ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΕΠΙΛΕΓΜΕΝΩΝ ΟΡΓΑΝΟΦΩΣΦΟΡΙΚΩΝ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΤΕΥΤΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΣΤΟ ΘΑΛΑΣΣΙΟ ΦΥΤΟΠΛΑΓΚΤΟΝΙΚΟ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟ Tetraselmis suecica

Transcript

1 9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας Πρακτικά, Τόμος ΙΙ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΕΠΙΛΕΓΜΕΝΩΝ ΟΡΓΑΝΟΦΩΣΦΟΡΙΚΩΝ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΤΕΥΤΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΣΤΟ ΘΑΛΑΣΣΙΟ ΦΥΤΟΠΛΑΓΚΤΟΝΙΚΟ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟ Tetraselmis suecica Σμαραγδάκη Ν.Μ., Παυλάκη Μ.Δ., Πέτσας Α.Σ., Βαγή Μ.Χ., Κωστοπούλου-Καραντανέλλη Μ.Ν. Εργαστήριο Τοξικολογίας, Τμήμα Επιστημών της Θάλασσας, Σχολή Περιβάλλοντος, Πανεπιστήμιο Αιγαίου, Λόφος Πανεπιστημίου, Μυτιλήνη, Smaragdaki.niki@gmail.com. Περίληψη Η παρούσα έρευνα περιλαμβάνει την εκτίμηση της τοξικότητας τεσσάρων επιλεγμένων οργανοφωσφορικών ενώσεων, που χρησιμοποιούνται ευρέως στη γεωργία ως φυτοπροστατευτικά προϊόντα «νέας γενιάς», έναντι οργανισμών μη-στόχων, όπως τα μικροφύκη. Ο ρόλος των μικροοργανισμών αυτών στα υδατικά οικοσυστήματα είναι πολύ σημαντικός, αφού σε αυτούς οφείλεται η πρωτογενής παραγωγή. Οι οργανοφωσφορικοί εστέρες που μελετήθηκαν είναι: Dimethoate, Fenthion, Parathion Εthyl και Parathion Μethyl. Πραγματοποιήθηκαν τελικές δοκιμές τοξικότητας στις οποίες καλλιέργειες του θαλάσσιου μονοκύτταρου μικροφύκους Tetraselmis suecica εκτέθηκαν για 96h σε εύρη συγκεντρώσεων των επιλεγμένων ενώσεων. Με βάση την κυτταρική πυκνότητα που μετρούνταν κάθε 24h προσδιορίστηκε η τιμή της αποτελεσματικής συγκέντρωσης EC 50 για κάθε ένωση. Τα πειραματικά δεδομένα αποδεικνύουν ότι από τις ενώσεις που μελετήθηκαν εκείνη που έχει μεγαλύτερη τοξική δράση είναι το Fenthion (EC 50 :1,52ppm), ενώ εκείνη με τη μικρότερη είναι το Dimethoate (EC 50 : 238,8 ppm). Λέξεις κλειδιά: υδατική τοξικολογία, δοκιμές τοξικότητας, μικροφύκος, αποτελεσματική συγκέντρωση, EC 50. EVALUATION OF TOXICITY OF SELECTED ORGANOPHOSPHORUS PESTICIDES BY MARINE MICRO ALGA Tetraselmis suecica Smaragdaki N.M., Pavlaki M.D., Petsas A.S., Vagi M.C., Kostopoulou-Karantanelli M.N. Toxicology Laboratory, Department of Marine Sciences, Faculty of Environmental Studies, University of Aegean, University Hill, , Mitilene, Smaragdaki.niki@gmail.com. Abstract The present study concerns the evaluation of toxicity of four selected organophosphorus compounds that are widely used in agriculture as new generation s pesticides, to non-target organisms, such as microalgae. Algae located at the base of the food chain are of vital importance in the primary production of aquatic ecosystems. The oganophoshporus esters that were examined are Dimethoate, Fenthion, Parathion Εthyl and Parathion Μethyl. Final ecotoxicity tests were carried out by exposing the marine unicellular green alga Tetraselmis suecica to various concentrations of the selected compounds for a period of 96h. Estimation of EC 50 values (Effective Concentration) was performed according to the daily measured cell densities of the tested cultures. Experimental results proved that from the tested compounds Fenthion (EC 50 : 1,52ppm) was the more toxic one, while on the contrary the less toxic organophosphorus ester was Dimethoate (EC 50 : 238,8 ppm). Keywords: aquatic toxicology, bioassays, phytoplankton, Effective Concentration, EC Εισαγωγή Τα φυτοπροστατευτικά προϊόντα χρησιμοποιούνται ευρέως στις αγροτικές δραστηριότητες, με σκοπό την προστασία των καλλιεργειών από παράσιτα, έντομα, ζιζάνια και άλλους εχθρούς των φυτών. Οι ουσίες αυτές έχουν συμβάλει στην αύξηση της γεωργικής παραγωγής, καταπολεμώντας αυτούς τους οργανισμούς «στόχους». Πέρα από τη θετική επίδρασή τους στον αγροτικό τομέα, τα προϊόντα αυτά έχουν προκαλέσει υποβάθμιση τόσο του χερσαίου όσο και του υδάτινου περιβάλλοντος. Η εισαγωγή τους στον υδροφόρο ορίζοντα μέσω των βροχοπτώσεων και της επιφανειακής απορροής, αλλά και μέσω της ατμόσφαιρας (όσον αφορά πτητικές ενώσεις) έχει αρνητικές επιδρά

2 9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, Proceedings, Volume ΙΙ σεις σε οργανισμούς «μη στόχους» (Μουρκίδης, 1974). Τα οργανοφωσφορικά φυτοπροστατευτικά προϊόντα είναι μία από τις κατηγορίες φυτοφαρμάκων, η χρήση των οποίων έχει αυξηθεί τα τελευταία χρόνια, αντικαθιστώντας άλλες ουσίες που θεωρούνται περισσότερο επιβλαβείς (Μουρκίδης, 1974; Tomlin, 1997). Για παράδειγμα, τα οργανοχλωριωμένα παρασιτοκτόνα έχουν σχεδόν αντικατασταθεί από τα οργανοφωσφορικά, γιατί τα τελευταία υδρολύονται ταχύτερα και επιπρόσθετα τα προϊόντα διάσπασής τους δεν θεωρούνται τοξικά (Ηodgson, 2004; Fest C. & K. J. Schmidt, 1983). Όσον αφορά τις οικοτοξικολογικές επιπτώσεις των οργανοφωσφορικών εντομοκτόνων, αξίζει να αναφερθεί ότι η πληροφορία προέρχεται κυρίως από ερευνητικές εργασίες που περιλαμβάνουν δοκιμές τοξικότητας με υδρόβιους μικροοργανισμούς μη-στόχους που διαβιούν σε γλυκά νερά (Ferrando et al., 1996; Cáceres et al., 2008). Αντίθετα, οι μελέτες στη διεθνή βιβλιογραφία που εστιάζουν σε θαλάσσιους οργανισμούς, είναι σχετικά περιορισμένες τόσο ως προς τον αριθμό των οργανοφωσφορικών ενώσεων, όσο και ως προς τα είδη που χρησιμοποιούνται (Guzzella et al., 1997). Όπως είναι γνωστό ο βαθμός τοξικότητας μίας ουσίας εξαρτάται από την ίδια την ουσία (χημική δομή, φυσικοχημικές ιδιότητες), από τις φυσικές και χημικές παραμέτρους του υδάτινου περιβάλλοντος, αλλά και από τους ίδιους τους οργανισμούς οι οποίοι εκτίθενται σε αυτήν. Είναι επίσης γνωστό ότι οι φυτοπλαγκτονικοί οργανισμοί αποτελούν τη βάση της τροφικής αλυσίδας στο θαλάσσιο περιβάλλον. Έτσι το μεγαλύτερο ποσοστό της πρωτογενούς παραγωγής οφείλεται στους οργανισμούς αυτούς και οποιαδήποτε διατάραξη των συνθηκών διαβίωσης τους έχει επίδραση και στους ανώτερους οργανισμούς, γεγονός που καθιστά πολύ σημαντική τη μελέτη της επίδρασης των οργανοφωσφορικών εστέρων σ αυτούς. Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της τοξικής δράσης των οργανοφωσρφορικών ενώσεων Dimethoate, Fenthion, Parathion Εthyl και Parathion Μethyl στο θαλάσσιο φυτοπλαγκτονικό είδος Tetraselmis Suecica. 2. Μεθοδολογία Το θρεπτικό υπόστρωμα που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη για την μονοκαλλιέργεια του μικροφύκους Tetraselmis suecica είναι το f/2, το οποίο χρησιμοποιείται ευρέως για την ανάπτυξη θαλάσσιων μικροφυκών (Guillard, 1975), ενώ η ακριβής του σύσταση περιγράφεται σε προηγούμενη εργασία του Εργαστηρίου Τοξικολογίας (Vagi et al., 2005). Η διεξαγωγή των πειραμάτων έγινε σύμφωνα με το πειραματικό πρωτόκολλο του OECD (OECD, 1981). Το θαλάσσιο μονοκύτταρο μαστιγωτό μικροφύκος Tetraselmis suecica επιλέχθηκε βάσει της διαθεσιμότητάς του, της ευκολίας καλλιέργειάς του και του ιδιαίτερου ενδιαφέροντος που παρουσιάζει ως πηγή τροφής ψαριών σε μεγάλο αριθμό ιχθυοτροφείων. Ο οργανισμός εκτέθηκε σε πέντε τουλάχιστον διαφορετικά επίπεδα συγκεντρώσεων για κάθε οργανοφωσφορικό εστέρα (Πίν. 1), οι οποίες επιλέχθηκαν βάσει της βιβλιογραφίας (Guzzella et al., 1997) και κυρίως βάσει των προκαταρκτικών δοκιμών τοξικότητας που πραγματοποιήθηκαν από την ερευνητική μας ομάδα για την εύρεση του εύρους αποτελεσματικών συγκεντρώσεων (Βαγή, 2007; Πέτσας, 2006; Vagi et al., 2005). Πίνακας 1: Τιμές των επιπέδων έκθεσης του Tetraselmis suecica στις δοκιμές τοξικότητας 96h. Χημική Ένωση Συγκέντρωση έκθεσης (mg L -1 ή ppm) Dimethoate 50,0 100,0 150,0 200,0 250,0 Fenthion 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 Parathion Ethyl 1,0 2,0 2,5 3,0 4,0 4,5 5,0 Parathion Methyl 4,5 5,5 6,5 7,0 7,5 8,0 Οι οργανοφωσφορικές ενώσεις διαλυτοποιήθηκαν σε κατάλληλο όγκο ακετόνης υψηλής κα

3 9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας Πρακτικά, Τόμος ΙΙ θαρότητας, ώστε η τελική συγκέντρωση της ως φέροντας διαλύτης στο θεωρούμενο διάλυμα, να μην είναι μεγαλύτερη από 50μL L -1. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε εμβολιασμός των σε εκθετική φάση καλλιεργειών του οργανισμού με αρχική πυκνότητα κυττάρων 1x10 5 κύτταρα ml -1 και τελικό όγκο 100mL, με την προσθήκη κατάλληλου όγκου προτύπου διαλύματος, ώστε να επιτευχθεί η τελική επιθυμητή συγκέντρωση του οργανοφωσφορικού εστέρα. Κάθε επαναληπτική σειρά εμπεριείχε καλλιέργεια ελέγχου (Control, C), καθώς και καλλιέργεια ελέγχου τοξικότητας διαλύτη (Control+Acetone, CA), στην οποία προστέθηκε η ενδεικνυόμενη ποσότητα διαλύτη ακετόνης. Συνολικά για κάθε επίπεδο συγκέντρωσης της κάθε ουσίας πραγματοποιήθηκαν 3 δοκιμές, ώστε να είναι δυνατή η περαιτέρω στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων. Οι φιάλες τοποθετήθηκαν σε θάλαμο σταθερών συνθηκών του οίκου SNIJDER SCIENTIFIC B.V, σε θερμοκρασία 20±0,3 ο C και υπό συνεχή σταθερό φωτισμό ελεγχόμενης έντασης 4300 lux. Οι καλλιέργειες ανακινούνταν ημερησίως για την ομογενοποίηση των διαλυμάτων, ενώ ο υπολογισμός της μέσης πυκνότητας των κυττάρων διεξάγονταν σε 24ωρη βάση μέσω καταμέτρησης των κυττάρων με άμεση μικροσκοπική μέτρηση (χρήση αιμοκυττόμετρου τύπου Neubauer και μικροσκοπίου Olympus CH-20) στις 0h, 24h, 48h, 72h, και 96h. Τέλος η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έγινε με τη βοήθεια των λογισμικών πακέτων SPSS 14.0 και Microsoft Office Excel Αποτελέσματα Τα δεδομένα που προέκυψαν από τις δοκιμές τοξικότητας αξιοποιήθηκαν αρχικά για την κατασκευή των καμπυλών ανάπτυξης που υποδεικνύουν επιπτώσεις στην ανάπτυξη του οργανισμού κατά την έκθεσή του στα προκαθορισμένα επίπεδα συγκεντρώσεων εκάστου οργανοφωσφορικού εστέρα (Εικ. 1α). Για το σκοπό αυτό υπολογίστηκαν η μέση κυτταρική πυκνότητα (σε x10 5 κύτταρα ml -1 ) καθώς και η τυπική απόκλιση (SD για n=3). Στη συνέχεια τα δεδομένα μετατράπηκαν σε ποσοστά απόκρισης (% Response) και ακολούθησε μετασχηματισμός αυτών, τύπου τετραγωνικής ρίζας τόξου ημιτόνου (z= arcsine x ), ώστε οι ομάδες αυτών να εμφανίζουν κανονική κατανομή (έλεγχος Kolmogorov-Smirnof για επίπεδο σημαντικότητας α=0,05) και να είναι δυνατή η περεταίρω στατιστική επεξεργασία τους με ανάλυση διασποράς (Anova one-way). Επίσης ελέγχθηκε εάν υφίσταται στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των δειγμάτων των ελέγχων, δηλαδή των καλλιεργειών ελέγχου (C) και ελέγχου τοξικότητας διαλύτη (CA). Σημειώνεται ότι δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ του δείγματος ελέγχου και του δείγματος ελέγχου που περιείχε ακετόνη. Ως τιμή στατιστικής σημαντικότητας λήφθηκε α= 0,05, τιμή η οποία και συνήθως θεωρείται σε αντίστοιχα πειράματα τοξικότητας. Ο μέγιστος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης των πληθυσμών μ αv (ημέρες) -1 (Maximum Specific Population Growth Rate in days -1 ), υπολογίστηκε από τη σχέση (1): μ α v ln X lnx ( t ) ( to) = t (1) όπου: lnx (t) η βιομάζα στο χρόνο t, δηλαδή στην συγκεκριμένη περίπτωση στις 96h και όπου lnx (tο) η βιομάζα στο χρόνο έναρξης της δοκιμής, δηλαδή στις 0h (Guillard, 1973). Για τον υπολογισμό της αποτελεσματικής συγκέντρωσης (ΕC 50, Effective Concentration) της τοξικής ένωσης, η οποία έχει ως επίπτωση το θάνατο ποσοστού 50% των οργανισμών υπολογίστηκε αρχικά το εκατοστιαίο ποσοστό παρεμπόδισης ή αναχαίτισης του ρυθμού ανάπτυξης του οργανισμού στόχου για κάθε επίπεδο συγκέντρωσης και για κάθε οργανοφωσφορικό εστέρα με βάση τη σχέση (2), (Rand & Petrocelli, 1985):

4 9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, Proceedings, Volume ΙΙ %Παρεμπόδιση = 100 μ control μ φυτοπροστατευτικής ουσίας μ control (2) Ενδεικτικά δίνεται το Εικ. (1β) που αφορά στη σιγμοειδή καμπύλη, η οποία προκύπτει από το % ποσοστό παρεμπόδισης σε σχέση με τη συγκέντρωση του τοξικού παράγοντα (Parathion Εthyl), κατά την έκθεση του Tetraselmis suecica, για 96h. Οι καμπύλες που προέκυψαν στο σύνολο των οργανοφωσφορικών φυτοπροστατευτικών προϊόντων χαρακτηρίζονται ως σιγμοειδείς, γεγονός που είναι αναμενόμενο λόγω της σχέσης που υφίσταται μεταξύ απόκρισης και συγκέντρωσης τοξικού παράγοντα. (α) Εικ. 1: α) Καμπύλη ανάπτυξης του Tetraselmis suecica κατά την έκθεσή του στο Parathion Ethyl. β) % Παρεμπόδιση του ρυθμού ανάπτυξης του Tetraselmis suecicα σε συνάρτηση με το δεκαδικό λογάριθμο της συγκέντρωσης του Parathion Ethyl. Τέλος για την εύρεση της αποτελεσματικής συγκέντρωσης EC 50 έγιναν τα γραφήματα της % παρεμπόδισης της ανάπτυξης του πληθυσμού σε σχέση με το δεκαδικό λογάριθμο της συγκέντρωσης φυτοπροστατευτικού προϊόντος (Εικ. 2). Στη συνέχεια εφαρμόστηκε γραμμική παλινδρόμηση δίνοντας πολύ ικανοποιητικούς συντελεστές συγγραμμικότητας των δύο παραμέτρων (R 2 >0,9126) και μέσω των γραμμικών εξισώσεων που προέκυψαν υπολογίστηκε η τιμή EC 50 για κάθε δραστική ουσία (Πίν. 2). Πίνακας 2: Τιμές αποτελεσματικής συγκέντρωσης (EC 50 ) για τα τέσσερα επιλεγμένα οργανοφωσφορικά προϊόντα όπως προέκυψαν από δοκιμές τοξικότητας στο μικροφύκος Tetraselmis suesicα. (β) Χημική Ένωση EC 50 (mg/l) Εξίσωση Γραμμικής Παλινδρόμησης R 2 Dimethoate 238,8 % Παρεμπόδιση=84,382. logc+150,7 0,9173 Fenthion 1,52 % Παρεμπόδιση =181,26. logc +17,01 0,9778 Parathion Ethyl 3,46 % Παρεμπόδιση =108,12. logc +7,87 0,9126 Parathion Methyl 6,30 % Παρεμπόδιση =233,04. logc +142,9 0, Συμπεράσματα - Συζήτηση Τα αποτελέσματα των δοκιμών τοξικότητας δείχνουν ότι η ευαισθησία του φυτικού οργανισμού μελέτης έναντι των ενώσεων αυτών είναι σχετικά μικρή, δεδομένου ότι τα επίπεδα των συγκεντρώσεων που χρησιμοποιήθηκαν και για τα οποία καταγράφηκε μείωση του ρυθμού ανάπτυξης ήταν

5 9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας Πρακτικά, Τόμος ΙΙ Εικ. 2: Ποσοστό παρεμπόδισης (%) του ρυθμού ανάπτυξης του Tetraselmis suecica σε συνάρτηση με το δεκαδικό λογάριθμο της συγκέντρωσης έκθεσης, για φυτοπροστατευτικό προϊόν. της τάξης των mg L -1 (ppm), ενώ τα επίπεδα συγκεντρώσεων των ενώσεων αυτών στις ελληνικές θάλασσες είναι της τάξης των μg L -1 (ppb). Βέβαια τα αποτελέσματα τοξικότητας της παρούσας μελέτης συμφωνούν με αποτελέσματα που έχουν προκύψει από ανάλογες μελέτες τοξικότητας οργανοφωσφορικών φυτοπροστατευτικών προϊόντων σε άλλους μικροοργανισμούς και στις οποίες καταγράφονται αποτελεσματικές συγκεντρώσεις της ίδιας τάξης μεγέθους (Ferrando et al., 1996; Tomlin, 1997; Guzzella et al., 1997; Vagi et al., 2005; Πέτσας, 2006; Βαγή, 2007). Αποδεικνύεται ότι, αν και τα επιλεγμένα φυτοπροστατευτικά προϊόντα ανήκουν όλα στην κατηγορία των οργανοφωσφορικών εστέρων και για τούτο επιδεικνύουν ίδια τοξικολογική δράση ως αναστολείς της ακετυλοχολινεστεράσης, ωστόσο η δραστικότητα αυτών ποικίλει μέχρι και ~150 φορές. Συγκεκριμένα, παρατηρείται σημαντική διαφορά μεταξύ της μικρότερης και της μεγαλύτερης τιμής, καθώς οι τιμές EC 50 για τον ίδιο οργανισμό, και για τις ίδιες συνθήκες έκθεσης κυμάνθηκαν από 1,52 ppm (Fenthion) έως 238,8 ppm (Dimethoate). Επιπρόσθετα αποδεικνύεται ότι το ethyl-παράγωγο είναι τοξικότερο του methyl παραγώγου έναντι του Tetraselmis suecica, κατά 2 περίπου φορές, γεγονός που έχει καταγραφεί στη βιβλιογραφία και για άλλους οργανοφωσφορικούς εστέρες και αποδίδεται στις διαφορετικές φυσικοχημικές ιδιότητες των μορίων, οι οποίες επηρεάζουν την κατανομή των ενώσεων (Πέτσας, 2006; Βαγή, 2007). Συνοπτικά και με βάση τη τοξική δράση των εν λόγω οργανοφωσφορικών ενώσεων στο είδος Tetraselmis suecica, μετά από έκθεσή τους για 96h, δίνεται η παρακάτω σειρά φθίνουσας τοξικής δράσης: Fenthion > Parathion Ethyl >Parathion Methyl >> Dimethoate. 5. Βιβλιογραφικές Αναφορές Albanis T.A., Danis T.G. & Kourgia M.K., Transportation of pesticides in estuarines of the Axios, Loudias and Aliakmon rivers (Thermaikos Gulf) Greece. Sci. Tot. Environ., 156: Caceres, T., Megharaj, M. & Naidou, R., Toxicity and transformation of fenamiphos and its metabolites by two micro

6 9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, Proceedings, Volume ΙΙ algae Pseudokirchneriella subcapitata and Chlorococcum sp. Sci. Tot. Environ., 398: Ferrando, M. D., Sancho, E. & Andreu-Moliner, E., Chronic toxicity of Fenitrothion to an Algae (Nannochloris occulata), a Rottifer (Brachionus calyciflorus), and the Cladoceran (Daphnia magna). Ecotoxic. Environ. Saf., 35: Fest, C. & Schmidt, K. J., Organophosphorus insecticides in Chemistry of Pesticides. Buchel K.H., John Wiley & Sons Inc (Eds), New York. Guillard, R. R.L., Division rates. p In:/ Culture Methods and Growth Measurements, Stein J.R. Cambridge University Press. Guillard, R. R.L., Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. p In: Culture of Marine Invertebrate Animals, Smith W.L. and Chentley M.H (Eds), Plenum Press, New York, USA. Guzzella, L., Gronda, L. & Colombo, L., Acute Toxicity of Organophosphorus Insecticides to Marine Invertebrates. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 59: Hodgson, E., A Textbook of modern toxicology. Publ. J. Wiley & Sons, Inc, Hoboken, New Jersey, USA. Organization for Economic Co-Operation and Development, (OECD), OECD Guideline 201: Testing of Effects on Biotic Systems, Alga, Growth Inhibition Test. In: OECD Guideline for Testing of Chemicals, Environ. Health and Safety Div., OECD Environ. Directorate, Paris. Rand, G.M. & Petrocelli, S. R., /Fundamentals of Aquatic Toxicology, Methods and Applications/. Hemisphere Publishing Corporation, USA. Tomlin, C.D.S., The Pesticide Manual-A World Compendium, 11 th Edition. Tomlin C.D.S. (Eds), British Crop Protection Council Publications Sales, Bear Farm, Binfield, Bracknell, Berks RG42 5QE, UK. Vagi, M.C., Kostopoulou, M. N., Petsas, A. P., Lalousi, M. E., Rasouli, Ch. & Lekkas, T. D., Toxicity of organophosphorus pesticides to the marine alga Tetraselmis suecica. Global Nest Intern. J., 7 (2): Βαγή, Μ., Μελέτη της υδρόλυσης και προσρόφησης επιλεγμένων οργανοφωσφορικών φυτοπροστατευτικών προϊόντων σε υδατικά και εδαφικά συστήματα/. Διδακτορική Διατριβή, Πανεπιστήμιο Αιγαίου, Σχολή Περιβάλλοντος, Τμήμα Περιβάλλοντος, Τομέας Περιβαλλοντικής Μηχανικής και Επιστήμης, Εργαστήριο Ποιότητας Υδάτων και Αέρα, Μυτιλήνη. Μουρκίδης, Γ.Α., Γεωργική Χημεία, Γ Γεωργική Φαρμακολογία. Θεσσαλονίκη. Πέτσας, Α., Μελέτη της φωτοδιάσπασης και της τοξικότητας των φυτοπροστατευτικών προϊόντων Azinphos Ethyl, Azinphos Methyl, Dimethoate, Disulfoton και Fenthion σε φυσικά νερά και ιζήματα. Διδακτορική Διατριβή, Πανεπιστήμιο Αιγαίου, Σχολή Περιβάλλοντος, Τμήμα Περιβάλλοντος, Τομέας Περιβαλλοντικής Μηχανικής και Επιστήμης, Εργαστήριο Ποιότητας Υδάτων και Αέρα, Μυτιλήνη