Άσκηση 6: Φωτοσύνθεση και Φωτοσυνθετικές χρωστικές

Transcript

1 Άσκηση 6: Φωτοσύνθεση και Φωτοσυνθετικές χρωστικές Σύνοψη Σκοπός της άσκησης είναι να εξοικειωθούν οι φοιτητές με ένα από τα σπουδαιότερα βιολογικά φαινόμενα της ζωής πάνω στη Γη, τη βιοχημική διεργασία της φωτοσύνθεσης. Η άσκηση συνδυάζει τις γνώσεις που απόκτησαν οι εκπαιδευόμενοι στην Άσκηση 3 (ως προς την ανατομία των φύλλων και τα οργανίδια των φυτικών κυττάρων), με τη βιοχημεία της φωτοσύνθεσης. Στο πρώτο μέρος της άσκησης περιγράφεται η μεθοδολογία κατά την οποία χρησιμοποιούνται φύλλα σπανακιού και η τεχνική των πλωτών δίσκων για να διαπιστωθεί η παραγωγή οξυγόνου, η οποία λαμβάνει χώρα κατά τη διάρκεια των φωτεινών αντιδράσεων της φωτοσύνθεσης και της υδρόλυσης (φωτόλυσης) του νερού. Στο δεύτερο μέρος της άσκησης, οι εκπαιδευόμενοι χρησιμοποιούν τη μέθοδο της χρωματογραφίας για να διαχωρίσουν τις χημικές ενώσεις (χλωροφύλλη α και β, ξανθοφύλλες, καροτενοειδή) που συνιστούν το υπόβαθρο της φωτοσύνθεσης, ενώ στο τρίτο μέρος, μελετούν ποιοτικά τη σχέση φωτοσύνθεσης και παραγωγής αμύλου. Προαπαιτούμενη γνώση Από το βιβλίο των Campbell, N. A., & Reece, J.B. (2010), Βιολογία (τόμος I), Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, ISBN: , ο φοιτητής θα πρέπει να ανατρέξει στο Κεφάλαιο 10: Φωτοσύνθεση. 1. Εισαγωγικό μέρος Φωτοσύνθεση είναι η διεργασία κατά την οποία τα φυτά και ορισμένοι άλλοι οργανισμοί μετασχηματίζουν την ενέργεια του φωτός, συνήθως από τον Ήλιο, σε χημική ενέργεια. Αυτή η χημική ενέργεια αποθηκεύεται σε ενεργειακά πλούσιες οργανικές ενώσεις, κυρίως υδατάνθρακες [CH 2 O], που στα φυτά συντίθενται από διοξείδιο του άνθρακα (CO 2 ) και νερό με απελευθέρωση οξυγόνου (O 2 ) ως παραπροϊόν (Εικ. 6.1). Η φωτοσύνθεση είναι ίσως η σημαντικότερη μεταβολική πορεία που γίνεται στη βιόσφαιρα, γιατί µε τις οργανικές ενώσεις που παράγονται μέσω αυτής συντηρείται η ζωή στο γήινο οικοσύστημα. Όλοι σχεδόν οι οργανισμοί στηρίζονται, άμεσα ή έμμεσα, στην εξασφάλιση της τροφής τους και της αναγκαίας ενέργειας στις οργανικές ενώσεις που παράγουν οι φωτοσυνθέτοντες οργανισμοί. Ταυτοχρόνως, η ατμόσφαιρα εμπλουτίζεται µε το απαραίτητο για την αναπνοή O 2. Επομένως, χωρίς τη φωτοσύνθεση δεν θα ήταν δυνατή η συντήρηση και η συνέχιση της ζωής στον πλανήτη µας. Εικόνα 6.1 Η φωτοσύνθεση στα φυτά

2 Οι φωτοσυνθέτοντες οργανισμοί ανήκουν στους αυτότροφους οργανισμούς, επειδή συντηρούν μόνοι τους τον εαυτό τους χρησιμοποιώντας τα προϊόντα της φωτοσύνθεσης, χωρίς να χρειάζονται τα προϊόντα άλλων οργανισμών. Αποτελούν την κύρια πηγή ενέργειας για όλους τους οργανισμούς που δεν είναι αυτότροφοι και γι αυτόν τον λόγο χαρακτηρίζονται και ως παραγωγοί. Αντίθετα, οι οργανισμοί που δεν μπορούν να συνθέσουν μόνοι τους οργανικές ενώσεις από απλές ανόργανες, αλλά είναι υποχρεωμένοι να τις προμηθεύονται έτοιμες από το περιβάλλον τους, χαρακτηρίζονται ως ετερότροφοι (αλλιώς καταναλωτές). Ικανότητα φωτοσύνθεσης έχουν όλοι οι οργανισμοί που διαθέτουν φωτοσυνθετικές χρωστικές, όπως η χλωροφύλλη. Από τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς φωτοσύνθεση γίνεται στα φυτά και στα φύκη, ενώ από τους προκαρυωτικούς σε ορισμένα βακτήρια και στα κυανοφύκη ή κυανοβακτήρια (βλέπε Άσκηση 2) Χλωροπλάστες: οι θέσεις φωτοσύνθεσης στα φυτά Η φωτοσύνθεση επιτελείται στα πράσινα μέρη των φυτών, κυρίως στα φύλλα και στους βλαστούς, τα κύτταρα των οποίων περιέχουν πολυάριθμους χλωροπλάστες. Οι χλωροπλάστες είναι είδος πλαστιδίων που χαρακτηρίζονται από υψηλές συγκεντρώσεις χλωροφύλλης και περιέχουν όλα τα ένζυμα που απαιτούνται για τις διεργασίες της φωτοσύνθεσης. Στα φύλλα, που είναι και το κύριο φωτοσυνθετικό όργανο των φυτών, η μεγαλύτερη πυκνότητα χλωροπλαστών παρατηρείται στα κύτταρα του μεσόφυλλου (βλέπε Άσκηση 3, Εικ. 3.10). Θυμηθείτε ότι τα φύλλα έχουν εξειδικευμένα επιδερμικά κύτταρα, τα στόματα, κυρίως στην κάτω επιδερμίδα τους (βλέπε Άσκηση 3, Εικ. 3.7 και 3.10), διαμέσου των οποίων εισέρχεται στο εσωτερικό του φύλλου το CO 2 και εξέρχεται το Ο 2. Το νερό που απορροφάται από τις ρίζες κατανέμεται στα φύλλα μέσω ενός συστήματος αγωγών ιστών (ηθμαγγειώδεις δεσμίδες), μέσω των οποίων γίνεται και η τροφοδοσία των ριζών και άλλων μη φωτοσυνθετικών ιστών με τα σάκχαρα που παράγονται στα φύλλα (Εικ. 6.1). Οι χλωροπλάστες, φακοειδούς συνήθως μορφής, περιβάλλονται από διπλή στοιχειώδη μεμβράνη που τους απομονώνει από το υπόλοιπο κύτταρο. Στο εσωτερικό τους υπάρχει υδατώδης ρευστή μάζα, που ονομάζεται στρώμα, και ένα εκτεταμένο δίκτυο πεπλατυσμένων μεμβρανικών σάκων, τα θυλακοειδή, στις μεμβράνες των οποίων βρίσκεται η χλωροφύλλη. Όπως εξηγείται στη συνέχεια, στις θυλακοειδείς μεμβράνες επιτελούνται οι λεγόμενες «φωτεινές αντιδράσεις» της φωτοσύνθεσης, ενώ στο στρώμα οι «σκοτεινές αντιδράσεις». Ανά διαστήματα, τα θυλακοειδή στοιβάζονται το ένα πάνω στο άλλο σχηματίζοντας φωτοσυνθετικά συσσωματώματα, τα grana. Μεμονωμένες μεμβρανώδεις δομές, τα ελάσματα, συνδέουν τα grana μεταξύ τους (Εικ. 6.2). Ιδιαίτερο χαρακτηριστικό των χλωροπλαστών είναι ότι περιέχουν δικό τους DNA και ριβοσώματα, όπως συμβαίνει και με τα μιτοχόνδρια, που τους επιτρέπουν να συνθέτουν μερικές από τις πρωτεΐνες τους χωρίς να εξαρτώνται ολοκληρωτικά από το γενετικό υλικό του πυρήνα, αλλά και να διαιρούνται παρέχοντας θυγατρικά οργανίδια. Παρότι οι χλωροπλάστες βρίσκονται μόνο στα φωτοσυνθετικά κύτταρα, τα οργανικά μόρια και το Ο 2 που παράγουν είναι απαραίτητα για την κάλυψη των ενεργειακών αναγκών και τη διατήρηση της ζωής όλων των οργανισμών της Γης. Εικόνα 6.2 Δομή ενός φυτικού χλωροπλάστη (αριστερά) και μικροσκοπική απεικόνιση χλωροπλαστών στο εσωτερικό φυτικών κυττάρων (δεξιά)

3 1.2. Φωτοσυνθετικές χρωστικές Στα κύτταρα, η φωτεινή ακτινοβολία δεσμεύεται από τις φωτοσυνθετικές χρωστικές. Απ αυτές, οι πιο σημαντικές είναι οι χλωροφύλλες. Οι χλωροφύλλες είναι πολύπλοκες οργανικές ενώσεις που φέρουν ένα κεντρικό άτομο μαγνησίου και είναι διαδεδομένες σε όλα τα φυτά, στα πρώτιστα, στα κυανοφύκη και σε ορισμένα βακτήρια (βακτηριοχλωροφύλλες). Οι συνηθέστεροι τύποι χλωροφυλλών είναι η χλωροφύλλη α, που συμμετέχει άμεσα στις φωτεινές αντιδράσεις, και η χλωροφύλλη β, που διαφέρει ελάχιστα ως προς τη δομή της από τη χλωροφύλλη α. Άλλη σημαντική ομάδα φωτοσυνθετικών χρωστικών είναι τα καροτενοειδή. Οι παραπάνω χρωστικές απορροφούν διαφορετικά μήκη κύματος του φωτός (Εικ. 6.3). Τα μήκη κύματος που απορροφώνται από μία χρωστική απουσιάζουν από το φως. Οι χλωροφύλλες, για παράδειγμα, απορροφούν κυρίως την μπλε και την ερυθρή ακτινοβολία και ανακλούν την πράσινη, δίνοντας έτσι στα φυτά το χαρακτηριστικό πράσινο χρώμα. Τα καροτενοειδή πάλι, απορροφούν το φως στα μήκη κύματος του ιώδους, του κυανού και του πράσινου (Εικ. 6.3). Η παρουσία αυτών των ενώσεων στους χλωροπλάστες διευρύνει περεταίρω το φάσμα των χρωμάτων που συνεισφέρουν στη φωτοσύνθεση (γι αυτόν τον λόγο ονομάζονται βοηθητικές ή συµπληρωµατικές χρωστικές), παρέχοντας επιπλέον φωτοπροστασία στις χλωροφύλλες, δηλαδή προστασία έναντι ενός περιβαλλοντικού φωτισμού υψηλής έντασης που θα μπορούσε να προκαλέσει βλάβες στο μόριο της χλωροφύλλης. Τα καροτενοειδή διακρίνονται σε δύο κύριες κατηγορίες, τις ξανθοφύλλες και τα καροτένια, όπως το β-καροτένιο που είναι το κυρίαρχο καροτινοειδές στα καρότα. Αν και καροτεινοειδή βρίσκονται σε όλα τα κύτταρα που φωτοσυνθέτουν, το χρώμα τους (διάφορες αποχρώσεις του κίτρινου, πορτοκαλί και κόκκινου) καλύπτεται από αυτό της χλωροφύλλης. Το φθινόπωρο, ωστόσο, όταν στα φυλλοβόλα φυτά αποδομούνται οι χλωροφύλλες, γίνεται ορατό το χρώμα των καροτενοειδών, γεγονός που εξηγεί την ποικιλία χρωµάτων που παρουσιάζουν τα φύλλα των διαφόρων φυλλοβόλων φυτών το φθινόπωρο. Μια άλλη κατηγορία φωτοσυνθετικών χρωστικών είναι οι φυκομπιλίνες (φυκοκυανίνη και φυκοερυθρίνη), που είναι οι κυρίαρχες συµπληρωµατικές χρωστικές στα κυανοβακτήρια και στα ερυθρά φύκη. Οι χρωστικές αυτές απορροφούν αποτελεσματικά το φως στην περιοχή του πορτοκαλί, του κίτρινου και του πράσινου, σε μήκη κύματος που δεν απορροφούν οι χλωροφύλλες. Εικόνα 6.3 Το φάσμα απορρόφησης της χλωροφύλλης α, της χλωροφύλλης β και των καροτενοειδών Η φωτοσύνθεση στα φυτά: μια διαδικασία σε δύο στάδια Η φωτοσυνθετική διεργασία κατά την οποία τα χλωροφυλλούχα φυτά παράγουν οργανικές ενώσεις (όπως γλυκόζη) και οξυγόνο από διοξείδιο του άνθρακα και νερό είναι δυνατόν να συνοψιστεί στην ακόλουθη απλοποιημένη εξίσωση: 6CΟ Η 2 Ο + Ενέργεια του φωτός C 6 Η 12 Ο 6 + 6O 2 + 6Η 2 Ο

4 Στην παραπάνω αντίδραση το νερό εμφανίζεται και στα δύο σκέλη της εξίσωσης (επειδή κατά τη φωτοσύνθεση δεν καταναλώνεται μόνο νερό αλλά και συντίθεται) και γι αυτόν τον λόγο συχνά παρουσιάζεται ακόμη πιο απλοποιημένη ως: 6CΟ 2 + 6Η 2 Ο + Ενέργεια του φωτός C 6 Η 12 Ο 6 + 6O 2. Ωστόσο, η πιο απλοποιημένη εκδοχή υποδηλώνει ότι το ελεύθερο οξυγόνο προέρχεται εξ ημισείας από το CO 2 και το Η 2 Ο, ενώ, στην πραγματικότητα, το οξυγόνο προέρχεται αποκλειστικά από τη διάσπαση του Η 2 Ο. Για την ακρίβεια, η φωτοσύνθεση πραγματοποιείται σε δύο επιμέρους στάδια μέσω μιας σειράς πολύπλοκων χημικών αντιδράσεων που λαμβάνουν χώρα στους χλωροπλάστες, οι οποίες είναι γνωστές ως φωτεινές και σκοτεινές αντιδράσεις (οι τελευταίες ονομάζονται επίσης και φωτοανεξάρτητες αντιδράσεις ή κύκλος του Calvin). «Φωτεινές αντιδράσεις» ονομάζονται επειδή απαραίτητη προϋπόθεση για να πραγματοποιηθούν είναι η ύπαρξη φωτός, σε αντιδιαστολή με τις «σκοτεινές αντιδράσεις» που μπορούν να πραγματοποιηθούν και στο σκοτάδι (δεν απαιτείται άμεσα η παρουσία φωτός) Φωτεινές αντιδράσεις Οι φωτεινές αντιδράσεις είναι το στάδιο της φωτοσύνθεσης κατά το οποίο η ηλιακή ακτινοβολία μετατρέπετε σε χημική ενέργεια. Το φως που απορροφά η χλωροφύλλη (πολλά μόρια της οποίας μαζί µε συμπληρωματικές χρωστικές και μεταφορείς ηλεκτρονίων οργανώνονται σε μονάδες συλλογής του φωτός που ονομάζονται φωτοσυστήµατα) προκαλεί διέγερση του μορίου της, τροφοδοτώντας ενεργειακά τη μεταφορά ηλεκτρονίων και ιόντων υδρογόνου (Η + ). Δότης των ηλεκτρονίων που χάνει η χλωροφύλλη είναι το νερό, το οποίο διασπάται (φωτολύεται) με αποτέλεσμα την απελευθέρωση Ο 2, και αποδέκτης το συνένζυμο NADP (φωσφορικό δινουκλεοτίδιο νικοτιναμίδης-αδενίνης), στο οποίο τα ηλεκτρόνια αποθηκεύονται προσωρινά σε κατάσταση υψηλής δυναμικής ενέργειας. Δηλαδή, οι φωτεινές αντιδράσεις χρησιμοποιούν την ενέργεια της ηλιακής ακτινοβολίας για την αναγωγή του NADP + σε NADPΗ, με την προσθήκη ενός ζεύγους ηλεκτρονίων και ενός Η +. Κατά τη μεταφορά των ηλεκτρονίων παράγεται ΑΤΡ (η όλη διεργασία ονομάζεται φωτοφωσφορυλίωση), που συνιστά το ενεργειακό νόμισμα για μεγάλο αριθμό κυτταρικών αντιδράσεων. Επομένως, κατά τις φωτεινές αντιδράσεις, η ενέργεια του φωτός μετατρέπεται αρχικά σε χημική ενέργεια με τη μορφή δύο ενώσεων, του NADP (που δρα ως «αναγωγική δύναμη», δηλαδή πηγή ηλεκτρονίων για την αναγωγή άλλων ενώσεων) και του ΑΤΡ (Εικ. 6.4). Κατά το στάδιο των φωτεινών αντιδράσεων δεν παράγονται σάκχαρα, κάτι που γίνεται στο δεύτερο στάδιο της φωτοσύνθεσης, τις σκοτεινές αντιδράσεις Σκοτεινές αντιδράσεις Οι σκοτεινές αντιδράσεις αναφέρονται και ως κύκλος του Calvin προς τιμή του Αμερικανού χημικού Μέλβιν Κάλβιν ( ), ο οποίος στα τέλη της δεκαετίας του 1940 περιέγραψε τη σειρά των βιοχημικών αντιδράσεων που οδηγούν στη σύνθεση υδατανθράκων κατά τη φωτοσύνθεση. Κατά τον κύκλο του Calvin, το ατμοσφαιρικό CO 2 ενσωματώνεται με αντιδράσεις αναγωγής σε περισσότερο πολύπλοκα οργανικά μόρια και τελικά σε υδατάνθρακες. Ο κύκλος ξεκινά με την ενσωμάτωση του CΟ 2 σε οργανικά μόρια που προϋπάρχουν στους χλωροπλάστες (διφοσφωρική ριβουλόζη, RuBP), φάση γνωστή ως δέσμευση του άνθρακα. Στη συνέχεια, κατά την πορεία του κύκλου προστίθενται ηλεκτρόνια στον νεοενσωματωμένο άνθρακα, ανάγοντάς τον σε υδατάνθρακα. Η αναγωγική ισχύς προέρχεται από το NADP, ενώ η ενέργεια για τη σειρά των αντιδράσεων αυτών παρέχεται από το ATP (τα οποία, όπως προαναφέρθηκε, είναι προϊόντα των φωτεινών αντιδράσεων). Ο υδατάνθρακας που παράγεται άμεσα από τον κύκλο του Calvin δεν είναι η γλυκόζη, αλλά ένα σάκχαρο τριών ατόμων άνθρακα που ονομάζεται 3-φωσφωρική γλυκερυναλδεΰδη (G3Ρ), για τη σύνθεση του οποίου απαιτούνται τρεις συνεχόμενες εκτελέσεις του κύκλου (δέσμευση τριών μορίων CO 2 ). Αυτό σημαίνει ότι σε κάθε έξι ολοκληρώσεις του κύκλου παράγονται επαρκείς ποσότητες G3Ρ προκειμένου να παραχθεί ένα μόριο γλυκόζης, ενώ ταυτοχρόνως αναγεννάτε το αρχικό μόριο-δέκτης του CO 2 (Εικ. 6.4). Ο κύκλος του Calvin λαμβάνει χώρα στο στρώμα του χλωροπλάστη, ενώ οι φωτεινές αντιδράσεις εκτελούνται στις μεμβράνες των θυλακοειδών. Αν και για την ολοκλήρωση του κύκλου του Calvin δεν απαιτείται η παρουσία φωτός, στα περισσότερα φυτά ο κύκλος γίνεται κατά τη διάρκεια της ημέρας, αφού μόνο τότε μπορούν να παραχθούν (από τις φωτεινές αντιδράσεις) τα απαιτούμενα NADP και ΑΤΡ. Στην Εικόνα

5 συνοψίζονται τα δύο φωτοσυνθετικά στάδια και παρουσιάζονται απλοποιημένα τα κύρια αντιδρώντα και προϊόντα των φωτεινών αντιδράσεων και του κύκλου του Calvin. Εικόνα 6.4 Επισκόπηση της φωτοσύνθεσης: συνεργασία των φωτεινών και των σκοτεινών αντιδράσεων Χρωματογραφία H χρωματογραφία είναι μια ευρύτατα διαδεδομένη εργαστηριακή τεχνική διαχωρισμού ουσιών από ένα μίγμα τους. Το μίγμα των ουσιών τοποθετείται στη μία άκρη ενός υλικού προσρόφησης που ονομάζεται στατική φάση. Στη συνέχεια, το μίγμα εκλούεται (ξεπλένεται) από μία κινητή φάση (έναν διαλύτη ή ένα αέριο) η οποία κινείται προς την άλλη άκρη της στατικής φάσης. Όσες ουσίες κατακρατούνται ασθενέστερα από τη στατική φάση και είναι πιο διαλυτές στην κινητή φάση κινούνται ταχύτερα κατά τη ροή της κινητής φάσης, ενώ όσες κατακρατούνται ισχυρότερα «τρέχουν» πιο αργά. Το αποτέλεσμα είναι ο διαχωρισμός τους. Η χρωµατογραφία δεν περιορίζεται µόνο σε αναλυτικούς προσδιορισμούς, αλλά μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην παρασκευή υψηλής καθαρότητας ουσιών, στη διερεύνηση της δομής των µορίων και στον προσδιορισμό φυσικοχημικών σταθερών κ.λπ. Σήμερα χρησιμοποιούνται ευρέως διάφορες μέθοδοι χρωματογραφίας για τον διαχωρισμό και την απομόνωση ουσιών, οι οποίες κατατάσσονται σε είδη, κυρίως ανάλογα με τη μορφή της στατικής φάσης (χάρτου, στήλης κ.λπ.), τη φύση της στατικής και της κινητής φάσης (στερεού-υγρού, υγρού-αερίου κ.λπ.) και τον μηχανισμό διαχωρισμού (προσρόφησης, κατανομής κ.λπ.). Χρωματογραφία χάρτου: Είναι η πιο απλή μορφή χρωματογραφίας. Στην άκρη μιας λωρίδας προσροφητικού χαρτιού (στατική φάση) τοποθετείται μια κηλίδα δείγματος. Το χαρτί βυθίζεται στον κατάλληλο διαλύτη (κινητή φάση) από τη μεριά της κηλίδας και όπως διαποτίζεται σιγά-σιγά από τον διαλύτη εκλούονται τα συστατικά του δείγματος και γίνεται διαχωρισμός (Εικ. 6.5). Πρόκειται για αναλυτική μέθοδο, κατάλληλη για τον διαχωρισμό χρωματιστών ενώσεων, όπως οι φωτοσυνθετικές χρωστικές. Αν και έχει εν πολλοίς αντικατασταθεί από τη χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (βλέπε παρακάτω) χρησιμοποιείται ευρέως για εκπαιδευτικούς σκοπούς. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Ως συντελεστής επιβράδυνσης (Retardation factor, Rƒ) μιας ουσίας ορίζεται ο λόγος της απόστασης που διανύθηκε από την ουσία προς την απόσταση που διήνυσε ο διαλύτης. Εάν η τιμή Rƒ μιας ουσίας είναι μηδέν, αυτό σημαίνει ότι η διαλυμένη ουσία παραμένει στη στατική φάση αμετακίνητη. Αν η τιμή Rƒ=1, τότε η διαλυμένη ουσία δεν έχει καμία συγγένεια για τη στατική φάση και «ταξιδεύει» με το μέτωπο του διαλύτη. Για τον υπολογισμό της τιμής Rƒ, μετράμε την απόσταση που διανύθηκε από την

6 ουσία και τη διαιρούμε μ αυτή που διανύθηκε από τον διαλύτη (Εικ. 6.5). Για παράδειγμα, εάν μία χημική ένωση διήνυσε 2,4 εκατοστά και το μέτωπο του διαλύτη διήνυσε 3,2 εκατοστά, τότε η τιμή Rƒ της ουσίας αυτής ισούται με 0,75 (2,4/3,2 = 0,75). Η τιμή Rƒ εξαρτάται από τη θερμοκρασία και τον διαλύτη που χρησιμοποιείται κάθε φορά, επομένως διαφορετικοί διαλύτες δίνουν διαφορετικές τιμές Rƒ για το ίδιο μίγμα ουσιών. Εικόνα 6.5 Χρωματογραφία χάρτου και τρόπος προσδιορισμού του συντελεστής επιβράδυνσης (Rf) μιας ουσίας. Χρωματογραφία στήλης: Κατά τη μέθοδο αυτή, το δείγμα τοποθετείται στην αρχή (κορυφή) μίας στήλης, συχνά ενός υάλινου σωλήνα, γεμάτης με το κατάλληλο προσροφητικό υλικό (π.χ. οξείδιο του πυριτίου). Ακολουθεί η έκλουση του δείγματος με τη βοήθεια του διαλύτη, ο οποίος διέρχεται µέσω της στατικής φάσης µε την εφαρμογή πίεσης σ αυτήν ή λόγω της βαρύτητας. Τα συστατικά του δείγματος μετακινούνται κατά μήκος της στήλης µε διαφορετική ταχύτητα, η οποία εξαρτάται από τη συγγένεια του κάθε συστατικού ως προς τη στατική φάση, και καθώς εξέρχονται από την άλλη άκρη της στήλης απομονώνονται ως ξεχωριστά κλάσματα (Εικ. 6.6). Εικόνα 6.6 Χρωματογραφία στήλης και κλασμάτωση των συστατικών ενός δείγματος

7 Χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (Thin Layer Chromatography, TLC): Είναι ανάλογη της χρωματογραφίας χάρτου, αλλά αντί χαρτιού χρησιμοποιείται λεπτή στιβάδα προσροφητικού υλικού που στηρίζεται πάνω σε λεία επιφάνεια (συνήθως οξείδιο πυριτίου ή αλουμίνα πάνω σε γυάλινη πλάκα). Έχει πολύ καλύτερη ικανότητα διαχωρισμού από τη χρωματογραφία χάρτου. Αέριος χρωματογραφία (Gas Chromatography, GC): Σ αυτή, η κινητή φάση είναι αέριο και η όλη οργανολογία είναι αρκετά πολύπλοκη (Εικ. 6.7). Το δείγμα εισάγεται σ έναν χώρο όπου αεριοποιείται άμεσα. Αυτό σημαίνει ότι όλα τα συστατικά του δείγματος πρέπει να μπορούν να αεριοποιηθούν. Το αέριο πλέον δείγμα παρασύρεται μέσα σε μια στήλη που περιέχει το προσροφητικό υλικό, οπότε επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός. Έτσι, από την άλλη άκρη της στήλης εξέρχονται με τη σειρά τα διαχωρισθέντα συστατικά. Από εκεί οδηγούνται σ έναν ανιχνευτή (ηλεκτρονικό μέρος), ο οποίος στέλνει σήματα σ ένα καταγραφικό ανάλογα με την ένταση ανίχνευσης. Με τη μέθοδο αυτή επιτυγχάνεται όχι μόνο πολύ καλός διαχωρισμός των ουσιών ενός μίγματος, αλλά και ανιχνεύονται ουσίες που βρίσκονται σε μικροποσότητες (της τάξης των ng ή pg). Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Πίεσης (High Pressure Liquid Chromatography, HPLC): Πρόκειται για εξέλιξη της χρωματογραφίας στήλης, κατά την οποία χρησιμοποιείται κατάλληλος μηχανολογικός/ηλεκτρονικός εξοπλισμός (Εικ. 6.7). Ο διαλύτης διέρχεται από τη στήλη με τη βοήθεια αντλίας, με υψηλή πίεση, ακριβώς λόγω της οποίας η HPLC είναι ταχύτατη (παρέχει αποτέλεσμα σε μερικά λεπτά της ώρας) και επειδή χρησιμοποιούνται λεπτόκοκκα υλικά προσρόφησης έχει πολύ μεγάλη ικανότητα διαχωρισμού. Εικόνα 6.7 Σύστημα αέριας χρωματογραφίας GC (αριστερά) και υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης HPLC (δεξιά). 2. Πρακτικό μέρος 2.1. Κατάλογος εφοδίων Συσκευές πηγή φωτός (με λυχνία 100 Watt ή μεγαλύτερη), χρονόμετρο, φυγόκεντρος, καμινέτο (λύχνος buncen)

8 Υλικά φρέσκα φύλλα σπανακιού (ή άλλου φυτού χωρίς πολλές επιδερμικές τρίχες, π.χ., κισσός), φρέσκα φύλλα γερανιού που έχουν παραμείνει εκτεθειμένα στο φως και στο σκοτάδι, φελλοτρυπητήρας ή πλαστικά καλαμάκια του καφέ μεγάλης διαμέτρου, πλαστικές σύριγγες των 20 ml, χωρίς βελόνα, υάλινα ποτήρια ζέσεως ή διαφανή πλαστικά κύπελλα των 100 και 500 ml, υάλινες ράβδοι ανάδευσης, σταγονόμετρα ή σιφώνια (πιπέτες) μεταφοράς του 1 ml, πορσελάνινο γουδί, άμμος, πλαστικοί σωλήνες φυγοκέντρου των 15 ml, υάλινη διαχωριστική χοάνη, δοκιμαστικοί σωλήνες των 10 και 20 ml, ογκομετρικοί κύλινδροι των 25 ml, υάλινοι ογκομετρικοί κύλινδροι των 100 ml με πώμα (λαστιχένιο πώμα ή φελλό), ξηρό χαρτί χρωματογραφίας Whatman No1, υάλινα τριχοειδή σιφώνια, λαβίδα, ψαλίδι, πλαστικά κουταλάκια, συνδετήρες, μολύβι, τρυβλία Petri Διαλύματα διάλυμα 0,5% όξινου ανθρακικού νατρίου (NaHCO 3 ) (μαγειρική σόδα), αραιό διάλυμα υγρού απορρυπαντικού (1 κουταλάκι απορρυπαντικού πιάτων σε 50 ml νερό), ακετόνη (διάλυμα 80% v/v), καθαρός πετρελαϊκός αιθέρας, υγρό ανάπτυξης (έκλουσης) πετρελαϊκός αιθέρας: βενζόλιο: ακετόνη 40:10:5 (v/v), καθαρή αιθανόλη (οινόπνευμα 95%), χρωστική Lugol (υδατικό διάλυμα ιωδίου/ιωδιούχου καλίου) Πειραματική διαδικασία Μελέτη της φωτοσύνθεσης στα φύλλα φυτών με την τεχνική των πλωτών δίσκων Στο πείραμα αυτό θα διαπιστώσετε τη διεργασία της φωτοσύνθεσης στα φύλλα των φυτών χρησιμοποιώντας μικρούς δίσκους φύλλων, τους οποίους θα κόψετε από φύλλα σπανακιού. Οι δίσκοι των φύλλων κανονικά επιπλέουν σε ένα υδατικό διάλυμα, εξαιτίας του αέρα που παγιδεύεται στα διάκενα του σπογγώδους παρεγχύματος στο μεσόφυλλο του φύλλου (βλέπε Άσκηση 3, Εικ. 3.10). Εάν οι χώροι αέρα πληρωθούν με το υδατικό διάλυμα στο οποίο επιπλέουν οι δίσκοι των φύλλων, τότε η πυκνότητα των δίσκων αυξάνεται, βαραίνουν και αρχίζουν σιγά-σιγά να βυθίζονται στο διάλυμα. Το διάλυμα που θα χρησιμοποιήσετε περιέχει όξινα ανθρακικά ιόντα, αλλιώς διττανθρακικά ιόντα (HCO 3 - ), τα οποία θα χρησιμεύουν ως πηγή CO 2 για τη φωτοσύνθεση. Καθώς η φωτοσύνθεση προχωρά απελευθερώνεται O 2 που δημιουργεί φυσαλίδες στα διάκενα του μεσόφυλλου, προκαλώντας την άνωση των δίσκων (Εικ. 6.8). Ο ρυθμός με τον οποίο οι δίσκοι αρχίζουν να επιπλέουν και πάλι είναι μια έμμεση μέτρηση του ρυθμού φωτοσύνθεσης. Στη συνέχεια περιγράφεται η διαδικασία που θα ακολουθήσετε για να διαπιστώσετε την παραγωγή O 2 κατά την πορεία των φωτεινών αντιδράσεων της φωτοσύνθεσης

9 Εικόνα 6.8 Η τεχνική των πλωτών δίσκων για τη μελέτη της φωτοσύνθεσης στα φύλλα των φυτών. 1. Αρχικά θα προετοιμάστε το διάλυμα 0,5% όξινου ανθρακικού νατρίου διαλύοντας 2,5 gr μαγειρικής σόδας (~ ½ κουταλάκι του γλυκού) σε 500 ml νερού. Όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως, τα διττανθρακικά ιόντα (HCO 3 - ) που περιέχει το διάλυμα θα αποτελέσουν την πηγή CO 2 για τη φωτοσύνθεση. 2. Γεμίστε μέχρι τη μέση ένα υάλινο ποτήρι ζέσεως των 100 ml με το διάλυμα του όξινου ανθρακικού νατρίου και με τη χρήση σταγονόμετρου προσθέστε 2-3 σταγόνες αραιού διαλύματος υγρού απορρυπαντικού. Αναδέψτε ελαφρά με μία υάλινη ράβδο ή ένα πλαστικό καλαμάκι, αποφεύγοντας το σχηματισμό φυσαλίδων. Εάν σχηματιστούν φυσαλίδες προσθέστε περισσότερο διάλυμα όξινου ανθρακικού νατρίου. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το απορρυπαντικό βοηθά στη διάρρηξη της κηρώδους επικάλυψης της επιδερμίδας των φύλλων και δρα ως επιφανειοδραστικός παράγοντας που μειώνει την επιφανειακή τάση, διευκολύνοντας έτσι τη διείσδυση του διαλύματος όξινου ανθρακικού νατρίου στα διάκενα του μεσόφυλλου. 3. Χρησιμοποιώντας τον τρυπητήρα φελλών ή αλλιώς ένα πλαστικό καλαμάκι του καφέ, κόψτε 10 ομοιόμορφους δίσκους φύλλων από ένα τρυφερό φύλλο σπανακιού. Πιέστε το καλαμάκι κάθετα στο φύλλο και με περιστροφικές κινήσεις διαχωρίστε τους δίσκους, όπως υποδεικνύεται στην Εικόνα 6.9Α. Αποφύγετε να τρυπήσετε σε περιοχές όπου υπάρχουν νεύρα του φύλλου. 4. Αφαιρέστε το έμβολο από μία πλαστική σύριγγα των 20 ml και τοποθετήστε στο εσωτερικό της τους δίσκους του φύλλου φυσώντας το καλαμάκι ή με τη βοήθεια μιας λαβίδας, προσέχοντας να μην τραυματιστούν οι δίσκοι (Εικ. 6.9Β). Βεβαιωθείτε ότι όλοι οι δίσκοι βρίσκονται στην αρχή της σύριγγας (κοντά στο στόμιο) και επανατοποθετήστε το έμβολο. Πιέστε το έμβολο σχεδόν μέχρι το τέλος, προσέχοντας να μην συνθλίψετε τους δίσκους του φύλλου. 5. Αναρροφήστε ~10 ml διαλύματος NaHCO 3 /απορρυπαντικού (Εικ. 6.9Γ) και στη συνέχεια αναστρέψτε τη σύριγγα σε κάθετη θέση. Χτυπήστε ελαφρά με το χέρι σας τη σύριγγα ώστε όλοι οι δίσκοι να ξεκολλήσουν από τα τοιχώματα. Οι δίσκοι κανονικά θα πρέπει να επιπλέουν στο διάλυμα. Σπρώξτε προσεκτικά το έμβολο προς τα μέσα προκειμένου να αποβάλλεται όσον αέρα έχει παραμένει στη σύριγγα

10 6. Με τον δείκτη του ενός χεριού σφραγίστε το στόμιο της σύριγγας και με το άλλο σας χέρι τραβήξτε το έμβολο προς τα έξω για να δημιουργήσετε στιγμιαία κενό στο εσωτερικό της σύριγγας (Εικ. 6.9Δ). Κρατήστε αυτό το κενό για περίπου 10 δευτερόλεπτα. Κανονικά, αν έχετε σφραγίσει καλά το στόμιο της σύριγγας θα πρέπει να συναντήσετε δυσκολία στο τράβηγμα του εμβόλου και θα βλέπετε μικρές φυσαλίδες αέρα να απελευθερώνονται από τις άκρες των δίσκων του φύλλου. Με τον τρόπο αυτό «εξαναγκάζετε» τον αέρα που υπάρχει στα διάκενα του μεσόφυλλου να εξέλθει από τους δίσκους. Ακολούθως, και ενώ κρατάτε ακόμη σφραγισμένο το στόμιο της σύριγγας, πιέστε το έμβολο προς τα μέσα για να βοηθήσετε την είσοδο διαλύματος NaHCO 3 στο εσωτερικό των δίσκων του φύλλου (Εικ. 6.9Δ). 7. Αμέσως μετά, απελευθερώστε το στόμιο και χτυπήστε ελαφρά τα τοιχώματα της σύριγγας. Οι δίσκοι του φύλλου θα πρέπει τώρα να αρχίσουν σιγά-σιγά να βυθίζονται στο διάλυμα (Εικ. 6.9Ε). 8. Επαναλάβετε τα στάδια 6 και 7 προκειμένου να επιτύχετε την καταβύθιση όλων των δίσκων (1-2 επαναλήψεις θα πρέπει να είναι αρκετές). Ιδιαίτερη προσοχή απαιτείται στην εκτέλεση των σταδίων αυτών, καθώς οι πολλές επαναλήψεις μπορεί να βλάψουν την ακεραιότητα των φυτικών κυττάρων στους δίσκους, οδηγώντας σε αποτυχία του πειράματος. Εικόνα 6.9 Πειραματική διαδικασία για τη μελέτη της φωτοσύνθεσης σε φύλλα με την τεχνική των πλωτών δίσκων. 9. Αφού αφαιρέσετε το έμβολο της σύριγγας, χύστε τους δίσκους μαζί με το διάλυμα σε ένα ποτήρι ζέσεως των 100 ml που έχετε γεμίσει μέχρι τη μέση με φρέσκο διάλυμα όξινου ανθρακικού νατρίου. Σιγουρευτείτε ότι όλοι οι δίσκοι έχουν κατακάτσει στον πυθμένα του ποτηριού. Ανάψτε τη λυχνία (την οποία έχετε τοποθετήσει σε απόσταση ~20 cm από την άκρη του ποτηριού) και ξεκινήστε το χρονόμετρο. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εναλλακτικά, μπορείτε να τοποθετήστε απευθείας τη σύριγγα με τους καταβυθισμένους δίσκους των φύλλων κάτω από τη φωτεινή πηγή (Εικ. 6.9ΣΤ), αφού προηγουμένως γεμίσετε τη σύριγγα με 20 ml φρέσκου διαλύματος NaHCO

11 10. Παρατηρήστε τι συμβαίνει με τους δίσκους των φύλλων καθώς προχωρά η φωτοσύνθεση (βλέπε Εικ. 6.8 και 6.9ΣΤ). Συνεχίστε την παρατήρηση για τα επόμενα λεπτά, καταγράφοντας ανά λεπτό τα αποτελέσματά σας στον Πίνακα 6.1. Στο τέλος κάθε χρονικής στιγμής χτυπάτε ελαφρά με το χέρι σας τα τοιχώματα του ποτηριού ή της σύριγγας, για να σιγουρέψετε ότι κάποιοι από τους δίσκους δεν έχουν «κολλήσει» στα τοιχώματα. 11. Επαναλάβετε την όλη διαδικασία (στάδια 2-10) υπό τις παρακάτω νέες πειραματικές συνθήκες: α) καλύπτοντας το ποτήρι με τους δίσκους του φύλλου στο στάδιο 9 με μία μαύρη πλαστική σακούλα ή ένα χάρτινο κουτί κατάλληλων διαστάσεων, προκειμένου να εμποδίσετε το φως (δοκιμασία στο Σκοτάδι), β) χρησιμοποιώντας σε όλα τα στάδια σκέτο καθαρό νερό με απορρυπαντικό, αντί δηλαδή για διάλυμα NaHCO 3 /απορρυπαντικού (δοκιμασία χωρίς NaHCO 3 ). Καταγράψτε στον Πίνακα 6.1 τα αποτελέσματα των δοκιμασιών αυτών και συγκρίνετέ τα μ αυτά της πρώτης δοκιμασίας. ΣΧΟΛΙΟ: Οι δοκιμασίες που θα συγκρίνετε στο πείραμα αυτό πρέπει κανονικά να εκτελούνται παράλληλα προκειμένου να περιορίσετε τους παράγοντες που θα μπορούσαν να τροποποιήσουν τα αποτελέσματά σας (π.χ. δίσκοι από διαφορετικά φύλλα σπανακιού σε κάθε δοκιμασία ή διαφορετικός χειρισμός των δίσκων). Ποιούς άλλους παράγοντες μπορείτε να σκεφτείτε που θα μπορούσαν να επηρεάσουν τα αποτελέσματα του πειράματος αυτού; Χρόνος (min) Αριθμός πλωτών δίσκων (ΦΩΣ) Αριθμός πλωτών δίσκων (ΣΚΟΤΑΔΙ) Αριθμός πλωτών δίσκων (χωρίς NaHCO3) Πίνακας 6.1 Πειραματικές μετρήσεις του αριθμού των πλωτών δίσκων

12 Ποιοτικός προσδιορισμός φωτοσυνθετικών χρωστικών Για τον ποιοτικό προσδιορισμό των φωτοσυνθετικών χρωστικών θα εφαρμόσετε την τεχνική του διαχωρισμού τους με χρωματογραφία χάρτου. Αρχικά, γίνεται απομόνωση (εκχυλίση) των χρωστικών από μαλακά φύλλα (σπανάκι, κολεό κ.λπ.), τα οποία λειοτριβούνται παρουσία ενός εκχυλιστικού μέσου (ενός οργανικού διαλύτη στον οποίο διαλυτοποιούνται οι λιπόφιλες φωτοσυνθετικές χρωστικές). Στο πείραμα αυτό θα χρησιμοποιήσετε φύλλα σπανακιού και ως εκχυλιστικό μέσο την ακετόνη (διάλυμα 80%) γιατί αναμιγνύεται καλά με το περιεχόμενο στα κύτταρα νερό χωρίς να δημιουργεί γαλάκτωμα (σε αντίθεση με άλλους οργανικούς διαλύτες, π.χ. βενζόλιο, αιθανόλη, μεθανόλη). Α. Εκχύλιση μίγματος χρωστικών 1. Με τη βοήθεια ψαλιδιού κόψτε σε μικρά κομμάτια 2-3 φύλλα σπανακιού σε ένα γουδί πορσελάνης. Τοποθετήστε στο γουδί μικρή ποσότητα καθαρής άμμου (~0,2 g) και λειοτριβήστε τα κομμάτια των φύλλων προσθέτοντας τμηματικά 15 ml ακετόνης 80%. Συνεχίστε τη λειοτρίβηση για μερικά λεπτά ώσπου το διάλυμα να γίνει πράσινο και όσο το δυνατόν ομογενές. 2. Το εκχύλισμα που προκύπτει δεν είναι διαυγές γιατί περιέχει υπολείμματα κυττάρων, αγγεία και άμμο (η οποία προστίθεται γιατί διευκολύνει τη λειοτρίβηση). Για τον λόγο αυτό, μεταφέρετε το εκχύλισμα σε έναν πλαστικό σωλήνα φυγοκέντρου και φυγοκεντρήστε στις rpm για 5 min. Απομακρύνετε με τη βοήθεια σιφωνίου το διαυγές, πράσινο υπερκείμενο σε έναν καθαρό ογκομετρικό σωλήνα. 3. Τοποθετήστε σε μία διαχωριστική χοάνη το υπερκείμενο της φυγοκέντρησης (ακετονικό εκχύλισμα) και προσθέστε σιγά-σιγά και από τα τοιχώματα ίση ποσότητα αιθέρα. Αναδέψτε το μίγμα ήπια ώστε να αποφευχθεί η δημιουργία γαλακτώματος. Στη συνέχεια, προσθέστε νερό (πάλι σιγά-σιγά και από τα τοιχώματα) με ήπια συνεχή ανάδευση μέχρι τη δημιουργία δύο φάσεων (Εικ. 6.10). ΠΡΟΣΟΧΗ: Καθώς αναμιγνύετε το μίγμα με τον αιθέρα, θα πρέπει κατά διαστήματα να γυρίζετε τη χοάνη προς τα πάνω και να ανοίγετε τη στρόφιγγα για να εκτονώνεται ο αέρας. Είναι πολύ σημαντικό ο αιθέρας και μετά το νερό να προστίθενται αργά και από τα τοιχώματα. Αν ξεπεράσετε τον όγκο νερού που απαιτείται θα εξαφανισθούν οι δύο φάσεις. 4. Με τη διαχωριστική χοάνη σε κάθετη θέση, ανοίξτε προσεκτικά τη στρόφιγγα και απορρίψτε την άχρωμη φάση νερού-ακετόνης (Εικ. 6.10). Απομονώστε σε έναν καθαρό δοκιμαστικό σωλήνα την υπερκείμενη αιθερική φάση που περιέχει τις χρωστικές. Εικόνα 6.10 Δημιουργία φάσεων και μεταφορά του υδατοακετονικού εκχυλίσματος σε αιθέρα

13 Β. Διαχωρισμός χρωστικών με χρωματογραφία χάρτου 5. Κόψτε μία λωρίδα χαρτιού χρωματογραφίας (Whatman No1) που να έχει μήκος όσο και ο ογκομετρικός σωλήνας στον οποίο θα τοποθετηθεί και πλάτος τέτοιο ώστε να μην ακουμπά στα τοιχώματά του όταν θα τοποθετηθεί μέσα σ αυτόν. Το χαρτί της χρωματογραφίας θα πρέπει να στηρίζεται με κάποιο τρόπο στο πώμα του ογκομετρικού σωλήνα (μπορείτε να χρησιμοποιήστε έναν συνδετήρα ως άγκιστρο) και να παραμένει κατακόρυφο. Συμβουλευτείτε την Εικόνα Με τη βοήθεια ενός τριχοειδούς σιφωνίου πάρτε μια μικρή ποσότητα του δείγματος των χρωστικών (αιθερική φάση) και ακουμπήστε προσεκτικά μία σταγόνα κοντά στην ελεύθερη άκρη του χαρτιού χρωματογραφίας. Το σημείο εκκίνησης στο χαρτί χρωματογραφίας πρέπει να βρίσκετε σε απόσταση ~2,0 cm από την άκρη του χαρτιού και να το έχετε προσημειώσει τραβώντας μια οριζόντια γραμμή με μολύβι (όχι στυλό). 7. Επαναλάβατε τη διαδικασία αυτή αρκετές φορές, ώστε να δημιουργηθεί στο σημείο εκκίνησης μία πράσινη κηλίδα, η οποία πρέπει να απλωθεί όσο το δυνατόν λιγότερο. Φροντίστε να στεγνώνει καλά η κάθε σταγόνα προτού φορτώσετε την επόμενη (φυσώντας συνέχεια για να μην απλώνει η κηλίδα). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Προκειμένου να επιτύχετε καλό διαχωρισμό των χρωστικών (ευδιάκριτες ζώνες) πρέπει η αρχική κηλίδα δείγματος να είναι μικρής επιφάνειας. Πετυχημένες κηλίδες είναι αυτές που έχουν μικρή έκταση, ενώ συγχρόνως περιέχουν αρκετή συγκέντρωση των προς ανάλυση ουσιών, ώστε αυτές να διακρίνονται μετά την ανάπτυξη του χρωματογραφήματος. Προς την κατεύθυνση αυτή βοηθά η μεταφορά του αρχικού υδατοακετονικού εκχυλίσματος σε αιθέρα με μικρότερο όγκο. Έτσι, εκτός από τη συμπύκνωση των χρωστικών, απομακρύνεται και το νερό, το οποίο συνεισφέρει στο άπλωμα της κηλίδας και στεγνώνει δύσκολα. 8. Τοποθετήστε τη λωρίδα του χαρτιού με την κηλίδα στον ογκομετρικό σωλήνα και εκτελέστε ανερχόμενη χρωματογραφία με υγρό ανάπτυξης πετρελαϊκό αιθέρα: βενζόλιο: ακετόνη (40:10:5). Αποσύρετε το χαρτί της χρωματογραφίας όταν το μέτωπο του διαλύτη απέχει ~0,5 cm από το άνω άκρο (αλλιώς θα χάσετε την 1 η κηλίδα που αντιστοιχεί στο β-καροτένιο) και σημειώστε το μέτωπο του διαλύτη με το μολύβι (Εικ. 6.11). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η στάθμη του υγρού ανάπτυξης πρέπει οπωσδήποτε να είναι χαμηλότερη από το σημείο εκκίνησης (~0,5 cm), αλλιώς η αρχική κηλίδα του δείγματος θα διαλυθεί πριν διαχωρισθεί. 9. Μετά την ανάπτυξη του χρωματογραφήματος, καταγράψτε τις διάφορες κηλίδες και υπολογίστε τις τιμές Rf των χρωστικών. Εικόνα 6.11 Διαδραστική απεικόνιση ανερχόμενης χρωματογραφίας και χρωματογραφήματος φωτοσυνθετικών χρωστικών

14 Αποχρωματισμός φύλλων και ανίχνευση αμύλου Κατά τις σκοτεινές αντιδράσεις της φωτοσύνθεσης (κύκλος του Calvin), το ατμοσφαιρικό CO 2 ενσωματώνεται με αντιδράσεις αναγωγής σε πολύπλοκα οργανικά μόρια και τελικά σε υδατάνθρακες. Οι παραγόμενοι απλοί υδατάνθρακες αποθηκεύονται στα αποταμιευτικά μέρη και όργανα του φυτού ως άμυλο. Με το πείραμα αυτό θα ανιχνεύσετε με έναν απλό τρόπο την παρουσία αμύλου στα φύλλα των φυτών, εκμεταλλευόμενοι την ιδιότητα του ιωδίου να χρωματίζει με μπλε χρώμα το άμυλο. 1. Κόψτε ένα φύλλο από φυτό γερανιού ή άλλου φυτού που ήταν εκτεθειμένο στον ήλιο και τοποθετήστε το σε νερό που βράζει για ~1/2 λεπτό (Εικ. 6.12Α). Η διαδικασία αυτή νεκρώνει τα κύτταρα του φύλλου, «μαλακώνει» το κυτταρικό τοίχωμα και διαταράσσει την κυτταρική μεμβράνη, προκειμένου να υποβοηθηθεί η διείσδυση του ιωδίου. 2. Σε έναν δοκιμαστικό σωλήνα βάλτε λίγη καθαρή αιθανόλη (οινόπνευμα) και τοποθετήστε το δοκιμαστικό σωλήνα στο δοχείο µε το βραστό νερό (λουτρό ύδατος). Βυθίστε το φύλλο στον δοκιμαστικό σωλήνα, ώστε να καλυφθεί µε το οινόπνευμα (Εικ. 6.12Β). Τοποθετήστε το δοχείο µε τον δοκιμαστικό σωλήνα σε σιγανή φωτιά γκαζιού. Όπως και η ακετόνη, έτσι και η αιθανόλη έχει την ιδιότητα να διαλύει και να απομακρύνει τη χλωροφύλλη από τα φύλλα. Έτσι, το φύλλο θα αποχρωματιστεί ενώ το οινόπνευμα θα πρασινίσει. 3. Μετά από ~5 λεπτά, όταν το φύλλο θα έχει αποχρωματιστεί αρκετά, βγάλτε το από το οινόπνευμα και ξεπλύνετέ το στο ζεστό νερό για να μαλακώσει. 4. Στη συνέχεια, βάλτε το φύλο σε ένα τρυβλίο Petri και ρίξτε πάνω του μερικές σταγόνες χρωστικής Lugol (διάλυμα Ι 2 /ΙΚ) (Εικ. 6.13). Παρατηρήστε το σκούρο μπλε χρώμα που παίρνει το άμυλο παρουσία του ιωδίου. 5. Επαναλάβετε την όλη διαδικασία (στάδια 1-4) χρησιμοποιώντας αυτή τη φορά φύλλα που έχουν παραμένει στο σκοτάδι για ~1 εβδομάδα. Για τον σκοπό αυτό, οι υπεύθυνοι της άσκησης έχουν φροντίσει να καλύψουν μερικά φύλλα στη γλάστρα με το γεράνι με αλουμινόχαρτο. Τι παρατηρείτε σε σχέση με το χρώμα που βάφονται τα φύλλα αυτή τη φορά; Γιατί συμβαίνει αυτό; Εικόνα 6.12 Εκχύλιση χλωροφύλλης και αποχρωματισμός φύλλου

15 Εικόνα 6.13 Διαδραστική απεικόνιση του τρόπου ανίχνευσης αμύλου σε φύλλα παρουσία διαλύματος ιωδίου Ερωτήσεις - Παρατηρήσεις 1. Ποιοί περιβαλλοντικοί παράγοντες θα μπορούσαν να επηρεάσουν τον ρυθμό της φωτοσύνθεσης στο πείραμα με τους πλωτούς δίσκους φύλλων που εκτελέσατε; Εξηγήστε γιατί. 2. Εξηγήστε την προέλευση του Ο 2 κατά τις φωτεινές αντιδράσεις της φωτοσύνθεσης και τη χρησιμότητα του CO 2. Πώς αναμένετε να διαφέρουν τα αποτελέσματα του πειράματος με τους πλωτούς δίσκους των φύλλων παρουσία και απουσία όξινου ανθρακικού νατρίου; 3. Αν συνεχίσετε να παρατηρείτε τους πλωτούς δίσκους των φύλλων για αρκετό χρονικό διάστημα θα διαπιστώσετε ότι σιγά-σιγά αρχίζουν να καταβυθίζονται και πάλι. Μπορείτε να σκεφτείτε γιατί συμβαίνει αυτό; 4. Εξηγήστε ποια είναι η βασική αρχή της χρωματογραφίας χάρτου. Με τι κριτήρια θα επιλέγατε το υγρό ανάπτυξης (έκλουσης) που θα χρησιμοποιούσατε σε μία χρωματογραφία σε χαρτί; 5. Ποιές πληροφορίες μπορείτε να πάρετε από τον συντελεστή επιβράδυνσης (Rƒ) μιας ουσίας; Στο πείραμα που εκτελέσατε, ποιά χρωστική ουσία είχε τη μικρότερη και ποιά τη μεγαλύτερη τιμή Rf; Εάν χρησιμοποιούσατε έναν διαφορετικό διαλύτη έκλουσης, πώς θα επηρεαζόντουσαν οι τιμές Rf που προσδιορίσατε; Εξηγήστε

16 Συνιστώμενη βιβλιογραφία 1. Campbell, N. A., & Reece, J. B. (2010). Βιολογία (τόμος I). Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, Ηράκλειο Κρήτης. ISBN: