα παραγόμενα λευκά τυριά άλμης, ο πληθυσμός των λακτοβάκιλλων δε μεταβάλλεται σημαντικά μέχρι τις εξήντα ημέρες αποθήκευσης. Μετά από την εξηκοστή ημέρα αποθήκευσης σημειώθηκε μείωση των λακτοβάκιλλων στα λευκά τυριά άλμης που περιείχαν την πρόσθετη καλλιέργεια. Η παρατηρούμενη μείωση 135

152 Λακτοβάκιλλοι (log cfu/ g λευκού τυριού άλμης) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ των λακτοβάκιλλων μετά τις εξήντα ημέρες αποθήκευσης οφείλεται πιθανότατα σε επικράτηση συνθηκών (όπως το υψηλό ποσοστό αλατιού, η έλλειψη σακχάρων προς ζύμωση και η πιθανή παραγωγή βακτηριοσινών), που δεν ευνοούν την ανάπτυξη των λακτοβάκιλλων στη μάζα των λευκών τυριών άλμης (Stanton και συνεργάτες, 1998). 9,5 8,5 7,5 6,5 5,5 4, Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) MΤ EKΤ 0,2AKΤ 0,3AKΤ 0,9AKΤ Σχήμα 26. Μεταβολή των λακτοβάκιλλων των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Οι ζύμες και οι μύκητες δεν αποτελούν συνήθως μέρος των αρχικών καλλιεργειών στη παρασκευή των τυριών. Εντούτοις, σχετικά υψηλός αριθμός τους εμφανίζεται σε πολλά μαλακά τυριά, ημίσκληρα τυριά και σε τυριά που ωριμάζουν επιφανειακά, προερχόμενος από τον εξοπλισμό που χρησιμοποιείται κατά τη διαδικασία της τυροκόμησης, από την άλμη και από το χώρο τυροκόμησης (Viljoen, 2001). Η παρουσία ζυμών σχετίζεται με την κατανάλωση γαλακτικού οξέος και την παραγωγή αιθανόλης και η συνεισφορά των ζυμών στην ωρίμανση των τυριών έγκειται στη λιπολυτική και πρωτεολυτική τους δράση. Τα λευκά τυριά άλμης που περιείχαν την πρόσθετη καλλιέργεια L. casei σε ελεύθερη ή ακινητοποιημένη σε πίσσα Πάφου μορφή εμφάνισαν παρόμοιες τιμές ζυμών-μυκήτων (P>0,05) κατά το χρόνο αποθήκευσής τους. Σημαντική διαφορά (P<0,05) στον πληθυσμό των ζυμών-μυκήτων παρουσίασε το κοντρόλ συγκριτικά με τα υπόλοιπα λευκά τυριά άλμης (Πίνακας 22, Σχήμα 27). 136

153 Ζύμες-μύκητες (log cfu/ g λευκού τυριού άλμης) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 5,00 4,50 4,00 3,50 MΤ EKΤ 0,2AKΤ 0,3AKΤ 0,9AKΤ 3,00 2,50 2,00 1, Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) Σχήμα 27. Μεταβολή των ζυμών-μυκήτων των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Ο αριθμός των ζυμών-μυκήτων μειώθηκε (P<0,05) στα λευκά τυριά άλμης που περιείχαν L. casei σε ελεύθερη ή ακινητοποιημένη μορφή σε πίσσα Πάφου συγκριτικά με το κοντρόλ μετά την πρώτη ημέρα αποθήκευσής τους. Οι Schnurer και Magnusson (2005) αναφέρουν επικαλούμενοι βιβλιογραφία την ανασταλτική δράση του L. casei ως προς μικροοργανισμούς, όπως οι ζύμες και οι μύκητες και ο Dalie και οι συνεργάτες του (2010), αναφέρουν την αντιβακτηριακή δράση των γαλακτικών βακτηρίων σε τρόφιμα. Το φαινόμενο πιθανότατα βοηθείται από την παρουσία βακτηριοσίνης που παράγεται από τον L. casei (Huttunen και συνεργάτες, 1995) και αποτελεί ανασταλτικό παράγοντα στην ανάπτυξη των ζυμών και των μυκήτων. Επιπλέον, είναι πιθανό ο L. casei να συναγωνίζεται με τις ζύμες και τους μύκητες για τη χρήση μεταβολιτών, με άμεσο αποτέλεσμα τη μείωση του πληθυσμού των προσδιοριζόμενων ζυμών-μυκήτων στα λευκά τυριά άλμης. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 22 δεν υπήρξε ανάπτυξη κολοβακτηρίων και εντεροβακτηρίων σε όλη τη διάρκεια αποθήκευσης όλων των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης. Ο αριθμός των σταφυλόκοκκων μειώθηκε αισθητά (P<0,05) κατά τη διάρκεια αποθήκευσης στα λευκά τυριά άλμης που περιείχαν την πρόσθετη καλλιέργεια L. casei συγκριτικά με το κοντρόλ (Σχήμα 28). Τα λευκά τυριά άλμης με την ελεύθερη και την 137

154 Σταφυλόκοκκοι (log cfu/ g λευκού τυριού άλμης) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ακινητοποιημένη σε πίσσα Πάφου καλλιέργεια L. casei παρουσίασαν την ίδια εικόνα (P>0,05) αναφορικά με τον πληθυσμό των σταφυλόκοκκων κατά τη διάρκεια αποθήκευσης. 5 4,5 4 MΤ EKΤ 0,2AKΤ 0,3AKΤ 0,9AKΤ 3,5 3 2,5 2 1, Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) Σχήμα 28. Μεταβολή των σταφυλόκοκκων των παραγόμενων λευκών τυριών άλμης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Σημειώνεται ότι σε κανένα από τα παραγόμενα λευκά τυριά άλμης δεν υπήρξε ανάπτυξη του παθογόνου S. aureus. Ο S. aureus είναι ένας παθογόνος μικροοργανισμός που μπορεί να επιβιώσει στα λευκά τυριά άλμης, ιδιαίτερα παρουσία ζυμών, ακόμη και σε χαμηλές τιμές ph και σε υψηλή συγκέντρωση άλατος και δύναται να προκαλέσει σοβαρά προβλήματα υγείας στον καταναλωτή, λόγω των θερμοσταθερών εντεροτοξινών που παράγει. Όσον αφορά στον L. casei, ο πληθυσμός του παραμένει πάνω από τη συγκέντρωση 10 6 cfu/g προϊόντος στα λευκά τυριά άλμης που παρασκευάστηκαν με προσθήκη κυττάρων L. casei σε ελεύθερη ή ακινητοποιημένη μορφή, γεγονός που καθιστά τα παραγόμενα λευκά τυριά άλμης προβιοτικά προϊόντα (Πίνακας 22, Σχήμα 29). 138

155 Βιωσιμότητα L.casei (%) L.casei (log cfu/g λευκού τυριού άλμης) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΕΚΤ 0,2ΑΚΤ 0,3ΑΚΤ 0,9ΑΚΤ Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) Σχήμα 29. Πληθυσμοί κυττάρων L. casei στα παραγόμενα λευκά τυριά άλμης κατά τις ενενήντα ημέρες αποθήκευσής τους στους 4 o C Σημαντική διαφορά (P<0,05) ως προς τον πληθυσμό του L. casei εμφανίζεται μεταξύ των λευκών τυριών άλμης με κύτταρα L. casei σε ελεύθερη μορφή συγκριτικά με τα λευκά τυριά άλμης που περιέχουν κύτταρα L. casei σε ακινητοποιημένη μορφή σε πίσσα Πάφου, με τα λευκά τυριά άλμης με ακινητοποιημένα κύτταρα να παρουσιάζουν μεγαλύτερο πληθυσμό, ενώ τα λευκά τυριά άλμης με διαφορετική ποσότητα ακινητοποιημένου βιοκαταλύτη δεν παρουσιάζουν σημαντική διαφορά (P>0,05) ως προς τον πληθυσμό L. casei στις 90 ημέρες αποθήκευσής τους στους 4 o C (Σχήμα 29). Στο Σχήμα 30 φαίνεται ότι η ακινητοποίηση σε πίσσα Πάφου των κυττάρων L. casei συμβάλλει θετικά στη βιωσιμότητά τους στα παραγόμενα λευκά τυριά άλμης EKΤ 0,2AKΤ 0,3AKΤ 0,9AKΤ Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) Σχήμα 30. Βιωσιμότητα κυττάρων L. casei στα παραγόμενα λευκά τυριά άλμης κατά τις ενενήντα ημέρες αποθήκευσής τους στους 4 C 139

156 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Τέλος, σημειώνεται ότι η συνολική μικροβιολογική εικόνα που παρουσιάστηκε για τα λευκά τυριά άλμης συνάδει με το ότι μακροσκοπικά δεν παρατηρήθηκε αλλοίωσή τους μέχρι την 90 η ημέρα αποθήκευσής τους στους 4 C Προκαταρκτική οργανοληπτική αξιολόγηση λευκών άλμης Το λευκό τυρί άλμης που παρασκευάστηκε με απουσία πρόσθετης καλλιέργειας και τα λευκά τυριά άλμης που παρασκευάστηκαν με προσθήκη κυττάρων L. casei (σε ελεύθερη ή ακινητοποιημένη μορφή σε πίσσα Πάφου) εξετάστηκαν ως προς τα οργανοληπτικά τους χαρακτηριστικά. Η αξιολόγηση πραγματοποιήθηκε σε λευκό τυρί άλμης των 25 g που είχε αφεθεί για ωρίμανση 90 ημέρες. Η οργανοληπτική αξιολόγηση διενεργήθηκε από 10 δοκιμαστές, οι οποίοι ζητήθηκαν να βαθμολογίσουν τα λευκά τυριά άλμης σε κλίμακα από το 0 εώς στο 10 (0 μη αποδεκτό, 10 εξαιρετικό) όσον αφορά τις ιδιότητες: άρωμα και γεύση. Οι δοκιμαστές χρησιμοποιούσαν νερό για ξέπλυμα του στόματός τους μεταξύ των δειγμάτων και δεν γνώριζαν την ταυτότητα των εξεταζόμενων δειγμάτων. Τα αποτελέσματα της οργανοληπτικής αξιολόγησης παρουσιάζονται στον Πίνακα 23. Προκύπτει ότι η χρήση των ακινητοποιημένων κυττάρων L. casei στην πίσσα Πάφου στην παρασκευή των λευκών τυριών άλμης επηρέασε σημαντικά (P < 0.05) τις προτιμήσεις των δοκιμαστών. Τα λευκά τυριά άλμης με τα ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei στην πίσσα Πάφου συγκεντρώσανε την υψηλότερη βαθμολογία συγκριτικά με τα λευκά τυριά άλμης που δε περιείχαν πίσσα Πάφου. Πίνακας 23. Προκαταρκτική οργανοληπτική αξιολόγηση λευκών τυριών άλμης Είδος τυριού τυρογάλακτος Γεύση Άρωμα 8 7 ΜΤ Λευκό τυρί άλμης μόνο με πυτιά ΕΚΤ Λευκό τυρί άλμης με πυτιά και με ελεύθερα κύτταρα L. casei 0,2 ΑΚΤ Λευκό τυρί άλμης με πυτιά και με 0,2 g πίσσα Πάφου (με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei) /100 g λευκού τυριού άλμης 0,3 ΑΚΤ Λευκό τυρί άλμης με πυτιά και με 0,3 g πίσσα Πάφου (με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei) /100 g λευκού τυριού άλμης 0,9 ΑΚΤ Λευκό τυρί άλμης με πυτιά και με 0,9 g πίσσα Πάφου (με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei) /100 g λευκού τυριού άλμης

157 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Συμπέρασμα για τα λευκά τυριά άλμης Διαπιστώθηκε ότι τα παραγόμενα λευκά τυριά άλμης με τη πρόσθετη καλλιέργεια του μικροοργανισμού L. casei (σε ελεύθερη ή σε ακινητοποιημένη μορφή σε πίσσα Πάφου) χαρακτηρίζονται από καλύτερα φυσικοχημικά και μικροβιολογικά χαρακτηριστικά συγκριτικά με το λευκό τυρί άλμης που παρασκευάστηκε χωρίς χρήση κυττάρων L. casei. Συγκεκριμένα, η πρόσθετη καλλιέργεια οδήγησε σε προϊόντα με υψηλότερη οξύτητα, χαμηλότερη τιμή ph, μικρότερο αριθμό πληθυσμού σταφυλόκοκκων και συνέβαλε στην παραγωγή προϊόντων με καλύτερα ποιοτικά χαρακτηριστικά συγκριτικά με το λευκό τυρί άλμης που δε περιείχε καλλιέργεια L. casei. Η επιλογή μάλιστα του μικροοργανισμού L. casei έδωσε προβιοτικό χαρακτήρα στα παραγόμενα λευκά τυριά άλμης, αφού η βιωσιμότητά του διατηρήθηκε μεγαλύτερη από 10 6 cfu/g προϊόντος κατά τη διάρκεια αποθήκευσης των λευκών τυριών άλμης. Επιπρόσθετα, τα λευκά τυριά άλμης με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε πίσσα Πάφου διακρίθηκαν από «λεπτό» άρωμα. 141

158 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 15. Τυρί τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» Τα τυριά τυρογάλακτος παρασκευάζονται μέσω μετουσίωσης και καταβύθισης των πρωτεϊνών του τυρογάλακτος (α-λακταλβουμίνη, β-λακτογλοβουλίνη), που συνοδεύεται από θέρμανση σε θερμοκρασία μεγαλύτερη των 85 C. Ακολουθεί συλλογή και στράγγιση του πήγματος (Samelis και συνεργάτες, 2003). Τα τυριά τυρογάλακτος καταναλώνονται ως επιτραπέζια τυριά. Έχουν υψηλή θρεπτική αξία, χαμηλή περιεκτικότητα σε λίπος και σε αλάτι και παρουσιάζουν καλά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά (Papaioannou και συνεργάτες, 2007). Τα φρέσκα τυριά τυρογάλακτος παρουσιάζουν τιμή ph μεγαλύτερη του 6, έχουν υψηλό ποσοστό υγρασίας και χαμηλό ποσοστό αλατιού και ως εκ τούτου θεωρούνται εξαιρετικά επηρρεπή σε μικροβιακή αλλοίωση (Hough και συνεργάτες, 1999). Ορισμένες φορές, ο χρόνος ζωής των ελληνικών τυριών τυρογάλακτος μπορεί να φθάνει μέχρι επτά ημέρες κάτω από αερόβιες συνθήκες αποθήκευσης, ενώ η αποθήκευση υπό κενό μπορεί να βοηθήσει σε αύξηση της διατηρησιμότητας του προϊόντος σε 20 με 30 ημέρες (Samelis και συνεργάτες, 2003). Επομένως ιδιαίτερης σημασίας αποτελεί η εύρεση τρόπου αύξησης της διατηρησιμότητας των τυριών τυρογάλακτος. Για αύξηση του χρόνου διατηρησιμότητας στα παραγόμενα τυριά τυρογάλακτος έγινε προσθήκη κυττάρων του μικροοργανισμού L. casei σε ελεύθερη και σε ακινητοποιημένη μορφή σε πίσσα Πάφου, δεδομένου ότι τα κύτταρα L. casei έχει βρεθεί ότι πιθανότατα παράγουν βακτηριοσίνη και δρουν ανασταλτικά ως προς την ανάπτυξη αλλοιογόνων μικροοοργανισμών (Huttunen και συνεργάτες, 1995). Για λόγους σύγκρισης παρασκευάστηκαν και τυριά τυρογάλακτος απουσία κυττάρων L. casei. Στα παραγόμενα προϊόντα μελετήθηκε η επίδραση του ακινητοποιημένου βιοκαταλύτη στα φυσικοχημικά τους χαρακτηριστικά, στο μικροβιολογικό και στο οργανοληπτικό τους προφίλ κατά τη διάρκεια αποθήκευσής τους για διάστημα είκοσι ημερών στους 4 C. Ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε στον προσδιορισμό της βιωσιμότητας των κυττάρων του L. casei στη διάρκεια αποθήκευσης των τυριών τυρογάλακτος. Σημειώνεται ότι τα τυριά τυρογάλακτος που περιείχαν τα ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei στη πίσσα Πάφου 142

159 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ παρουσίασαν μια διακριτική γεύση και το χαρακτηριστικό άρωμα της περιεχόμενης πίσσας Πάφου. Επιπλέον, παρασκευάστηκε τυρί τυρογάλακτος που περιείχε ελεύθερα κύτταρα L. casei και «ελεύθερη» ποσότητα 0,5 g πίσσας Πάφου/100g προϊόντος, για λόγους σύγκρισης Φυσικοχημικά χαρακτηριστικά τυριών τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» Στον Πίνακα 24 παρουσιάζεται η τιμή του ph, η οξύτητα και η υπολειπόμενη λακτόζη των παραγόμενων τυριών τυρογάλακτος σε συνάρτηση με το χρόνο αποθήκευσής τους στους 4 C. Πίνακας 24. Τιμή ph, οξύτητα, λακτόζη τυριών τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Είδος τυριού τυρογάλακτος Μμ Τυρί τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» Εκμ Τυρί τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» με 1 g ελεύθερα κύτταρα L. casei / 100 g προϊόντος 0,5Ακμ Τυρί τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» με 0,5 g ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε πίσσα Πάφου/100 g προϊόντος Τυρί τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» με 0,5 g «ελεύθερη» πίσσα Πάφου και 1 g ελεύθερα κύτταρα L. casei/100 g προϊόντος χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) Τιμή ph οξύτητα (g γαλακτικού οξέος/100 g προϊόντος) λακτόζη (g /100 g προϊόντος) 1 6,47±0,04 0,19±0,01 3,78±0,08 4 6,45±0,05 0,20±0,01 3,80±0,08 7 6,47±0,05 0,20±0,01 3,79±0, ,44±0,04 0,21±0,01 3,80±0, ,43±0,04 0,21±0,01 3,79±0,04 1 6,34±0,04 0,30±0,02 3,79±0,05 4 6,22±0,03 0,38±0,02 3,66±0,06 7 6,16±0,04 0,40±0,02 3,63±0, ,08±0,04 0,48±0,03 3,60±0, ,00±0,04 0,48±0,03 3,58±0,04 1 6,37±0,04 0,31±0,02 3,78±0,07 4 6,17±0,04 0,50±0,03 3,67±0,06 7 6,00±0,03 0,61±0,04 3,55±0, ,94±0,03 0,62±0,04 3,53±0, ,93±0,04 0,62±0,04 3,52±0,07 1 6,33±0,04 0,29±0,02 3,78±0,04 4 6,19±0,04 0,28±0,02 3,67±0,04 7 6,21±0,04 0,40±0,03 3,63±0, ,04±0,03 0,44±0,03 3,61±0, ,03±0,03 0,47±0,03 3,60±0,06 143

160 Τιμή ph ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Η τιμή ph των τυριών τυρογάλακτος επηρεάστηκε από την πρόσθετη καλλιέργεια. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 24, στο τυρί τυρογάλακτος που περιείχε ελεύθερα κύτταρα L. casei και στο τυρί τυρογάλακτος με τον ακινητοποιημένο βιοκαταλύτη παρατηρήθηκε μία σημαντική μείωση της τιμής του ph (P<0,05) συγκριτικά με το κοντρόλ. Η τιμή του ph στο τυρί τυρογάλακτος με ελεύθερα κύτταρα L. casei μειώθηκε από την αρχική τιμή 6,4 στη τιμή 6,0 και στο τυρί τυρογάλακτος με τα ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε πίσσα Πάφου η τιμή του ph μειώθηκε από την τιμή 6,4 στη τιμή 5,9, μετά από 20 ημέρες αποθήκευσης. Η τιμή του ph του κοντρόλ δε μεταβλήθηκε σημαντικά κατά τη διάρκεια αποθήκευσης και παρέμεινε στη τιμή 6,4 με 6,5. Η παρατηρούμενη μείωση της τιμής του ph στα τυριά τυρογάλακτος με την πρόσθετη καλλιέργεια οφείλεται στη δράση των προστιθέμενων κυττάρων L. casei. Το τυρί τυρογάλακτος με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε πίσσα Πάφου δεν εμφάνισε στατιστική διαφορά ως προς την τιμή του ph (P>0,05) από το τυρί τυρογάλακτος με τα ελεύθερα κύτταρα L. casei κατά το χρόνο αποθήκευσης (Σχήμα 31). 6,6 6,5 6,4 6,3 6,2 6,1 6 5,9 5,8 Mμ EKμ 0,5AKμ Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) Σχήμα 31. Μεταβολή της τιμής ph τυριών τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Γενικά μπορεί να ειπωθεί ότι η τιμή του ph όλων των παραγόμενων τυριών τυρογάλακτος μετά από 20 ημέρες αποθήκευσης στους 4 C κυμάνθηκε σε σχετικά υψηλές τιμές από 5,93 έως 6,43 (Πίνακας 24). Οι τιμές αυτές είναι παραπλήσιες με εκείνες που αναφέρονται από την Dimitrellou και τους συνεργάτες της (2007) για τη περίπτωση τυριού τυρογάλακτος που είναι αποθηκευμένο για 14 ημέρες στους 5 C και 144

161 Οξύτητα (g γαλακτικού οξέος/100g τυριού τυρογάλακτος) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ δικαιολογούνται από την μη προσθήκη ισχυρής οξυγαλακτικής καλλιέργειας στα παραγόμενα προϊόντα. Η οξύτητα των τυριών τυρογάλακτος επηρεάστηκε από την πρόσθετη καλλιέργεια. Τα τυριά τυρογάλακτος με πρόσθετη καλλιέργεια L. casei (σε ελεύθερη ή ακινητοποιημένη μορφή στη πίσσα Πάφου) παρουσίασαν οξύτητα στατιστικά μεγαλύτερη (P<0,05) συγκριτικά με το τυρί τυρογάλακτος που παρασκευάστηκε χωρίς πρόσθετη καλλιέργεια. Συγκεκριμένα, η οξύτητα εμφάνισε αύξηση από την τιμή 0,3 σε τιμή 0,5 g γαλακτικού οξέος/100g προϊόντος στο τυρί τυρογάλακτος με ελεύθερα κύτταρα L. casei και αύξηση από την τιμή 0,3 σε τιμή 0,6 g γαλακτικού οξέος/100 g προϊόντος στο τυρί τυρογάλακτος με ακινητοποιημένο βιοκαταλύτη, όπως φαίνεται στον Πίνακα 24 και απεικονίζεται στο Σχήμα 32. 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Mμ EKμ 0,5AKμ Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) Σχήμα 32. Μεταβολή της οξύτητας τυριών τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Στο Σχήμα 33 παρουσιάζεται η μεταβολή της υπολειπόμενης λακτόζης τυριών τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους. Το τυρί τυρογάλακτος με ελεύθερα και το τυρί τυρογάλακτος με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε πίσσα Πάφου παρουσίασαν σημαντικά (P<0,05) μεγαλύτερο ρυθμό μείωσης της λακτόζης συγκριτικά με το κοντρόλ, το οποίο οφείλεται στη δράση των προστιθέμενων κυττάρων L. casei (Πίνακας 24, Σχήμα 33). 145

162 Λακτόζη (g /100g τυριού τυρογάλακτος) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Στατιστική διαφορά (P>0,05) ως προς την υπολειπόμενη λακτόζη δεν εμφανίστηκε μεταξύ των τυριών τυρογάλακτος που περιείχαν τα κύτταρα L. casei σε ελεύθερη ή ακινητοποιημένη μορφή σε πίσσα Πάφου. Σημειώνεται ότι το ποσοστό της υπολειπόμενης λακτόζης δε μεταβλήθηκε σημαντικά μετά τη τέταρτη ημέρα αποθήκευσης των τυριών τυρογάλακτος με πρόσθετη καλλιέργεια (Πίνακας 24, Σχήμα 33), γεγονός που δηλώνει τον αργό ρυθμό ζύμωσης της λακτόζης. 3,90 3,80 3,70 3,60 3,50 3,40 3,30 Mμ EKμ 0,5AKμ Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) Σχήμα 33. Μεταβολή της υπολειπόμενης λακτόζης τυριών τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C Τα παραγόμενα τυριά τυρογάλακτος παρουσίασαν υγρασία της τάξεως του 70% και τέφρα ίση με 1% σε όλη τη διάρκεια αποθήκευσής τους στους 4 C. Η παρουσία κυττάρων L. casei (ελεύθερων ή ακινητοποιημένων σε πίσσα Πάφου) και ο χρόνος αποθήκευσης δεν επηρέασαν σημαντικά το ποσοστό της υγρασίας και της τέφρας. Τέλος, τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά του τυριού τυρογάλακτος με τα ελεύθερα κύτταρα L. casei και την «ελεύθερη» πίσσα Πάφου δεν παρουσίασαν σημαντική διαφορά (P>0,05) από τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά του τυριού τυρογάλακτος με τα ελεύθερα ή τα ακινητοποιημένα σε πίσσα Πάφου κύτταρα L. casei. 146

163 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Μικροβιολογικό προφίλ τυριών τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» Τα τυριά τυρογάλακτος αποτελούν καλό υπόστρωμα ανάπτυξης παθογόνων βακτηρίων, τα οποία μπορούν να μολύνουν το τυρόπηγμα και να πολλαπλασιαστούν με γρήγορο ρυθμό με πιθανό αποτέλεσμα την πρόκληση μόλυνσης. Παραδείγματα αποτελούν οι περιπτώσεις ανάπτυξης του μικροοργανισμού L. monocytogenes σε τυριά τυρογάλακτος (Tsiotsias και συνεργάτες, 2002) και η μόλυνση τυριών τυρογάλακτος κατά την παραγωγική διαδικασία με τον παθογόνο μικροοργανισμό E. coli (Govaris και συνεργάτες, 2001). Για τη διασφάλιση αποφυγής της ανάπτυξης παθογόνων μικροοργανισμών στα τυριά τυρογάλακτος απαιτείται η λήψη προστατευτικών μέτρων κατά την παραγωγική διαδικασία. Για το σκοπό αυτό, έχει προταθεί η χρήση ακτινοβόλησης των τυριών (Tsiotsias και συνεργάτες, 2002), η προσθήκη νισίνης σε τυριά (Samelis και συνεργάτες, 2003), η χρήση φυσικών αντιμικροβιακών ή προστατευτικών καλλιεργειών γαλακτικών βακτηρίων και η προσθήκη αιθερίων ελαίων (Tsiraki και Savvaidis, 2011). Οι Tsiraki και Savvaidis (2011) μελέτησαν την επίδραση της προσθήκης αιθερίου ελαίου βασιλικού στο τυρί τυρογάλακτος ανθότυρος (με τελική συγκέντρωση στο τελικό προϊόν ίση με 0,4% κ.ο.) όσον αφορά στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά και στο χρόνο διατηρησιμότητάς του. Διαπίστωσαν ότι ο συνδυασμός προσθήκης αιθερίου έλαιου βασιλικού με αποθήκευση του προϊόντος σε ατμόσφαιρα CO 2 /N 2 ή σε κενό διατήρησε τα αρχικά ευχάριστα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του προϊόντος και ο χρόνος διατηρησιμότητάς του επιμηκύνθηκε περισσότερο από πέντε ημέρες. Στη παρούσα διδακτορική διατριβή, έγινε χρήση της πίσσας Πάφου και του προβιοτικού μικροοργανισμού L. casei (σε ελεύθερη ή σε ακινητοποιημένη μορφή σε πίσσα Πάφου) ως συστατικού τυριών τυρογάλακτος και μελετήθηκε η επίδρασή τους στα μικροβιολογικά χαρακτηριστικά των παραγόμενων προϊόντων. Στον Πίνακα 25 παρουσιάζονται οι πληθυσμοί ολικής μεσόφιλης χλωρίδας, λακτόκοκκων, ζυμών-μυκήτων, σταφυλόκοκκων, κολοβακτηρίων, εντεροβακτηρίων και του L. casei στα τυριά τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C. 147

164 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Πίνακας 25. Πληθυσμοί ολικής μεσόφιλης χλωρίδας, λακτόκοκκων, ζυμών-μυκήτων, σταφυλόκοκκων, κολοβακτηρίων, εντεροβακτηρίων και του L. casei σε τυριά τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους στους 4 C (log cfu/g προϊόντος) Είδος τυριού τυρογάλακτος Μ μ Τυρί τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» ΕΚ μ Τυρί τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» με 1 g ελεύθερα L. casei/100 g προϊόντος 0,5ΑΚ μ Τυρί τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» με 0,5 g ακινητοποιημένο βιοκαταλύτη/100 g προϊόντος 0,5 πίσσα ΕΛ μ Τυρί τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» με 0,5 g πίσσα Πάφου και 1 g ελεύθερα L. casei /100 g προϊόντος Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) Ολική μεσόφιλη χλωρίδα Λακτόκοκκοι Ζύμες- Μύκητες Σταφυλόκοκκοι Κολοβακτηρίδια Εντεροβακτηρίδια L. casei 1 3,78±0,19 2,80±0,14 1,68±0,08 1,98±0, ,97±0,15 4 4,30±0,21 2,85±0,15 2,30±0,12 1,92±0, ,66±0,13 7 4,65±0,23 2,70±0,14 2,62±0,13 2,14±0, ,57±0, ,75±0,24 2,75±0,14 2,42±0,12 2,21±0, ,05±0, ,78±0,29 2,78±0,14 2,30±0,12 2,25±0, ,74±0,19 1 3,30±0,17 2,83±0,15 1,60±0,08 2,11±0, ,97±0,47 4 4,26±0,21 3,95±0,19 1,90±0,10 1,70±0, ,28±0,46 7 4,83±0,24 3,18±0,16 2,04±0,10 1,30±0, ,81±0, ,50±0,23 3,23±0,16 1,95±0, ,32±0, ,00±0,25 3,58±0,18 1,80±0, ,16±0,42 1 3,78±0,19 2,90±0,15 1,74±0,09 1,98±0, ,96±0,50 4 4,99±0,24 3,52±0,17 1,80±0,09 1,52±0, ,87±0,49 7 5,00±0,25 3,48±0,18 1,83±0,09 1,00±0, ,8±0, ,12±0,25 3,20±016 1,56±0, ,71±0, ,21±0,26 2,85±0,14 1,00±0, ,78±0,47 1 3,30±0,17 2,69±0,14 1,70±0,09 2,01±0, ,85±0,48 4 4,22±0,21 3,20±0,16 2,30±0,12 1,80±0, ,42±0,47 7 5,00±0,25 4,11±0,20 2,26±0,11 1,24±0, ,34±0, ,02±0,24 3,06±0,15 2,11±0, ,54±0, ,30±0,27 3,01±0,15 1,45±0, ,46±0,44 148

165 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Κατά τη διάρκεια αποθήκευσης των τυριών τυρογάλακτος για 20 ημέρες δεν παρουσιάστηκε ανάπτυξη παθογόνων μικροοργανισμών όπως κολοβακτηριδίων, εντεροβακτηριδίων, σαλμονέλλας και του St. aureus. Παρατηρήθηκε σημαντική μείωση (P<0,05) του πληθυσμού των σταφυλόκοκκων στα τυριά τυρογάλακτος που περιείχαν κύτταρα L. casei σε ελεύθερη ή σε ακινητοποιημένη μορφή στη πίσσα Πάφου συγκριτικά με το τυρί τυρογάλακτος χωρίς πρόσθετη καλλιέργεια. Η μείωση των σταφυλόκοκκων στα τυριά τυρογάλακτος με την πρόσθετη καλλιέργεια L. casei βρίσκεται σε συμφωνία με προηγούμενη μελέτη της Madureira και των συνεργατών της (2011), όπου διαπιστώθηκε η καταστολή του παθογόνου βακτηρίου St. aureus παρουσία της προβιοτικής καλλιέργειας L. casei σε τυρί τυρογάλακτος. Μάλιστα η Madureira και οι συνεργάτες της (2011) προτείνουν την προσθήκη προβιοτικής καλλιέργειας L. casei σε τυρί τυρογάλακτος για αύξηση του χρόνου διαθεσιμότητάς και για διασφάλιση της αποφυγής αλλοιωσής του. Η ολική μεσόφιλη χλωρίδα αυξήθηκε κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης σε όλα τα τυριά τυρογάλακτος. Η προσθήκη της πρόσθετης καλλιέργειας L. casei δεν επηρεάζει την ολική μεσόφιλη χλωρίδα (P>0,05). Οι τιμές της ολικής μεσόφιλης χλωρίδας κυμάνθηκαν μεταξύ 3 και 6 log cfu/g προϊόντος. Ανόλογες τιμές προσδιορίστηκαν από την Kalogridou- Vassiliadou και τους συνεργάτες της (1994) σε τυρί τυρογάλακτος (ανθότυρο). Σε μελέτη που διεξήγαγαν για τον ανθότυρο βρήκαν ότι ποσοστό 56% των εμπορικών δειγμάτων ανθότυρου που ανάλυσαν είχε τιμές ολικής μεσόφιλης χλωρίδας που βρισκόταν σε εύρος 10 5 με 10 6 cfu/g προϊόντος, ενώ η ολική μεσόφιλη χλωρίδα ήταν μικρότερη από 10 5 cfu/g προϊόντος στο 28% των μελετηθέντων δειγμάτων και μεγαλύτερη από 10 6 cfu/g προϊόντος σε ποσοστό 16%. Ο πληθυσμός των λακτόκοκκων δε μεταβλήθηκε σημαντικά με τον χρόνο αποθήκευσης σε κανένα από τα τυριά τυρογάλακτος και κυμαινόταν μεταξύ 3 και 4 cfu/g προϊόντος. Ο πληθυσμός των ζυμών-μυκήτων βρίσκεται μεταξύ 1 με 2 log cfu/g προϊόντος σε όλα τα τυριά τυρογάλακτος. Μεγαλύτερες τιμές ζυμών-μυκήτων αναφέρουν σε ανασκόπηση ο Panagou και οι συνεργάτες του (2013), όπου η μυζήθρα του εμπορίου σε χύμα μορφή με τιμή ph 6,5 έχει ζύμες-μύκητες σε πληθυσμό 3,0 log cfu/g προϊόντος. 149

166 Βιωσιμότητα L.casei (%) L.casei (log cfu/g τυριού τυρογάλακτος) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Στο Σχήμα 34 παρουσιάζεται η μεταβολή του πληθυσμού του L. casei σε τυριά τυρογάλακτος κατά την αποθήκευσή τους στους 4 C για 20 ημέρες. Σημειώνεται ότι το κοντρόλ περιείχε έναν αρχικό πληθυσμό L. casei, ο οποίος βρισκόταν σε χαμηλά επίπεδα (3 με 4 log cfu/g προϊόντος). 12 ΕΚμ ΑΚ0,5μ 0,5πίσσα ΕΛμ Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) Σχήμα 34. Μεταβολή του πληθυσμού L. casei σε τυριά τυρογάλακτος κατά την αποθήκευσή τους στους 4 C για 20 ημέρες Η πίσσα Πάφου επηρεάζει σημαντικά (P<0,05) τη βιωσιμότητα της ακινητοποιημένης σε αυτή πρόσθετης καλλιέργειας L. casei. Στο τυρί τυρογάλακτος που περιείχε τον ακινητοποιημένο βιοκαταλύτη, η επιβίωση των κυττάρων L. casei παρέμεινε σε υψηλότερα επίπεδα συγκριτικά με το τυρί τυρογάλακτος που περιείχε ελεύθερα κύτταρα L. casei σε όλη τη διάρκεια της αποθήκευσής τους στους 4 C, όπως φαίνεται στο Σχήμα EKμ AK0,5μ 0,5πίσσαΕΛμ Χρόνος αποθήκευσης (ημέρες) Σχήμα 35. Βιωσιμότητα L. casei σε τυριά τυρογάλακτος κατά την αποθήκευσή τους στους 4 C για 20 ημέρες 150

167 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Επιπλέον, σημειώνεται ότι, όπως αναμενόταν, η βιωσιμότητα των προστιθέμενων ελεύθερων κυττάρων L. casei του παραγόμενου τυριού τυρογάλακτος παρουσία «ελεύθερης» πίσσας Πάφου βρισκόταν στα ίδια επίπεδα με τη βιωσιμότητα που προσδιορίστηκε στο τυρί τυρογάλακτος που περιείχε ελεύθερα κύτταρα L. casei (P>0,05). Συμπεραίνεται ότι η ακινητοποίηση συμβάλλει στην αύξηση της βιωσιμότητας των κυττάρων, όπως εξάλλου τεκμαίρεται και από τη σύγκριση της βιωσιμότητας ελεύθερων και ακινητοποιημένων κυττάρων στη πίσσα Πάφου Αρωματικό προφίλ τυριών τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» Στον Πίνακα 26 παρουσιάζονται τα τερπενικά συστατικά τυριού τυρογάλακτος που περιέχει ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε πίσσα Πάφου. Ένας μεγάλος αριθμός τερπενικών ενώσεων, με το κυριότερο το α-πινένιο (Πίνακας 26, Σχήμα 36) εμφανίζεται στο παραγόμενο τυρί τυρογάλακτος με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε πίσσα Πάφου, που οφείλεται αποκλειστικά στην προστιθέμενη σε αυτό πίσσα Πάφου. 151

168 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Πίνακας 26. Τερπενικά συστατικά τυριών τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» (στο % του συνόλου των προσδιοριζόμενων τερπενίων), που έχει παρασκευαστεί με προσθήκη 0,5 g ακινητοποιημένου βιοκαταλύτη σε 100 g προϊόντος με χρήση της τεχνικής SPME GC/MS Ένωση Μέθοδος ταυτοποίησης Kovats Index Kovats Index βιβλιογραφίας Τυρί τυρογάλακτος με ελεύθερα κύτταρα L. casei Τυρί τυρογάλακτος με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei σε πίσσα Πάφου Μονοτερπένια α-πινένιο KI, MS c Nd 84,5±1, h 1019 b καμφένιο KI, MS c Nd 0,8±0, j β-πινένιο KI, MS d Nd 2,2±0, b 3-καρένιο KI, MS e Nd 0,6±0, h β-μυρσένιο KI, MS c Nd 0,6±0, e 1158 j 2-καρένιο MS 1164 N.A. Nd 0,2±0,01 D-λεμονένιο KI, MS e Nd 1,3±0, g 1189 f 1198 b β-φυλλανδρένιο KI, MS e Nd 0,1±0,01 o-κυμένιο MS 1250 N.A. Nd 0,7±0,04 Οξυγονωμένα μονοτερπένια ευκαλυπτόλη KI, MS e Nd 0,3±0,02 τερπινολένιο KI, MS i Nd 3,6±0,2 καμφενόλη MS 1482 N.A. Nd 0,1±0,04 λιναλοόλη KI, MS a Nd 0,2±0, j οξικό βορνύλιο KI, MS i Nd 0,8±0,1 4 τερπινεόλη KI, MS b Nd 0,3±0, d πινοκαρβεόλη MS 1651 Ν.Α. Nd 0,4±0,1 βερβενόλη MS 1671 N.A. Nd 0,3±0,1 α-τερπινεόλη KI, MS i Nd 1,4±0, j 5,8,10εντεκτατριεν-3-όλη MS 1716 N.A. Nd 0,7±0,2 μελιλοτάλη MS 1783 N.A. Nd 0,2±0,1 μυρτενόλη KI, MS i Nd 0,2±0,1 p-συμεν-8-όλη KI, MS i Nd 0,7±0,2 MS: θετική επιβεβαίωση με φάσμα μάζας από τις βιβλιοθήκες NIST107, NIST21 και SZTERP, Nd: Μη ανιχνεύσιμο, N.A. Μη Διαθέσιμο, a : Shimoda και συνεργάτες (1995), b : Shiratsuchi και συνεργάτες (1993), c : Gardeli και συνεργάτες (2008), d : Hognadottir και συνεργάτες (2003), e : Prompona και συνεργάτες (2012), f : Kandylis και συνεργάτες (2010), g : Mallouchos και συνεργάτες (2007), h : Vichi και συνεργάτες (2007), i : Lee και συνεργάτες (2005), j : Goodner (2008). 152

169 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Στο τυρί τυρογάλακτος με 0,5 g ακινητοποιημένα κύτταρα σε πίσσα Πάφου βρέθηκε ότι στο σύνολο των ολικών προσδιοριζόμενων τερπενίων τα ολικά μονοτερπένια βρίσκονται σε ποσοστό 90,9% και τα ολικά οξυγονωμένα μονοτερπένια σε ποσοστό 9,1%. Στο Σχήμα 36 παρουσιάζεται η κατανομή των τερπενικών συστατικών τυριού τυρογάλακτος που περιέχει 0,5 g ακινητοποιημένου βιοκαταλύτη σε 100 g προϊόντος, όπου φαίνεται ότι η κυριότερη σε ποσοστό ένωση είναι το α-πινένιο (84,5%). α-πινένιο καμφένιο β-πινένιο 3-καρένιο β-μυρσένιο 2-καρένιο D-λεμονένιο β-φυλλανδρένιο ο-κυμένιο ευκαλυπτόλη τερπινολένιο καμφενόλη λιναλοόλη οξικό βορνύλιο 4 τερπινεόλη πινοκαρβεόλη βερβενόλη α-τερπινεόλη 5,8,10 εντεκατριέν-3-ολη μελιλοτάλη μυρτενόλη p-συμεν-8-όλη Σχήμα 36. Κατανομή τερπενίων σε τυρί τυρογάλακτος που περιέχει πίσσα Πάφου Προκαταρκτική οργανοληπτική αξιολόγηση τυριών τυρογάλακτος τύπου «μυζήθρα» Το τυρί τυρογάλακτος που παρασκευάστηκε με απουσία πρόσθετης καλλιέργειας και τα τυριά τυρογάλακτος που παρασκευάστηκαν με προσθήκη κυττάρων L. casei (σε ελεύθερη ή ακινητοποιημένη μορφή σε πίσσα Πάφου) εξετάστηκαν ως προς τα οργανοληπτικά τους χαρακτηριστικά. Η αξιολόγηση πραγματοποιήθηκε σε τυρί τυρογάλακτος των 25 g που είχε αφεθεί για ωρίμανση 20 ημέρες. Η οργανοληπτική αξιολόγηση διενεργήθηκε από 10 δοκιμαστές, οι οποίοι ζητήθηκαν να βαθμολογίσουν τα λευκά τυριά άλμης σε κλίμακα από το 0 εώς στο 10 (0 μη αποδεκτό, 10 εξαιρετικό) όσον αφορά τις ιδιότητες: άρωμα και γεύση. Οι δοκιμαστές χρησιμοποιούσαν νερό για ξέπλυμα του στόματός τους μεταξύ των δειγμάτων και δεν γνώριζαν την ταυτότητα των εξεταζόμενων δειγμάτων. Τα αποτελέσματα της οργανοληπτικής αξιολόγησης παρουσιάζονται στον Πίνακα 27. Προκύπτει ότι η χρήση των ακινητοποιημένων κυττάρων L. casei στην πίσσα Πάφου στην παρασκευή τυριών τυρογάλακτος επηρέασε σημαντικά (P < 0.05) τις προτιμήσεις των δοκιμαστών. Το τυρί τυρογάλακτος με τα ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei στην πίσσα Πάφου έλαβε την υψηλότερη βαθμολογία συγκριτικά με τα τυριά τυρογάλακτος που δε 153