ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ & ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ & ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ O ρόλος των μεσεγχυματικών στρωματικών κυττάρων στην ενίσχυση της εμφύτευσης των γενετικά τροποποιημένων αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων σε πειραματικό μοντέλο μεταμόσχευσης ΕΛΕΜΗΝΙΑΔΟΥ ΕΥΡΥΔΙΚΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2013

2 ARISTOTLE UNIVERSITY OF THESSALONIKI FACULTY OF SCIENCE SCHOOL OF BIOLOGY DEPARTMENT OF GENETICS, DEVELOPMENT AND MOLECULAR BIOLOGY MASTER S DEGREE PROGRAM APPLIED GENETICS AND BIOTECHNOLOGY DIPLOMA DISSERTATION The role of mesenchymal stromal cells in enhancing the engraftment of genetically modified hematopoietic stem cells in an experimental transplantation model ELEMINIADOU EVRIDIKI THESSALONIKI

3 ΕΠΙΒΛΕΠΟΝΤΕΣ: Ευαγγελία Γιαννάκη (Αιματολόγος του Νοσοκομείου Γ.Παπανικολάου, Διευθύντρια, Affiliate Associate Professor του Πανεπιστημίου της Washington-Seattle) Μηνάς Γιάγκου (Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας Α.Π.Θ) ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: Μηνάς Γιάγκου (Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας Α.Π.Θ) Αφροδίτη Σιβροπούλου (Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τμήματος Βιολογίας Α.Π.Θ) Μηνάς Αρσενάκης (Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας Α.Π.Θ) 3

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 4

5 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ... 7 ΠΡΟΛΟΓΟΣ... 9 ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Γονιδιακή θεραπεία Φορείς γονιδιακής μεταφοράς (vectors) Τύποι ιικών φορέων α Ρετροιικοί φορείς β Λεντι-ιικοί φορείς γ Αδενοιικοί φορείς δ Αδενο-σχετιζόμενοι ιικοί φορείς Ο λεντι-ιικός φορέας prscpwpre Τρόποι γονιδιακής μεταφοράς Ex vivo γονιδιακή μεταφορά In vivo γονιδιακή μεταφορά Περιορισμοί και θέματα προς επίλυση στη γονιδιακή θεραπεία σήμερα Προπαρασκευαστικό σχήμα Μειωμένη εμφύτευση των γενετικά τροποποιημένων κυττάρων Ασφάλεια του ιικού φορέα Αιμοποιητικά στελεχιαία κύτταρα (HSCs) Γονιδιακή μεταφορά του αιμοποιητικού στελεχιαίου κυττάρου Μεσεγχυματικά στρωματικά κύτταρα (MSCs) Εφαρμογές MSCs in vivo ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Αντιδραστήρια Πειραματόζωα Απομόνωση και καλλιέργεια των MSCs Ταυτοποίηση των MSCs Συλλογή και συμπύκνωση υπερκειμένου από καλλιέργειες MSCs Παραγωγή του φορέα prscpwpre Μετασχηματισμός βακτηρίων με τα τρία πλασμίδια και απομόνωση πλασμιδιακού DNA σε μικρή κλίμακα Απομόνωση πλασμιδιακού DNA σε μεγάλη κλίμακα Πέψη του πλασμιδιακού DNA με ένζυμα περιορισμού

6 4. Διαμόλυνση της κυτταρικής σειράς 293Τ με τα πλασμίδια Τιτλοδότηση του ιικού φορέα Προσδιορισμός της απαιτούμενης ποσότητας ιικού φορέα για διαμόλυνση κυττάρων και πολλαπλότητα διαμόλυνσης Απομόνωση αιμοποιητικών κυττάρων από το μυελό των οστών Διαμόλυνση μυελού των οστών με τον GFP φορέα Αποικίες προγονικών κυττάρων (colony assays) Συγκαλλιέργεια αιμοποιητικών κυττάρων με MSCs Έλεγχος της μεταναστευτικής ικανότητας των αιμοποιητικών κυττάρων in vitro Επίδραση υπερκειμένου καλλιέργειας MSCs στη μεταναστευτική ικανότητα των αιμοποιητικών κυττάρων Επίδραση των MSCs στη μεταναστευτική ικανότητα των αιμοποιητικών κυττάρων Μεταμοσχεύσεις Μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρων και MSCs Μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρων και υπερκειμένου καλλιέργειας MSCs Μεταμόσχευση διαμολυσμένων αιμοποιητικών κυττάρων Μεταμόσχευση διαμολυσμένων αιμοποιητικών κυττάρων και MSCs Ανάλυση με κυτταρομετρία ροής Στατιστική ανάλυση ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Φαινοτυπικός χαρακτηρισμός και διαφοροποίηση των MSCs Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων πέψης του πλασμιδιακού DNA Τίτλοι ιικού φορέα In vitro αποτελέσματα Ενίσχυση της μεταναστευτικής ικανότητας, διαμολυσμένων και μη, HSCs με προσθήκη υπερκειμένου καλλιέργειας MSCs Ενίσχυση της μεταναστευτικής ικανότητας, διαμολυσμένων και μη, HSCs έπειτα από συγκαλλιέργεια με MSCs In vivo αποτελέσματα Τα διαμολυσμένα HSCs εμφανίζουν χαμηλά ποσοστά εμφύτευσης Ενίσχυση της εμφύτευσης μη επεξεργασμένων ή διαμολυσμένων HSCs με συγχορήγηση MSCs Το υπερκείμενο καλλιέργειας MSCs δεν ενισχύει την εμφύτευση των μη επεξεργασμένων HSCs ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

7 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ 7

8 Σύντμηση Πλήρης ονομασία Πλήρης Αγγλική ονομασία BM μυελός των οστών bone marrow BU βουσουλφάνη busulfan GFP πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη Green Fluorescent Protein HSCs αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα hematopoietic stem cells MOI πολλαπλότητα διαμόλυνσης myltiplicity of infection MSCs μεσεγχυματικά στρωματικά κύτταρα mesenchymal stromal cells SE τυπικό σφάλμα των μέσων όρων standard error SDF-1 εκκρινόμενος παράγοντας-1 stromal-derived factor-1 από τα στρωματικά κύτταρα Sup υπερκείμενο supernatant Txd διαμολυσμένα transduced Untxd μη διαμολυσμένα untransduced 8

9 ΠΡΟΛΟΓΟΣ 9

10 Η παρούσα μεταπτυχιακή εργασία εκπονήθηκε στο τμήμα Γονιδιακής και Κυτταρικής Θεραπείας της Αιματολογικής Κλινικής- Μονάδας Μεταμόσχευσης Μυελού των Οστών του Νοσοκομείου Γ.Παπανικολάου, κατά τη χρονική περίοδο Ιούλιος Μάιος Θα ήθελα να ευχαριστήσω αρχικά τον επιβλέποντα Καθηγητή μου κ. Μηνά Γιάγκου, Καθηγητή του τμήματος Βιολογίας του Α.Π.Θ, ο οποίος μου πρότεινε και μου έδωσε την ευκαιρία να εκπονήσω τη συγκεκριμένη εργασία. Θα ήθελα να τον ευχαριστήσω θερμά για την καθοδήγηση, επίβλεψη, υπομονή, επιμονή και τη γενικότερη συμπαράσταση που μου επέδειξε καθ όλη τη διάρκεια της εργασίας. Ένα μεγάλο ευχαριστώ οφείλω στη συνεπιβλέπουσά μου κ. Ευαγγελία Γιαννάκη, υπεύθυνη της Μονάδας Γονιδιακής & Κυτταρικής Θεραπείας, Αιματολόγο του Νοσοκομείου Γ.Παπανικολάου, Affiliate Associate Professor του Πανεπιστημίου της Washington (Seattle), για την ευκαιρία που μου έδωσε να ασχοληθώ μ ένα τόσο ενδιαφέρον θέμα. Την ευχαριστώ από καρδίας για την επιστημονική καθοδήγηση, ηθική υποστήριξη, άψογη συνεργασία και την εμπιστοσύνη που έδειξε στο πρόσωπό μου. Ευχαριστώ το Διευθυντή της Αιματολογικής κλινικής- Μονάδας Μεταμόσχευσης Μυελού των Οστών, κ.αχιλλέα Αναγνωστόπουλο για τη δυνατότητα που μου έδωσε να εκπονήσω την παρούσα εργασία σ ένα ιδεώδες εργαστηριακό περιβάλλον. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω την Κτηνίατρο του εργαστηρίου, κ.ελένη Σιώτου για τις εποικοδομητικές συμβουλές και την υποστήριξή της, τόσο σε εργαστηριακό όσο και προσωπικό επίπεδο. Ιδιαίτερες ευχαριστίες οφείλω στη διδάκτορα Αναστασία Παπαδοπούλου, στην Τεχνολόγο του εργαστηρίου Φανή Ζερβού και στους υποψήφιους διδάκτορες Γαρυφαλλιά Καρπόνη, Νικολέττα Ψαθά, Νίκο Ζώγα και Ελευθερία Τσολάκη για την αμέριστη βοήθειά τους σε όλα τα επίπεδα, την καθοδήγηση και τις συμβουλές τους, καθώς επίσης και στους Έλενα Χρυσικοπούλου, Ελένη Γούναρη, Ελένη Σγουραμάλη, Σάκη Σιαμέτη, Νατάσα Κοτζιαλάμπου, Μαρία Τσιαμίτα και Μαρία Σαμαλίδου για το ευχάριστο εργαστηριακό κλίμα που δημιούργησαν όλο αυτό το διάστημα. Τέλος, το μεγαλύτερο ευχαριστώ οφείλω στην οικογένειά μου, τους γονείς μου Ιωάννη και Μαρία και την αδερφή μου Χάρις, που με στηρίζουν σε κάθε μου προσπάθεια. 10

11 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 11

12 Η γονιδιακή θεραπεία είναι η θεραπευτική προσέγγιση με την οποία μια νόσος αντιμετωπίζεται σε γενετικό επίπεδο, καθώς πραγματοποιείται εισαγωγή γενετικού υλικού, αντίγραφο δηλαδή φυσιολογικού γονιδίου, σε πάσχοντα κύτταρα με στόχο τη διόρθωση ενός παθολογικού φαινοτύπου. Η μεταμόσχευση γενετικά διορθωμένων, αυτόλογων αιμοποιητικών στελεχιαίων κυττάρων (γονιδιακή θεραπεία) θα μπορούσε να προσδώσει σημαντικό θεραπευτικό όφελος / ίαση, σε ασθενείς με αιμοσφαιρινοπάθειες, όπως η θαλασσαιμία, με θεωρητικά λιγότερες επιπλοκές σε σχέση με την αλλογενή μεταμόσχευση, που αποτελεί την καθιερωμένη μόνη ριζική θεραπεία για τη νόσο. Απαραίτητη προϋπόθεση της γενετικής τροποποίησης των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων (HSCs) με λεντι-ιικούς φορείς είναι η ex vivo ενεργοποίησή τους σε καλλιέργεια παρουσία διαφόρων κυτοκινών. Η ενεργοποίηση αυτή τροποποιεί την έκφραση διαφόρων μορίων προσκόλλησης (CAMs), θέτει τα κύτταρα σε κυτταρικό κύκλο και αυξάνει την τάση των κυττάρων για απόπτωση, με αποτέλεσμα να παρατηρείται μειωμένη ικανότητα εγκατάστασης στο μυελό των οστών (homing) και κατ επέκταση εμφύτευσης στο δέκτη, έπειτα από μεταμόσχευση των γενετικά διορθωμένων HSCs. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση του ρόλου των μεσεγχυματικών στρωματικών κυττάρων στην προαγωγή της εμφύτευσης γενετικά τροποποιημένων HSCs με λεντιιικό φορέα αναφοράς egfp, σε πειραματικό μοντέλο μεταμόσχευσης. Τα MSCs φαίνεται να αποτελούν μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική, ως κύτταρα υποστηρικτικά της εμφύτευσης αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων, καθώς η συγχορήγησή τους με HSCs σε αλλογενείς μεταμοσχεύσεις κλινικού επιπέδου οδήγησε σε υψηλότερα ποσοστά εμφύτευσης. Ωστόσο, ο ρόλος των MSCs στην προαγωγή της εμφύτευσης και των γενετικά τροποποιημένων HSCs δεν έχει διερευνηθεί μέχρι σήμερα και εάν αυτό επιβεβαιωθεί αναμένεται να βελτιώσει σημαντικά την έκβαση της γονιδιακής θεραπείας για τα γενετικά νοσήματα. Επειδή όχι μόνο η κυτταρική επαφή (MSCs- HSCs) μπορεί να επηρεάζει τις ιδιότητες των γενετικά τροποποιημένων κυττάρων αλλά και οι εκκρινόμενοι από τα MSCs διαλυτοί παράγοντες, διερευνήθηκε επιπλέον η συμβολή τους στην προαγωγή της εγκατάστασης/εμφύτευσης των γενετικά τροποποιημένων HSCs. Στα in vitro πειράματα, η συγκαλλιέργεια μη επεξεργασμένων HSCs-MSCs οδήγησε σε σημαντική αύξηση της μεταναστευτικής ικανότητας των HSCs, σε σχέση με αυτή των κυττάρων που δε συγκαλλιεργήθηκαν με MSCs. Αντίθετα, στην περίπτωση των HSCs που ενεργοποιήθηκαν σε στρώμα MSCs πριν τη διαμόλυνση, η μετανάστευση μειώθηκε κατά το ήμισυ, σε σχέση με τα HSCs που καλλιεργήθηκαν με το συμβατικό τρόπο, πιθανότατα για τεχνικούς λόγους. Παρά το γεγονός ότι δε διαπιστώθηκε αύξηση της συνολικής μεταναστευτικής ικανότητας των HSCs που 12

13 ενεργοποιήθηκαν σε στρώμα MSCs πριν τη διαμόλυνση, είναι ενδιαφέρον το γεγονός ότι η πλειονότητα των HSCs που καλλιεργήθηκαν με αυτόν τον τρόπο και μετανάστευσαν προς τον SDF-1 ήταν διαμολυσμένα και με υψηλό ποσοστό έκφρασης της GFP πρωτεΐνης. Διαπιστώθηκε επίσης πως η διαδικασία της ενεργοποίησης των HSCs σε καλλιέργεια, αυξάνει σημαντικά τη μεταναστευτική τους ικανότητα προς τον παράγοντα SDF-1, σε σχέση με αυτή των κυττάρων του μη επεξεργασμένου μυελού. Ωστόσο, in vivo, η αυξημένη μεταναστευτική ικανότητα δεν μεταφράστηκε και σε αυξημένη ικανότητα εμφύτευσης, επιβεβαιώνοντας την προβληματική εμφύτευση των HSCs που καλλιεργούνται έστω και βραχυχρόνια. Στην παρούσα εργασία, αναδείχτηκε για πρώτη φορά η θετική συμβολή των εκκρινόμενων διαλυτών παραγόντων από τα MSCs στη μετανάστευση των HSCs in vitro, καθώς παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση της μεταναστευτικής ικανότητας των μη επεξεργασμένων αλλά και διαμολυσμένων HSCs, σε σχέση με αυτή των HSCs απουσία υπερκειμένου. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει πως οι διαλυτοί εκκρινόμενοι παράγοντες από τα MSCs δημιουργούν ένα κατάλληλο μικροπεριβάλλον, το οποίο ωθεί τα HSCs προς μετανάστευση προς τον παράγοντα SDF-1. Αντίθετα όμως με ότι παρατηρήσαμε με τη συγκαλλιέργεια HSCs MSCs, το υπερκείμενο καλλιέργειας MSCs ενίσχυσε μεν τη συνολική μετανάστευση των HSCs αλλά επηρέασε αρνητικά τη μεταναστευτική ικανότητα των διαμολυσμένων κυττάρων. Στα in vivo πειράματα, κατά τη συγχορήγηση μη επεξεργασμένων HSCs και MSCs αναδείχτηκε ο υποστηρικτικός ρόλος των MSCs, τόσο στη βραχυπρόσθεσμη όσο και στη μακροπρόθεσμη εμφύτευση των αιμοποιητικών stem cells. Επιπρόσθετα, φάνηκε πως τα MSCs ενισχύουν, τουλάχιστον τη βραχυπρόθεσμη εμφύτευση των γενετικά τροποποιημένων HSCs, καθώς στην ομάδα που έλαβε συνδυασμό γενετικά τροποποιημένων HSCs-MSCs παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση της εμφύτευσης, σε σχέση με την ομάδα που έλαβε μόνο διαμολυσμένα HSCs. Αντίθετα, στην περίπτωση της in vivo συγχορήγησης συμπυκνωμένου υπερκειμένου καλλιέργειας MSCs με μη γενετικά τροποποιημένα HSCs, δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στην ικανότητα εμφύτευσης των κυττάρων, πιθανό λόγω της έντασης του προπαρασκευαστικού σχήματος. Συνολικά, τα δεδομένα μας προτείνουν ότι τα MSCs προσδίδουν ένα πλεονέκτημα εγκατάστασης/εμφύτευσης στα γενετικά τροποποιημένα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα μετά από μεταμόσχευση. Αυτό θα επαληθευτεί στη συνέχεια με μεγαλύτερο αριθμό πειραμάτων και μετά από δευτερογενείς μεταμοσχεύσεις που θα καταδείξουν οριστικά εάν τα MSCs βελτιώνουν σημαντικά τη μακροπρόθεσμη εμφύτευση των γενετικά τροποποιημένων HSCs. 13

14 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 14

15 1. Γονιδιακή Θεραπεία Η γονιδιακή θεραπεία είναι η θεραπευτική προσέγγιση με την οποία μια νόσος αντιμετωπίζεται σε γενετικό επίπεδο. Με τη γονιδιακή θεραπεία πραγματοποιείται εισαγωγή γενετικού υλικού, δηλαδή αντίγραφο φυσιολογικού γονιδίου, σε πάσχοντα κύτταρα με στόχο τη διόρθωση ενός παθολογικού φαινοτύπου που προκαλεί μια μετάλλαξη. Η εισαγωγή αυτή πραγματοποιείται μέσω ενός φορέα-οχήματος (vector), ο οποίος φέρει το επιθυμητό γονίδιο (διαγονίδιο/ transgene) και εισέρχεται στα κύτταρα-στόχος του ασθενούς μέσω μιας διαδικασίας που ονομάζεται διαμόλυνση. Είναι λοιπόν, μια στρατηγική που στοχεύει στην οριστική διόρθωση της υποκείμενης αιτίας νόσου, διαφοροποιούμενη σημαντικά από τις συμβατικές θεραπευτικές μεθόδους που αντιμετωπίζουν κατά κύριο λόγο την παθοφυσιολογία ή τα συμπτώματα της νόσου. Πρώτος ο Friedmann (1976) υποστήριξε πως για την ίαση της ασθένειας αρκεί η αποκατάσταση του γονιδίου και προχώρησε στην πρώτη ουσιαστικά προσπάθεια γονιδιακής θεραπείας. Πιο συγκεκριμένα, ιικός φορέας (shope papillomavirus) που έφερε το γονίδιο της αργινάσης χορηγήθηκε σε τρεις ασθενείς με υψηλά επίπεδα αργινίνης στο αίμα. Παρά τα επιτυχή πειράματα σε πειραματικά μοντέλα, οι ασθενείς δεν κατάφεραν να μειώσουν τα επίπεδα αργινίνης στον ορό του αίματός τους, γεγονός που αποδόθηκε σε αδυναμία του συγκεκριμένου ιικού φορέα. Η πρώτη κλινική εφαρμογή γονιδιακής θεραπείας στον άνθρωπο πραγματοποιήθηκε το 1991, όταν δύο παιδιά που έπασχαν από σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια λόγω έλλειψης της απαμινάσης της αδενοσίνης (Adenoside deaminase severe combined immunodeficiency, ADA- SCID) υποβλήθηκαν σε αυτόλογη μεταμόσχευση γενετικώς τροποποιημένων CD34+ κυττάρων με ρετροιικούς φορείς που έφεραν το γονίδιο της απαμινάσης της αδενοσίνης (Blaese et al., 1993). To 2000 άρχισε στη Γαλλία μια άλλη κλινική έρευνα σε παιδιά που έπασχαν από SCID-X1. Η νόσος αυτή οφείλεται σε έλλειψη του γονιδίου της γc υπομονάδας του υποδοχέα των κυτταροκινών που έχει ως συνέπεια τη μη ομαλή διαφοροποίηση και ωρίμανση των Τ-λεμφοκυττάρων και ΝΚ κυττάρων. Η διόρθωση του γονιδίου έγινε με τη χρήση του ρετροιού MLV (Moloney leukemia virus) (Cavazzana-Calvo et al., 2000). Λίγο αργότερα μια αγγλική ομάδα επιστημόνων χρησιμοποίησε την ίδια μεθοδολογία για τη γονιδιακή θεραπεία 10 ασθενών με SCID-X1 (Howe et al., 2008). Από τα διάφορα κύτταρα-στόχος για γονιδιακή μεταφορά, τα στελεχιαία ή αρχέγονα κύτταρα (stem cells) είναι μοναδικά για την ικανότητά τους να αναγεννούν ιστούς και να αποδίδουν μακροχρόνια θεραπευτικά οφέλη. Τα αιμοποιητικά στελεχιαία κύτταρα (hematopoietic stem cells HSCs) είναι τα καλύτερα μελετημένα στελεχιαία κύτταρα ενήλικων ιστών και η δυνατότητα της εφαρμογής γονιδιακής μεταφοράς για μονογονιαδιακές διαταραχές που επιδρούν στην παραγωγή ή 15

16 τη λειτουργία του αίματος (όπως η β-θαλασσαιμία) μελετάται από εικοσαετίας. Καθώς τα γονίδια του ανθρώπου κλωνοποιήθηκαν και αναπτύχθηκαν οι μέθοδοι γονιδιακής μεταφοράς, γεννήθηκε η ιδέα της εισαγωγής ενός φυσιολογικού αντιγράφου ανθρώπινου γονιδίου σε αυτόλογα HSCs ασθενών, ως εναλλακτική προσέγγιση στην αλλογενή μεταμόσχευση μυελού των οστών. Η έκφραση του φυσιολογικού γονιδιακού προϊόντος στον αντίστοιχο τύπο αιματικού κυττάρου (π.χ Τ και Β λεμφοκύτταρα στις ανοσοανεπάρκειες, στελεχιαία κύτταρα στην αναιμία Fanconi, ερυθροκύτταρα στις αιμοσφαιρινοπάθειες) θα μπορούσε να αντισταθμίσει το γενετικό έλλειμμα. Αυτή η γενική αρχή είναι εφαρμόσιμη σε έναν αριθμό συγγενών και επίκτητων διαταραχών. Τα νοσήματα-στόχος της γονιδιακής θεραπείας ουσιαστικά καλύπτουν ολόκληρο το φάσμα της ανθρώπινης νόσου: από σύνθετες γενετικές διαταραχές, όπως ο καρκίνος, η αθηροσκλήρωση και ο σακχαρώδης διαβήτης μέχρι νευροεκφυλιστικές παθήσεις, όπως η νόσος Parkinson και Alzheimer ή/και οι λοιμώδεις παθήσεις, όπως το AIDS (Εικ.1). Η θεραπευτική προσέγγιση, ακόμη και όταν δεν υπάρχει γενετικό υπόστρωμα μπορεί να γίνει στο γενετικό επίπεδο εφόσον υπάρχουν γονίδιαστόχοι, η τροποποιημένη έκφραση των οποίων μπορεί να επηρεάσει τον κλινικό φαινότυπο. Κλινικές μελέτες γονιδιακής θεραπείας Καρκίνος 64,3% (n=1223) Μονογονιδιακά νοσήματα 8,8% (n=1667) Καρδιοαγγειακές παθήσεις 8,3% (n=158) Λοιμώδεις ασθένειες 8% (n=153) Νευρολογικές παθήσεις 1,9% (n=36) Οφθαλμολογικές παθήσεις 1,5% (n=28) Φλεγμονώδεις ασθένειες 1,5% (n=13) Άλλες ασθένειες 1,4% (n=27) Γονίδια σήμανσης 2,6% (n=50) Υγιείς εθελοντές 2,5% (n=42) Εικόνα 1: Κλινικές μελέτες γονιδιακής θεραπείας για το έτος 2013 ανά ασθένεια. Το μεγαλύτερο ποσοστό αυτών (64,3%) αφορούν στον καρκίνο και ακολουθούν τα μονογονιδιακά νοσήματα (8.8%) (The Journal of Gene Medicine). 16

17 1.1 Φορείς γονιδιακής μεταφοράς (vectors) Η γονιδιακή μεταφορά στα κύτταρα-στόχος επιτελείται μέσω φορέων ή οχημάτων (vectors). Οι φορείς αυτοί θα πρέπει να εξασφαλίζουν: την επιτυχή μεταφορά του διαγονιδίου στον πυρήνα του κυττάρου-στόχο την προστασία του διαγονιδίου από αποδόμηση την έκφραση του διαγονιδίου στα κύτταρα-στόχος αλλά και στα θυγατρικά τους. Πέρα από τις απαραίτητες προαναφερθείσες συνθήκες, ο ιδανικός φορέας χρειάζεται να έχει υψηλή απόδοση διαμόλυνσης, συνεχή και σταθερή έκφραση του διαγονιδίου, ιστοειδικότητα, να μη δημιουργεί επιπλοκές (π.χ. μεταλλαξιγένεση), να έχει τη δυνατότητα ένθεσης μεγάλου μεγέθους διαγονιδίου, να μπορεί να διαμολύνει τόσο διαιρούμενα όσο και μη κύτταρα και να μπορεί να παραχθεί σε μεγάλη κλίμακα με χαμηλό κόστος (E.Papapetrou et al. 2005). Για τη μεταφορά του διαγονιδίου στα κύτταρα-στόχος έχουν αναπτυχθεί ιικά συστήματα γονιδιακής μεταφοράς καθώς και μη ιικά. Στα ιικά συστήματα γονιδιακής μεταφοράς, ενσωματώνεται με μοριακές τεχνικές ένα φυσιολογικό γονιδίο στο γονιδίωμα των ιών και στη συνέχεια μεταφέρουν το γενετικό τους υλικό στα κύτταρα-στόχος, κάνοντας χρήση των φυσικών μηχανισμών του ξενιστή για να πολλαπλασιαστούν. Οι ιοί-φορείς, προηγουμένως τροποποιούνται γενετικά ώστε να απενεργοποιηθούν, να καταστούν δηλαδή μη λοιμογόνοι ώστε να μην πολλαπλασιάζονται ανεξέλεγκτα όταν εισέλθουν στα κύτταρα. Διάφοροι τύποι ιικών φορέων χρησιμοποιούνται σήμερα σε ερευνητικό και κλινικό επίπεδο (Εικ.2) και βασίζονται κυρίως σε ρετροιούς (retroviruses), λεντι-ιιούς (lentiviruses), αδενοιούς (adenoviruses), αδενο-σχετιζόμενους (adeno-associated) και αφρώδεις (foamy) ιούς. Στα μη ιικά συστήματα, η γονιδιακή μεταφορά επιτυγχάνεται από μη ιικούς φορείς, όπως λιποσώματα, γυμνό (naked) DNA, ανθρώπινα τεχνητά χρωμοσώματα (HAC) και τρανσποζόνια. Το μειονέκτημα των φορέων αυτών είναι ότι δεν εξασφαλίζουν μόνιμη και σταθερή έκφραση του γονιδίου που μεταφέρουν και ως εκ τούτου δεν είναι κατάλληλοι για τη θεραπεία γενετικών νοσημάτων τα οποία απαιτούν μακροχρόνια έκφραση του θεραπευτικού γονιδίου (E.Papapetrou et al. 2005). 17

18 Φορείς που χρησιμοποιούνται στις κλινικές μελέτες Αδενοιοί 23,2% (n=453) Ρετροιοί 19,4% (n=378) Γυμνό/πλασμιδιακό DNA 18% (n=351) Ιός δαμαλίτιδας 7,8% (n=152) Λιποσώματα 5,7% (n=112) Αδενο-συσχετιζόμενοι 5,1% (n=99) Ιός ευλογιάς 4,9% (n=95) Λεντι-ιοί 3,2% (n=62) Ερπητοιοί 3,1% (n=60) Άλλες κατηγορίες 6,3% (n=123) Άγνωστοι 3,3% (n=64) Εικόνα 2: Φορείς γονιδιακής θεραπείας που χρησιμοποιούνται σε κλινικές μελέτες κατά το έτος Στην πλειονότητα των κλινικών μελετών (23,2%) χρησιμοποιούνται οι αδενοιοί και ακολουθούν οι ρετροιοί (19,4%) (The Journal of Gene Therapy). 1.2 Τύποι ιικών φορέων 1.2.α Ρετροιικοί φορείς Οι ρετροιοί έχουν 2 αντίγραφα RNA τα οποία περιβάλλονται από πρωτεϊνικής σύστασης κάψα και εξωτερικά φέρουν ένα λιπιδιοπρωτεϊνικό έλυτρο, τον ιικό φάκελο (envelope). Το γονιδίωμα των ιών φέρει τρία γονίδια, τα προϊόντα των οποίων είναι απαραίτητα για τον ιικό αναδιαπλασιασμό και το πακετάρισμα του ιού. Το γονίδιο pol κωδικοποιεί πρωτεΐνες (αντίστροφη μεταγραφάση, ιντεγκράση, πρωτεϊνάση) που σχετίζονται με τον ιικό πολλαπλασιασμό, το γονίδιο gag κωδικοποιεί πρωτεΐνες της ιϊκής κάψας και το γονίδιο env κωδικοποιεί τις γλυκοπρωτεΐνες του φακέλου. Οι τελευταίες είναι αυτές που καθορίζουν τον τροπισμό του ιού, καθώς μέσω αυτών συνδέεται το ιϊκό σωμάτιο με τους υποδοχείς του κυττάρου. Οι ρυθμιστικές αλληλουχίες του ιού βρίσκονται στις LTR (Long Terminal Repeats) περιοχές, που βρίσκονται εκατέρωθεν των παραπάνω γονιδίων. Επιπλέον, μεταξύ της 5 -LTR και του γονιδίου gag υπάρχει η αλληλουχία ψ, η οποία αποτελεί το σήμα πακεταρίσματος του ιού (Εικ.3A). 18

19 Ο κύκλος ζωής ενός ρετροιού συνοψίζεται στα εξής στάδια: 1) είσοδος στα κύτταρα του ξενιστή, 2) αντίστροφη μεταγραφή του RNA σε δίκλωνο DNA, 3) ενσωμάτωση στο γονιδίωμα του ξενιστή ως προιός (provirus), 4) μεταγραφή του προιού και παραγωγή νέων αντιγράφων ιικού RNA που κωδικοποιούν για τις πρωτεΐνες του καψιδίου και του φακέλου και 5) εξαγωγή των ιικών σωματίων από το κύτταρο ξενιστή (Εικ.3B). γονιδίωμα ρετροιού μόλυνση αντίστροφη μεταγραφή ενσωμάτωση προιός μεταγραφή μετάφραση Κύτταροξενιστή Συναρμολόγηση ιικού σωματίου έξοδος από το κύτταρο Εικόνα 3: Ρετροιός. Α. Οργάνωση του ρετροιικού γονιδιώματος, Β. Στάδια του κύκλου ζωής του ρετροιού (Molecular therapies, 2011). Οι ρετροιικοί φορείς ήταν από τους πρώτους που χρησιμοποιήθηκαν σε πετυχημένα πειράματα γονιδιακής θεραπείας για την αντιμετώπιση κληρονομικών παθήσεων και του καρκίνου. Ο συνηθέστερος τύπος ρετροιικού φορέα είναι ο βασιζόμενος στον ιό της λευχαιμίας των ποντικών Moloney (Moloney murine leukemia virus, MLV), καθώς διακρίνεται για τροπισμό κυττάρων ευρέους φάσματος, μπορεί να παρασκευαστεί σε σχετικά υψηλούς τίτλους ( ιικά σωμάτια/ ml) και μπορεί να εξασφαλίσει θεωρητικά μακροχρόνια έκφραση του διαγονιδίου, καθώς ενσωματώνεται στο χρωμοσωμικό DNA του κυττάρου-ξενιστή. Οι φορείς αυτοί είναι ανίκανοι για αναδιπλασιασμό (replication defective) (Coffin J, 2000) καθώς κατασκευάζονται με απομάκρυνση των γονιδίων gag, pol και env και στη θέση τους εισάγεται το επιθυμητό γονίδιο (περίπου 8 kb), ενώ διατηρούν τις LTRs περιοχές και το σήμα πακεταρίσματος ψ. Για την παραγωγή των φορέων χρησιμοποιούνται ειδικές κυτταρικές σειρές 19

20 (producers cell lines), οι οποίες φέρουν στο γονιδίωμά τους τα ρετροιικά γονίδια gag, pol και env, παρέχοντας τις απαραίτητες ιικές δομικές πρωτεΐνες για το πακετάρισμα. Πραγματοποιείται διαμόλυνση των σειρών αυτών με το φορέα, ο οποίος πακετάρεται σε ιικό σωμάτιο και εξέρχεται από το κύτταρο (Εικ.4). Επομένως, ο φορέας έχει στο ιικό σωμάτιο μόνο τα προϊόντα των παραπάνω γονιδίων, εξασφαλίζοντας ότι δε θα πολλαπλασιαστεί και δε θα καταστρέψει τα κύτταρα-στόχος (Heilbronn & Weger 2010). αντικατάσταση ιικών γονιδίων με το επιθυμητό αγρίου τύπου ρετροιός έκφραση ιικών πρωτεϊνών από την κυτταρική σειρά παραγωγής παροδική διαμόλυνση ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη γονιδίωμα DNA προιού ιικό RNA φορέα RNA προιού κυτταρική σειρά παραγωγής Εικόνα 4: Παραγωγή ρετροιικών φορέων. Α: Δομή ρετροιού, Β: Κατασκευή ρετροιικού φορέα, C: Διαμόλυνση κυτταρικής σειράς παραγωγής με τον φορέα, D: Παραγωγή φορέα και διαμόλυνση κυττάρωνστόχων (Lentiviral vector systems for gene transfer, Landes Bioscience, 2003). Για την είσοδο των ρετροιικών φορέων στον πυρήνα των κυττάρων απαιτείται η διάσπαση της κυτταρικής μεμβράνης, γεγονός που τους περιορίζει στη διαμόλυνση μόνο ενεργώς διαιρούμενων κυττάρων. Επομένως, διευκολύνεται η γονιδιακή μεταφορά σε καρκινικά κύτταρα που διαιρούνται έντονα, αλλά περιορίζεται σημαντικά η χρήση τους στη διαμόλυνση νευρώνων, ηπατοκυττάρων, μυικών ινών, λεμφοκυττάρων και προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων. Παρόλο που οι πρώτες κλινικές δοκιμές με τη χρήση των ρετροιικών φορέων δεν απέδωσαν θεραπευτικά αποτελέσματα, τα τελευταία χρόνια οι βελτιστοποιημένες συνθήκες της ex vivo διαμόλυνσης και η in vivo επιλογή των διαμολυσμένων κυττάρων, οδήγησαν σε εντυπωσιακά κλινικά αποτελέσματα στην περίπτωση της νόσου του μοσχεύματος κατά του ξενιστή (graft versus 20

21 host disease, GvHD) μετά από αλλογενή μεταμόσχευση (Bonini C. et al., 1997) και της σοβαρής συνδυασμένης ανοσοανεπάρκειας (X-SCID) (Cavazzana-Calvo et al., 2000/ Aiuti A et al., 2002). 1.2.β Λεντι-ιικοί φορείς Οι λεντι-ιοί ανήκουν επίσης στην κατηγορία των ρετροιών αλλά, σε αντίθεση με τους αυτούς, έχουν την ικανότητα να διαμολύνουν και μη διαιρούμενα κύτταρα. Οι HIV-1 (Human immunodeficiency virus-1), SIV (simian immunodeficiency virus) και EIAV (equine infectious anemia virus) αποτελούν παραδείγματα των ιών αυτών. Το γονιδίωμά τους είναι πιο σύνθετο από τους ρετροιούς, καθώς κωδικοποιούν παραπάνω πρωτεΐνες. Πιο συγκεκριμένα, ο HIV παράγει δύο επιπλέον ρυθμιστικές πρωτεΐνες, τις Tat, Rev και τέσσερις βοηθητικές, τις Nef, Vif,Vpr,Vpu. Οι λεντι-ιικοί φορείς που παράγονται για γονιδιακή μεταφορά βασίζονται στον ιό HIV-1. Οι φορείς αυτοί πλεονεκτούν έναντι των ρετρο-ιικών φορέων καθώς, εκτός του ότι έχουν την ικανότητα να διαμολύνουν και κύτταρα που βρίσκονται σε φάση G 0, μπορούν να εσωκλείουν μεγαλύτερα διαγονίδια (~10 kb) και τείνουν να ενσωματώνονται λιγότερο κοντά σε περιοχές πρωτο-ογκογονιδίων. Το γεγονός αυτό συνεπάγεται και μικρότερη πιθανότητα μεταλλαξιγένεσης. Ενώ οι φορείς της πρώτης γενιάς έφεραν όλες τις παραπάνω πρωτεΐνες, πλέον οι νεότερες γενιές αποτελούν ακρωτηριασμένες μορφές μη λοιμογόνων λεντι-ιών σε ελαχιστοποιημένες (minimal) κατασκευές που μεταφέρουν τη μικρότερη δυνατή ιική πληροφορία, ώστε να αυξηθεί η βιολογική τους ασφάλεια (Dull et al, 1998). Επιπρόσθετα, για την αποφυγή φαινομένων μεταλλαξιγένεσης λόγω ένθεσης (insertional mutagenesis) καθώς και ενεργοποίησης και ανασυνδυασμού του ιικού φορέα, οι λεντι-ιικοί φορείς κατασκευάζονται ως αυτο-αδρανοποιούμενοι (Self-inactivating, SIN). Στους φορείς αυτούς γίνεται απαλοιφή της καθοδικής LTR περιοχής, που κατά τη διαμόλυνση του κυττάρου οδηγεί σε μεταγραφική αδρανοποίηση της ανοδικής LTR (Zufferey et al, 1998/ Miyoshi et al,1998) και προστίθεται ένας ετερόλογος υποκινητής ακριβώς πριν από το διαγονίδιο. Με τον τρόπο αυτό απομακρύνονται από τον ιικό φορέα οι ρυθμιστικές αλληλουχίες του ιού (ενισχυτής και υποκινητής), ελαττώνοντας σημαντικά τα φαινόμενα επανα-ενεργοποίησης του ιού και μεταλλαξιγένεσης και το διαγονίδιο εκφράζεται μόνο μέσω του υποκινητή του και ιστοειδικά. Τα τελευταία χρόνια έχει δειχτεί ότι οι λεντι-ιικοί φορείς διαμολύνουν αποτελεσματικά νευρώνες, κύτταρα γλοίας του κεντρικού νευρικού συστήματος αλλά και αιμοποιητικά στελεχιαία κύτταρα επιτυγχάνοντας υψηλά ποσοστά διαμόλυνσης και μακροχρόνια έκφραση του διαγονιδίου. Πιο συγκεκριμένα, έδωσαν εντυπωσιακά προ-κλινικά αποτελέσματα γονιδιακής μεταφοράς και έκφρασης στα HSCs, κάτι που για δεκαετίες αποτελούσε έναν άπιαστο στόχο με τη χρήση 21

22 ρετροιικών φορέων. Η ανακοίνωση της διόρθωσης του θαλασσαιμικού φαινοτύπου σε ζωικό μοντέλο (May et al,2000) με χρήση λεντι-ιικών φορέων σφαιρίνης και αρκετές που ακολούθησαν (Emery et al, 2002/ Puthenveetil et al, 2004) άνοιξαν το δρόμο για την έναρξη κλινικών δοκιμών γονιδιακής θεραπείας για τα μεσογειακά σύνδρομα. 1.2.γ Αδενοιικοί φορείς Υπάρχουν πάνω από 50 διαφορετικοί ορότυποι αδενοιών του ανθρώπου και οι τρέχοντες αδενοιικοί φορείς προέρχονται κυρίως από τους ορότυπους 2 και 5, στους οποίους οι περισσότεροι ενήλικες έχουν εκτεθεί. Για την αποφυγή δυνητικών προβλημάτων εξαιτίας προϋπάρχουσας ανοσίας, που μπορεί να αποκλείει ή να ελαττώνει την αποτελεσματικότητα της χορήγησης αυτών των φορέων, γίνεται προσπάθεια να χρησιμοποιηθούν και άλλοι ορότυποι ή ακόμα και μη ανθρώπινοι αδενοιοί (Loser P et al, 1999). Οι αδενοιικοί φορείς μπορούν να παρασκευαστούν σε πολύ υψηλούς τίτλους (10 10 ιικά σωμάτια/ ml), να φιλοξενήσουν μεγάλα ενθέματα DNA, να επιτύχουν παροδικά υψηλή έκφραση του διαγονιδίου και, σε αντίθεση με τους ρετροιικούς φορείς, να διαμολύνουν μη διαιρούμενα κύτταρα. Ωστόσο, καθώς δεν ενσωματώνονται στο γονιδίωμα του κυττάρου και παραμένουν ως επισώματα, δε μπορούν να εξασφαλίσουν τη μακροχρόνια έκφραση του μεταφερόμενου γονιδίου. Επιπρόσθετα, έχουν ενοχοποιηθεί για σημαντική ανοσογονικότητα και για το λόγο αυτό οι νεότερες γενιές αδενοιικών φορέων έχουν σχεδιαστεί με απαλείψεις ή μεταλλάξεις γονιδίων στη δομή τους, με στόχο να ελαττωθούν οι ανοσολογικές αντιδράσεις. Πρόσφατα, αδενοιικοί φορείς επιλέγησαν για κλινικές έρευνες γονιδιακής θεραπείας του καρκίνου, λόγω της αποτελεσματικής γονιδιακής μεταφοράς που εξασφαλίζουν και γιατί δυνητικά η κυτταρική τοξικότητα και ανοσογονικότητα που προκαλούν ενισχύει ενδεχομένως τη δράση έναντι του όγκου (Heise C & Kirn DH, 2000). Δυστυχώς, η αποτελεσματικότητα των μη αναδιπλασιαζόμενων πρώτης γενιάς αδενοιικών φορέων ήταν χαμηλή και τα αποτελέσματα από κλινικές μελέτες απογοητευτικά. Για να βελτιωθεί η διείσδυση εντός του όγκου και η τοπική ενίσχυση της δράσης κατά του όγκου, κατασκευάστηκαν επιλεκτικά ογκολυτικοί ή υπό όρους αναδιπλασιαζόμενοι φορείς (conditionaly replicating adenoviruses-crad). Έτσι, διαμόλυνση κυττάρων όγκου με τους CRAd οδηγεί σε αναδιπλασιασμό εντός του όγκου, ογκόλυση και απελευθέρωση ιικών απογόνων. Ο φυσιολογικός ιστός διαφυλάσσεται εξαιτίας της έλλειψης ικανότητας αναδιπλασιασμού (Derek Ko et al, 2005). 22

23 1.2.δ Αδενο-σχετιζόμενοι ιικοί φορείς Οι αδενο-σχετιζόμενοι ιικοί φορείς (Adeno-associated virus vectors, AVV-based vectors) προέρχονται από ανθρώπινους Parvo-ιούς, φέρουν μονάχα ιϊκό καψίδιο και το γονιδίωμά τους αποτελείται από μονόκλωνο DNA. Οι ιοί αυτοί για να επιτύχουν παραγωγική λοίμωξη απαιτούν την παρουσία βοηθητικού ιού (helper virus), όπως οι αδενοϊοί ή ερπητοϊοί. Κάποιοι αδενοσχετιζόμενοι ιοί μπορούν να παραμένουν σε επισωματική κατάσταση (αδενο-σχετιζόμενοι ορότυπου 2 AAV2), ενώ κάποιοι άλλοι ενσωματώνονται στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Δεν υπάρχει γνωστή νόσος που να σχετίζεται με τους AAV φορείς, γεγονός που τους καθιστά ιδανικούς για γονιδιακή θεραπεία. Διαμολύνουν μεγάλο εύρος κυττάρων, καθώς και μη διαιρούμενα κύτταρα και δεν προκαλούν ανοσολογικές αντιδράσεις. Το σημαντικότερο μειονέκτημά τους είναι η περιορισμένη ικανότητα ένθεσης, καθώς μπορούν να εσωκλείσουν γονίδια < 5 kb. Οι ανασυνδυασμένοι AVV φορείς χάνουν την ικανότητα για ενσωμάτωση σε συγκεκριμένη θέση στο γονιδίωμα και παραμένουν κυρίως ως επισώματα. Έχουν χρησιμοποιηθεί με επιτυχία σε διαφορετικά ζωικά μοντέλα κληρονομικών και επίκτητων παθήσεων και κλινικές έρευνες για την θεραπεία της κυστικής ίνωσης,της αιμοφιλίας και της μυικής δυστροφίας είναι σε εξέλιξη ή έχουν ολοκληρωθεί (Moss RB et al, 2004/ Romero NB, 2004). 1.3 Ο λεντι-ιικός φορέας prscpgwpre Ο φορέας prscpgwpre (GFP-φορέας) είναι ένας SIN λεντι-ιικός φορέας αναφοράς που φέρει το γονίδιο gfp (enhanced Green Fluorescent Protein, egfp). Για τη συναρμολόγηση του ιικού φορέα χρησιμοποιείται το σύστημα τριών πλασμιδίων (three plasmid expression system), το οποίο περιλαμβάνει το πλασμίδιο που φέρει το gfp γονίδιο (ιικός φορέας) και δύο βοηθητικά πλασμίδια, τα pml3 και pmd2.g (Εικ.5). Το pml3 περιέχει τα γονίδια gag και pol, που όπως αναφέρθηκε παραπάνω, κωδικοποιούν αντίστοιχα πρωτεΐνες της ιικής κάψας και πρωτεΐνες απαραίτητες για τον ιικό πολλαπλασιασμό. Επίσης, περιέχονται τα γονίδια tat και rev, τα προϊόντα των οποίων προάγουν τη μεταγραφή του ιικού RNA (Jones and Peterlin, 1994). Το pmd2.g φέρει το γονίδιο env που κωδικοποιεί για τις γλυκοπρωτεΐνες του ιικού φακέλου. Καθώς οι λεντι-ιικοί φορείς βασίζονται στον HIV-1, μπορούν να διαμολύνουν συγκεκριμένους μόνο κυτταρικούς τύπους (CD4+ κύτταρα). Για να αυξηθεί η διαμολυσματική ικανότητα του φορέα (φαινόμενο τροπισμού), το γονίδιο env προέρχεται από τον ιό της στοματίτιδας (VSV-G), ο οποίος εκφράζει έναν ιικό φάκελο με ευρεία ικανότητα πρόσδεσης σε κύτταρα-ξενιστές (τεχνική 23

24 pseudotyping) (Amado and Chen, 1999). Η έκφραση των γονιδίων gag, pol, rev, tat και env βρίσκονται υπό τον έλεγχο του υποκινητή του μεγαλοκυτταροϊού (Cytomegalovirus, CMV). Από τα τρία πλασμίδια, το μόνο που περιέχει το ιικό μήνυμα πακεταρίσματος ψ είναι αυτό του ιικού φορέα. Έτσι, η μόνη πληροφορία που πακετάρεται στο ιικό σωμάτιο είναι αυτή του φορέα, ενώ τα βοηθητικά πλασμίδια περιέχουν απλώς τις πληροφορίες που θα βοηθήσουν το φορέα να πακεταριστεί. Εικόνα 5: Το σύστημα τριών πλασμιδίων. Επιπλέον, κάθε πλασμίδιο φέρει το γονίδιο που προσδίδει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό αμπικιλλίνη, καθώς και θέσεις κοπής από ένζυμα περιορισμού (Εικ.6). 24

25 Εικόνα 6: Χάρτες των πλασμιδίων prscpgwpre, pml3 και pmd2.g. 1.4 Τρόποι γονιδιακής μεταφοράς Ex vivo γονιδιακή μεταφορά Τα κύτταρα-στόχοι αφαιρούνται από τον ασθενή και καλλιεργούνται μαζί με τον ιικό φορέα εξωσωματικά. Ο φορέας, που μεταφέρει το θεραπευτικό γονίδιο, ενσωματώνεται στο χρωμοσωμικό υλικό των κυττάρων και μεταδίδει τη σωστή γενετική πληροφορία στα κύτταρα-απογόνους. Τα γενετικά διορθωμένα κύτταρα επανεγχύονται στον ασθενή άμεσα, όταν πρόκειται για νόσημα στο οποίο προσδίδεται πλεονέκτημα επιβίωσης των διορθωμένων κυττάρων (π.χ συγγενείς 25

26 ανοσοανεπάρκειες) ή μετά από μερική μυελοκαταστολή, σε νοσήματα που δεν παρέχεται επιλεκτικό πλεονέκτημα σε επίπεδο αιμοποιητικού στελεχιαίου κυττάρου (π.χ θαλασσαιμία), εξασφαλίζοντας τη διόρθωση της νόσου (Εικ.7). Εικόνα 7: Στάδια της ex vivo γονιδιακής μεταφοράς In vivo γονιδιακή μεταφορά Κατά την in vivo γονιδιακή μεταφορά, ο ιικός φορέας που φέρει το θεραπευτικό γονίδιο εισάγεται απευθείας στον ασθενή. Η έγχυση του φορέα μπορεί να γίνει είτε στον πάσχοντα ιστό, όπως στο ρινικό επιθήλιο στην περίπτωση της κυστικής ίνωσης, είτε σε ιστό από τον οποίο στη συνέχεια βρίσκει πρόσβαση στον ιστό-στόχο, όπως για παράδειγμα ενδομυϊκά στην περίπτωση της αιμοφιλίας απ όπου ο φορέας βρίσκει πρόσβαση στην κυκλοφορία του αίματος (Εικ.8). 26

27 Εικόνα 8: Απευθείας έγχυση του φορέα κατά την in vivo γονιδιακή μεταφορά. 1.5 Περιορισμοί και θέματα προς επίλυση στη γονιδιακή θεραπεία σήμερα Παρόλο που τα τελευταία χρόνια τα αποτελέσματα από τις κλινικές εφαρμογές γονιδιακής θεραπείας είναι ενθαρρυντικά, υπάρχουν εμπόδια που πρέπει να ξεπεραστούν για την επιτυχή και ασφαλή εφαρμογή της. Τα σημαντικότερα από αυτά αφορούν στο προπαρασκευαστικό σχήμα που θα λάβει ο δέκτης, στη μειωμένη ικανότητα εμφύτευσης των γενετικά τροποποιημένων κυττάρων και στην ασφάλεια του ιικού φορέα που χρησιμοποιείται για τη μεταφορά του γενετικού υλικού Προπαρασκευαστικό σχήμα Η επιλογή του κατάλληλου προπαρασκευαστικού σχήματος είναι καίριας σημασίας, καθώς τοξικές παρενέργειες είναι ανεπιθύμητες, κυρίως σε μη κακοήθεις ασθένειες. Στην περίπτωση αλλογενούς μεταμόσχευσης μυελού των οστών, το προπαρασκευαστικό σχήμα χορηγείται για να καταστείλει τις ανοσολογικές αντιδράσεις του δέκτη έναντι των κυττάρων του δότη, ενώ παράλληλα εξυπηρετεί στη μείωση των ενδογενών HSCs, με σκοπό την ευκολότερη εμφύτευση των κυττάρων του δότη. Αντίθετα, σε περιπτώσεις αυτόλογης μεταμόσχευσης όπου οι ανοσολογικές αντιδράσεις απουσιάζουν, το προπαρασκευαστικό σχήμα στοχεύει στην εξάλειψη των ενδογενών κυττάρων με αποτέλεσμα τη διάνοιξη χώρου στο μυελό των οστών. Καθώς η μυελοκαταστολή σχετίζεται άμεσα με τη νοσηρότητα της θεραπείας και τη θνησιμότητα, οι έρευνες έχουν στραφεί τα τελευταία χρόνια στην ανάπτυξη λιγότερο τοξικών και μερικώς μυελοκατασταλτικών προπαρασκευαστικών σχημάτων (ελαττωμένης ισχύος σχήματα). Τα 27

28 σχήματα αυτά διευκολύνουν την εμφύτευση των γενετικά διορθωμένων κυττάρων, χωρίς να επιφέρουν υψηλά επίπεδα τοξικότητας (Aiuti et al.,2002) Μειωμένη εμφύτευση των γενετικά τροποποιημένων κυττάρων Η αιματολογική αποκατάσταση ασθενών, οι οποίοι έλαβαν υψηλή δόση χημειοθεραπείας και στη συνέχεια μεταμοσχεύθηκαν, χαρακτηρίζεται από μια κρίσιμη περίοδο (10 μέρες έως κάποιους μήνες) ουδετεροπενίας και θρομβοπενίας, η οποία εξαρτάται από τον αριθμό και την προέλευση των κυττάρων που χορηγήθηκαν. Για το λόγο αυτό, τα τελευταία χρόνια ερευνάται η πιθανότητα ενίσχυσης της εμφύτευσης των χορηγούμενων κυττάρων, μετά από ex vivo έκπτυξη σε καλλιέργειες, παρουσία των κατάλληλων κυτοκινών (Paquette et al., 2000). Το μειονέκτημα της ex vivo καλλιέργειας των κυττάρων είναι η μερική διαφοροποίησή τους, καθώς μπαίνουν από τη φάση G 0 στη G 1 -S φάση του κυτταρικού κύκλου, με αποτέλεσμα να χάνουν την ικανότητα μακροπρόθεσμης επαναπληθυσμοποίησης (long-term engraftment potential) (Szilvassy et al.,2001). Επιπλέον, έρευνες έχουν δείξει πως η μειωμένη ικανότητα εμφύτευσης των καλλιεργούμενων κυττάρων οφείλεται στην τροποποίηση της έκφρασης μορίων προσκολλήσεως (cell adhesion molecules, CAMs), όπως της β1 ιντεγκρίνης. Πιο συγκεκριμένα, έχει δειχτεί πως έπειτα από ex vivo καλλιέργεια μόνο το 50% των κυττάρων εξέφραζε την ιντεγκρίνη και τα επίπεδα έκφρασης ήταν 50 φορές μειωμένα σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα του μυελού (Szilvassy et al.,2001). Δεδομένου ότι για τη διαμόλυνση των κυττάρων με ιικούς φορείς απαιτείται η ενεργοποίηση των κυττάρων σε καλλιέργειες, γίνεται φανερό πως τα γενετικά τροποποιημένα κύτταρα εμφανίζουν σημαντικά μειωμένη ικανότητα εγκατάστασης (homing) και εμφύτευσης στο μυελό των οστών, σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα του μυελού (fresh bone marrow cells). Για το λόγο αυτό, οι έρευνες τα τελευταία χρόνια έχουν στραφεί στην εξεύρεση μεθόδων ενίσχυσης της εμφύτευσης των γενετικά τροποποιημένων κυττάρων Ασφάλεια του ιικού φορέα Για τους ιικούς φορείς που ενσωματώνονται στο γονιδίωμα, όπως οι ρετροιικοί και οι λεντιιικοί, υπάρχει μεγάλος κίνδυνος να προκαλέσουν την ενεργοποίηση ενός ογκογονιδίου και να επάγουν εισχωρητική μεταλλαξιγένεση (insertional mutagenesis), εξαιτίας της τυχαίας και μη προβλέψιμης θέσης ενσωμάτωσης (Thomas et al., 2003). Αυτός ο κίνδυνος, που για αρκετά χρόνια ήταν μόνο θεωρητικός, έγινε πραγματικότητα όταν αναφέρθηκαν τρεις περιπτώσεις παιδιών με συγγενή ανοσοανεπάρκεια (X-SCID), τα οποία έπειτα από τρία χρόνια επιτυχούς γονιδιακής 28

29 θεραπείας με τη χρήση ρετροιικού φορέα, εμφάνισαν λευχαιμία (Hacein-Bey-Abina S,2003). Η μεταλλαξιογένεση αυτή προκλήθηκε λόγω γειτνίασης της θέσης ενσωμάτωσης του φορέα με το ογκογονίδο LMO2. Καταδείχτηκε λοιπόν σαφώς μέσα από τη συγκεκριμένη δημοσίευση η ανάγκη κατασκευής ιικών φορέων με πολλαπλές δικλείδες ασφαλείας που να ελαχιστοποιούν το δυνητικό κίνδυνο ογκογένεσης. Τα τελευταία χρόνια, έγιναν πολλές προσπάθειες για την κατανόηση του μοριακού μηχανισμού μέσω του οποίου οι ιοί, και κατ επέκτασην οι ιικοί φορείς αλληλεπιδρούν με το κύτταρο-ξενιστή. Τα ευρήματα οδήγησαν σε αρκετές προτεινόμενες τροποποιήσεις στην κατασκευή ιικών φορέων για την ελαχιστοποίηση του κινδύνου ενεργοποίησης ενός ογκογονιδίου. Αυτό-αδρανοποιούμενοι ιικοί φορείς (SIN vectors). Όπως αναφέρθηκε νωρίτερα, οι συγκεκριμένοι φορείς δημιουργούνται με απαλοιφή της U3 περιοχής στην 3 LTR, με αποτέλεσμα την αδρανοποίηση του ενισχυτή και υποκινητή και των δύο LTRs μετά την ενσωμάτωση. Το θεραπευτικό διαγονίδιο εκφράζεται στη συνέχεια από έναν εσωτερικό υποκινητή και ενισχυτή. Με την τροποποίηση αυτή, περιορίζεται ο αριθμός των ενεργών υποκινητών και ενισχυτών εντός του φορέα από δύο σε ένα, καταργώντας την καθοδική μεταγραφική ανάγνωση από την ιική 3 LTR. Με τον τρόπο αυτό ελαττώνεται ο κίνδυνος ενεργοποίησης κάποιου γονιδίου από τον ενσωματωμένο φορέα. Ιστοειδική έκφραση του διαγονιδίου. Η χρήση ιστοειδικών υποκινητών ή ενισχυτών, αντίθετα με τους μη ειδικούς, επάγει την έκφραση μόνο στα κύτταρα-στόχους. Οι φορείς σφαιρίνης αποτελούν ένα παράδειγμα τέτοιων φορέων, καθώς εκφράζουν το θεραπευτικό γονίδιο ειδικά στους ώριμους προερυθροβλάστες. Έτσι, σε περίπτωση που ένας ερυθροειδικός ιικός φορέας ενσωματωθεί κοντά σε ένα ογκογονίδιο τα ιστοειδικά στοιχεία του υποκινητή του αναμένεται να ενεργοποποιήσουν τον υποκινητή του ογκογονιδίου μόνο στην ερυθρά σειρά. Μονωτές χρωματίνης (insulators). Τα τελευταία χρόνια, η ενσωμάτωση μονωτών χρωματίνης στις κατασκευές ιικών φορέων απέκτησε πρόσθετο ενδιαφέρον καθώς, εκτός από την προστασία του μεταφερόμενου γονιδίου από τα φαινόμενα θέσεως, η ικανότητά τους να μπλοκάρουν τη λειτουργία ενισχυτών μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να εμποδίσει την ενεργοποίηση γονιδίων γύρω από τη θέση ενσωμάτωσης του φορέα (Yannaki et al.,2002). Γονίδια αυτοκτονίας (suicide genes). Μια διαφορετική προσέγγιση στην ενίσχυση της ασφάλειας των ιικών φορέων, είναι η ενσωμάτωση γονιδίων που επιτελούν μια λειτουργία ασφάλειας και θα μπορούσαν να ενεργοποιηθούν σε περίπτωση ογκογένεσης. Η στρατηγική αυτή περιλαμβάνει τη χρήση ενός γονιδίου αυτοκτονίας και έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία 29

30 για τη θεραπεία της GvHD, έπειτα από αλλογενή μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρων (Bonini et al.,2006). Ενσωμάτωση σε ειδική θέση (site-specific integration). Η στοχευμένη και ασφαλής ενσωμάτωση του φορέα στο γονιδίωμα αποτελεί την ιδεώδη προσέγγιση στο θέμα της ασφάλειας των ιικών φορέων, αποτελεί προς το παρόν όμως μία ισχυρή πρόκληση στο πεδίο της γονιδιακής θεραπείας. 2. Αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα (HSCs) Τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα (hematopoietic stem cells, HSCs) αποτελούν τον πιο καλά μελετημένο πληθυσμό αρχέγονων στελεχιαίων κυττάρων με βασική λειτουργία την έναρξη και συντήρηση της αιμοποίησης, δηλαδή την παραγωγή όλων των κυτταρικών πληθυσμών του αίματος (Εικ.9). Τα HSCs ανευρίσκονται στο μυελό των οστών, σε ένα πολύ μικρό ποσοστό (0,01% των μυελικών κυττάρων) και χαρακτηρίζονται από την ικανότητά τους για: α. αυτοανανέωση : διατηρούν τον πληθυσμό τους σταθερό αφού ακολουθούν το μοντέλο της ασύμμετρης διαίρεσης σε κάθε διαίρεση το ένα θυγατρικό κύτταρο διαφοροποιείται και το άλλο παραμένει αδιαφοροποίητο β. πολυδυναμία : όπως αναφέρθηκε παραπάνω, δίνει γένεση σε όλες τις κυτταρικές σειρές του μυελού των οστών γ. επαναπληθυσμιοποίηση : ικανότητα αποκατάστασης της αιμοποίησης, έπειτα από μεταμόσχευση σε λήπτη του οποίου ο μυελός έχει προηγουμένως υποστεί πλήρη μυελοκαταστολή 30

31 Εικόνα 9: Το ιεραρχικό μοντέλο της αιμοποίησης: από το αρχέγονο αιμοποιητικό κύτταρο στα τελικώς διαφοροποιημένα κύτταρα του περιφερικού αίματος (Alberts B. et al, 2002). Τα HSCs χωρίζονται περαιτέρω σε δύο πληθυσμούς: έναν με μακράς - διάρκειας (Long-Term Hematopoietic Stem Cells/LT-HSCs) συχνότητα εμφάνισης στο μυελό των οστών (1:10.000) και έναν με μικρής - διάρκειας ικανότητα δημιουργίας πληθυσμών (Short-Term Hematopoietic Stem Cells/ST-HSCs) (συχνότητα εμφάνισης στο μυελό των οστών 1:2.000). Ενώ και οι δύο πληθυσμοί προσφέρουν ανασύσταση της αιμοποίησης έπειτα από ακτινοβόληση, μόνο τα LT-HSCs είναι ικανά να ανταπεξέλθουν για διάστημα μεγαλύτερο των 10 εβδομάδων (Erica Herzog et al. 2003). Το μικροπεριβάλλον του μυελού παίζει σημαντικό ρόλο στην αιμοποίηση και διαφοροποίηση των HSCs. Αποτελείται από διάφορα είδη μη αιμοποιητικών κυττάρων, όπως ινοβλάστες, ενδοθηλιακά κύτταρα και οστεοβλάστες, που αναφέρονται συνολικά ως στρωματικά κύτταρα (stromal cells) και παίζουν ρόλο στην εγκατάσταση, την επιβίωση, την αυτοανανέωση, τον 31

32 πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των HSCs (Taichman 2012), καθώς και από μη κυτταρικά στοιχεία που αποκαλούνται εξωκυττάρια ουσία (extracellular matrix). Τα HSCs εδράζονται σε συγκεκριμένες περιοχές του μυελού, που ονομάζονται φωλεές (stem cell niches) και περιβάλλονται από τα στρωματικά κύτταρα. Η εγκατάσταση (homing) των HSCs στη φωλεά, οφείλεται στην αλληλεπίδραση των τελευταίων με τα στρωματικά κύτταρα. Η αλληλεπίδραση αυτή επιτυγχάνεται κυρίως μέσω του εκκρινόμενου από τα στρωματικά κύτταρα παράγοντα-1 (stromal derived-factor 1, SDF-1) και του υποδοχέα του CXCR4, που εκφράζεται από τα HSCs (Lapidot 2002). Η κατεύθυνση που θα ακολουθήσουν τα αρχέγονα όπως και τα προγονικά κύτταρα, εξαρτάται από τον τύπο και τη συγκέντρωση των κυτοκινών που υπάρχουν στο μικροπεριβάλλον και επηρεάζουν την αντίστοιχη διαφοροποίηση προς το συγκεκριμένο κυτταρικό τύπο. Σε κυτταρικές καλλιέργειες σε ημιστερεά μέσα μεθυλοκυτταρίνης (methylcellulose), τα αρχέγονα ή/και τα προγονικά κύτταρα δίνουν γένεση σε καθορισμένες αποικίες (colony forming units, CFUs) πολυδύναμων αιμοποιητικών κυττάρων. Το είδος των αποικιών αυτών εξαρτάται από την παρουσία αιμοποιητικών παραγόντων, γνωστών ως παράγοντες που διεγείρουν τις αποικίες (colony stimulating factors-csf) ή απλά αυξητικοί παράγοντες. Οι αυξητικοί παράγοντες εκκρίνονται συστηματικά ή τοπικά και ελέγχουν τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, και την ωρίμανση (Goldsby R et al, 2000; Georgoulis I.,2007) των κυττάρων. Για τις μυελικές σειρές, τα είδη των αποκιών είναι: CFU-E (colony forming units- erythroid), CFU-GM (colony forming units-granulocyte/monocyte), CFU-ΕΟ (colony forming units-eosinophil), CFU-Bas (colony forming units -basophil), CFU-M (colony forming units-monocytes/macrophage), CFU-G (colony forming units-granulocyte) και CFU-Meg (colony forming units-megacaryocyte). Οι κύριες κατηγορίες αυξητικών παραγόντων είναι οι ακόλουθες: Διεγερτικοί παράγοντες αποικιών (Colony-stimulating factors, CSF): κυτoκίνες που απελευθερώνονται από το μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών, συνδέονται με τους αντίστοιχους υποδοχείς της μεμβράνης των αιμοποιητικών κυττάρων και αυξάνουν το ρυθμό παραγωγής των κυτταρικών σειρών, ιδιαίτερα των κοκκιοκυττάρων και των μονοκύτταρων/μακροφάγων. Για αυτό το λόγο είναι γνωστοί ως αυξητικοί παράγοντες (π.χ G-CSF/ granulocyte-colony stimulating factor, GM-CSF/ granulocyte-macrophage-colony stimulating factor). Stem Cell Factor (SCF): κυτοκίνη που λειτουργεί ως παράγοντας ρύθμισης της αιμοποίησης (τόσο της μυελοειδούς όσο και της λεμφοειδούς σειράς). Είναι μια μεμβρανική πρωτεΐνη και είναι δυνατό να εντοπίζεται και ως εκκρινόμενη διαλυτή πρωτεΐνη. 32

33 Ερυθροποιητίνη (EPO): εκκρίνεται στο αίμα από τους νεφρούς και, σε μικρότερες ποσότητες, από το ήπαρ. Η ερυθροποιητίνη δρα στο μυελό των οστών και διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των προγονικών ερυθροκυττάρων και τη διαφοροποίησή τους σε ώριμα ερυθροκύτταρα. Ιντερλευκίνες (IL-): κυτοκίνες που εκκρίνονται από έναν τύπο λευκοκυττάρων και συμμετέχουν στη διαίρεση και διαφοροποίηση. Οι περισσότερες ρυθμίζουν την ανοσογονική απόκριση των Τ- όσο και των Β- λεμφοκυττάρων, ενώ συγχρόνως συμβάλλουν στη ρύθμιση της αιμοποίησης. Παράγονται κυρίως από τα Τ-βοηθητικά (T helper, Τ H ), τα μακροφάγα και τα επιθηλιακά κύτταρα. Οι σημαντικότερες ιντερλευκίνες που συμμετέχουν στην αιμοποίηση είναι η IL-3, IL-6, IL-9 και IL-11. Τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα δεν έχουν χαρακτηριστεί φαινοτυπικά και μορφολογικά. Φαίνεται να είναι μάλιστα μια ανομοιογενής ομάδα που ο φαινότυπός της αλλάζει βάσει της φάσεως του κυτταρικού κύκλου και μάλλον επηρεάζεται από το μικροπεριβάλλον (Quesenberry et al 2010). Στην καθ ημέρα πράξη, τόσο στην ερευνητική όσο και στην κλινική (μεταμόσχευση, γονιδιακή θεραπεία), για να απομονωθούν αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα χρησιμοποιείται το αντιγόνο επιφανείας CD34, όπως επίσης και άλλοι επιφανειακοί κυτταρικοί δείκτες (Πίνακας 1). Ο επίτοπος αυτός απαντάται στο 1-5% των μονοπύρηνων κυττάρων του μυελού. Το CD34 δεν είναι ειδικό για τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα καθώς ανευρίσκεται και σε άλλα κύτταρα, γι αυτό τα CD34+ κύτταρα θεωρούνται εμπλουτισμένα σε HSCs. Πίνακας 1: Επιφανειακοί κυτταρικοί δείκτες των HSCs στο ποντίκι και τον άνθρωπο. Mouse Human CD34 low/- CD34 + sca-1 + CD59 + Thy1 +/low Thy1 + CD38 + C-kit + CD38 low/- c-kit -/low Lin - Lin - 33

34 Οι μέθοδοι λήψης των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων είναι οι παρακάτω: Απευθείας με αναρρόφηση μυελού των οστών. Από περιφερικό αίμα κινητοποιημένου δότη. Η κινητοποίηση είναι η διαδικασία κατά την οποία τα HSCs και κύτταρα του μυελού εξάγονται στο περιφερικό αίμα με τη χρήση φαρμακευτικών ουσιών. Η κινητοποίηση πραγματοποιείται με τη χρήση αυξητικών παραγόντων (G CSF/ granulocyte colony stimulating factor), χημειοθεραπευτικών ή νεώτερων παραγόντων κινητοποίησης (plerixafor). To plerixafor ανταγωνίζεται την πρόσδεση του SDF με τον υποδοχέα του CXCR4 (C-X-C chemokine receptor 4) (Yannaki et al.,2010). Από το αίμα ομφάλιου λώρου. Η περιεκτικότητά του σε HSCs είναι μεγαλύτερη από την αντίστοιχη του μυελού των οστών, όμως ο συνολικός αριθμός τους είναι μικρότερος, γεγονός που περιορίζει τη χρήση τους στη κλινική πράξη. 2.1 Γονιδιακή θεραπεία του αιμοποιητικού στελεχιαίου κυττάρου Γενετικά νοσήματα, όπως η θαλασσαιμία και η δρεπανοκυτταρική αναιμία, που οφείλονται σε έλλειψη ή ελαττωμένη ή ελαττωματική σύνθεση μιας από τις φυσιολογικές αλυσίδες του τετραμερούς της αιμοσφαιρίνης, αποτελούν ιδανικούς στόχους για θεραπευτικές μεθόδους γονιδιακής μεταφοράς. Οι δύο παραπάνω ασθένειες αποτελούν συχνές μονογονιδακές διαταραχές που προκαλούν σημαντικού βαθμού νοσηρότητα και θνητότητα παγκοσμίως, αλλά κυρίως στις χώρες της Μεσογείου. Μέχρι σήμερα, η μόνη οριστική θεραπεία για τους ασθενείς με θαλασσαιμία και δρεπανοκυτταρική αναιμία είναι η αλλογενής μεταμόσχευση μυελού των οστών. Ωστόσο, η θεραπεία αυτή είναι διαθέσιμη σε μικρό αριθμό ασθενών που διαθέτουν συμβατό αδελφό δότη και επιπλέον συνοδεύεται από τοξικότητα, η οποία αυξάνει με την πρόοδο της ηλικίας του ασθενούς. Η γονιδιακή θεραπεία, δηλαδή η μεταμόσχευση αυτόλογων, γενετικώς διορθωμένων αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων, μπορεί να αποτελέσει εναλλακτική θεραπευτική προσέγγιση η οποία αναμένεται να έχει την ίδια αποτελεσματικότητα με την αλλογενή μεταμόσχευση, αλλά με σημαντικά μικρότερη τοξικότητα. Λόγω της παθοφυσιολογίας αυτών των διαταραχών, η προσθήκη ενός λειτουργικού γονιδίου σφαιρίνης στα HSCs των ασθενών, με επακόλουθο υψηλό ποσοστό έκφρασής τους στα ερυθρά αιμοσφαίρια, μπορεί να οδηγήσει σε ισόβια διόρθωση της πάθησης. 34

35 Το πρώτο μεγάλο πρόβλημα που χρειάστηκε να αντιμετωπιστεί ήταν η δημιουργία ενός φορέα που να επιτυγχάνει ικανοποιητικά επίπεδα έκφρασης του γονιδίου της β-σφαιρίνης. O ρετροιός moloney leukemia, που είχε χρησιμοποιηθεί και σε κλινικές έρευνες, ήταν ιδιαίτερα ασταθής κυρίως λόγω του μεγέθους του γονιδίου της β-σφαιρίνης και των ρυθμιστικών περιοχών που έπρεπε να ενσωματωθούν στο φορέα (Malik and Arumugam, 2005). Με τη χρήση άλλων ιικών φορέων, και πιο συγκεκριμένα λεντι-ιικών, δημιουργήθηκε ένα σταθερό σύστημα έκφρασης με το οποίο κατάφεραν το 2000 να ιάσουν ποντίκια που έπασχαν από ενδιάμεση β-θαλασσαιμία (GLOBE LV) (May et al, 2000). Τα αποτελέσματα ήταν εντυπωσιακά καθώς μετά από 40 εβδομάδες τα επίπεδα της β-αλυσίδας ήταν σταθερά, ενώ είχε βελτιωθεί η μη παραγωγική και εξωμυελική ερυθροποίηση και ταυτόχρονα μειωνόταν και ο σίδηρος στο ήπαρ (May et al, 2002). Επίσης, αναπτύχθηκε ένας ακόμα λεντι-ιικός φορέας ο οποίος φέρει το γ-γονίδιο της αιμοσφαιρίνης, και τα πειραματικά δεδομένα σε θαλασσαιμικά ποντίκια δείχνουν ενθαρρυντικά αποτελέσματα (Persons et al 2003). Μετά από τα παραπάνω ενθαρρυντικά δεδομένα, μία κλινική έρευνα έχει ήδη ξεκινήσει στη Γαλλία για ασθενείς με β-θαλασσαιμία και δρεπανοκυτταρική αναιμία με τη χρήση του λεντι-ιικού φορέα του Μ. Sadelain (Bank et al 2005). Στην παραπάνω έρευνα έχουν ενταχθεί 2 ασθενείς, στον πρώτο η μεταμόσχευση με γενετικά τροποποιημένα HSCs έχει πετύχει και ο ασθενής έχει καλά επίπεδα αιμοσφαιρίνης και είναι κλινικά βελτιωμένος. Όμως, παρατηρείται κλώνος γενετικά τροποποιημένων κυττάρων (10% των τροποποιημένων κυττάρων) στον οποίον ο φορέας έχει εισέλθει στο πρωτο-ογκογονίδιο HMGA2. Το προϊόν της έκφρασης του γονιδίου έχει αλλάξει χωρίς αυτό, προς το παρόν, να επηρεάζει την κλινική εικόνα του ασθενούς (Persons 2010, Cavazzana-Calvo et al 2010). 3. Μεσεγχυματικά στρωματικά κύτταρα (MSCs) Πρώτος ο Friedenstein περιέγραψε έναν πληθυσμό στελεχιαίων κυττάρων που είχε την ικανότητα να διαφοροποιείται σε κύτταρα μεσεγχυματικής σειράς (Friedenstein et al., 1968). Τα κύτταρα αυτά ονομάζονται μεσεγχυματικά στρωματικά κύτταρα (mesenchymal stromal cells MSCs), εδράζονται στο μυελό των οστών αποτελώντας το 0.01%-0.001% των μονοπύρηνων κυττάρων, καθώς επίσης και σε άλλους ιστούς (Bieback et al., 2004). Ο βασικός ρόλος των MSCs είναι η υποστήριξη της αιμοποίησης μέσω της έκκρισης ρυθμιστικών μορίων και κυτοκινών (Dorshkind, 1990), καθώς και η αντικατάσταση νεκρωτικών ή αποπτωτικών κυττάρων λόγω φυσιολογικής αναδιοργάνωσης του ιστού, βλάβης ή γήρανσης. 35

36 Τα MSCs μπορούν να απομονωθούν εύκολα χάρη στην ικανότητά τους να προσκολλώνται σε πλαστικές επιφάνειες, να καλλιεργηθούν χωρίς την προσθήκη αυξητικών παραγόντων ή κυτοκινών και να εκπτυχθούν αποτελεσματικά σε καλλιέργεια αποδίδοντας γρήγορα υψηλούς ρυθμούς. Μορφολογικά στην καλλιέργεια προσομοιάζουν στους ινοβλάστες. Καθώς μέχρι σήμερα δεν έχει βρεθεί κάποιος ειδικός δείκτης που να τα χαρακτηρίζει, η Διεθνής Εταιρεία Κυτταρικής Θεραπείας όρισε ως ελάχιστα κριτήρια για την πιστοποίηση ενός πληθυσμού κυττάρων ως MSCs τα παρακάτω: την ικανότητα προσκόλλησής τους σε πλαστικές επιφάνειες, την απουσία έκφρασης αιμοποιητικών και επιθηλιακών δεικτών, όπως CD11b, CD14, CD31, CD34 και CD45 και την έκφραση πληθώρας άλλων δεικτών, όπως MHC τάξης I (HLA I), CD105, CD73, CD29και CD90 και την ικανότητα τριγραμμικής διαφοροποίησης προς λιποκύτταρα, οστεοκύτταρα και χονδροκύτταρα (Dominici et al.,2006). Κύριο χαρακτηριστικό των MSCs είναι η ικανότητα αυτο-ανανέωσης και διαφοροποίησης προς ένα ευρύ φάσμα κυττάρων του μεσοδέρματος (λιποκύτταρα, οστεοκύτταρα, χονδροκύτταρα) αλλά και κυττάρων του εξωδέρματος (νευρώνες, δερματικά κύτταρα) και του ενδοδέρματος (επιθηλιακά κύτταρα, ηπατοκύτταρα, πνευμονοκύτταρα) (Εικ.10) (Wang et al.,2005). Τα MSCs μπορούν και μεταναστεύουν σε ιστούς με βλάβη, όπου συμμετέχουν στην ιστική αναγέννηση άμεσα, με τη διαφοροποίησή τους σε κύτταρα του βεβλαμένου ιστού ή έμμεσα ως υποστηρικτικά κύτταρα (Aronin and Tuan, 2010). Τα MSCs παίζουν σπουδαίο ρόλο στο μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών. Η κύρια λειτουργία τους είναι η δημιουργία ενός ιστολογικού πλαισίου, το οποίο εξασφαλίζει μηχανική υποστήριξη για το αιμοποιητικό κυτταρικό σύστημα. Εκκρίνουν διάφορες πρωτεΐνες του εξωκυττάριου στρώματος, όπως φιμπρονεκτίνη, λαμινίνη, κολλαγόνο και πρωτεογλυκάνες. Επιπλέον, παράγουν αιμοποιητικούς και μη αιμοποιητικούς αυξητικούς παράγοντες, συμμετέχοντας έτσι στη ρύθμιση της αιμοποίησης. Οι βασικότερες από τις ουσίες που εκκρίνουν είναι : IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-7, IL-8, IL-11, IL-14, IL-15, διεγερτικός παράγοντας αποικιών μακροφάγων, διεγερτικός παράγοντας αποικιών κοκκιοκυττάρων-μακροφάγων (GM-SCF), ανασταλτικός παράγοντας λευχαιμίας, παράγοντας βλαστικών κυττάρων (SCF), κινάση τυροσίνης- 3 εμβρυϊκού ήπατος, θρομβοποιητίνη και αυξητικός παράγοντας ηπατοκυττάρων (HGF). 36

37 Εικόνα 10: Δυνητική διαφοροποίηση των MSCs (Uccelli et al.,2008). Τα MSCs διαθέτουν ένα μοναδικό ανοσοπρονόμιο, καθώς εμφανίζουν ιδιαίτερα χαμηλή έκφραση του MHC I, ενώ δεν εκφράζουν το MHC II ή συνδιεγερτικά μόρια που είναι απαραίτητα για την ενεργοποίηση των Τ-λεμφοκυττάρων. Αίροντας λοιπόν τους φραγμούς του συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας διαφεύγουν από την ανοσολογική επιτήρηση (DelaRosa & Lombardo, 2010). Ωστόσο, υπό ορισμένες συνθήκες, μπορούν να χάσουν αυτό τους το προνόμιο και να απορρηφθούν (Nauta et al., 2006). Τα MSCs μπορούν να ρυθμίσουν τη δράση των κυριότερων κυτταρικών πληθυσμών του ανοσοποιητικού συστήματος, καθώς μπορούν να αναστείλλουν τον πολλαπλασιασμό και τη λειτουργική δράση των κυττάρων της επίκτητης ανοσίας, κυρίως των Τ- λεμφοκυττάρων. Ο ακριβής όμως μηχανισμός της ανοσορρυθμιστικής τους δράσης δεν έχει εξακριβωθεί πλήρως. Πιστεύεται ότι δρουν μέσω κυτταρικής επαφής με τους διάφορους τύπους 37

38 κυττάρων και μέσω διαλυτών παραγόντων, τους οποίους εκκρίνουν ως απόκριση στις κυτοκίνες που έχουν παραχθεί από τα ενεργοποιημένα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος (DelaRosa & Lombardo, 2010). 3.1 Εφαρμογές των MSCs in vivo Οι παραπάνω ιδιότητες έχουν εγείρει έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον για τη χρήση των MSCs σε ποικίλες εφαρμογές. Λόγω της ικανότητάς τους να διαφοροποιούνται προς άλλους τύπους κυττάρων μελετώνται στην ιστική αναγέννηση, ιστική μηχανική και αναγεννητική ιατρική και λόγω της ανοσορρυθμιστικής τους δράσης σε περιπτώσεις αυτοανοσίας (Yannaki et al.,2010) και στην οξεία νόσο του μοσχεύματος κατά του ξενιστή μετά από αλλογενή μεταμόσχευση μυελού των οστών. Επίσης, διερευνάται στη γονιδιακή θεραπεία ως οχήματα γονιδιακής μεταφοράς και στη μεταμόσχευση μυελού των οστών ως κύτταρα υποστηρικτικά της εμφύτευσης των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων (Picinich et al., 2007/ Nauta & Fibbe, 2007) (Πίνακας 2). Οι μεταδιαφοροποιητικές και ανοσορρυθμιστικές ικανότητες των MSCs έχουν δοκιμαστεί in vivo σε προ-κλινικές (Πίνακας 3) και σε κλινικές μελέτες ( Πίνακας 2: Δυνητικές εφαρμογές των MSCs. 38

39 Πίνακας 3: Προ-κλινικές μελέτες χορήγησης MSCs (Nauta & Fibbe, 2007). Τα MSCs έχουν συγχορηγηθεί in vivo σε αλλογενείς μεταμοσχεύσεις αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων, με αποτέλεσμα να επιτυγχάνονται υψηλότερα ποσοστά εμφύτευσης (Le Blanc et al.,2007) (Πίνακας 3). Επίσης, έχει δειχτεί ότι τα MSCs υποστηρίζουν την αιμοποίηση τόσο in vitro όσο και in vivo. Συγκαλλιέργειες MSCs και HSCs οδήγησαν στην έκπτυξη των τελευταίων in vitro και όταν τα κύτταρα αυτά μεταμοσχεύθηκαν, σημειώθηκε αύξηση της εμφύτευσής τους (Wang et al.,2010). Ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίον τα MSCs οδηγούν στην αύξηση της εμφύτευσης δεν είναι γνωστός, αλλά φαίνεται πως δημιουργούν ένα μικροπεριβάλλον (είτε μέσω άμεσης επαφής με τα HSCs είτε μέσω των εκκρινόμενων διαλυτών τους παραγόντων) το οποίο προάγει την εμφύτευση των HSCs στο μυελό των οστών. 39

40 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ 40

41 Απαραίτητη προϋπόθεση της γενετικής τροποποίησης των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων (HSCs) με λεντι-ιικούς φορείς είναι η ex vivo ενεργοποίησή τους σε καλλιέργεια παρουσία διαφόρων κυτοκινών. Η ενεργοποίηση αυτή τροποποιεί την έκφραση διαφόρων μορίων προσκόλλησης (CAMs), θέτει τα κύτταρα σε κυτταρικό κύκλο και αυξάνει την τάση των κυττάρων για απόπτωση, με αποτέλεσμα να παρατηρείται μειωμένη ικανότητα εγκατάστασης στο μυελό των οστών (homing) και κατ επέκταση εμφύτευσης στο δέκτη, έπειτα από μεταμόσχευση των γενετικά διορθωμένων HSCs. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η διερεύνηση του ρόλου των μεσεγχυματικών στρωματικών κυττάρων στην προαγωγή της εμφύτευσης γενετικά τροποποιημένων HSCs με λεντιιικό φορέα αναφοράς egfp, σε πειραματικό μοντέλο μεταμόσχευσης. Το συγκεκριμένο μοντέλο που χρησιμοποιείται στην εργασία επιτρέπει τον έλεγχο της αιμοποιητικής χίμαιρας του δότη στο λήπτη ( δότες CD45.2+ / λήπτες CD45.1+) και η μεταμόσχευση γίνεται μετά από χορήγηση ενός μερικά μυελοκατασταλτικού προπαρασκευαστικού σχήματος στους λήπτες. Συγκεκριμένα, εξετάζεται εάν η αλληλεπίδραση των MSCs με τα HSCs κατά τη διάρκεια της ex vivo ενεργοποίησής τους και πριν τη διαμόλυνση οδηγεί σε i) αύξηση της μεταναστευτικής ικανότητας των HSCs in vitro ii) και ενίσχυση της εμφύτευσης των HSCs in vivo, σε σχέση με τα γενετικά τροποποιημένα κύτταρα που καλλιεργήθηκαν με το συμβατικό τρόπο. Καθώς η επιτυχής έκβαση της γονιδιακής θεραπείας εξαρτάται επίσης από τα υψηλά ποσοστά ικανότητας διαμόλυνσης (% transduction efficiency) των χορηγούμενων HSCs, εξετάζεται εάν η αλληλεπίδραση των MSCs με τα HSCs κατά τη διάρκεια της ex vivo ενεργοποίησής τους και πριν τη διαμόλυνση οδηγεί και σε iii) ενίσχυση της γονιδιακής μεταφοράς. Παράλληλα, ελέγχεται εάν η συγχορήγηση MSCs με γενετικά τροποποιημένα HSCs που καλλιεργήθηκαν με το συμβατικό τρόπο προάγει την εμφύτευσή τους, σε σχέση με τη χορήγηση μόνο γενετικά τροποποιημένων HSCs. Επειδή όχι μόνο η κυτταρική επαφή (MSCs- HSCs) μπορεί να επηρεάζει τις ιδιότητες των γενετικά τροποποιημένων κυττάρων αλλά και οι εκκρινόμενοι διαλυτοί παράγοντες από τα MSCs, διερευνάται εάν i) η προσθήκη συμπυκνωμένου υπερκειμένου καλλιέργειας MSCs σε διαμολυσμένα HSCs προάγει τη μεταναστευτική ικανότητα των HSCs in vitro και ii) η συγχορήγηση διαμολυσμένων HSCs με συμπυκνωμένο υπερκείμενο καλλιέργειας MSCs ενισχύει την εμφύτευσή τους. Η υπόθεση για την παρούσα εργασία βασίστηκε σε πρόσφατη βιβλιογραφία προκλινικών και κλινικών μελετών που καταδεικνύει ενίσχυση της εμφύτευσης των μη γενετικά επεξεργασμένων HSCs με συγχορήγηση MSCs ή των ομφαλιοπλακουντικών μοσχευμάτων μετά από συγκαλλιέργειά τους με MSCs. Ο ρόλος των MSCs στην προαγωγή της εμφύτευσης και των 41

42 γενετικά τροποποιημένων HSCs δεν έχει διερευνηθεί μέχρι σήμερα και εάν αυτό επιβεβαιωθεί αναμένεται να βελτιώσει σημαντικά την έκβαση της γονιδιακής θεραπείας για τα γενετικά νοσήματα. 42

43 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 43

44 Αντιδραστήρια Το Busulfan (Busilvex ) είναι ένας χημειοθεραπευτικός παράγοντας και χρησιμοποιήθηκε ως προπαρασκευαστικό σχήμα στις μεταμοσχεύσεις των αιμοποιητικών κυττάρων. Χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά σε συγκέντρωση 100 mg ανά κιλό ποντικού (μερική μυελοκατασταλτική δόση) σε τρεις δόσεις (35 mg+35 mg+30 mg), ξεκινώντας πέντε μέρες νωρίτερα από την ημέρα της μεταμόσχευσης. Το αναισθητικό avertin παρασκευάστηκε με διάλυση 2-μεθυλ-2-βουτανόλης (tert-amyl-alcohol C2H5C(CH3)2OH, Aldrich) και 2,2,2-τριβρωμοαιθανόλης (tribromoethanol Aldrich) σε φυσιολογικό ορό (0.9% NaCl) και χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά σε δόση 33,3 ml/ kg βάρους ποντικού. Η αναισθησία επέρχονταν 5 λεπτά μετά τη χορήγηση του αναισθητικού και διαρκούσε περίπου λεπτά. Πειραματόζωα Ως πειραματόζωα χρησιμοποιήθηκαν: ποντίκια της σειράς C57BL/6J (C57). Τα ζώα αυτά αποτελούν ισχυρό γενετικό υπόβαθρο για την έκφραση πολλών μεταλλάξεων σε γενετικά τροποποιημένα ποντίκια και χρησιμοποιούνται ως μοντέλα ασθενειών του ανθρώπου. Χρησιμοποιούνται ευρέως εργαστηριακά γιατί αναπαράγονται εύκολα, ζουν για αρκετό χρονικό διάστημα, έχουν ελάχιστη ευαισθησία στην ανάπτυξη όγκων και τα HSCs που προέρχονται από αυτά τα ζώα εμφανίζουν καθυστερημένη γήρανση σε σχέση με αυτά των σειρών BALB/c και DBA/2J ( ποντίκια της σειράς Β6.SJL-Ptprc a Pepc b /BoyJ (PepBoy). Τα ζώα της σειράς αυτής είναι συγγενεϊκά με τα ζώα της σειράς C57BL/6J και διαφέρουν ως προς έναν αλλότυπο του CD45 αντιγόνου στα αιμοποιητικά τους κύτταρα. Για το λόγο αυτό, χρησιμοποιούνται ευρέως εργαστηριακά σε μοντέλα μεταμόσχευσης, καθώς εύκολα μπορούν να αναγνωριστούν τα κύτταρα του δότη στο δέκτη. ποντίκια της σειράς C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J (GFP). Τα ζώα της σειράς αυτής είναι διαγονιδιακά, έχουν υπόβαθρο C57BL/6 και εκφράζουν την πράσινη φθορίζουσα χρωστική (Green Fluorescent Protein, GFP) υπό τον έλεγχο υποκινητή της ανθρώπινης ουβικουιτίνης. Ποντίκια ομόζυγα για το διαγονίδιο είναι βιώσιμα, γόνιμα, φυσιολογικά σε μέγεθος και εκφράζουν τη GFP πρωτεϊνη σε όλους τους ιστούς τους. Τα ζώα που 44

45 χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα της παρούσας εργασίας εξέφραζαν τη GFP πρωτεϊνη σε ποσοστό > 90% στα αιμοποιητικά τους κύτταρα. Τα ζώα διατηρούνταν σε χώρο διαβίωσης θερμοκρασίας ο C, υγρασίας 50-60% και τεχνητής φωτοπεριοδικότητας 12 ωρών, σε ειδικούς κλωβούς από plexiglass, με στρώση από ροκανίδι και με μεταλλικό διχτυωτό καπάκι. Τα πειραματόζωα τρέφονταν με τυποποιημένη και καθορισμένης περιεκτικότητας τροφή εμπορίου και είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε αποστειρωμένο νερό με 20% HCl. Θυσιάζονταν με αυχενική εξάρθρωση έπειτα από αναισθησία με αιθέρα ή avertin. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν με έγκριση της Διεύθυνσης Κτηνιατρικής Υπηρεσίας (Περιφέρεια Κεντρικής Μακεδονίας, Νομός Θεσσαλονίκης, Νομαρχιακή Αυτοδιοίκηση Θεσσαλονίκης, Γενική Διεύθυνση Ανάπτυξης ). Τα πρωτόκολλα που εφαρμόστηκαν ήταν σύμφωνα με τους κανονισμούς δεοντολογίας για χρήση πειραματοζώων του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, την υπάρχουσα ελληνική νομοθεσία περί πειραματοζώων και των κανονισμών της Ευρωπαϊκής Ενωσης. Απομόνωση και καλλιέργεια των MSCs Τα ολικά κύτταρα του μυελού των οστών απομονώθηκαν από τα μηριαία οστά και τις κνήμες C57 ποντικών με έγχυση εμπλουτισμένου alpha-mem θρεπτικού μέσου (20% FBS, 100 U/ml πενικιλίνη / 100 μg/ml στρεπτομυκίνη, 2 mm L-γλουταμίνη, Gibco) στα οστά με τη βοήθεια σύριγγας ινσουλίνης. Ακολούθησε διάλυση των συσσωματωμάτων των κυττάρων (single cell suspension) με τη χρήση σύριγγας με βελόνα 21Gauge και το εναιώρημα των κυττάρων διηθήθηκε με ηθμό πόρων 100 μm (BD strainers) κατά την τοποθέτησή τους σε σωληνάριο των 50 ml. Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στoυς 4 ο C για 5 στα 800 g,, και η επαναιώρηση έγινε με το παραπάνω εμπλουτισμένο θρεπτικό μέσο. Η μέτρηση των κυττάρων έγινε σε αιμοκυτταρόμετρο Neubauer κατόπιν χρώσης με τη χρωστική Turks και τα κύτταρα ( κύτταρα / cm 2 ) καλλιεργήθηκαν σε υγρό περιβάλλον 37 o C, 5% CO 2. Τα μη προσκολλημένα κύτταρα απομακρύνθηκαν με αφαίρεση του θρεπτικού υλικού (υπερκείμενο καλλιέργειας) μετά από 24 ώρες, ενώ τα προσκολλημένα καλλιεργήθηκαν σε φρέσκο θρεπτικό υλικό. Μετά το πέρας μίας εβδομάδας, τα προσκολλημένα κύτταρα αποκολλήθηκαν με ανασυνδυασμένο ένζυμο εναλλακτικό-θρυψίνης (TrypLE Select, Gibco), ακολουθώντας την παρακάτω διαδικασία: 45

46 Απομάκρυνση υπερκειμένου από τα τρυβλία και ξέπλυμα της επιφάνειας του τρυβλίου με PBS (Phosphate-Buffered Saline, Invitrogen). Προσθήκη της Tryple Select ( η οποία είχε προηγουμένως προθερμανθεί στους 37 ο C για 20 λεπτά) και επώαση των κυττάρων στους 37 o C για 5 λεπτά. Eξουδετέρωση της δράσης της θρυψίνης με προσθήκη διπλάσιου όγκου FBS (Fetal Bovine Serum), του οποίου το συμπλήρωμα έχει απενεργοποιηθεί μετά από επώαση μιας ώρας στους 56 o C (heat-inactivation). Αποκόλληση των κυττάρων που παραμένουν προσκολλημένα στην επιφάνεια του τρυβλίου με τη χρήση cell lifters (Corning) και συλλογή των κυττάρων. Φυγοκέντρηση των κυττάρων στους 4 o C για 5 στα 800 g. Απομάκρυνση υπερκειμένου, επαναδιάλυση των κυττάρων σε εμπλουτισμένο θρεπτικό alpha-mem και μέτρηση των κυττάρων με τη χρωστική Trypan Blue (Invitrogen). Επίστρωση των κυττάρων σε συγκέντρωση κύτταρα / cm 2. Το θρεπτικό υλικό καλλιέργειας ανανεώνονταν 2 φορές την εβδομάδα. Τα προσκολλημένα κύτταρα στις καλλιέργειες ΜSCs συλλέγονταν με τη χρήση ανασυνδυασμένου ενζύμου εναλλακτικό-θρυψίνης και ανακαλλιεργούνταν κάθε φορά που επικάλυπταν κατά % την περιοχή ανάπτυξης του τριβλίου. Για τη μεταμόσχευση των κυττάρων, MSCs 3 ης -5 ης ανακαλλιέργειας συλλέχθηκαν με ανασυνδυασμένο ένζυμο-εναλλακτικό θρυψίνης. Μετά από τρεις πλύσεις με HBSS (Hank s Balanced Salt Solution, Gibco) τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε HBSS και μετρήθηκαν με τη χρωστική Trypan Blue σε πλάκα Neubauer. Ταυτοποίηση των MSCs Μετά την τρίτη ανακαλλιέργεια τα MSCs ταυτοποιήθηκαν με κυτταρομετρία ροής ως προς τους δείκτες CD45, CD44, CD73, CD54 και sca-1 (BD, παράγραφος Ανάλυση με κυτταρομετρία ροής) και βάσει της ικανότητας διαφοροποίησής τους προς λιποκύτταρα και οστεοκύτταρα. Πιο αναλυτικά, για τη λιπογένεση MSCs επιστρώθηκαν ανά οπή σε πιάτα των 6 οπών (6-well tissue culture plates,corning) και τοποθετήθηκαν στον κλίβανο (37 o C, 5% CO 2 ) έως ότου επικαλύψουν κατά % την περιοχή ανάπτυξης της κάθε οπής. Πραγματοποιήθηκε τρεις φορές εναλλαγή θρεπτικού λιπογένεσης για 72 ώρες με θρεπτικό υλικό διατήρησης για 24 ώρες. Το θρεπτικό λιπογένεσης αποτελoύνταν από Iscove s Modified Dulbecco s Medium (IMDM, Invitro- 46

47 gen), 20% FBS, 100 U/ml πενικιλίνη/ 100 μg/ml στρεπτομυκίνη, 2 mm L-γλουταμίνη, 10 μg/ml ινσουλίνη (Sigma) και 500 μm 3-ισοβουτυλ-1-μεθυλ-ξανθίνη (IBMX, Sigma). Το θρεπτικό υλικό διατήρησης αποτελούνταν από θρεπτικό IMDM, 20% FBS, 100 U/ml πενικιλίνη/ 100 μg/ml στρεπτομυκίνη, 2 mm L-γλουταμίνη και 10 μg/ml ινσουλίνη. Μετά το πέρας της καλλιέργειας, ακολούθησε χρώση με Oil red O (Sigma), η οποία βάφει τα λιποκύτταρα, με την ακόλουθη διαδικασία: Απομάκρυνση θρεπτικού υλικού από τις οπές και ξέπλυμα της επιφάνειας των οπών με PBS. Μονιμοποίηση με 10% φορμαλδεϋδη για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και διπλό ξέπλυμα με ddh 2 O (double-distilled). Χρώση με 0.5% Oil red O σε μεθανόλη για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και διπλό ξέπλυμα με PBS. Στη συνέχεια, τα κύτταρα παρατηρήθηκαν στο μικροσκόπιο και φωτογραφήθηκαν. Για την οστεογένεση, MSCs επιστρώθηκαν ανά οπή σε πιάτα 6 οπών και τοποθετήθηκαν στον κλίβανο (37 o C, 5% CO 2 ) έως ότου επικαλύψουν κατά % την περιοχή ανάπτυξης της κάθε οπής. Το θρεπτικό οστεογένεσης αποτελούνταν από IMDM, 20% FBS, 100 U/ml πενικιλίνη/ 100 μg/ml στρεπτομυκίνη, 2 mm L-γλουταμίνη, 100 nm δεξαμεθαζόνη, 10 mm β-γλυκεροφωσφορικό άλας (Sigma) και 50 μm φωσφορικό άλας ασκορβικού οξέος (Sigma). Το παραπάνω θρεπτικό χρησιμοποιήθηκε για 22 μέρες και ανανεώνονταν δύο φορές την εβδομάδα. Μετά το πέρας της καλλιέργειας ακολούθησε χρώση με Alizarin Red (Sigma), η οποία βάφει τα οστεοκύτταρα, με την ακόλουθη διαδικασία: Απομάκρυνση θρεπτικού υλικού από τις οπές και ξέπλυμα της επιφάνειας των οπών με PBS. Μονιμοποίηση με 10% φορμαλδεΰδη για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και διπλό ξέπλυμα με ddh 2 O (double-distilled). Χρώση με 2% Alizarin Red σε ddh 2 O, ph για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και διπλό ξέπλυμα με PBS. Στη συνέχεια, τα κύτταρα παρατηρήθηκαν στο μικροσκόπιο και φωτογραφήθηκαν. 47

48 Συλλογή και συμπύκνωση υπερκειμένου από καλλιέργειες MSCs Η συλλογή υπερκειμένου (supernatant, sup) πραγματοποιήθηκε από καλλιέργειες μεσεγχυματικών στρωματικών κυττάρων, τα οποία προηγουμένως είχαν ταυτοποιηθεί τόσο με κυτταρομετρία ροής όσο και με in vitro διαφοροποίηση προς οστεοκύτταρα και λιποκύτταρα. Σε καλλιέργειες κυττάρων MSCs, οι οποίες είχαν καλύψει το 90% της επιφάνειας του τρυβλίου, αλλάχθηκε το θρεπτικό μέσο και 24 ώρες μετά συλλέχθηκε το υπερκείμενο. Έπειτα από διήθησή του από ηθμό με πόρους 100 μm, τοποθετήθηκε σε ειδικά συστήματα συμπύκνωσης των 12 ml (Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Devices- Millipore). Ακολούθησε συμπύκνωση του υπερκειμένου με φυγοκέντρηση στους 4 o C για 90 στις 5000 rpm, και το συμπυκνωμένο υπερκείμενο συλλέχθηκε, ογκομετρήθηκε και φυλάχθηκε στους -80 ο C. Με την παραπάνω διαδικασία επιτυγχάνεται συμπύκνωση 70 έως 80 φορές, οπότε μετά τη φυγοκέντρηση συλλέχθηκαν από κάθε σύστημα περίπου 120 μl συμπυκνωμένου υπερκειμένου. Μετά την απομάκρυνση του υπερκειμένου από τις καλλιέργειες, τα MSCs αποκολλήθηκαν και συλλέχθηκαν από τα τρυβλία ακολουθώντας τη διαδικασία που περιγράφηκε παραπάνω. Ακολούθησε μέτρηση των κυττάρων έπειτα από χρώση με Trypan Blue και προσδιορίστηκε ο ολικός τους αριθμός, ώστε να είναι γνωστή η αναλογία του αριθμού MSCs προς τον όγκο συμπυκνωμένου υπερκειμένου που προέκυψε από αυτά. Παραγωγή του φορέα prscpgwpre 1. Μετασχηματισμός βακτηρίων με τα πλασμίδια και απομόνωση πλασμιδιακού DNA σε μικρή κλίμακα Το στέλεχος TOP10 (One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli- Invitrogen ) της E.coli μετασχηματίστηκε με τα βοηθητικά πλασμίδια pml3, pmd2.g και τον GFP-φορέα και ακολούθησε απομόνωση πλασμιδιακού DNA σε μικρή κλίμακα. Τα βοηθητικά πλασμίδια παραχωρήθηκαν από τον Dr Dave Emery (University of Washington, Seattle, WA), ενώ ο GFP-φορέας από τον Dr Hans-Peter Kiem (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA). Για το μετασχηματισμό ακολουθήθηκε η παρακάτω διαδικασία: Προσθήκη 100 ng/μl πλασμιδιακού DNA σε 25 μl του στελέχους TOP10. Επώαση για 30 λεπτά σε πάγο. Έκθεση των βακτηρίων σε θερμικό σοκ στους 42 o C για 30 δευτερόλεπτα. 48

49 Επώαση των βακτηρίων για 2 λεπτά σε πάγο. Προσθήκη 900 μl S.O.C medium (2% τρυπτόνη, 0.5% εκχύλισμα ζύμης, 10 mm NaCl, 2.5 mm KCl, 10 mm MgCl 2, 10 mm MgSO 4, 20 mm γλυκόζη Invitrogen) για επίτευξη της μέγιστης μετασχηματικής ικανότητας των βακτηρίων. Επώαση των βακτηρίων για 1 ώρα σε επωαστικό κλίβανο (37 o C, 225 rpm). Επίστρωση 100 μl βακτηρίων σε τρυβλία Petri που περιέχουν θρεπτικό υπόστρωμα LB (Luria-Bertani Medium) και άγαρ (10 g/l τρυπτόνη, 5 g/l εκχύλισμα ζύμης, 10 g/l NaCl, 15 g/l άγαρ), εμπλουτισμένο με καρβενικιλλίνη σε συγκέντρωση 100 μg/ml και επώαση στους 37 o C για 18 ώρες. Παρουσία της καρβενικιλλίνης μπορούν να αναπτυχθούν μόνο τα μετασχηματισμένα βακτηρία, καθώς τα πλασμίδια φέρουν γονίδιο που τους προσδίδει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό. Μετά το πέρας των 18 ωρών, έγινε επιλογή δύο αποικιών από κάθε τριβλίο και η κάθε μία τοποθετήθηκε σε 2 ml υγρού LB (10 g/l τρυπτόνη, 10 g/l NaCl, 5 g/l εκχύλισμα ζύμης) παρουσία καρβενικιλλίνης σε συγκέντρωση 100 μg/ml. Οι υγρές καλλιέργειες επωάστηκαν για άλλες 18 ώρες στους 37 o C (προκαλλιέργειες). Ακολούθησε απομόνωση πλασμιδιακού DNA σε μικρή κλίμακα με τη χρήση του εμπορικού πρωτοκόλλου ChargeSwitch - Pro Plasmid Miniprep (Invitrogen), που περιλαμβάνει τα παρακάτω στάδια: Φυγοκέντρηση 1 ml προκαλλιέργειας στις rpm για 5. Η υπόλοιπη καλλιέργεια (1 ml) φυλάχτηκε στους 4 o C για απομόνωση πλασμιδιακού DNA σε μεγάλη κλίμακα, όπως θα αναφερθεί παρακάτω. Απομάκρυνση υπερκειμένου και επαναδιάλυση της βακτηριακής πελέτας με 250 μl ρυθμιστικού διαλύματος επαναιώρησης που περιέχει RNάση Α (Resuspension Buffer premixed with RNase A). Προσθήκη 250 μl ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (Lysis Buffer) και επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά. Προσθήκη 250 μl ρυθμιστικού διαλύματος κατακρήμνισης (Precipitation Buffer) και καλή ανάδευση έως ότου εμφανιστεί ένα λευκό ίζημα. Φυγοκέντρηση στις rpm για 10 ώστε να απομακρυνθεί τυχόν ίζημα και μεταφορά του υπερκειμένου σε σωληνάρια συλλογής (collection tubes) που περιέχουν τις ChargeSwitch - Pro Miniprep στήλες. Οι στήλες αυτές φέρουν μεμβράνες πυριτίου που είναι θετικά φορτισμένες, με αποτέλεσμα να προσδεθεί σε αυτές το αρνητικά φορτισμένο πλασμιδιακό DNA και να επιτευχθεί ο καθαρισμός του. 49

50 Φυγοκέντρηση των σωληναρίων στις rpm για 1 λεπτό, αφαίρεση της στήλης από το σωληνάριο, απομάκρυνση του περιεχομένου και επανατοποθέτηση της στήλης. Προσθήκη 750 μl ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης 1 (Wash buffer 1) στη στήλη και φυγοκέντρηση στις rpm για 1 λεπτό. Aφαίρεση της στήλης από το σωληνάριο, απομάκρυνση του περιεχομένου και επανατοποθέτηση της στήλης. Προσθήκη 250 μl ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης 2 (Wash buffer 2) στην στήλη και φυγοκέντρηση στις rpm για 1 λεπτό. Αφαίρεση της στήλης από το σωληνάριο και τοποθέτηση σε σωληνάριο έκλουσης (Elution tubes). Προσθήκη 50 μl ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης (Elution buffer) στη στήλη και φυγοκέντρηση στις rpm για 1 λεπτό. Αφαίρεση της στήλης από το σωληνάριο, συλλογή του εκλούσματος, επανατοποθέτηση της στήλης και μεταφορά του εκλούσματος σε αυτήν. Φυγοκέντρηση ξανά στις rpm για 1 λεπτό. Με την επανάληψη του σταδίου αυτού επιτυγχάνεται η μέγιστη ανάκτηση καθαρού πλασμιδιακού DNA. Απομάκρυνση της στήλης και συλλογή εκλούσματος που φέρει το πλασμιδιακό DNA. Η συγκέντρωση και η καθαρότητα του DNA προσδιορίστηκαν φασματοφωτομετρικά. Συγκεκριμένα, η συγκέντρωση του DNA προσδιορίστηκε βάση της απορρόφησης του δείγματος στα 260 nm και του νόμου του Lambert-Beer, A=e c l, όπου Α: η απορρόφηση στα 260 nm, e: ο συντελεστής απόσβεσης DNA ίσος με 20, c: η συγκέντρωση του DNA (μg /ml), λ: το μήκος της κυψελίδας σε cm. Η καθαρότητα του DNA προσδιορίστηκε βάσει του λόγου OD 260nm /OD 280nm, με βέλτιστη τιμή Απομόνωση πλασμιδιακού DNA σε μεγάλη κλίμακα Η περίσσεια της προκαλλιέργειας (1 ml) τοποθετήθηκε σε 500 ml υγρού LB εμπλουτιμένο με καρβενικιλλίνη σε συγκέντρωση 100 μg/ml και επωάστηκε στους 37 o C, 225 rpm, ώρες. Η απομόνωση του DNA έγινε με τη χρήση του εμπορικού πρωτοκόλλου PureLink HiPure Plasmid DNA Maxiprep (Invitrogen), το οποίο περιλαμβάνει τα παρακάτω στάδια: Εξισορρόπηση της κολώνας PureLink HiPure Filter Maxi Column με 30ml ρυθμιστικού διαλύματος εξισορρόπησης (Equilibration Buffer). Φυγοκέντρηση της καλλιέργειας στις 5000 rpm, 10 λεπτά και απομάκρυνση του υπερκειμένου. Ένα μικρό μέρος της καλλιέργειας πριν τη φυγοκέντρηση τοποθετείται σε 50% γλυκερόλη (glycerol stock) και φυλάσσεται στους -80 o C. 50

51 Επαναδιάλυση της βακτηριακής πελέτας με 20 ml ρυθμιστικoύ διαλύματος επαναιώρησης που περιέχει RNάση Α (Resuspension Buffer). Προσθήκη 20 ml ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (Lysis Buffer) και επώαση για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Προσθήκη 20 ml ρυθμιστικού διαλύματος κατακρήμνισης (Precipitation Buffer) και καλή ανάδευση έως ότου το μείγμα γίνει πλήρως ομοιογενές. Μεταφορά του μείγματος στην κολώνα. Η κολώνα φέρει θετικά μικροσφαιρίδια ρητίνης πάνω στα οποία προσδένεται το αρνητικά φορτισμένο πλασμιδιακό DNA. Αφήνουμε το μείγμα να περάσει από την κολώνα με τη ροή της βαρύτητας. Πλύση της κολώνας (δύο διαδοχικές) προσθέτοντας 10 ml και 50 ml ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης (Wash buffer) ώστε να απομακρυνθούν τα RNA, οι πρωτεΐνες και να επιτευχθεί η μέγιστη καθαρότητα του DNA. Τοποθέτηση ενός 50 ml σωληναρίου κάτω από την κολώνα, προσθήκη 15 ml ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης (Elution buffer) και συλλογή του εκλούσματος με τη ροή της βαρύτητας. Προσθήκη 10,5 ml ισοπροπανόλης στο έκλουσμα και φυγοκέντρηση στις 5000 rpm, 1 ώρα, 4 o C για κατακρήμνιση του DNA. Απομάκρυνση του υπερκειμένου, επαναδιάλυση του DNA ιζήματος σε 400 μl ρυθμιστικού διαλύματος TE (Tris-EDTA) και μεταφορά σε σωληνάριο eppendorf. Προσθήκη 1/10 του όγκου οξικό νάτριο και δύο όγκους 100% αιθανόλης και τοποθέτηση στους -20 o C για 10 λεπτά. Φυγοκέντρηση στις rpm, 10 λεπτά, 4 o C, απομάκρυνση του υπερκειμένου και πλύση της πελέτας με 70% αιθανόλη. Επαναδιάλυση του ιζήματος με 400 μl ρυθμιστικού διαλύματος TE και φύλαξη στους -80 o C. Η συγκέντρωση και η καθαρότητα του DNA προσδιορίστηκαν φασματοφωτομετρικά, όπως περιγράφηκε παραπάνω. 51

52 3. Πέψη του πλασμιδιακού DNA με ένζυμα περιορισμού Για να διασφαλιστεί ότι οι διαδικασίες μετασχηματισμού των βακτηρίων με το εκάστοτε πλασμίδιο (pml3, pmd2.g, GFP-φορέας) και απομόνωσης πλασμιδιακού DNA ήταν επιτυχής, ακολούθησε πέψη των πλασμιδιακών DNA με ένζυμα περιορισμού. Για την επιλογή των ενζύμων περιορισμού χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα Μοριακής Βιολογίας Serial Cloner (Εικ.11), το οποίο παρέχει εργαλεία ανάλυσης αλληλουχιών, όπως αυτό της εικονικής πέψης αλληλουχιών με επιλεγμένα ένζυμα περιορισμού (virtual cutter). Εικόνα 11 : Το πρόγραμμα Serial Cloner. Μετά από εισαγωγή της αλληλουχίας του κάθε πλασμιδίου (pml3, pmd2.g, GFP-φορέα) στο Serial Cloner, επιλέχθηκε το ένζυμο περιορισμού ή το ζευγάρι των ενζύμων και εξήχθησαν οι αναμενόμενες ζώνες μετά από κάθε πέψη (Εικ.12). Σε κάθε αντίδραση πέψης χρησιμοποιήθηκαν 5 units/ μl ενζύμου (EcoRI, BamHI Invitrogen) και 0,5 μg πλασμιδιακού DNA. Τα προϊόντα της πέψης ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 0,8% παρουσία του δείκτη μεγέθους λhindiii (Fermentas Lamda DNA/HindIII, Thermo Scientific) και η χρώση του πηκτώματος έγινε με τη φθορίζουσα χρωστική SYBR Green (Invitrogen). Η αναγνώριση των ζωνών DNA έγινε με παρατήρηση στο υπεριώδες φως (260nm). 52

53 Εικόνα 12: Αναμενόμενες ζώνες από την πέψη των πλασμιδίων pmd2.g, pml3 και του GFP-φορέα. 4. Διαμόλυνση της κυτταρικής σειράς 293Τ με τα πλασμίδια Για τη συναρμολόγηση των ιικών σωματίων, χρησιμοποιήθηκε η κυτταρική σειρά πακεταρίσματος 293T (American Type Culture Collection, ATCC). Η διαμόλυνση (transfection) της κυτταρικής σειράς με τον ιικό φορέα περιλαμβάνει τα παρακάτω στάδια: Ημέρα 1: Επίστρωση Τ κυττάρων σε φλάσκα Τ-75 (75 cm 2 εμβαδό επιφάνειας ανάπτυξης, BD) παρουσία εμπλουτισμένου Dulbecco's Modified Eagle θρεπτικού μέσου (DMEM, 10% FBS, 100 U/ml πενικιλίνη / 100 μg/ml στρεπτομυκίνη, 2 mm L-γλουταμίνη, Gibco) και επώαση σε υγρό περιβάλλον 37 o C, 5% CO 2 για 24 ώρες. Ημέρα 2 : Αποκόλληση των προσκολλημένων κυττάρων με θρυψίνη (0.05% trypsin-edta, Gibco) και ανακαλλιέργεια σε τρεις Τ-75 φλάσκες, στους 37 o C, 5% CO 2 για 24 ώρες. Ημέρα 3: Αποκόλληση των προσκολλημένων κυττάρων με θρυψίνη και ανακαλλιέργεια σε πέντε SOLO φλάσκες (185 cm 2 εμβαδό επιφάνειας ανάπτυξης, Thermo Scientific) στους 37 o C, 5% CO 2 για 72 ώρες. Ημέρα 6 : Επίστρωση τρυβλίων των 100 mm (tissue culture treated, Corning) με ρυθμιστικό διάλυμα επικάλυψης (coating buffer - 1% διάλυμα ζελατίνης, PBS και poly-l-λυσίνη, Sigma) το οποίο διηθήται από φίλτρο με πόρους 0.22 μm (filter unit 0.22 µm, PES Membrane- Corning). Σε 53

54 κάθε τρυβλίο προστίθεται τόση ποσότητα διαλύματος ώστε να επικαλύψει όλη την επιφάνεια ανάπτυξης και στη συνέχεια αναρροφάται. Το διάλυμα αυτό αυξάνει την προσκόλληση των κυττάρων στην επιφάνεια ανάπτυξης των τρυβλίων. Ακολουθεί αποκόλληση των 293Τ κυττάρων από τις SOLO φλάσκες με τη χρήση θρυψίνης (με την ίδια διαδικασία που περιγράφηκε και για τα MSCs) και μέτρηση με τη χρωστική Trypan Blue. Επίστρωση κυττάρων ανά τρυβλίο σε 10 ml εμπλουτισμένου DMEM και επώαση στους 37 o C, 5% CO 2 για 24 ώρες. Ημέρα 7: Απομάκρυνση του θρεπτικού μέσου από τα τρυβλία και προσθήκη νέου (7 ml/τρυβλίο) περίπου 4 ώρες πριν από τη διαμόλυνση. Η είσοδος των πλασμιδίων στα 293Τ κύτταρα επιτυγχάνεται με χημικό τρόπο (chemical transfection) χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικά διαλύματα: Διάλυμα Α (ποσότητες/τρυβλίο σε όγκο 500 μl) 250 mm CaCl 2 10 μg GFP-φορέας 6.5 μg pml3 6 μg pmd2.g ddh 2 O Διάλυμα B (ποσότητες/τρυβλίο σε όγκο 500 μl) 28 mm NaCl 100 mm Hepes Saline 1.5 mm Na 2 HPO 4 Φυσιολογικός ορός ph =7.12 Το διάλυμα Β προστίθεται στο διάλυμα Α με ταυτόχρονη ανάδευση του τελευταίου και στη συνέχεια μεταφέρεται σταγόνα-σταγόνα στα τρυβλίο με τα 293Τ κύτταρα. Κατά την ανάμειξη αυτή δημιουργούνται κρύσταλλοι φωσφορικού ασβεστίου οι οποίοι παρασέρνουν τα πλασμίδια, με αποτέλεσμα να επικάθονται και εν συνεχεία να εγκολπώνονται από τα κύτταρα. Τα τρυβλία επωάζονται στους 37 o C, 5% CO 2 για 16 έως 18 ώρες. Ημέρα 8: Απομάκρυνση του θρεπτικού μέσου από τα τρυβλία, ώστε να απομακρυνθούν τα πλασμίδια που δεν εγκολπώθηκαν από τα κύτταρα και προσθήκη φρέσκου εμπλουτισμένου DMEM (10 ml/τρυβλίο). Επώαση των τρυβλίων στους 37 o C, 5% CO 2 για 24 ώρες. Ημέρα 9: Πρώτη συλλογή του υπερκειμένου από τα τρυβλία (harvest 1) στο οποίο περιέχονται τα συναρμολογημένα ιικά σωμάτια. Το υπερκείμενο διηθήται από φίλτρο με πόρους 0.22 μm και φυλάσσεται στους 4 o C. Στα τρυβλία προστίθονται 10 ml φρέσκου εμπλουτισμένου DMEM και επωάζονται στους 37 o C, 5% CO 2 για 24 ώρες. Ημέρα 10: Δεύτερη συλλογή του υπερκειμένου από τα τρυβλία (harvest 2) και διήθησή του, όπως προηγουμένως. Τα δύο harvests αναμειγνύονται, τοποθετούνται σε δοχεία φυγοκέντρησης (centrifuge buckets, Corning) και συμπυκνώνονται με φυγοκέντρηση στις 5000 rpm, 18 έως 20 ώρες, 4 o C. 54

55 Πριν τοποθετηθεί το υπερκείμενο για φυγοκέντρηση, φυλάσσουμε 2 ml μη συμπυκνωμένου ιού (crude) στους -80 o C για την διαδικασία της τιτλοδότησης του ιού. Ημέρα 11: Απομάκρυνση του υπερκειμένου και ανασύσταση του ιικού ιζήματος με εμπλουτισμένο DMEM. Η ανασύσταση γίνεται με τέτοιον τρόπο ώστε να επιτευχθεί συμπύκνωση του ιού χίλιες φορές. Για παράδειγμα, αν ο όγκος του υπερκειμένου πριν τη φυγοκέντρηση ήταν 1 λίτρο, η ανασύσταση γίνεται σε 1 ml θρεπτικό. Μετά την ανασύσταση ακολουθεί φυγοκέντρηση στους 4 o C για 5 λεπτά στις 1100 rpm, ώστε να απομακρυνθούν ως ίζημα τυχόν υπολείμματα κυττάρων. Το υπερκείμενο μοιράζεται ανά 100 μl σε φιαλίδια (cryogenic vials, Corning) και φυλάσσεται στους -80 o C. 5. Τιτλοδότηση του ιικού φορέα Για την τιτλοδότηση (titration) του ιικού φορέα χρησιμοποιήθηκε η κυτταρική σειρά HeLa (American Type Culture Collection, ATCC). Η διαδικασία αυτή μας επιτρέπει να ανιχνεύσουμε τον αριθμό των ιικών σωμάτιων που περιέχονται ανά ml (Infectious Units per ml, IU/ml) συμπυκνωμένου εναιώρηματος. Η τιτλοδότηση περιλαμβάνει τα παρακάτω στάδια: Ημέρα 1: Επίστρωση HeLa κυττάρων σε φλάσκα Τ-75 παρουσία εμπλουτισμένου DMEM και επώαση στους 37 o C, 5% CO 2 για 24 ώρες. Ημέρα 3 : Αποκόλληση των προσκολλημένων κυττάρων με θρυψίνη (0.05% trypsin-edta), ανακαλλιέργεια σε πέντε Τ-75 φλάσκες και επώαση στους 37 o C, 5% CO 2 για 72 ώρες. Ημέρα 6: Αποκόλληση των HeLa κυττάρων από τις T-75 φλάσκες με θρυψίνη και μέτρηση των κυττάρων με τη χρωστική Trypan Blue. Επίστρωση κυττάρων ανά οπή σε τρία πιάτα των 6- οπών: - στο πρώτο πιάτο επιστρώνονται τέσσερις οπές και στα κύτταρα αυτά δεν πραγματοποιείται διαμόλυνση (control plate). - στο δεύτερο πιάτο επιστρώνονται τρεις οπές και τα κύτταρα αυτά διαμολύνονται με τρεις διαδοχικές αραιώσεις του μη συμπυκνωμένου ιού. - στο τρίτο πιάτο επιστρώνονται πέντε οπές και τα κύτταρα αυτά διαμολύνονται με διαδοχικές αραιώσεις του συμπυκνωμένου ιού. Επώαση των πιάτων στους 37 o C, 5% CO 2 για 24 ώρες. Ημέρα 7: Αποκόλληση των κυττάρων από δύο οπές του πιάτου control με θρυψίνη και μέτρηση με Trypan Blue. Ο μέσος όρος των κυττάρων θα πρέπει να είναι μεταξύ και ο αριθμός αυτός χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό του τίτλου του ιού. Για τη διαμόλυνση (trans- 55

56 duction) με το μη συμπυκνωμένο και συμπυκνωμένο ιό ετοιμάζονται οι αραιώσεις, όπως φαίνονται στους Πίνακα 4 και 5 αντίστοιχα. Πίνακας 4: Διαδοχικές αραιώσεις του μη συμπυκνωμένου ιού. Αραίωση 1:3 1:9 1:27 Ποσότητα ιού (μl) Εμπλουτισμένο DMEM (μl) Τελικός όγκος (μl) Πίνακας 5: Διαδοχικές αραιώσεις του συμπυκνωμένου ιού. Αραίωση 1:100 1:500 1:1250 1:5000 1:12500 Ποσότητα ιού (μl) Εμπλουτισμένο DMEM (μl) Τελικός όγκος (μl) Από κάθε οπή απομακρύνθηκε το υπερκείμενο και προστέθηκαν 500 μl από την αντίστοιχη αραίωση του συμπυκνωμένου και μη ιού και 500 μl εμπλουτισμένου DMEM παρουσία θειϊκής πρωταμίνης (protamine sulfate) σε συγκέντρωση 8 μg/ml, η οποία ενισχύει τη διαμόλυνση των κυττάρων. Στο πιάτο control, όπου τα κύτταρα δεν υπόκεινται σε διαμόλυνση, προστέθηκαν 500 μl εμπλουτισμένου DMEM παρουσία θειικής πρωταμίνης και 500 μl εμπλουτισμένου DMEM. Τα πιάτα επωάζονται στους 37 o C, 5% CO 2 για 24 ώρες. Ημέρα 8: Αφαίρεση του θρεπτικού μέσου από τις οπές, ώστε να απομακρυνθούν τα ιικά σωμάτια που δεν εγκολπώθηκαν από τα κύτταρα και προσθήκη φρέσκου εμπλουτισμένου DMEM (2 ml/οπή). Επώαση των πιάτων στους 37 o C, 5% CO 2 για 48 ώρες. Ημέρα 10: Αποκόλληση των κυττάρων από τις οπές με θρυψίνη και ανίχνευση της έκφρασης της GFP πρωτεΐνης ανά αραίωση, με κυτταρομετρία ροής. Ο τίτλος του ιού σε ιικά σωματίδια /ml ανά αραίωση υπολογίζεται από τον τύπο: Τίτλος ιού (IU/ml) = GFP% Αραίωση κύτταρα που μετρήθηκαν την ημέρα 7 Για τον υπολογισμό του τελικού τίτλου, προσθέτουμε τους τίτλους που προέκυψαν από τις πέντε αραιώσεις του συμπυκνωμένου ιού και υπολογίζουμε το μέσο όρο τους. Ο τίτλος του ιικού φορέα θα πρέπει να είναι > IU/ml, ώστε να διαμολύνει αποδοτικά τα κύτταρα-στόχος. 56

57 % διαμολυσμένα κύττταρα Προσδιορισμός της απαιτούμενης ποσότητας ιικού φορέα για διαμόλυνση κυττάρων και πολλαπλότητα διαμόλυνσης Ο όγκος ιικού φορέα που απαιτείται για τη διαμόλυνση των κυττάρων-στόχων εξαρτάται από τρεις διαφορετικές παραμέτρους: τον τίτλο του ιικού φορέα τον αριθμό κυττάρων προς διαμόλυνση την πολλαπλότητα διαμόλυνσης (Multiplicity of Infection, MOI) και προσδιορίζεται από τον παρακάτω τύπο: V ιού = MOI Αριθμός κυττάρων / τίτλος ιού (IU/ml) Η πολλαπλότητα διαμόλυνσης ορίζεται ως ο λόγος ιικών σωματίων ανά κύτταρο-στόχο. Πιο συγκεκριμένα, αν η πολλαπλότητα διαμόλυνσης είναι 30 τότε κάθε κύτταρο-στόχος θα προσβληθεί από 30 ιικά σωμάτια. Επομένως, η πιθανότητα να διαμολυνθούν περισσότερα κύτταρα αυξάνεται όσο μεγαλώνει το MOI μέχρι ένα σημείο κορεσμού (Εικ.13), όπου τα κύτταρα δεν μπορούν να ενσωματώσουν παραπάνω ιικά αντίγραφα. Εικόνα 13: Επίδραση της πολλαπλότητας διαμόλυνσης στην διαμόλυνση των κυττάρων ( 57

58 Απομόνωση αιμοποιητικών κυττάρων από το μυελό των οστών Τα ολικά κύτταρα μυελού των οστών απομονώθηκαν από τα μηριαία οστά και τις κνήμες C57 ή PepBoy ποντικών (ανάλογα με τον εκάστοτε πειραματικό σχεδιασμό) με έγχυση στα οστά IMDM (Iscove s Modified Dulbecco s Medium, Gibco) θρεπτικού μέσου εμπλουτισμένο με 20% FBS. Ακολούθησε διάλυση των συσσωματωμάτων των κυττάρων (single cell suspension) με τη χρήση σύριγγας με βελόνα 21 Gauge και το εναιώρημα των κυττάρων διηθήθηκε με ηθμό πόρων 70 μm (BD strainers). Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στους 4 ο C για 10 στα 400 g και απομακρύνθηκε το υπερκείμενο. Ακολούθησε λύση των ερυθρών κυττάρων με προσθήκη υποτονικού διαλύματος χλωριούχου αμμωνίου στο ίζημα για 5 και έπειτα φυγοκέντρηση στους 4 ο C για 10 στα 400 g. Η επαναδιάλυση του κυτταρικού ιζήματος έγινε με εμπλουτισμένο IMDM (10% FBS, 100 U/ml πενικιλίνη / 100 μg/ml στρεπτομυκίνη) και τα κύτταρα μετρήθηκαν σε αιμοκυτταρόμετρο Neubauer κατόπιν χρώσης με Trypan Blue. Διαμόλυνση μυελού των οστών με τον GFP φορέα Τα αιμοποιητικά κύτταρα ενεργοποιήθηκαν (pre-stimulation) σε καλλιέργεια παρουσία αυξητικών παραγόντων (mil3: 10 ng/ml, mscf: 50 ng/ml, hflt3: 10 ng/ml, R&D Systems) και /ml από αυτά επιστρώθηκαν σε πιάτα των 6-οπών (0,1-0,3x10 6 κύτταρα/cm 2 ). Ακολούθησε επώαση σε υγρό περιβάλλον 37 o C, 5% CO 2 για 18ώρες και στη συνέχεια αποκόλληση με PBS και συλλογή των κυττάρων. Έπειτα από φυγοκέντρηση στους 4 o C για 10 στα 300 g, το κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε σε εμπλουτισμένο IMDM (10% FBS, 100 U/ml πενικιλίνη / 100 μg/ml στρεπτομυκίνη) και τα κύτταρα μετρήθηκαν σε αιμοκυτταρόμετρο Neubauer κατόπιν χρώσης με Trypan Blue. Στο θρεπτικό μέσο διαμόλυνσης, πέρα από τους αυξητικούς παράγοντες (mil3: 10 ng/ml, mscf: 50 ng/ml, hflt3: 10 ng/ml), προστέθηκε και η θειϊκή πρωταμίνη (protamine sulfate) σε τελική συγκέντρωση 4 μg/ml. Ανάλογα με τον αριθμό των προς διαμόλυνση κυττάρων, την πολλαπλότητα διαμόλυνσης και τον τίτλο του εκάστοτε ιού, προστέθηκε και η απαιτούμενη ποσότητα από τον ιικό φορέα. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πιάτα των 6-οπών (0,1-0, κύτταρα /cm 2 ) σε τελικό αριθμό /ml. Πριν την επίστρωση των κυττάρων, είχε προηγηθεί επικάλυψη των οπών με RetroNectin (Takara), μια ανασυνδυασμένη ανθρώπινη φιμπρονεκτίνη που ενισχύει τη διαδικασία της διαμόλυνσης, σε τελική συγκέντρωση 2 μg/cm 2. Ως ομάδα ελέγχου (control) για τη διαμόλυνση, επιστρώθηκαν κύτταρα με τον ίδιο τρόπο, απουσία του ιού. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε υγρό περιβάλλον 37 o C, 5% CO 2 για 24 ώρες. Να σημειωθεί ότι η 58

59 διαμόλυνση πραγματοποιήθηκε σε δύο δόσεις, αρχικά προστέθηκε ο μισός όγκος ιού και έπειτα από 8 ώρες ο υπόλοιπος, για επίτευξη καλύτερης γονιδιακής μεταφοράς. Μετά το πέρας των 24 ωρών, τα κύτταρα συλλέχθηκαν από τα πιάτα με διαδοχικά πλυσίματα της επιφανείας τον οπών με PBS. Ακολούθησε φυγοκέντρηση στους 4 o C για 10 στα 300g, τα κύτταρα επαναδιαλύθηκαν σε PBS και υπολογίστηκε ο αριθμός τους έπειτα από μέτρηση σε αιμοκυτταρόμετρο Neubauer, κατόπιν χρώσης με Trypan Blue. Ο κύριος όγκος των κυττάρων προετοιμάστηκε για χορήγηση στα ποντίκια-δέκτες ( κύτταρα ανά δέκτη σε τελικό όγκο 1 ml PBS), ένα μέρος αυτών ( κύτταρα) επιστρώθηκε σε ημιστερεό μέσο μεθυλοκυτταρίνης και περίπου 0.5x10 6 κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής ως προς την έκφραση της GFP πρωτεΐνης, για να εκτιμηθεί το ποσοστό γονιδιακής μεταφοράς (transduction rate). Αποικίες προγονικών κυττάρων (colony assays) Για να προσδιοριστεί ο απόλυτος αριθμός αρχέγονων και προγονικών κυττάρων που περιέχονταν στα αιμοποιητικά κύτταρα έπειτα από τη διαμόλυνση, κύτταρα σε τελικό όγκο 300 μl IMDM + 2% FBS προστέθηκαν σε 3,3 ml ημιστερεού μέσου μεθυλοκυτταρίνης (MethoCult#3134, Stem cell Technologies), το οποίο αποτελείται από: 40% methylcellulose 30% FBS 100 U/ml πενικιλίνη / 100 μg/ml στρεπτομυκίνη 2 mm L-γλουταμίνη 1% Bovine Serum Albumin (Stem Cell Technologies) 20 ng/ml mil-3 50 ng/ml mscf M 2-μερκαπτοαιθανόλη IMDM Τα κύτταρα με το θρεπτικό μέσο επιστρώθηκαν εις διπλούν σε τριβλία κυτταροκαλλιέργειας εναιωρήματος διαμέτρου 35 mm (Corning) και οι καλλιέργειες επωάστηκαν σε υγρό περιβάλλον 37 o C, 5% CO 2 για 8-10 μέρες. Μετά το πέρας του συγκεκριμένου χρονικού διαστήματος, πραγματοποιήθηκε καταμέτρηση των αποικιών και μέρος αυτών συλλέχθηκε για τον προσδιορισμό του ποσοστού γονιδιακής μεταφοράς με κυτταρομετρία ροής. 59

60 Συγκαλλιέργεια αιμοποιητικών κυττάρων με MSCs Καλλιέργειες MSCs, που επικάλυπταν το 90% της περιοχής ανάπτυξης του τριβλίου, ακτινοβολήθηκαν στα 2000 rads για να σταματήσει ο πολλαπλασιασμός τους και το υπερκείμενο των καλλιεργειών αφαιρέθηκε. Αιμοποιητικά κύτταρα που απομονώθηκαν από C57 ή Pepboy δότες προστέθηκαν σε αναλογία 1:10 (1 MSC:10 αιμοποιητικά κύτταρα) σε θρεπτικό μέσο καλλιέργειας MSCs και τα κύτταρα συγκαλλιεργήθηκαν για 48 ώρες σε υγρό περιβάλλον 37 o C, 5% CO 2. Στη συνέχεια, συλλέχθηκαν τα μη προσκολλημένα αιμοποιητικά κύτταρα με πλύσεις της επιφάνειας των τρυβλίων με PBS, προσέχοντας να μην αποκολληθούν τα προσκολλημένα MSCs. Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στους 4 o C για 10 στα 300 g, το κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε σε IMDM+2% FBS και προσδιορίστηκε ο αριθμός των κυττάρων έπειτα από χρώση με Trypan Blue. Στην περίπτωση των αιμοποιητικών κυττάρων που θα υπόκεινταν σε διαμόλυνση, η διαδικασία της ενεργοποίησης έγινε πάνω σε στρώμα MSCs (MSCs layer). Όπως και παραπάνω, καλλιέργειες MSCs που επικάλυπταν το 90% της περιοχής ανάπτυξης του τρυβλίου, ακτινοβολήθηκαν στα 2000 rads. Αιμοποιητικά κύτταρα προστέθηκαν σε αναλογία 1:10 (1 MSC:10 αιμοποιητικά κύτταρα) σε θρεπτικό μέσο ενεργοποίησης και τα κύτταρα συγκαλλιεργήθηκαν για 48 ώρες σε υγρό περιβάλλον 37 o C, 5% CO 2. Στη συνέχεια, ακολουθήθηκαν δύο διαφορετικές διαδικασίες. Στην πρώτη, συλλέχθηκαν τα μη προσκολλημένα κύτταρα (όπως και παραπάνω) και επιστρώθηκαν σε retronectin, όπου πραγματοποιήθηκε η διαμόλυνση. Στη δεύτερη περίπτωση, συλλέχθηκαν όλα τα κύτταρα, προσκολλημένα και μη (δηλαδή μεσεγχυματικά και αιμοποιητικά κύτταρα) και ακολούθησε μαγνητικός διαχωρισμός των κυττάρων με το αντίσωμα CD45 (mouse CD45 Microbeads kit, Miltenyi Biotec). Τα CD45+ κύτταρα (αιμοποιητικά) επιστρώθηκαν σε retronectin και πραγματοποιήθηκε η διαμόλυνση. Μετά από 24 ώρες, και στις δύο περιπτώσεις, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν σε αιμοκυτταρόμετρο έπειτα από χρώση με Trypan Blue. Ο κύριος όγκος των κυττάρων μεταμοσχεύθηκε και μεταφέρθηκε ο απαιτούμενος αριθμός στα συστήματα transwell. Έλεγχος της μεταναστευτικής ικανότητας των αιμοποιητικών κυττάρων in vitro Η μεταναστευτική ικανότητα των διαμολυσμένων ή μη αιμοποιητικών κυττάρων, ελέγχθηκε in vitro σε καλλιεργητικά συστήματα transwell (Corning #3421). Τα συστήματα αυτά αποτελούνται από 24 οπές, 12 εκ τις οποίες διαχωρίζονται σε δύο διαμερίσματα μέσω μιας ημιδιαπερατής μεμβράνης με πόρους διαμέτρου 5 μm (inserts) ενώ οι υπόλοιπες 12 λειτουργούν ως μάρτυρες 60

61 (control) και δε φέρουν μεμβράνη (Εικ.14). Στο κάτω διαμέρισμα των οπών αυτών επιστρώνεται ο χημειοτακτικός παράγοντας SDF-1 (stromal-derived factor-1, R&D Systems), παρουσία εμπλουτισμένου IMDM με 2% FBS,σε συγκέντρωση 100 ng/ml. Έπειτα από μία ώρα επώασης του πιάτου με τον SDF-1, αιμοποιητικά κύτταρα σε εμπλουτισμένο IMDM με 2% FBS μεταφέρονται σε όλες τις οπές και ακολουθεί επώαση για 4 ώρες σε υγρό περιβάλλον 37 o C, 5% CO κύτταρα control SDF SDF control ημιδιαπερατή μεμβράνη με πόρους 5μm 100 ng/ml SDF-1 Εικόνα 14: Σχηματική αναπράσταση των καλλιεργητικών συστημάτων transwell. Μετά το πέρας των 4 ωρών, τα κύτταρα συλλέγονται από όλες τις οπές και φυγοκεντρούνται στους 4 o C για 10 στα 300 g. Το υπερκείμενο απομακρύνεται, τα κύτταρα επαναιωρούνται σε 300 μl IMDM + 2% FBS και στη συνέχεια επιστρώνονται σε καλλιέργειες μεθυλοκυτταρίνης. Το ποσοστό της μετανάστευσης των κυττάρων ορίζεται ως ο λόγος: % μετανάστευση = αριθμός αποικιών στον SDF-1 * 100 / αριθμός αποικιών στο control 1. Επίδραση υπερκειμένου καλλιέργειας MSCs στη μεταναστευτική ικανότητα των αιμοποιητικών κυττάρων Η επίδραση του υπερκειμένου από καλλιέργειες MSCs στη μεταναστευτική ικανότητα αιμοποιητικών κυττάρων ελέγχθηκε με transwell καλλιεργητικά συστήματα. Πιο συγκεκριμένα, σε μη επεξεργασμένα αιμοποιητικά κύτταρα προστέθηκαν ποσότητες συμπυκνωμένου υπερκειμένου που αντιστοιχούν σε δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις: α) υπερκείμενο καλλιέργειας 61

62 που αντιστοιχεί σε MSCs (sup 1) και β) σε MSCs (sup 2). Ως ομάδα ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν αιμοποιητικά κύτταρα χωρίς την προσθήκη υπερκειμένου. Επιπλέον, μελετήθηκε η επίδραση του υπερκειμένου και σε διαμολυσμένα αιμοποιητικά κύτταρα. Συγκεκριμένα, αιμοποιητικά κύτταρα απομονώθηκαν, ενεργοποιήθηκαν σε καλλιέργεια και διαμολύνθηκαν με τον GFP-φορέα. Στη συνέχεια, τοποθετήθηκαν στα συστήματα transwell όπως και παραπάνω. Ο πειραματικός σχεδιασμός ήταν ο ακόλουθος: Ομάδα I Ομάδα II Ομάδα I: ομάδα ελέγχου αιμοποιητικά κύτταρα Ομάδα II: αιμοποιητικά κύτταρα + sup1 Ομάδα III: αιμοποιητικά κύτταρα + sup 2 Ομάδα II Ομάδα III Ομάδα I Ομάδα II Ομάδα III Ομάδα I: ομάδα ελέγχου μη επεξεργασμένα αιμοποιητικά κύτταρα Ομάδα II: μη διαμολυσμένα αιμοποιητικά κύτταρα Ομάδα III: διαμολυσμένα αιμοποιητικά κύτταρα Ομάδα IV: διαμολυσμένα αιμοποιητικά κύτταρα + sup 1 Ομάδα IV Ομάδα V Ομάδα V: διαμολυσμένα αιμοποιητικά κύτταρα + sup 2 62

63 2. Επίδραση των MSCs στη μεταναστευτική ικανότητα των αιμοποιητικών κυττάρων Αιμοποιητικά κύτταρα, διαμολυσμένα ή μη, που προηγουμένως είχαν συγκαλλιεργηθεί με μεσεγχυματικά κύτταρα (παράγραφος Συγκαλλιέργεια αιμοποιητικών κυττάρων και MSCs), μεταφέρθηκαν σε συστήματα transwell για να προσδιοριστεί το ποσοστό της μεταναστευτικής τους ικανότητας. Ο πειραματικός σχεδιασμός ήταν ο ακόλουθος: Ομάδα I Ομάδα I: ομάδα ελέγχου μη επεξεργασμένα αιμοποιητικά κύτταρα Ομάδα II: αιμοποιητικά κύτταρα τα οποία είχαν συγκαλλιεργηθεί με MSCs για 24ώρες σε θρεπτικό MSCs Ομάδα II Ομάδα I Ομάδα II Ομάδα III Ομάδα I: ομάδα ελέγχου μη επεξεργασμένα αιμοποιητικά κύτταρα Ομάδα II: μη διαμολυσμένα αιμοποιητικά κύτταρα Ομάδα III: διαμολυσμένα αιμοποιητικά κύτταρα Ομάδα IV: μη διαμολυσμένα αιμοποιητικά κύτταρα τα οποία ενεργοποιήθηκαν σε στρώμα MSCs Ομάδα IV Ομάδα V Ομάδα V: διαμολυσμένα αιμοποιητικά κύτταρα τα οποία ενεργοποιήθηκαν σε στρώμα MSCs 63

64 Μεταμοσχεύσεις Οι μεταμοσχεύσεις που πραγματοποιήθηκαν ήταν συγγενεϊκές, καθώς δότης (C57 ή Pepboy) και λήπτης (Pepboy αν ο δότης είναι C57 ή το αντίστροφο) είναι συγγενεϊκά είδη. Τα δύο αυτά στελέχη διαφέρουν μεταξύ τους ως προς έναν αλλότυπο του CD45 αντιγόνου (τα C57 εκφράζουν το CD45.2 ενώ τα Pepboy το CD45.1), με αποτέλεσμα να είναι εύκολο να διαχωριστούν τα κύτταρα του δότη στο δέκτη με κυτταρομετρία ροής (Εικ.15). Τα ζώα που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα, ως δότες και ως λήπτες, ήταν ηλικίας 8-10 εβδομάδων. Εικόνα 15: Διαχωρισμός των αιμοποιητικών κυττάρων του δότη στον δέκτη με κυτταρομετρία ροής. Τα κύτταρα χορήγηθηκαν ενδοφλέβια (στην ουρά ή στην οπισθοβολβική φλέβα του οφθαλμού) ή ενδομυελικά στους λήπτες, οι οποίοι προηγουμένως είχαν λάβει το προπαρασκευαστικό σχήμα Busulfan 100 mg/kg. Έπειτα από ένα μήνα μετά τη μεταμόσχευση και κάθε μήνα για τους επόμενους έξι μήνες, πραγματοποιήθηκε έλεγχος της εμφύτευσης των αιμοποιητικών κυττάρων στο δέκτη μέσω αιμοληψίας από την οπισθοβολβική φλέβα του οφθαλμού. Στον έκτο μήνα, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και πραγματοποιήθηκε λήψη αίματος, κυττάρων του μυελού και σπληνός και ακολούθησε έλεγχος της εμφύτευσης με κυτταρομετρία ροής. 64

65 1. Μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρων και MSCs Ως δότες αιμοποιητικών και MSCs κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν C57 ζώα. Τα MSCs ανακαλλιεργήθηκαν τέσσερις φορές και ταυτοποιήθηκαν με κυτταρομετρία ροής και ως προς την ικανότητά τους να διαφοροποιούνται σε οστεοκύτταρα και λιποκύτταρα. Πραγματοποιήθηκαν ενδομυελικές και ενδοφλέβιες συγχορηγήσεις των δύο κυτταρικών πληθυσμών σε λήπτες Pepboy. Στις ενδομυελικές χορηγήσεις, οι λήπτες αναισθητοποιήθηκαν με avertin και η διάνοιξη του οστού έγινε με σύριγγα των 5 ml και βελόνα 25G αιμοποιητικά κύτταρα και MSCs συγχορηγήθηκαν με βελόνα ινσουλίνης σε τελικό όγκο μl. Στις ενδοφλέβιες χορηγήσεις, συγχορηγήθηκαν αιμοποιητικά κύτταρα και MSCs με σύριγγα ινσουλίνης σε τελικό όγκο 1 ml. Οι ομάδες και ο αριθμός ληπτών ανά ομάδα παρουσιάζονται στον Πίνακα 6. Πίνακας 6: Ομάδες και αριθμός ληπτών (ν) ανά ομάδα στις ενδομυελικές χορηγήσεις. Ομάδα I Ομάδα II μη επεξεργασμένος μυελός μη επεξεργασμένος μυελός + MSCs ν=4 ν=8 2. Μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρων και υπερκειμένου καλλιέργειας MSCs Ως δότες αιμοποιητικών κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν GFP ποντίκια, τα οποία εξέφραζαν την GFP πρωτεΐνη σε ποσοστό >90% στα αιμοποιητικά τους κύτταρα. Συμπυκνωμένο υπερκείμενο από καλλιέργειες MSCs (παράγραφος Συλλογή και συμπύκνωση υπερκειμένου) χρησιμοποιήθηκε σε δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις: α) υπερκείμενο που αντιστοιχεί σε MSCs (sup 1) και β) υπερκείμενο που αντιστοιχεί σε MSCs (sup 2). Ως λήπτες χρησιμοποιήθηκαν Pepboy ζώα και ο πειραματικός σχεδιασμός παρουσιάζεται στον Πίνακα 7. 65

66 Πίνακας 7: Ομάδες και αριθμός ληπτών (ν) ανά ομάδα. Ομάδα I Ομάδα II Ομάδα III μη επεξεργασμένος μη επεξεργασμένος μη επεξεργασμένος μυελός μυελός+sup1 μυελός+sup2 ν= 3 ν=5 ν=5 3. Μεταμόσχευση διαμολυσμένων αιμοποιητικών κυττάρων Αιμοποιητικά κύτταρα απομονώθηκαν από C57 δότες, ενεργοποιήθηκαν σε καλλιέργεια και διαμολύνθηκαν με τον GFP-φορέα (παράγραφος Διαμόλυνση αιμοποιητικών κυττάρων) με MOI κύτταρα μεταμοσχεύθηκαν σε Pepboy λήπτες και ο πειραματικός σχεδιασμός παρουσιάζεται στον Πίνακα 8. Πίνακας 8: Σχεδιασμός των ομάδων και αριθμός ληπτών (ν) ανά ομάδα. Ομάδα I Ομάδα II Ομάδα III μη επεξεργασμένος μη διαμολυσμένος μη διαμολυσμένος μυελός μυελός μυελός ν= 3 ν=6 ν=8 4. Μεταμόσχευση διαμολυσμένων αιμοποιητικών κυττάρων με MSCs Αιμοποιητικά κύτταρα απομονώθηκαν από C57 δότες, ενεργοποιήθηκαν σε καλλιέργεια και διαμολύνθηκαν με τον GFP-φορέα (παράγραφος Διαμόλυνση αιμοποιητικών κυττάρων) με MOI κύτταρα μεταμοσχεύθηκαν σε Pepboy λήπτες και ο πειραματικός σχεδιασμός παρουσιάζεται στον Πίνακα 9. Τα MSCs απομονώθηκαν από C57 δότη, ανακαλλιεργήθηκαν 4 φορές, ταυτοποιήθηκαν και κύτταρα χορηγήθηκαν ανά κιλό λήπτη. Η χορήγηση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε ενδοφλέβια σε τελικό όγκο 1ml PBS. 66

67 Πίνακας 9: Σχεδιασμός των ομάδων και αριθμός ληπτών (ν) ανά ομάδα. Ομάδα I Ομάδα II Ομάδα III Ομάδα IV Ομάδα V μη επεξεργασμένος μη επεξεργασμένος μη διαμολυσμένα διαμολυσμένα διαμολυσμένα μυελός μυελός MSCs/kg MSCs/kg ν=3 ν=5 ν=3 ν=5 ν=5 Ανάλυση με κυτταρομετρία ροής. Η χρώση των MSCs ποντικών με τα αντισώματα για τους επιφανειακούς δείκτες CD45, CD73, Sca-1 και CD44, πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το προτεινόμενο από τον κατασκευαστή πρωτόκολλο (BD). Συγκεκριμένα, MSCs επωάστηκαν με τα ανάλογα συζευγμένα με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC), φυκοερυθρίνη (PE) ή αλλοφυκοκυανίνη (APC) αντισώματα για 15 λεπτά στο σκοτάδι και στη συνέχεια επωάστηκαν για άλλα 15 λεπτά με λυτικό διάλυμα (BD), για τη λύση τυχόν ερυθρών. Ακολούθησε φυγοκέντρηση, επαναιώρηση σε PBS και ανάλυση με κυτταρομετρία ροής. Για την τιτλοδότηση του ιικού φορέα, πραγματοποιήθηκε ανίχνευση της GFP πρωτεΐνης, χωρίς την προσθήκη κάποιου αντισώματος. Ως αρνητικός μάρτυρας (control) για την έκφραση της πρωτεΐνης, χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα που δε διαμολύνθηκαν (untransduced). Για την ανάλυση των διαμολυσμένων προγονικών κυττάρων, τα κύτταρα από τις καλλιέργειες μεθυλοκυτταρίνης συλλέχθηκαν απευθείας σε HBSS με προσθήκη 2% FBS και ξεπλύθηκαν για να απομακρυνθεί τυχόν αδιάλυτη μεθυλοκυτταρίνη. Η ανάλυση έγινε όπως και παραπάνω, με ανίχνευση δηλαδή της GFP πρωτεΐνης. Το θετικό κλάσμα των κυττάρων (CD45+), όπως επίσης και το αρνητικό (waste) που προέκυψε έπειτα από το μαγνητικό διαχωρισμό αιμοποιητικών και MSCs κυττάρων αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Συγκεκριμένα, κύτταρα και από τα δύο κλάσματα επωάστηκε με το CD45 (APC) (BD) αντίσωμα για 15 λεπτά στο σκοτάδι. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS για απομάκρυνση περίσσειας αντισώματος, επαναδιαλύθηκαν σε PBS και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. 67

68 Για την ανάλυση κυττάρων περιφερικού αίματος στα μεταμοσχευθέντα ζώα, έγινε λήψη αίματος με ηπαρινισμένο μικροαιματοκρίτη (Vitrex) από την οπισθοβολβική φλέβα. Περίπου 40 μl αίματος επωάστηκαν με αντισώματα συζευγμένα με PE ή FITC που αναγνωρίζουν τους επιφανειακούς δείκτες CD45.1 ή CD45.2 για 15 λεπτά στο σκοτάδι. Ακολούθησε λύση των ερυθρών κυττάρων, όπως και παραπάνω, πλύση των κυττάρων και επαναιώρηση με PBS. Για την ανάλυση των κυττάρων μυελού έπειτα από τη θυσία του ζώου, τα κύτταρα απομονώθηκαν (παράγραφος: απομόνωση αιμοποιητικών κυττάρων) και περίπου επωάστηκαν με αντισώματα συζευγμένα με PE ή FITC που αναγνωρίζουν τους επιφανειακούς δείκτες CD45.1 ή CD45.2. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε είναι ίδια με αυτή του αίματος. Ομοίως και για το σπλήνα, μετά τη διήθηση των σπληνοκυττάρων από ηθμό με πόρους 100 μm (BD strainers), περίπου κύτταρα επωάστηκαν με τα παραπάνω αντισώματα. Η έκφραση των παραπάνω δεικτών πραγματοποιήθηκε σε FACSCalibur κυτταρομετρητή (BD) και οι αναλύσεις έγιναν με λογισμικό CellQuest Pro6. Στατιστική ανάλυση Όλα τα αποτέλεσματα εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα των μέσων όρων (SE). Οι στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ δύο ομαδών προσδιορίστηκαν με το student s t-test. Τιμές p<0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. 68

69 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 69

70 1. Φαινοτυπικός χαρακτηρισμός και διαφοροποίηση των MSCs Τα MSCs απομονώθηκαν από το μυελό των οστών C57 μυών, καλλιεργήθηκαν και αφού πρώτα ταυτοποιήθηκαν ως αμιγής πληθυσμός, χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα. Τα MSCs ταυτοποιήθηκαν με κυτταρομετρία ροής ως CD45 - CD44 + CD54 + CD73 + sca-1 + (Εικ.16). 93% 91,5% 90% 84% Εικόνα 16: Ταυτοποίηση MSCs με κυτταρομετρία ροής. Επιπλέον, τα MSCs χαρακτηρίστηκαν βάσει της ικανότητάς τους να διαφοροποιούνται προς λιποκύτταρα (Εικ.17β) και οστεοκύτταρα (Εικ.17γ). 70

71 α. β. γ. Εικόνα 17: MSCs ποντικού α) πριν (μεγέθυνση 20X) και μετά τη διαφοροποίησής τους προς β) οστεοκύτταρα (μεγέθυνση 100X) και γ) λιποκύτταρα (μεγέθυνση 100X). 2. Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων πέψης του πλασμιδιακού DNA Μετά το μετασχηματισμό των βακτηρίων με τα τρία πλασμίδια (pml3, pmd2.g, GFP-vector) ακολούθησε απομόνωση πλασμιδιακού DNA σε μικρή και μεγάλη κλίμακα. Πραγματοποιήθηκε πέψη του πλασμιδιακού DNA με ένζυμα περιορισμού και τα προϊόντα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή αγαρόζης 0,8% (Εικ.18). 71

72 δείκτης μεγέθους λhindiii pmd2.g (miniprep) pmd2.g (maxiprep) δείκτης μεγέθους λhindiii GFP-vector (miniprep) GFP-vector (maxiprep) δείκτης μεγέθους λhindiii pml3 (miniprep) pml3 (maxiprep) Εικόνα 18: Αποτελέσματα ηλεκτροφόρησης των προϊόντων πέψης. Αναγνώριση των ζωνών DNA με παρατήρηση στο υπεριώδες φως (260 nm). 3. Τίτλοι ιικού φορέα Η τιτλοδότηση των ιικών φορέων που παρήχθησαν πραγματοποιήθηκε με κυτταρομετρία ροής και ως αρνητικοί μάρτυρες (control) χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα που δε διαμολύνθηκαν με το φορέα (Εικ.19). Οι ιικοί φορείς που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα, έφεραν τους τίτλους που φαίνονται στον Πίνακα 10. Πίνακας 10: Οι τίτλοι των ιικών φορέων. GFP-φορέας Τίτλος (IU/ml) #1 0, #2 1, #3 2, #4 2, #5 1,

73 0,12% 32,61% 82,63% Εικόνα 19: Τιτλοδότηση του ιικού φορέα με κυτταρομετρία ροής. Παρουσιάζονται ενδεικτικά οι αναλύσεις από τον αρνητικό μάρτυρα (control), από την πρώτη αραίωση (1:3) του μη συμπυκνωμένου ιού (crude) και από την πρώτη αραίωση (1:100) του συμπυκνωμένου ιού (concentrated). Ο αριθμός των κυττάρων που εξέφραζαν την GFP πρωτεΐνη στο crude ήταν 28, , ενώ στο concentrated 15, , γεγονός που υποδηλώνει ότι η συμπύκνωση του ιού κατά 1000 φορές ήταν επιτυχής. 4. In vitro αποτελέσματα 4.1 Ενίσχυση της μεταναστευτικής ικανότητας, διαμολυσμένων και μη, HSCs με προσθήκη υπερκειμένου καλλιέργειας MSCs. Για να διερευνηθεί η επίδραση του υπερκειμένου καλλιέργειας MSCs στη μεταναστευτική ικανότητα των αιμοποιητικών κυττάρων, ποσότητες που αντιστοιχούν σε δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις συμπυκνωμένου υπερκειμένου (sup 1: υπερκείμενο που αντιστοιχεί σε MSCs, sup 2: υπερκείμενο που αντιστοιχεί σε MSCs) προστέθηκαν σε αιμοποιητικά κύτταρα και μεταφέρθηκαν σε συστήματα transwell. Παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση της μετανάστευσης των κυττάρων παρουσία και των δύο συγκεντρώσεων 73

74 % μετανάστευση υπερκειμένου (BM+sup 1: 43,3±6,3%, BM+ sup 2: 55,7±4,9%) σε σχέση με τον αρνητικό μάρτυρα (21,8±2,9%) (Εικ.20) * ** BM control 40 BM+sup1 30 BM+sup Εικόνα 20: Σημαντική αύξηση της μετανάστευσης των αιμοποιητικών κυττάρων έπειτα από προσθήκη των δύο συγκεντρώσεων υπερκειμένου MSCs. Κάθε μπάρα αντιπροσωπεύει το μέσο όρο±se. * = p<0.05 και ** =p<0.001, σε σύγκριση με τη συνθήκη απουσίας υπερκειμένου MSCs στα αιμοποιητικά κύτταρα. Για να διερευνηθεί αν το υπερκείμενο καλλιέργειας MSCs συμβάλλει σημαντικά και στη μετανάστευση των διαμολυσμένων αιμοποιητικών κυττάρων, οι ίδιες ποσότητες προστέθηκαν σε διαμολυσμένα αιμοποιητικά κύτταρα. Η πολλαπλότητα διαμόλυνσης ήταν 15 και το ποσοστό γονιδιακής μεταφοράς ήταν 62% (Εικ.21). Παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση της μεταναστευτικής ικανότητας των κυττάρων που ενεργοποιήθηκαν σε καλλιέργεια, ανεξαιρέτως αν στη συνέχεια διαμολύνθηκαν, σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα αιμοποιητικά κύτταρα (Εικ.22). Το γεγονός αυτό υποδηλώνει πως η διαδικασία ενεργοποίησης των κυττάρων σε καλλιέργειες αυξάνει τη χημειόταξή τους προς τον παράγοντα SDF-1. Επιπρόσθετα, σημειώθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση της μεταναστευτικής ικανότητας στις ομάδες που προστέθηκε υπερκείμενο καλλιέργειας (BMtxd+sup1 & BMtxd+sup2) σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (BMtxd). 74

75 % μετανάστευση % γονιδιακής μεταφοράς 62% Εικόνα 21: Ποσοστό γονιδιακής μεταφοράς. Τα διαμολυσμένα αιμοποιητικά κύτταρα εξέφραζαν την GFP πρωτεΐνη σε ποσοστό 62% ** ** * * BM control BM untxd ** BM txd BMtxd+sup1 30 BMtxd+sup Εικόνα 22: Σημαντική αύξηση της μετανάστευσης των κυττάρων που ενεργοποιήθηκαν σε καλλιέργεια (ΒΜ untxd: 47,6±0,8%, BM txd: 52,8±3,7%) σε σχέση με το φρέσκο μυελό (19±1,2%). Επίσης σημαντική αύξηση σημειώθηκε στα διαμολυσμένα κύτταρα παρουσία των δύο συγκεντρώσεων υπερκειμένου (BMtxd+sup1: 75,4±1,7%, BMtxd+sup2 :85,8±1%) σε σχέση με αυτά απουσία υπερκειμένου (BM txd). * = p<0.05 και ** =p<0.001 Από τις αποικίες που προέκυψαν στις καλλιέργειες μεθυλοκυτταρίνης, συλλέχθηκαν δέκα μονήρεις από κάθε ομάδα διαμολυσμένων κυττάρων και ελέγχθηκαν με κυτταρομετρία ροής ως προς την έκφραση της GFP πρωτεΐνης (Εικ. 23 & 24). 75

76 % GFP (μέσοι όροι 10 διαμολυσμένων αποικιών) % GFP ανά μονήρη αποικία txd SDF txd+sup1 SDF txd+sup2 SDF Εικόνα 23: Ποσοστό έκφρασης της GFP πρωτεΐνης ανά μονήρη αποικία * txd SDF txd+sup1 SDF txd+sup2 SDF Εικόνα 24: Ποσοστό έκφρασης της GFP πρωτεΐνης ανά ομάδα. Κάθε μπάρα αντιπροσωπεύει το μέσο όρο έκφρασης GFP από δέκα αποικίες±se (txd SDF: 32,9±5,8%, txd+sup1 SDF: 28,1±9,2%, txd+sup2 SDF: 10±6,5%). * = p < 0.05 σε σχέση με την ομάδα των διαμολυσμένων κυττάρων (txd). 76

77 % μετανάστευση 4.2 Ενίσχυση της μεταναστευτικής ικανότητας HSCs έπειτα από συγκαλλιέργεια με MSCs Αιμοποιητικά κύτταρα, μη διαμολυσμένα, συλλέχθηκαν έπειτα από συγκαλλιέργεια με MSCs και μεταφέρθηκαν σε συστήματα transwell για να προσδιοριστεί το ποσοστό μετανάστευσης προς τον SDF-1. Παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση στη μεταναστευτική ικανότητα των κυττάρων που προήλθαν από τη συγκαλλιέργεια (BM+MSCs) σε σχέση με το μη επεξεργασμένο μυελό (BM control) (Εικ.25) * BM control BM+MSCs Εικόνα 25: Σημαντική αύξηση της μετανάστευσης των κυττάρων που συγκαλλιεργήθηκαν με MSCs. Κάθε μπάρα αντιπροσωπεύει το μέσο όρο μετανάστευσης±se. Στην ομάδα BM+MSCs παρατηρήθηκε μετανάστευση 49,8±3,2% ενώ στην ομάδα ελέγχου 15±0,6%. * = p<0.05 Στην περίπτωση των αιμοποιητικών κυττάρων που θα υπόκεινταν σε διαμόλυνση, η ενεργοποίηση πραγματαποιήθηκε σε στρώμα MSCs. Στη συνέχεια, συλλέχθηκαν και οι δύο κυτταρικοί πληθυσμοί και ακολούθησε μαγνητικός διαχωρισμός των κυττάρων με το mousecd45 Microbeads kit, με σκοπό να διαχωριστούν οι πληθυσμοί. Ο διαχωρισμός αυτός ήταν ανεπιτυχής (Εικ.26), καθώς τόσο στο θετικό κλάσμα όσο και στο αρνητικό, περιέχονταν CD45+ κύτταρα. Τα δύο κλάσματα ενώθηκαν, με αποτέλεσμα στο εναιώρημα των κυττάρων να υπάρχουν και MSCs, και ακολούθησε διαμόλυνση με τον GFP-φορέα με MOI 30. Ως ομάδες ελέγχου για τα κύτταρα που ενεργοποιήθηκαν πάνω στα MSCs (untxd+mscs, txd+mscs) χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα τα οποία ενεργοποιήθηκαν σε καλλιέργεια με το συμβατικό τρόπο (untxd, txd). 77

78 Δεν παρατηρήθηκε διαφορά στο ποσοστό γονιδιακής μεταφοράς (Εικ.27) μεταξύ των ομάδων txd και txd+mscs, γεγονός που υποδηλώνει πως η ενεργοποίηση πάνω στα MSCs δεν επηρέασε τη διαμόλυνση. Στη συνέχεια, τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε συστήματα transwell και ελέγχθηκε η μεταναστευτική τους ικανότητα (Εικ.28). Ο αριθμός αποικιών που προέκυψαν στις καλλιέργειες μεθυλοκυτταρίνης ανά ομάδα παρουσιάζονται στον Πίνακα 11. Παρατηρούμε πως το ποσοστό μετανάστευσης των κυττάρων που ενεργοποιήθηκαν σε στρώμα MSCs (untxd-mscs, txd-mscs) είναι περίπου το μισό σε σχέση με αυτό των αντίστοιχων ομάδων ελέγχου (untxd, txd). Αυτό πιθανότατα να οφείλεται στην ύπαρξη των μεσεγχυματικών κυττάρων, που ως μεγαλύτερου μεγέθους κύτταρα μπορεί να έφραξαν τους 5 μm πόρους της μεμβράνης, εμποδίζοντας έτσι τη μετανάστευση των HSCs. 83% 87% Εικόνα 26: Τα δύο κλάσματα των κυττάρων όπως προέκυψαν με τον μαγνητικό διαχωρισμό, τα CD45+ κύτταρα και το αρνητικό κλάσμα (waste). Παρατηρούμε πως CD45+ θετικά κύτταρα υπάρχουν και στο αρνητικό κλάσμα, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο διαχωρισμός ήταν ανεπιτυχής. α. txd 89,6% 78

79 % μετανάστευση β. txd-mscs 89,9% Εικόνα 27: Ποσοστό γονιδιακής μεταφοράς (transduction rate) α) διαμολυσμένων κυττάρων και β) διαμολυσμένων κυττάρων που ενεργοποιήθηκαν πάνω σε στρώμα MSCs. Πίνακας 11: Αριθμός αποικιών ανά ομάδα, όπως προέκυψαν από τις καλλιέργειες μεθυλοκυτταρίνης. Αριθμός αποικιών Αριθμός αποικιών BM untxd untxd-mscs μάρτυρες SDF txd txd-mscs μάρτυρες SDF ** * * BM untxd txd untxd-mscs txd-mscs Εικόνα 28: Ποσοστά μετανάστευσης των κυττάρων προς τον SDF-1 ανά ομάδα. Κάθε μπάρα αντιπροσωπεύει το μέσο όρο μετανάστευσης±se (BM: 12,6±4,6%, untxd: 66,7±9,1%, txd:57,7±11,1%, untxd-mscs: 37,5±6,7%, txd-mscs: 33,2±2,1%). * = p<0,05 και ** = p<0,

80 % GFP ανά μονήρη αποικία % GFP έκφραση Παρόλο που το ποσοστό γονιδιακής μεταφοράς μεταξύ των ομάδων txd και txd-mscs ήταν παρόμοιο (Εικ.27), παρατηρήθηκαν διαφορές στην έκφραση της GFP πρωτεΐνης στα κύτταρα που μετανάστευσαν προς τον SDF-1. Πιο συγκεκριμένα, η έκφραση GFP που παρατηρήθηκε σε σωρούς (pools) των δέκα αποικιών στην ομάδα txd+mscs ήταν σχεδόν διπλάσια σε σχέση με την ομάδα txd (80% vs 41,6%) (Εικ..29). Επιπλέον, τόσο το ποσοστό των διαμολυσμένων αποικιών όσο και η έκφραση της GFP πρωτεΐνης σε επίπεδο μεμονωμένων αποικιών, ήταν υψηλότερο στην ομάδα txd-mscs σε σχέση με την ομάδα ελέγχου txd (txd-mscs: 54,4±12,2% vs txd: 26,4±10,6%) (Εικ.30) txd SDF txd-mscs SDF Εικόνα 29: Έκφραση της GFP πρωτεΐνης σε σωρούς 10 αποικιών, ανά ομάδα txd SDF txd-mscs SDF Εικόνα 30: Ποσοστό έκφρασης της GFP πρωτεΐνης ανά μονήρη αποικία. 80

81 5. In vivo πειράματα 5.1 Τα διαμολυσμένα HSCs εμφανίζουν χαμηλά ποσοστά εμφύτευσης Μυελός των οστών συλλέχθηκε από C57 δότες, τα κύτταρα ενεργοποιήθηκαν σε καλλιέργεια και διαμολύνθηκαν με τον GFP-φορέα με MOI 30. Το ποσοστό γονιδιακής μεταφοράς την ημέρα της μεταμόσχευσης ήταν 78,5% (Εικ.31) CD45.2+ κύτταρα μεταμοσχεύθηκαν σε CD45.1+ Pepboy λήπτες και η εμφύτευση, καθώς επίσης και η έκφραση της GFP πρωτεΐνης, ελεγχόταν μηνιαίως στο περιφερικό αίμα με κυτταρομετρία ροής (Εικ.32). Στους Πίνακες 12, 13 & 14 παρουσιάζονται οι μέσες τιμές εμφύτευσης των CD45.2+ κυττάρων±se, η μέση τιμή έκφρασης της GFP πρωτεΐνης±se στα CD45.2+ κύτταρα και η μέση τιμή εμφύτευσης των GFP+CD45.2+ κυττάρων±se, αντίστοιχα. Όπως αναμενόταν, η ομάδα ελέγχου που έλαβε μη επεξεργασμένο μυελό (BM) εμφάνισε υψηλότερα ποσοστά εμφύτευσης στο περιφερικό αίμα από τον πρώτο μέχρι και τον έκτο μήνα μετά τη μεταμόσχευση, σε σχέση με τις ομάδες που έλαβαν μη διαμολυσμένο (untxd) και διαμολυσμένο (txd) μυελό. Παρατηρούμε επίσης πως, ενώ η εμφύτευση του διαμολυσμένου και μη, μυελού κυμαίνεται τους δύο πρώτους μήνες στα ίδια ποσοστά, από τον τρίτο μήνα και μετά η εμφύτευση του διαμολυσμένου είναι μειωμένη κατά το ήμισυ σε σχέση με το μη διαμολυσμένο (Εικ.32). % γονιδιακής μεταφοράς 78,5% Εικόνα 31: Ποσοστό γονιδιακής μεταφοράς την ημέρα της μεταμόσχευσης. Ο διαμολυσμένος μυελός εξέφραζε την GFP πρωτεΐνη σε ποσοστό 78,5%. 81

82 % εμφύτευση GFP+ CD45.2+ κυττάρων % GFP έκφραση % εμφύτευση CD45.2+ κυττάρων α ος μήνας 2ος μήνας Περιφερικό αίμα 3ος μήνας 4ος μήνας 5ος μήνας 6ος μήνας untxd txd BM μήνες μετά τη μεταμόσχευση β. Περιφερικό αίμα ος μήνας 2ος μήνας 3ος μήνας 4ος μήνας 5ος μήνας 6ος μήνας untxd txd μήνες μετά τη μεταμόσχευση Περιφερικό αίμα γ untxd 15 txd ος μήνας 2ος μήνας 3ος μήνας 4ος μήνας 5ος μήνας 6ος μήνας μήνες μετά τη μεταμόσχευση Εικόνα 32: Ποσοστά α) εμφύτευσης των CD45.2+ κυττάρων, β) έκφρασης της GFP πρωτεΐνης στα CD45.2+ κύτταρα και γ) εμφύτευσης GFP+CD45.2+ κυττάρων στο περιφερικό αίμα των ληπτών που έλαβαν διαμολυσμένο μυελό. 82

83 Πίνακας 12: Μέσοι όροι εμφύτευσης±se των CD45.2+ κυττάρων στο περιφερικό αίμα ανά ομάδα ληπτών. * =p<0.05. % CD45.2+ κύτταρα 1ος μήνας 2ος μήνας 3ος μήνας 4ος μήνας 5ος μήνας 6ος μήνας μη επεξεργασμένος μυελός (ν=3) μη διαμολυσμένος μυελός (ν=6) διαμολυσμένος μυελός (ν=8) 61,3±1,8 * 67,4±1,7 * 73,2±2,8 77±2,4 82,7±3,8 78,4±1,3 28,9±3,2 38,2±4,3 71,4±7,1 75,8±5,9 77,9±5,9 81,9±4,1 25,5±4,8 36,2±10,5 39,4±20,3 42,2±21,6 40,4±23,1 42±22,2 Πίνακας 13: Μέσοι όροι έκφρασης της GFP πρωτεΐνης±se των CD45.2+ κυττάρων στο περιφερικό αίμα των ληπτών που έλαβαν διαμολυσμένο μυελό. %GFP έκφραση 1ος μήνας 2ος μήνας 3ος μήνας 4ος μήνας 5ος μήνας 6ος μήνας περιφερικό αίμα 50,2±4,7 77,6±1,4 73,7±3,6 59,8±12,6 37±3,2 37,4±2,6 Πίνακας 14: Μέσοι όροι εμφύτευσης±se των GFP+CD45.2+ κυττάρων στο περιφερικό αίμα των ληπτών που έλαβαν διαμολυσμένο μυελό. %GFP+CD45.2+ κύτταρα 1ος μήνας 2ος μήνας 3ος μήνας 4ος μήνας 5ος μήνας 6ος μήνας περιφερικό αίμα 12,9±3 28,3±8,5 29,2±15,3 31,2±17,1 13,4±7,5 14,6±8,1 Στον έκτο μήνα μετά τη μεταμόσχευση τα ποντίκια θυσιάστηκαν,απομονώθηκαν ο μυελός των οστών και ο σπλήνας και προσδιορίστηκε το ποσοστό των CD45.2+ κυττάρων και η έκφραση της GFP πρωτεΐνης από αυτά (Εικ.33-37). Όπως και στο περιφερικό αίμα, τα ποσοστά εμφύτευσης των CD45.2+ κυττάρων, τόσο στο μυελό όσο και στο σπλήνα, στις ομάδες που έλαβαν μη επεξεργασμένο και μη διαμολυσμένο μυελό ήταν υψηλότερα σε σχέση με την ομάδα που έλαβε διαμολυσμένο μυελό. 83

84 % εμφύτευση CD45.2+ κυττάρων % GFP έκφραση % εμφύτευση CD45.2+ κυττάρων % GFP έκφραση α. Περιφερικό αίμα β. Περιφερικό αίμα BM untxd txd txd 0 6ος μήνας 0 6ος μήνας Εικόνα 33: Ποσοστό α) εμφύτευσης των CD45.2+ κυττάρων στο περιφερικό αίμα (ΒΜ: 88,9±1,2%, untxd:81,9±4,1%, txd:42±20%) και β) έκφρασης της GFP από τα διαμολυσμένα CD45.2+ κύτταρα (37,4±2,6%). α Μυελός των οστών β Μυελός των οστών BM untxd txd txd 0 6ος μήνας 0 6ος μήνας Εικόνα 34: Ποσοστό α) εμφύτευσης των CD45.2+ κυττάρων στο μυελό των οστών (ΒΜ: 84±0,6%, untxd:71,4±5,2%, txd:33,1±18,8%) και β) έκφρασης της GFP από τα διαμολυσμένα CD45.2+ κύτταρα (28,1±10,6%). 84

85 % εμφύτευση CD45.2+ κυττάρων % GFP έκφραση α. Σπλήνας β. Σπλήνας BM untxd txd txd 0 6ος μήνας 0 6ος μήνας Εικόνα 35: Ποσοστό α) εμφύτευσης των CD45.2+ κυττάρων στο σπλήνα (ΒΜ: 89,3±0,6%, untxd:77±7,8%, txd:42±21,2%) και β) έκφρασης της GFP από τα διαμολυσμένα CD45.2+ κύτταρα (49±0,5%). 5.2 Ενίσχυση της εμφύτευσης μη επεξεργασμένων ή διαμολυσμένων HSCs με συγχορήγηση MSCs Για να διερευνήσουμε το ρόλο των MSCs στην προαγωγή της εμφύτευσης των HSCs, μη επεξεργασμένα αιμοποιητικά CD45.2+ κύτταρα (BM fresh) και MSCs συγχορηγήθηκαν ενδοφλέβια σε μερικώς μυελοκατεσταλμένους CD45.1+ Pepboy λήπτες (BU:100 mg/kg). Δυστυχώς, τα ζώα απεβίωσαν κατά την έγχυση των κυττάρων, πιθανόν από εμβολή. Η εκτίμησή μας ήταν ότι για την οξεία τοξικότητα που παρατηρήθηκε στα ζώα υπεύθυνα ήταν τα MSCs τα οποία είναι μεγαλύτερα κύτταρα από τα HSCs, καθώς στην ομάδα ελέγχου που έλαβε μόνο HSCs επέζησαν όλα τα ζώα. Πιθανόν οι δόσεις MSCs που χρησιμοποιήθηκαν σε συνδυασμό με τα HSCs να δημιούργησαν συσσωματώματα κυττάρων που τελικά οδήγησαν σε εμβολικά επεισόδια και θάνατο των ζώων. Στη συνέχεια, δοκιμάστηκε η ενδομυελική συγχορήγηση μη επεξεργασμένων αιμοποιητικών CD45.2+ κυττάρων και MSCs και οι λήπτες ελέγχθηκαν για το ποσοστό εμφύτευσης στο περιφερικό τους αίμα (Εικ.36). Στον Πίνακα 15 εμφανίζονται οι μέσοι όροι εμφύτευσης±se για κάθε ομάδα. Ως ομάδα ελέγχου, χρησιμοποιήθηκαν λήπτες που έλαβαν μόνο αιμοποιητικά κύτταρα. Παρατηρήθηκε ότι στην ομάδα που έλαβε MSCs, τα ποσοστά εμφύτευσης των CD45.2+ κυττάρων είναι υψηλότερα συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου, σε όλα τα χρονικά στιγμιότυπα που ελέγχθηκαν μετά τη μεταμόσχευση. Στατιστικά σημαντικές διαφορές 85

86 % εμφύτευση CD45.2+ κυττάρων σημειώθηκαν κατά τους πρώτους τρεις μήνες μετά τη μεταμόσχευση, ενώ στους επόμενους δύο παρατηρήθηκε μια τάση σημαντικότητας Περιφερικό αίμα 1ος μήνας 2ος μήνας 3ος μήνας 4ος μήνας 5ος μήνας μήνες μετά τη μεταμόσχευση BM ΒΜ+MSCs Εικόνα 36: Ποσοστά εμφύτευσης των HSCs στο περιφερικό αίμα των ληπτών τους πέντε πρώτους μήνες μετά τη μεταμόσχευση. Εμφανίζονται οι μέσοι όροι εμφύτευσης ανά ομάδα ληπτών. Πίνακας 15: Μέσοι όροι ποσοστών εμφύτευσης±se των CD45.2+ κυττάρων. ν = αριθμός ληπτών, * = p 0.05, # p = 0,08. % CD45.2+ κύτταρα 1ος μήνας 2ος μήνας 3ος μήνας 4ος μήνας 5ος μήνας μη επεξεργασμένος μυελός (ν=4) μη επεξεργασμένος μυελός +MSCs (ν=8) 32,8±1,7 40,9±3,8 53,2±2,5 66,8±4,9 72,3±3,2 54,7±2,3 * 68,8±3 * 79,4±2,9 * 84,8±5,8 # 89,1±3,7 # Στον πέμπτο μήνα τα ζώα θυσιάστηκαν και ελέγχθηκε η εμφύτευση των κυττάρων στο μυελό και το σπλήνα των ληπτών (Εικ.37). Και στους δύο αιμοποιητικούς ιστούς, η εμφύτευση των κυττάρων στην ομάδα που έλαβε MSCs ήταν υψηλότερη σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. 86

87 % εμφύτευση CD45.2+ κυττάρων % εμφύτευση CD45.2+ κυττάρων % εμφύτευση CD45.2+ κυττάρων α. Περιφερικό αίμα β. Μυελός των οστών # 100 # BM BM+MSCs BM BM+MSCs ος μήνας 0 5ος μήνας γ. 100 Σπλήνας # BM BM+MSCs ος μήνας Εικόνα 37: Ποσοστά εμφύτευσης κατά τον 5 ο μήνα α) στο περιφερικό αίμα (ΒΜ: 71,5±3,3%, BM+MSCs: 92,2±4,1%), β) στο μυελό των οστών (ΒΜ: 69,6±4,2%, BM+MSCs: 87,5±2,8%) και γ) στο σπλήνα (ΒΜ: 72,3±5,2%, BM+MSCs: 91,2±4,4%). Κάθε μπάρα αντιπροσωπεύει το μέσο όρο εμφύτευσης±se. # p=0,8. Στη συνέχεια, για να αποφύγουμε την οξεία τοξικότητα από την έγχυση MSCs χορηγήσαμε MSCs ανά κιλό λήπτη ( MSCs ανά λήπτη) μαζί με CD45.2+ μη επεξεργασμένα ή διαμολυσμένα αιμοποιητικά κύτταρα, σε μερικώς μυελοκατεσταλμένους CD45.1+ Pepboy λήπτες. Η διαμόλυνση των αιμοποιητικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε με MOI 30. Από τον έλεγχο εμφύτευσης των CD45.2+ κυττάρων στο περιφερικό αίμα των ληπτών, φαίνεται μέχρι στιγμής (2 ος μήνας μετά τη μεταμόσχευση, το πείραμα βρίσκεται σε εξέλιξη) πως οι ομάδες που έλαβαν και MSCs εμφανίζουν υψηλότερα ποσοστά εμφύτευσης στο περιφερικό αίμα (Εικ.38), καθώς επίσης και υψηλότερα ποσοστά έκφρασης της GFP πρωτεΐνης (Εικ.39).Στον 87

88 % εμφύτευση CD45.2+ κυττάρων Πίνακα 16 & 17 εμφανίζονται οι μέσοι όροι εμφύτευσης±se των CD45.2+ κυττάρων και η έκφραση της GFP πρωτεΐνης±se στις ομάδες που έλαβαν διαμολυσμένο μυελό, αντίστοιχα. Περιφερικό αίμα ος μήνας 2ος μήνας μήνες μετά τη μεταμόσχευση BM fresh BM fresh+mscs untxd txd txd+mscs Εικόνα 38: Ποσοστά εμφύτευσης των CD45.2+ κυττάρων στο περιφερικό αίμα των ληπτών. Εμφανίζονται οι μέσοι όροι εμφύτευσης ανά ομάδα. Πίνακας 16: Μέσοι όροι ποσοστών εμφύτευσης των CD45.2+ κυττάρων±se στο περιφερικό αίμα των ληπτών. ν =αριθμός ληπτών, * = p 0,05, ** = p< 0,01. μη επεξεργασμένος μυελός (ν=3) φρέσκος μυελός+mscs (ν=5) μη διαμολυσμένος μυελός (ν=3) διαμολυσμένος μυελός (ν=5) διαμολυσμένος μυελός+mscs (ν=5) % CD45.2+ κύτταρα 1ος μήνας 2ος μήνας 67,1±1,5 71,4±1,4 76,1±1,1 * 83±0,7 ** 29,4±1,9 37,8±1,5 21,5±4,1 27,3±3,8 27,4±2,9 ** 35,3±3,3 * 88

89 % GFP έκφραση Περιφερικό αίμα untxd txd txd+mscs 0 1ος μήνας 2ος μήνας μήνες μετά τη μεταμόσχευση Εικόνα 39: Ποσοστά έκφρασης της GFP πρωτεΐνης από τα CD45.2+ κύτταρα. Εμφανίζονται οι μέσοι όροι έκφρασης ανά ομάδα. Πίνακας 17: Μέσοι όροι έκφρασης της GFP πρωτεΐνης±se στο περιφερικό αίμα των ληπτών που έλαβαν διαμολυσμένο μυελό. διαμολυσμένος μυελός διαμολυσμένος μυελός+mscs % GFP έκφραση 1ος μήνας 2ος μήνας 21,5±0,6 27,3±4,6 27,4±9,6 35,3±6,3 5.3 Το υπερκείμενο καλλιέργειας MSCs δεν ενισχύει την εμφύτευση των μη επεξεργασμένων HSCs 1x10 6 MSCs/kg Για να ελεγχθεί εάν, όχι μόνο τα MSCs καθ εαυτά, αλλά και οι εκκρινόμενοι από αυτά διαλυτοί παράγοντες επιδρούν στην εμφύτευση των HSCs συγχορηγήθηκε υπερκείμενο καλλιέργειας μεσεγχυματικών κυττάρων με HSCs. Το υπερκείμενο προήλθε από καλλιέργειες μεσεγχυματικών κυττάρων που αφού συλλέχθηκε στη συνέχεια συμπυκνώθηκε. Για την in vivo χορήγησή του, επιλέχθηκαν δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις: α) συμπυκνωμένο υπερκείμενο καλλιέργειας που 89

90 % εμφύτευση GFP+CD45.2+ κυττάρων αντιστοιχούσε σε MSCs (sup1) και β) συμπυκνωμένο υπερκείμενο που αντιστοιχούσε σε MSCs (sup2). Οι ποσότητες ( μl) που αναλογούσαν στις παραπάνω συγκεντρώσεις συγχορηγήθηκαν με GFP+ αιμοποιητικά κύτταρα σε μερικώς μυελοκατεσταλμένους Pepboy λήπτες. Τα GFP ποντίκια-δότες εξέφραζαν την GFP πρωτεΐνη στο περιφερικό αίμα σε ποσοστό >90% (Εικ.40). Μετά τη μεταμόσχευση ελεγχόταν μηνιαία μέχρι τον 6 ο μήνα η εμφύτευση των κυττάρων στο περιφερικό αίμα των ληπτών (Εικ.41). Στον Πίνακα 18 εμφανίζονται οι μέσοι όροι εμφύτευσης±se ανά μήνα για κάθε ομάδα. 98,2% Εικόνα 40: Έλεγχος της GFP έκφρασης στο περιφερικό αίμα ενός GFP-δότη. Περιφερικό αίμα ος μήνας 2ος μήνας 3ος μήνας 4ος μήνας 5ος μήνας 6ος μήνας μήνες μετά τη μεταμόσχευση BM BM+sup1 BM+sup2 Εικόνα 41: Ποσοστά εμφύτευσης των κυττάρων στο περιφερικό αίμα των ληπτών κατά τους 6 πρώτους μήνες μετά τη μεταμόσχευση. Εμφανίζονται οι μέσοι όροι εμφύτευσης ανά ομάδα. 90

91 % εμφύτευση GFP+CD45.2+ κυττάρων Πίνακας 18: Μέσοι όροι εμφύτευσης±se των κυττάρων του δότη στο περιφερικό αίμα ανά ομάδα ληπτών. ν = αριθμός ληπτών % CD45.2+ κύτταρα 1ος μήνας 2ος μήνας 3ος μήνας 4ος μήνας 5ος μήνας 6ος μήνας μη επεξεργασμένος μυελός (ν=3) μη επεξεργασμένος μυελός+sup1 (ν=5) μη επεξεργασμένος μυελός+sup2 (ν=5) 73,9±2,5 79±3,1 83,8±2,8 90±4,3 92,3±1,5 94±1,6 70±3,3 74,3±2,8 78,1±4,1 83,6±2,4 85,1±5,1 88,5±3,8 74,3±1,9 78,4±2,6 82,5±5,1 87,1±1,4 89,6±3,7 91±3,1 Στον έκτο μήνα μετά τη μεταμόσχευση τα ζώα θυσιάστηκαν, απομονώθηκαν ο σπλήνας και ο μυελός των οστών και ελέγχθηκε η εμφύτευση των CD45.2+ κυττάρων (Εικ.42). Όπως και στο περιφερικό αίμα, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων που έλαβαν υπερκείμενο καλλιέργειας MSCs, τόσο στο σπλήνα (BM+sup1: 94,3±1,9%, BM+sup2: 92±3%), όσο και στο μυελό των οστών (BM+sup1: 91,2±3%, BM+sup2: 89,5±2,1%) σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (BM: 89±2,8% και 85±3,3% αντίστοιχα). α. Περιφερικό αίμα ΒΜ ΒΜ+sup1 BM+sup ος μήνας 91