ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΑ. Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων. Λάμπρου Μαρία, M.Sc., Ph.D. Βιοχημικός & Βιοτεχνολόγος

Transcript

1 ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΑ Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων Λάμπρου Μαρία, M.Sc., Ph.D. Βιοχημικός & Βιοτεχνολόγος

2 Κλάδοι Ιατρικής Μικροβιολογίας

3 Ιατρική Παρασιτολογία Έχει ως αντικείµενο τη Βιολογία των Πρωτόζωων και των Μεταζώων, και τη µελέτη της παθογόνου δράσεώς τους

4 Παράσιτα Τι είναι; Οργανισμοί που ζουν στην εξωτερική επιφάνεια ή στα εσωτερικά όργανα ενός άλλου οργανισμού, ο οποίος ονομάζεται ξενιστής, από τον οποίο και λαμβάνουν την τροφή του και όλα τα απαραίτητα στοιχεία για την ανάπτυξή τους παθογόνο, του οποίου η επιβίωση εξαρτάται από το ξενιστή και ταυτόχρονα προκαλεί βλάβη σ αυτόν Παρασιτισμός, είναι μορφή συμβίωσης που όμως είναι ωφέλιμη βιολογικά για ένα είδος (τα παράσιτα) αλλά βλαβερή σε αισθητό (ελάχιστα ως σε μεγάλο βαθμό) στον άνθρωπο ή τα ζώα όπου παρασιτούν

5 Ξενιστής τελικός, όταν φιλοξενεί τη σεξουαλικά ώριμη μορφή του παρασίτου ενδιάμεσος, όταν φιλοξενεί προνυμφική ή ενδιάμεση μορφή του παρασίτου βιολογικός φορέας ή αληθής ενδιάμεσος ξενιστής (απαραίτητος στον βιολογικό κύκλο εξέλιξης του παρασίτου) μηχανικός φορέας ή ψευδής ενδιάμεσος ξενιστής (δεν είναι απαραίτητος στον κύκλο εξέλιξης του παρασίτου) Επίσης, διακρίνονται σε: φυσικούς, όταν το παράσιτο ολοκληρώνει πλήρως τον κύκλο εξέλιξης που επιτελεί σε αυτούς κάτω από κανονικές συνθήκες μη φυσικούς, όταν το παράσιτο αναπτύσσεται ή εξελίσσεται μέχρις ενός βαθμού, και η ανάπτυξη και εξέλιξή του σταματά, ή πεθαίνει αμέσως ψευδοξενιστές, όταν το παράσιτο εισέρχεται εντελώς τυχαία και εγκυστούται αμέσως χωρίς να παρουσιάζει καμία εξέλιξη

6 Σχέση Παρασίτου - Ξενιστή (Παρασιτισμός) ΠΑΡΑΣΙΤΩΣΗ: η σχέση δύο οργανισμών κατά την οποία ο ένας οργανισμός (παράσιτο) προκαλεί βλάβη στον άλλο (ξενιστή) ΠΑΡΑΣΙΤΙΑΣΗ: η κατάσταση κατά την οποία το παράσιτο είναι ικανό να προκαλέσει βλάβη στον ξενιστή, αλλά δεν υπάρχουν εμφανή συμπτώματα νόσου ΙΣΟΡΡΟΠΙΑ: η σχέση δύο οργανισμών κατά την οποία ο ένας (παράσιτο) ευνοείται, ενώ ο δεύτερος (ξενιστής) ούτε ευνοείται ούτε βλάπτεται ΣΥΜΒΙΩΣΗ: η σχέση δύο οργανισμών κατά την οποία ο δεσμός ξενιστή- παρασίτου είναι αναγκαίος, και από το δεσμό αυτό ευνοούνται και οι δύο οργανισμοί ΑΜΟΙΒΑΙΟΤΗΣ: σχέση όμοια με τη συμβίωση με τη διαφορά ότι ο δεσμός παρασίτου - ξενιστή δεν είναι απαραίτητος και ο ξενιστής μπορεί να ζήσει χωρίς την παρουσία του παρασίτου

7 Κατηγοριοποίηση Παρασίτων Ι Ανάλογα με το σημείο του ξενιστή όπου αυτά παρασιτούν: Ενδοπαράσιτα: ζούν σε εσωτερικά όργανα του σώματος του ξενιστή και προκαλούν λοίμωξη Εκτοπαράσιτα: όσα ζούν στην εξωτερική επιφάνεια του ξενιστή και προκαλούν επιφανειακή λοίμωξη ή μόλυνση

8 Κατηγοριοποίηση Παρασίτων ΙΙ Ανάλογα με το βαθμό εξάρτησής τους από τον ξενιστή: ΥΠΟΧΡΕΩΤΙΚΑ: όταν έχουν προσαρμοστεί απόλυτα στη παρασιτική ζωή και η ύπαρξή τους εξαρτάται απόλυτα από τον ξενιστή και δεν είναι ικανά να ζήσουν ως ελεύθεροι οργανισμοί ΠΡΟΑΙΡΕΤΙΚΑ: όταν η εξάρτησή τους δεν είναι απόλυτη από τον ξενιστή και έχουν την ικανότητα να ζήσουν και ως ελεύθεροι οργανισμοί ΤΥΧΑΙΑ ή ΣΠΟΡΑΔΙΚΑ: όταν αναπτύσσονται σε έναν ξενιστή στον οποίο κανονικά δεν αναπτύσσονται

9 Κατηγοριοποίηση Παρασίτων ΙΙΙ Ανάλογα με τη διάρκεια της παραμονής τους στον ξενιστή: ΜΟΝΙΜΑ: όταν παραμένουν για όλη τη διάρκεια του βίου τους σε έναν ξενιστή. ΠΡΟΣΩΡΙΝΑ ή ΗΜΙΜΟΝΙΜΑ: όταν ο βιολογικός κύκλος τους έχει τουλάχιστον ένα στάδιο εξέλιξης εκτός του σώματος του ξενιστή κατά τη διάρκειά του οποίου συμπεριφέρονται ως ελεύθεροι οργανισμοί. ΠΕΡΙΟΔΙΚΑ ή ΔΙΑΛΕΙΠΟΝΤΑ: όταν παρασιτούν τον ξενιστή για βραχύ χρονικό διάστημα ή τον επισκέπτονται περιοδικά για να τραφούν

10 Χαρακτηριστικά Παρασίτων δεν παράγουν ουσιώδη στοιχεία, όπως βιταμίνες και ένζυμα που είναι αναγκαία για την επιβίωσή τους, τα οποία όμως προσλαμβάνουν έτοιμα από τους ξενιστές τους παράγουν πολύ μεγάλο αριθμό αυγών, έτσι ώστε η πιθανότητα μόλυνσης ενός νέου ξενιστή και της διατήρησης του είδους σε δυσμενές περιβάλλον μετατρέπονται ή παράγουν ανθεκτικές μορφές, οι οποίες επιβιώνουν και εξελίσσονται σε ώριμες μορφές όταν πλέον οι συνθήκες του περιβάλλοντος είναι κατάλληλες και ευνοούν την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό τους προκειμένου να υπερνικήσουν τους μηχανισμούς απώθησης του ξενιστή έχουν αναπτύξει όργανα προσκόλλησης, τα οποία βοηθούν στη συγκράτησή τους έχουν υποστεί βιοχημικές και ανοσολογικές μεταλλαγές, έτσι ώστε να μην υφίστανται βλάβες από το αμυντικό σύστημα των ξενιστών τους

11 Οργανα προσκόλλησης

12 Αναπαραγωγή των Παρασίτων Τα παράσιτα έχουν την ικανότητα να αναπαράγονται τόσο µονογονικά (χωρίς διαφοροποίηση φύλων) όσο και αµφιγονικά (µε διαφοροποίηση φύλων) Μονογονική αναπαραγωγή: σχιζογονία (πολλαπλές, ταυτόχρονες µιτωτικές διαιρέσεις που οδηγούν σε σχηµατισµό πολλαπλών θυγατρικών κυττάρων από ένα µητρικό), ενδοδυογένεση (σχηµατίζονται δύο θυγατρικά κύτταρα περιβαλλόµενα από κυτταροπλασµατική µεµβράνη µέσα στο µητρικό κυτταρικό σώµα) και απλή εκβλάστηση Αµφιγονική αναπαραγωγή: δύο ξεχωριστά «άτοµα» διαφοροποιηµένα όργανα που βρίσκονται στο ίδιο άτοµο, οπότε το φαινόµενο καλείται ερµαφροδιτισµός

13 Αναπαραγωγή των Παρασίτων Μονογονική αναπαραγωγή Αµφιγονική αναπαραγωγή

14 Κύκλος ζωής των Παρασίτων Τα παράσιτα έχουν αναπτύξει έναν τρόπο ζωής ή κύκλο ζωής, στον οποίο περιλαµβάνεται η επιβίωση ή ανάπτυξή τους στο εξωτερικό περιβάλλον και σε έναν ή περισσότερους ξενιστές Εξωτερικό περιβάλλον: παραµένει σε αδράνεια είτε ως ανθεκτικό αβγό ή κύστη Κατάλληλος ξενιστής: αναπτύσσεται ενεργά και µεταµορφώνεται Όταν ένα παράσιτο ζει και αναπτύσσεται εµφανίζοντας όλα τα στάδια του κύκλου ζωής του, µέσα σε έναν και µοναδικό ξενιστή, τότε ο κύκλος ζωής του καλείται µονόξενος ή άµεσος (αµοιβάδες και εντερικά µαστιγοφόρα) (χωρίς ενδιάµεσο ξενιστή) Τα παράσιτα αυτά, συνήθως εµφανίζονται µε δύο βασικές µορφές τον τροφοζωίτη ή νύµφη ή βλαστική µορφή που ζει στον οργανισµό του ξενιστή και την κύστη ή ωοκύστη ή αβγό ή ανθεκτική µορφή, η οποία έχει τη δυνατότητα να επιβιώσει ελεύθερη στο περιβάλλον.

15 Κύκλος ζωής των Παρασίτων Όταν για την ολοκλήρωση του κύκλου της ζωής ενός παρασίτου απαιτούνται δύο ή περισσότεροι ξενιστές, σπονδυλωτοί ή ασπόνδυλοι, τότε ο κύκλος της ζωής του παρασίτου καλείται ετερόξενος ή πολύπλοκος ή σύνθετος (ενδιάµεσος ξενιστής) Τα παράσιτα αυτά αναπτύσσονται σε ένα τελικό ή κύριο ξενιστή (που κατά κανόνα είναι ο άνθρωπος) και σε ένα ή περισσότερους ενδιάµεσους σπονδυλωτούς ή ασπόνδυλους ξενιστές Χαρακτηριστικό παράσιτο µε τέτοιου είδους κύκλο είναι το πλασµώδιο της ελονοσίας Η γνώση του κύκλου ζωής των παρασίτων είναι απαραίτητη και σηµαντική από ιατρικής πλευράς

16 Ειδικοί όροι της Παρασιτολογίας Δεξαμενή ή αποθήκη του παρασίτου: Τελικός ξενιστής φυσικά μολυσμένος- υπεύθυνος για διατήρηση του παρασίτου σε μια ορισμένη περιοχή Φορέας: Τελικός ξενιστής- υπεύθυνος για διασπορά του παρασίτου, χωρίς ο ίδιος να έχει συμπτώματα μόλυνσης Μεταφορέας ή μεταδότης: Οργανισμός- μέσο μετάδοσης παρασίτου από έναν ξενιστή σε άλλον Μηχανικός μεταφορέας: καμιά εξέλιξη παρασίτου Βιολογικός μεταφορέας: εξέλιξη παρασίτου σε άλλο στάδιο

17 Ειδικοί όροι της Παρασιτολογίας Αφανής ή άδηλος περίοδος: Χρονικό διάστημα μεταξύ εισόδου ενός παρασίτου στο ξενιστή και της ανίχνευσής του με εργαστηριακές μεθόδους Εμφανής ή έκδηλος περίοδος: Χρονικό διάστημα κατά την διάρκεια του οποίου είναι δυνατή η ανίχνευση του παρασίτου μέσα στον ξενιστή με εργαστηριακές μεθόδους

18 Μόλυνση ανθρώπου με παράσιτα Πεπτική οδός, μολυσμένα τρόφιμα και νερό (ταινίες, εχινόκοκκοι, ασκαρίδες, οξύουροι, αμοιβάδες, λάμβλιες κ.α.) Δέρμα, άμεση επαφή (αγγυλοστώματα, σχιστοσώματα) Ξενιστές - αρθρόποδα (ελονοσία, νόσος του ύπνου κ.λπ.) Σημαντική είναι η Πρόληψη

19 Εργαστηριακή διάγνωση Παρασιτολογική εξέταση των κοπράνων, αναζητούμε τροφοζωίτες και κύστεις των πρωτόζωων, αυγά και προνύμφες των ελμίνθων Παρασκευάσματα περιφερικού αίματος ή μυελού, αιμοπαράσιτα (πλασμώδιο ελονοσίας, λεϊσμάνιες κ.α.) Παρασκευάσματα πτυέλων (άγγριστρα εχινόκοκκου) Παρασκευάσματα ούρων (αυγά σχιστοσωμάτων) Ορολογικές μέθοδοι, αναζήτηση ειδικών αντισωμάτων ή αντιγόνων στον ορό του αίματος (τοξοπλάσμωση, αμοιβάδωση, εχινοκοκκίαση κ.λπ.)

20 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΑΣ Εργαστηριακές ασκήσεις Παρασιτολογίας

21 Εργαστηριακές ασκήσεις Παρασιτολογίας Εξετάσεις κοπράνων Σύσταση κοπράνων: Νερό Υπολείμματα τροφών Μικρόβια φυσιολογικής χλωρίδας παχέος εντέρου Κύτταρα λαχνών του εντέρου Γαστρεντερικές εκκρίσεις Αλλες διαλυμένες ουσίες

22 Εργαστηριακές ασκήσεις Παρασιτολογίας Εξετάσεις κοπράνων Μορφή Σύσταση Ποσότητα Χρώμα Ενδογενείς και εξωγενείς παράγοντες Λαχανικά: πολλά, ογκώδη, μαλακά ζωικές τροφές Υπερκινητικότητα εντέρου: πιο υδαρή δυσκοιλιότητα Νόσος: Μεταβολές σε μακροσκοπικούς χαρακτήρες, χημική σύσταση, μικροβιακή χλωρίδα, εμφάνιση μη φυσιολογικών ουσιών

23 Εργαστηριακές ασκήσεις Παρασιτολογίας Μακροσκοπική εξέταση κοπράνων Ποτέ δεν πρέπει να παραλείπεται!!! Χαρακτήρες Φυσιολογικοί Παθολογικοί ΧΡΩΜΑ Καστανό Κίτρινο: Χολερυθρίνη, Φάρμακα Κίτρινο Πράσινο (βρέφη) Μαύρο- καφετί: Αίμα, Τροφές Πράσινο: Λαχανικά Αχρωμα: Απόφραξη χοληφόρου Γκρι- λευκό: Στεατόρροια ΒΛΕΝΗ Δεν υπάρχει Λαχνώδες αδένωμα παχέος εντέρου (3-4 κιλά ημερησίως) Δυσκοιλιότητα Κολίτιδες βλεννώδεις, ελκώδης, δυσεντερία, καρκίνος παχέος εντέρου ΠΥΟΝ Δεν υπάρχει Χρόνια ελκώδης κολίτιδα Μικροβιακή δυσεντερία, Συρίγγιο

24 Εργαστηριακές ασκήσεις Παρασιτολογίας Μορφή και σύσταση κοπράνων Διάρροιες: Υδαρής ασχημάτιστη Στεατόρροια: Πολτώδη κάκοσμα λευκά και επιπλέοντα Στένωση ορθού ή σπαστική κολίτιδα: Λεπτά ταινιοειδή

25 Εργαστηριακές ασκήσεις Παρασιτολογίας Χρώμα κοπράνων Χρώμα Αιτιολογία Φυσιολογικό καστανό Στερκοχολίνη (ουροχολινογόνο των κοπράνων) οξείδωση χολερυθρίνης Κίτρινο σε κόπρανα ενήλικου Παρουσία χολερυθρίνης, Φάρμακα (χρυσομυκίνη) Μαύρο ή φαιόμαυρο Κόκκινο Πράσινο Ελλειψη χρώματος Γκριζωπό ή λευκωπό Αιμορραγίες από στομάχι και αρχή λεπτού εντέρου πέψη αιμοσφαιρίνης (50-70ml) Μαύρες τροφές, Σκευάσματα σιδήρου κ.α. Αιμορραγίες από ορθό και πρωκτό, Κόκκινες τροφές, Φάρμακα Πράσινα λαχανικά Παρεμπόδιση ροής χολής στο έντερο ή μη παραγωγή χολής Λιπαρή σύσταση Στεατόρροια

26 Εργαστηριακές ασκήσεις Παρασιτολογίας Βλένη στα κόπρανα Σπαστική δυσκοιλιότητα: Διαφανής άχρωμη βλένη στην επιφάνεια των κοπράνων Ελκώδη κολίτιδα, Μικροβιακή δυσεντερία, Ελκωτικό καρκίνωμα παχέος εντέρου: Πυοαιματηρή βλένη Καρκίνος ορθού ή φλεγμονή ορθού: Αιματηρή βλένη και μέσα στη μάζα των κοπράνων Λαχνώδες αδένωμα παχέος εντέρου: Τεράστιες ποσότητες βλένης (3-4 κιλά/ημέρα)

27 Εργαστηριακές ασκήσεις Παρασιτολογίας Πύον στα κόπρανα Φυσιολογικά: Ελάχιστα λευκά αιμοσφαίρια (μακροφάγα) Πύον εμφανίζεται σε φλεγμονώδεις νόσους παχέος εντέρου, όπως: Χρόνια ελκώδης κολίτιδα Χρόνια μικροβιακή δυσεντερία Συρίγγιο που επικοινωνεί με τον πρωκτό Δεν υπάρχει πύον: Αμοιβαδική δυσεντερία Ιογενή γαστρεντερίτιδα Σπάνια στις μικροβιακές γαστρεντερίτιδες

28 Τεχνικές και μέθοδοι παρασιτολογικών εξετάσεων των κοπράνων Μακροσκοπική εξέταση κοπράνων Μικροσκοπική εξέταση κοπράνων Αμεσα παρασκευάσματα με ή χωρίς έμβιες χρώσεις Χρώσεις αμοιβάδων και άλλων παρασίτων Εμπλουτισμός κοπράνων για ωάρια σκωλήκων και κύστεις πρωτοζώων Καλλιέργειες πρωτοζώων Ανοσολογικές εξετάσεις Οροαντιδράσεις στο αίμα Δερμοαντιδράσεις

29 Τρόποι συλλογής των κοπράνων 1. Δείγμα φυσικής κένωσης 2. Δείγματα μετά από καθαρτικό 3. Πρωκτικό επίχρισμα Μέθοδος κολλητικής ταινίας Μέθοδος στειλεού με παραφίνη 4. Δείγμα από ορθοσκόπηση

30 Τρόποι συλλογής των κοπράνων 1. Δείγμα φυσικής κένωσης Εξέταση για: σκώληκες, ωάρια σκωλήκων και κύστεις πρωτοζώων (αμοιβάδων και λαμβλιών) Εξέταση μέσα σε 1-2 ώρες, διαφορετικά χρήση τρόπων συντήρησης Δείγμα από πρωινή κένωση

31 Τρόποι συλλογής των κοπράνων Δείγματα κοπράνων σε δοχεία μεταφοράς για εξέταση: Τα δοχεία με το μπλέ και το κίτρινο χρώμα αφορούν παρασιτολογικές εξετάσεις, το δοχείο με το κόκκινο πώμα για καλλιέργεια κοπράνων, ενώ το δοχείο με το λευκό πώμα είναι το δοχείο που συνέλλεξε το δείγμα ο ασθενής

32 Τρόποι συλλογής των κοπράνων 2. Δείγματα μετά από καθαρτικό Αναζήτηση αμοιβάδων Εξεταζόμενος: πίνει το πρωί νηστικός ένα μπουκάλι καθαρτική λεμονάδα ή άλλο αλατούχο καθαρτικό (όχι παραφίνη ή άλλα ελαιώδη) Τουλάχιστον τρεις εκκενώσεις (διαρροϊκές ή μη) Δεν δίδεται καθαρτικό σε παιδιά <5 ετών (μισή καθαρτική σοκολάτα ή τσίχλα) Κάθε μία εκκένωση εξετάζεται αμέσως χωρίς να περιμένουμε τις άλλες

33 Τρόποι συλλογής των κοπράνων 3. Πρωκτικό επίχρισμα: Αναζήτηση ωαρίων οξυούρου Ο οξύουρος ωοτοκεί στις πρωκτικές πτυχές και όχι μέσα στον εντερικό κανάλι 5% παιδιών με οξυουρίαση φέρουν ωάρια στα κόπρανα, ενώ βρίσκονται πάντα στις πρωκτικές πτυχές Μέθοδος κολλητικής ταινίας Μέθοδος στειλεού με παραφίνη

34 Τρόποι συλλογής των κοπράνων Μέθοδος κολλητικής ταινίας a. Κομμάτι cellotape πάνω σε αντικειμενοφόρο πλάκα b. Τοποθετούμε την πλάκα στο μέσο γλωσσοπίεστρου c. Ανασηκώνουμε το ένα άκρο της ταινίας και αναδιπλώνουμε γύρω από το ένα άκρο της σπάτουλας με την κολλητική επιφάνεια προς τα έξω d. Ασθενής σε γονατοαγκωνιαία θέση και πιέζουμε την κολλητική επιφάνεια ανάμεσα στις πρωκτικές πτυχές e. Ξανακολλάμε την ταινία στην πλάκα f. Μικροσκοπούμε

35 Τρόποι συλλογής των κοπράνων Μέθοδος στειλεού με παραφίνη Βαμβακοφόρο στειλεό τον επαλείφουμε με βαζελίνη και τον βουτάμε σε ζεστή λυωμένη παραφίνη Αφήνουμε να στεγνώσει Πρωκτικό επίχρισμα από πρωκτικές πτυχές και λίγο επίχρισμα ορθικό, εισάγοντας το στειλεό στο ορθό περί ένα εκατοστό Στην παραφίνη έχουν κολλήσει ωάρια, επιθήλια και υπολείμματα κοπράνων Απελευθέρωση βουτώντας τον στειλεό σε ξυλόλη Απορρίπτουμε το υπερκείμενο Μικροσκοπική εξέταση ιζήματος

36 Τρόποι συλλογής των κοπράνων 4. Δείγμα από ορθοσκόπηση Υπόνοια για αμοιβάδωση ή εντερική ελμινθίαση Το δείγμα παίρνεται σαν επίχρισμα του εντερικού βλεννογόνου της περιοχής Φλεγμονή: πυοσφαίρια, μακροφάγα, ερυθρά και μακροφάγα που έχουν φαγοκυτταρώσει ερυθρά

37 Συντήση των κοπράνων 1. Θερμοκρασία δωματίου 2. Φορμόλη 5% ουδέτερο διάλυμα 3. Μερθειολική ιωδιούχος φορμαλδεϋδη ή MIF (Merthiolate Iodine Formaldeyde) 4. Πολυβινυλική αλκοόλη ή PVA (Polyvinyl Alcohol)

38 Συντήση των κοπράνων 1. Θερμοκρασία δωματίου Καλύτερος τρόπος συντήρησης για εξέταση νωπών παρασκευασμάτων με τα οποία θέλουμε να δούμε τα πρωτόζωα στη φάση του τροφοζωϊτου ζωντανά με την κινητικότητά τους Δεν είναι σωστός τρόπος διατήρησης αμοιβάδων, καθώς επέρχεται θανάτωση από την ενζυμική δραστηριότητα των μικροβίων της χλωρίδας Διαφύλαξη στο ψυγείο: μη διατήρηση της κινητικότητας, διατήρηση τροφοζωϊτη ζωντανό για περισσότερες ώρες

39 Συντήση των κοπράνων 2. Φορμόλη 5% ουδέτερο διάλυμα Η φορμόλη σκοτώνει τους τροφοζωίτες των αμοιβάδων και άλλων πρωτοζώων, αλλά συντηρεί αυτά αναλλοίωτα σαν μονιμοποιημένα Κατάλληλος τρόπος για έγχρωμα παρασκευάσματα για αμοιβάδες

40 Συντήση των κοπράνων 3. Μερθειολική ιωδιούχος φορμαλδεϋδη ή MIF (Merthiolate Iodine Formaldeyde) Το ιώδιο χρωματίζει τους τροφοζωίτες και το μερθειολικό τους συντηρεί Καλό συντηρητικό για εξέταση κοπράνων με μικροσκοπική εξέταση νωπών παρασκευασμάτων (όχι προκειμένου να γίνει χρώση) Μια σταγόνα αντιδραστηρίου σε αντικειμενοφόρο πλάκα αραιώνεται με μια σταγόνα νερό και σε αυτό εναιωρούμε μια κρικιά κοπράνων Καλυπτρίδα και μικροσκόπηση

41 Συντήση των κοπράνων 4. Πολυβινυλική αλκοόλη ή PVA (Polyvinyl Alcohol) Μονιμοποιεί και διατηρεί κυρίως τις αμοιβάδες, όχι όμως και τις κύστεις Χρησιμοποιείται προκειμένου από το δείγμα που περιέχει αμοιβάδες να γίνει χρώση αμοιβάδων με ειδικές χρωστικές αμοιβάδων

42 Μακροσκοπική εξέταση των κοπράνων Βασική εξέταση που δεν πρέπει να παραλείπεται ορατό σκουλήκι Οξύουροι: Μέθοδος εκλογής γιατί αποβάλλονται εξέταση ανακατεύοντας τα κόπρανα Προγλωττίδες των εντερικών ταινιών Τριχοκέφαλος Ασκαρίδες Η μακροσκοπική εξέταση προηγείται της μικροσκοπικής και είναι απαραίτητη για την παρασκευή άμεσων παρασκευασμάτων

43

44 Μικροσκοπική παρασιτολογική εξέταση των κοπράνων Κύρια παρασιτολογική εξέταση που πραγματοποιείται κυρίως με άμεσα παρασκευάσματα και με ξηρά έγχρωμα 1. Αμεσο νωπό παρασκεύασμα 2. Αμεσο παρασκεύασμα με ηωσίνη 3. Αμεσο παρασκεύασμα με Lugol ή με MIF 4. Αμεσο παρασκεύασμα με κυανούν του μεθυλενίου

45 Μικροσκοπική παρασιτολογική εξέταση των κοπράνων 1. Αμεσο νωπό παρασκεύασμα Αντικειμενοφόρο πλάκα σταγόνα φυσιολογικού ορού μεταφορά με κρίκο ποσότητα από κόπρανα ανακατεύουμε καλυπτρίδα μικροσκόπηση Διαρροϊκά κόπρανα: όχι αραίωση με φ.ο. Επιτυχής εξέταση: δείγμα (μέρος των κοπράνων που επιλέγουμε) Σχηματισμένα και σκληρά: επιφάνεια Ημιδιαρροϊκά ή μισοσχηματισμένα: ανάδευση με ξύλινο στυλεό για εύρεση ζωντανών σκωλήκων ή βλέννης Διαρροϊκά: ανάδευση με κρίκο και λήψη θολερών κροκίδων από βλέννα και πύον

46

47 Μικροσκοπική παρασιτολογική εξέταση των κοπράνων 2. Αμεσο παρασκεύασμα με ηωσίνη Διάλυμα 0,1% ηωσίνης σε φ.ο. Δεν χρωματίζονται τα ζωντανά ζωικά κύτταρα (τροφοζωίτες και κύστεις πρωτοζώων, ωάρια ελμίνθων, βλαστομύκητες, ζωντανά λευκά αιμοσφαίρια, επιθηλιακά και μακροφάγα) Ολα αυτά διακρίνονται μαργαριταρόλευκα μέσα στο λαμπρό κόκκινο της ηωσίνης φόντο Μόλις πεθαίνουν χρωματίζονται Προτιμότερη μέθοδος για αρχάριους, και όπου είναι λίγα τα ζητούμενα στοιχεία

48 Μικροσκοπική παρασιτολογική εξέταση των κοπράνων 3. Αμεσο παρασκεύασμα με Lugol ή με MIF (μεθειολική ιωδιούχο φορμαλδεϋδη) Αντικειμενοφόρο πλάκα σταγόνα ιωδιούχου διαλύματος (lugol) μεταφορά με κρίκο ποσότητα κοπράνων και ανάδευση μικροσκόπηση Lugol: Χρωματίζεται το κυτταρόπλασμα των κύστεων καστανό προς κίτρινο. Ο πυρήνας με το καρυόσωμα και τα κοκκία χρωματίνης παίρνουν πιο σκούρο καστανό χρώμα Πυκνό: Συρρίκνωση κύστεων και παραμόρφωση τροφοζωιτών Αραιωμένο: Δεν χρωματίζονται έντονα οι κύστεις και καθόλου οι τροφοζωίτες

49 Giardia spp. (µε Lugol)

50 Μικροσκοπική παρασιτολογική εξέταση των κοπράνων 3. Αμεσο παρασκεύασμα με Lugol ή με MIF (μεθειολική ιωδιούχο φορμαλδεϋδη) (συνέχεια) MIF: Μονιμοποιούνται οι τροφοζωίτες και χρωματίζονται μαζί με τις κύστεις (όπως lugol) Αν προσθέσουμε σταγόνα ηωσίνης το κυτταρόπλασμα των τροφοζωιτών και των κύστεων παίρνουν το χρώμα της ηωσίνης, ενώ οι πυρήνες εξακολουθούν να διατηρούν το καστανό χρώμα του ιωδίου

51

52

53 1. Τροφοζωίτες Giardia lamblia 2. Κύστεις Giardia lamblia

54 Μικροσκοπική παρασιτολογική εξέταση των κοπράνων 4. Αμεσο παρασκεύασμα με κυανούν του μεθυλενίου Το κυανούν του μεθυλενίου σε όξινο ρυθμιστικό διάλυμα χρωματίζει τις αμοιβάδες και έτσι γίνονται ορατές σαν μπλε σωματίδια στο οπτικό πεδίο Χρώσεις αμοιβάδων και άλλων πρωτοζώων Οι αμοιβάδες των κοπράνων δεν χρωματίζονται με τις συνήθεις αιμοχρωστικές (πρωτόζωα αίματος) Χρώση σιδηρούχου αιματοξυλίνης Τρίχρωμη χρώση (ειδική για Τριχομονάδα) Φθορίζουσα χρώση

55 Εμπλουτισμός κοπράνων Επιδιώκουμε να συγκεντρώσουμε σε μικρότερο όγκο εξεταστέου υλικού τα παρασιτικά στοιχεία των κοπράνων απομακρύνοντας τις κοπρικές ύλες Διάφοροι μηχανισμοί εμπλουτισμού: Μόνο ωάρια ελμίνθων Κυρίως κύστεις πρωτοζώων και ωάρια ορισμένων ελμίνθων Κύστεις πρωτοζώων και όλα τα ωάρια Στηρίζονται είτε σε καθίζηση των παρασιτικών στοιχείων είτε σε επίπλευση αυτών

56

57 Μέθοδοι εμπλουτισμού των κοπράνων για ωάρια και κύστεις παρασίτων A. Μέθοδος επίπλευσης με θειικό ψευδάργυρο (Faust) Η καλύτερη μέθοδος για εμπλουτισμό κύστεων πρωτοζώων και ελαφρότερων ωαρίων (οξύουρων, αγκυλοστόματος ωάρια ασκαρίδων, τριχοκεφάλου, ταινιών) Τα ωάρια του σχιστοσώματος καταστρέφονται Το κεκορεσμένο διάλυμα θειικού ψευδαργύρου ειδικού βάρους 1,18 είναι πολύ βαρύ και δεν επιτρέπει τα ωάρια των περισσότερων ελμίνθων και τις κύστεις των πρωτοζώων να καθιζάνουν

58 Μέθοδος επίπλευσης με θειικό ψευδάργυρο (Faust) Πυκνό εναιώρημα κοπράνων σε νερό βρύσης (διαρροϊκά). Διήθηση εναιωρήματος από διπλή γάζα μουσκεμένη λίγο με νερό βρύση Φυγοκέντρηση για 1-2 min στις 1500 στροφές και απορρίπτουμε το θολό υπερκείμενο. Επανάληψη μέχρι το υπερκείμενο να γίνει διαυγές Προσθέτουμε στο ίζημα λίγα ml διαλύματος ZnSO4, αναδεύουμε, συμπληρώνουμε μέχρι ψηλά στο στόμιο του σωληναρίου και φυγοκεντρούμε για 1-2 min στις 1500 στροφές Αφήνουμε το σωληνάριο σε στατό κατακόρυφα. Ηδη έχουν ανεβεί στην επιφάνεια τα παρασιτικά στοιχεία. Παίρνουμε μια μικρή ποσότητα με κρίκο ή την άκρη της καλυπτρίδας

59 (συνέχεια) Μέθοδος επίπλευσης με θειικό ψευδάργυρο (Faust) Κάνουμε νωπό παρασκεύασμα με φ.ο. και με lugol και μικροσκοπούμε Αν δεν βρεθούν παρασιτικά στοιχεία, συμπληρώνουμε λίγη ακόμα ποσότητα διαλύματος ZnSO4, αφήνουμε και μετά από μία ώρα ξαναεξετάζουμε Κύστεις G. lamblia σε άμεσο νωπό παρασκεύασμα μετά από επίπλευση

60 Μέθοδος επίπλευσης με θειικό ψευδάργυρο (Faust) hžp://cal.vet.upenn.edu/projects/parasit06/ website/zincvideo.htm hžp://cal.vet.upenn.edu/projects/parasit06/ website/zinc.htm#zinc

61 Μέθοδοι εμπλουτισμού των κοπράνων για ωάρια και κύστεις παρασίτων B. Μέθοδοι καθιζήσεως i. Απλή μέθοδος καθιζήσεως ii. Μέθοδος καθιζήσεως Telemann iii. Μέθοδος καθιζήσεως μετά από εκχύλιση και μονιμοποίηση (Richie)

62 Μέθοδοι καθιζήσεως i. Απλή μέθοδος καθιζήσεως 5 gr κοπράνων ομοιογενοποιούνται και εναιωρούνται σε νερό βρύσης μέσα σε φιάλη Erlenmeyer των 250ml Το εναιώρημα διηθείται σε κωνικό ποτήρι, όπου αφήνουμε να κατακάτσει. Απορρίπτουμε το υπερκείμενο. Από το ίζημα γίνεται φυγοκέντρηση και νέο πλύσιμο Επανάληψη πλυσίματος μέχρι να έχουν ένα αρκετά διαυγές υπερκείμενο. Εξετάζουμε μικροσκοπικά για ωάρια παρασίτων, ίσως και για κύστεις και προνύμφες

63 Μέθοδοι καθιζήσεως ii. Μέθοδος καθιζήσεως Telemann Σε δοκιμαστικό σωλήνα προσθέτουμε 1 gr κοπράνων μαζί με 5-6 ml διαλύματος HCl 16% Καλή ανάδευση με ξύλινο στυλεό και διήθηση εναιωρήματος από ψιλή σίτα ή διπλή βρεγμένη γάζα Στο διήθημα προσθέτουμε 5-6 ml αιθέρα και ανακινούμε έντονα, αφού καλύψουμε το στόμιο του σωλήνα Φυγοκέντρηση στις 1500 στροφές για 3 min. Απόρριψη υπερκείμενου και λήψη μιας σταγόνας από ίζημα, την οποία τοποθετούμε σε αντικειμενοφόρο πλάκα και καλύπτουμε με καλυπτρίδα Μικροσκόπηση

64 Spirocerca lupi Spirocerca lupi Trichuris vulpis Taeniidae

65 Μέθοδοι καθιζήσεως iii. Μέθοδος καθιζήσεως μετά από εκχύλιση και μονιμοποίηση (Richie) Μέθοδος εκλογής για εμπλουτισμό κύστεων πρωτοζώων και ωαρίων σκωλήκων. Παρασκευάζουμε εναιώρημα κοπράνων με νερό βρύσης και διηθούμε το εναιώρημα μέσα από βργμένη γάζα Φυγοκεντρούμε σε κωνικό σωληνάριο ποσότητα διαλύματος 10ml για 1-2min σε 1500 στροφές Απορρίπτουμε το υπερκείμενο και επαναλαμβάνουμε το πλύσιμο 2-3 φορές, μέχρι το υπερκείμενο να γίνει διαυγές Στο ίζημα προσθέτουμε λίγα ml φορμαλίνης 5%, ανακινούμε, συμπληρώνουμε με φορμαλίνη μέχρι τα ¾ του σωληναρίου, ανακατεύουμε και αφήνουμε για 5min για να γίνει η μονιμοποίηση

66 Μέθοδοι καθιζήσεως iii. Μέθοδος καθιζήσεως μετά από εκχύλιση και μονιμοποίηση (Richie) (συνέχεια) Αναδεύουμε και επιστιβάζουμε 3 ml αιθέρα. Σκεπάζουμε το σωληνάριο και ανακινούμε ζωηρά Φυγοκεντρούμε για 1-2 min στις 1500 στροφές. Σχηματίζονται 4 στιβάδες. Πάνω η στιβάδα του αιθέρα, από κάτω μια στιβάδα- δακτύλιος από άπεπτα και αδιάλυτα στοιχεία, πιο κάτω η στιβάδα της φορμαλίνης και τέλος το ίζημα Αποκολλάμε με στυλεό το δακτύλιο με τα άπεπτα και αδειάζουμε το σωληνάριο Από το ίζημα παρασκευάζουμε νωπά παρασκευάσματα με φ.ο. και lugol και μικροσκοπούμε

67 Μέθοδοι εμπλουτισμού των κοπράνων για ωάρια και κύστεις παρασίτων Οι μέθοδοι καθιζήσεως είναι προτιμότεροι από τις μεθόδους επιπλεύσεως γιατί συγκεντρώνουν όλα τα ωάρια ελμίνθων, ενώ με τη μέθοδο επιπλεύσεως δεν συγκεντρώνονται εύκολα τα βαρύτερα ωάρια των ασκαρίδων, τριχοκεφάλου και ταινιών Οι κύστεις των πρωτοζώων συχνά παραμορφώνονται Αν δεν γίνει η φάση της μονιμοποίησης με τη φορμαλίνη οι κύστεις καταστρέφονται με τον αιθέρα Η μονιμοποίηση των κύστεων γίνεται με διάλυμα MIF

68 Μέθοδος ανίχνευσης παρασίτων στα κόπρανα Διάγνωση παρασίτων με τη μέθοδο αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR). Η PCR είναι μια τεχνική in vitro η οποία επιτρέπει την ενίσχυση συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA σε δύο περιοχές γνωστής αλληλουχίας του μορίου. Με τον τρόπο αυτό παράγεται τεράστιος αριθμός αντιγράφων της επιθυμητής αλληλουχίας. Με την PCR είναι δυνατό να πολλαπλασιαστεί ένα μικρό κομμάτι DNA ή RNA εκατομμύρια φορές κάνοντας δυνατή τη μοριακή διάγνωση των παρασιτώσεων στο δείγμα ενός ασθενούς ακόμα και από ένα μόνο κύτταρο.

69 Ποσοτική παρασιτολογική εξέταση i. Απλή των κοπράνων Εναιώρηση ορισμένης ποσότητας κοπράνων σε καθορισμένη ποσότητα νερού, εξετάζεται ορισμένη ποσότητα εναιωρήματος και το αποτέλεσμα ανάγεται σε 1 gr κοπράνων Εκτέλεση: 5 gr κοπράνων και προσθέτουμε 75 ml νερού (αναλογία 1:15) Μικρή ποσότητα γυάλινων σφαιριδίων Ανακίνηση (αναστροφή) κοπράνων για 1 min 1-3 min σε ηρεμία και επανάληψη μέχρι να ολοκληρωθεί η εναιώρηση

70 Ποσοτική παρασιτολογική εξέταση (συνέχεια) των κοπράνων Πριν αρχίσουν να καθιζάνουν τα παρασιτικά στοιχεία, λαμβάνουμε 0,15 ml εναιωρήματος και παρασκευάζουμε νωπό παρασκεύασμα Μικροσκοπούμε (10x) και καταμετρούμε τα παρασιτικά στοιχεία Εξετάζουμε 3-5 παρασκευάσματα Αθροίζουμε τα παρασιτικά στοιχεία και διαιρούμε με τον αριθμό των παρασκευασμάτων Ο μέσος όρος πολλαπλασιάζεται με το 100 (χρησιμοποιήθηκε το 1/100 εναιωρήματος 1:15) Το αποτέλεσμα δείχνει τον αριθμό παρασιτικών στοιχείων σε 1 gr κοπράνων

71 Ποσοτική παρασιτολογική εξέταση ii. Μέθοδος Stoll- Faust των κοπράνων Συνδυασμός απλής ποσοτικής (Stoll) με τη μέθοδο Faust 5 gr κοπράνων και προσθέτουμε 75 ml νερού (αναλογία 1:15) Μικρή ποσότητα γυάλινων σφαιριδίων Ανακίνηση (αναστροφή) κοπράνων για 1 min 1-3 min σε ηρεμία και επανάληψη μέχρι να ολοκληρωθεί η εναιώρηση Τοποθετούμε 15 ml εναιωρήματος σε σωλήνα φυγοκέντρου (όγκος εναιωρήματος 1 gr κοπράνων) Φυγοκέντρηση 1-3 min στις 1500 στροφές

72 Ποσοτική παρασιτολογική εξέταση (συνέχεια) των κοπράνων Απόρριψη υπερκείμενου μέχρι 0,5-1 εκατοστό πάνω από το ίζημα (στην πάνω στιβάδα βρίσκονται τα παρασιτικά στοιχεία) Προσθήκη νερού μέχρι 1 εκατοστό πριν το χείλος και ανάδευση Επανάληψη των 3 τελευταίων βημάτων μέχρι να γίνει διαυγές το υπερκείμενο Απόρριψη υπερκείμενου μέχρι 0,5-1 εκατοστό πάνω από το ίζημα και προσθέτουμε διάλυμα θειικού ψευδαργύρου 33,2%

73 Ποσοτική παρασιτολογική εξέταση (συνέχεια) των κοπράνων Ανάδευση ιζήματος με ποσότητα διάλυματος θειικού ψευδαργύρου (τόση ώστε να σχηματιστεί μηνίσκος πάνω το χείλος του σωλήνα) Τοποθετούμε μια καλυπτρίδα με προσοχή ώστε να μην σχηματιστούν φυσαλίδες Φυγοκέντρηση για 1-3 min στις 900 στροφές Αμεση αφαίρεση της καλυπτρίδας και τοποθέτηση σε αντικειμενοφόρο πλάκα Μικροσκόπηση (10x)

74 Εξέταση για προνύμφες νηματωδών ελμίνθων iii. Μέθοδος Baermann Με αυτή τη μέθοδο αναζητούμε ζωντανές προνύμφες νηματωδών παρασίτων των πνευμόνων Εκτέλεση: 5-20 gr νωπών κοπράνων τοποθετούνται σε γάζα και μετά σε μεταλλικό πλέγμα που τοποθετείται σε γυάλινο χωνί της συσκευής Baermann Το γυάλινο χωνί πληρούται με νερό (25-30 ο C), ώστε η μάζα των κοπράνων να βυθίζεται ελάχιστα στο νερό 8-24 ώρες σε θερμοκρασία περιβάλλοντος

75

76 Εξέταση για προνύμφες (συνέχεια) νηματωδών ελμίνθων Στο διάστημα αυτό οι προνύμφες εγκαταλείπουν την μάζα των κοπράνων, βυθίζονται στο νερό και συγκεντρώνονται στον σφιγκτήρα του ελαστικού σωλήνα Η απομάκρυνση ολοκληρώνεται σε 1-2 ώρες αφού τοποθετήσουμε λαμπτήρα σε απόσταση cm από τα κόπρανα Συλλέγουμε 5-10 ml υγρού μετά το άνοιγμα του σφιγκτήρα

77 (συνέχεια) Εξέταση για προνύμφες νηματωδών ελμίνθων Το υγρό εξετάζεται σε στερεοσκόπιο (16-24x) ή εξετάζονται 1-2 παρασκευάσματα αυτού στο μικροσκόπιο (10x, 40x) Επίσης, μπορούμε να φυγοκεντρήσουμε το υγρό για 1-2 min στις 1500 στροφές και να εξετάσουμε μικροσκοπικά παρασκευάσματα από το ίζημα

78

79 Μέθοδος Baermann hžp://cal.vet.upenn.edu/projects/parasit06/ website/baermannvideo.htm hžp://cal.vet.upenn.edu/projects/parasit06/ website/baermann.htm#baermann

80 Παράγοντες που επηρεάζουν το αποτέλεσμα της παρασιτολογικής εξέτασης των κοπράνων Τα παράσιτα δεν παράγουν συνεχώς αναπαραγωγικά στοιχεία αρνητικό Ο αριθμός των αναπαραγωγικών στοιχείων επηρεάζεται από: Είδος παρασίτου Ηλικία παρασίτου Ενταση της μόλυνσης Αντίσταση ξενιστή Διατροφή ξενιστή Χορήγηση φαρμάκων Συχνότητα αφοδεύσεων Ποσότητα κοπράνων Σύσταση κοπράνων

81 ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΚΟΛΠΙΚΟΥ ΥΓΡΟΥ Οι λοιμώξεις του γεννητικού συστήματος έχουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον λόγω της συχνότητάς τους αλλά και των σοβαρών προβλημάτων που δημιουργούν Οι λοιμώξεις αυτές προκαλούνται από μια πληθώρα μικροοργανισμών

82 ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΚΟΛΠΙΚΟΥ ΥΓΡΟΥ Διάγνωση χρόνιας ή οξείας κολπίτιδας και τραχηλίτιδας Συμπτώματα κολπίτιδας: έκκριμα, πολλές φορές δύσοσμο κνησμός πόνος τσούξιμο στην ούρηση κ.ά.

83 Φυσιολογική μικροβιακή χλωρίδα του Γεννητικού Συστήματος Γυναίκες Στην αναπαραγωγική ηλικία Πριν την ήβη & μετά την εμμηνόπαυση Σταφυλόκοκκοι, Στρεπτόκοκκοι, Εντεροβακτηριακά Αναερόβια Streptococcus agalacjae Σταφυλόκοκκοι, Κορυνοβακτηρίδια Γαλακτοβάκιλλοι, Κλωστρίδια

84 Αίτια κολπίτιδας ΚΟΛΠΙΤΙΔΑ Αίτια Ειδική Μύκητες Trichomonas vaginalis Μη ειδική Gardenerella G. vaginalis + αναερόβια βακτήρια (Bacteroides, Prevotella, Πεπτοστρεπτόκοκκοι κ.α.)

85 ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΚΟΛΠΙΚΟΥ ΥΓΡΟΥ ΤΡΟΠΟΣ ΛΗΨΗΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Αποστειρομένο βαμβακοφόρο στυλεό ή πλαστικό πουάρ Μαιευτικό κολποδιαστολέα Εισαγωγή βαμβακοφόρου στυλεού στον κόλπο και σε βάθος 5-8 εκατ. Πλευρικές κινήσεις 2-3 αντικειμενοφόρες πλάκες ξηρά παρασκευάσματα Κολπικό εναιώρημα νωπά παρασκευάσματα

86

87 ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΚΟΛΠΙΚΟΥ ΥΓΡΟΥ Νωπά παρασκευάσματα: Τριχομονάδες Μύκητες Ερυθρά Πυοσφαίρια Επιθηλιακά κύτταρα του κόλπου

88 ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΚΟΛΠΙΚΟΥ ΥΓΡΟΥ Ξηρά παρασκευάσματα: Κυανό του μεθυλενίου Χρώση Gram Διάγνωση: Γονόκοκκο Μονίλια (μικκύλια και σπόρια είναι θετικά Gram) Σαπροφυτική χλωρίδα

89 Μικροσκοπική εξέταση Νωπό παρασκεύασμα: Σε αντικειμενοφόρο πλάκα τοποθετούμε δείγμα και μια σταγόνα φ.ο. NaCl 0.8%. Καλυπτρίδα και μικροσκόπηση Τριχομοναδική κολπίτιδα: Τριχομονάδες, κινούμενα σωματίδια, μεγαλύτερα από πυοσφαίρια, στρογγυλά ή μακρουλά Εχουν κίνηση ζωηρή και με κατεύθυνση

90 Μικροσκόπηση - Τριχομονάδες

91 Τριχομονάδες Η δεύτερη μετά τη μυκητίαση κολπίτιδα Η συχνότητα είναι μεγαλύτερη σε γυναίκες ηλικίας ετών. Μια στις πέντε γυναίκες μολύνονται στη διάρκεια της σεξουαλικής τους ζωής Η τριχομονάδα επιζεί για μια (1) ώρα σε υγρό περιβάλλον και 24 ώρες σε υγρό θερμό 35οC περιβάλλοντος Μόλυνση και από κάθισμα τουαλέτας 13% Νεογνά μολύνονται 5% από τις μητέρες Η πρόκληση λοίμωξης υπαγορεύεται από την προσκολλητικότητα του πρωτόζωου σε πλακώδη επιθήλια του βλεννογόνου του κόλπου

92 Τριχομονάδες Τα τελευταία χρόνια η συχνότητα απομόνωσης έχει μειωθεί σημαντικά, λόγω της τήρησης των κανόνων υγειινής και λόγω της ευαισθησίας του μικροβίου στα φάρμακα Τα συμπτώματα περιλαμβάνουν: Κολπική διόγκωση Κνησμό, ερεθισμό, πόνο Αίσθημα καύσου Πηκτό, κίτρινο- πράσινο κολπικό έκκριμα Συχνή ανάγκη για ούρηση Πιθανές κηλίδες αίματος

93 Διάγνωση Τ. vaginalis Νωπό παρασκεύασμα (ευαισθησία 55-60%): πρώτες ενδείξεις μικροσκόπιο - μορφολογία του παρασίτου μέθοδος απλή και γρήγορη, όμως το παράσιτο μπορεί να μας διαφύγει λόγω δειγματοληπτικού σφάλματος πρέπει να πραγματοποιηθεί μέσα σε 15 min από την λήψη του δείγματος

94 Διάγνωση Τ. vaginalis Καλλιέργεια του δείγματος (ευαισθησία >90%): περισσότερο ευαίσθητη εξέταση μικροαερόφιλη ή αναερόβια συνθήκες ανάπτυξης επώαση CO2, ο C καθημερινός έλεγχος καλλιέργειας για 5 ημέρες απαιτείται όμως καλλιέργεια 7 ημερών για τη πλήρη ανάπτυξη του παρασίτου

95 hžps://

96 Διάγνωση Τ. vaginalis Αμεσος ανοσοφθορισμός (DFA), μια μέθοδος που ανιχνεύει τα αντιγόνα της τριχομονάδας Αμεση ανίχνευση αντιγόνου Trichomonas Rapid Test

97 Διάγνωση Τ. vaginalis Μοριακός έλεγχος: άμεσους ιχνηθέτες DNA τεχνολογία της PCR ELISA Real- Time PCR Προσφέρει τον πιο ευαίσθητο και έγκαιρο προσδιορισμό (συνήθως εντός 24 ωρών)

98 ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΟΥΡΩΝ Ανίχνευση αναπαραγωγικών στοιχείων των παρασίτων: Ωάρια σχιστοσώματος Προνύμφες φιλαριών Τριχομονάδα του κόλπου (γυναίκες με κολπίτιδα) Οξύουροι, ωάρια οξύουρου και ασκαρίδας, κύστεις λαμβλιών κ.α. που παρασύρθηκαν από το περίνεο παιδιού με εντερική ελμινθίαση

99 ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΟΥΡΩΝ ΛΗΨΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ml δείγματος ούρων από φυσιολογική ούρηση (T. Vaginalis, Φιλάριες) Ούρα 24ώρου (Σχιστόσωμα)

100 ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΟΥΡΩΝ ΕΞΕΤΑΣΗ ΟΥΡΩΝ Από φυσιολογική ούρηση: Φυγοκέντρηση ml ούρων στις 1500 στροφές για 1-2 min Μικροσκόπηση (10x, 40x) ιζήματος Ούρα 24ώρου: Αφήνουμε σε ηρεμία για 15-20min Απορρίπτουμε έως το ύψος των 4-6cm από τον πυθμένα Τοποθετούμε σε κωνική φιάλη και αφήνουμε σε ηρεμία για 15-20min Απορρίπτουμε έως το ύψος των 2-3cm από τον πυθμένα Εξέταση ιζήματος με ή χωρίς φυγοκέντρηση σε μικροσκόπιο (10x, 40x)

101 ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΟΥΡΩΝ Αναζήτηση Σχιστοσώματος Δείγμα: πρέπει να συλλέγεται όταν είναι μεγαλύτερη η πιθανότητα να βρούμε αυγά (μεταξύ 10 π.μ. και 2 μ.μ.) Πρέπει να εξεταστεί όσο το δυνατόν μεγαλύτερη ποσότητα ούρων για την ανίχνευση ήπιων λοιμώξεις (δείγμα από πολλές διαφορετικές ημέρες) Υπάρχουν δύο κύριες μέθοδοι για την ανίχνευση αυγών του S. haematobium: 1. Μέθοδος καθίζησης 2. Μέθοδος διήθησης

102 ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΟΥΡΩΝ 1. Μέθοδος καθίζησης Αναζήτηση Σχιστοσώματος Αφήνουμε σε ηρεμία (αφού αρχικά αναδεύσαμε) το δείγμα ούρων να καθιζάνει επί 1 ώρα σε μια κωνική φιάλη Απορρίπτουμε το υπερκείμενο και συλλέγουμε το ίζημα σε φυγοκεντρικό σωλήνα Φυγοκεντρούμε για όχι περισσότερο από 2 λεπτά στις 2000 g Εξετάζουμε το ίζημα σε χαμηλή μεγέθυνση για την παρουσία ωαρίων

103 ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΟΥΡΩΝ 2. Μέθοδος διήθησης Αναζήτηση Σχιστοσώματος Τοποθετούμε ένα πολυανθρακικό ή φίλτρο ίνες από νάιλον (12-20 μm μέγεθος πόρου) σε μια υποδοχή του φίλτρου Ανακινούμε τα ούρα και γεμίζουμε μια σύριγγα (10-20 ml) Προσαρμόζουμε στη βάση του φίλτρου και φιλτράρουμε τα ούρα Αφαιρούμε με λαβίδα το φίλτρο και τοποθετούμε σε μια αντικειμενοφόρο πλάκα Εξετάζουμε ολόκληρο το φίλτρο για αυγά μετά από χρώση με ιωδιούχο διάλυμα Lugol

104

105 ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΟΥΡΩΝ Υποπτος ασθενής με αρνητικό αποτέλεσμα εξέτασης Επανάληψη της εξέτασης 3-5 φορές κάθε 2-3 ημέρες

106 ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΑΙΜΑΤΟΣ Αναζήτηση αιμοπρωτοζώων και μικροφιλαριών 3-5 ml αίματος σε φιαλίδιο με EDTA Πριν την έναρξη της φαρμακευτικής αγωγής Μέθοδοι: Χρωματισμένο επίχρισμα αίματος κατά Giemsa Μέθοδος «παχιάς σταγόνας» Τροποποιημένη μέθοδος Kno Μέθοδος διήθησης με φίλτρο μεμβράνης

107 ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΑΙΜΑΤΟΣ Χρωματισμένο επίχρισμα αίματος κατά Giemsa: Αποτελεσματικότητα της μεθόδου για αιμοπαράσιτα Τοποθέτηση σταγόνας αίματος σε αντικειμενοφόρο πλάκα Καλυπτρίδα που εφάπτεται στη σταγόνα με γωνία περίπου 45 ο Ροή της σταγόνας στην πλευρά της καλυπτρίδας και έπειτα σύρουμε την καλυπτρίδα ώστε να γίνει ένα λεπτό επίχρισμα αίματος (έλκουμε- δεν σπρώχνουμε) Αφήνουμε να στεγνώσει σε θερμοκρασία δωματίου Μονιμοποιούμε με επικάλυψη με μεθανόλη για τουλάχιστον 5 min

108 ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΑΙΜΑΤΟΣ Χρωματισμένο επίχρισμα αίματος κατά Giemsa (συνέχεια): Απόρριψη ή εξάχνωση της μεθανόλης Αφήνουμε να στεγνώσει σε θερμοκρασία δωματίου Χρώση Giemsa (περίπου 4ml/επίχρισμα) για 30-45min Απόρριψη χρωστικής και ξέπλυμα με απεσταγμένο νερό Αφήνουμε να στεγνώσει και μικροσκοπούμε (100x) Μονιμοποίηση: αμέσως μετά το στέγνωμα Χρώση: το αργότερο έως 1 εβδομάδα Μη μονιμοποιημένα: διατήρηση στους - 20 ο C

109 Χρωματισμένο επίχρισμα αίματος κατά Giemsa Thin and thick blood films hžp://cal.vet.upenn.edu/projects/parasit06/ website/bloodvideo.htm και hžp:// diagnosis.ch/bloodfilms Χρώση Giemsa hžp:// diagnosis.ch/giemsa

110 ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΑΙΜΑΤΟΣ Μέθοδος «παχιάς σταγόνας»: Στεγνό παρασκεύασμα νωπού αίματος που γίνεται αμέσως μετά την αιμοληψία, χωρίς αντιπηκτικό, και αποστέλλεται στο εργαστήριο Τοποθέτηση 3 σταγόνων αίματος σε αντικειμενοφόρο πλάκα και αφήνουμε να στεγνώσει σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (όχι επίχρισμα) Αποτελεσματικότητα μεθόδου για πρωτόζωα που απαντώνται στο αίμα, ιδιαίτερα όταν η συγκέντρωσή τους είναι μικρή

111 ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΑΙΜΑΤΟΣ Μέθοδος «παχιάς σταγόνας» (συνέχεια): Τοποθέτηση της αντικειμενοφόρου ανεστραμμένη σε δοχείο με απεσταγμένο νερό μέχρι να σταματήσει ο αποχρωματισμός του αίματος. Η αιμόλυση επιτυγχάνεται επίσης με επικάλυψη με υδατικό διάλυμα μπλε του μεθυλενίου 0,5% (χρωματισμός παρασίτων, όχι άλλα στάδια τεχνικής) Αφήνουμε να στεγνώσει σε θερμοκρασία δωματίου Μονιμοποιούμε με επικάλυψη με μεθανόλη για τουλάχιστον 5 min Απόρριψη ή εξάχνωση της μεθανόλης

112 ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΑΙΜΑΤΟΣ Μέθοδος «παχιάς σταγόνας» (συνέχεια): Αφήνουμε να στεγνώσει σε θερμοκρασία δωματίου Χρώση Giemsa (περίπου 4ml/επίχρισμα) για 30-45min Απόρριψη χρωστικής και ξέπλυμα με απεσταγμένο νερό Αφήνουμε να στεγνώσει και μικροσκοπούμε (100x)

113 ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΑΙΜΑΤΟΣ Τροποποιημένη μέθοδος Kno Αποτελεσματικότητα μεθόδου για μικροφιλάριες Τοποθέτηση 1ml αίματος σε σωλήνα φυγοκέντρου Προσθήκη 9ml διαλύματος φορμόλης 2% Ανάδευση με ξύλινη ράβδο Αφήνουμε σε ηρεμία για 1-2min ώστε αν επέλθει πλήρης αιμόλυση Φυγοκέντρηση στις 1500 στροφές για 5-10min (στο ίζημα συγκεντρώνονται οι μικροφιλάριες) Απόρριψη υπερκείμενου με αναστροφή

114 ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΑΙΜΑΤΟΣ Τροποποιημένη μέθοδος Kno (συνέχεια): Προσθήκη σταγόνων (περίπου ίση ποσότητα με ίζημα) υδατικού διαλύματος μπλε του μεθυλενίου 0,1% και ανάμειξη Τοποθέτηση 1-2 σταγόνων του υλικού σε αντικειμενοφόρο πλάκα Καλυπτρίδα και μικροσκόπηση Οι μικροφιλάριες χρωματίζονται μπλε

115 Τροποποιημένη μέθοδος Kno hžp://cal.vet.upenn.edu/projects/parasit06/ website/knožvideo.htm Και hžp:// diagnosis.ch/microfilariae

116 ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΑΙΜΑΤΟΣ Μέθοδος διήθησης με φίλτρο Τοποθέτηση 1ml δείγμα αίματος (με EDTA ή ηπαρίνη) σε μια σύριγγα Προσθήκη έως 10ml διαλύματος λύσης (5,0 ml Triton Χ- 100, 8,0 gr NaCO3, 1 λίτρο νερό) Καλή ανάδευση Προσαρμογή της σύριγγας σε συσκευή φίλτρου Το διάλυμα αίματος (έχει υποστεί λύση) φιλτράρεται με χρήση φίλτρου μεμβράνης (πόροι 8μ) Αφαίρεση φίλτρου και τοποθέτηση σε αντικειμενοφόρο πλάκα Προσθήκης μιας σταγόνας χρώσης μπλε του μεθυλενίου Καλυπτρίδα και μικροσκόπηση

117 Μέθοδος διήθησης με φίλτρο hžp://cal.vet.upenn.edu/projects/parasit06/ website/filtra onvideo.htm

118 ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΕΓΚΕΦΑΛΟΝΩΤΙΑΙΟΥ ΥΓΡΟΥ Αναζήτηση πρωτοζώων Entamoeba histolyfca Naegleria fowleri Hartmannella culbertsoni Toxoplasma gondii Trypanosoma Στο ΕΝΥ υπάρχουν παράσιτα σε τέτοιο χαμηλό αριθμό που πρέπει να συμπυκνώνεται (με φυγοκέντηση) πριν την εξέταση

119 ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΕΓΚΕΦΑΛΟΝΩΤΙΑΙΟΥ ΥΓΡΟΥ ΕΝΥ που συλλέγεται από οσφυονωτιαία παρακέντηση μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αναζήτηση παρασίτων και βακτηρίων που προκαλούν μηνιγγίτιδα Ταυτοποίηση του αιτιολογικού παράγοντα της εγκεφαλικής ελονοσίας ή τρυπανοσωμίασης

120 ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΕΓΚΕΦΑΛΟΝΩΤΙΑΙΟΥ ΥΓΡΟΥ Μόλις γίνει η συλλογή του θα πρέπει να εξεταστεί το συντομότερο δυνατό Τα παράσιτα δεν είναι σε θέση να επιβιώσουν για περισσότερο από λεπτά στο ΕΝΥ, αφού έχει αφαιρεθεί. Τα παράσιτα αδρανοποιούνται, λύονται ταχέως και συνεπώς δεν θα ανιχνεύονται Το ΕΝΥ πρέπει να εξετάζεται με νωπό παρασκεύασμα και με φιλμ- μεμβράνη. Η μεμβράνη στη συνέχεια βάφεται με χρώση Field s ή Giemsa και εξετάζεται μικροσκοπικά

121