Η ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΟΥ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ COUP-TF ΜΕ ΤΟΝ CTIP ΚΑΙ ΟΙ ΙΑΦΟΡΕΤΙΚΕΣ ΙΣΟΜΟΡΦΕΣ ΤΟΥ ΣΤΑ ΜΕΤΑΖΩΑ.

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥ ΩΝ Η ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΟΥ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ COUP-TF ΜΕ ΤΟΝ CTIP ΚΑΙ ΟΙ ΙΑΦΟΡΕΤΙΚΕΣ ΙΣΟΜΟΡΦΕΣ ΤΟΥ ΣΤΑ ΜΕΤΑΖΩΑ. ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΙΠΛΩΜΑ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗΣ ΣΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ Πετροπούλου Χριστίνα ΑΜ: 440 Πάτρα, Ιούλιος 2011

2 2

3 3 Περιεχόµενα Εισαγωγή οµή ενεργοποιητών Η υπεροικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων Η καρβόξυτελική επέκταση (CTE) στους διαφόρους πυρηνικούς υποδοχείς Ο µηχανισµός δράσης των πυρηνικών υποδοχέων Αναδιαµόρφωση χρωµατίνης Η ακετυλιωση των ιστονών Η υποοικογένεια των COUP-TF υποδοχέων Τα στοιχεία απόκρισης των υποδοχέων Οι πρωτεϊνες CTIP1 και η CTIP Η εµπλοκή της αποακετυλάσης SIRT1 στη µεταγραφική καταστολή που διαµεσολαβείται από τον παράγοντα CTIP Προτεινόµενο µοντέλο δράσης των πρωτεινών CTIP.21 4.Εχινόδερµα και ο ρόλος του COUP-TF Συνοµοταξία Εχινόδερµων Τα αναπτυξιακά στάδια του αχινού Πρώτο στάδιο της εγκόλπωσης του αρχεντέρου εύτερη και τρίτη φάση της εγκόλπωσης του αρχεντέρου Tο γονίδιο SpCOUP-TF Η πρωτεΐνη SpCOUP-TF 30 Υλικά και µέθοδοι Μελέτη της αλληλεπίδρασης του COUP-TF µε τον CTIP Ηλεκτροφόρηση µορίων Sodium dodecyl sulfate polyacrilamide gel electrophoresis (SDS- PAGE) Western blotting Καλλιέργεια εµβρύων αχινού Paracentrotus lividus Συλλογή εµβρύων αχινού από διάφορα αναπτυξιακά στάδια Μονιµοποίηση εµβρύων..43

4 4 1.6 Μέθοδος ανοσοφθορισµού (Whole mount immunefluorescence) µε τη χρήση πλακών terasaki Εκχύλιση πρωτεϊνών από ωοκύτταρα και έµβρυα του αχινού Paracentrotus lividus Εκτίµηση της συγκέντρωσης πρωτεϊνών σε διάλυµα Ανοσοκατακρήµνιση (IP) EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay).50 Μελέτη της αλληλεπίδρασης του COUP-TF µε τον CTIP Εισαγωγή Αποτελέσµατα Western blot ανάλυση EMSA ανάλυση Πειράµατα ανοσοκατακρήµνισης Ανοσοκατακρήµνιση µε τα αντισώµατα Η-6Ο και anti-coup (πεπτ.) και εµφάνιση µε το αντίσωµα έναντι του CTIP Ανοσοκατακρήµνιση µε τo αντισώµα Η-6Ο (4 µgr) και εµφάνιση µε το αντίσωµα έναντι του COUP (πεπτ.) Ανοσοκατακρήµνιση µε το αντισώµα anti-ctip (3 µgr) και εµφάνιση µε το ίδιο αντίσωµα Ανοσοκατακρήµνιση µε το αντισώµα anti-ctip (3 µgr) και εµφάνιση µε το αντίσωµα anti-coup..68 Συζήτηση πειραµάτων ανοσοκατακρήµνισης Πειράµατα ανοσοφθορισµού Ανίχνευση της πρωτείνης CTIP µε τη µέθοδο του ανοσοφθορισµού στα πρώιµα αναπτυξιακά στάδια του αχινού P. lividus Ανίχνευση της πρωτείνης COUP µε τη µέθοδο του ανοσοφθορισµού στα πρώιµα αναπτυξιακά στάδια του αχινού P. lividus Συζήτηση αποτελεσµάτων ανοσοφθοριµού.72 Μελλοντικοί στόχοι.74 Μελέτη των ισοµορφών του COUP-TF στα Μετάζωα...75 Εισαγωγή Υλικά και µέθοδοι Σχεδιασµός εκφυλισµένων εκκινητών Αποµόνωση ολικού RNA από ιστούς 81

5 5 1.3 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης αντίστροφης µεταγραφής (RT-PCR) NESTED PCR Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης Καθαρισµός των προϊόντων PCR Αντίδραση λιγάσης Μετασγηµατισµός βακτηρίων µε πλασµιδιακό DNA Επιλογή αποικιών, streaking και ανακαλλιέργειά τους σε υγρό θρεπτικό µέσο Αποµόνωση πλασµιδίου µικρής κλίµακας (minipreps) Πέψη πλασµιδίων µε EcoRI Αλληλούχηση κλώνων Μοναδικές αποικίες και STOCK επιλεγµένων κλώνων...90 Αποτελέσµατα Μελέτη των ισοµορφών του COUP-TF στα Μετάζωα Φύλο Εχινόδερµα Οµοταξία Εχινοειδών Α. Strongylocetrotus purpuratus 91 B. Sphaerechinus granularis Οµοταξία Αστεροειδή..93 Α. Patiria miniata 93 Β. Marthasteria glacialis Οµοταξία Ολοθούρια Holothuria polii Οµοταξία Αµφιουροι. 103 Amphiura filiphormis Φύλο Χαιτόγναθων..106 Αντιπρόσωπος Sagitta minima Φύλο Xenoturbellida 106 Xenoturbella bocki Φυλο Ηµιχορδωτών..108 Αντιπρόσωπος Sakoglossus kowalevskii Υπόφυλο Ουροχορδωτών 109 Ciona intestinalis...109

6 6 Σύγκριση των αποτελεσµάτων όλων των υπό µελέτη οργανισµών..112 Συζήτηση Βιβλιογραφία

7 7 Στο Σπύρο που ήταν πάντα δίπλα µου

8 1 Εισαγωγή Στους ευκαρυώτες η γονιδιακή έκφραση ελέγχεται συνήθως στο επίπεδο της έναρξης της µεταγραφής. Για την έναρξη της µεταγραφής είναι απαραίτητο το ένζυµο RNA πολυµεράση και µεταγραφικοί παράγοντες. Όλες οι πρωτείνες που είναι απαραίτητες για την έναρξη της µεταγραφής ενώ δεν αποτελούν οι ίδιες συστατικά της RNA πολυµεράσης, ορίζονται ως µεταγραφικοί παράγοντες. Πολλοί µεταγραφικοί παράγοντες δρουν αναγνωρίζοντας cis-δραστικές αλληλουχίες, δηλαδή στοιχεία των υποκινητών και των ενισχυτών. Ωστόσο, η πρόσδεση στο DNA δεν είναι ο µοναδικός τρόπος δράσης ενός µεταγραφικού παράγοντα. Ένας παράγοντας µπορεί να αναγνωρίζει έναν άλλο παράγοντα, να αναγνωρίζει την RNA πολυµεράση ή να ενσωµατώνεται στο εναρκτήριο σύµπλοκο µόνο παρουσία άλλων πρωτεϊνών. Η έναρξη στους υποκινητές των ευκαρυωτικών οργανισµών ενέχει ένα µεγάλο αριθµό παραγόντων που προσδένονται σε µια πληθώρα cisδραστικών στοιχείων. Ο υποκινητής ορίζεται ως η περιοχή που περιέχει όλες αυτές τις θέσεις πρόσδεσης, δηλαδή αυτές που καθοδηγούν τη µεταγραφή µε το φυσιολογικό τρόπο ρύθµισης και σε φυσιολογικά επίπεδα. Έτσι, το σηµαντικότερο χαρακτηριστικό του υποκινητή ενός ευκαρυωτικού γονιδίου είναι ο εντοπισµός των θέσεων πρόσδεσης των µεταγραφικών παραγόντων. Η RNA πολυµεράση προσδένεται γύρω από το σηµείο έναρξης, αλλά δεν έρχεται σε άµεση επαφή µε την περιοχή του υποκινητή ανοδικά του σηµείου έναρξης. Οι µεταγραφικοί παράγοντες δηµιουργούν µια δοµή στους υποκινητές η οποία αποτελεί το στόχο που αναγνωρίζεται από την RNA πολυµεράση. Οι παράγοντες των RNA πολυµερασών Ι και ΙΙΙ είναι σχετικά απλοί, αλλά στην περίπτωση της RNA πολυµεράσης ΙΙ αποτελούν µια µεγάλη οµάδα µε τη γενική ονοµασία βασικοί παράγοντες. Οι βασικοί παράγοντες συνδέονται µε την RNA πολυµεράση ΙΙ σχηµατίζοντας ένα σύµπλοκο που περιβάλλει και καθορίζει το σηµείο έναρξης. Οι βασικοί παράγοντες, µαζί µε την RNA πολυµεράση ΙΙ συνιστούν τη βασική µεταγραφική συσκευή. Εκτός από τους βασικούς µεταγραφικούς παράγοντες στη µεταγραφή διαδραµατίζουν επίσης πολύ σηµαντικό ρόλο οι ενεργοποιητές και οι συνενεργοποιητές. Οι ενεργοποιητές είναι µεταγραφικοί παράγοντες οι οποίοι αναγνωρίζουν µε ειδικότητα, σύντοµες αλληλουχίες, οι οποίες εντοπίζονται στον υποκινητή ή τον ενισχυτή. Οι ενεργοποιητές αυξάνουν την αποδοτικότητα της πρόσδεσης

9 2 της βασικής συσκευής στον υποκινητή. Συνεπώς, αυξάνουν τη συχνότητα της µεταγραφής και γι αυτό είναι απαραίτητοι για τη λειτουργία ενός υποκινητή σε ικανοποιητικό επίπεδο. Κάποιοι ενεργοποιητές δρουν ιδιοστατικά (απαντώνται σε όλους του ιστούς), ενώ άλλοι έχουν ρυθµιστικό ρόλο και συντίθενται ή ενεργοποιούνται σε συγκεκριµένες χρονικές στιγµές ή σε συγκεκριµένους ιστούς. Εποµένως αυτοί οι παράγοντες ευθύνονται για τις µεταβολές του προτύπου της µεταγραφής ανάλογα µε τη θέση, δηλαδή µε τον κυτταρικό τύπο ή τον ιστό ενός πολυκύτταρου οργανισµού. Οι αλληλουχίες στις οποίες προσδένονται ονοµάζονται στοιχεία απόκρισης. Μια άλλη οµάδα παραγόντων που είναι αναγκαία για την αποδοτική µεταγραφή είναι οι συνενεργοποιητές. Οι παράγοντες αυτοί αποτελούν σύνδεσµο µεταξύ των ενεργοποιητών και της βασικής συσκευής, µέσω της ανάπτυξης αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Η συνηθισµένη µορφή ρύθµισης της µεταγραφής στους ευκαρυωτικούς οργανισµούς είναι θετική: ένας µεταγραφικός παράγοντας υπόκειται σε ιστοειδικό έλεγχο για την ενεργοποίηση ενός υποκινητή ή ενός συνδυασµού υποκινητών που φέρουν µια κοινή αλληλουχία-στόχο. Η ρύθµιση µε ειδική καταστολή του υποκινητήστόχου είναι πιο σπάνια. 1. οµή ενεργοποιητών Συνήθως οι ενεργοποιητές έχουν τµηµατική δοµή αφού άλλες επικράτειες ευθυνονται για την πρόσδεση στο DNA και άλλες για την ενεργοποίηση της µεταγραφής. Οι παράγοντες συχνά ταξινοµούνται ανάλογα µε τον τύπο της επικράτειας πρόσδεσης στο DNA. Τυπικά, ένα πολύ σύντοµο µοτίβο αµινοξέων αυτής της επικράτειας ευθύνεται για την πρόσδεση στο DNA. Το µοτίβο δάκτυλος ψευδαργύρου (zing finger) είναι µια επικράτεια πρόσδεσης στο DNA η οποία αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά στον παράγοντα TFIIIA, που είναι απαραίτητος για τη µεταγραφή των γονοδίων 5S του ριβοσωµικού RNA από την RNA πολυµεράση III. Από τότε έχει εντοπισθεί σε πολλούς µεταγραφικούς παράγοντες καθώς και σε υποθετικούς µεταγραφικούς παράγοντες. Μια διαφορετική παραλλαγή του µοτίβου αυτού έχει βρεθεί στους υποδοχείς των στεροειδών. Οι υποδοχείς στεροειδών (steroid receptors) κατατάσσονται σε µια οµάδα βάσει µιας λειτουργικής σχέσης: κάθε υποδοχέας ενεργοποιείται µε την πρόσδεση ενός συγκεκριµένου στεροειδούς. Ο υποδοχέας των γλυκοκορτικοειδών (glucocorticoid receptor) είναι αυτός που έχει αναλυθεί περισσότερο από όλους. Οι υποδοχείς των στεροειδών καθώς

10 3 και άλλοι υποδοχείς, όπως ο υποδοχέας της θυροειδούς ορµόνης (thyroid hormone receptor) ή ο υποδοχέας του ρετινοικού οξέος (retinoic acid receptor) είναι µέλη µιας µεγαλης οικογένειας προσδετοεξαρτώµενων ενεργοποιητών που έχουν τον ίδιο γενικό τρόπο λειτουργίας: ο ενεργοποιητής είναι ανενεργός έως ότου δεσµεύεσει ένα µικροµοριακό, ειδικό προσδέτη. Το µοτίβο έλικα-στροφή-έλικα (HTH, Helix-Turn-Helix) αναγνωρίστηκε αρχικά στους φάγους, ως επικράτεια πρόσδεσης των καταστολέων τους στο DNA. Η µια α-έλικα εφαρµόζει µέσα στη µεγάλη αύλακα του DNA, ενώ η άλλη προσανατολίζεται υπό γωνία εγκάρσια προς το DNA. Μια συγγενική µορφή του µοτίβου αυτού η οµοιοεπικράτεια (homeodomain), που αρχικά είχε χαρακτηριστεί σε διάφορες πρωτείνες οι οποίες κωδικοποιούνται από γονίδια που ρυθµίζουν την ανάπτυξη της Drosophila. Εντοπίζεται επίσης και σε µεταγραφικούς παράγοντες θηλαστικών. Το µοτίβο αµφιπαθής έλικα-βρόγχος-έλικα (HLH, Helix-Loop- Helix) βρέθηκε σε πρωτείνες των ευκαρυωτικών, πολλές από τις οποίες ρυθµίζουν την ανάπτυξη. Κάθε αµφιπαθής έλικα παρουσιάζει µία πλευρά µε υδρόφοβα κατάλοιπα και µια πλευρά µε φορτισµένα καάλοιπα. Το µήκος του συνδετικού βρόγχου είναι αµινοξέα. Το µοτίβο αυτό επιτρέπει το διµερισµό των πρωτεινών, ενώ µια βασική περιοχή της πρωτείνης, που βρίσκεται δίπλα του, έρχεται σε επαφή µε το DNA. Το µοτίβο φερµουάρ λευκίνης (leucine zipper) αποτελείται από µια αλληλουχία αµινοξέων στην οποία, σε κάθε έβδοµη θέση, βρίσκεται ένα κατάλοιπο λευκίνης. Το φερµουάρ λευκίνης ενός πολυπεπτιδίου αλληλεπιδρά µε το φερµουάρ λευκίνης ενός άλλου πολυπεππτιδίου σχηµατίζοντας ένα διµερές. ίπλα στο φερµουάρ λευκίνης µπορεί να υπάρχει µια αλληλουχία θετικά φορτισµένων καταλοίπων που ενέχονται στην πρόσδεση στο DNA. 1.1 Η υπεροικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων Η υπεροικογένεια των πυρηνκών υποδοχέων συνίσταται από περίπου 150 µέλη τα οποία εντοπίζονται σε όλα τα φύλα. Κατά συνέπεια η απανταχού παρουσία αυτών των παραγόντων αποδεικνύει ένα εξελικτικό πλεονέκτηµα (Mangelsdorf DJ et al 1995). Οι πυρηνικοί υποδοχείς παίζουν κεντρικό ρόλο στην διαφοροποίηση, την ανάπτυξη, τη µεταβολική ρύθµιση και την οµοιόσταση και αυτό φαίνεται από τις λειτουργίες που ρυθµίζουν σε κάθε οργανισµό καθώς και τις επιπτώσεις σε περίπτωση µεταλλάξεων των γονιδίων.

11 4 Οι κατηγορίες στις οποίες χωρίζεται η υπεροικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων βασιζόµενοι στο διµερισµό τους και στις ιδιότητες πρόσδεσης στο DNA είναι οι ακόλουθες (Mangelsdorf DJ et al 1995). Η κατηγορία των κλασσικών υποδοχέων στεροειδών ορµονών όπως τα γλυκοκορτικοειδή (GR), τα οιστρογόνα (ER), η προγεστερόνη (PR) κ.α. Ενεργοποιούνται από τον προσδέτη τους στο κυτταρόπλασµα και στη συνέχεια µεταφέρονται στον πυρήνα όπου προσδένονται στο DNA µε τη µορφή οµοδιµερών. Η κατηγορία των υποδοχέων του θυρεοειδκών ορµονών (TR), του ρετινοϊκού οξέως (RAR), της βιταµίνης D (VDR), του peroxisome proliferator activated receptor (PPAR), της εκδυσόνης (EcR) κ.α. Η πλειοψηφία των υποδοχέων που ανήκουν σε αυτή την κατηγορία προσδένονται σε ευθείες επαναλήψεις (µερικοί προσδένουν επίσης σε αντίθετες επαναλήψεις) στο DNA µε τη µορφή των ετεροδιµερών µε τον RXR παράγοντα (Retinoid X Receptor, Mangeldorf DJ et al 1990). Σηµειώνουµε ότι, µε εξαίρεση τους υποδοχείς των στεροειδών ορµονών, η κατηγορία αυτή συµπεριλαµβάνει τους υπόλοιπους γνωστούς προσδετο-εξαρτώµενους υποδοχείς. Η κατηγορία των υποδοχέων που προσδέται κυρίως σε ευθείες επαναλήψεις στο DNA µε τη µορφή οµοδιµερών. Η κατηγορία αυτή υποδοχέων προσδένει σε εκτεταµένες περιοχές του DNA µε τη µορφή µονοµερών. Αξίζει να σηµειωθεί, ότι οι περισσότεροι από τους ορφανούς υποδοχείς ανήκουν στην 3 η και 4 η κατηγορία πυρηνικών υποδοχέων, όπως φαίνεται και στην εικόνα που ακολουθεί. Εικόνα 1: Οι πυρηνικοί υποδοχείς µπορούν να χωριστούν σε 4 κατηγορίες ανάλογα µε τον προσδέτη τους, την πρόσδεση στο DNA και την ιδιότητα του διµερισµού τους.

12 5 Όλοι οι παραπάνω υποδοχείς παρουσιάζουν σηµαντικές δοµικές και λειτουργικές οµοιότητες. Οι επιµέρους δοµικές περιοχές των πυρηνικών υποδοχέων είναι οι ακόλουθες: Εικόνα 2: Οι επιµέρους δοµικές περιοχές των πυρηνικών υποδοχέων. Το αµινοτελικό άκρο των πυρηνικών υποδοχέων είναι η περιοχή Α/Β και συχνά καλείται «ρυθµιστής». Η επικράτεια αυτή περιέχει την περιοχή AF-1 µε ιδιότητα trans-ενεργοποίησης, ανεξάρτητη από την παρουσία προσδέµατος. Η περιοχή Α/Β αντιστοιχεί στο αµινοτελικό άκρο (-NH 2 ) της πρωτεΐνης και έχει τη µικρότερη οµολογία µεταξύ των µελών της υπεροικογένειας. Οι πυρηνικοί υποδοχείς προσδένονται στα στοιχεία απόκρισης στους υποκινητές των γονιδίων στόχων τους µέσω της επικράτειας πρόσδεσης στο DNA (DBD, DNA Binding Domain) ή C περιοχή. Στα µέλη της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων, η DBD αποτελείται από ένα εξαιρετικά συντηρηµένο πυρήνα (core DBD) και από µία ποικίλλουσα-µη συντηρηµένη καρβόξυ-τελική επέκταση της DBD (Carboxy-Terminal [CTE] extension of DBD ) περίπου αµινοξέων. Τα µοτίβα των δακτύλων ψευδαργύρου της DBD επικράτειας έχουν την εξής αλληλουχία: Cys-X 2 -Cys-Xi 3 -Cys-X 2 -Cys ή για συντοµία C 2 C 2 µιας και η θέση πρόσδεσης του ψευδαργύρου δηµιουργείται από τέσσερις κυστεϊνες. Ο πρώτος δάκτυλος ψευδαργύρου περιέχει την αλληλουχία P- box, δοµής α-έλικας που είναι υπεύθυνη για την υψηλής συγγένειας αναγνώριση και πρόσδεση του υποδοχέα στην ηµιθέση του στοιχείου απόκρισης. Στο δεύτερο δάκτυλο ψευδαργύρου, εντοπίζεται το D-box, δοµής επίσης α-έλικας, που εκτείνεται κάθετα στην α-έλικα του P-box και είναι υπεύθυνο για τον διµερισµό του υποδοχέα αλλά και για τον καθορισµό της πρόσδεσης σε σχέση µε την απόσταση µεταξύ των ηµιθέσεων του στοιχείου απόκρισης.

13 6 Εικόνα 3: Η επικράτεια πρόσδεσης στο DNA. Οι δάκτυλοι ψευδαργύρου εισέρχονται µέσα στη µεγάλη αύλακα του DNA. Από την άλλη η CTE αποτελείται από δύο επιµέρους δοµικά στοιχεία: Το <<T box>> που είναι ένας βρόγχος που συνδέει την core DBD µε το «Α-box» το οποίο και σχηµατίζει µια α-έλικα (Rastinejad et al., 1995). Ενώ τα αµινοξέα στο «Α-box» εµπλέκονται κυρίως στο σχηµατισµό ειδικών συνδέσεων µε το εκάστοτε στοιχείο απόκρισης, το «Τ-box» έχει διαφορετικές λειτουργίες όπως η ειδική αναγνώριση ζευγών βάσεων, η διαµόρφωση της επιφάνειας του διµερούς καθώς και η υποστήριξη του κατάλληλου προσανατολισµού της α-έλικας του «Αbox». Αµέσως παρακείµενα της επικράτειας πρόσδεσης στο DNA βρίσκεται η hinge περιοχή ή περιοχή D. Η λειτουργία της περιοχής αυτής δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως ακόµα. Η D περιοχή προσδίδει ελαστικότητα στον υποδοχέα, επιτρέποντας του αλλαγές στην στερεοδιαµόρφωση του κατά την δέσµευση του προσδέµατος. Η αλληλουχία της επικράτειας πρόσδεση του προσδέµατος (LBD, Ligand Binding Domain) ή Ε/F περιοχή ποικίλει πολύ ανάµεσα στους πυρηνικούς υποδοχείς, αλλά όλοι µοιράζονται µια κοινή δοµή α- ελίκων, οργανωµένων γύρω από ένα υδροφοβικό θυλάκιο πρόσδεσης. Τα αµινοξικά κατάλοιπα του θυλακίου προσδίδουν ειδικότητα στον υποδοχέα, καθορίζοντας αν η LBD θα δεχτεί στεροειδείς ορµόνες, ρετινοειδή ή ξενοβιοτικά προσδέµατα που επηρεάζουν την λειτουργικότητα του υποδοχέα. Η εξαρτώµενη από το πρόσδεµα ενεργοποίηση του υποδοχέα απαιτεί την παρουσία της AF-2 περιοχής ενεργοποίησης, που εντοπίζεται στο καρβοξυτελικό άκρο του πυρηνικού υποδοχέα. Η LBD επίσης περιέχει πληροφορίες για τον διµερισµό, για την εγκατάσταση του υποδοχέα στον πυρήνα και θέσεις για αλληλεπίδραση µε heat shock πρωτεΐνες, συν-ρυθµιστικές πρωτεΐνες και άλλους µεταγραφικούς παράγοντες. (Chawla A. et al., 2001, Bourguet W. et al., 2000).

14 7 1.2 Η καρβόξυτελική επέκταση (CTE) στους διαφόρους πυρηνικούς υποδοχείς. Η CTE δεν φαίνεται να έχει τον ίδιο ρόλο, δηλαδή ως σταθεροποιητής του συµπλόκου υποδοχέα-dna µέσω της επέκτασης της επιφάνειας υποδοχέα-dna πέραν από τις επαφές που γίνονται στην core- DBD, σε διαφορετικούς υποδοχείς (Melvin et al., 2004). Η CTE δεν κάνει τριτοταγής δεσµούς µε την υπόλοιπη DBD αλλά προβάλλει εγκάρσια στην µικρή αύλακα όπου ουσιαστικά επεκτείνει την επιφάνεια επαφών υποδοχέα-dna. H CTE της κλάσης ΙΙ των πυρηνικών υποδοχέων σχηµατίζει µια α-έλικα («Α-box») που προβάλλει εγκάρσια στην µικρή αύλακα µεταξύ των ηµιθέσεων του στοιχείου απόκρισης. Όµως στον VDR σε αντίθεση µε τον TR φαίνεται ότι ο βασικός ρόλος της CTE είναι η διάκριση των στοιχείων απόκρισης και όχι η επέκταση των επαφών µε το DNA (Jakob et al., 2007; Shaffer and Gewirth, 2002). H CTE των ορφανών υποδοχέων σχηµατίζει ένα εκτεταµένο βρόγχο ο οποίος σχηµατίζει ειδικές συνδέσεις στην µικρή αύλακα. Ένα µικρό πεπτιδικό µοτίβο που ονοµάζεται «GRIP-box» (consensus αλληλουχία: RXGRZP όπου Χ οποιοδήποτε αµινοξύ και όπου Ζ υδρόφοβο αµινοξύ) µεσολαβεί τις αλληλεπιδράσεις στην µικρή αύλακα. Η CTE απαιτείται επίσης για την αναγνώριση των στοιχείων απόκρισης από µονοµερείς ορφανούς υποδοχείς (Jakob et al., 2007; Melvin et al., 2004; Melvin et al., 2002). Οι πυρηνικοί υποδοχείς που προσδένουν DNA ενεργοποιούν την µεταγραφή µέσω της συγκρότησης συµπλόκων συνενεργοποίησης. Μερικοί από τους συνενεργοποιητές έχουν ενζυµικές δραστηριότητες οι οποίες πιστεύεται ότι υποβοηθούν στην πρόσβαση των χρωµατινικών υποστρωµάτων από τους γενικούς µεταγραφικούς παράγοντες (Chen et al., 1999; Chen et al., 1997; Edwards, 2000; Freedman, 1999; McKenna et al., 1999) Επιπλέον τα συµπλέγµατα των συνενεργοποιητών µπορούν να εξυπηρετούν σαν γέφυρες ώστε να υποβοηθούν την συγκρότηση της βασικής µεταγραφικής συσκευής. (Fondell et al., 1996; Ito et al.,1999). Σχετικά πρόσφατα έχει ταυτοποιηθεί ακόµα µια οµάδα συν-ρυθµιστικών πρωτεϊνών, οι High Mobility Group proteins 1 και 2 (HMGΒ-1/-2) οι οποίες υποβοηθούν την αλληλεπίδραση των υποδοχέων στεροειδών ορµονών µε ειδικές DNA αλληλουχίες στόχους και φαίνεται να είναι σηµαντικοί για την µέγιστη µεταγραφική ενεργοποίηση από αυτή την υποοµάδα πυρηνικών υποδοχέων (Melvin and Edwards, 1999; Zhang et al., 1999). Ωστόσο δεν επηρεάζονται όλοι οι µεταγραφικοί παράγοντες που προσδένονται ειδικά στο DNA, από τις HMGΒ-1/-2 πρωτεΐνες. Οι HMGΒ-1/-2 ενισχύουν την πρόσδεση στο DNA και την µεταγραφική δραστηριότητα των υποδοχέων στεροειδών ορµονών, δεν επηρεάζουν

15 8 όµως τη λειτουργία της κλάσης ΙΙ των υποδοχέων, συµπεριλαµβανοµένων των RAR, RXR, VDR. Η CTE φαίνεται να παίζει σηµαντικό ρόλο όσον αφορά τις αλληλεπιδράσεις µε τις HMGΒ-1/-2. Με τη χρήση χειµερικών αλλά και κοµµατιασµένων πρωτεϊνών, έχει δειχθεί ότι η CTE είναι υπεύθυνη για την ικανότητα των HMGΒ-1/-2 να αυξάνουν επιλεκτικά την συγγένεια πρόσδεσης στο DNA των υποδοχέων στεροειδών ορµονών και είναι επίσης απαραίτητη για τις πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις µεταξύ των HMGΒ-1/-2 και υποδοχέων στεροειδών ορµονών. Αυτό δεν συµβαίνει µε τους υποδοχείς που ανήκουν στην κλάση ΙΙ των πυρηνικών υποδοχέων, ακριβώς λόγω της διαφορετικότητας στη CTE. Επίσης έχει δειχθεί ότι η CTE είναι υπεύθυνη για την υψηλότερη ενδογενή συγγένεια πρόσδεσης στο DNA των υποδοχέων της κλάσης ΙΙ (Melvin et al., 2002). 1.3 Ο µηχανισµός δράσης των πυρηνικών υποδοχέων. Οι πυρηνικοί υποδοχείς ορµονών µπορούν να δράσουν µε δύο τρόπους (Smirnov, A.N. 2002). Ο πρώτος µηχανισµός δράσης ασκείται από τους υποδοχείς στεροειδών ορµονών και ο δεύτερος από τους υποδοχείς των ρετινοειδών, των θυρεοειδών και της βιταµίνης D. Απουσία του κατάλληλου προσδέµατος, οι στεροειδικοί, µεταγραφικά µη ενεργοί υποδοχείς MR, PR, GR, AR και ER σχηµατίζουν µεγάλα πρωτεϊνικά σύµπλοκα µε heat shock πρωτεΐνες (HSP-90,-70), FKBP52/51 και άλλες πρωτεΐνες τα οποία εντοπίζονται στο κυτταρόπλασµα ή στον πυρήνα ανάλογα µε τον κυτταρικό τύπο και τις υπό εξέταση συνθήκες. Γενικά όµως το ισχύον κεντρικό δόγµα υποστηρίζει ότι οι στεροειδικοί υποδοχείς απουσία προσδέµατος βρίσκονται στο κυτταρόπλασµα. Κατά την δέσµευση του κατάλληλου προσδέµατος επάγεται διακριτή αλλαγή στην στερεοδιαµόρφωση του υποδοχέα που πυροδοτεί την έναρξη σηµατοδότησης. Στην περίπτωση των στεροειδών ορµονών η δέσµευση του προσδέµατος επάγει την αποδέσµευση των HSP και απελευθερώνει έναν µονοµερή υποδοχέα από το σύµπλοκο (Bourguet, W. et al 2000). Από την άλλη µεριά, οι υποδοχείς TR, RAR και VDR δεν αλληλεπιδρούν µε HSP και εντοπίζονται στον πυρήνα απουσία προσδέµατος. Μερικοί υποδοχείς αυτής της κατηγορίας, απουσία προσδέµατος, µπορούν να αλληλεπιδρούν µε το DNA δρώντας ως µεταγραφικοί καταστολείς. Αυτό ενδεχοµένως επιτυγχάνεται µέσω αλληλεπίδρασης µε πρωτεΐνες συγκαταστολείς. Εξαίρεση αποτελεί ο υποδοχέας CAR(Constitutively Active Receptor) που απουσία προσδέµατος είναι µεταγραφικά ενεργός. Αλλαγές στη στερεοδιαµόρφωση του υποδοχέα κατά τη δέσµευση του προσδέµατος, επιτυγχάνεται και σε αυτή την κατηγορία υποδοχέων, υποδεικνύοντας ότι

16 9 οι αλλαγές στο σχήµα του υποδοχέα που επάγεται από τα προσδέµατα είναι σηµείο «κλειδί» για την ενεργοποίηση των καθοδικών σηµατοδοτικών µονοπατιών (J.P. Vanden Heuvel, 2009). Οι πυρηνικοί υποδοχείς, ως µεταγραφικοί παράγοντες, ρυθµίζουν την µεταγραφή γονιδίων στόχων τους και για τον σκοπό αυτό µπορούν να αλληλεπιδρούν µε πρωτεΐνες συν-εργοποιητές ή συγκαταστολείς, για να ενεργοποιήσουν ή να καταστείλουν αντίστοιχα την µεταγραφή γονιδίων στόχων. Οι πρωτεΐνες συνενεργοποιητές διακρίνονται σε δύο µεγάλες κλάσεις. Στην πρώτη κλάση ανήκει η οικογένεια των switch/sucrose nonfermental (SWI/SNF) πρωτεϊνών και στην άλλη κλάση οι ακετυλοτρανσφεράσες των ιστονών. Οι ακετυλοτρανσφεράσες των ιστονών αλληλεπιδρούν µε την LBD πληθώρας πυρηνικών υποδοχέων και οι πιο χαρακτηρισµένοι εκπρόσωποι της κατηγορίας αυτής είναι οι πρωτεΐνες p160, p300, CREB, CBP και PCAF. Εικόνα 4: Τα πρωτεϊνικά σύµπλοκα που συγκροτούνται µέσω της στρατολόγησης πρωτεϊνών συνεργοποιητών από τους πυρηνικούς υποδοχείς. Οι πρωτεΐνες και των δύο κλάσεων έχουν την ικανότητα να µεταβάλλουν το χρωµατινικό περιβάλλον, διευκολύνοντας την µεταγραφική µηχανή. Με ανάλογο, αλλά αντίθετο λειτουργικά τρόπο, δρουν οι πρωτεΐνες συγκαταστολείς των πυρηνικών υποδοχέων. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν οι NCoR (Nuclear hormone Receptor Corepressors) και οι SMRT (Silencing Mediator of Retinoid and Thyroid Receptors) (Chen & Evans 1995). Όπως οι συνενεργοποιητές, έτσι και οι συγκαταστολείς προκαλούν αλλαγές στην χρωµατινική δοµή, επιστρατεύοντας αποακετυλάσες των ιστονών (HDACs) γειτονικά των υποδοχέων. Οι NCoR και SMRT συγκαταστολείς αλληλεπιδρούν µε τους υποδοχείς TR και RAR απουσία προσδέµατος κατά τον ετεροδιµερισµό τους µε τον υποδοχέα RXR. Μελέτες έχουν δείξει ότι µια συγκεκριµένη

17 10 περιοχή γνωστή ως CoR box που βρίσκεται στην hinge περιοχή των πυρηνικών υποδοχέων είναι βασική για την αλληλεπίδραση µε τους συγκαταστολείς. Οι πρωτεΐνες NCoR και SMRT βρίσκονται οργανωµένες σε πρωτεϊνικά σύµπλοκα των οποίων µέλη αποτελούν και οι παράγοντες SIN3, οι οποίοι λειτουργούν ως ενδιάµεσοι µεταξύ αποακετυλασών των ιστονών και υποδοχέων. Εικόνα 5: Τα πρωτεϊνικά σύµπλοκα που συγκροτούνται µέσω της στρατολόγησης πρωτεϊνών συγκαταστολέων από τους πυρηνικούς υποδοχείς. Εικόνα 6: Ο µηχανισµός δράσης των πυρηνικών υποδοχέων 1.4 Αναδιαµόρφωση χρωµατίνης Το κυτταρικό γονιδίωµα οργανώνεται σε νουκλεοσώµατα, εντούτοις το πακετάρισµα της περιοχής του υποκινητή µπορεί να εµποδίσει την έναρξη της µεταγραφής. Το επίµαχο ερώτηµα είναι πως οι µεταγραφικοί παράγοντες αποκτούν πρόσβαση στο DNA του υποκινητή.

18 11 Η δοµή της χρωµατίνης σε ρυθµιστικές περιοχές αποτελεί αναπόσπαστο στοιχείο του µηχανισµού ρύθµισης της γονιδιακής έκφρασης. Η δοµή ενός γονιδίου µπορεί να είναι εναλλακτικά είτε σε <<ενεργή>> είτε σε <<ανενεργή>> κατάσταση. Η ενεργή κατάσταση εµφανίζεται µόνο στα κύτταρα όπου το γονίδιο εκφράζεται. Η αλλαγή της δοµής προηγείται της έναρξης της µεταγραφής και υποδεικνύει ότι το γονίδιο είναι σε θέση να µεταγράφεται. Η διαδικασία επαγωγής αλλαγών στη δοµή της χρωµατίνης ονοµάζεται αναδιαµόρφωση της χρωµατίνης και περιλαµβάνει µηχανισµούς εκτόπισης των ιστονών, οι οποίοι απαιτούν κατανάλωση ενέργειας. Προκειµένου να απελευθερωθούν οι ιστόνες από τη χρωµατίνη, χρειάζεται να διασπαστούν πολυάριθµες επαφές µεταξύ πρωτεϊνών και πρωτεϊνών και µεταξύ πρωτεϊνών και DNA. Η διαδικασία αυτή έχει σηµαντικό κόστος για το κύτταρο, µια και η διάσπαση των επαφών απαιτεί ενέργεια. Όταν το οκταµέρες των ιστονών απελευθερώνεται από το DNA, άλλες πρωτεΐνες (σε αυτήν την περίπτωση, οι µεταγραφικοί παράγοντες και η RNA πολυµεράση) µπορούν να προσδεθούν σε αυτό. Η αναδιαµόρφωση της χρωµατίνης διενεργείται από µεγαλοµοριακά σύµπλοκα πρωτεϊνών που υδρολύουν ATP για να παραγάγουν την απαιτούµενη ενέργεια. Τα σύµπλοκα αναδιαµόρφωσης συνήθως ταξινοµούνται βάσει του τύπου της υποµονάδας ΑΤΡασης που περιέχουν- όσα έχουν συγγενικές υποµονάδες ΑΤΡασης θεωρούνται ότι ανήκουν στην ίδια οικογένεια. Το SWI/SNF ήταν το πρώτο σύµπλοκο αναδιαµόρφωσης χρωµατίνης που αναγνωρίστηκε. Πως όµως τα σύµπλοκα αναδιαµόρφωσης στοχεύουν συγκεκριµένες θέσεις της χρωµατίνης; Τα ίδια τα σύµπλοκα δε φέρουν υποµονάδες ικανές να αναγνωρίζουν ειδικές αλληλουχίες του DNA. Εποµένως είναι πιθανόν, τα σύµπλοκα να στρατολογούνται στις ειδικές θέσεις από ενεργοποιητές ή µερικές φορές από καταστολείς της µεταγραφής. Οι αλλαγές της χρωµατίνης σε ένα µεµονωµένο υποκινητή ελέγχουν την έναρξη της µεταγραφής του αντίστοιχου γονιδίου. Τέτοιου είδους αλλαγές µπορεί να έχουν είτε θετικές είτε αρνητικές συνέπειες στη γονιδιακή έκφραση. Τα παραπάνω φαινόµενα εξαρτώνται από ειδικές τροποποιήσεις των ιστονών. Οι αλλαγές στη δοµή της χρωµατίνης απαιτούν τροποποίηση των Ν-τελικών ουρών των ιστονών, ειδικά των Η3 και Η4. Η ουρά των ιστονών περιλαµβάνει τα περίπου 20 Ν-τελικά αµινοξέα και προεκβάλλει από το νουκλεόσωµα, ανάµεσα από τις σπείρες του DNA. Οι ουρές αυτές των ιστονών µπορούν να τροποποιηθούν µε µεθυλίωση, ακετυλίωση ή φωσφορυλίωση σε διαφορετικά αµινοξέα. Οι τροποποιήσεις επηρεάζουν το ηλεκτρικό φορτίο της πολυπεπτιδικής

19 12 αλυσίδας. Οι τροποποιήσεις των ιστονών είναι δυνατόν να επηρεάζουν άµεσα τη δοµή του νουκλεοσώµατος ή να δηµιουργούν θέσεις πρόσδεσης για την προσκόλληση µη ιστονικών πρωτεϊνών, οι οποίες αλλάζουν τις ιδιότητες της χρωµατίνης. Οι αντιδράσεις τροποποίησης της χρωµατίνης είναι εξειδικευµένες, αφού πολλά από τα τροποποιητικά ένζυµα αναγνωρίζουν ειδικές θέσειςστόχους πάνω σε συγκεκριµένες ιστόνες. Οι περισσότερες θέσεις-στόχοι υπόκεινται σε ένα µόνο τύπο τροποποίησης. Ακόµα, σε ορισµένες περιπτώσεις, η τροποποίηση µιας θέσης είναι δυνατόν να ενεργοποιήσει ή να αναστείλει την τροποποίηση µιας άλλης θέσης. Όλες οι ιστόνες του νουκλεοσωµικού πυρήνα µπορούν να ακετυλιωθούν. Οι κυριότεροι στόχοι ακετυλίωσης είναι οι λυσίνες των Ν-τελικών ουρών των ιστονών Η3 και Η4. Η ακετυλίωση των ιστονών της χρωµατίνης συσχετίζεται µε την γονιδιακή έκφραση. Η συσχέτιση αυτή αρχικά διαπιστώθηκε από την παρατήρηση αυξηµένων επιπέδων ακετυλίωσης των ιστονών σε επικράτειες του γονιδιώµατος που περιέχουν µεταγραφόµενα γονίδια, καθώς και από την ευαισθησία της ακετυλιωµένης χρωµατίνης σε πέψη µε DNAαση Ι και (πιθανόν) µικροκοκκική νουκλεάση. Τέτοια φαινόµενα πιθανόν αφορούν την ακετυλίωση της ουράς των ιστονών που έχουν ενσωµατωθεί σε νουκλεοσώµατα. Είναι γνωστό σήµερα ότι η ακετυλίωση των ιστονών είναι συνηθισµένη σε νουκλεοσώµατα που βρίσκονται σε περιοχές υποκινητών ενεργών γονιδίων. 1.5 Η ακετυλίωση των ιστονών Η ακετυλίωση είναι αντιστρεπτή διαδικασία. Κάθε κατεύθυνση της αντίδρασης καταλύεται από διαφορετικό ειδικό τύπο ενζύµων. Τα ένζυµα που ακετυλιώνουν τις ιστόνες ονοµάζονται ακετυλάσες (acetylaces) ή ακετυλοτρανσφεράσες των ιστονών ή HAT (Histone Acetyltransferases). Οι ακετυλοµάδες αφαιρούνται από τις αποακετυλάσες των ιστονών HDAC ή (Histone Deacetylases). Υπάρχουν δύο οµάδες ενζύµων HAΤ: στην οµάδα Α ανήκουν εκείνα που ενέχονται στη µεταγραφή ενώ στην οµάδα Β εκείνα που ενέχονται στην συναρµολόγηση των νουκλεοσωµάτων. ύο καταστολείς ενζύµων φάνηκαν ιδιαίτερα χρήσιµοι για την ανάλυση της ακετυλίωσης των ιστονών. Η τριχοστατίνη και το βουτυρικό οξύ καταστέλλουν τις αποακετυλάσες των ιστονών και προκαλούν τη συσσώρευση ακετυλιωµένων νουκλεοσωµάτων. Οι συνέπειες τις επίδρασης αυτών των καταστολέων υποστηρίζουν τη γενική άποψη ότι η ακετυλίωση σχετίζεται µε τη γονιδιακή έκφραση. Πράγµατι, η ικανότητα του βουτυρικού οξέος να προκαλεί αλλαγές στη

20 13 χρωµατίνη, παρόµοιες µε εκείνες που παρατηρούνται κατά τη γονιδιακή ενεργοποίηση, υπήρξε µια από τις πρώτες ενδείξεις για τη σχέση ανάµεσα στην ακετυλίωση και στη µεταγραφική ενεργότητα των γονιδίων. Ο χαρακτηρισµός των ακετυλοτρασφερασών και των αποακετυλασών, καθώς και του ρόλου τους στη συγκρότηση συµπλόκων µε άλλες πρωτεΐνες που ενέχονται σε ειδικούς µηχανισµούς ενεργοποίησης και καταστολής έδωσαν µεγάλη ώθηση στην ανάλυση του ρόλου της ακετυλίωσης των ιστονών. Η ανακάλυψη ότι οι HAT δεν είναι ένζυµα που σχετίζονται αποκλειστικά µε τη χρωµατίνη, άλλα ότι αποτελούν ενεργότητα ορισµένων ήδη γνωστών ενεργοποιητών της µεταγραφής, οδήγησε σε ουσιαστική αλλαγή της αντίληψής µας για την ακετυλίωση των ιστονών. Ένα γενικό χαρακτηριστικό των HAT είναι η ιδιότητά τους να ενσωµατώνονται σε µεγάλα σύµπλοκα. Τυπικά, το σύµπλοκο περιλαµβάνει µια ή περισσότερες υποµονάδες στόχευσης, οι οποίες αναγνωρίζουν τις θέσεις πρόσδεσης στο DNA προσδιορίζοντας τους στόχους της HAT. Το σύµπλοκο περιέχει επίσης υποµονάδες που τροποποιούν τη δοµή της χρωµατίνης ή επιδρούν άµεσα στη µεταγραφή. Πιθανότατα, η ακετυλίωση αποτελεί απαραίτητη προϋπόθεση προκειµένου να δράσουν ορισµένες τουλάχιστον από αυτές τις υποµονάδες του συµπλόκου. Η αποακετυλίωση, που καταλύεται από κάποια HDAC, µπορεί να πραγµατοποιείται µε παρόµοιο τρόπο. Η απουσία ακετυλίωσης από τις ιστόνες αποτελεί χαρακτηριστικό γνώρισµα της ετεροχρωµατίνης. Αυτό ισχύει τόσο για την ιδιοστατική ετεροχρωµατίνη, η οποία συνήθως καταλαµβάνει τις περιοχές των κεντροµέρων και τελοµερών, όσο και για την εναλλακτική ετεροχρωµατίνη, δηλαδή τις περιοχές εκείνες του γονιδιώµατος που είναι µεταγραφικά απενεργοποιηµένες σε ένα κύτταρο, αλλά µπορεί να είναι ενεργές σε ένα άλλο. Τυπικά, στην ετεροχρωµατίνη, οι Ν-τελικές ουρές των ιστονών Η3 και Η4 δεν είναι ακετυλιωµένες. Έχει αναγνωριστεί ένας αριθµός HDACs στα θηλαστικά, οι οποίες έχουν κατηγοριοποιηθεί σε 3 κλάσεις µε βάσει την οµοιότητά τους σε ένζυµα της ζύµης. Η κλάση Ι των HDACs στα θηλαστικά περιλαµβάνει τις HDAC1-3, 8 και πιθανότατα την 11. Αυτή η κλάση είναι παρόµοια µε την Rpd3 της ζύµης. Η κλάση ΙΙ των HDACs (HDAC4-7, 9 και 10) είναι περισσότερο κοντά στο ένζυµο της ζύµης Hda1. Όλα τα γνωστά µέλη των κλάσεων Ι και ΙΙ είναι ευαίσθητα στην αναστολή από την τριχοστατίνη Α σε ποικίλο βαθµό. Η αποακετυλίωση των ιστονών πιστεύεται ότι προάγει τη µεταγραφική καταστολή µε το να προωθεί τη δηµιουργία µιας συµπυκνωµένης µορφής της χρωµατίνης και έτσι καθιστώντας τα γονίδια λιγότερο προσβάσιµα σε µεταγραφικούς ενεργοποιητές και/ή στη γενική µεταγραφική συσκευή. Επιπλέον, η

21 14 αποακετυλίωση των ιστονών που είναι ευαίσθητη στην τριχοστατίνη Α απαιτείται για τα αρχικά στάδια του σχηµατισµού της ετεροχρωµατίνης οδηγώντας στη γονιδιακή αποσιώπηση. Τα σύµπλοκα HDACs επιστρατεύονται στην περιοχή των νουκλεοσωµάτων µέσω ειδικών αλληλεπιδράσεων µε DNA δεσµευόµενες πρωτεΐνες καταστολείς (DNA binding repressor proteins), όπως είναι η Mad, η YY1, η Ume6, η REST/NRSF και ηbteb3 ή µε άλλους σχετικούς συγκαταστολείς όπως η N-CoR/SMRT και η Sin3A. (Thanaset Senawong et al., 2003) Μια τρίτη κλάση HDACs της οποίας τα µέλη είναι δοµικά και καταλυτικά διακριτά από τις κλάσεις Ι και ΙΙ αντιπροσωπεύεται από την Sir-2-like πρωτεΐνη. Η Sir 2 της ζύµης και τα οµόλογά της στα θηλαστικά είναι αποακετυλάσες εξαρτώµενες από το NAD+ (NAD+ dependent deacetylases), χαρακτηριστικό που τις διακρίνει από τις αποακετυλάσες των κλάσεων Ι και ΙΙ. Μέχρι σήµερα, έχουν αποµονωθεί 7 ανθρώπινα οµόλογα της κλάσεις ΙΙΙ των αποακετυλασών, γνωστές ως Sirtuins (SIRT1-7). Με βάση την πρωτεϊνική οµολογία, η SIRT1 και η ορθόλογή της στον ποντικό Sir2α είναι τα κοντινότερα οµόλογα στην Sir2 της ζύµης. Αν και η εξειδίκευση ως προς το υπόστρωµα των Sirtuins στα θηλαστικά δεν έχει ακόµα µελετηθεί αυστηρά, η Sirt2α του ποντικού έχει δειχθεί ότι αποακετυλιώνει τη λυσίνη 9 και 14 της ιστόνης Η3 και τη λυσίνη 16 της Η4 σε συνθετικά ακετυλιωµένα πεπτίδια. 2. Η υποοικογένεια των COUP-TF υποδοχέων Οι COUP-TFs (Chicken Ovalbumin Upstream Promoter Transcription Factors) ανήκουν στην υποοικογένεια των ορφανών υποδοχέων δεδοµένου ότι δεν έχει βρεθεί µέχρι στιγµής κάποιο πρόσδεµα να δένει σ αυτούς. Πήραν το όνοµά τους από το στοιχείο COUP (στοιχείο του DNA) στον υποκινητή της ωαλβουµίνης της όρνιθας. Η αρχική αποµόνωσή τους έγινε από κύτταρα HeLa ως οµοδιµερή που είναι ικανά να προσδένονται σ αυτό το στοιχείο. Το στοιχείο αυτό είναι µια ατελή ευθεία επανάληψη της αλληλουχίας AGGTCA (απόσταση DR1 µεταξύ των επαναλήψεων). Οι COUP-TFs έχουν µελετηθεί και εντοπιστεί σε µια µεγάλη ποικιλία οργανισµών, γεγονός που επιβεβαιώνει τη βαθιά φυλογενετική συντηρητικότητά τους. Από τον άνθρωπο µέχρι το βάτραχο και τον αχινό οι COUP-TFs φαίνεται να εµπλέκονται σε µια ποικιλία λειτουργιών και ρυθµίσεων. Στον άνθρωπο έχουν βρεθεί δύο τέτοια γονίδια (h COUP-TF I, II), στο βάτραχο Xenopus laevis τρία (X COUP-TFI, II/B, III/A), στη Drosophila ένα, το seven up (SVP), στην όρνιθα ένα (c COUP-TFII), στον ποντικό δύο (m COUP-TFI, II), στο χάµστερ και τον αρουραίο από ένα (hm COUP-TFI και r COUP-TFI αντιστοίχως), στο ψάρι zebrafish

22 15 τρία (svp 44, svp 46, svp 40) και στον αχινό S. purpuratus ένα (Sp COUPTF). Οι περιοχές πρόσδεσης στο DNA (DBDs) των COUP-TFs παρουσιάζουν οµολογία αµινοξέων της τάξεως του 94%. 2.1 Τα στοιχεία απόκρισης των COUP-TF Οι COUP-TFs προσδένουν αδιακρίτως µια µεγάλη ποικιλία στοιχείων απόκρισης, σε ποικίλους συνδυασµούς του βασικού µοτίβου PuGGTCA µε αποτέλεσµα την αναστολή της µεταγραφικής δραστηριότητας υποδοχέων που επίσης αναγνωρίζουν τα στοιχεία αυτά (υποδοχείς trans ρετινοϊκών οξέων RAR, του 9-cis ρετινοϊκού οξέος RXR-, των θυρεοειδικών ορµονών TR-, της βιταµίνης D3, του ηπατικού πυρηνικού παράγοντα (HNF-4). Βιοχηµικές αναλύσεις εµφανίζουν τους COUP-TFs σε διαλύµατα µε τη µορφή διµερών να συνδέονται µε µεγάλη συγγένεια σε οµόρροπη επανάληψη της αλληλουχίας PuGGTCA. Τα νουκλεοτίδια ανάµεσα στα δύο µισά του στοιχείου απόκρισης ποικίλουν και ανάλογα µε τον αριθµό τους διακρίνουµε τα στοιχεία απόκρισης σε DR1 αν είναι ένα το νουκλεοτίδιο, DR2 αν είναι δύο, DR3 αν είναι τρία και ούτο καθ εξής. Πιο ισχυρή πρόσδεση παρατηρείται για το DR1 στοιχείο µε την ισχύ να µειώνεται για τα υπόλοιπα στοιχεία κατά το πρότυπο: DR1> DR6>DR4>DR8>DR11. Πρόσδεση πραγµατοποιείται και σε παλίνδροµες επαναλήψεις της συναινετικής αλληλουχίας µε µικρότερη όµως συγγένεια από τις οµόρροπες. Οι COUP-TFs συνδέονται στα παραπάνω στοιχεία απόκρισης άλλοτε ως οµοδιµερή και άλλοτε ως ετεροδιµερή µε τον RXR και άλλους πυρηνικούς υποδοχείς. Η πιο κοινή περιοχή πρόσδεσης των COUP-TFs σε φυσικούς υποκινητές είναι η DR1 οµόρροπη επανάληψη της αλληλουχίας AGGTCA. Η ικανότητα των COUP-TFs να προσδένονται ως διµερή σε µία µεγάλη ποικιλία στοιχείων απόκρισης παρέχει τις πρώτες ενδείξεις για την ανάπτυξη από µέρους τους µιας ποικιλίας διαµορφώσεων που θα τους επιτρέψουν αρχικά να αναγνωρίσουν αλληλουχίες, ακολούθως να προσδεθούν σε αυτές και τελικά να ρυθµίσουν την έκφραση των αντίστοιχων γονιδίων τους. Αυτό έχει σηµαντικές βιολογικές προεκτάσεις δεδοµένου ότι σε πολλές από αυτές τις αλληλουχίες προσδένονται και άλλοι υποδοχείς των στεροειδών /θυρεοειδών ορµονών που τελικά ανταγωνίζονται τους COUP-TFs στην πρόσδεση (πχ. στα DR2 και DR5 προσδένονται τόσο οι COUP-TFs όσο και οι υποδοχείς του ρετινοΐκού οξέως).

23 16 3. Οι πρωτεΐνες COUP-TF interactive Proteins 1 και η 2 (CTIP1 και CTIP2) Εικόνα 7: Πρωτείνες δακτύλου ψευδαργύρου C2H2 ύο καινούριες πρωτεΐνες C2H2 δακτύλου ψευδαργύρου που εκφράζονται σε µεγάλο βαθµό στον εγκέφαλο, η CTIP1 και η CTIP2, αποµονώθηκαν και βρέθηκαν να αλληλεπιδρούν µε όλα τα µέλη της οικογένειας των COUP-TF. Η αλληλεπίδραση της CTIP1 και ARP1 µελετήθηκε λεπτοµερώς και η CTIP1 βρέθηκε να φιλοξενεί δύο ανεξάρτητες από την ARP1 περιοχές, τις ID1 και ID2, ενώ η περιοχή AF- 2 του ARP1 απαιτείται για την αλληλεπίδραση µε την CTIP1. (Dorina Avram et al., 1999) Οι COUP-TFI, ARP1/COUP-TFII και Ear2/COUP-TFIII έχουν τοποθετηθεί στην ίδια οικογένεια ορφανών πυρηνικών υποδοχέων βάσει οµολογιών στην ακολουθία τους, εξελικτικές αναλύσεις και την κοινή ικανότητά τους να καταστέλλουν τη µεταγραφή γονιδίων στόχων (εξαρτώµενη από πρόσδεµα) που διαµεσολαβείται από άλλους πυρηνικούς υποδοχείς όπως το ρετινοϊκό οξύ, οι θυροειδικές ορµόνες, τα οιστρογόνα και οι υποδοχείς της βιταµίνη D3 καθώς και ο υποδοχέας PRAR α (peroxisome proliferator-activated receptor α). Οι COUP-TFs διαδραµατίζουν σηµαντικό ρόλο στο σχέδιο ανάπτυξης του νευρικού συστήµατος του αναπτυσσόµενου εµβρύου του Xenopus και της Drosophila. Η εξάλειψη του γονιδίου του COUP-TFΙ στον ποντικό έχει ως αποτέλεσµα την προβληµατική αξονική καθοδήγηση και ανωµαλίες στη δηµιουργία των δενδριτών. Τέτοιες ατέλειες του γλωσσοφαρυγγικού γαγγλίου και του κρανιακού νεύρου ΙΧ φαίνεται ότι σχετίζονται άµεσα µε την πρόωρη θνησιµότητα των ζώων που στερούνται του συγκεκριµένου γονιδίου. Ο ARP1 εκφράζεται στα µεσεγχυµατικά κύτταρα κατά τη διάρκεια της οργανογένεσης και πιστεύεται ότι παίζουν σηµαντικό ρόλο στη

24 17 µεταβίβαση σήµατος στα µεσεγχυµατικά-ενδοθηλιακά κύτταρα. Η εξάλειψη του γονιδίου ARP1 στον ποντικό έχει ως συνέπεια τον εµβρυϊκό θάνατο κατά τη δέκατη ηµέρα την εµβρυογένεσης, πιθανότατα λόγω ατελειών στην αγγειογένεση και την εµβρυική ανάπτυξη της καρδιάς. Η λειτουργία του απανταχού εκφραζόµενου γονιδίου Ear2 κατά τη διάρκεια της εµβρυικής ανάπτυξης και στον ενήλικο οργανισµό δεν είναι γνωστή. Ωστόσο, ο ετεροδιµερισµός του Ear2 τόσο µε τον COUP-TFΙ όσο και µε τον ARP1 σε διαλύµατα σε διάφορα άµεσα επαναλαµβανόµενα DNA στοιχεία απόκρισης, υπονοεί ότι µπορεί να εµπλέκεται στο σηµατοδοτικό µονοπάτι τόσο του ARP1 όσο και του COUP-TFI. (Dorina Avram et al., 1999) Τα µέλη της οικογένειας COUP-TF γενικά θεωρούνται καταστολείς της µεταγραφής και πολυάριθµοι µηχανισµοί έχουν προταθεί να υποστηρίζουν αυτή τους τη δράση. Ανάµεσα σε αυτούς, η ενεργή µεταγραφική καταστολή που διαµεσολαβείται από τα µέλη της οικογένειας COUP-TF µπορεί να εµπλέκει την επιστράτευση πυρηνικών συγκαταστολέων ( Nuclear receptor co-repressor-ncor) και/ή κάποιο παράγοντα αποσιώπησης του υποδοχέα του ρετινοϊκού οξέως και των θυρεοειδικών ορµονών (SMRT) µε έναν τρόπο παρόµοιο αυτού άλλων χωρίς πρόσδεµα πυρηνικών υποδοχέων. Τα NCoR και SMRT είναι συστατικά ενός µεγαλύτερου κατασταλτικού συµπλέγµατος που ελάχιστα περιλαµβάνει το msin3a/b και την αποακετυλίωση που είναι ευαίσθητη στην τριχοστατίνη. Η αποακετυλίωση των ιστονών έχει προταθεί για την εξήγηση της µεταγραφικής καταστολής που διαµεσολαβείται από πυρηνικούς υποδοχείς και πολυάριθµες άλλες τάξεις µεταγραφικών καταστολέων. Με σκοπό να αποσαφηνιστεί ο µηχανισµός καταστολής των µελών της οικογένειας COUP-TF, χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος yeast two-hybrid για να αναγνωριστούν πρωτεΐνες που εκφράζονται επίσης στον εγκέφαλο και ταυτόχρονα αλληλεπιδρούν άµεσα µε τον ARP1. Η πρωτεΐνη CTIP1, ένα µέλος της καινούργιας οικογένειας των C2H2 πρωτεϊνών δακτύλου ψευδαργύρου, που αποµονώθηκε σαν µία πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά άµεσα µε τον ARP1 περιλαµβάνει αυτόνοµη περιοχή µεταγραφικής καταστολής και πιθανόν να εµπλέκεται στη µεταγραφική καταστολή που διαµεσολαβείται από τον ARP1, η οποία είναι ανεξάρτητη από την ευαίσθητη στην τριχοστατίνη Α αποακετυλίωση των ιστονών. Τόσο η CTIP1 όσο και η CTIP2 εκφράζονται σε µεγάλο βαθµό στον εγκέφαλο µια περιοχή για την οποία είναι γνωστό ότι εκφράζονται µέλη της οικογένειας COUP-TF, υπονοώντας ότι αυτή η καινούρια οικογένεια των πρωτεϊνών C2H2 δακτύλου ψευδαργύρου πιθανόν να εµπλέκονται στο σηµατοδοτικό µονοπάτι των COUP-TFs. (Dorina Avram et al., 1999)

25 18 Chicken ovalbumin upstream promoter transcription factor (COUP- TF) interacting proteins 1 και 2 (CTIP1/Evi9/B cell leukemia (bcl) 11a και CTIP2/Bcl 11b) είναι στενά συγγενικές πρωτεΐνες δακτύλου ψευδαργύρου, οι οποίες εκφράζονται ευρέως στον εγκέφαλο και στα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήµατος και σχετίζονται µε κακοήθειες του τελευταίου. Έχει βρεθεί επίσης ότι εκφράζεται στη στοιβάδα V του εγκεφαλικού φλοιού και διαδραµατίζει σηµαντικό ρόλο στην ανάπτυξη συνδέσεων µεταξύ κατερχόµενων κινητικών νευρώνων και του νωτιαίου µυελού. Οι πρωτεΐνες CTIPs καταστέλλουν τη µεταγραφή όταν προσδένονται σ έναν υποκινητή µέσω αλληλεπίδρασης µε µια πρωτεΐνη που προσδένεται στο DNA, όπως ο ARP1 ένα µέλος της οικογένειας των COUP-TFs ορφανών µεταγραφικών παραγόντων. Χρησιµοποιήθηκε µια διαδικασία επιλογής για να αποµονωθούν υψηλής συγγένειας DNA θέσεις πρόσδεσης για την πρωτεΐνη CTIP1. Ο πυρήνας της θέσης δέσµευσης στο DNA που αναγνωρίστηκε µε τη συγκεκριµένη µελέτη, 5 -GGCCGG-3, σχετίζεται στενά µε το τυπικό πλούσιο σε GC στοιχείο απόκρισης και σε αυτό δεσµεύτηκε ένα σύµπλεγµα πρωτεινών CTIP1 in vitro. Επιπλέον, τόσο η CTIP1 όσο και η CTIP2 κατάφεραν να καταστείλουν τη µεταγραφή ενός γονιδίου αναφοράς που έφερε ένα πολυµερές του στοιχείου απόκρισης και αυτή η καταστολή δεν ανεστράφη ούτε από την τριχοστατίνη Α (έναν αναστολέα των αποακετυλασών της των κλάσεων Ι και ΙΙ) ούτε διεγέρθηκε από την παρουσία µελών της οικογένειας COUP-TF. Η µεταγραφική καταστολή των που διαµεσολαβείται από τον CTIP1 και τον CTIP2 βρέθηκε ότι δεν επηρεάζεται από την αναστροφή από την τριχοστατίνη Α, υπονοώντας ότι άλλοι µηχανισµοί και όχι η επιστράτευση των ευαίσθητων στην τριχοστατίνη Α αποακετυλασών των κλάσεων Ι και ΙΙ ίσως να εµπλέκονται στην καταστολή της µεταγραφής που διαµεσολαβείται από τις CTIPs. (Mark Leid et al., 2004) Αυτά τα αποτελέσµατα καταδεικνύουν ότι η πρωτεΐνη CTIP1 είναι µια πρωτεΐνη που δεσµεύεται σε συγκεκριµένη αλληλουχία στο DNA και ένας µεταγραφικός καταστολέας ικανός να λειτουργήσει ανεξάρτητα από τα µέλη της οικογένειας COUP-TF. Αυτές οι ανακαλύψεις πιθανότατα σχετίζονται µε τη φυσιολογία και τη παθοφυσιολογία των πρωτεϊνών CTIPς στα κύτταρα τα οποία δεν εκφράζουν µέλη της οικογένειας COUP-TF, όπως τα αιµοποιητικά κύτταρα και τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήµατος. Οι πρωτεΐνες δακτύλου ψευδαργύρου C2H2 συνιστούν µια τεράστια οικογένεια µεταγραφικών παραγόντων στα ευκαρυωτικά και διαδραµατίζουν σηµαντικούς ρόλους στην ανάπτυξη τόσο των ζώων όσο και των φυτών. Η ολοκλήρωση της αλληλούχησης του γονιδιώµατος του Caenorhabditis elegans αποκάλυψε 157 ανοιχτά αναγνωστικά πλαίσια που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες δακτύλου ψευδαργύρου C2H2, ενώ

26 19 στον Saccharomyces cerevisiae αναγνωρίστηκαν περίπου 40. Το γονιδίωµα της Drosophila κωδικοποιεί πάνω από 400 πρωτεΐνες δακτύλου ψευδαργύρου C2H2 ενώ σχεδόν 900 γονίδια είναι παρόντα στον άνθρωπο. Πολλές από αυτές τις πρωτεΐνες, στον άνθρωπο, λειτουργούν ως σηµαντικότατοι µεταγραφικοί ρυθµιστές, όπως η οικογένεια πρωτεϊνών Ikaros, οι οποίες εµπλέκονται στη διαφοροποίηση αρχεγόνων κυττάρων προς λεµφοκύτταρα. Οι C2H2 πρωτεΐνες δακτύλου ψευδαργύρου είναι χαρακτηριστικές ρυθµιστικές πρωτεΐνες που συγκροτούνται από C2H2 µοτίβα δακτύλου ψευδαργύρου, τα οποία γενικά παρουσιάζουν ικανότητα δέσµευσης σε συγκεκριµένη αλληλουχία στο DNA, καθώς και µεταγραφικές ρυθµιστικές περιοχές. οµικά, το µοτίβο δακτύλου ψευδαργύρου τύπου C2H2 περιλαµβάνει β-στροφή ακολουθούµενη από µια α- έλικα η οποία αναδιπλώνεται γύρω από ένα µοναδικό ιόν ψευδαργύρου. Η αναγνώριση συγκεκριµένης αλληλουχίας στο DNA πραγµατοποιείται πρωταρχικά µέσω αλληλεπιδράσεων µεταξύ ποικίλων αµινοξέων µέσα και γύρω από την α- έλικα και νουκλεοτιδίων µέσα στη µεγάλη αύλακα του DNA. Αν και έχει διαπιστωθεί η προτίµηση µεταξύ συγκεκριµένων πλευρικών αλυσίδων αµινοξέων για επαφές µε συγκεκριµένες βάσεις, οι δοµικές λεπτοµέρειες είναι περίπλοκες και δεν έχει αποσαφηνιστεί ακόµα ποιος τελικά είναι ο κώδικας αναγνώρισης. (Dorina Avram et al., 2002) Η µη σωστή έκφραση των γονιδίων ctip1 και ctip2 εµπλέκεται σε διάφορες ασθένειες των θηλαστικών πολλαπλασιαστικού χαρακτήρα. Για παράδειγµα, η περιοχή CTIP1/Evi9 στο γονιδίωµα του ποντικού αναγνωρίστηκε σαν µια θέση ενσωµάτωσης ρετροιού στην ΜΧΗ2 µυελογενή λευχαιµία, ενώ ο ανθρώπινος γενωµικός τόπος της CTIP1 (χρωµόσωµα 2p13) έχει βρεθεί ότι µετατοπίζεται σε λεµφώµατα και σε χρόνιες β λεµφοκυτταρικές λευχαιµίες. Επιπλέον, το γονίδιο της CTIP1 βρίσκεται µέσα σε µια χρωµοσωµατική περιοχή η οποία συχνά µεταβάλλεται και σε άλλες ανθρώπινες νεοπλασίες. Η ανθρώπινη γενωµική περιοχή της CTIP2 (χρωµόσωµα 14q32) σχετίζεται µε µια µετατόπιση, η οποία φαίνεται να έχει ως αποτέλεσµα την εµφάνιση οξείας Τ λεµφοβλαστικής λευχαιµίας. Αυτές οι ανακαλύψεις προτείνουν ότι ανωµαλίες στην έκφραση των γονιδίων ctips στους προδρόµους των αιµοποιητικών κυττάρων έχει ως συνέπεια το µετασχηµατισµό των κυττάρων αυτών και την εµφάνιση κακοήθους φαινοτύπου. Ωστόσο, η µοριακή βάση του µετασχηµατισµού αυτού δεν είναι γνωστή. Η αλληλουχία του στοιχείου απόκρισης του µεταγραφικού παράγοντα CTIP συνδέεται στενά µε το τυπικό GC στοιχείο απόκρισης το οποίο σχετίζεται µε τη µεταγραφική έναρξη στους υποκινητές που στερούνται κουτί ΤΑΤΑ και επίσης µε τη ρύθµιση της γονιδιακής έκφρασης που µεσολαβείται από διάφορους µεταγραφικούς παράγοντες όπως οι πρωτεΐνες της οικογένειας των Sp1. Το στοιχείο απόκρισης

27 20 λοιπόν για το CTIP1 ίσως λοιπόν να λειτουργεί σαν µια θέση δέσµευσης στην οποία προσδένονται αδιάκριτα µία πληθώρα µεταγραφικών ρυθµιστικών πρωτεϊνών. Η µεταγραφική καταστολή που διαµεσολαβείται από τον CTIP1 µέσω του στοιχείου απόκρισης δεν φαίνεται να εµπλέκει την επιστράτευση των ευαίσθητων στην τριχοστατίνη Α αποακετυλάσες της κλάσης Ι και ΙΙ, όπως συµβαίνει και στην περίπτωση της δηµιουργίας συµπλόκων µε τον ARP1. Αυτά τα δεδοµένα προτείνουν εναλλακτικούς για την εξήγηση της διαµεσολαβούµενης από τις CTIPς µεταγραφική καταστολή, όπως την επιστράτευση αποακετυλασών της οικογένειας Sir2 (Silent information regulator 2) που δεν είναι ευαίσθητες στην τριχοστατίνη Α και εξαρτώνται από το NAD και/ή σε συνδυασµό µε την ετεροχρωµατίνη. (Thanaset Senawong et al., 2003) Τα αποτελέσµατα των παραπάνω µελετών έδειξαν ότι τόσο η πρωτεΐνη CTIP1 όσο και η πρωτεΐνη CTIP2 είναι πρωτεΐνες που δεσµεύονται σε συγκεκριµένη αλληλουχία το DNA και ότι µπορούν να δράσουν ανεξάρτητα από τα µέλη της οικογένειας των COUP-TFs. 3.1 Η εµπλοκή της αποακετυλάσης SIRT1 στη µεταγραφική καταστολή που διαµεσολαβείται από τον παράγοντα CTIP2. Τόσο η CTIP1όσο και η CTIP2 εκφράζονται στα αιµοποιητικά κύτταρα των λεµφικών οργάνων, γεγονός πολύ σηµαντικό αφού στα κύτταρα αυτά δεν παρατηρούνται µετάγραφα της COUP-TF οικογένειας. Έτσι, είναι πιθανόν ότι οι CTIPs να δρουν είτε µε άλλους πυρηνικούς υποδοχείς στα κύτταρα λεµφικής προέλευσης ή να δρουν ως ανεξάρτητοι µεταγραφικοί παράγοντες σε αυτά. Το τελευταίο φαίνεται να είναι αλήθεια αφού οι CTIP1 και 2 έχει δειχθεί ότι καταστέλλουν την έκφραση ενός γονιδίου αναφοράς µέσω άµεσης δέσµευσης σε ένα πρόσφατα αναγνωρισµένο στοιχείο απόκρισης µε την εξής ακολουθία νουκλεοτιδίων 5 - GGCCGGAGG -3. Αυτή η καταστολή παρατηρήθηκε απουσία COUP-TF πρωτεϊνών και ήταν ανεξάρτητη (insensitive) στην αναστροφή από την τριχοστατίνη Α (TSA). Thanaset Senawong et al., 2003) Αυτά τα δεδοµένα υποδεικνύουν ότι οι CTIPs µπορούν να ρυθµίζουν τη µεταγραφή ανεξάρτητα από τις COUP-TF πρωτεΐνες και τις TSA-ευαίσθητες αποακετυλάσες σε κάποιους κυτταρικούς τύπους και/ή υποκινητές. Αν και οι CTIPs καταστέλλουν τη µεταγραφή µε έναν τρόπο που δεν επηρεάζεται από την τριχοστατίνη Α, βρέθηκε ότι παροδική διαµόλυνση µε την CTIP2 είχε ως αποτέλεσµα την αποακετυλίωση της ιστόνης Η3 και/ή της Η4 που σχετίζονταν µε την περιοχή του υποκινητή του γονιδίου στόχου. Ακολούθως, βρέθηκε ότι το νικοτιναµίδιο

28 21 αντέστρεψε τη διαµεσολαβούµενη από την CTIP2 µεταγραφική καταστολή και την αποακετυλίωση των ιστονών Η3/Η4 που σχετίζονταν µε τον υποκινητή στα κύτταρα που διαµολύνθηκαν µε την πρωτεΐνη CTIP2. Αυτές οι ανακαλύψεις µας οδήγησαν στο να διερευνήσουµε την πιθανότητα ότι µια κλάση ΙΙΙ αποακετυλασών µπορεί να εµπλέκεται στη διαµεσολαβούµενη από τη CTIP2 µεταγραφική καταστολή. Η CTIP2 και η αποακετυλάση της κλάσης ΙΙΙ SIRT1 συν-ανοσοκατακριµνίστηκαν από εκχυλίσµατα κυττάρων (που είτε διαµολύνθηκαν είτε συνδιαµολύνθηκαν είτε τέλος δεν είχαν διαµολυνθεί) και οι δύο πρωτεΐνες βρέθηκε ότι αλληλεπιδρούν άµεσα in vitro. Επιπλέον, η SIRT1 πιθανότατα προήγαγε τόσο τη µεταγραφική καταστολή όσο και την αποκετυλίωση των ιστονών Η3/Η4 σε κύτταρα που είχαν διαµολυνθεί µε την πρωτεΐνη CTIP2. Αυτά τα δεδοµένα προτείνουν ένα ρόλο για την εξαρτώµενη από το NAD+ αποακετυλάση των ιστονών SIRT1 στη µεταγραφική καταστολή που διαµεσολαβείται από την CTIP2 στα κύτταρα των θηλαστικών. (Thanaset Senawong et al., 2003) 3.2 Προτεινόµενο µοντέλο δράσης των πρωτεϊνών CTIP Η συνδυαστική τροποποίηση των ιστονών, η οποία περιλαµβάνει την ακετυλίωση, τη µεθυλίωση, τη φωσφορυλίωση και την ουµπικυτιλίωση έχει προταθεί ότι αποτελεί τη βάση του µηχανισµού ρύθµισης της µεταγραφής από τη ζύµη µέχρι τον άνθρωπο. Γενικά, η ακετυλίωση, η φωσφορυλίωση και η ουµπικιτυλίωση των ιστονών πιστεύεται ότι προάγει την αποσυµπύκνωση των ιστονών και έχει θεωρηθεί ως ο τρόπος δράσης των µεταγραφικών ενεργοποιητών. Η συνέπεια της µεθυλίωσης των ιστονών στη µεταγραφή, συµπεριλαµβάνοντας τη µονο-, δι- και τριµεθυλίωση των κατάλοιπων της λυσίνης που εντοπίζονται κυρίως στην ουρά των ιστονών Η3 και Η4, είναι περισσότερο πολύπλοκη και µπορεί είτε να την ενεργοποιήσει είτε να την καταστείλει, µε έναν τρόπο εξαρτώµενο από το συγκεκριµένο πλαίσιο. Αντίθετα, πολλοί µεταγραφικού καταστολείς συµπεριλαµβανοµένων πυρηνικών υποδοχέων και άλλων οικογενειών µεταγραφικών παραγόντων έχει δειχθεί ότι επιστρατεύουν αποακετυλάσες ευαίσθητες στη δράση της τριχοστατίνης Α στην αντίστοιχη περιοχή της χρωµατίνης, έχοντας αυτό ως αποτέλεσµα τη συµπύκνωση της χρωµατίνης και τη µεταγραφική αποσιώπηση. Στις περισσότερες περιπτώσεις, οι αποακετυλάσες, που επιστρατεύονται στην περιοχή από µεταγραφικούς καταστολείς, έχει δειχθεί ότι ανήκουν κυρίως στη κλάση Ι και ΙΙ των αποακετυλασών. (Thanaset Senawong et al., 2003) Είχε προηγούµενα παρατηρηθεί ότι η πρωτεΐνη CTIP1, ένα µέλος µιας καινούριας οικογένειας πρωτεϊνών µε µοτίβο C2H2 δακτύλου

29 22 ψευδαργύρου C2H2, κατέστειλε τη µεταγραφή ενός γονιδίου αναφοράς µε έναν τρόπο ο οποίος ήταν ελάχιστα ευαίσθητος στην αντιστροφή από την τριχοστατίνη Α. Παρόµοια δεδοµένα ελήφθησαν για την πρωτεΐνη CTIP2. Ωστοσο, η διαµεσολαβούµενη από τη CTIP2 µεταγραφική καταστολή βρέθηκε να αναστέλλεται τουλάχιστον µερικώς από το νικοτιναµίδιο, έναν αναστολέα της κλάσης ΙΙΙ των εξαρτώµενων από το NAD+αποακετυλασών, όπως είναι η οικογένεια SIRT. Η πλούσια σε προλίνη περιοχή της CTIP2, η οποία περικλείει µια αυτόνοµη ενεργότητα µεταγραφικής καταστολής, βρέθηκε να αλληλεπιδρά µε την κεντρικά εντοπισµένη sirtuin οµόλογη περιοχή της SIRT1. Επειδή η sirtuin οµόλογη περιοχή εµφανίζει υψηλό βαθµό συντήρησης ανάµεσα σε όλες τις SIRT πρωτεΐνες είναι κατανοητό ότι και άλλα µέλη της οικογένειας sirtuin µπορούν επίσης να συµπεριφέρονται ως εναλλακτικά συνεργάτες που αλληλεπιδρούν µε την CTIP2. Αν αυτό είναι αλήθεια, θα µπορούσαµε να προβλέψουµε ότι άλλες SIRT πρωτεΐνες µπορεί να διαδραµατίζουν ένα ρόλο στην επαγόµενη από την CTIP2 µεταγραφική καταστολή, πιθανότατα σε διαφορετικούς κυτταρικούς πληθυσµούς ή σε διαφορετικούς υποδοχείς. Με παρόµοιο τρόπο η πλούσια σε προλίνη περιοχή της CTIP2 είναι επίσης παρούσα και σε υψηλό βαθµό διατηρηµένη στην CTIP1 και µπορεί πιθανότατα επίσης να αλληλεπιδρά µε τις πρωτεΐνες SIRT. Πράγµατι, έχουµε επίσης παρατηρήσει ότι η CTIP1 αλληλεπιδρά άµεσα µε την SIRT1 τόσο in vitro όσο και σε διαµολυνθέντα κύτταρα. (Thanaset Senawong et al., 2003) Άλλες C2H2 δακτύλου ψευδαργύρου πρωτεΐνες, όπως η πρωτεΐνη Kox1 (Kruppel-associated box-krab) έχει επίσης αναφερθεί ότι καταστέλλει τη µεταγραφή µε έναν τρόπο που δεν επηρεάζεται από την τριχοστατίνη Α. Η µεταγραφική καταστολή από τις KRAB πρωτεΐνες δακτύλου ψευδαργύρου απαιτούν αλληλεπίδραση µε την δεσµευτική πρωτεΐνη που διαθέτει KRAB περιοχή, την ΚΑΡ-1, η οποία µε τη σειρά της επιστρατεύει µέλη της οικογένειας ΗΡ1 (Heterochromatin protein 1) στην αντίστοιχη περιοχή. Αυτές οι ανακαλύψεις προτείνουν ένα ρόλο για τις πρωτεΐνες ΗΡ1 και το σχηµατισµό ετεροχρωµατίνης στη µεταγραφική καταστολή που διαµεσολαβείται από τα σύµπλοκα KRAB-KAP-1. Αν και καµία από αυτές τις µελέτες δεν απευθύνεται στον εν δυνάµει ρόλο της αποακετυλίωσης των ιστονών που είναι ανεπηρέαστη από την τριχοστατίνη Α και η οποία καταλύεται πιθανότατα από ένα µέλος της οικογένειας SIRT στη µεταγραφική καταστολή και στο σχηµατισµό της ετεροχρωµατίνης που διαµεσολαβείται από τα σύµπλοκα KRAB-KAP-1, η αποακετυλίωση των Η3-Κ9 απαιτείται στα αρχικά στάδια του σχηµατισµού της ετεροχρωµατίνης. Αυτό πιστεύεται ότι ακολουθείται από τη µεθυλίωση των Η3-Κ9 από το SUV39H, η οποία παρέχει µια επιφάνεια δέσµευσης για τις ΗΡ1 πρωτεΐνες οι οποίες δεσµεύονται και

30 23 αυτό-συναρµολογούνται προς ένα υπερµοριακό σύµπλοκο ετεροχρωµατίνης. Για το λόγο αυτό είναι ενδιαφέρον που προτείνεται εδώ επίσης ένας πιθανός ρόλος για τις ΗΡ1 πρωτεΐνες στη διαµεσολαβούµενη από την CTIP-µεταγραφική καταστολή. Σε αυτό το πλαίσιο, οι CTIPs µπορεί να δρουν επιστρατεύοντας την SIRT1 πρωτεΐνη (ή άλλα µέλη της οικογένειας SIRT1) σε ένα συγκεκριµένο γενωµικό τόπο είτε µέσω άµεσης πρόσδεσης στο DNA ή µέσω πρόσδεσης σε ένα µέλος της οικογένειας COUP-TF. Από τη στιγµή που θα επιστρατευτούν στην περιοχή, οι SIRT πρωτεΐνες µπορούν να καταλύσουν την αποακετυλίωση των ιστονών που εν τέλει οδηγεί στη δέσµευση των ΗΡ1 πρωτεϊνών, στο σχηµατισµό ετροχρωµατίνης και στη γονιδιακή αποσιώπηση. Η επιβεβαίωση αυτού του µοντέλου θα απαιτούσε την αναγνώριση όλων των πρωτεϊνικών συστατικών που συγκροτούν το σύµπλοκο καταστολής CTIP που δεσµεύεται στην περιοχή του υποκινητή ενός γονιδίου στόχου. (Thanaset Senawong et al., 2003) Συνοψίζοντας, τα συγκεκριµένα αποτελέσµατα προτείνουν ότι η διαµεσολαβούµενη από την CTIP2 µεταγραφική καταστολή εµπλέκει την επιστράτευση την πρωτεΐνης SIRT1 στην περιοχή, όπου η ανεπηρέαστη από την τριχοστατίνη Α αποακετυλάση (και εξαρτώµενη από το NAD+) καταλύει την αποακετυλίωση των σχετιζόµενων µε τον υποκινητή ιστονών Η3 και Η4. Μία συνέπεια αυτής της αποακετυλίωσης µπορεί απλά να είναι η χρωµατινική συµπύκνωση και η βραχύπνοη γονιδιακή αποσιώπηση. Εναλλακτικά, αυτά τα γεγονότα αποακετυλίωσης µπορούν να έχουν ως συνέπεια το σχηµατισµό ετεροχρωµατίνης, συµβάλλοντας σε ένα πιο µόνιµο σχέδιο αποσιώπησης. Σε κάθε περίπτωση, η επιστράτευση της πρωτεΐνης SIRT1 στην περιοχή του DNA από την CTIP2 αναµένεται να οδηγεί στη γονιδιακή αποσιώπηση. Αυτό το χαρακτηριστικό µπορεί να µας βοηθήσει να στην αναγνώριση και το χαρακτηρισµό των γονιδίων στόχων που βρίσκονται κάτω από τον έλεγχο των CTIP πρωτεϊνών σε κύτταρα του αιµοποιητικού συστήµατος και του αναπτυσσόµενου κεντρικού νευρικού συστήµατος. 4. Εχινόδερµα και ο ρόλος του COUP-TF 4.1 Συνοµοταξία Εχινόδερµων Τα εχινόδερµα αποτελούν συνοµοταξία µε χαρακτηριστική διαµόρφωση. Ο σκελετός τους, αποτελούµενος από συνδεδεµένες πλάκες και άκανθες ανθρακικού ασβεστίου, περιβάλλεται από επιδερµίδα και καλείται ενδοσκελετός. Άλλοτε οι πλάκες είναι ισχυρά συνδεδεµένες και άλλοτε χαλαρά (π,.χ. αστερίας). Τέλος µπορεί να ναι µικροσκοπικές (ολοθουροειδή).

31 24 Μεταξύ των σκελετικών πλακών προβάλλουν οι δοµές που χρησιµεύουν για την κίνηση, την αναπνοή και την άµυνα του οργανισµού, όπως ποδολαβίδες, σωληνοπόδια κ.ά. Παράλληλα χαρακτηριστικό είναι το αναπνευστικό σύστηµα χαρακτηριστικό υδροφορικό δοµηµένο από κανάλια που τροφοδοτούνται µε νερό και καταλήγουν στα σηµεία προσκόλλησης των εχινοδέρµων, τα πόδια. Πρόκειται για θαλάσσιους οργανισµούς (κανένας δε ζει στα γλυκά νερά ή στη στεριά), εντεροκοιλωµατικά ζώα, δευτεροστόµια µε χαρακτηριστική πεντακτινωτή συµµετρία (η οποία προκύπτει δευτερογενώς από µια περίοδο αµφίπλευρης συµµετρίας). Ταξινοµικά διακρίνεται σε πέντε κλάσεις αρτίγονων εχινόδερµων: Αστεροειδή, Κρινοειδή, Εχινοειδή, Οφοιουροειδή και Ολοθουροειδή. Η αναπαραγωγή τους γίνεται µε εξωτερική γονιµοποίηση, καθώς σπέρµα και αυγά ελευθερώνονται στο νερό κατά την περίοδο της αναπαραγωγής. 4.2 Τα αναπτυξιακά στάδια του αχινού H διαδικασία της εµβρυογένεσης είναι πολύ καλά µελετηµένη στον αχινό. H γονιµοποίηση είναι εξωτερική και τα γονιµοποιηµένα αυγά στον P.lividus περνούν από το στάδιο του βλαστιδίου, του γαστριδίου και του πλουτέα σε διάστηµα δύο ηµερών σε θερµοκρασία 18 0 C. Κατόπιν, τα έµβρυα αναπτύσσονται σε νύµφες και µεταµορφώνονται σε νεαρούς αχινούς σε διάστηµα τεσσάρων περίπου εβδοµάδων από τη στιγµή της γονιµοποίησης (Davidson et al. 1982; Davidson 1986; Gilbert 1985). Άλλα είδη αχινού όπως ο Strongylocentrotus Purpuratus ολοκληρώνουν την ανάπτυξή τους µε αργότερο ρυθµό, ενώ ο Lytechinus variegatus µε γρηγορότερο ρυθµό µιας και ζει σε πιο ζεστά ύδατα. Η γονιµοποίηση στον αχινό είναι εξωτερική, έτσι οι γαµέτες ελευθερώνονται στο θαλάσσιο περιβάλλον όπου λαµβάνει χώρα η γονιµοποίηση. Τα σπερµατοζωάρια έλκονται χηµειοτακτικά από το ωάριο και τελικά ένα από αυτά καταφέρνει να το γονιµοποιήσει. Αµέσως µετά από την είσοδο του σπερµατοζωαρίου, ως αποτέλεσµα της αντίδρασης των κοκκίων του φλοιού δηµιουργείται η µεµβράνη γονιµοποίησης, η οποία και αποτελεί ένα φυσικό εµπόδιο κατά της πολυσπερµίας, της εισόδου δηλαδή και άλλου σπερµατοζωαρίου στο ήδη γονιµοποιηµένο ωάριο. Το ισολεκιθικό αυγό µετά τη σύντηξη των δυο προπυρήνων ακολουθεί τον ολοβλαστικό τρόπο αυλάκωσης. Η 1 η και 2 η αυλάκωση γίνονται και οι δυο στο επίπεδο του µεσηµβρινού (διέρχονται δηλαδή από τον άξονα που ενώνει το ζωικό πόλο µε το φυτικό πόλο) και σε επίπεδο κάθετο η µια προς την άλλη. Στο τέλος της 2 ης αυλάκωσης το έµβρυο έχει χωριστεί σε τέσσερα ισοµεγέθη βλαστοµερίδια. Η 3 η αυλάκωση γίνεται

32 25 στο επίπεδο του ισηµερινού, κάθετα στις προηγούµενες και έχει σαν αποτέλεσµα τον ισοµερή διαχωρισµό του ζωικού από το φυτικό πόλο και συνεπώς των 4 κυττάρων που προέκυψαν στο τέλος της 2 η αυλάκωσης. Στο τέλος της 3 η αυλάκωσης έχουν προκύψει τελικά 8 κύτταρα εκ των οποίων τα 4 βρίσκονται στη φυτική περιοχή και τα άλλα 4 στη ζωική. Κατά την 4 η αυλάκωση, τα 4 κύτταρα του ζωικού στρώµατος διαιρούνται στο επίπεδο του µεσηµβρινού και δίνουν 8 ισοµεγέθη βλαστοµερίδια, τα οποία καλούνται µεσοµερίδια. Τα κύτταρα του φυτικού στρώµατος υφίστανται µια άνιση αυλάκωση στο επίπεδο του ισηµερινού, από την οποία προκύπτουν 4 µεγάλα κύτταρα (µακροµερίδια) και 4 µικρότερα κύτταρα (µικροµερίδια) προς το φυτικό πόλο. Κατά την 5 η (στάδιο 32 κυττάρων) και 6 η αυλάκωση (στάδιο 64 κυττάρων) αντίστοιχα, τα µεσοµερίδια διαιρούνται κάθετα και ύστερα ακτινωτά κατά µήκος του ζ/φ άξονα και σχηµατίζουν δύο ζωικές περιοχές τις an1 και an2. Tα µακροµερίδια διαιρούνται και αυτά κάθετα στο ζ/φ άξονα κατά την πέµπτη αυλάκωση και κατά µήκος του ζ/φ άξονα στην έκτη αυλάκωση και δίνουν γένεση σε δύο φυτικές περιοχές, τις veg1 και veg2. Τέλος, τα µικροµερίδια (µεταξύ 5 ης και 6 ης αυλάκωσης) διαιρούνται άνισα (κάθετα στον ζ/φ άξονα) και σχηµατίζουν δύο οµάδες κυττάρων, τέσσερα µεγάλα και τέσσερα µικρά µικροµερίδια τα οποία βρίσκονται κάτω από τις περιοχές veg1 και veg2 ( Davidson 1986; Cameron 1987; Cameron and Davidson 1991). H περιοχή των µικρών µικροµεριδίων Tα τέσσερα µικρά µικροµερίδια (χρώµατος µωβ στην παραπάνω εικόνα) προκύπτουν κατά την άνιση πέµπτη αυλάκωση και θα διαιρεθούν µία ακόµη φορά κατά την εµβρυογένεση παράγοντας οχτώ απογόνους. Tα κύτταρα αυτά θα αποτελέσουν το 40% των κυττάρων που βρίσκονται στον κοιλωµατικό σάκο στο ενήλικο άτοµο (Davidson et al. 1998). H περιοχή των σκελετογόνων κυττάρων Tα σκελετογόνα µεσεγχυµατικά κύτταρα προέρχονται αποκλειστικά από τα τέσσερα µεγάλα µικροµερίδια τα οποία αναφέρονται ως πρώιµα

33 26 µεσεγχυµατικά κύτταρα (PMC) και φαίνονται µε κόκκινο χρώµα στην εικόνα. H veg2 περιοχή Από την περιοχή αυτή θα προκύψουν ενδοδερµικά κύτταρα που συνεισφέρουν στο σχηµατισµό του πρόσθιου και µισού µέσου εντέρου. Επίσης θα προκύψουν τα δευτερογενή µεσεγχυµατικά κύτταρα από τα οποία θα σχηµατιστούν τα χρωµοφόρα κύτταρα, κύτταρα του βλαστόκοιλου, µυικές ίνες του οισοφάγου καθώς και προγονικά κύτταρα του ενήλικα ατόµου (Angerer et al. 2000). H veg1 περιοχή Όπως η veg2 έτσι και η veg1 περιοχή δίνει γένεση σε κύτταρα διαφόρων βλαστικών δερµάτων. Συγκεκριµένα, δίνει γένεση τόσο σε ενδόδερµα όσο και στο στοµατικό και αντιστοµατικό εξώδερµα (Davidson et al. 1998, Angerer et al. 2000). H περιοχή της φυτικής πλάκας Αυτή η πρώιµα σχηµατιζόµενη περιοχή (χρώµατος ανοιχτού µωβ) προέρχεται από τα οχτώ βλαστοµερίδια της περιοχής Veg2 που σχηµατίζουν µία µορφή σα δαχτυλίδι (χρώµατος µπλε). Κατά το τέλος του σταδίου του βλαστιδίου τα κύτταρα αυτά σχηµατίζουν τη φυτική πλάκα από όπου ξεκινά η γαστριδίωση. Ωστόσο, πρόκειται για µία προσωρινή περιοχή για το έµβρυο. Κατά το τέλος του βλαστιδίου εµφανίζεται στο κέντρο της φυτικής πλάκας µία µεσοδερµική περιοχή από όπου θα προκύψουν τα διαφοροποιηµένα µεσοδερµικά κύτταρα κατά το στάδιο του γαστριδίου. Από την περιφερική περιοχή της φυτικής πλάκας θα προκύψουν ενδοδερµικά κύτταρα τα οποία θα δώσουν γένεση στο πρόσθιο και το µισό µέσο έντερο (Davidson et al. 1998). H αντιστοµατική εξωδερµική περιοχή H αντιστοµατική περιοχή που βρίσκεται στον έναν πόλο του στοµατικού/αντιστοµατικού άξονα (δεύτερος εµβρυικός άξονας) σχηµατίζεται από κύτταρα που προέρχονται τόσο από τη veg1 περιοχή όσο και από τη Na περιοχή. Κάποιοι απόγονοι των Na κυττάρων συνεισφέρουν και στο σχηµατισµό της βλεφαριδωτής ζώνης (Davidson et al. 1998). H περιοχή του στοµατικού εξωδέρµατος Το στοµατικό εξώδερµα βρίσκεται στον αντίθετο (ως προς το αντιστοµατικό εξώδερµα) πόλο του δεύτερου άξονα. Tα κύτταρα που το αποτελούν είναι απόγονοι της No περιοχής. Πρόκειται για µία πολύπλοκη περιοχή από όπου προκύπτουν µία ποικιλία κυτταρικών γραµµών. Συγκεκριµένα το στοµατικό εξώδερµα θα δώσει γένεση στο στόµα της νύµφης, σε περιοχές από όπου θα σχηµατιστούν τα νευρικά κύτταρα καθώς και στη βλεφαριδωτή ζώνη (Davidson et al. 1998).

34 27 Το στάδιο του βλαστιδίου στον αχινό αρχίζει στο στάδιο των 128 κυττάρων (έχουν προκύψει µετά από το τέλος της 7 ης αυλάκωσης). Στο στάδιο αυτό τα κύτταρα διατάσσονται στην επιφάνεια σφαίρας στο κέντρο της οποίας υπάρχει µια κοιλότητα, ο βλαστόκοιλος. Σ αυτό το στάδιο όλα τα κύτταρα έχουν το ίδιο µέγεθος αφού τα µικροµερίδια έχουν επιβραδύνει τις διαιρέσεις τους. Η εσωτερική επιφάνεια όλων των κυττάρων της σφαίρας είναι σ επαφή µε το γεµάτο πρωτεΐνες υγρό του βλαστόκοιλου ενώ η εξωτερική τους επιφάνεια έρχεται σε επαφή µε το στρώµα της υαλίνης. Καθώς τα κύτταρα εξακολουθούν να διαιρούνται το πάχος του βλαστιδίου παραµένει ίσο µε µια σειρά κυττάρων και λεπταίνει καθώς αυτό επεκτείνεται. Αυτό επιτυγχάνεται από την προσκόλληση των βλαστοµεριδίων στο στρώµα της υαλίνης και από την εισροή νερού στο εσωτερικό του βλαστόκοιλου. Το βλεφαριδωτό επιθήλιο περιστρέφεται µέσα στη µεµβράνη γονιµοποίησης. Στη συνέχεια τα κύτταρα του φυτικού πόλου αρχίζουν να παχαίνουν και να σχηµατίζουν τη φυτική πλάκα. Τα κύτταρα της ζωικής ηµισφαίρας συνθέτουν και εκκρίνουν ένα ένζυµο το οποίο πέπτει τη µεµβράνη γονιµοποίησης. Το έµβρυο είναι τώρα ένα ελεύθερο βλαστίδιο µε ικανότητα να κολυµπά. Λίγο µετά την εκκόλαψη του βλαστιδίου από τη µεµβράνη γονιµοποίησης, η φυτική περιοχή του σφαιρικού βλαστιδίου αρχίζει να λεπταίνει και να γίνεται επίπεδη. Στο κέντρο αυτής της δοµής µια οµάδα κυττάρων αρχίζουν να αλλάζουν. Αυτά τα κύτταρα αρχίζουν να εκτείνουν µακριά και λεπτά φιλοπόδια (τα φιλοπόδια δε συµµετέχουν στη µετακίνηση αλλά φαίνονται να εξερευνούν και να αισθάνονται το τοίχωµα του βλαστόκοιλου), από την εσωτερική επιφάνεια τους. Τα κύτταρα αυτά διαχωρίζονται από την επιθηλιακή µονοστοιβάδα και διεισδύουν µέσα στο βλαστόκοιλο. Αυτά τα κύτταρα προέρχονται από τα µικροµερίδια και ονοµάζονται πρωτογενή µεσεγχυµατικά κύτταρα. Αυτά θα σχηµατίσουν το σκελετό γι αυτό και καλούνται και σκελετογόνα µεσεγχυµατικά κύτταρα. Στην αρχή τα κύτταρα αυτά φαίνονται να κινούνται τυχαία κατά µήκος της εσωτερικής επιφάνειας του βλαστόκοιλου, φτιάχνοντας και καταστρέφοντας συνδέσεις µέσω των φιλοποδίων τους µε την επιφάνεια του βλαστόκοιλου. Τελικά τοποθετούνται κοιλιοπλευρικά στο βλαστόκοιλο. Εκεί συντήκονται και σχηµατίζουν συγκύτια, τα οποία θα σχηµατίσουν τον άξονα των δοκίδων ανθρακικού ασβεστίου. Η διείσδυση των απογόνων των µεγάλων µικροµεριδίων µέσα στο βλαστόκοιλο είναι αποτέλεσµα της απώλειας της συγγένειας αυτών προς τα γειτονικά τους κύτταρα και προς τη µεµβράνη της υαλίνης. Αντίθετα, αποκτούν ισχυρή συγγένεια για µια οµάδα πρωτεϊνών που επενδύουν το βλαστόκοιλο (βασική µεµβράνη και εξωκυττάρια ύλη). Αυτές οι αλλαγές στη συγγένεια έχουν συσχετιστεί µε αλλαγές στα µόρια της κυτταρικής

35 28 επιφάνειας που λαµβάνουν χώρα κατά τη διάρκεια της περιόδου αυτής. Πρωτεΐνες, όπως η φιµπρονεκτίνη, η ιντεργκρίνη, η λαµινίνη, η L1 και οι καντερίνες έχει δεχθεί ότι µπλέκονται στην κυτταρική διείσδυση. Αλλά αυτή η καθοδήγηση δεν µπορεί να είναι επαρκής, αφού τα κύτταρα που µεταναστεύουν ξέρουν ακριβώς που να σταµατήσουν και να σχηµατίσουν σκελετικές δοκίδες κοντά στον ισηµερινό του βλαστόκοιλου. Πιστεύεται ότι η απαραίτητη πληροφορία για τη θέση που θα σταµατήσουν παρέχεται από τα κύτταρα που αναµένονται να γίνουν εξωδερµικά και τη βασική τους µεµβράνη. Μόνο τα πρωτογενή µεσεγχυµατικά κύτταρα είναι ικανά να αποκρίνονται σε αυτά τα στοιχεία. 4.2 Πρώτο στάδιο της εγκόλπωσης του αρχεντέρου Καθώς τα πρωτογενή µεσεγχυµατικά κύτταρα αφήνουν τη φυτική περιοχή του βλαστόκοιλου, σηµαντικές αλλαγές συµβαίνουν στα κύτταρα που παραµένουν στη φυτική πλάκα. Αυτά τα κύτταρα παραµένουν δεσµευµένα το ένα στο άλλο και στο στρώµα υαλίνης και µετακινούνται για να γεµίσουν τα κενά που προκλήθηκαν από τη διείσδυση των πρωτογενών µεσεγχυµατικών κυττάρων. Στη συνέχεια η φυτική πλάκα εγκολπώνεται κατά το ½ µε ¼ του βλαστόκοιλου. Η περιοχή αυτή ονοµάζεται αρχέντερο και το άνοιγµα του αρχεντέρου στο φυτικό πόλο λέγεται βλαστοπόρος. Η εγκόλπωση φαίνεται να προκαλείται από αλλαγές στο σχήµα των κυττάρων της φυτικής πλάκας και στην εξωκυττάρια ύλη που βρίσκεται κάτω από αυτά. Μια οµάδα κυττάρων της φυτικής πλάκας αποκτά φιαλόµορφο σχήµα. Αυτή η αλλαγή προκαλεί την κάµψη των κυττάρων προς το εσωτερικό. Επιπρόσθετα, το στρώµα της υαλίνης στη φυτική περιοχή κάµπτεται προς το εσωτερικό λόγω αλλαγών στη σύστασή του. Τα ενδοδερµικά κύτταρα τα οποία βρίσκονται δίπλα στα µεσεγχυµατικά κύτταρα (τα προερχόµενα από τα µικροµερίδια) γίνονται το πρόσθιο τµήµα του αρχεντέρου και µεταναστεύουν περισσότερο µέσα στο βλαστόκοιλο. Το επόµενο στρώµα ενδοδερµικών κυττάρων γίνεται το ενδιάµεσο τµήµα του εντέρου και η τελευταία περιφερειακή σειρά που εγκολπώνεται σχηµατίζει το οπίσθιο έντερο και την έδρα. 4.3 εύτερη και τρίτη φάση της εγκόλπωσης του αρχεντέρου Στη δεύτερη φάση της γαστριδίωσης, το αρχέντερο εκτείνεται πάρα πολύ. Για να επιτευχθεί αυτή η επέκταση τα κύτταρα του αρχεντέρου αναδιατάσσονται, µεταναστεύοντας το ένα πάνω από το άλλο και αλλάζοντας σχήµα (συγκλίνουσα επέκταση). Επιπλέον, οι κυτταρικές

36 29 διαιρέσεις συνεχίζονται παράγοντας περισσότερα ενδοδερµικά και δευτερογενή µεσεγχυµατικά κύτταρα καθώς το αρχέντερο εκτείνεται. Το τελικό τρίτο στάδιο της εγκόλπωσης του αρχεντέρου προκαλείται από την τάση που αναπτύσσουν τα δευτερογενή µεσεγχυµατικά κύτταρα, τα οποία συγκροτούν την κορυφή του αρχεντέρου. Αυτά τα κύτταρα εκτείνουν φιλοπόδια δια µέσου του υγρού του βλαστόκοιλου για να έρθουν σε επαφή µε την εσωτερική επιφάνεια αυτού. Τα φιλοπόδια συνδέονται µε την επένδυση του βλαστόκοιλου και µικραίνουν τραβώντας το αρχέντερο. Φαίνεται ότι υπάρχει µια περιοχή-στόχος η οποία αναγνωρίζεται από τα δευτερογενή µεσεγχυµατικά κύτταρα. Συγκεκριµένα τα δευτερογενή µεσεγχυµατικά κύτταρα τοποθετούν το αρχέντερο στην περιοχή όπου θα σχηµατισθεί µελλοντικά το στόµα. Όταν η κορυφή του αρχεντέρου συναντήσει το τοίχωµα του βλαστόκοιλου στην περιοχή στόχο, τα δευτερογενή µεσεγχυµατικά κύτταρα διασκορπίζονται µέσα στο βλαστόκοιλο, όπου πολλαπλασιάζονται για να σχηµατίσουν τα µεσοδερµικά όργανα. Όπως προαναφέραµε, εκεί όπου το αρχέντερο έρχεται σε επαφή µε το εξωδερµικό τοίχωµα του εµβρύου, σχηµατίζεται τελικά το στόµα. Το στόµα συντήκεται µε το αρχέντερο, για να σχηµατίσει ένα συνεχόµενο πεπτικό σωλήνα. Έτσι, ο βλαστοπόρος αποτελεί τη θέση της µελλοντικής έδρας, στοιχείο το οποίο χαρακτηρίζει όλα τα δευτεροστόµια. 5. Tο γονίδιο SpCOUP-TF Ένα οµόλογο της οικογένειας των γονιδίων COUP-TFs είναι το γονίδιο SpCOUP-TF, που έχει αποµονωθεί από τον αχινού Strongylocentrotus purpuratus. Το γονίδιο αυτό εµφανίζει µεγάλη οµοιότητα αλληλουχίας µε τα γονίδια COUP-TF άλλων ασπόνδυλων και σπονδυλωτών. Έτσι, µεταξύ του ανθρώπινου COUP-TFI και του SpCOUP-TF το 96% των αµινοξέων τους που αντιστοιχεί στην περιοχή πρόσδεσης στο DNA (DBD) είναι κοινό, καθώς και το 92% των αµινοξέων της περιοχής πρόσδεσης της ορµόνης (LBD) (Chan et al., 1992). Το γονίδιο SpCOUP-TF εκφράζεται κατά τη διάρκεια της ωογένεσης και τα µετάγραφά του παραµένουν στο ωάριο ως µητρικό mrna. Το µητρικό mrna εντοπίζεται στη µια πλευρά του ωοκυττάρου προς την περιοχή του φλοιού. Το ίδιο συµβαίνει και στο αυγό δηλαδή συγκέντρωση του mrna προς τη µία πλευρά του (Vlahou et al.1996). Κατά την αυλάκωση και ξεκινώντας από το στάδιο των δύο κυττάρων, το mrna του SpCOUP-TF συγκεντρώνεται κυρίως στο ένα από τα δύο βλαστοµερίδια και σε γωνία 90 0 ως προς το επίπεδο

37 30 αυλάκωσης. Κατά τη δεύτερη αυλάκωση το mrna ανιχνεύεται σε δύο από τα τέσσερα βλαστοµερίδια. Μετά από δύο ακόµη διαιρέσεις το έµβρυο βρίσκεται στο στάδιο των 16 κυττάρων και το mrna πλέον ανιχνεύεται σε 4 από τα 8 µεσοµερίδια, σε 2 από τα 4 µακροµερίδια, ενώ ανιχνεύεται λιγότερο στα µικροµερίδια. Στο στάδιο του βλαστιδίου, το SpCOUP-TF mrna εντοπίζεται αποκλειστικά στα εξωδερµικά κύτταρα στη µια πλευρά του τοιχώµατος του βλαστόκοιλου, την υποτιθέµενη στοµατική περιοχή. Στο στάδιο αυτό το ανιχνεύσιµο mrna είναι πιθανόν λιγότερο µητρικό και περισσότερο ζυγωτικό. Από το στάδιο του γαστριδίου και µετά όλα τα µετάγραφα του COUP-TF θεωρούνται ζυγωτικής προέλευσης και ανιχνεύονται στo στοµατικό εξώδερµα. Στο στάδιο του πλουτέα, το SpCOUP-TF mrna εντοπίζεται καθαρά στα εξωδερµικά κύτταρα που σχηµατίζουν τη βλεφαριδωτή ζώνη (που είναι το προϊόν των κυτταρικών αλληλεπιδράσεων µεταξύ των απογόνων των βλαστοµεριδίων στο στοµατικό και αντιστοµατικό εξώδερµα) και στην έδρα (Vlachou et al. 1996). 6. Η πρωτεΐνη SpCOUP-TF Μελέτες που αφορούν την ενδοκυτταρική τοποθέτηση της πρωτεΐνης σε πρώιµα εµβρυικά στάδια, απέδειξαν ότι η µητρική πρωτεΐνη ανιχνεύεται στο κυτταρόπλασµα και στον πυρηνίσκο του ωοκυττάρου και στο κυτταρόπλασµα στο ώριµο αγονιµοποίητο αυγό (εικ.8a, B). Μετά τη γονιµοποίηση το µεγαλύτερο µέρος της πρωτεΐνης µεταναστεύει από το κυτταρόπλασµα στους πυρήνες. Στο στάδιο των δύο κυττάρων και κατά τη µεσόφαση, η πρωτεΐνη COUP-TF ανιχνεύεται στην περιφέρεια του εµβρυικού πυρήνα (εικ.8c), όπου και παραµένει και σε επόµενα αναπτυξιακά στάδια µε ένα µικρό ποσοστό της να ανιχνεύεται και στο κυτταρόπλασµα (εικ.8d). Εικ.8 Ανίχνευση του COUP-TF µε ανοσοφθορισµό σε ωοκύτταρα, αυγά και βλαστοµερίδια που βρίσκονται στη µεσόφαση πρώιµων εµβρύων (Vlahou et al. 2000). Ωστόσο, κατά τη µιτωτική διαίρεση των χρωµοσωµάτων η πρωτεΐνη COUP-TF βρίσκεται συνδεδεµένη µε τη συµπυκνωµένη χρωµατίνη.

38 31 Όπως φαίνεται και στην εικόνα 9A-C, στο στάδιο των 2, 4, και 16 κυττάρων αντίστοιχα ο COUP-TF ανιχνεύεται στα χρωµοσώµατα. Στο στάδιο των 16 κυττάρων όµως, τα µικροµερίδια βρίσκονται ακόµη στη φάση της µεσόφασης, οπότε και ο COUP-TF ανιχνεύεται στην περιφέρεια του πυρήνα σε αυτά (εικ. 9C). Ωστόσο, όταν και τα µικροµερίδια ξεκινούν τη µίτωση ο SpCOUP-TF ανιχνεύεται πλέον στα συµπυκνωµένα χρωµοσώµατα (εικ.9d). Στο στάδιο των 60 κυττάρων, ο SpCOUP-TF ανιχνεύεται σε κάποια κύτταρα στην πυρηνική περιφέρεια ενώ σε άλλα στη συµπυκνωµένη χρωµατίνη (εικ.9e) (Vlahou et al. 2000). Άρα η πρωτεΐνη COUP-TF πηγαινοέρχεται µεταξύ της πυρηνικής περιφέρειας και των χρωµοσωµάτων κατά τον κυτταρικό κύκλο. Εικόνα 9: Ανίχνευση του COUP- TF µε ανοσοφθορισµό σε πρώιµα εµβρυικά κύτταρα που βρίσκονται στο στάδιο της µίτωσης (Vlahou et al. 2000).

39 32 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΗΣ ΤΟΥ COUP-TF ΜΕ ΤΟΝ CTIP. 1. Ηλεκτροφόρηση µορίων Η ηλεκτροφόρηση είναι µια µέθοδος διαχωρισµού µορίων ή σωµατιδίων µε πολλές εφαρµογές στην µοριακή βιολογία, βιοχηµεία, πρωτεϊνική χηµεία, φαρµακολογία, εγκληµατολογία κ.α. Χρησιµοποιείται κυρίως για τον προσδιορισµό της καθαρότητας ενός δείγµατος, ποιοτικό και ποσοτικό έλεγχο, προσδιορισµό µοριακού βάρους (Μ.Β.) ενώ ως δείγµατα µπορεί να είναι οτιδήποτε µπορεί να κουβαλάει φορτίο από ολόκληρα κύτταρα έως πρωτεΐνες, πεπτίδια, νουκλεϊκά οξέα (DNA, RNA), αµινοξέα, φαρµακευτικές ουσίες, οργανικά οξέα και βάσεις και πολλά άλλα. Η βασική αρχή στηρίζεται στο φαινόµενο κατά το οποίο φορτισµένα µόρια και σωµατίδια, µέσα σε υδάτινα διαλύµατα και κάτω από την επίδραση ενός ηλεκτρικού πεδίου, κινούνται προς την κατεύθυνση του ηλεκτροδίου µε το αντίθετο φορτίο. Λόγω των διαφορετικών φορτίων και µαζών, τα διάφορα µόρια θα κινηθούν µε διαφορετικές ταχύτητες (κινητικότητα). Η κινητικότητα αυτή εξαρτάται από την σταθερά pk και το µοριακό βάρος του φορτισµένου σωµατιδίου ενώ άλλοι παράγοντες που µπορούν να επηρεάσουν την κινητικότητα είναι το ph και η συγκέντρωση του ρυθµιστικού διαλύµατος (buffer), η ένταση του ηλεκτρικού πεδίου, η θερµοκρασία καθώς και η φύση του υλικού µέσα στο οποίο γίνεται η ηλεκτροφόρηση. Η ηλεκτροφόρηση µπορεί να γίνει σε χαρτί, φιλµ και πηκτές (gels). Οι πιο γνωστές είναι η ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών και DNA σε πηκτές ακρυλαµίδης και αγαρόζης, αντίστοιχα. 1.1 Sodium dodecyl sulfate polyacrilamide gel electrophoresis (SDS- PAGE) Είναι η πιο αξιόπιστη µέθοδος για τον διαχωρισµό και ανάλυση πρωτεϊνικών δειγµάτων ενώ παράλληλα συνδυάζεται εύκολα και αποτελεσµατικά µε άλλες µεθόδους (π.χ. western blotting, IEF, mass spectrometry). Οι πηκτές πολυακριλαµίδης είναι χηµικά αδρανής και διάφανες µε πόρους που δηµιουργούνται από τον πολυµερισµό των µονοµερών ακρυλαµίδης µε το αντιδραστήριο N,N -methylenebisacrylamide. Το µίγµα ( ακρυλαµίδης, Tris-HCl, SDS, APS, TEMED) χύνεται µέσα σε

40 33 καλούπια (συνήθως ανάµεσα σε 2 επίπεδα γυαλιά µε σφραγισµένα τα πλαϊνά άκρα τους) ενώ τα δείγµατα τοποθετούνται σε οπές (wells) στο πάνω µέρος της πηκτής. Πιο αναλυτικά τώρα η πηκτή πολυακρυλαµίδης παρασκευάζεται από ένα διάλυµα ακρυλαµιδίου και µεθυλενο-δισακρυλαµιδίου. Το ακρυλαµίδιο από µόνο του σχηµατίζει γραµµικά πολυµερή. Το δισακρυλαµίδιο διασυνδέει πλευρικά τις αλυσίδες πολυακρυλαµιδίου. Το µέγεθος των πόρων καθορίζεται από το λόγο από το λόγο ακρυλαµιδίου/δισακρυλαµιδίου και από τη συγκέντρωση του ακρυλαµιδίου. Ένας υψηλός λόγος δισακρυλαµιδίου προς ακρυλαµιδίου καθώς και µια υψηλή συγκέντρωση ακρυλαµιδίου προκαλεί χαµηλή ηλεκτροφορητική κινητικότητα. Ο πολυµερισµός των µονοµερών ακρυλαµιδίου και δισακρυλαµιδίου επάγεται από το υπερθειικό αµµώνιο (ammonium persulfate ή APS), το οποίο αυθόρµητα διασπάται για να σχηµατίσει ελεύθερες ρίζες. Το αντιδραστήριο TEMED είναι ένας σταθεροποιητής των ελεύθερων ριζών και προάγει µε αυτόν τον τρόπο των πολυµερισµό. diaminoethane) TEMED (N,N,N,N -tetramethyl-1,2- Το 1970, ο Laemmli εισήγαγε ένα σύστηµα (Tris-glycine-SDS system) το οποίο χρησιµοποιείται περισσότερο στις µέρες µας. Στο σύστηµα αυτό, το πήκτωµα διαχωρισµού (stacking gel) έχει ph 6,8 και το δείγµα παγιδεύεται ανάµεσα σε ιόντα Cl-, τα οποία προηγούνται, και µόρια γλυκίνης, τα οποία ακολουθούν, και έτσι το δείγµα σχηµατίζει µια λεπτή µπάντα (band), σύµφωνα µε τις αρχές της ισοταχούς ηλεκτροφόρησης. Αυτό συµβαίνει διότι η γλυκίνη είναι διπολικό ιόν σε αυτό το περιβάλλον, καθώς η τιµή pka της γλυκίνης είναι αρκετά υψηλότερη από το ph του gel, και έτσι η κινητικότητα των µορίων της είναι πολύ χαµηλή. Τα ιόντα χλωρίου έχουν υψηλότερη κινητικότητα και προηγούνται αλλά δε µπορούν να αποµακρυνθούν καθώς αφήνουν πίσω τους θετικά ιόντα δηµιουργώντας µια διαφορά δυναµικού κρατώντας τα σε κοντινή απόσταση. Έτσι σχηµατίζεται µια ζώνη µέσα στην οποία βρίσκεται παγιδευµένο το δείγµα. Με λίγα λόγια, η κινητικότητες των µορίων εξαρτώνται αποκλειστικά από το καθαρό τους φορτίο και όχι από το µέγεθος τους διότι οι πόροι της πηκτής είναι αρκετά µεγάλοι. Το φαινόµενο αυτό στηρίζεται στο λεγόµενο Kohlrausch boundary. Όταν η ζώνη αυτή εισέλθει στο πήκτωµα διαχωρισµού (resolving gel), το οποίο

41 34 έχει ph 8,8 και µικρότερους πόρους, η κινητικότητα του δείγµατος µειώνεται και αυτή των µορίων της γλυκίνης αυξάνεται κατά πολύ, καθώς ιοντίζονται, και προσπερνάνε τα µόρια του δείγµατος. Από το σηµείο αυτό (σταθερό ph και δυναµικό) ξεκινάει ο διαχωρισµός των µορίων του δείγµατος. Όλη η διαδικασία της ηλεκτροφόρησης γίνεται µέσα σε buffer (Tris-Glycine-SDS) µε ph περίπου 8,3. Ένα άλλο πλεονέκτηµα του συστήµατος Laemmli, είναι η χρήση του sodium dodecyl sulfate (SDS ή δωδεκάκυλο-θειικό νάτριο). Το SDS είναι ένα ισχυρό ανιοντικό απορρυπαντικό, το οποίο δεσµεύεται στις πρωτεΐνες και καταστρέφει όλες τις µη οµοιοπολικές αλληλεπιδράσεις µιας φυσικής πρωτεΐνης. Όπως φαίνεται και από το σχήµα που ακολουθεί το µόριο αποτελείται από µια ανιοντική κεφαλή και από µια λιποφιλική ουρά. Τα ανιόντα του SDS δεσµεύονται στις κύριες αλυσίδες των πρωτεϊνών µέσω της υδρόφοβης ουράς, σε αναλογία ενός µορίου SDS ανά δύο αµινοξέα. Το αρνητικό φορτίο που αποκτάται µε τη δέσµευση του SDS είναι συνήθως πολύ µεγαλύτερο από ότι το αρχικό φορτίο της πρωτεΐνης και εποµένως το αρχικό φορτίο καθίσταται αµελητέο. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα την αποδιάταξη της τεταρτοταγούς και δευτεροταγούς δοµής και την πρόσδοση αρνητικού φορτίου σε όλες τις πρωτεΐνες. Το τελευταίο εξαλείφει την επιρροή του φορτίου στην κινητικότητα και οι πρωτεΐνες κινούνται µόνο µε βάση το Μ.Β. τους. Επίσης, γίνεται δυνατή η ανάλυση όλων των πρωτεϊνών του δείγµατος καθώς τώρα θα κινηθούν όλες προς το ίδιο ηλεκτρόδιο (άνοδο-θετικά φορτισµένο ηλεκτρόδιο) ενώ διαφορετικά οι πρωτεΐνες µε ισοηλεκτρικά σηµεία (pi) µεγαλύτερα του 6,8 θα µετακινούνταν προς την κάθοδο και θα χάνονταν. Προετοιµασία του δείγµατος Η προετοιµασία του δείγµατος είναι πολύ σηµαντική και από µόνη της µπορεί να κρίνει την επιτυχία της ηλεκτροφόρησης. Ο υπό εξέταση ιστός (π.χ. ωοθήκες) ζυγίζεται και µεταφέρεται στον οµογενοποιητή. Θεωρώντας ότι οι ιστοί αποτελούνται σε ποσοστό 99% από νερό µεταφέρουµε στον οµογενοποιητή ίσο όγκο πυκνού sample buffer µε DTT. Ακολούθως, ο ιστός οµογενοποιείται µε τη µηχανική πίεση του εµβόλου που τον συνθλίβει.

42 35 Μετά την οµογενοποίηση, το οµογενοποίηµα λαµβάνεται µε πιπέτα, µεταφέρεται σε µικροσωλήνες eppendorf και αυτοί σε υδατόλουτρο µε νερό που βράζει (ΣΖ. 100 ο C). Ο βρασµός παρατείνεται για 10 περίπου λεπτά. Στη συνέχεια, το οµογενοποίηµα φυγοκεντρείται. Μετά το πέρας της φυγοκέντρησης, οι αδιάσπαστοι ιστοί έχουν καθιζάνει στον πυθµένα του µικροσωλήνα, στην επιφάνεια παρατηρούνται στρώµα αδιάλυτων λιπιδίων ενώ στη µέση περιοχή βρίσκεται το πρωτεϊνικό εκχύλισµα. Το πρωτεϊνικό αυτό εκχύλισµα συλλέγεται και µπορεί να αποθηκευτεί στους -20 ο C. Στη συνέχεια το δείγµα είτε θερµαίνεται στους ο C για µερικά λεπτά, ώστε το SDS να δεθεί µε τις πρωτεΐνες και να δράσει η αναγωγική ουσία (εφόσον έχει προστεθεί στο buffer) ή αφήνεται σε θερµοκρασία δωµατίου για 30 λεπτά. Τέλος, το δείγµα φυγοκεντρείται ώστε να αποµακρυνθούν οι αδιάλυτες ουσίες (καθώς επηρεάζουν αρνητικά την ανάλυση). Τα αµινοξέα σε διάλυµα που έχει ουδέτερο ph συµπεριφέρονται σαν διπολικά ιόντα (που ονοµάζονται και αµφοτερικά ιόντα). Στη διπολική µορφή η αµινική οµάδα είναι πρωτονιωµένη (-ΝΗ3+) και η καρβοξυλική οµάδα είναι αποπρωτονιωµένη (-COO-). Ο βαθµός ιοντισµού ενός αµινοξέος ποικίλλει ανάλογα µε το ph. Σε όξινο ph, η αµινική οµάδα είναι πρωτονιωµένη (-ΝΗ3+) και η καρβοξυλική οµάδα είναι ανέπαφη (-COOΗ). Καθώς αυξάνεται το ph, η πρώτη οµάδα που απελευθερώνει πρωτόνιο είναι η καρβοξυλική οµάδα, εφόσον το pka για αυτήν είναι κοντά στο 2. Η διπολική µορφή συνεχίζεται µέχρι το ph να πλησιάζει το 9, όταν η πρωτονιωµένη αµινική οµάδα χάνει ένα πρωτόνιο. Υλικά Συσκευή ηλεκτροφόρησης ιάλυµα ακρυλαµιδίου 30% (Acr/bis=100/1) 30g Acrylamide 0.3g bis-acrylamide Πλήρωση µέχρι τα 100 ml µε απεσταγµένο H2O 1 Μ Tris-HCl, ph g Tris-HCl Πλήρωση µε απεσταγµένο H2O µέχρι τα 200ml Πεχαµέτρηση µε HCl 37% (ph 8.8) Πλήρωση µε απεσταγµένο H2O µέχρι τα 250ml 1 Μ Tris-HCl, ph g Tris-HCl Πλήρωση µε απεσταγµένο H2O µέχρι τα 200ml Πεχαµέτρηση µε HCl 37% (ph 8.8) Πλήρωση µε απεσταγµένο H2O µέχρι τα 250ml

43 36 10% SDS Ammonium persulfate (APS, 20%) TEMED, N,N,N,N -tetramethylethylendiamine 70% αιθανόλη Απεσταγµένο νερό ιάλυµα ηλεκτροφόρησης (Running buffer 5x, ph 8.3) 30 g Tris-HCl 144g Glycine 5g SDS (Dodecylsulfate Na-salt) DdH20 µέχρι το 1 L Πρωτεινικός µάρτυρας (prestained protein marker, NEB). Μικροσωλήνες eppendorfs και ρύγχοι Τροφοδοτικό ιάλυµα χρωστικής Coomassie Blue: 0.6g Coomassie brilliant Blue R ml Μεθανόλη 70ml Οξικό οξύ 500ml ddh20 Αποχρωστικό διάλυµα 300ml Μεθανόλη 70ml Οξικό οξύ 630ml ddh20 ιάλυµα διατήρησης πηκτώµατος 7% οξικό οξύ Συγκέντρωση gel, % Μοριακό βάρος, kda <5 > >15 <15 ιαδικασία Καθαρίζουµε προσεκτικά όλα τα µέρη της συσκευής ηλεκτροφόρησης µε 70% αιθανόλη (ειδικά τις δύο γυάλινες πλάκες και το χτενάκι). Ακολούθως, συναρµολογούµε τη συσκευή και ελέγχουµε το σύστηµα για τυχών διαρροές. Αρχικά, παρασκευάζουµε το διάλυµα για το gel διαχωρισµού (separation or lower gel) και το µεταφέρουµε στο κενό µεταξύ των γυάλινων πλακών. Η επιφάνεια του gel διαχωρισµού ευθυγραµµίζεται προσεκτικά µε την προσθήκη νερού µε τη βοήθεια πιπέτας pauster.

44 37 Αφού πήξει το gel διαχωρισµού, περίπου 40 min µετά τη µεταφορά, αποχύνεται η στοιβάδα του νερού και παρασκευάζεται και µεταφέρεται στο κενό µεταξύ των πλακών, το διάλυµα για το gel πακεταρίσµατος (stacking or upper gel). Στη συνέχεια, τοποθετείται η χτένα για τη δηµιουργία των πηγαδιών στα οποία θα φορτωθούν τα δείγµατα. Η απόσταση της κάτω επιφάνειας της χτένας από την επάνω επιφάνεια του gel διαχωρισµού πρέπει να είναι περίπου 0.5 cm. Το διάστηµα αυτό είναι αρκετό για το πακετάρισµα των πρωτεϊνών. Το gel πακεταρίσµατος πήζει µετά από την πάροδο περίπου 20 λεπτών οπότε και αφαιρείται προσεκτικά η χτένα, καθαρίζονται τα πηγαδάκια για την αποµάκρυνση φυσαλίδων αέρα που θα παρεµπόδιζαν τη διαδικασία της ηλεκτροφόρησης, η συσκευή µεταφέρεται σε µπανάκι το οποίο πληρούται µε διάλυµα ηλεκτροφόρησης (running buffer). Με το ίδιο διάλυµα πληρούται και το διάκενο µεταξύ των πλακών της συσκευής καθώς και τα ίδια τα πηγαδάκια. Το τελευταίο θα βοηθήσει τα δείγµατα να καθιζάνουν καλύτερα µέσα στα πηγαδάκια. Αφού φορτωθούν τα δείγµατα στα πηγαδάκια (συνήθως 10λ/πηγαδάκι) καθώς και ο κατάλληλος µάρτυρας, το όλο σύστηµα αποµονώνεται µε το ειδικό κάλυµµα και ανοίγουµε το τροφοδοτικό. Η ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών διαρκεί περίπου 90 min µε σταθερή ένταση ρεύµατος 20 ma. Separating gel (lower gel) 10% Buffer Tris-CL ph ml d H2O 6 ml Acrylamide (30%) 5 ml SDS 10% 150 µl AP (20%) 50 µl TEMED 20 µl Stacking gel (upper gel) Buffer Tris-CL ph ml d H2O 5.5 ml Acrylamide (30%) 2 ml SDS 10% 100 µl AP (20%) 30 µl TEMED 10 Μl

45 Western blotting ιαδικασία Η µεµβράνη νιτροκυτταρίνης (PVDF) ενεργοποιείται σε καθαρή µεθανόλη για περίπου 1 min. Η µεθανόλη βοηθά τη µεταφορά των πρωτεϊνών από το gel στη µεµβράνη. Μισή ώρα πριν τη λήξη της ηλεκτρόφορησης, τα απορροφητικά σφουγγάρια και χαρτιά εµβαπτίζονται σε transfer buffer έτσι ώστε να επιτευχθεί πλήρης εµπότιση αυτών. Μετά από το πέρας της ηλεκτροφόρησης των πρωτεινών το gel πολυακρυλαµιδίου αποσύρεται προσεκτικά για να µην σπάσει, από τις γυάλινες πλάκες και τοποθετείται επάνω σε ένα σύστηµα που περιλαµβάνει απορροφητικά σφουγγάρια και χαρτιά (διαστάσεων περίπου 7x7 cm). Η όλη διάταξη εµποτίζεται µε transfer buffer αποφεύγοντας τη δηµιουργία φυσαλίδων. Ακολούθως επάνω στο gel τοποθετείται κοµµάτι µεµβράνης νιτροκυτταρίνης (PVDF) και αφού το διαβρέξουµε µε νέα ποσότητα transfer buffer, το όλο σύστηµα καλύπτεται από την επάνω πλευρά αυτή τη φορά, µε απορροφητικά χαρτιά και σφουγγάρια που προηγουµένως είχαν εµποτιστεί σε transfer buffer. Η παραπάνω διάταξη κλείνεται τελικά σε κατάλληλο πλαίσιο που της προσδίδει σταθερότητα και µεταφέρεται στη δεξαµενή της συσκευής µεταφοράς µέχρι να καλυφθεί πλήρως από το transfer buffer 1x. Αφού συνδέσουµε τη συσκευή µε το τροφοδοτικό µηχάνηµα κατάλληλα έτσι ώστε να εξασφαλίσουµε την ορθή µεταφορά των αρνητικά φορτισµένων πρωτεϊνών προς τη θετικά φορτισµένη µεµβράνη µε τη βοήθεια της φοράς του ρεύµατος, η µεταφορά πραγµατοποιείται σταθερά στα 200 ma. Ο χρόνος της µεταφοράς καθορίζεται από το µέγεθος της πρωτεΐνης και ποικίλει από 2 εως 4 ώρες. Μπλοκάρισµα της µεµβράνης PVDF Μετά από τη µεταφορά των πρωτεϊνών από το gel στη µεµβράνη PVDF αυτή αποσύρεται προσεκτικά από το όλο σύστηµα και ενυδατώνεται σε διάλυµα TBS 1x το οποίο περιέχει απορρυπαντικό Tween 0.1%. Η ενυδάτωση πραγµατοποιείται υπό συνεχή ανάδευση για περίπου 5 λεπτά. Στη συνέχεια όλες οι θέσεις της µεµβράνης καλύπτονται µε πρωτεΐνες µε σκοπό να παρεµποδιστεί η µη ειδική πρόσδεση αντισώµατος. Το συνήθως χρησιµοποιούµενο διάλυµα είναι αυτό του ξηρού γάλακτος (5%) σε TBS 1x -0.1 % Tween, ενώ το αποτέλεσµα µπορεί να ενισχυθεί µε αλβουµίνη βοός (BSA 1%).

46 39 Το µπλοκάρισµα πραγµατοποιείται στους 37 ο C υπό συνεχή ανάδευση για µια ώρα ή over night στους 4 ο C. Μετά την πάροδο του χρονικού αυτού διαστήµατος, η µεµβράνη ξεπλένεται πολύ καλά τρεις φορές επί 5 min µε διάλυµα TBS 1x -0.1 % Tween υπό συνεχή ανάδευση. Έκθεση στο 1 ο και 2 ο αντίσωµα Ακολούθως, η µεµβράνη εκτίθεται στο 1 ο αντίσωµα το οποίο έχει ειδικά παραχθεί για να αναγνωρίζει ένα συγκεκριµένο επίτοπο στην επιφάνεια της πρωτεΐνης στόχου (µονοκλωνικό αντίσωµα) ή διαφορετικούς επίτοπους στην επιφάνεια της πρωτεΐνης στόχου (πολυκλωνικό αντίσωµα). Το πρωτογενές αυτό αντίσωµα διαλύεται σε TBS 1x -0.1 % Tween και η συγκέντρωσή του καθορίζεται είτε από τη βιβλιογραφία και τον κατασκευαστή είτε µετά από πειράµατα που θα προσδιορίσουν τη βελτιστη συγκέντρωση αυτού. Η έκθεση στο 1 ο αντίσωµα πραγµατοποιείται υπό συνεχή ανάδευση στους 4 ο C over night είτε σε θερµοκρασία δωµατίου 25 ο C για 2 περίπου ώρες. Στη συνέχεια, η µεµβράνη ξεπλένεται πολύ καλά τρεις φορές επί 5 min µε διάλυµα TBS 1x -0.1 % Tween υπό συνεχή ανάδευση. Η µεµβράνη κατόπιν, εκτείθεται στο δευτερογενές αντίσωµα για µία ώρα υπό συνεχή ανάδευση στους 37 ο C. Το δευτερογενές αυτό αντίσωµα είναι συζευγµένο µε το ένζυµο υπεροξειδάση και είναι ειδικό για το Fc κλάσµα των IgG πρωτογενών αντισωµάτων (π.χ. goat anti-rabbit ). Το δευτερογενές αντίσωµα χρησιµοποιείται στη συγκέντρωση που καθορίζεται από τον κατασκευαστή είτε µετά από πειράµατα που προσδιόρισαν την άριστη συγκέντρωση για πάρουµε το καλύτερο αποτέλεσµα. Στη συνέχεια, η µεµβράνη ξεπλένεται πολύ καλά τρεις φορές επί 5 min µε διάλυµα TBS 1x -0.1 % Tween υπό συνεχή ανάδευση και επί δυο φορές υπό συνεχή ανάδευση ανά 5 λεπτά µε TBS 1x. Μέθοδος χηµειοφωταύγειας Με σκοπό να οπτικοποιήσουµε την ειδική πρόσδεση του πρωτογενούς αντισώµατος χρησιµοποιούµε τη µέθοδο της χηµειοφωταύγειας. Με τη µέθοδο αυτή, το ένζυµο της υπεροξειδάσης, το οποίο είναι δεσµευµένο στο δευτερογενές αντίσωµα, αντιδρά µε το υπόστρωµα, το υπεροξείδιο του υδρογόνου-h2o2 και ένα συστατικό που έχει την ικανότητα να εκπέµπει φως, όπως είναι η λουµινόλη. Αυτή η αντίδραση έχει ως συνέπεια την εκποµπή φωτός, η οποία µπορεί να ανιχνευθεί χρησιµοποιώντας ένα φωτοευαίσθητο film.

47 40 ιαδικασία Η µεµβράνη στεγνώνεται ελαφρώς και στη συνέχεια καλύπτεται µε διάλυµα των αντιδραστηρίων ECL (Η2Ο2-λουµινόλη) για περίπου 1 λεπτό. Ακολούθως, αφου στεγνώσουµε ελαφρώς και παλι τη µεµβράνη τοποθετούµε πάνω σε αυτήν film ακτίνων Χ. Μεµβράνη και φιλµ τοποθετούνται µέσα σε ειδική κασετίνα. Η έκθεση ποικίλει από 10 sec- 10 min. Υπολογισµός του µοριακού βαρους (ΜΒ) µιας πρωτεΐνης Με σκοπό να καθοριστεί το µοριακό βάρος µιας πρωτεΐνης, υπολογίζεται η σχετική απόσταση (Rf) για κάθε µάρτυρα διαφορετικού µοριακού βάρους καθώς και για κάθε υπό εξέταση πρωτεΐνη. Ο Rf υπολογίζεται από την απόσταση που έχει διανύσει κάθε µάρτυρας και οι άγνωστου µοριακού βάρους πρωτεΐνες µέσα στο gel διαιρώντας αυτόν τον αριθµό µε την απόσταση που το µέτωπο της χρωστικής έχει ταξιδέψει µέσα στο gel. Στη συνέχεια µπορούµε να σχεδιάσουµε µια καµπύλη µε τη σχετική απόσταση Rf στον αξονα χ και το µοριακό βάρος (σε KDa) στον άξονα y. Μια λογαριθµική καµπύλη µπορεί να µας δώσει µια εξίσωση από την οποία το µοριακό βάρος των πρωτεϊνών µπορεί να υπολογισθεί από την Rf τιµή τους. 1.3 Καλλιέργεια εµβρύων αχινού Paracentrotus lividus Η συλλογή των ατόµων αχινού πραγµατοποιήθηκε κατά το χρονικό διάστηµα µεταξύ του Νοεµβρίου και του Μαίου. Την περίοδο αυτή οι αχινοί είναι γενετικά ώριµοι. Τα άτοµα των αχινών συλλέχθηκαν από τις παραλίες της Περιοχής του Ριου και του Αγίου Βασιλείου. Τα άτοµα είτε χρησιµοποιήθηκαν άµεσα σε πειραµατικές διαδικασίες είτε µετά από κάποιες µέρες παραµονής σε ενυδρείο υπό σταθερές συνθήκες, µιας και

48 41 τα ζώα πρέπει να διατηρηθούν µέσα σε ένα εύρος θερµοκρασίας το οποίο είναι κατάλληλο για το γένος. Για παράδειγµα για το γένος Paracentrotus αυτό το εύρος κυµαίνεται από 14 έως 19 ο C, ενώ για το είδος S. purpuratus από 4 έως 16 ο C. Πρόκληση εκσπερµάτωσης και ωορρηξίας Χρησιµοποιούµενα υλικά: Αχινοί Paracentrotus lividus ιάλυµα KCL 0.5M Φιλτραρισµένο θαλασσινό νερό (Mili-pore Filtered Sea Water, διάµετρος πόρων φίλτρου 45 µm). Σωλήνες eppendorf των 1.5 ml, πιπέτες pauster και αναρροφητής Ποτήρια ζέσεως των 50 και 100 ml Γάζες (sterilux SE-HARTMANN 10cm x 10cm) Στερεοσκόπιο Σύριγγες Όλα τα σκεύη τα οποία χρησιµοποιούνται κατά τις διαδικασίες πρόκλησης ωορρηξίας και εκσπερµάτισης καθώς επίσης και τα δοχεία στα οποία πραγµατοποιείται η καλλιέργεια των εµβρύων αχινού πλένονται αποκλειστικά µε νερό βρύσης και ξεπλένονται µε dd H2O. εν επιτρέπεται η χρήση κανενός απορρυπαντικού. Ωορρηξία Με τη βοήθεια βελόνας γίνεται ένεση ενός περίπου ml διαλύµατος 0,5M KCl στην περιστοµατική κοιλότητα του αχινού, πλευρικά του λύχνου του Αριστοτέλη, µε αποτέλεσµα την αλλαγή της ισορροπίας ιόντων Κ + /Να +, την σύσπαση των γονάδων και τελικά την απελευθέρωση των γαµετών από έναν ή περισσότερους από τους πέντε γονοπόρους της αντιστοµατικής περιοχής, αν το ζώο είναι ώριµο. Κάποια ζώα δίνουν περισσότερους γαµέτες αν κουνηθούν µετά την ένεση. Άλλα δε µπορεί να χρειαστούν περισσότερες ενέσεις KCl. Οι θηλυκοί αχινοί τοποθετούνται µε την έδρα προς τα κάτω σε ποτήρι ζέσεως των 50ml που περιέχει θαλασσινό νερό, έτσι ώστε τα ωάρια να συλλέγονται στο ποτήρι. Το χρώµα των ωαρίων είναι ελαφρά κόκκινο. Αφού τα ωάρια καθιζάνουν, το υπερκείµενο θαλασσινό νερό απορρίπτεται προσεκτικά και προστίθεται νέο. Ακολούθως τα ωάρια επανααιωρούνται και το διάλυµα διηθείται µέσω γάζας για την αποµάκρυνση άχρηστων αντικειµένων όπως σπασµένες άκανθοι των αχινών. Τα ωάρια µεταφέρονται σε νέο ποτήρι ζέσεως των 50ml έτσι ώστε να είναι αιωρηµένα σε 75ml θαλασσινό νερό.

49 42 Εκσπερµάτωση Με τη βοήθεια βελόνας γίνεται ένεση διαλύµατος 0,5M KCl στην περιστοµατική κοιλότητα του ώριµου αρσενικού αχινού, µε αποτέλεσµα την αλλαγή της ιοντικής ισχύος, την σύσπαση των γονάδων και τελικά την απελευθέρωση σπέρµατος. Τα αρσενικά άτοµα ακολούθως τοποθετούνται µε την έδρα προς τα κάτω και το σπέρµα τελικά συλλέγεται σε eppendorf άµεσα µε τη βοήθεια πιπέτας pauster και διατηρείται στον πάγο. Το αδιάλυτο σπέρµα, αν αποθηκευτεί στους 4 ο C µπορεί να χρησιµοποιηθεί για δύο µε τρεις µέρες. Έλεγχος γονιµοποίησης Για την επιτυχή λήψη µιας συγχρονισµένης και καλά αναπτυσσόµενης καλλιέργειας ελέγχεται προηγουµένως η καταλληλότητα των γαµετών. Συγκεκριµένα σε αντικειµενοφόρο πλάκα τοποθετείται µία σταγόνα ωαρίων των οποίων ο βαθµός ωριµότητας ελέγχεται µικροσκοπικά. Τα ώριµα ωάρια χαρακτηρίζονται από µικρό πυρήνα περικλειόµενο από µεγάλη ποσότητα κυτταροπλάσµατος. Στη συνέχεια, αν η µορφολογία των αυγών είναι ικανοποιητική, ελάχιστη ποσότητα ξηρού σπέρµατος διαλύεται σε 1 ml θαλασσινού νερού που έχει µεταφερθεί σε eppendorf και ακολούθως µια σταγόνα από το αραιωµένο σπέρµα µεταφέρεται στην πλάκα πάνω από την σταγόνα των ωαρίων. Η αραίωση του σπέρµατος γίνεται για την αποφυγή πολυσπερµίας. Στη συνέχεια µε τη βοήθεια µικροσκοπίου παρατηρείται η εξέλιξη της γονιµοποίησης. Συγκεκριµένα ελέγχεται το ποσοστό της γονιµοποίησης (ένα ποσοστό πάνω από 75% θεωρείται γενικά ικανοποιητικό) καθώς και τα χαρακτηριστικά της µεµβράνης γονιµοποίησης, η οµοιόµορφη µορφολογία και ο σχετικά γρήγορος ρυθµός σχηµατισµού της. ιαδικασία Παρασκευή διαλύµατος PABA 10 m M ( 4-Aminobenzoic Acid- MW: 137,14-SIGMA). Το διάλυµα πεχαµετρείται και το ph ρυθµίζεται στο 8,2-8,3 (ph γονιµοποίησης). Η ουσία αυτή εµποδίζει την σκλήρυνση της µεµβράνης γονιµοποίησης αποτρέποντας την αλληλοσύνδεση πρωτεϊνών. Ολόκληρη η ποσότητα των ωαρίων µεταφέρεται σε 1000 ml διαλύµατος ΡΑΒΑ και στη συνέχεια προστίθεται 1 ml περίπου αραιωµένου σπέρµατος. Το διάλυµα αναδεύεται καλά και ελέγχεται µικροσκοπικά η γονιµοποίηση. Αν η εξέλιξή της είναι επιτυχής, η καλλιέργεια αφήνεται να αναδεύεται διαρκώς σε θερµοκρασία δωµατίου για ένα χρονικό διάστηµα περίπου δεκαπέντε λεπτών.

50 43 Μετά την πάροδο του χρονικού αυτού διαστήµατος αποµακρύνουµε τη µεµβράνη γονιµοποίησης, της οποίας η σκλήρυνση έχει παρεµποδιστεί από το 4-Aminobenzoic Acid και µπορεί πλέον να αποµακρυνθεί εύκολα µε διήθηση της καλλιέργειας µέσω µεµβράνης Nitex (πόροι µεµβράνης 73 µm). Η καλλιέργεια διαβιβάζεται µέσω της µεµβράνης περίπου τρεις φορές για να αποµακρυνθεί επιτυχώς από όλα τα γονιµοποιηµένα αυγά. Η αποµάκρυνση της µεµβράνης ελέγχεται µικροσκοπικά και ακολούθως η καλλιέργεια µεταφέρεται στους 18 ο C 1.4 Συλλογή εµβρύων αχινού από διάφορα αναπτυξιακά στάδια Συλλέγουµε 50 ml σε σωλήνα falcon από την καλλιέργεια στις 0, 2, 4, 20, 30, 44, και 50 ώρες µετά τη γονιµοποίηση. Οι ώρες αυτές αντιστοιχούν στα παρακάτω αναπτυξιακά στάδια του αχινού: 0 hr: Αγονιµοποίητα ωάρια 2 hr: Στάδιο τεσσάρων κυττάρων 4 hr: Στάδιο 16 κυττάρων 20 hr: Στάδιο µεσεγχυµατικού βλαστιδίου 30 hr: Στάδιο γαστριδίου 44 hr: Στάδιο πρώιµου πλουτέα 50 hr: Στάδιο ώριµου πλουτέα Τα έµβρυα αφήνονται να καθιζάνουν στον πάγο (διακοπή περαιτέρω ανάπτυξης) για να ακολουθήσει στη συνέχεια η µονιµοποίηση τους. 1.5 Μονιµοποίηση εµβρύων Η µονιµοποίηση όλων των εµβρύων έγινε µε τη χρήση διαλύµατος παραφορµαλδεύδης (PFA 8%). Συγκεκριµένα σε 0,5 ml δ/τος εµβρύων προστίθενται 0,5 ml δ/τος PFA 8%. Μετά από ήπια ανάµειξη το διάλυµα επωάζεται για 15 min σε θερµοκρασία δωµατίου. Κατά το χρονικό αυτό διάστηµα τα έµβρυα καθιζάνουν και µετά το πέρας του χρόνου το υπερκείµενο υγρό απορρίπτεται και προστίθεται 1 ml Artifitial Sea Water (ASW). Αφού τα έµβρυα καθιζάνουν πάλι η όλη διαδικασία επαναλαµβάνεται. Στη συνέχεια, τα έµβρυα ξεπλένονται 3 φορές µε διάλυµα PBS (1x) για να αποθηκευτούν τελικά σε διάλυµα PBS (1x) το οποίο περιέχει sodium azide 0.01 %. Στο διάλυµα αυτό τα έµβρυα µπορούν να αποθηκευτούν στους 4 ο C. Artificial Sea Water 28,3g NaCl 0,77g KCl 5,41g MgCl2.6H2O 3,42g MgSO4 ή 7,13g MgSO4.7H20 0,2g NaHCO3

51 44 1,56g CaCl2 dehydrate (προστίθεται τελευταίο) Phosphate Buffered Saline (PBS 10x) 14,1g Na2HPO4 5,44g KH2PO4 10g NaCl Οι παραπάνω ποσότητες των αλάτων προστίθενται σε 1 L ddh20 και το ρυθµίζεται στο 7,4 (ισοτονικό ρυθµιστικό διάλυµα). 1.6 Ανοσοφθορισµός µε τη χρήση πλακών terasaki. Πορεία Σε κάθε ένα από τα 6 πηγάδια των σειρών 1, 2, 4-6, 8-11 µεταφέρουµε από 10 λ διαλύµατος TBS (1x)-TX-100 0,1 % - Sheep serum 5% (blocking solution). Με τη βοήθεια πιπέτας στόµατος µεταφέρουµε 4 περίπου έµβρυα σε κάθε πηγάδι της σειράς 1 της πλάκας terasaki. Αφού καθιζάνουν τα έµβρυα στον πυθµένα κάθε πηγαδιού, µεταφέρουµε αυτά στο αντίστοιχο πηγάδι της σειράς 2. Σε κάθε πηγάδι της σειράς 3 µεταφέρουµε από 10 λ δ/τος του επιθυµητού αντισώµατος σε PBS (1x) και ακολούθως, και πάλι µε τη βοήθεια πιπέτας στόµατος, µεταφέρουµε στο αντίστοιχο πηγάδι τα έµβρυα προσέχοντας πάντα να µη µεταφέρουµε ταυτόχρονα και ποσότητα από το blocking solution. Τα έµβρυα επωάζονται παρουσία του επιθυµητού αντισώµατος σε κατάλληλη συγκέντρωση αυτού, καθ όλη τη διάρκεια της νύχτας, στους 4 ο C. Την επόµενη µέρα ακολουθεί µεταφορά των εµβρύων στα αντίστοιχα πηγαδάκια των σειρών 4, 5, και 6 µε σκοπό την έκπλυση των εµβρύων από το διάλυµα του αντισώµατος. Στα πηγαδάκια της σειράς 7 µεταφέρουµε από 10 λ δ/τος του δευτερογενούς αντισώµατος (anti-rabbit σηµασµένου µε φθοριόχρωµα FITC) σε PBS (1x), κατάλληλης συγκέντρωσης. Ακολουθεί και πάλι µεταφορά των εµβρύων στα αντίστοιχα πηγαδάκια των σειρών 8, 9, 10 και 11 µε σκοπό την έκπλυση των εµβρύων από το διάλυµα του δευτερογενούς αντισώµατος. Τελικά, τα έµβρυα µεταφέρονται στα πηγαδάκια της σειράς 12 καθ ένα από τα οποία φέρει 10 λ δ/τος 50% γλυκερόλη σε PBS (1x). Στο διάλυµα αυτό µπορούν να αποθηκευτούν για αρκετές µέρες. Με τη βοήθεια µικροσκοπίου φθορισµού ή συνεστιακού µικροσκοπίου τα έµβρυα µπορούν να παρατηρηθούν για φθορισµό.

52 Εκχύλιση πρωτεϊνών από ωοκύτταρα και έµβρυα του σταδίου των 16 κυττάρων. Η ανάλυση και µελέτη των πρωτεϊνών έγινε σε ολικά εκχυλίσµατα ωοκυττάρων. Κατά τη διαδικασία αυτή τα κύτταρα λύονται µε διάλυµα το οποίο περιέχει απορρυπαντικό, προκειµένου να σπάσουν οι µεµβράνες των κυττάρων, και αναστολείς πρωτεϊνασών για να προστατευθούν οι πρωτεΐνες από πρωτεολυτική διάσπαση. Κατόπιν, πραγµατοποιείται φυγοκέντρηση και το υπερκείµενο περιλαµβάνει το διαλυτό κλάσµα των ολικών πρωτεϊνών των κυττάρων. Η διαδικασία πραγµατοποιείται σε πάγο ή στους 4 0 C προκειµένου να ανασταλεί η δράση των πρωτεϊνασών και να παραταθεί η διατήρηση των πρωτεϊνών. Υλικά και διαλύµατα ιάλυµα οµογενοποίησης (Lysis buffer) ph 7,4 8 ml nhibitor cocteil 1 ml ml tock 250 mm, ph 8,0) 200 µl tock 10 mm) 100 µl (stock 100 mm) 100 µl Πειραµατική πορεία 1. Συλλογή ωαρίων σε falcon και φυγοκέντρηση αυτών στις 4000 rpm για 5 min στους 4 ο C. 2. Απόρριψη υπερκείµενου θαλασσινού νερού. 3. Στα καθιζάνοντα ωάρια (περίπου 1 ml) προστίθενται 5 ml διαλύµατος οµογενοποίησης. 4. Μεταφορά του µείγµατος σε οµογενοποιητή για οµογενοποίηση. 5. Το οµογενοποίηµα φυγοκεντρείται στα g για 15 min, στους 4 0 C. 6. Λήψη του υπερκειµένου οµογενοποιήµατος. Το οµογενοποίηµα χρησιµοποιείται άµεσα ή διατηρείται µέχρι 2 µήνες στους C ή για µεγαλύτερο χρονικό διάστηµα στους 80 ο C. 1.8 Εκτίµηση της συγκέντρωσης πρωτεϊνών σε διάλυµα Η εύρεση της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών που περιέχονται σε ένα διάλυµα γίνεται εύκολα µε χρωµατοµετρικές µεθόδους, ή µε τη µέτρηση της οπτικής απορρόφησης των δειγµάτων σε µήκος κύµατος 280 nm. Οι µέθοδοι Bradford και Lowry χρησιµοποιούνται πιο συχνά για τον υπολογισµό µικροµοριακών ποσοτήτων πρωτεϊνών. Τα τελευταία χρόνια ως µέθοδος εκλογής χρησιµοποιείται η µέθοδος Bradford, λόγω της

53 46 ευκολίας και της ταχύτητας µε την οποία µπορεί να πραγµατοποιηθεί. Η µέθοδος αυτή εξαρτάται από τη δέσµευση της χρωστικής Coomasie G- 250, κυρίως στα βασικά αµινοξέα των πρωτεϊνών, αλλάζοντας ταυτόχρονα το µήκος κύµατος της µέγιστης απορρόφησης τους. Η δέσµευση αυτή είναι ανάλογη του ποσού των πρωτεϊνών (Bradford 1976). Με τη µέθοδο Bradford µπορεί να µετρηθεί συγκέντρωση πρωτεϊνών από µg. Για τον υπολογισµό της συγκέντρωσης αγνώστου δείγµατος χρησιµοποιείται πρότυπη καµπύλη, η οποία κατασκευάζεται µε τη βοήθεια γνωστών συγκεντρώσεων της πρωτεΐνης αλβουµίνης ορού βοός (BSA). Θα πρέπει να σηµειωθεί ότι η πρότυπη πρωτεΐνη διαλύεται σε ίδιας σύστασης ρυθµιστικό διάλυµα, στο οποίο είναι διαλυµένες οι άγνωστες πρωτεΐνες. Υλικά και διαλύµατα Αντιδραστήριο Bradford Coomasie G-250 H 3 PO 4 85% Αιθανόλη 95% Απεσταγµένο H 2 O NaOH 1N 20 mg 20 ml 10 ml 170 ml 10 ml Πειραµατική πορεία 1. Σε σωλήνες τύπου eppendorf προστίθεται µία ποσότητα από το άγνωστο διάλυµα (µέχρι όγκου 10 µl) ή το πρότυπο διάλυµα BSA. 2. Προσθήκη 1 ml αντιδραστηρίου Bradford σε κάθε σωλήνα και έντονη ανάδευση (vortex). 3. Επώαση των δειγµάτων σε θερµοκρασία δωµατίου για 5 λεπτά. 4. Μέτρηση της οπτικής απορρόφησης των δειγµάτων σε φασµατοφωτόµετρο, σε µήκος κύµατος 595 nm. 5. Υπολογισµός της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών στο άγνωστο δείγµα γίνεται µε τη βοήθεια πρότυπης καµπύλης κατασκευασµένης µε τη βοήθεια γνωστών συγκεντρώσεων BSA. 1.9 Ανοσοκατακρήµνιση (IP) Η πρωτεϊνική κατακρήµνιση αναφέρεται στο σχηµατισµό πρωτεϊνικών συσσωµατωµάτων τα οποία µπορούν να αποµονωθούν µέσω φυγοκέντρησης. Οι σφαιρίνες (globular proteins) µπορούν να κατακρηµνιστούν σε υδατικά διαλύµατα µε την προσθήκη άλατος (π.χ. ammonium sulfate), οργανικού διαλύτη (π.χ. ακετόνη), οργανικών πολυµερών (π.χ. polyethylene glycol) ή µε trichloroacetic acid. Ωστόσο το πρόβληµα που ανακύπτει από τη χρήση τέτοιων παραγόντων σ ένα

54 47 µείγµα πρωτεϊνών είναι ότι συνήθως περισσότερες από µια πρωτεΐνες του µείγµατος θα κατακρηµνιστούν. Η ανοσοκατακρήµνιση αποτελεί µία µορφή χρωµατογραφίας συγγένειας και περιλαµβάνει πολλά βήµατα: λύση των κυττάρων µε απορρυπαντικό αν το αντιγόνο (συνήθως πρωτεΐνη) που θέλουµε να κατακρηµνίσουµε είναι δεσµευµένο σε µεµβράνη, δέσµευση του συγκεκριµένου αντιγόνου στο αντίστοιχο αντίσωµά του, κατακρήµνιση του συµπλόκου αντιγόνου αντισώµατος, ξέπλυµα του κατακρηµνίσµατος και αποδέσµευση του αντιγόνου από το ανοσοσύµπλοκο. Το αποδεσµευµένο αντιγόνο αναλύεται στη συνέχεια µε ηλεκτροφορητικές µεθόδους. Εξαιτίας της υψηλής ειδικότητάς τους, τα αντισώµατα µπορούν να χρησιµοποιηθούν για την αποµόνωση συγκεκριµένων αντιγόνων τα οποία είναι µικρότερα συστατικά ενός συσσωµατώµατος, όπως είναι το πρωτεϊνικό εκχύλισµα κυττάρων. Πριν από την αποµόνωση, οι µεµβρανικές πρωτεΐνες πρέπει να διαλυτοποιηθούν µε τη βοήθεια απορρυπαντικών. Τα µη ιοντικά απορρυπαντικά προτιµούνται από τα χολικά άλατα (bile salts) µιας και τα τελευταία κατακρηµνίζονται σε όξινο ph ή παρουσία δισθενών κατιόντων. Τόσο τα πολυκλωνικά αντισώµατα όσο και τα µονοκλωνικά µπορούν να επιστρατευτούν για την πραγµατοποίηση ανοσοκατακρήµνισης. Τα µονοκλωνικά αντισώµατα δεν κατακρηµνίζονται συνήθως, όπως τα περισσότερα πολυκλωνικά αντισώµατα σε χαµηλές συγκεντρώσεις του αντιγόνου. Έτσι, ένα sandwich reagent χρησιµοποιείται για να κατακρηµνίσει ή να αποµονώσει το σύµπλοκο αντιγόνου-αντισώµατος. Το sandwich reagent µπορεί να είναι ορός anti-ig, affinity purified ή µονοκλωνικά anti-ig, Staphylococcus protein A Streptococcus protein G δεσµευµένα σε Sepharose ή σε S. aureus Cowan strain II cells. Πρωτεΐνη Α Η πρωτεΐνη Α είναι µια πρωτεΐνη επιφανείας µεγέθους ΚDa που εντοπίζεται στο κυτταρικό τοίχωµα του βακτηρίου Staphylococcus aureus. Εµφανίζει ευρύτατη χρήση σε ποικίλες βιοχηµικές διεργασίες λόγω της ικανότητάς της να δεσµεύει ανοσοσφαιρίνες. εσµεύει πολλές πρωτείνες που εντοπίζονται σε διάφορα είδη θηλαστικών, µε πιο αξιοσηµείωτες τις IgG ανοσοσφαιρίνες. Πιο αναλυτικά δεσµεύεται στην Fc περιοχή των ανοσοσφαιρινών µέσω αλληλεπιδράσεων µε την βαριά αλυσίδα. Το αποτέλεσµα αυτής της δέσµευσης είναι η παρεµπόδιση της ωψονοποίησης και της φαγοκυττάρωσης, µιας και τα αντισώµατα του ορού δεσµεύονται, ναι µεν, µε αυτόν τον τρόπο στη επιφάνεια των βακτηριακών κυττάρων, αλλά µε φορά αντίθετη από αυτήν που θα

55 48 οδηγούσε, µέσω των παραπάνω διεργασιών, στην παρεµπόδιση του παθογόνου παράγοντα. Η πρωτεΐνη Α δεσµεύεται µε υψηλή συγγένεια στις ανθρώπινες υποκλάσεις IgG1 και IgG2 καθώς και στις υποκλάσεις του ποντικού IgG2a και IgG2b. Από την άλλη πλευρά δεσµεύεται ασθενώς στις ανθρώπινες κλάσεις των ανοσοσφαιρινών IgA, IgΜ και IgΕ ενώ το ίδιο ισχύει για τις υποκλάσεις του ποντικού IgG3 και IgG1. Τέλος δεν αλληλεπιδρά καθόλου µε τις ανθρώπινες ανοσοσφαιρίνες IgD και IgG3 ή µε τις ανοσοσφαιρίνες του ποντικού IgA, IgΜ και IgΕ. Εκτός από την πρωτεΐνη Α και άλλες βακτηριακές πρωτεΐνες που δεσµεύουν ανοσοσφαιρίνες όπως η πρωτεΐνη G, η πρωτεΐνη Α/G και η πρωτεΐνη L, έχουν χρησιµοποιηθεί για τον καθαρισµό, την ακινητοποίηση και την ανίχνευση ανοσοσφαιρινών. Πρωτόκολλο ΙΡ Protein A sepharose from Staphylococcus aureus Lyophilized powder, 1,5 gr Το 1 gr σκόνης τυπικά διογκώνεται κατά την ενυδάτωση µε το buffer A εως τα 4 ml. Sigma P-3391 Binding capacity: 20 mgr/ml Buffer A: 0,02 M NaH2PO4 2,4 gr 0,15 M NaCL 8,8 gr V τελικό= 1000 ml Το ρη ρυθµίζεται στο 8, gr της παραπάνω σκόνης µεταφέρονται σε eppendorf. Στο ίδιο eppendorf µεταφέρονται ακολούθως, 200 µl από το buffer A. Τα σφαιρίδια της σεφαρόζης αφήνονται να εµποτιστούν µε νερό σε θερµοκρασία δωµατίου, για τουλάχιστον 30 λεπτά.!!! Τα σφαιρίδια δεν πρέπει να αναδευτούν έντονα µε τη χρήση κανενός µηχανικού αναδευτήρα. 1. Για να προετοιµάσουµε τα σφαιρίδια σεφαρόζης-πρωτεΐνης Α, αφαιρούµε το υπερκείµενο buffer A και εµποτίζουµε τα σφαιρίδια σε 400 λ PBS (1x). Αφού τα σφαιρίδια καθιζάνουν το υπερκείµενο αφαιρείται και τα σφαιρίδια επαναιωρούνται και πάλι σε 400 λ PBS (1x). Αφού αφαιρεθεί εκ νέου το υπερκείµενο, στα σφαιρίδια τελικά προστίθενται 400 λ PBS (1x) µε 0,1 % sodium azide. Το αζίδιο του νατρίου δρα ως συντηρητικό παρεµποδίζοντας την ανάπτυξη µικροβίων. Τελικά, από το υπερκείµενο αφαιρούνται περίπου 200 λ µε σκοπό να διατηρήσουµε τα σφαιρίδια σε ένα περιβάλλον PBS (1x) 50%.

56 49!!! Είναι απαραίτητο να κόψουµε το ρύγχος της πιπέτας όταν χειριζόµαστε τα σφαιρίδια για να µην αποδιοργανωθούν αυτά. 2. Κατόπιν, προσδιορίζουµε τη συγκέντρωση του κυτταρικού οµογενοποιήµατος. Η ολική πρωτεΐνη του δείγµατος ποσοτικοποιείται µε τη µέθοδο Bradford.!!! Αν χρησιµοποιηθεί η τεχνική Bradford, τότε το κυτταρικό οµογενοποίηµα πρέπει να αραιωθεί τουλάχιστον 1: 10 πριν καθοριστεί η πρωτεϊνική συγκέντρωση λόγω της παρεµβολής των απορρυπαντικών που περιέχονται στο λυτικό διάλυµα µε τη χρωστική Coomassie µgr από το κυτταρικό οµογενοποίηµα (συγκέντρωση τρέχοντος δείγµατος 15 µgr/µl, δηλαδή περίπου 330 λ) προστίθενται σε eppendorf και αραιώνεται µέχρι όγκου 500 µl µε ρυθµιστικό διάλυµα PBS (1x). Το κυτταρικό οµογενοποίηµα αραιώνεται µε αυτόν τον τρόπο σε συγκέντρωση ίση µε 10 µgr/µl, για να µειώσουµε τη συγκέντρωση των απορρυπαντικών του διαλύµατος λύσης. Επίσης, ένα πιο συγκεντρωµένο κυτταρικό οµογενοποίηµα, δηλ. 10 µgr/µl και όχι 1 µgr/µl) ίσως να είναι απαραίτητο για να ανοσοκατακρηµνίσουµε µια πρωτεΐνη που βρίσκεται σε χαµηλά επίπεδα σ έναν κυτταρικό τύπο. 4. Ακολούθως προστίθενται 100 λ δ/τος PBS (1x) 50% σφαιριδίων σεφαρόζης συζευγµένων µε πρωτεΐνη. Το µείγµα επωάζεται στους 4 ο C για 10 min σε rocker.!!! Με τον τρόπο αυτό ελαττώνεται το µη ειδικό δέσιµο πρωτεϊνών σφαιριδίων, όταν αυτά θα χρησιµοποιηθούν αργότερα στη διαδικασία της ανοσοκατακρήµνισης. 5. Αποµακρύνουµε τα σφαιρίδια πρωτείνης Α ή G µε φυγοκέντρηση στα 2000 g, στους 4 ο C, για 3min. Το υπερκείµενο συλλέγεται και µεταφέρεται σε eppendorf. 6. Στη συνέχεια, προσθέτουµε τον ενδεικνυόµενο όγκο από το αντίσωµα στο υπερκείµενο του προηγούµενου σταδίου. Η βέλτιστη ποσότητα αντισώµατος που θα ανοσοκατακρηµνίσει ποσοτικά την πρωτεΐνη που µας ενδιαφέρει, πρέπει να καθοριστεί πειραµατικά. 2 µgr antibody H-60 (200 µgr/ml δηλ. 10 λ). 7. Το κυτταρικό οµογενοποίηµα και το αντίσωµα αναδεύονται ήπια σε rocker για 2 hrs, στους 4 ο C. 8. Το ανοσοσύµπλοκο αιχµαλωτίζεται προσθέτοντας 20 µl σφαιριδίων σεφαρόζης µε πρωτεΐνη Α και ήπια αναδεύουµε αυτά σε rocker overnight, στους 4 ο C. 9. Συλλέγουµε τα σφαιρίδια σεφαρόζης µε φυγοκέντρηση στα 2000 g, για 3 min, στους 4 ο C.

57 50!!!Το υπερκείµενο δεν απορρίπτεται (όγκος υπερκείµενου περίπου 500 λ) αλλά συλλέγεται και προστίθενται σ αυτό 400 λ SB (2x) και 100 λ DTT. Το υπερκείµενο κατόπιν βράζεται 5 min, για να αποθηκευτεί ακολούθως στους -20 ο C, εφόσον δεν χρησιµοποιηθεί άµεσα. Τα σφαιρίδια που συλλέξαµε µε τη φυγοκέντρηση ξεπλένονται δύο φορές µε 1000 λ PBS (1x). Για τη συλλογή των σφαιριδίων το δείγµα φυγοκεντρείται στα 2000g για 3 min, στους 4 ο C. 10. Επαναιωρούµε τα σφαιρίδια µε το ανοσοσύµπλοκο σε 80 λ SB (2x) και 20 λ DTT και αναµειγνύουµε ήπια. Η ποσότητα αυτή θα διανεµηθεί περίπου 10 lanes. 11. Τα σφαιρίδια αγαρόζης/ σεφαρόζης βράζονται 5 min για να αποχωριστεί το ανοσοσύµπλοκο από τα σφαιρίδια. Τα σφαιρίδια συλλέγονται µε φυγοκέντρηση και το υπερκείµενο χρησιµοποιείται για SDS-PAGE. Εναλλακτικά αυτό µπορεί να µεταφερθεί σε eppendorf και να καταψυχθεί στους -20 ο C για να χρησιµοποιηθεί αργότερα.!!! Τα καταψυγµένο υπερκείµενο πρέπει να βρασθεί ξανά για 5 min λίγο πριν φορτωθεί στο gel. 2.0 EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) Πρόκειται για µέθοδο ανίχνευσης αλληλεπιδράσεων µεταξύ πρωτεϊνικών παραγόντων µε νουκλεοτιδικές αλληλουχίες. Αρχή της µεθόδου είναι η παρατήρηση ότι τα σύµπλοκα πρωτεϊνών-dna µεταναστεύουν πιο αργά σε µη αποδιατακτικά πηκτώµατα πολυακρυλαµιδίου ή αγαρόζης, σε σύγκριση µε τα ελεύθερα µόρια DNA. Η EMSA χρησιµοποιείται για την ποιοτική ανίχνευση ειδικών αλληλουχιών που δένουν στο DNA (όπως µεταγραφικοί παράγοντες) σε διαλύµατα και, σχετικά µε τη µεταλλαξιγένεση, για να ανιχνευτούν σηµαντικές αλληλουχίες πρόσδεσης µέσα σε ρυθµιστικές περιοχές συγκεκριµένων γονιδίων. Η ικανότητα να αναλυθούν τα σύµπλοκα DNA-πρωτεϊνών εξαρτάται σε ένα µεγάλο βαθµό από τη σταθερότητα του συµπλόκου για ένα συγκεκριµένο χρόνο (κατά προσέγγιση ενός λεπτού) καθώς µεταναστεύει στο πήκτωµα. Οι ειδικές για τις αλληλουχίες αλληλεπιδράσεις είναι παροδικές και σταθεροποιούνται από την αναλογία χαµηλών ιονικών δυνάµεων στο χρησιµοποιούµενο διάλυµα ηλεκτροφόρησης. Καθώς τα συµπλέγµατα των πρωτεϊνών εισέρχονται µέσα στο πήκτωµα γρήγορα διαχωρίζονται από το ελεύθερο DNA και σαν αποτέλεσµα είναι το πάγωµα της ισορροπίας µεταξύ ελεύθερου και δεσµευµένου DNA. Μέσα στο πήκτωµα, τα σύµπλοκα µπορεί να σταθεροποιηθούν από διάφορους παράγοντες του δικτύου του πηκτώµατος, µε αποτέλεσµα αν

58 51 διαχωριστούν, η τοπική τους συγκέντρωση να διατηρηθεί υψηλή και να προωθηθεί η ταχεία επανασύνδεσή τους. Μη ειδικοί ανταγωνιστές Οι µη ειδικοί ανταγωνιστές όπως poly (di / dc) και poly (da / dt) χρησιµοποιούνται στις αντιδράσεις σύνδεσης προκειµένου να περιοριστεί το δέσιµο µη ειδικών πρωτεϊνών στο σηµασµένο ραδιενεργά DNA στόχο. Αυτά τα ανταγωνιστικά πολυµερή παρέχουν µια περίσσεια µη ειδικών θέσεων για την πρόσδεση πρωτεϊνών σε πρωτογενή διαλύµατα που δένουν γενικά σε νουκλεοτιδικές αλληλουχίες. Η σειρά προσθήκης των συστατικών είναι σηµαντική. Για να αυξηθεί η αποτελεσµατικότητα της µεθόδου ο DNA ανταγωνιστής πρέπει να προστεθεί µαζί µε το εκχύλισµα και πριν από την προσθήκη του ανιχνευτή. Εκτός από τα poly (di / dc) και άλλους µη ειδικούς ανταγωνιστές, µια ειδική µη σηµασµένη αλληλουχία ανταγωνιστή µπορεί να προστεθεί στο διάλυµα αντίδρασης. Προσθήκη περίσσειας (200x) της αλληλουχίας που µελετάµε αλλά µη σηµασµένης είναι ικανή να εξουδετερώσει αποτελεσµατικά τις ειδικές αλληλεπιδράσεις, πιστοποιώντας ταυτόχρονα την ειδικότητά τους. Στη πραγµατικότητα κάθε ανιχνεύσιµο (λόγω πρόσδεσης του σηµασµένου ανιχνευτή) δέσιµο θα πρέπει να προσδιορίζεται (αν όχι να εξαλείφεται) από την περίσσεια µη σηµασµένων µορίων του που δρουν ανταγωνιστικά. Συστατικά της αντίδρασης δεσίµατος Οι παράγοντες που επιδρούν στη σταθερότητα και την ειδικότητα της σύνδεσης πρωτεΐνης-dna είναι η ιοντική ισχύς και το ph του διαλύµατος στο οποίο πραγµατοποιούνται οι αλληλεπιδράσεις, η παρουσία µη ιονικών απορρυπαντικών, γλυκερόλης ή µεταφορέων πρωτεϊνών (π.χ BSA), η παρουσία / απουσία δισθενών κατιόντων (π.χ Mg 2+ ή Zn 2+ ), η συγκέντρωση και ο τύπος του DNA ανταγωνιστή, η θερµοκρασία και ο χρόνος που πραγµατοποιείται η αντίδραση. Ηλεκτροφόρηση Μη αποδιατακτικά πηκτώµατα TBE - polyacrylamide ή TAE - agarose χρησιµοποιούνται για να ανιχνευθούν τα σύµπλοκα DNA - πρωτεϊνών από το ελεύθερο DNA. Η συγκέντρωση των πηκτωµάτων εξαρτάται από το µέγεθος του DNA - στόχου, τον αριθµό και το φορτίο των πρωτεϊνών που δένουν σε αυτό. Ακόµη, η σύσταση του πηκτώµατος καθορίζεται ανάλογα µε το µήκος του ολιγονουκλεοτιδιου. Για παράδειγµα, σε µήκος από 150bp-500bp η συγκέντρωση του πηκτώµατος ακρυλαµιδίου είναι 5%, ενώ για 30bp-150bp 10%. Τα πηκτώµατα προηλεκτροφορούνται σε σταθερή τάση µέχρι να σταθεροποιηθεί η

59 52 ένταση του παρεχόµενου ρεύµατος. Οι βασικοί λόγοι για την προηλεκτροφόρηση είναι η αποµάκρυνση της περίσειας AP (χρησιµοποιείται για την κατασκευή του πηκτώµατος), η σταθεροποιήση οποιουδήποτε ειδικού παράγοντα ή ιόντος έχει προστεθεί στο διάλυµα ηλεκτροφόρησης και η διατήρηση σταθερής θερµοκρασίας στο πήκτωµα. Υλικά - όργανα Πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου 9 % (για συσκευή ηλεκτροφόρησης 45 ml) - TBE (5x) 9 ml - ιάλυµα stock acryl 13.5 ml (30% 30:0,6 ακρυλαµίδιο - bis ακρυλαµίδιο) - mmq H 2 O 22.5 ml - AP 300 λ - TEMED 15 λ-18 λ (ανάλογα µε την θερµοκρασία δωµατίου) Running buffer 1x TBE Παραγωγή δίκλωνων τµηµάτων του στοιχείου απόκρισης Υλικά - όργανα - Forward και Reversed primer - συµπληρωµατικά ολιγονουκλεοτίδια - για κάθε ένα από τα στοιχεία απόκρισης που θέλουµε να παραχθεί. - mq H 2 O - SSC 10x - Υδατόλουτρο - Πορεία Αντίδραση υβριδοποίησης Σε eppendorf προστίθενται : µl από το κάθε oligo Reversed µl από το κάθε oligo Forward µl H 2 O (mq) 4. 4 µl, 20x SSC Ο τελικός όγκος της παραπάνω αντίδρασης είναι 40 µl. Επωάζουµε τα δείγµατά µας για 1 min στους 100 ο C. Στη συνέχεια, επωάζουµε ξανά τα δείγµατά µας, αυτή τη φορά στο υδατόλουτρο, για 5 min στους 70 ο C. Μετά το πέρας των 5 min, κλείνουµε το υδατόλουτρο και αφήνουµε τα δείγµατά µας σε αυτό µέχρι η θερµοκρασία να φτάσει τους 35 ο C (η χρονική διάρκεια της παραπάνω διαδικασίας είναι 2-2,5 h). Τέλος, αποθηκεύουµε τα δείγµατά µας στους -20 ο C. Αντίδραση κινάσης - Σήµανση µε 32 P-γ-ATP

60 53 Η Τ 4 Polynucleotide Kinase καταλύει τη µεταφορά του γ-atp από το ATP στο 5 άκρο του νουκλεοτιδίου. Σηµειώνουµε ότι, τα παραπάνω συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια έχουν -OH στο 5 άκρο τους και όχι -P. Ιδιαίτερα προσεκτικοί πρέπει να είµαστε όταν χειριζόµαστε τη ραδιενέργεια. Συγκεκριµένα, φοράµε πάντα γάντια, οι εργασίες γίνονται πίσω από την ασπίδα, φυλάσσουµε τα ραδιενεργά δείγµατά µας σε ειδική φωλιά και τα απορρίµµατά µας τα πετάµε σε ειδικό µέρος. Υλικά - όργανα - T 4 Polynucleotide Kinase - Buffer κινάσης 10x - 32 P-γ-ATP - δίκλωνες αλληλουχίες DNA Πορεία Για κάθε έναν από τους ανιχνευτές που είναι αναγκαίο να κατασκευαστούν χρησιµοποιήθηκαν : - ds DNA : 1µl (µε συγκέντρωση 10pmole/µl) - Kinase buffer 10x : 1µl - T 4 Polynucleotide Kinase : 1µl - mq H 2 O : 6µl - 32 P-γ-ATP : 1µl Ο τελικός όγκος της παραπάνω αντίδρασης είναι 10 µl. Επωάζουµε τα δείγµατά µας σε υδατόλουτρο για 1h στους 37 ο C. (Έπειτα από την επώαση ακολουθεί φυγοκέντρηση σε περίπτωση που έχει εξατµιστεί ποσότητα δείγµατος). Στη συνέχεια, αυξάνουµε τον όγκο της αντίδρασης στα 50 µl - προσθέτοντας 40 µl mq H 2 O - και περνάµε τα δείγµατά µας από κολωνίτσα Sephadex G Καθαρισµός των δειγµάτων µας µε κολωνίτσες Sephadex G - 50 Υλικά - όργανα - eppendorfs µε τα δείγµατά µας - Sephadex G-50 - Κολώνες Μicrospin της Pharmacia Biotech - Σωληνάρια eppendorfs - Αυτόµατες πιπέτες - Φυγόκεντρος - Πορεία 1) Σε κολώνες Μicrospin της Pharmacia Biotech τοποθετηµένες σε eppendorfs µεταφέρθηκε ποσότητα Sephadex G-50 µε τη βοήθεια πιπέτας Pasteur.

61 54 2) Αφήσαµε τη Sephadex να πακεταριστεί στη κολωνίτσα για µερικά λεπτά. Απορρίπτουµε τυχόν H 2 O που έχει µείνει πάνω από τη Sephadex που έχει πακεταριστεί. 3) Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1 min στις 3000 rpm ώστε να αποµακρυνθεί το H 2 O και να πακεταριστεί το υλικό στις κολώνες. 4) Στη συνέχεια, απορρίφθηκαν τα eppendorfs και οι κολώνες τοποθετήθηκαν σε καθαρά eppendorfs. 5) Σε κάθε κολώνα προστέθηκε προσεκτικά - στο κέντρο και χωρίς να τρυπήσουµε την κολώνα - το δείγµα µας (49 µl απ το δείγµα µας). 6) Ακολούθησε φυγοκέντρηση για 2 min στις 3000 rpm και απορρίφθηκαν οι κολώνες. 7) Ογκοµετρούµε την ποσότητα των δειγµάτων µας που παίρνουµε στα eppendorfs. 8) Οι ανιχνευτές µας είναι πλέον έτοιµοι (αφού βέβαια πραγµατοποιήσουµε τις ανάλογες αραιώσεις) να χρησιµοποιηθούν στις αντιδράσεις EMSA. * Σηµειώνουµε ότι στο 1 µl που δεν περάσαµε από την κολωνίτσα Sephadex, προσθέσαµε 1-1,5 ml υγρού σπινθηρισµού (LSF liquid scintillation fluid) και µετρήσαµε την ολική ραδιενέργεια πριν την αντίδραση. Τα υπόλοιπα 49 µl απ το δείγµα µας τα περάσαµε από κολωνίτσα, πήραµε 1 µl και από το υλικό αυτό και προσθέσαµε 1-1,5 ml υγρού σπινθηρισµού και µετρήσαµε την ραδιενέργεια του δείγµατος µετά την αντίδραση. Αντιδράσεις πρόσδεσης πρωτεϊνών σε ραδιενεργά σηµασµένα στοιχεία απόκρισης Υλικά - όργανα 5x binding buffer : 100 mm Hepes ph = mm KCl 10 mm DTT 25 mm MgCl 2 40% Glycerol 6x χρωστική : 0.25% bromophenol blue 0.25% Xylene cyanol σε ddh 2 O ddh 2 O ραδιενεργοί ανιχνευτές πυρηνικό εκχύλισµα (Nuclear extract) ειδικοί ανταγωνιστές poly (di / dc) και poly (da / dt) σε συγκέντρωση 2µg/µl

62 55 Πορεία Αφού µετρήσουµε την ολική ραδιενέργεια πριν και τη ραδιενέργεια του δείγµατός µας µετά την αντίδραση κινάσης κάνουµε τις κατάλληλες αραιώσεις έτσι ώστε η ποσότητα του ανιχνευτή που προσθέτουµε σε κάθε αντίδραση να αντιστοιχεί σε cpm. Οµοίως, πραγµατοποιούµε και τους ανάλογους υπολογισµούς προκειµένου η ποσότητα του ειδικού ανταγωνιστή (µη ραδιενεργός) που προσθέτουµε να είναι να είναι τέτοια ώστε ανάλογα µε την αντίδραση ο ειδικός ανταγωνιστής να είναι σε περίσεια 100x, 250x και 500x. Σηµειώνουµε ότι, οι παρακάτω αντιδράσεις πραγµατοποιούνται στο πάγο και ότι η σειρά µε την οποία βάζουµε τα συστατικά της αντίδρασης είναι σηµαντική. Πρώτα προσθέτουµε το mq H 2 O (ο όγκος που προσθέτουµε εξαρτάται από την αντίδραση έτσι ώστε ο συνολικός όγκος της κάθε αντίδρασης να είναι τα 15 µl), έπειτα το binding buffer (3 µl σε κάθε αντίδραση), τα poly (di / dc) και poly (da / dt) (1 µl σε κάθε αντίδραση), τον ειδικό ανταγωνιστή (1 µl σε συγκεκριµένες αντιδράσεις) και τον ανιχνευτή µας (1 µl σε κάθε αντίδραση). Ακολουθεί ήπια ανάδευση. Τελευταίο προσθέτουµε το πυρηνικό εκχύλισµα (2 µl σε κάθε αντίδραση εκτός από την πρώτη αντίδραση, η οποία και χρησιµεύει για να ανιχνέυσουµε την ηλεκτροφορητική θέση του DNA στο πήκτωµα), αναδεύουµε ήπια και αφήνουµε τις αντιδράσεις µας στον πάγο για 20 min. Έπειτα από το πέρας αυτού του χρονικού διαστήµατος προσθέτουµε σε κάθε µια από τις αντιδράσεις µας 1,5 µl χρωστικής, φορτώνουµε τα δείγµατά µας στα φρεάτια του πηκτώµατος και ακολουθεί ηλεκτροφόρηση. Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης µεταφέρουµε το πήκτωµα σε χαρτί watman και ακολουθεί ξήρανση υπό κενό στους 60 ο C για 2 ώρες. Τέλος, εκθέτουµε το ξεραµένο πήκτωµα αφού πρώτα το περιβάλλουµε µε ζελατινώδη µεµβράνη στους -70 ο C σε x-ray film. Αυτοραδιογραφία Η αυτοραδιογραφία πραγµατοποιείται µε την τοποθέτηση και έκθεση του ξηραµένου πηκτώµατος σε φωτογραφικό φιλµ. Οι µέρες της έκθεσης διαφέρουν ανά περίπτωση. Πιο συγκεκριµένα, η specific activity των ανιχνευτών µας µειώνεται καθώς περνάει ο καιρός µε αποτέλεσµα να χρειάζεται µεγαλύτερη έκθεση των πηκτωµάτων µας. Ακόµη, οι µέρες έκθεσης εξαρτώνται από το αν η κασετίνα µε το πήκτωµά µας που τοποθετείται στους -70 ο C διαθέτει επιφάνεια ενίσχυσης του σήµατος.

63 56 Πίνακα1 Προετοιµασία δειγµάτων για πειράµατα EMSA SuperShift Mq H2O 4λ 6.5λ 4λ 4λ 4λ 4λ C1R 0,5λ 0,5λ 0,5λ 0,5λ 0,5λ 0,5λ Polyd (1µgr/µL) 1λ 1λ 1λ 1λ 1λ 1λ bb (5x) 2λ 2λ 2λ 2λ 2λ 2λ Wg 2,5λ Μικρή υποµ ,5λ Μικρη υποµ. + s.c ,5λ+1λ - - Μικρή υποµ. + anti- COUP ,5λ+1λ - Μικρη υποµ. + Η ,5λ+1λ

64 57 Μελέτη της αλληλεπίδρασης COUP-TF - CTIP Εισαγωγή Στο πρώτο µέρος της παρούσας µεταπτυχιακής διατριβής, ο στόχος µας ήταν να διερευνήσουµε το πρότυπο έκφρασης της πρωτεΐνης COUP- TF Interactive Protein (CTIP) στα πρώιµα αναπτυξιακά στάδια του αχινου Paracentrotus lividus µε τη µέθοδο του ανοσοφθoρισµού και να συγκρίνουµε το πρότυπο αυτό µε το πρότυπο έκφρασης του COUP-TF και ταυτόχρονα να ελέγξουµε αν οι δύο αυτοί µεταγραφικοί παράγοντες αλληλεπιδρούν µέσω πειραµάτων ανοσοκατακρήµνισης. Όλες οι παραπάνω µεθοδολογίες απαιτούν τη χρήση αντισωµάτων τόσο έναντι του COUP-TF όσο και έναντι της πρωτεΐνης CTIP του αχινού P. lividus. Ένα πρώτο και πολύ σηµαντικό βήµα ήταν λοιπόν η αποµόνωση του γονιδίου αυτού στο συγκεκριµένο αχινό, µε απώτερο στόχο να αποµονώσουµε την πρωτεΐνη CTIP και να παράγουµε αντισώµατα έναντι αυτής. Με σκοπό να αποµονώσουµε το γονίδιο CTIP, η προπτυχιακή φοιτήτρια Γούβη Γεωργία πήρε την αλληλουχία αυτού από το ποντίκι και αναζήτησε, µε τη βοήθεια των βάσεων δεδοµένων, τόσο στο ανθρώπινο γονιδίωµα όσο και σε αλλά θηλαστικά συντηρηµένες περιοχές. Η έρευνα επεκτάθηκε πέρα από το φύλο των χορδωτών και σε άλλους οργανισµούς των οποίων το γονιδίωµα έχει αλληλουχηθεί και αποτελούν αντιπροσωπευτικά δείγµατα για το εκάστοτε φύλο. Ο αχινός Paracentrotus lividus δεν έχει αλληλουχηθει οπότε χρησιµοποιήθηκε η αλληλουχία του αχινού Strongylocentrotus purpuratus για να κατασκευαστούν εκκινητές (primers) µε στόχο την κλωνοποίηση της αντίστοιχης αλληλουχίας στον αχινό Paracentrotus lividus, ο οποίος και αποτελεί το διαθέσιµο πειραµατικό υλικό µας.

65 58 Εικόνα 1: Σύγκριση µέσω των δεδοµένων από τη βιβλιοθήκη του NCBI της κωδικής περιοχής του γονιδίου του Sp CTIP µε αυτό άλλων οργανισµών. Η παραπάνω εικόνα µας παραθέτει τις εξής πληροφορίες: 1. Συνολικό µέγεθος της κωδικής περιοχής του CTIP στον Strogylocentrotus purpuratus είναι 2807 νουκλεοτίδια, γεγονός το οποίο µεταφράζεται σε 934 αµινοξέα. Αν ο αριθµός αυτός των αµινοξέων πολλαπλασιαστεί µε το µέσο µοριακό βάρος των αµινοξέων τότε προκύπτει ότι το µοριακό βάρος της πρωτεΐνης CTIP στον S. purpuratus είναι περίπου 102 KDa. 2. Υπάρχουν δύο πολύ συντηρηµένες περιοχές, η πρώτη µεταξύ των νουκλεοτιδίων και η δεύτερη µεταξύ των νουκλεοτιδίων Οι περιοχές αυτές δεν είναι άλλες από τις περιοχές πρόσδεσης στο DNA (δάκτυλοι ψευδαργύρου). Σε µια πρώτη φάση έγινε προσπάθεια να αποµονωθεί ολόκληρο το γονίδιο του µεταγραφικού παράγοντα CTIP. Για το λόγο αυτό δηµιουργήθηκαν ζεύγη εκκινητών για το 5 και 3 άκρο αυτού,

66 59 στηριζόµενοι στην αλληλουχία του S.purpuratus. Οι εκκινητές που χρησιµοποιήθηκαν ήταν οι ακόλουθοι: AUG1 ATGTCACGCCGGAAGCAGGAC FORWARD PRIMER TGA1 TCACTTGGACAATCCCGATAGATCTG REVERCE PRIMER AUG2 GTCACGCCGGAAGCAGGACAA FORWARD PRIMER TGA2 ACTTGGACAATCCCGATAGACTGGC REVERCE PRIMER Από ωάρια του αχινού P. lividus αποµονώθηκε ολικό RNA και πραγµατοποιήθηκε RT-PCR. υστυχώς, όλες οι προσπάθειες χρησιµοποιώντας όλα τα δυνατά ζευγάρια εκκινητών και µεταβάλλοντας τη θερµοκρασία και τη συγκέντρωση του µαγνησίου, απέβησαν άκαρπες. Οι ατελέσφορες αυτές προσπάθειες οδήγησαν να επικεντρωθούµε σε πιο συντηρηµένες περιοχές. Στηριζόµενοι σ αυτές τις συντηρηµένες περιοχές δηµιουργήσαµε καινούρια ζεύγη εκκινητών, στα 5 και 3 άκρα αυτών, ειδικών για την αλληλουχία του S.purpuratus και πάλι. Οι εκκινητές που σχεδιάστηκαν ήταν οι ακόλουθοι: 1429 AAGCTAAAGCGACACATGAAGAC FORWARD PRIMER 2685 TAGAGTGCTGTAGACGGAAAAGG REVERCE PRIMER Από τη σειρά αυτή των πειραµάτων επετεύχθη η αποµόνωση της περιοχής του γονιδίου του µεταγραφικού παράγοντα CTIP που εκτεινόταν από τη θέση 1429 έως τη θέση Το µέγεθος της αλληλουχίας που κλωνοποιήθηκε ήταν 1191 νουκλεοτίδια. GAATTCACTAGTGATTAAGCTAAAGCGACACATGAAGACGCACATGAATAAACCACCATCAGCAATGGGATCAGCTCCAGACATGG ATGATAAGGATGGAAACAACAGCATGGAGGATGATGGGCATGAAGGATCAATGGGGATGCGGGATGGCAAGAATATGAGTGATAGC TCCTCTCCAGATGAGGAGGAGATGGAGGAGGAGGAAGAGGAAGAAGAGGATGAGGAGGAGAAAGAAGAAGAAGAGGAGGAAGAAGA GGAGGAAGAACCTGATGAGGCAGATATGATTGATATAAAACCAAAAAACCTTGGGAAGGAGGAGGAAGAAGAGAAAAGTGAGAAAT CTGAGGGTGAGGTCAAATCATCAGAAAGAGAGTTTGAAGATGAAGAGAAGGCCAAGCAAAGGAGGCCATCCAGCACTGAAATTGAT CATCTGAAAAATATGAGCAGAACTAGTCCGAAAGATGCATCCCATCATCCTTCTTCATTGTTGTGTGAGATGATGGTCAATTCTGG ATTAGATGAAATTCAGCAATACAGCGAGGCTTTCAAGCAGGCTATAGCAGAGCGAAATATAATATTTGGAAAGCCTCGATCGTCAA GTGATGTATCATCACCAGAAAACCATCAGCCACGCAATTCTAACAGCAGGCCTCCTTCAAGACCACATGATCACCATAGTCCAATT GAAGCAGGTTTGATAGCCAGATTACGAGCAGAGCAAATTCTACAAGCCAACCACCATATGGCAGAGCGTAACAATTTGTCTGACTT GGAACTGGTGACCAATCGCATCAAAATGGAGCCAGTAACATCTTGGCCACCTTCACCTTTAGCAATACACAGAGAACCACTCATGT CATCACCCGTCCGCTCTGATGCCAGCCCACTCGGAACACCCAATGGCGGTCCAGCTGCTTTCTTTGCTCAACGTCATTTCATGGAA TCCAACGGGGCCATGTCGTCTAATGCCATACTGCCGTACAACAGTCCTCCTAACAGGATGAAGCCCCATAGATCGAGTGATAAGCG AAGTGACACCTGCGAGTTCTGCGGGAAGCAGTTCAAGAATTGCAGCAACTTGACAGTTCATCGTCGCTCGCACACCGGAGAGAAGC CCTACAAGTGTCAGCTGTGTTCCTATGCGTGCGCCCAGAGCAGCAAGCTAACCCGTCACATGAAGACCCACGGTCATGGTGCCAAA GAGGTCTTCAAGTGTGAGGTCTGCAACATGCCCTTTTCCGTCTACAGCACTCTAAATSGAATTC Εικόνα 2: Η νουκλεοτιδική αλληλουχία του των 1191 νουκλεοτιδίων που αποµονώθηκαν από το γονίδιο του CTIP.

67 60 Η αλληλουχία αυτή αποτελούσε ένα ανοιχτό αναγνωστικό πλαίσιο και έδινε την ακόλουθη αµινοξική αλληλουχία: 5 atgaataaaccaccatcagcaatgggatcagctccagacatggat M N K P P S A M G S A P D M D 50 gataaggatggaaacaacagcatggaggatgatgggcatgaagga D K D G N N S M E D D G H E G 95 tcaatggggatgcgggatggcaagaatatgagtgatagctcctct S M G M R D G K N M S D S S S 140 ccagatgaggaggagatggaggaggaggaagaggaagaagaggat P D E E E M E E E E E E E E D 185 gaggaggagaaagaagaagaagaggaggaagaagaggaggaagaa E E E K E E E E E E E E E E E 230 cctgatgaggcagatatgattgatataaaaccaaaaaaccttggg P D E A D M I D I K P K N L G 275 aaggaggaggaagaagagaaaagtgagaaatctgagggtgaggtc K E E E E E K S E K S E G E V 320 aaatcatcagaaagagagtttgaagatgaagagaaggccaagcaa K S S E R E F E D E E K A K Q 365 aggaggccatccagcactgaaattgatcatctgaaaaatatgagc R R P S S T E I D H L K N M S 410 agaactagtccgaaagatgcatcccatcatccttcttcattgttg R T S P K D A S H H P S S L L 455 tgtgagatgatggtcaattctggattagatgaaattcagcaatac C E M M V N S G L D E I Q Q Y 500 agcgaggctttcaagcaggctatagcagagcgaaatataatattt S E A F K Q A I A E R N I I F 545 ggaaagcctcgatcgtcaagtgatgtatcatcaccagaaaaccat G K P R S S S D V S S P E N H 590 cagccacgcaattctaacagcaggcctccttcaagaccacatgat Q P R N S N S R P P S R P H D 635 caccatagtccaattgaagcaggtttgatagccagattacgagca H H S P I E A G L I A R L R A 680 gagcaaattctacaagccaaccaccatatggcagagcgtaacaat E Q I L Q A N H H M A E R N N 725 ttgtctgacttggaactggtgaccaatcgcatcaaaatggagcca L S D L E L V T N R I K M E P 770 gtaacatcttggccaccttcacctttagcaatacacagagaacca V T S W P P S P L A I H R E P 815 ctcatgtcatcacccgtccgctctgatgccagcccactcggaaca L M S S P V R S D A S P L G T 860 cccaatggcggtccagctgctttctttgctcaacgtcatttcatg P N G G P A A F F A Q R H F M 905 gaatccaacggggccatgtcgtctaatgccatactgccgtacaac E S N G A M S S N A I L P Y N 950 agtcctcctaacaggatgaagccccatagatcgagtgataagcga S P P N R M K P H R S S D K R 995 agtgacacctgcgagttctgcgggaagcagttcaagaattgcagc S D T C E F C G K Q F K N C S 1040 aacttgacagttcatcgtcgctcgcacaccggagagaagccctac N L T V H R R S H T G E K P Y 1085 aagtgtcagctgtgttcctatgcgtgcgcccagagcagcaagcta K C Q L C S Y A C A Q S S K L 1130 acccgtcacatgaagacccacggtcatggtgccaaagaggtcttc T R H M K T H G H G A K E V F 1175 aagtgtgaggtctgcaacatg 1195 K C E V C N M Εικόνα 3: Η αµινοξική αλληλουχία των αποµονωθέντων 1191 νουκλεοτιδίων του CTIP γονιδίου

68 61 Η παραπάνω αλληλουχία εστάλη για την παρασκευή κατάλληλου δεκαπενταπεπτιδίου συγκεκριµένων προδιαγραφών το οποίο θα αποτελούσε το αντιγόνο για την παραγωγή πολυκλωνικού αντισώµατος έναντι του µεταγραφικού παράγοντα CTIP. Το πολυκλωνικό αντίσωµα έναντι του µεταγραφικού παράγοντα CTIP, το οποίο δηµιουργήθηκε σε κουνέλι (anti-ctip -rabbit) είχε συγκέντρωση ίση µε 1,622 mgr/ml Η αµινοξική αλληλουχία του COUP-TF του Paracentrotus lividus χρησιµοποιήθηκε επίσης για την παρασκευή πολυκλωνικού αντισώµατος και έναντι αυτού του µεταγραφικού παράγοντα. Το εν λόγω πολυκλωνικό αντίσωµα (anti-coup Pl) παρασκευάστηκε σε κουνέλι. Η συγκέντρωση του αντισώµατος ήταν ίση µε 0,528 mgr/ml. Στα πειράµατά µας χρησιµοποιήθηκε και το αντίσωµα Η-60. Το αντιίσωµα αυτό είναι ένα αντισώµατα το οποίο στρέφεται έναντι της LBD (α.α ) του ανθρώπινου COUP-TF. εδοµένου ότι αυτή παρουσιάζει ελάχιστες αµινοξικές διαφορές από τη LBD του COUP-TF του P. lividus, επιστρατεύτηκε µε την ελπίδα ότι θα αποτελούσε ένα ικανό µέσο για την αναγνώριση του COUP-TF και στον αχινό P. lividus.

69 62 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1. Western blot ανάλυση Με Western blot ανάλυση έγινε έλεγχος της ικανότητας των αντισωµάτων να αναγνωρίζουν την πρωτοταγή δοµή των µεταγραφικών παραγόντων CTIP και COUP Από τα πειράµατα διαπιστώθηκε ότι το αντίσωµα anti-coup αναγνωρίζει τον µεταγραφικό παράγοντα COUP-TF σε οµογενοποίηµα ωαρίων του αχινού Paracentrotus lividus σε αραίωση 1/500. Το αντίσωµα Η-60 όµως δεν αναγνώρισε τον εν λογω παράγοντα στο ίδιο οµογενοποίηµα. ΜW COUP-TF: 66 KDa Εικόνα 4. Το πολυκλωνικό αντίσωµα έναντι του COUP-TF του αχινού P. lividus (anti-coup) αναγνωρίζει των παράγοντα COUP-TF σε πρωτεϊνικό εκχύλισµα ωαρίων αχινού σε συγκέντρωση 1/500. A B A: Οµογενοποίηµα εγκεφάλου ποντικού Β: Οµογενοποίηµα ωαρίων αχινού Εικόνα 5: Το πολυκλωνικό αντίσωµα Η-60 δεν αναγνώρισε τον παράγοντα COUP- TF σε πρωτεϊνικό εκχύλισµα ωαρίων αχινού. Με Western blot ανάλυση µελετήθηκε επίσης η ικανότητα του αντισώµατος έναντι του CTIP να αναγνωρίζει το συγκεκριµένο παράγοντα σε οµογενοποίηµα ωαρίων αχινού. Το τελικό αποτέλεσµα

70 63 ήταν ότι το αντίσωµα anti-ctip αναγνώριζε τον παράγοντα CTIP σε αραίωση 1/400. CTIP, MB=106 KDa Εικόνα 6: Το πολυκλωνικό αντίσωµα anti-ctip αναγνώρισε το µεταγραφικό παράγοντα CTIP σε συγκέντρωση 1/ EMSA ανάλυση Με EMSA ανάλυση έγινε έλεγχος της ικανότητας των αντισωµάτων anti-coup (pl) και Η-60 να αναγνωρίζουν την τεταρτοταγή δοµή του µεταγραφικού παράγοντα COUP µέσω της εµφάνισης super shift σε πειράµατα EMSA. Οι χρησιµοποιούµενοι παράγοντες παρατίθενται στα υλικά και µέθοδοι ( EMSA για SuperShift πίνακας1). Τα αποτελέσµατα που ελήφθησαν, εντοπίζουν την παρουσία SuperShift µόνο στη θέση 6. Στο πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου και στη θέση 6 το σύµπλοκο αντιγόνου (µικρή υποµονάδα του COUP-TF), αντισώµατος (Η-60) και στοιχείου απόκρισης µεταναστεύει κάτω από την επίδραση του ηλεκτρικού πεδίου διανύοντας µικρότερη απόσταση δηµιουργώντας ένα SuperShift.

71 Εικόνα 7: EMSA ανάλυση µε την εµφάνιση SuperSift στη θέση 6 του αντισώµατος Η-60. Το αντίσωµα H-60 είναι το µόνο από τα 2 αντισώµατα έναντι του µεταγραφικού παράγοντα COUP-TF που αναγνώρισε το συγκεκριµένο µεταγραφικό παράγοντα στην τεταρτοταγή του δοµή. 3. Πειράµατα ανοσοκατακρήµνισης Συγκεκριµένα µε βάση την υπόθεση µας αν ένα αντίσωµα έναντι του µεταγραφικού παράγοντα COUP αναγνωρίσει την πρωτεΐνη αυτή µέσα σ ένα πρωτεϊνικό εκχύλισµα, η τελευταία θα συµπαρασύρει προς την περιοχή του αντισώµατος και όλες εκείνες τις πρωτεΐνες µε τις οποίες αλληλεπιδρά είτε άµεσα είτε έµµεσα µέσω άλλων πρωτεϊνών. Σε µια επακόλουθη λοιπόν φυγοκέντρηση στο ανοσοίζηµά µας εκτός από την πρωτεΐνη στόχο (COUP) εµφανίζεται και µια πληθώρα άλλων πρωτεϊνών. Αν το ανοσοσύµπλοκο αυτό στη συνέχεια θερµανθεί µε σκοπό να διαταραχθούν οι πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις, µια επακόλουθη ηλκετροφόρηση σε συνδυασµό µε τη χρήση Western blot ανάλυση, θα µας δώσει πληροφορίες σχετικά µε το ποιες πρωτεΐνες συµπαρασύρθηκαν µαζί µε την πρωτεΐνη στόχο. Αν εφαρµόσουµε λοιπόν ένα αντίσωµα έναντι της πρωτεΐνης CTIP στο ανοσοσύµπλοκο αυτό, η διαπίστωση του µεταγραφικού παράγοντα στο πρωτεϊνικό αυτό ικρίωµα θα αποτελούσε απόδειξη της συνεργικής δράσης των δύο αυτών µεταγραφικών παραγόντων.

72 Ανοσοκατακρήµνιση µε τα αντισώµατα Η-6Ο και anti-coup (πεπτ.) και εµφάνιση µε το αντίσωµα έναντι του CTIP. Η-60 4 µgr anti-coup(pl)5 µgr 105 KDa 79 KDa Εικόνα 8: Western ανάλυση των ανοσοιζηµάτων που προκύπτουν µετά από ανοσοκατακρήµνιση µε τα αντισώµατα Η-60 και anti-coup-tf. Μόνο η ανοσοκατακρήµνιση µε το αντίσωµα Η-60 (και όταν αυτό χρησιµοποιήθηκε σε ποσότητα ίση µε 4 µgr) οδήγησε στην εµφάνιση ζώνης µεγέθους περίπου ίσης µε το ΜΒ της πρωτεΐνης CTIP, όταν αργότερα πραγµατοποιήθηκε µε το ανοσοίζηµα western blot ανάλυση και εµφάνιση µε το αντίσωµα έναντι της πρωτεΐνης αυτής.

73 Ανοσοκατακρήµνιση µε τo αντίσωµα Η-6Ο (4 µgr) και εµφάνιση µε το αντίσωµα έναντι του COUP (πεπτ.). Α Β Β Γ 66 ΚDa Γ: πρωτεϊνικό εκχύλισµα ωαρίων αχινού Β : ανοσοΐζηµα Α: υπερκείµενο Εικόνα 9: Western ανάλυση του ανοσοιζήµατος που προκύπτει µετά από ανοσοκατακρήµνιση µε το αντίσωµα Η-60. Η εφαρµογή στο ανοσοίζηµα, που προέκυψε µετά από ανοσοκατακρήµνιση µε το αντίσωµα Η-60, του αντισώµατος έναντι του COUP σε western blot δεν έδωσε ζώνη επιθυµητού µεγέθους. Η πρωτεΐνη του COUP ωστόσο ανιχνεύεται τόσο στο υπερκείµενο όσο και στο πρωτεϊνικό εκχύλισµα.

74 Ανοσοκατακρήµνιση µε το αντίσωµα anti-ctip (3 µgr) και εµφάνιση µε το ίδιο αντίσωµα. Α Β Γ 104 KDa Α: πρωτεϊνικό εκχύλισµα ωαρίων αχινού Β : ανοσοΐζηµα Γ: υπερκείµενο Εικόνα 10: Western ανάλυση του ανοσοιζήµατος που προκύπτει µετά από ανοσοκατακρήµνιση µε το αντίσωµα Η-60. Όταν εµφανίζουµε κατά τη Western µε το ίδιο αντίσωµα µε το οποίο ανοσοκατακρηµνίσαµε (anti-ctip) στην περιοχή του ανοσοιζήµατος εντοπίζεται µια ζώνη µεγέθους 104 KDa, περίπου ίση δηλαδή µε το µοριακό βάρος της πρωτεΐνης CTIP.

75 Ανοσοκατακρήµνιση µε το αντίσωµα anti-ctip (3 µgr) και εµφάνιση µε το αντίσωµα anti-coup. 98 KDa A B Γ Α: πρωτεϊνικό εκχύλισµα ωαρίων αχινού Β : ανοσοΐζηµα Γ: υπερκείµενο Εικόνα 11: Western ανάλυση του ανοσοιζήµατος που προκύπτει µετά από ανοσοκατακρήµνιση µε το αντίσωµα anti-ctip. Το αποτέλεσµα αυτής της σειράς των πειραµάτων οδήγησε στην εµφάνιση µιας ζώνης ΜΒ 98 ΚDa, η οποία δε συµπίπτει µε το ΜΒ της πρωτεΐνης COUP.

76 69 Συζήτηση πειραµάτων ανοσοκατακρήµνισης Η σειρά των πειραµάτων ανοσοκατακρήµνισης επιβεβαιώνει την αλληλεπίδραση των δύο αυτών µεταγραφικών παραγόντων, CTIP και COUP, αφού η ανοσοκατακρήµνιση µε το αντίσωµα έναντι του COUP, Η-60 οδήγησε στην συνκατακρήµνιση και της πρωτεΐνης CTIP µιας και η παρουσία της απεδείχθη µε επακόλουθη western blot ανάλυση. Το αντίσωµα anti-ctip ανοσοκατακρήµνισε την πρωτεΐνη CTIP και όταν κατά την ανάλυση του ανοσοιζήµατος µε western blot εφαρµόστηκε το ίδιο αντίσωµα ελήφθη η επιθυµητή ζώνη (CTIP). Αν και όπως προαναφέραµε το αντίσωµα έναντι του COUP Η-60 συνανοσοκατακρήµνισε την πρωτεΐνη CTIP (πρώτη σειρά πειραµάτων), ωστόσο η ανάλυση του ανοσοιζήµατος στη δεύτερη σειρά πειραµάτων δεν οδήγησε στην εµφάνιση ζώνης µοριακού βάρους που να ταυτίζεται µε το µοριακό βάρος της πρωτεΐνης του COUP. Με το ίδιο ακριβώς πρόβληµα ήρθαµε αντιµέτωποι και µε τη δεύτερη σειρά πειραµάτων. Σε µια προσπάθεια να αποσαφηνίσουµε την απουσία ζώνης του COUP στο ανοσοίζηµα θα µπορούσαµε να υποθέσουµε ότι οφείλεται στην πολύ µικρή ποσότητα του µεταγραφικού παράγοντα που ανοσοκατακρηµνίζεται. Ταυτόχρονα δεν πρέπει να ξεχνάµε ότι το µοριακό βάρος της πρωτεΐνης του COUP είναι κοντά στα 60 KDa πολύ κοντά δηλαδή στο µοριακό βάρος του αντισώµατος που χρησιµοποιείται για την ανοσοκατακρήµνιση, γεγονός το οποίο θα µπορούσε να δηµιουργήσει προβλήµατα παρεµβολών κατά την εµφάνιση µε τη µέθοδο της χηµειοφωταύγειας.

77 70 4. Αποτελέσµατα πειραµάτων ανοσοφθορισµού 4.1 Ανίχνευση της πρωτεΐνης CTIP µε τη µέθοδο του ανοσοφθορισµού στα πρώιµα αναπτυξιακά στάδια του αχινού P. lividus. Εικόνα 12: Έµβρυο του αχινού Paracentrotus lividus ευρισκόµενο στο στάδιο των 16 κυττάρων. Το έµβρυο µετά από κατάλληλη µονιµοποιήση έχει εκτεθεί στο αντίσωµα anti-ctip σε αραίωση 1/10. Η φωτογραφία του εµβρύου προέρχεται µετά από ανάλυση µε συνεστιακό µικροσκόπιο. Η ανίχνευση της πρωτεΐνης CTIP µε τη µέθοδο του ανοσοφθορισµού πραγµατοποιήθηκε χρησιµοποιώντας τις ακόλουθες συγκεντρώσεις του αντισώµατος anti-ctip: 1/5, 1/20, 1/50, 1/100, 1/200, 1/400, 1/700 και 1/1000. Η συγκέντρωση 1/10 κρίθηκε ως η καλύτερη συγκέντρωση στην οποία ανιχνεύεται ασθενές έστω σήµα από τον πυρήνα. 4.2 Ανίχνευση της πρωτεΐνης COUP µε τη µέθοδο του ανοσοφθορισµού στα πρώιµα αναπτυξιακά στάδια του αχινού P. lividus µε τη χρήση του αντισώµατος anti-coup-tf. Η ανίχνευση της πρωτεΐνης COUP-TF µε τη µέθοδο του ανοσοφθορισµού πραγµατοποιήθηκε χρησιµοποιώντας τις ακόλουθες συγκεντρώσεις του αντισώµατος anti-coup: 1/5, 1/20, 1/50, 1/100, 1/200 και 1/300. Σε καµία από τις παραπάνω συγκεντρώσεις του αντισώµατος anti- COUP-TF δεν ανιχνεύτηκε σήµα από τους πυρήνες.

78 71 Εικόνα 13: Φωτογραφία εµβρύου που έχει εκτεθεί στο αντίσωµα anti-coup-tf σε αραίωση 1/10. Η µικροσκοπική παρατήρηση του εµβρύου έγινε µε συνεστιακό µικροσκόπιο. 4.3 Ανίχνευση της πρωτεΐνης COUP µε τη µέθοδο του ανοσοφθορισµού στα πρώιµα αναπτυξιακά στάδια του αχινού P. lividus µε τη χρήση του αντισώµατος Η-60. Η ανίχνευση της πρωτεΐνης COUP-TF µε τη µέθοδο του ανοσοφθορισµού πραγµατοποιήθηκε χρησιµοποιώντας τις ακόλουθες συγκεντρώσεις του αντισώµατος H-60: 1/5, 1/50, 1/100, 1/150, 1/200 και 1/500. Και µε τη χρήση του αντισώµατος Η-60, σε οποία αραίωση και αν αυτό χρησηµοποιήθηκε δεν ελήφθη σήµα από τους πυρήνες. Εικόνα 13: Φωτογραφία εµβρύου που έχει εκτεθεί στο αντίσωµα Η-60 σε αραίωση 1/10. Η µικροσκοπική παρατήρηση του εµβρύου έγινε µε συνεστιακό µικροσκόπιο.

79 72 Συζήτηση πειραµάτων ανοσοφθορισµού Η παρατήρηση των εµβρύων του αχινού Paracentrotus lividus µε τη βοήθεια του συνεστιακού µικροσκοπίου, επικεντρώθηκε κυρίως στο στάδιο των 16 κυττάρων. Στο στάδιο αυτό έχουµε το σχηµατισµό των τριών ειδών βλαστοµεριδίων (8 µεσοµερίδια, 4 µακροµερίδια και 4 µικροµερίδια) και αρχίζει να καθορίζεται η αναπτυξιακή τύχη των κυττάρων. Επιπλέον, το στάδιο αυτό είναι ένα ικανοποιητικό στάδιο για την παρατήρηση πυρήνων, ενώ ταυτόχρονα στο στάδιο αυτό έχει ενεργοποηθεί το θυγατρικό DNA. Ακόµα και αν το αποθηκευµένο µητρικό mrna εξαντλήθηκε στα πρώιµα αναπτυξιακά στάδια, δίνεται ο απαραίτητος χρόνος για την κινητοποίηση του γενωµικού DNA και την παραγωγή νέας πρωτεΐνης CTIP θυγατρικής προέλευσης αυτήν τη φορά. Η µικροσκοπική παρατήρηση ωστόσο µε τη βοήθεια του συνεστιακού µικροσκοπίου δεν αποκάλυψε ένα ανάλογο πρότυπο έκφρασης για την πρωτεΐνη CTIP µε αυτήν του COUP-TF. Στις εικόνες που ελήφθησαν διαγράφονται αχνά οι πυρήνες χωρίς όµως το τελικό σήµα να είναι αρκετά ξεκάθαρο µιας και σχεδόν εξίσου έντονο σήµα λαµβάνεται και από το κυτταρόπλασµα. Η ανίχνευση της πρωτεΐνης του COUP στο στάδιο των 16 κυττάρων µε τη χρήση των αντισωµάτων anti-coup και Η-60 δεν απέδωσε την ήδη γνωστή από τη βιβλιογραφία ενδοκυτταρική κατανοµή της µικρής υποµονάδος του COUP-TF. Αν και πραγµατοποιήθηκε πληθώρα πειραµάτων µε αλλαγές στον τρόπο µονιµοποίησης των εµβρύων, διαφορετικές συγκεντρώσεις τόσο του πρώτου όσο και του δεύτερου αντισώµατος, αλλαγές στη χρονική διάρκεια επώασης των αντισωµάτων όπως επίσης και στο στάδιο του µπλοκαρίσµατος, οι εικόνες που ελήφθησαν εµφάνιζαν αχνά την πρωτεΐνη του COUP-TF στο κυτταρόπλασµα ενώ απουσίαζε από τους πυρήνες. Η εικόνα αυτή είναι εκ διαµέτρου αντίθετη µε αυτήν που αναφέρεται στη βιβλιογραφία και ως εκ τούτη απορρίπτεται αποδιδόµενη σε αδυναµία του αντισώµατος να ανιχνεύσει την πρωτεΐνη. Στα πλαίσια της προσπάθειάς µας να καταλήξουµε στις καταλληλότερες συνθήκες πραγµατοποίησης των πειραµάτων του ανοσοφθορισµού, χρησιµοποιήθηκε ως θετικό control ένα αντίσωµα έναντι του ενζύµου DNA (cytosine-5) methyltransferase (Dmnt 1). Το ένζυµο Dmnt εντοπίζεται κατά κύριο λόγο στον πυρήνα µέχρι το στάδιο του βλαστιδίου. Το αντίσωµα χρησιµοποιήθηκε σε συγκέντρωση 1/500. Οι εικόνες που ελήφθησαν µε τη βοήθεια του µικροσκοπίου φθορισµού είναι οι ακόλουθες:

80 73 Εικόνα 14: Φωτογραφία εµβρύων που έχουν εκτεθεί σε αντίσωµα έναντι του ενζύµου Dmnt και σε αραίωση 1/500 αυτού. Η µικροσκοπική παρατήρηση του εµβρύου έγινε µε µικροσκόπιο φθορισµού. Οι παραπάνω εικόνες επιβεβαιώνουν την επιτυχία των πρωτοκόλλων µονιµοποίησης των εµβρύων και του ανοσοφθορισµού και συνηγορούν υπερ της αδυναµίας των ιδίων των αντισωµάτων να ανιχνεύσουν τις πρωτείνες CTIP και COUP.

81 74 Μελλοντικοί στόχοι Η αποσαφήνιση των κατασταλτικών µηχανισµών του COUP-TF απαιτεί την επανάληψη των πειραµάτων µε τη χρήση νέων εργαλείων. Για το σκοπό αυτό µελλοντικά στοχεύουµε στον επανασχεδιασµό του αντισώµατος έναντι του COUP-TF µέσω της παραγωγής της καθαρής πρωτεΐνης αυτού. Η πρωτεΐνη του COUP-TF θα αποτελέσει το αντιγόνο για την ανοσοποίηση κατάλληλου θηλαστικού. Η παρασκευή νέου πολυκλωνικού αντισώµατος µεγαλύτερης συγγένειας προς την πρωτεΐνη του COUP-TF θα µας έδινε τη δυνατότητα να επαναλάβουµε τα πειράµατα της ανοσοκατακρήµνισης και να αναζητήσουµε µέσα στο πρωτεϊνικό σύµπλεγµα που θα ανοσοκατακρήµνιζε το αντίσωµα έναντι του COUP-TF, τον παράγοντα CTIP. Σηµαντική ώθηση στην επιτυχή έκβαση των πειραµάτων αυτών θα έδινε η αποµόνωση πυρηνικού εκχυλίσµατος. Ο µεταγραφικός παράγοντας COUP-TF γνωρίζουµε ότι εντοπίζεται στον πυρήνα και µετακινείται µεταξύ της περιφέρειας αυτού και των συµπυκνωµένων χρωµοσωµάτων κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Η εντόπισή του, µε άλλα λόγια, καθ όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, περιορίζεται στον πυρήνα. Η αποµόνωση λοιπόν του πυρηνικού εκχυλίσµατος θα απέκλειε κυτταροπλασµατικούς παράγοντες και συνεπώς µια σειρά πρωτεϊνών µε τις οποίες αλληλεπιδρά ο COUP-TF µετά την µετακίνησή τους στον πυρήνα, ενώ ταυτόχρονα θα µας παρείχε µια πιο συµπυκνωµένη ποσότητα πρωτεϊνών. Με την επανάληψη των πειραµάτων της ανοσοκατακρήµνισης µε τη χρήση του πυρηνικού εκχυλίσµατος θα ήταν δυνατόν να ανοσοκατακρηµνήσουµε µεγαλύτερη ποσότητα από το µεταγραφικό παράγοντα COUP-TF. Η επακόλουθη εµφάνιση µε το αντίσωµα έναντι του παράγοντα CTIP θα επιβεβαίωνε την άµεση ή έµµεση αλληλεπίδραση αυτών. Ταυτόχρονα, η πραγµατοποίηση από την προπτυχιακή φοιτήτρια Γεωργία Γούβη πειραµάτων in situ υβριδοποίησης µε κατάλληλο ανιχνευτή για το mrna του CTIP παράγοντα, µας έδωσε σηµαντικές πληροφορίες σχετικά µε το πρότυπο έκφρασης του m RNA αυτού στα πρώιµα εµβρυικά στάδια του αχινού P. lividus. Συγκριµένα µέσω των εν λόγω πειραµάτων προέκυψε ότι η εντόπιση του mrna του CTIP ακολουθεί την εντόπιση του m RNA του COUP-TF. Το ανάλογο αυτό πρότυπο έκφρασης αποτελεί µια ισχυρή πρώτη ένδειξη της στενής συνεργικής δράσης των δύο αυτών µεταγραφικών παραγόντων.

82 75 Μελέτη των ισοµορφών του COUP-TF στα Μετάζωα. Εισαγωγή Το γονίδιο COUP-TF αποτελείται, σε όλους τους µέχρι σήµερα µελετηµένους οργανισµούς, από τρία εξώνια και δύο εσώνια που διακόπτουν την κωδική περιοχή του γονιδίου σε συντηρηµένες θέσεις. Ωστόσο, πειράµατα τα οποία διενεργήθηκαν για πρώτη φορά στο εργαστήριο µας, έδειξαν ότι ο αχινός Paracentrotus lividus διαφοροποιείται από αυτό το µοντέλο καθώς το γονίδιο του COUP-TF στον οργανισµό αυτό αποτελείται από τέσσερα εξώνια. Συγκεκριµένα, έχει βρεθεί ότι το επιπλέον εξώνιο βρίσκεται µεταξύ του πρώτου και του δεύτερου εξωνίου και έχει µέγεθος 63nt. Στο πρωτογενές µετάγραφο του COUP-TF συµβαίνει εναλλακτικό µάτισµα που έχει ως αποτέλεσµα την παραγωγή δύο mrnas που κωδικοποιούν δύο πρωτεΐνες, οι οποίες διαφέρουν ως προς το µέγεθος λόγω της εισαγωγής 21 επιπρόσθετων αµινοξέων στην καρβόξυτελική περιοχή (CTE) της επικράτειας πρόσδεσης στο DNA (DBD). Στόχος της δεύτερης αυτής σειράς πειραµάτων ήταν να µελετήσουµε διεξοδικότερα το φαινόµενο του εναλλακτικού µατίσµατος και συγκεκριµένα να διαπιστώσουµε αν πρόκειται για ένα φαινόµενο συντηρηµένο στα εχινοειδή, αποκλειστικό ή όχι αυτών. Προς αυτή την κατεύθυνση, η τότε προπτυχιακός φοιτήτρια ιονυσία Βουκελάτου πραγµατοποίησε σειρά RT-PCR µε ολικό RNA από τα διάφορα αναπτυξιακά στάδια του αχινού P.lividus (µε εκκινητές στο τέλος του πρώτου και δεύτερου εξωνίου) διαπιστώνοντας για πρώτη φορά την παρουσία εναλλακτικού µατίσµατος (2 προϊόντα- 478bp και 541bp. Συγκεκριµένα, εναλλακτικό µάτισµα λαµβάνει χώρα σε όλα τα στάδια από τα αγονιµοποίητα ωάρια έως τον πλουτέα (εικόνα 1) και σε όλους τους ιστούς που o COUP-TF εκφράζεται (κοιλωµατικά κύτταρα, µύες, έντερο, αγονιµοποίητα αυγά) (Κοζάου Ζ, 2006) (εικόνα 2).

83 76 Εικόνα 1. Το εναλλακτικό µάτισµα παρατηρείται στο στάδιο των γονιµοποιηµένων αυγών, των 5, 20, 30, 44 και 50 Εικόνα 2. Το εναλλακτικό µάτισµα παρατηρείται και στους διάφορους ιστούς έκφρασης του COUP-TF. RT-PCR σε RNA από g (έντερο), s (κοιλωµατικά κύτταρα), m (µύες) και σαν θετικό control (+) ολικό Για να µελετηθεί διεξοδικότερα ο ρόλος των δύο ισοµορφών του COUP-TF, πραγµατοποιήθηκε κλωνοποίηση ολόκληρης της κωδικής περιοχής του. Πιο συγκεκριµένα µετά από το σχεδιασµό ειδικών εκκινητών (t-coupf και t-coupr) από την αλληλουχία του Strongylocetrotus.purpuratus (S.purpuratus GenomeProject) και του Ρ. lividus, πραγµατοποιήθηκε RT-PCR µε ολικό RNA από ωάρια P.lividus και διαπιστώθηκε η παρουσία δύο καθαρών προϊόντων µέσου µεγέθους bp. Στο σχήµα που ακολουθεί παριστάνεται γραφικά η κατανοµή εσωνίων-εξωνίων στον αχινό όπως προέκυψε µετά και την πλήρη αλληλούχιση των προιόντων (σχήµα 3). Το επιπλέον εξώνιο εντοπίστηκε µετά από blast στη βάση δεδοµένων και για τον S.purpuratus στις αλληλουχίες του όπως προέκυψαν από το S.purpuratus Genome Project..

84 77 Σχήµα 3: Γραφική απεικόνιση εσωνίων-εξωνίων του γονιδίου COUP-TF στον αχινό Μετά από blast των αµινοξικών αλληλουχιών προκύπτει ότι οι δύο πρωτεΐνες διαφέρουν σε 21 αµινοξέα, το προϊόν έκφρασης του επιπλέον εξωνίου και σε τρία ακόµη συντηρηµένα αµινοξέα. Η ένθεση των 21 αµινοξέων γίνεται στη καρβοξυτελική επέκταση της περιοχής πρόσδεσης στο DNA και συγκεκριµένα στο Τ-box.

85 78 Η δοµή των δύο πρωτεϊνών σύµφωνα µε τη κλασική δοµή ενός πυρηνικού υποδοχέα. Με πράσινο χρώµα παριστάνεται η θέση ένθεσης των 21 αµινοξέων στη µεγάλη πρωτεΐνη. Είναι σηµαντικό στο σηµείο αυτό να αναφερθεί ότι όσον αφορά την ένθεση των 21 αµινοξέων µεταξύ των οργανισµών P.lividus που µελετήθηκε και του S.purpuratus που βρέθηκε να περιέχει την αλληλουχία του επιπλέον εξωνίου στην αλληλουχία ενός εκ των contigs του, οι δύο αυτές αλληλουχίες διαφέρουν µόνο ως προς 2 αµινοξέα. Συγκεκριµένα στις δύο Τ (θρεονίνες) στον P.lividus για τον S.purpuratus αντιστοιχούν δύο S, σερίνες. Για να µελετήσουµε κατά πόσο λαµβάνει χώρα το εναλλακτικό µάτισµα στα πρωταρχικά µετάγραφα του COUP και σε άλλους οργανισµούς εκτός από τον αχινό Paracentrotus lividus, επιλέχθηκαν οργανισµοί αντιπροσωπευτικοί για τις διάφορες οµοταξίες του φύλου των εχινοδέρµων, των φύλων Xenoturbellida, Χαιτόγναθων και Ηµιχορδωτών και του υποφυλου των Ουροχορδωτών. Συγκεκριµένα αποµονώθηκε ολικό RNA από τους ακόλουθους οργανισµούς: Φύλο Εχινόδερµα Οµοταξία Εχινοειδή Strongylocetrotus purpuratus Sphearechinus granularis Οµοταξία ΑστεροειδήPatiria miniata Marthasteria glacialis Οµοταξία ΟφιουροειδήAmphiura filiphormis Οµοταξία ΟλοθουροειδήHolothuria polii Οµοταξία ΚρινοειδήOxycomanthus japonicus Φυλο Xenoturbellida Αντιπρόσωπος Xenoturbella bocki Φύλο Χαιτόγναθων Αντιπρόσωπος Sagitta minima Φυλο Ηµιχορδωτών

86 79 Αντιπρόσωπος Sakoglossus kowalevskii Υποφυλο Ουροχορδωτά Αντιπρόσωπος Ciona intestinalis Για τον σκοπό αυτό χρησιµοποιήθηκαν εκφυλισµένοι εκκινητές (degenerate primers) για τους οποίους πραγµατοποιήθηκε αρχικά RT- PCR µε κλίση θερµοκρασιών, χρησιµοποιώντας ως υπόστρωµα ολικό RNA του αχινού Arecia lixula µε σκοπό να βρεθεί η βέλτιστη θερµοκρασία υβριδοποίησης αυτών. Οι θερµοκρασίες που ελέχθησαν είναι οι εξής: 50, 52.8, 54.3, 57.4 και 60 ο C. Η βέλτιστη θερµοκρασία των in και out εκκινητών βρέθηκε ότι είναι 52.8 ο C. Τα πειράµατα αυτά διενεργήθηκαν από τη φοιτήτρια Πέττα Ιωαννα. Gradient PCR για εύρεση της βέλτιστης θερµοκρασίας πρόσδεσης των in και out εκφυλισµένων εκκινητών. Α) in εκινητές Β) out εκκινητές. Στη συνέχεια, οι εκκινητές αυτή χρησιµοποιήθηκαν για την πραγµατοποίηση PCR ή RT-PCR, έχοντας ως υπόστρωµα cdna ή RNA από τους οργανισµούς που προαναφέρθηκαν. Μετά τη nested PCR, πραγµατοποιείται κλωνοποίηση των προϊόντων στο φορέα pgem-teasy, µετασχηµατισµός βακτηρίων, αποµόνωση πλασµιδίων και πέψεις µε το ένζυµο περιορισµού EcoR1, οι οποίες βοηθούν στο να πιστοποιήσουµε ποιος κλώνος φέρει τα επιθυµητά ενθέµατα των 346bps και 283bps (µικρή και µεγάλη ισοµορφή αντίστοιχα).

87 80 Υλικά και µέθοδοι Οι διαφορετικές ισοµορφές του COUP-TF στα µετάζωα 1. 1 Σχεδιασµός εκφυλισµένων εκκινητών Για την µελέτη του εναλλακτικού µατίσµατος, χρησιµοποιήθηκαν ειδικοί εκφυλισµένοι εκκινητές (degenerate primers) που σχεδιάστηκαν µε βάση την αλληλουχία COUP-TF διαφόρων οργανισµών. Σχεδιάστηκαν δύο ζεύγη εκκινητών, τα LBDout - DBDout και LBDin - DBDin µε σκοπό την διεξαγωγή nested PCR πειραµάτων. Οι αµινοξικές αλληλουχίες των COUP-TFs από τους διάφορους οργανισµούς µελετήθηκαν προσεκτικά ως προς την οµολογία τους. Για την σχεδίαση των εκκινητών προτιµήθηκαν περιοχές των LBDs και DBDs που παρουσιάζουν τη µεγαλύτερη δυνατή οµολογία µεταξύ των οργανισµών. Εικόνα 1. Σχεδιασμός εκφυλισμένων εκκινητών βάση της αλληλουχίας COUP-TF από διάφορους οργανισμούς. Παρουσιάζονται οι θέσεις σχεδιασμού των εκκινητών DBDout (μαύρο βέλος), DBDin (κόκκινο βέλος), LBDin (κόκκινο διακεκομμένο βέλος) και LBDout (μαύρο διακεκομμένο βέλος) Στις περιπτώσεις που χρειάστηκε να συµπεριληφθεί στην αλληλουχία των εκκινητών κάποιο από τα αµινοξέα που κωδικοποιείται από περισσότερες των τριών τριπλέτες, τότε η θέση του νουκλεοτιδίου που αλλάζει αντικαθίσταται από ινοσίνη που έχει την ιδιότητα να

88 81 υβριδοποιείται µε οποιοδήποτε νουκλεοτίδιο. H ινοσίνη κατατάσσεται στην κατηγορία των νουκλεοσιδίων και αποτελεί προκάτοχο της αδενοσίνης. Η ινοσίνη όπως και τα άλλα νουκλεοσίδια µπορούν να φωσφορυλιωθούν από συγκεκριµένες κινάσες και να παράγουν τα νουκλεοτίδια. Οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιµοποιήθηκαν είναι οι εξής: DBD out 5 -CAA/GTTT/CACITGT/CGAA/GGGITGT/CAA-3 (βαθµός εκφυλισµού 32) LBD out 5' - AAA/ GAAIGGA/ G/TATA/ GTTICG/TIGCCCA-3 (βαθµός εκφυλισµού 24) DBD in 5 -AAT/CTGT/CCCIATT/CGAT/CCAA/GCT/CCA-3 (βαθµός εκφυλισµού 64) LBD in 5 -TCA/GCAA/G/TATA/GTTA/GTCA/G/TATICCCAT -3 (βαθµός εκφυλισµού 72) 1.2 Αποµόνωση ολικού RNA από ιστούς Τεµάχιο ιστού ίσο µε 50 mgr ψύχεται ταχέως µε υγρό άζωτο και θρυµατίζεται µε τη βοήθεια αποστειρωµένου γουδιού. Ο κονιορτοποιηµένος πλέον ιστός µεταφέρεται σε οµογενοποιητή µαζί µε 1 ml Tripure isolation reagent. Η οµογενοποίηση συνεχίζεται µεχρις ότου να µην παρατηρούνται µε γυµνό µάτι τεµάχια ιστού. Ακολούθως, το οµογενοποίηµα επωάζεται σε θερµοκρασία δωµατίου για 5 min. Μετά την πάροδο του χρονικού αυτού διαστήµατος, στο οµογενοποίηµα προστίθενται 200 µl χλωροφόρµιου και το νέο αυτό διάλυµα αναδεύεται έντονα (παρατηρείται ο σχηµατισµός γαλακτώµατος). Ακολουθεί επώαση σε θερµοκρασία δωµατίου για 15 min και στη συνέχεια φυγοκέντρηση στα g για 15 min στους 4 ο C. Μετά το τέλος της φυγοκέντρησης παρατηρούνται τρεις φάσεις. Η κατώτερη ροζ και η ενδιάµεση υποκίτρινη χρησιµοποιούνται για την αποµόνωση του DNA και των πρωτεινών. Η υπερκείµενη άχρωµη υδάτινη φάση είναι αυτή που θα χρησιµοποιηθεί για την αποµόνωση του RNA και για το λόγο αυτό συλλέγεται σε eppendorf και προστίθονται σε αυτήν 500 µl ισοπροπανόλης. Μετά από καλή ανάδευση το διάλυµα της υδάτινης φάσης µε την ισοπροπανόλη επωάζεται σε θερµοκρασία δωµατίου για 10 min. Ο

89 82 χρόνος αυτός είναι ο χρόνος που απαιτείται για το σχηµατισµό ιζήµατος RNA. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα g για 10 min στους 4 ο C, αποµάκρυνση όλου του υπερκείµενου και προσθήκη 1 ml αιθανόλης 70%. Στη συνέχεια µετά από έντονη ανάδευση ακολουθεί και πάλι φυγοκέτρηση στα g για 15 min στους 4 ο C και αποµάκρυνση και πάλι όλου του υπερκείµενου και ξήρανση του ιζήµατος σε θερµοκρασία δωµατίου. Στη συνέχεια στο ίζηµα του RNA προστίθενται 100 µl DEP H20. Το διάλυµα του RNA θερµένεται για 5 min στους 70 ο C και φωτοµετρείται για τον προσδιορισµό της συγκέντρωσής του. ιατηρείται αναλύωτο στους -80 ο C. 1.3 Η Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυµεράσης αντίστροφης µεταγραφής (RT-PCR) Τα πειράµατα RT-PCR πραγµατοποιήθηκαν µε το kit της εταιρείας Takara, χρησιµοποιήθηκε το ζεύγος εκκινητών DBDout - LBDout και οι αντιδράσεις γίνονται σε τελικό όγκο 25λ Υλικά- ιαλύµατα 2x One Step Buffer (Reaction Buffer, dntp mixture, One Step Enhancer Solution) One Step Enzyme Mix (PrimeScript RTase, DNA Polymerase, RNase Inhibitor) Προετοιµασία δειγµάτων 12,5λ 2x One Step Buffer 3λ primer LBD out (15 µμ) 33 primer DBD out (15 µμ) 1λ One Step Enzyme mix 5.5λ RNA (50 ng/µΐ) Πρόγραµµα RT-PCR 50 0 C για 30 min 94 0 C για 2min 94 0 C για 30sec 53 0 C για 30sec 72 0 C για 45 sec Go to 3 x 39

90 C για 10min 1.4 NESTED PCR Οι nested PCRs πραγµατοποιήθηκαν µε το kit της εταιρίας KAPA Biosystems και χρησιµοποιήθηκε το ζεύγος εκκινητών DBDin - LBDin. Υλικά- Αιαλύµατα 16λ 25λ 3λ 3λ 3λ H2O 2x Ready Mix primer LBD in (15 KM) primer DBD in (15µΜ) cdna Πρόγραµµα PCR 94 0 C για 2min 94 0 C για 30sec 53 0 C για 30sec 72 0 C για 45sec Go to 3 x C για 10min 1.5 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης Η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης είναι η πιο κλασική µέθοδος για τον διαχωρισµό και την ταυτοποίηση τµηµάτων DNA. Το DNA σε ουδέτερο ph είναι αρνητικά φορτισµένο και µεταναστεύει προς τον θετικό πόλο, ενώ το κατιόν του αιθιδίου κινείται ανάποδα, και έτσι το DNA κατά τη µετανάστευσή του κατά µήκος του πηκτώµατος δεσµεύει αιθίδιο και το συµπαρασύρει µαζί του. Μαζί µε το δείγµα τρέχουµε και τον µάρτυρα (ladder), που περιέχει κοµµάτια DNA γνωστού µεγέθους και µας επιτρέπει να υπο1ογίσουµε το µέγεθος των θραυσµάτων του δείγµατός µας.

91 84 Υλικά- ιαλύµατα: ddh2o Αγαρόζη ΤΒΕ 5Χ (για 1L: 54g Tris-Base, 27,5g Boric Acid, 20ml 0,5M EDTA ph 8.0) EtBr 10mg/ml Gel Loading Dye 6X (σε Η 2 Ο: 0,25% bromophenol blue, 0,25% xylene cyanol FF, 15% Ficoll [Type 400 Pharmacia]) 1kb ladder (NEB) Πλασµιδιακό DNA από πέψεις Πειραµατική Πορεία: 1. Ζυγίζονται 0,3g αγαρόζης και τοποθετούνται σε κωνική φιάλη των 100ml 2. Προστίθενται στην κωνική 30ml ΤΒΕ 0,5Χ 3. H κωνική τοποθετείται σε φούρνο µικροκυµάτων µέχρι να διαλυθεί πλήρως η αγαρόζη. 4. Στο διάλυµα προστίθενται 2λ EtBr 10mg/ml 5. Το διάλυµα τοποθετείται στην πλαστική µήτρα. Στη µήτρα επίσης τοποθετείται και το κτενάκι που θα δηµιουργήσει τα πηγαδάκια 6. Όταν το διάλυµα γίνει πλέον πήκτωµα το κτενάκι αφαιρείται και µήτρα τοποθετείται στη συσκευή ηλεκτροφόρησης την οποία γεµίζουµε µε TBE 0,5X 7. Τα προς ανάλυση δείγµατα αναµιγνύονται µε την Gel Loading Dye φορτώνονται (όπως και ο ladder) και ηλεκτροφορούνται. 8. Το πήκτωµα ηλεκτροφορείται στα 80V. 1.6 Καθαρισµός των προϊόντων της PCR Ο καθαρισµός των cdnas γινόταν µε τον kit της Roche. Πειραµατική πορεία 1. Σε σωλήνα eppendorf προστίθενται 500 µl Binding Buffer και 100 µl του προϊόντος της nested PCR (cdna). 2. Ο σωλήνας ανακινείται ώστε να αναµειχθεί το περιεχόµενό του.

92 85 3. Το µείγµα µεταφέρεται σε κολώνα φυγοκέντρου, η οποία είναι τοποθετηµένη σε σωλήνα συλλογής. Φυγοκέντρηση για sec στα x g. 4. Απορρίπτεται το περιεχόµενο του σωλήνα συλλογής. 5. Προστίθενται 200 λ Wash Buffer στην κολώνα. Φυγοκέντρηση για 1 min στα x g. 6. Απορρίπτεται το περιεχόµενο του σωλήνα συλλογής. 7. Προστίθενται 200 λ Wash Buffer στην κολώνα. Φυγοκέντρηση για 1 min στα x g. 8. Απορρίπτεται το περιεχόµενο του σωλήνα συλλογής. 9. Η κολώνα φυγοκέντρου τοποθετείται σε σωλήνα eppendorf 1,5 ml. 10. Προστίθενται λ Elution Buffer (προθερµασµένο στους 37 0 C) χαµηλά, επάνω από το µέσο του φίλτρου της κολώνας. Φυγοκέντρηση για 1 min στα x g. 11. Αποµακρύνεται η κολώνα φυγοκέντρου και αποµένει το καθαρισµένο προϊόν της nested PCR (cdna) στο σωλήνα eppendorf. Τα καθαρισµένα cdnas αποθηκεύονται στην κατάψυξη στους -20 C. 1.7 Αντίδραση λιγάσης Κατά την αντίδραση αυτή, το τµήµα DNA συνδέεται µε ένα πλασµιδιακό φορέα µέσω της δηµιουργίας φωσφοδιεστερικών δεσµών από το ένζυµο λιγάση. Οι φωσφοδιεστερικοί δεσµοί λαµβάνουν χώρα µεταξύ της 3'υδροξυλοµάδας ενός νουκλεοτιδίου και της 5'φωσφορικής οµάδας ενός άλλου νουκλεοτιδίου. Μία τέτοια σύνδεση είναι εφικτή όταν τα µόρια DNA φέρουν τυφλά ή µονόκλωνα άκρα. Στην περίπτωσή µας, τα προς σύνδεση µόρια DNA φέρουν µονόκλωνα άκρα, καθώς ο φορέας pgem-t Easy φέρει άκρα µε θυµίνες (Τ), ενώ το DNA φέρει άκρα µε αδενίνες (Α). Υλικά - ιαλύµατα 5λ 2x Rapid Ligation Step Buffer0

93 86 0,5 λ T4 DNA Ligase (3 U/µΐ) 1λ pgem-t Easy Vector (5 0 ng/µΐ) 3 λ cdna (purified PCR product) Επώαση O/N στους 18 0 C. 1.8 Μετασγηµατισµός βακτηρίων µε πλασµιδιακό DNA Υλικά- Αιαλύµατα 1. εκτικά κύτταρα E. coli (σφαιροπλάστες) 2. Αντίδραση λιγάσης 3. Θρεπτικό υλικό για κύτταρα, LB (5 gr Bactotryptone, 2,5 gr Yeast extract και 2,5 gr NaCl σε τελικό όγκο 500 ml, ph 7) 4. Τρυβλία Petri επιστρωµένα µε θρεπτικό υλικό LB (L Broth) που περιέχει 1%ο v/v αντιβιοτικό αµπικιλίνη (100 mg/ml). 5. ιάλυµα X-gal (20 mg/ml) 6. Σωλήνας PP-tube των 4 ml. Πειραµατική πορεία 1. Υπό το λύχνο Bunsen, δύο τρυβλία Petri επιστρώνονται µε 80 λ X-gal το καθένα, µε τη βοήθεια κεκαµµένης πιπέτας Pasteur. Τα τρυβλία Petri τοποθετούνται στον επωαστικό θάλαµο έως ότου απορροφηθεί το X-gal (περίπου 2 ώρες). 2. Σε σωλήνα PP-tube µεταφέρεται 1 ml LB και ακολούθως, ο σωλήνας αυτός τοποθετείται σε υδατόλουτρο στους 37 "C. 3. Σε πάγο αποψύχονται 50 λ δεκτικών βακτηριακών κυττάρων, όπου προστίθεται 3 λ από την αντίδραση της λιγάσης. Ακολουθεί επώαση 10 min στον πάγο. 4. Ο µετασχηµατισµός γίνεται µε ηλεκτροδιάτρηση (electroporation) σε ειδικό µηχάνηµα, κατά την οποία περνάει ρεύµα 1660 V για 5 msec από τα τοιχώµατα της ειδικής κυβέτας (περιέχει το µείγµα των δεκτικών βακτηριακών κυττάρων µε την αντίδραση λιγάσης).

94 87 5. Τα µετασχηµατισµένα βακτήρια µεταφέρονται στο σωλήνα PP-tube στο υδατόλουτρο στους 37 ο Ο για 1 ώρα και αναδεύονται κάθε 15 min. 6. Τα τρυβλία Petri µε το X-gal επιστρώνονται αντίστοιχα µε 20 λ και 100 λ από την καλλιέργεια των βακτηρίων, µε τη βοήθεια κεκαµµένης πιπέτας Pasteur. Στη συνέχεια, τοποθετούνται στον επωαστικό θάλαµο στους 37 ο Ο για ολονύκτια επώαση. 1.9 Επιλογή αποικιών, streaking και ανακαλλιέργειά τους σε υγρό θρεπτικό µέσο. Η επιλογή γίνεται µε βάση το χρώµα των αποικιών. Τα κύτταρα που έχουν µετασχηµατιστεί µε τον pgem-t Easy και περιέχουν ένθεµα, έχουν λευκό χρώµα και επιλέγονται έναντι των µπλε αποικιών που έχουν δεχτεί πλασµίδιο χωρίς ένθεµα. Το πλασµίδιο περιέχει γονίδιο που προσδίδει ανθεκτικότητα στην αµπικιλίνη και συνεπώς, τα βακτήρια που δεν έχουν προσλάβει πλασµίδιο δε δηµιουργούν αποικίες. 1. Επιλέγεται ένας αριθµός λευκών αποικιών, οι οποίες µεταφέρονται υπό στείρες συνθήκες σε νέα τρυβλία µε στερεό θρεπτικό µέσο, µε τη βοήθεια αποστειρωµένων βακτηριακών κρίκων. 2. Οι βακτηριακοί κρίκοι ξεπλένονται, κατόπιν, σε αποστειρωµένους σωλήνες falcon των 15ml που περιέχουν 1,5ml LB και 1,5 λ αµπικιλίνη (100 mg/ml). Ακολούθως, οι σωλήνες τοποθετούνται στον αναδευτήρα στους 37 C για ολόκληρη τη νύχτα, προκειµένου να πολλαπλασιασθούν τα βακτήρια. 3. Τα τρυβλία τοποθετούνται στον επωαστικό θάλαµο στους 37 για επώαση Ο/Ν. 2.0 Αποµόνωση πλασµιδίου µκρής κλίµακας (minipreps) Για την αποµόνωση των πλασµιδιακών DNAs χρησιµοποιήθηκε το kit της εταιρείας Macherey-Nagel (Nucleospin Plasmid) και η διαδικασία πραγµατοποιήθηκε σύµφωνα µε το πρωτόκολλο. Υλικά- ιαλύµατα/πειραµατική Πορεία:

95 88 1. Μετά από φυγοκέντρηση της υγρής καλλιέργειας (5', 10000g, 00C), ακολουθεί επαναιώρηση του ιζήµατος των βακτηρίων µε τη χρήση 250 λ Buffer Α1 (Cell Resuspension Solution) 2. Προσθήκη 250 λ Buffer Α2 (Cell Lysis Solution)και ήπια ανάδευση, ώστε να γίνει λύση των βακτηρίων. 3. ιατήρηση για 5 min σε θερµοκρασία δωµατίου. 4. Προσθήκη 300 λ Buffer Α3 (Neutralization Solution) και ήπια ανάδευση. 5. Φυγοκέντρηση για 10 min σε 17000g σε θερµοκρασία δωµατίου. 6. Το υπερκείµενο µεταφέρεται στην κολωνίτσα του Kit. 7. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1min σε 11000g σε θερµοκρασία δωµατίου. 8. Προσθήκη 500λ προθερµασµένου στους 50^ ΑW Buffer. 9. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1min σε 11000g σε θερµοκρασία δωµατίου 10.Προσθήκη 600λ διαλύµατος µε αιθανόλη (Buffer A4) στο φίλτρο για ξέπλυµα. 11.Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1min σε 11000g σε θερµοκρασία δωµατίου. 12. Αφαιρούµε το διάλυµα ξεπλύµατος και ξαναφυγοκεντρούµε για 2 min σε 13000rpm σε θερµοκρασία δωµατίου, προκειµένου το DNA που έχει προσδεθεί στο φίλτρο να στεγνώσει. 13. Το φιλτράκι τοποθετείται σε καθαρό eppendorf και προστίθενται 100 λ Buffer ΑΕ, ώστε να γίνει η έκλουση του DNA από το φίλτρο. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1 min σε 11000g σε θερµοκρασία δωµατίου. Τελικά, το πλασµιδιακό DNA έχει συλλεχθεί στο eppendorf (Vτελ=100λ). Έπειτα από κατάλληλη αραίωση (1:50) προσδιορίζεται η συγκέντρωση του διαλύµατος σε νουκλεϊκά οξέα µέσω φωτοµέτρησης. Η φωτοµέτρηση γίνεται στα 260nm (οπτική απορρόφηση νουκλεϊκών οξέων) και στα 280nm (οπτική απορρόφηση πρωτεϊνών). Ο λόγος των οπτικών απορροφήσεων O.D.260/O.D.280 πρέπει να είναι µεγαλύτερος του 1,8 για να θεωρηθεί το DNA πολύ καθαρό. Η συγκέντρωση του

96 89 DNA υπολογίζεται αν λάβει κανείς υπόψη του ότι 1 O.D.260 α= 50µg\ml DNA 2.1 Πέψη πλασµιδίων µε Ε EcoRI Η πέψη των πλασµιδίων πραγµατοποιείται µε την ενδονουκλεάση περιορισµού EcoRI. Η EcoRI προσδένεται στο φορέα pgem-t Easy, όπου αναγνωρίζει και κόβει τις αλληλουχίες GAATTC που εντοπίζονται εκατέρωθεν του ενθέµατος. Με τον τρόπο αυτόν, καθίσταται δυνατή η επιλογή των κλώνων που φέρουν το µικρό ή το µεγάλο ένθεµα (cdna µε το επιπλέον εξώνιο) µετά από ηλεκτροφόρηση. Εικόνα2: Ο φορέας κλωνοποίησης pgem-t Easy. Υλικα- ιαλύµατα 12µL H 2 O 2µL 10x EcoRI buffer 1µL EcoRI (20 U/µΐ) 5µL DNA Γίνεται επώαση στους 37 ο C για 2 ώρες. 2.2 Αλληλούχηση κλώνων

97 90 Οι κλώνοι που φέρουν το µικρό και µεγάλο ένθεµα φωτοµετρούνται προκειµένου να υπολογιστούν οι συγκεντρώσεις τους και ακολούθως, αποστέλλονται 2 µgr πλασµιδιακού DNA από τον κάθε κλώνο για αλληλούχηση. Πραγµατοποιείται αλληλούχηση και για τις δύο αλυσίδες του DNA µε τους primers M13 forward και M13 reverse. 2.3 Μοναδικές αποικίες και STOCK επιλεγµένων κλώνων Πραγµατοποιείται ανακαλλιέργεια των επιθυµητών αποικιών σε νέα τρυβλία µε στερεό θρεπτικό µέσο, κατά τέτοιο τρόπο ώστε να προκύψουν µοναδικές αποικίες. Στη συνέχεια, τα τρυβλία τοποθετούνται στον επωαστικό θάλαµο στους 37 ο C για ολονύκτια επώαση. Την επόµενη ηµέρα, µοναδικές αποικίες µεταφέρονται µε βακτηριακό κρίκο σε σωλήνες Cryovial που φέρουν 0,5 ml LB και αµπικιλίνη σε τελική συγκέντρωση 100 µg/ml. Έπειτα, οι σωλήνες τοποθετούνται στον αναδευτήρα στους 37 ο C για ολόκληρη τη νύχτα. Την επόµενη ηµέρα, προστίθενται 100 λ γλυκερόλης σε κάθε σωλήνα. Ακολούθως, οι σωλήνες ανακινούνται και αποθηκεύονται στην υπερκατάψυξη στους C.

98 91 Αποτελέσµατα Μελέτη των ισοµορφών του COUP-TF στα Μετάζωα 1. Φύλο Εχινόδερµα 1.1 Οµοταξία Εχινοειδών A. Strongylocetrotus purpuratus Για τον αχινό Strogylocentrotus purpuratus χρησιµοποιήθηκε αραίωση 1/25 του ολικού RNA από το στάδιο του αυγού συγκέντρωσης 0,5 µgr/µl για την πραγµατοποίηση RT-PCR µε χρησιµοποιούµενους εκκινητές τους LBD out και DBD out. Η ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της nested PCR που ακολούθησε (µε εκκινητές τους LBD in και DBD in) έδειξε ότι συµβαίνει εναλλακτικό µάτισµα στον αχινό Strongylocetrotus purpuratus αφού παρατηρούνται δύο προϊόντα µεγέθους περίπου 350 και 280 bps αντίστοιχα. Μ 500 bps 350 bps 280 bps Kingdom: Phylum: Class: Subclass: Superorder: Order: Family: Genus: Species: Animalia Echinodermata Echinoidea Euechinoidea Echinacea Echinoida Strongylocentrotidae Strongylocentrotus S. purpuratus Εικόνα 1: Ηλεκτροφόρηση των προιόντων της RT PCR Η κλωνοποίηση των προϊόντων της nested PCR και οι πέψεις των ανασυνδυασµένων πλασµιδίων που αποµονώθηκαν, µε την ενδονουκλεάση EcoR1, έδειξαν ότι µόνο ο κλώνος 10 περιείχε τη µεγάλη ισοµορφή, ενώ όλοι οι υπόλοιποι περιείχαν τη µικρή ισοµορφή. 2 µgr από τους κλώνους 5 και 10 εστάλησαν για νουκλεοτιδική αλληλούχηση.

99 92 Μ Εικόνα 2: Πέψη µε EcoR1 ανασυνδυασµένων πλασµιδίων µε ένθεµα από τον COUP- TF του Strogylocentrotus purpuratus. Μόνο ο κλώνος 10 έφερε µια µεγάλη νουκελοτιδική ισοµορφή Η νουκλεοτιδική ανάλυση του µικρού κλώνου 5, µεταξύ των θέσεων αναγνώρισης της ενδονουκλεάσης περιορισµού EcoR1, έδωσε ένα προϊόν µεγέθους 286 nt και είναι η ακόλουθη: GATTAATTGCCCGATCGATCAGCATCACCGGAATCAATGCCAG TACTGCAGACTTAAAAAGTGCCTCAAGATGGGCATGAGAAGG GAAGCTGTTCAGAGGGGTCGTATGCCACCGACTCAACCGGGCC CTGGTCAATACCTGGATGGTCGCTTCGAAGGACACACATTCCT CTCGGGTTACATCTCGCTACTGCTTCGAGCTGAGCCCTACCCA ACGTCGCGTTACGCCCAGTGCATGCAGACCAACTCAGTAATGG GCATCGACAATATCTGCGAAATCACTAGT Η νουκλεοτιδική ανάλυση του µεγάλου κλώνου 10, µεταξύ των θέσεων αναγνώρισης της ενδονουκλεάσης περιορισµού EcoR1, έδωσε ένα προϊόν µεγέθους 349 nt και είναι η ακόλουθη: GATTAACTGCCCGAGTGATCAGCATCACCGGAATCAATGCCAG TACTGCAGACTTAAAAAGTGCCTCAAGATGGGCATGAGAAGG GAAGGCAGAAACACTGTATCCAATCACCCTTGGGACCTTCGAC TTAACCTCCCGTCCGAGGGACAAGCTGTTCAGAGGGGTCGTAT GCCACCGACTCAACCGGGCCCTGGTCAATACCTGGATGGTCGC TTCGAAGGACACACATTCCTCTCGGGTTACATCTCGCTACTGCT TCGAGCTGAGCCCTACCCGACGTCGCGTTACGCCCAGTGCATG CAGACCAACTCAGTAATGGGCATCGACAACATCTGTGAAATCA CTAGT

100 93 Η σύγκριση των αλληλουχιών αυτών µε τα στοιχεία της βάσης δεδοµένων, µιας και το γονιδίωµα του αχινού S. purpuratus έχει αλληλουχηθεί, οδήγησε στα εξής συµπεράσµατα α. ότι οι παραπάνω αλληλουχίες αντιστοιχούν στην αλληλουχία του γονιδιού COUP-TF του συγκεκριµένου οργανισµού β. και δεύτερον ότι πράγµατι και στον αχινό S. purpuratus υπάρχει το επιπλέον εξώνιο µε µικρές νουκλεοτιδικές διαφορές. Πιο συγκεκριµένα σε ότι αφορά στην ένθεση των 21 αµινοξέων, µεταξύ των οργανισµών P.lividus και του S.purpuratus που µελετήθηκε, οι δύο αυτές αλληλουχίες διαφέρουν µόνο ως προς 2 αµινοξέα. Συγκεκριµένα στις δύο Τ (θρεονίνες) στον P.lividus για τον S.purpuratus αντιστοιχούν δύο S (σερίνες). B. Sphaerechinus granularis Η µελέτη του εναλλακτικού µατίσµατος στον αντιπρόσωπο αυτόν των Εχινοειδών πραγµατοποιήθηκε µε τη χρήση των εκφυλισµένων εκκινητών και τη διεξαγωγή πειραµάτων RT-PCR και Nested PCR. Η ηλεκτροφόρηση του προϊόντος της PCR αποκάλυψε δύο ζώνες επιθυµητού µεγέθους. Η κλωνοποίηση αυτών οδήγησε στην αποµόνωση µιας µικρής ισοµορφής και µιας µεγάλης λόγω της εισαγωγής 21 επιπλέον αµινοξέων στην CTE της επικράτειας πρόσδεσης στο DNA. (Πειράµατα προηγούµενων ετών). 1.2 Οµοταξία Αστεροειδή Α. Patiria miniata Για να διαπιστώσουµε αν στον αστερία P. miniata υπάρχει το επιπλέον εξόνιο στο γονίδιο του COUP-TF και λαµβάνει χώρα εναλλακτικό µάτισµα των µεταγράφων του, πραγµατοποιήσαµε RT-PCR και ακολούθως Nested PCR µε τη χρήση των εκφυλισµένων εκκινητών. Ως υπόστρωµα χρησιµοποιήθηκε ολικό RNA (2 µgr/20 µl) αποµονωµένο από το συγκεκριµένο οργανισµό.

101 94 Η ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της nested PCR έδειξε ότι συµβαίνει εναλλακτικό µάτισµα στον αστερία Patiria miniata, αφού παρατηρούνται δύο προϊόντα µεγέθους περίπου 350 και 300 bps αντίστοιχα. Παρατηρούµε ωστόσο ότι το προϊόν µεγαλύτερου µεγέθους εκφράζεται αναλογικά σε πολύ µεγαλύτερο ποσοστό. Μ 500 bps Kingdom: Animalia Phylum: Echinodermata Class: Asteroidea Order: Spinulosida Family: Asterinidae Genus: Asterina Species: P. miniata Εικόνα 3:Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της RT PCR Τα προϊόντα της Nested PCR µετά τον καθαρισµό τους κλωνοποιήθηκαν και οι πέψεις των αποµονωθέντων ανασυνδυασµένων πλασµιδίων, µε την ενδονουκλεάση EcoR1, έδειξαν ότι µόνο ο κλώνος 6 περιείχε ένα µεγάλο προϊόν, ενώ όλοι οι υπόλοιποι περιείχαν ένα προϊόν ίδιου µεγέθους µικρότερο ωστόσο σε σχέση τον κλώνο 6. 2 µgr από τους κλώνους 6 και 8 εστάλησαν για νουκλεοτιδική αλληλούχηση. Μ bps Εικόνα 4: Πέψη µε EcoR1 ανασυνδυασµένων πλασµιδίων µε ένθεµα από τον COUP- TF της Patiria miniata. Μόνο ο κλώνος 6 έφερε µια µεγάλη νουκλεοτιδική ισοµορφή.

102 95 Τα αποτελέσµατα της νουκλεοτιδικής ανάλυσης των κλώνων 6 και 8, µε τη χρήση των βάσεων δεδοµένων, µας οδήγησαν στο συµπέρασµα ότι και οι δύο κλώνοι δεν αντιστοιχούν στο γονίδιο του COUP-TF. Η ανεπιτυχής επανάληψη του πειράµατος, οδήγησε στο να απορρίψουµε το αρχικό υπόστρωµα µας (ολικό RNA) ως ακατάλληλο για χρήση λόγω επιµόλυνσης κατά την επεξεργασία και τον καθαρισµό του. Με τη χρήση νέου υποστρώµατος (νέο διάλυµα ολικού RNA από έµβρυα 24 ωρών του αστερία P. miniata, 1 µgr) επαναλήφθηκαν οι αντιδράσεις RT-PCR και Nested PCR κάτω από τις ίδιες ακριβώς συνθήκες. Το αποτέλεσµα της ηλεκτροφόρησης παρουσιάζεται παρακάτω: Μ RT Nested PCR 500 bps 280 bps Εικόνα 5: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της RT PCR και της Nested PCR. Όπως και την πρώτη φορά, κατά την ηλεκτροφόρηση του προϊόντος της Nested PCR παρατηρείται µία ζώνη επιθυµητού µεγέθους πολύ µεγάλης έντασης και µια δεύτερη σηµαντικά µικρότερης έντασης. Τα προϊόντα αυτά καθαρίστηκαν και ακολούθως κλωνοποιήθηκαν. Από τους 18 συνολικά κλώνους, 2 µgr από τους κλώνους 3 και 18 εστάλησαν για νουκλεοτιδική αλληλούχηση.

103 96 M bps Εικόνα 6: Πέψη µε EcoR1 ανασυνδυασµένων πλασµιδίων µε ένθεµα από τον COUP- TF της Patiria miniata. Μόνο ο κλώνος 18 έφερε µια µεγάλη νουκλεοτιδική ισοµορφή. Η νουκλεοτιδική ανάλυση του κλώνου 3, µεταξύ των θέσεων αναγνώρισης της ενδονουκλεάσης περιορισµού EcoR1, έδωσε ένα προϊόν µεγέθους 273nt και είναι η ακόλουθη: GATTAACTGTCCGATTGACCAACACCACCGGAATCAATGCCAG TACTGTAGGCTTAAGAAATGTCTGAAAATGGGCATGAGACGAG AAGCAGTACAGCGCGGACGAGTTCCACCGTCACAGCCCGGGC CAGGCCAGTACCTGGACGGCCGCTTCGAGGGCCACTCTTTCCT CTCGGGCTACATCTCCCTCTTGCTGCGGGCCGAGCCCTACCCC ACCTCCCGCTACGCCCAGTGCATGCAGACCAACAGCGTCATGG GCATCGAATCACTAGT Η νουκλεοτιδική ανάλυση του κλώνου 18, µεταξύ των θέσεων αναγνώρισης της ενδονουκλεάσης περιορισµού EcoR1, έδωσε ένα προϊόν µεγέθους 328nt και είναι η ακόλουθη: GATTAATTGTCCGATTGACCAACACCACCGGAATCAATGCCAG TACTGTAGGCTTAAGAAATGTCTGAAAATGGGCATGAGACGAG AAGGTGTGACAAAACTCCCAACAGTTTTCAGTCAACGTTACTG TACAGTACAGCGCGGACGAGTTCCACCGTCACAGCCCGGGCCA GGCCAGTACCTGGACGGCCGCTTCGAGGGCCACTCTTTCCTCT CGGGCTACATCTCCCTCTTGCTGCGGGCCGAGCCCTACCCCAC CTCCCGCTACGCCCAGTGCATGCAGACCAACAGCGTCATGGGC ATCGACAACATCTGCGAAATCACTAGT Τα συµπεράσµατα που προκύπτουν από την παραπάνω ανάλυση είναι τα εξής:

104 97 Α. Στο αστερία P.miniata παρατηρείται το επιπλέον εξόνιο στο γονίδιο του COUP-TF και ως εκ τούτου συντελείται εναλλακτικό µάτισµα. Β. Το επιπλέον εξόνιο στον οργανισµό P.miniata δεν εµφανίζει καµία οµοιότητα µε το επιπλέον εξόνιο που παρατηρείται στους αχινούς S. Purpuratus και P. lividus. Το µέγεθος του εξονίου στον αχινό P.miniata ανέρχεται στα 42 nt γεγονός το οποίο µεταφράζεται σε ένα πεπτίδιο 14 αµινοξέων. Β. Marthasteria glacialis Από τις ωοθήκες του αστερία Marthasteria glacialis αποµονώθηκε ολικό RNA, η συγκέντρωση του οποίου προσδιορίστηκε µε φωτοµέτρηση και βρέθηκε ίση µε 458 µgr/ml. Πειράµατα προηγούµενων ετών είχαν καταστήσει δυνατή τη αποµόνωση της αλληλουχίας του COUP-TF στο συγκεκριµένο αστερία. Με βάση την αλληλουχία αυτή σχεδιάστηκαν ειδικοί για τον οργανισµό εκκινητές, οι οποίοι παραθέτονται ακολούθως: Regnum: Animalia Phylum: Echinodermata Subphylum: Eleutherozoa Superclassis: Asterozoa Classis: Asteroidea Ordo: Forcipulatida Familia: Asteriidae Genus: Marthasterias Species: Marthasterias glacialis Mg fwd out: 5 -GAT CGA TCA ACA TCA CCG CAA CC-3 Mg fwd in: 5 -GTA CTG TCG TCT CAA GAA ATG TC-3 Mg rev in: 5 -TGG TTC GGC CCG GAG CAG CAA T-3 Χρησιµοποιώντας ως εκκινητές τους Mg fwd in και Mg rev in πραγµατοποιήσαµε RT-PCR. Κατά την ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της RT-PCR σε gel αγαρόζης 1.5% παρατηρούνται δύο προϊόντα µεγέθους περίπου 280 και 220 bps αντίστοιχα. Τα προϊόντα αυτά, γνωρίζοντας την ακριβή θέση των εκκινητών, είναι προϊόντα επιθυµητού µεγέθους. Αυτό ακριβώς το

105 98 γεγονός αποτέλεσε το έναυσµα για τον καθαρισµό των προϊόντων της RT-PCR και την κλωνοποίησή τους. Μ Εινόνα 7: Ηλεκτροφόρηση των προιόντων της RT-PCR. Η κλωνοποίηση των προϊόντων της RT-PCR και οι πέψεις των ανασυνδυασµένων πλασµιδίων που αποµονώθηκαν, µε την ενδονουκλεάση EcoR1, έδειξαν ότι µόνο ο κλώνος 5 περιείχε µια µεγάλη ισοµορφή, ενώ όλοι οι υπόλοιποι περιείχαν τη µικρή ισοµορφή. 2 µgr από τους κλώνους 4 και 5 εστάλησαν για νουκλεοτιδική αλληλούχηση. Μ Εικόνα 8: : Πέψη µε EcoR1 ανασυνδυασµένων πλασµιδίων µε ένθεµα από τον COUP-TF του Marthasteria gracialis. Μόνο ο κλώνος 4 έφερε µια µεγάλη νουκλεοτιδική ισοµορφή. Η νουκλεοτιδική ανάλυση των κλώνων 5 και 4 κατέδειξε ότι ο µικρός κλώνος 4 είναι ταυτόσηµος µε αυτών που αποµονώθηκε από τα πειράµατα προηγούµενων ετών, ενώ ο θεωρητικά µεγαλύτερος κλώνος 5 δεν αντιστοιχούσε σε αλληλουχία του γονιδίου του COUP-TF.

106 99 Για να ελέγξουµε το αποτέλεσµα της RT-PCR πραγµατοποιήσαµε µια νέα σειρά πειραµάτων. Συγκεκριµένα χρησιµοποιώντας ως εκκινητές τους εκφυλισµένους primers LBD out και DBD out πραγµατοποιήθηκε, µε υπόστρωµα το ολικό RNA του αστερία, νέα RT-PCR. Το προϊόν cdna της αντίδρασης αυτής, χρησιµοποιήθηκε ως υπόστρωµα για την πραγµατοποίηση Nested PCR µε εκκινητές τους LBD in και DBD in. Η ηλεκτροφόρηση του προϊόντος της Nested PCR µας έδωσε την ακόλουθη εικόνα: M 500 bps Εικόνα 9: Ηλεκτροφόρηση των προιόντων της Nested-PCR. Το προϊόντα αυτά της Nested PCR αποτέλεσαν το υπόστρωµα για την πραγµατοποίηση δύο νέων αντιδράσεων Nested PCR. Η πρώτη αντίδραση (1) περιλαµβάνει τη χρήση των ειδικών για το συγκεκριµένο οργανισµό εκκινητών Mg frd in και Mg rev in ενώ η δεύτερη (2) τη χρήση των ειδικών για το Marthasteria εκκινητών Mg fwd out και Mg rev in. Η ηλεκτροφόρηση των προιόντων των δύο αντιδράσεων Nested PCR που ακολούθησε έδωσε την εξής εικόνα: Μ ( 1 ) ( 2 ) 500 bps 160 bps 190 bps Εικόνα 10: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων των δύο αντιδράσεων Nested-PCR

107 100 Οι παραπάνω ζώνες αντιστοιχούν σε προϊόντα επιθυµητού µεγέθους γεγονός το οποίο αποτέλεσε το έναυσµα για τη συνέχιση των πειραµάτων προς την κατεύθυνση της κλωνοποίησης αυτών. Η κλωνοποίηση των προϊόντων της nested PCR και οι πέψεις των ανασυνδυασµένων πλασµιδίων που αποµονώθηκαν, µε την ενδονουκλεάση EcoR1, έδειξαν ότι µόνο ο κλώνος 2 περιείχε τη µεγάλη ισοµορφή, ενώ όλοι οι υπόλοιποι περιείχαν τη µικρή ισοµορφή. 2 µgr από τους κλώνους 1 και 2 εστάλησαν για νουκλεοτιδική αλληλούχηση. 500 bps Μ Μ bps Εικόνα 11: Πέψη µε EcoR1 ανασυνδυασµένων πλασµιδίων µε ένθεµα από τον COUP-TF του Marthasteria gracialis. Μόνο ο κλώνος 4 έφερε µια µεγάλη νουκελοτιδική ισοµορφή. Η νουκλεοτιδική ανάλυση του µικρού κλώνου 1 δεν κατέστη δυνατή. Η νουκλεοτιδική ανάλυση του µεγάλου κλώνου 2, µεταξύ των θέσεων αναγνώρισης της ενδονουκλεάσης περιορισµού EcoR1, έδωσε ένα προϊόν µεγέθους 225 nt και είναι η ακόλουθη: GATTTGGTTCGGCCCGGAGCAGCAATGGCCAGCCGACACACG AAGTGGTCAGGTGGACCAGTCGGACTCGAGATTTTCATCAGGC TTCCATCATCAAGGAGGGGATACACCGGAAAAGTACAATGCA GACCAAAGCAGTATATACCCTGGTGACTACACCGACCAGGCTA CCAGCAGCAGTATGGCTGCAATGACATTTCTTGAGACGACAGT ACAATCACTAGT Η ηλεκτρονική στη συνέχεια ανάλυση, µε τη βοήθεια των βάσεων δεδοµένων, οδήγησε στο συµπέρασµα ότι το προϊόν αντιστοιχεί στο γονίδιο του COUP-TF χωρίς όµως αυτό να φέρει το επιπλέον εξώνιο.

108 Οµοταξία Ολοθούρια Holothuria polii Από τις ωοθήκες του Ολοθούριου Holothuria polii αποµονώθηκε ολικό RNA, η συγκέντρωση του οποίου προσδιορίστηκε µε φωτοµέτρηση και βρέθηκε ίση µε 82 µgr/ml. Kingdom: Animalia Phylum: Echinodermata Class: Holothuroidea Order: Aspidochirotida Family: Holothuriidae Genus: Holothuria Πειράµατα προηγούµενων ετών είχαν καταστήσει δυνατή την αποµόνωση της αλληλουχίας του COUP-TF στο συγκεκριµένο οργανισµό. Με βάση την αλληλουχία αυτή σχεδιάστηκαν ειδικοί για τον οργανισµό εκκινητές, οι οποίοι παραθέτονται ακολούθως: Hp fwd out: 5 -CTG CCC GAT TGA TCA GCA CCA TC-3 Hp fwd in: 5 -CCA GTG TCA GTA CTG CCG TCT TA-3 Hp rev in: 5 -CGA TGC CCA TAA CGC TAT TGG TT-3 Χρησιµοποιώντας ως εκκινητές τους Hp fwd in και Hp rev in πραγµατοποιήσαµε RT-PCR. Κατά την ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της RT-PCR σε gel αγαρόζης 1.5% παρατηρούνται δύο προϊόντα µεγέθους περίπου 280 και 320 bps αντίστοιχα. Τα προϊόντα αυτά, γνωρίζοντας την ακριβή θέση των εκκινητών, είναι προϊόντα επιθυµητού µεγέθους. Αυτό ακριβώς το γεγονός αποτέλεσε το έναυσµα για τον καθαρισµό των προϊόντων της RT-PCR και την κλωνοποίησή τους. Μ 500 bps 320 bps 280 bps Εικόνα 12: Ηλεκτροφορηση των προιόντων της RT-PCR.

109 102 Η κλωνοποίηση των προϊόντων της RT-PCR και οι πέψεις των ανασυνδυασµένων πλασµιδίων που αποµονώθηκαν, µε την ενδονουκλεάση EcoR1, έδειξαν ότι ο κλώνος 3 περιείχε τη µεγάλη ισοµορφή. 2 µgr από τον κλώνο αυτόν µαζί µε αντίστοιχη ποσότητα από τον κλώνο 1 εστάλησαν για νουκλεοτιδική αλληλούχηση. Μ bps Μ bps Εικόνα 13: : Πέψη µε EcoR1 ανασυνδυασµένων πλασµιδίων µε ένθεµα από τον COUP-TF του Holothurio poli. Μόνο ο κλώνος 3 έφερε µια µεγάλη νουκελοτιδική ισοµορφή. Η νουκλεοτιδική ανάλυση του µικρού κλώνου 1, µεταξύ των θέσεων αναγνώρισης της ενδονουκλεάσης περιορισµού EcoR1, έδωσε ένα προϊόν µεγέθους 244 nt και είναι η ακόλουθη: GATTCCAGTGTCAGTACTGCCGTCTTAAGAAGTGCCTGAAGAT GGGCATGCGACGTGAAGCCGTCCAAAGAGGCCGCATGCCACC GACACAACCAGGTCCAGGACAATACCTGGATGGTCGCTTCGAG GGACATTCCTTCTTGTCAGGTTACATATCTCTACTCCTCCGAGC AGAGCCATACCCAACGTCCAGATACGCACAGTGTATGCAAACC AATAGCGTTATGGGCATCGAATCACTAGT

110 103 Η νουκλεοτιδική ανάλυση του µεγάλου κλώνου 3, µεταξύ των θέσεων αναγνώρισης της ενδονουκλεάσης περιορισµού EcoR1, έδωσε ένα προϊόν µεγέθους 310 nt και είναι η ακόλουθη: GATTCCAGTGTCAGTACTGCCGTCTTAAGAAGTGCCTGAAGAT GGGCATGCGACGTGAAGATACCCGTTCCAAATCGTTTGATCTG CAGAACCACAGAGGCTGGCAAAACGGGGACCATTTTAACACC GTCCAAAGAGGCCGCATGCCACCGACACAACCAGGTCCAGGA CAATACCTGGATGGTCGCTTCGAGGGACATTCCTTCTTGTCAG GTTACATATCTCTACTCCTCCGAGCAGAGCCATACCCAACGTC CAGATACGCACAGTGTATGCAAACCAATAGCGTTATGGGCATC GAATCACTAGT Σύγκριση της µεγάλης και της µικρής ισοµορφής της πρωτείνης του COUP-TF στον οργανισµό Holothurio poli. Τα συµπεράσµατα που προκύπτουν από την παραπάνω ανάλυση είναι τα εξής: Α. Στο ολοθούριο H. poli παρατηρείται το επιπλέον εξόνιο στο γονίδιο του COUP-TF και ως εκ τούτου συντελείται εναλλακτικό µάτισµα. Β. Το επιπλέον εξόνιο στον οργανισµό H. poli δεν εµφανίζει καµία οµοιότητα µε το επιπλέον εξόνιο που παρατηρείται στους αχινούς S. Purpuratus και P. lividus, καθώς κα στον αστερία Patiria miniata. Tο µέγεθος του εξονίου είναι 66 nt τα οποία αντιστοιχούν σε ένα προϊόν µεγέθους 22 αµινοξέων. 1.4 Οµοταξία Αµφίουροι Amphiura filiphormis Για να διαπιστώσουµε αν στον οργανισµό Amphiura filiphormis υπάρχει το επιπλέον εξόνιο στο γονίδιο του COUP-TF και λαµβάνει χώρα εναλλακτικό µάτισµα των µεταγράφων του, πραγµατοποιήσαµε RT-PCR και ακολούθως Nested PCR χρησιµοποιώντας τους

111 104 εκφυλισµένους εκκινητές. Ως υπόστρωµα χρησιµοποιήθηκε ολικό RNA σε αιθανόλη (8.9 µgr/100µl) αποµονωµένο από έµβρυα 12 ωρών του συγκεκριµένου οργανισµού. Kingdom: Animalia Phylum: Echinodermata Subphylum: Eleutherozoa Class: Ophiuroidea Order: Ophiurida Suborder: Gnathophiurina Family: Amphiuridae Genus: Amphiura Κατά την ηλεκτροφόρηση των προιόντων της nested PCR παρατηρούνται δύο προιόντα µεγέθους περίπου 350 και 280 bps αντίστοιχα. M RT-PCR Nested 500 bps 350bps 280bps Εικόνα 14: Η ηλεκτροφόρηση των προιόντων της RT-PCR και Nested PCR Τα προϊόντα της Nested PCR µετά τον καθαρισµό τους κλωνοποιήθηκαν και οι πέψεις των αποµονωθέντων ανασυνδυασµένων πλασµιδίων, µε την ενδονουκλεάση EcoR1, έδειξαν ότι όλοι οι κλώνοι περιείχαν ένα ένθεµα µεγέθους περίπου 380 bps. 2 µgr από τους κλώνους 4 και 9 εστάλησαν για νουκλεοτιδική αλληλούχηση.

112 105 Μ bps Εικόνα 15: : Πέψη µε EcoR1 ανασυνδυασµένων πλασµιδίων µε ένθεµα από τον COUP-TF του Amphiura filiphormis. Όλοι οι κλώνοι έφεραν ένθεµα του ίδιου µεγέθους. Η ηλεκτρονική ανάλυση, µε τη χρήση των βάσεων δεδοµένων, µας οδήγησε στο συµπέρασµα ότι και οι δύο κλώνοι δεν αντιστοιχούν στο γονίδιο του COUP-TF. Πειράµατα προηγούµενων ετών είχαν καταστήσει δυνατή τη αποµόνωση της αλληλουχίας του COUP-TF στο συγκεκριµένο οργανισµό. Με βάση την αλληλουχία αυτή σχεδιάστηκαν ειδικοί για τον οργανισµό εκκινητές, οι οποίοι παραθέτονται ακολούθως: Af fwd out: 5 -CTG TCC GAT CGA TCA GCA CCA TC-3 Af fwd in: 5 -CCA GTG CCA GTA CTG CCG TCT CA-3 Af rev in: 5 -ATG GCT CGG CCC GCA GCA AGA G-3 Χρησιµοποιώντας ως εκκινητές τους Af fwd in και Af rev in πραγµατοποιήσαµε µια νέα αντίδραση RT-PCR χρησιµοποιώντας το ίδιο υπόστρωµα (ολικό RNA 8.9 µgr/100µl, αποµονωµένο από έµβρυα 12 ωρών του συγκεκριµένου οργανισµού). Η ηλεκτροφόρηση του προϊόντος της RT-PCR σε gel αγαρόζης µας έδωσε την ακόλουθη εικόνα:

113 106 M 500 bps Εικόνα 16: Ηλεκτροφόρηση των προιόντων της RT-PCR Λόγω των πολλών παραπροϊόντων κρίθηκε ακατάλληλο το δείγµα για περεταίρω καθαρισµό και κλωνοποίηση. 2. Φύλο Χαιτόγναθων Αντιπρόσωπος Sagitta minima Η µελέτη του εναλλακτικού µατίσµατος στον αντιπρόσωπο αυτόν των Χαιτόγναθων πραγµατοποιήθηκε µε τη χρήση των εκφυλισµένων εκκινητών και τη διεξαγωγή πειραµάτων RT-PCR και Nested PCR. Η ηλεκτροφόρηση του προϊόντος της PCR αποκάλυψε µόνο µια ζώνη επιθυµητού µεγέθους. Η κλωνοποίηση αυτής οδήγησε στην αποµόνωση µιας µόνο µικρής ισοµορφής από την οποία απουσίαζε το επιπλέον εξώνιο.(πειράµατα προηγούµενων ετών). 3.Φύλο Xenoturbellida Xenoturbella bocki Για την πραγµατοποίηση RT-PCR χρησιµοποιήθηκε ως υπόστρωµα ολικό RNA το οποίο αποµονώθηκε από τεµάχιο ιστού του συγκεκριµένου οργανισµού, συντηρηµένο σε RNA later, ενώ ως εκκινητές χρησιµοποιήθηκαν οι degenerate primers. Η ηλεκτροφόρηση του προϊόντος της nested PCR που ακολούθησε, έδειξε την παρουσία ενός µόνο προϊόντος µεγέθους περίπου 300 bps.

114 bps Nested PCR M Kingdom: Animalia Superphylum: Deuterostomia Phylum: Xenoturbellida Family: Xenoturbellidae Genus: Xenoturbella Species X. bocki Westblad, 1949 X. westbladi Israelsson, bps Εικόνα 17: Ηλεκτροφόρηση του προιόντος της Nested PCR. Το προϊόν της nested PCR ακολούθως κλωνοποιήθηκε και οι πέψεις των ανασυνδυασµένων πλασµιδίων µε την ενδονουκλεαση περιορισµού EcoR1 είχαν ως αποτέλεσµα να λάβουµε µόνο ένα προϊόν µεγέθους περίπου 300 bps. Από τους παρακάτω ταυτόσηµους σε µέγεθος κλώνους, 2 µgr από τον πρώτο στάλθηκαν για νουκλεοτιδική ανάλυση. Μ bps Εικόνα 18: : Πέψη µε EcoR1 ανασυνδυασµένων πλασµιδίων µε ένθεµα από τον COUP-TF της Xenoturbella bocki. Όλοι οι κλώνοι έφεραν ένθεµα ανάλογου µεγέθους. Η νουκλεοτιδική ανάλυση του πρώτου αυτού κλώνου, µεταξύ των θέσεων αναγνώρισης της ενδονουκλεάσης περιορισµού EcoR1, έδωσε ένα προϊόν µεγέθους 286 nt και είναι η ακόλουθη:

115 108 GATTAATTGTCCGATTGATCAGCATCATCGAAACCAGTGTCAG TACTGCCGTCTTAAGAAGTGCCTGAAGATGGGCATGCGACGTG AAGCCGTCCAAAGAGGCCGCATGCCACCGACACAACCAGGTC CAGGACAATACCTGGATGGTCGCTTCGAGGGACATTCCTTCTT GTCAGGTTACATATCTCTACTCCTCCGAGCAGAGCCATACCCA ACGTCCAGATACGCACAGTGTATGCAAACCAATAGCGTTATGG GCATTGACAATATCTGCGAAATCACTAGT Η σύγκριση της παραπάνω αλληλουχίας µε τα στοιχεία της βάσης δεδοµένων, µιας και το γονιδίωµα του οργανισµού X. bocki έχει αλληλουχηθεί, οδήγησε στo συµπέρασµα ότι πρόκειται για µέρος της αλληλουχίας του γονιδίου COUP-TF στο συγκεκριµένο οργανισµό. 4. Φυλο Ηµιχορδωτών Αντιπρόσωπος Sakoglossus kowalevskii Η µελέτη στον αντιπρόσωπο των Ηµιχορδωτών Sakoglossus kowalevskii πραγµατοποιήθηκε µε ειδικά σχεδιασµένους εκκινητές σύµφωνα µε την αλληλουχία του COUP-TF του συγκεκριµένου οργανισµού και έδειξε ότι και σε αυτόν τον οργανισµό τα COUP-TF µετάγραφα υφίστανται εναλλακτικό µάτισµα παράγοντας όµως διαφορετικά σε µέγεθος πρωτεϊνικά προϊόντα από αυτά των εχινοδέρµων. Πιο συγκεκριµένα, στον οργανισµό Sakoglossus kowalevskii η µεγάλη πρωτεϊνική ισοµορφή του COUP-TF διαφέρει από τη µικρή κατά µόνο τρία αµινοξέα. (Πειράµατα προηγούµενων ετών).

116 Υπόφυλο Ουροχορδωτών Ciona intestinalis Για την πραγµατοποίηση RT-PCR χρησιµοποιήθηκε ως υπόστρωµα ολικό RNA το οποίο αποµονώθηκε από εναιώρηµα κυττάρων σε συντηρητικό µέσο Trisol ( είγµα 1) και RNA later ( είγµα 2), ενώ ως εκκινητές χρησιµοποιήθηκαν ειδικοί για τον οργανισµό αυτόν εκκινητές. Η ηλεκτροφόρηση του προϊόντος της RT-PCR σε gel αγαρόζης 1.5% µας έδωσε πολλές ζώνες για το δείγµα 1 και 2 ζώνες µικρότερης όµως έντασης για το δείγµα 2, όπως διακρίνεται στην εικόνα που ακολουθεί. Μ Εικόνα 19: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της RT-PCR. Kingdom: Animalia Phylum: Chordata Subphylum: Urochordata Class: Ascidiacea Order: Enterogona Suborder: Phlebobranchia Family: Cionidae Genus: Ciona Species: C. intestina Ακολούθως, πραγµατοποιήθηκε Nested PCR τόσο για το δείγµα 1 όσο και για το δείγµα 2, χρησιµοποιώντας αυτή τη φορά τους εσωτερικούς εκφυλισµένους εκκινητές (LBD in και DBD in). Η

117 110 ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της nested PCR που ακολούθησε έδωσε τρεις ζώνες για το δείγµα 1 και δύο ζώνες για το δείγµα 2 επιθυµητού µεγέθους (η µία ζώνη ωστόσο εµφανίζει πολύ µεγαλύτερη ένταση σε σχέση µε την άλλη), όπως διακρίνεται στην εικόνα που ακολουθεί. Το αποτέλεσµα αυτό αποδίδεται στην καλύτερη καθαρότητα του ολικού RNA του δεύτερου δείγµατος. Για το λόγο αυτό επιλέξαµε να καθαρίσουµε και να κλωνοποιήσουµε µόνο το προϊόν της δεύτερης αντίδρασης. M Εικόνα 20: Ηλεκτροφόρηση των προιόντων της Nested PCR. Οι πέψεις των ανασυνδυασµένων πλασµιδίων µε την ενδονουκλεαση περιορισµού EcoR1 είχαν ως αποτέλεσµα να λάβουµε µόνο ένα προιόν µεγέθους περίπου 300 bps. Από τους παρακάτω ταυτόσηµους σε µέγεθος κλώνους, 2 µgr από τον δεύτερο στάλθηκαν για νουκλεοτιδική ανάλυση. Μ Εικόνα 21: : Πέψη µε EcoR1 ανασυνδυασµένων πλασµιδίων µε ένθεµα από τον COUP-TF της Ciona intestinalis. Όλοι οι κλώνοι έφεραν ένθεµα ανάλογου µεγέθους. Η νουκλεοτιδική ανάλυση του δεύτερου αυτού κλώνου, µεταξύ των θέσεων αναγνώρισης της ενδονουκλεάσης περιορισµού EcoR1, έδωσε ένα προϊόν µεγέθους 304 nt και είναι η ακόλουθη:

118 111 GATTAATTGTCCGATAGACCAGCATCATAGAAATCAATGCCAA TATTGCCGACTGAATAAGTGTGTGAAGATCGGGATGCGAAGGG AAGCTGTACAAAGGGGACGCATGCCGCCCAGTCAACCCCATA CTACAGGCCAATATGCGATAACCAACGGTGTTGAAAGCAACTT CGGTCCAGGGTATATGTCCGGTTATATATCCATGTTGTTAAGA GCCGAGCCTTGCCCAACGTCGAGATTTGCTTTGCAATGTCCCG TCCCAAACCAAATTATGGGCATCGACAACATATGCGAAATCAC TAGT Η σύγκριση της παραπάνω αλληλουχίας µε τα στοιχεία της βάσης δεδοµένων, µιας και το γονιδίωµα του οργανισµού C. intestinalis έχει αλληλουχηθεί, οδήγησε στo συµπέρασµα ότι πρόκειται για µέρος της αλληλουχίας του γονιδίου COUP-TF στο συγκεκριµένο οργανισµό.

119 112 Σύγκριση των αποτελεσµάτων όλων των υπό µελέτη οργανισµών Σε µια προσπάθεια να µελετηθεί διεξοδικότερα το φαινόµενο του εναλλακτικού µατίσµατος και συγκεκριµένα να διαπιστωθεί αν πρόκειται για ένα φαινόµενο συντηρηµένο στα εχινοειδή, αποκλειστικό ή όχι αυτών, ένα πρώτο συµπέρασµα που προέκυψε είναι ότι το εναλλακτικό µάτισµα είναι συντηρηµένο και εµφανίζεται σταθερά στα είδη των αχινών που µελετήθηκαν (Paracentrotus lividus, Spaerechinus granularis, Strongylocentrotus purpuratus). Τα αποτελέσµατα µας έδειξαν ότι στο φύλο των Εχινοδέρµων εναλλακτικό µάτισµα συµβαίνει σε όλα τα εχινοειδή που µελετήθηκαν (Paracentrotus lividus, Strongylocentrotus purpuratus, Sphaerechinus granularis), παράγοντας δύο πρωτεϊνικές ισοµορφές που διαφέρουν κατά 21 αµινοξέα τα οποία προστίθενται στην καρβοξυτελική επέκταση (CTE) της επικράτειας πρόσδεσης στο DNA (DBD) όπως ακριβώς στον αχινό Paracentrotus lividus. Το επιπλέον πεπτίδιο των 21 αµινοξέων εµφανίζει µικρές µόνο διαφορές της τάξης των 2 µόλις αµινοξέων, γεγονός αναµενόµενο λόγω µικρής εξελικτικής απόστασης ανάµεσα στα συγκεκριµένα είδη των εχινοειδών.

120 113 Με το πρόγραµµα BLAST ψάξαµε στις βάσεις δεδοµένων για αλληλουχία οµόλογη µε αυτήν του δεύτερου εξονίου του γονιδίου COUP-TF του αχινού Paracentrotus lividus. Η αναζήτηση αυτή δεν έδειξε οµόλογη αλληλουχία στα ήδη αλληλουχηµένα γονιδιώµατα και ESTs µε εξαίρεση αυτήν του αχινού Strongylocentrotus purpuratus. Για να µελετήσουµε κατά πόσο λαµβάνει χώρα εναλλακτικό µάτισµα στα πρωταρχικά µετάγραφα του COUP και σε άλλους οργανισµούς εκτός από τους αχινούς Paracentrotus lividus, Strongylocetrotus purpuratus, Sphearechinus granularis, επιλέχθηκαν οργανισµοί αντιπροσωπευτικοί για τις υπόλοιπες οµοταξίες του φύλου των εχινοδέρµων (Patiria miniata, Marthasteria glacialis, Amphiura filiphormis, Holothuria polii), των φύλων Xenoturbellida, των Χαιτόγναθων (Sagitta minima) και των Ηµιχορδωτών (Sakoglossus kowalevskii) καθώς και του υποφυλου των Ουροχορδωτών (Ciona intestinalis). Από τους οργανισµούς αυτούς αποµονώθηκε ολικό RNA το οποίο αποτέλεσε το υπόστρωµα για την πραγµατοποίηση αντιδράσεων RT-PCR. Σηµαντική ώθηση προς την επίτευξη του στόχου µας αποτέλεσε η κατασκευή εκφυλισµένων εκκινητών (degenerate primers) που χρησιµοποιούνται ευρέως σε µελέτες εξέλιξης. Οι εκκινητές µπορούν να υβριδοποιούνται µε οποιοδήποτε γονίδιο COUP-TF, καθώς σχεδιάστηκαν µε βάση τις πιο συντηρηµένες αλληλουχίες των γονιδίων COUP-TF 17 οργανισµών. Οι εκκινητές αυτοί περιέχουν επίσης σε ορισµένες θέσεις το νουκλεοσίδιο ινοσίνη που µπορεί να σχηµατίζει δεσµούς µε οποιαδήποτε αζωτούχο βάση. Για τους οργανισµούς Sakoglossus kowalevskii και Ciona intestinalis σχεδιαστηκαν ειδικοί για τους οργανισµούς αυτούς εκκινητές αφού το γονιδίωµα τους είναι αλληλουχηµένο και είµαστε σε θέση να γνωρίζουµε την ακριβή αλληλουχία του COUP-TF στους συγκεκριµένους οργανισµούς.

121 114 Η αναγωγή όλων των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών σε αµινοξικό επίπεδο δίνει τα ακόλουθα αποτελέσµατα: Η µετάβαση από την οµοταξία των Εχινοειδών, στην οµοταξία των Εχινοδέρµων Ολοθούρια και στο είδος Holothuria polii δε συντηρεί ένα πεπτίδιο ανάλογου µεγέθους και αµινοξικής σύστασης. Συγκεκριµένα η αµινοξική σύσταση αυτού αλλάζει άρδην ενώ ταυτόχρονα το µέγεθος του προσαυξάνεται κατά ένα αµινοξύ (συνολικό µέγεθος 22 αµινοξέα). Στον αστερία Patiria miniata (οµοταξία αστεροειδή) το επιπλέον εξώνιο της µεγάλης ισοµορφής που αποµονώθηκε έχει µέγεθος 14 µόλις αµινοξέα, η ακολουθία των οποίων διαφέρει από αυτήν των υπολοίπων οργανισµών. Η µελέτη που αφορούσε στον αντιπρόσωπο των Ηµιχορδωτών (Saccoglossus kowalevskii) πραγµατοποιήθηκαν µε ειδικά σχεδιασµένους εκκινητές σύµφωνα µε την αλληλουχία COUP-TF του συγκεκριµένου οργανισµού και έδειξε ότι και σε αυτόν τον οργανισµό τα COUP-TF µετάγραφα υφίστανται εναλλακτικό µάτισµα, παράγοντας όµως διαφορετικά ως προς το µέγεθος πρωτεϊνικά προϊόντα από αυτά των εχινοδέρµων. Πιο συγκεκριµένα, στο Saccoglossus kowalevskii η µεγάλη πρωτεϊνική COUP-TF ισοµορφή διαφέρει από την µικρή κατά τρία µόνο αµινοξέα.

122 115 Στους άλλους αντιπροσώπους των οµοταξιών του φύλου των Εχινοδέρµων που µελετήθηκαν (Marthasterias glacialis, Amphiura filiformis) καθώς και των φύλων Xenoturbellida, των Χαιτόγναθων (Sagitta minima) και του υπόφυλου των Ουροχορδωτών (Ciona intestinalis) αποµονώθηκε µόνο η µικρή ισοµορφή του COUP-TF. Σε κάθε περίπτωση η µη αποµόνωση κλώνου που να φέρει τη µεγάλη ισοµορφή, δε συνεπάγεται πάντα και την απουσία εναλλακτικού µατίσµατος αλλά µπορεί να οφείλεται και στην αδυναµία αποµόνωσης της µεγάλης ισοµορφής. Πρέπει ωστόσο να τονίσουµε ότι η επιτυχία των πειραµάτων αυτών έγκειται στο γεγονός ότι, µε βάση τις αλληλουχίες των οργανισµών αυτών, σχεδιάστηκαν ειδικοί εκκινητές για τους οργανισµούς αυτούς µε σκοπό να επαναλάβουµε µελλοντικά τα πειράµατα χωρίς τον φόβο επιµολύνσεων καθιστώντας τις συνθήκες πιο ειδικές.

123 116 Συζήτηση Αν και ο µεταγραφικός παράγοντας COUP-TF έχει αποµονωθεί και µελετηθεί σε µία πληθώρα οργανισµών, λίγα είναι γνωστά σχετικά µε την ύπαρξη ή όχι εναλλακτικού µατίσµατος στα πρωτογενή µετάγραφά του. Η µόνη µελέτη που µιλούσε για την παρουσία εναλλακτικού µατίσµατος σε πρωτογενή µετάγραφα του COU-TF είχε να κάνει µε τον οργανισµό C. elegans. Στην περίπτωση αυτή το εναλλακτικό µάτισµα οδηγούσε στην παραγωγή δύο ισοµορφών των πρωτεϊνών unc-55a και unc-55b (πρωτεΐνες οµόλογες του COUP-TF) µε την τελευταία να είναι 13 αµινοξέα µεγαλύτερη από την πρώτη. Ταυτόχρονα η µελέτη αυτή αποτέλεσε και την πρώτη ένδειξη ότι οι διαφορετικές αυτές ισοµορφές επιτελούν και διαφορετικές λειτουργίες µιας και έχει δειχθεί πειραµατικά ότι η unc-55a ισοµορφή είναι απαραίτητη τόσο στα αρσενικά όσο και ερµαφρόδιτα άτοµα για την κίνηση τους, ενώ η ισοµορφή unc-55b, είναι απαραίτητη στα αρσενικά άτοµα για το ζευγάρωµα τους (Shan and Walthall, 2008). Όπως ήδη έχουµε αναφέρει, το γονίδιο COUP-TF αποτελείται, σε όλους τους µέχρι σήµερα µελετηµένους οργανισµούς, από τρία εξώνια και δύο εσώνια που διακόπτουν την κωδική περιοχή του γονιδίου σε συντηρηµένες θέσεις. Ωστόσο, πειράµατα τα οποία διενεργήθηκαν για πρώτη φορά στο εργαστήριο µας, έδειξαν ότι ο αχινός Paracentrotus lividus διαφοροποιείται από αυτό το µοντέλο καθώς το γονίδιο του COUP-TF στον οργανισµό αυτό αποτελείται από τέσσερα εξώνια. Συγκεκριµένα, έχει βρεθεί ότι το επιπλέον εξώνιο βρίσκεται µεταξύ του πρώτου και του δεύτερου εξωνίου και έχει µέγεθος 63nt. Στο πρωτογενές µετάγραφο του COUP-TF συµβαίνει εναλλακτικό µάτισµα που έχει ως αποτέλεσµα την παραγωγή δύο mrnas. Το τελικό αποτέλεσµα είναι η παραγωγή δύο πολυπεπτιδικών αλυσίδων διαφορετικών ως προς το µέγεθος λόγω της εισαγωγής 21 επιπρόσθετων αµινοξέων στην καρβόξυτελική περιοχή (CTE) της επικράτειας πρόσδεσης στο DNA (DBD). Μάλιστα, εναλλακτικό µάτισµα λαµβάνει χώρα σε όλα τα στάδια από τα αγονιµοποίητα ωάρια εως τον πλουτέα και σε όλους τους ιστούς που o COUP-TF εκφράζεται (ωοκύτταρα, κοιλωµατικά κύτταρα, µύες, έντερο). (Κοζάου Z., 2006). Ποιος είναι όµως ο ρόλος της µεγάλης ισοµορφής; Τι αλλαγές προκαλεί στην λειτουργικότητα της η ένθεση των 21 πρόσθετων αµινοξέων στη CTE; Όπως προέκυψε από EMSA ανάλυση, οι in vitro συντιθέµενες ισοµορφές του PlCOUP-TF διαφοροποιούνται ως προς το πρότυπο

124 117 πρόσδεσης τους στο DNA. Συγκεκριµένα, χρησιµοποιώντας τις in vitro συντιθέµενες ισοµορφές του PlCOUP-TF και σχεδιάζοντας σειρά στοιχείων απόκρισης µε βάση το µοτίβο του στοιχείου C1R στον υποκινητή του γονιδίου CyIIIb του αχινού έγινε µια προσπάθεια να αναλυθεί η ικανότητα πρόσδεσης των δύο ισοµορφών. Για τη µικρή ισοµορφή παρατηρείται πρόσδεση σε όλα τα στοιχεία απόκρισης. Τα αποτελέσµατα της EMSA ανάλυσης δεν εµφάνισαν ανάλογο πρότυπο πρόσδεσης και για τη µεγάλη ισοµορφή. Παρουσιάζει εξαιρετικό ενδιαφέρον το γεγονός ότι για τη µεγάλη PlCOUP-TF πρωτεΐνη δεν παρατηρήθηκε αποτελεσµατικό δέσιµο για κανένα από τα στοιχεία απόκρισης που µελετήθηκαν. (Κοζάου Z., 2006) Από την βιβλιογραφία γνωρίζουµε ότι η καρβοξυτελική επέκταση της DBD παίζει σηµαντικό ρόλο στη δηµιουργία επιπρόσθετων δεσµών µε την µικρή αύλακα του DNA, εκτός από τους βασικούς δεσµούς που δηµιουργούνται από τον πυρήνα της DBD στην µεγάλη αύλακα, κυρίως για τους υποδοχείς κλάσης II και για τους ορφανούς υποδοχείς. Τα δοµικά στοιχεία της CTE, A-box και T-box είναι καθοριστικά για την αναγνώριση του σωστού στοιχείου απόκρισης και την δηµιουργία συγκεκριµένων δεσµών µε αυτό ενώ συγχρόνως συµβάλλουν και στο σχηµατισµό της επιφάνειας διµερισµού του υποδοχέα. Επίσης έχει δειχθεί ότι η CTE µπορεί να λειτουργήσει ως περιοχή στρατολόγησης συν- ρυθµιστικών πρωτεϊνών (π.χ HMBG) ενισχύοντας τη δράση του εκάστοτε υποδοχέα (Claessens F. and Gewirth D.T 2004, Roemer,S.C et al., 2006, Giguere V et al., 1986, Jakob M. et a.,l 2007, Zhao Q. et a., 1998, Harding H.P and Lazar, M.A ). Πρόσφατα, βρέθηκε ότι η CTE κάποιων υποδοχέων µπορεί µετά τις αλληλεπιδράσεις µε την µικρή αύλακα να σχηµατίζει επιπλέον δεσµούς µε τον πυρήνα της DBD ενισχύοντας τη σταθερότητα του συµπλόκου υποδοχέα-dna (Gearhart M.D. et al., 2003). Ιδιαίτερα σηµαντική παρατήρηση που βοηθά άµεσα στην ερµηνεία των αποτελεσµάτων αυτών είναι η σηµαντικότητα του GRIP-box των ορφανών υποδοχέων στη δηµιουργία επαφών µε την µικρή αύλακα. Όπως έχει αναφερθεί από τους Dumas et al το 1994 αρχικά αλλά και από άλλες ερευνητικές οµάδες στη συνέχεια (Ueda et a.l, 1992, Wilson et al 1993, Harding and Lazar 1995, McBroom et al 1995), η απόσταση του GRIP-box από τον συντηρηµένο πυρήνα της DBD παίζει καθοριστικό ρόλο στην δηµιουργία επαφών µε το DNA. Λαµβάνοντας υπ' όψιν τα παραπάνω δεδοµένα µπορούµε να συµπεράνουµε ότι η παρατηρούµενη αδυναµία της µεγάλης ισοµορφής να αλληλεπιδρά µε το DNA οφείλεται στην ένθεση των 21 αµινοξέων

125 118 στη CTE. Η ένθεση αυτή προσδίδει τέτοια στερεοδιαµόρφωση στην πρωτεΐνη, η οποία την εµποδίζει να προσδεθεί στο C1R (ή σε άλλα ειδικά του COUP-TF στοιχεία απόκρισης που έχουν χρησιµοποιηθεί στο παρελθόν στο εργαστήριο µας). Η ιδιότητα αυτή της µεγάλης ισοµορφής ενδεχοµένως σχετίζεται και µε την επαγόµενη από την ένθεση, αύξηση της απόστασης του GRIP-box από τον πυρήνα της DBD. Πιο συγκεκριµένα, στη µικρή COUP-TF ισοµορφή το GRIP-box απέχει από τα συντηρηµένα νουκλεοτίδια GM (τέλος πυρήνα DBD) πέντε αµινοξέα ενώ στην µεγάλη ισοµορφή, λόγω της ένθεσης, το GRIP-box µετατοπίζεται και απέχει 26 αµινοξέα. Η διαφορά αυτή είναι ιδιαίτερα σηµαντική ώστε να εξηγεί την ανικανότητα της CTE να εισέλθει στην µικρή αύλακα και να δηµιουργήσει επαφές µε το DNA. Η αλληλουχία της CTE της μικρής και της μεγάλης ισομορφής μετά τα συντηρημένα GM στο τέλος του πυρήνα της DBD (γαλάζιο). Σημειώνεται το GRIP-box (κίτρινο) και στις δύο ισομορφές και η ένθεση των 21 αμινοξέων στην μεγάλη ισομορφή (πράσινο). Επίσης είναι πιθανόν η ένθεση να εµποδίζει τις αλληλεπιδράσεις του πυρήνα της DBD µε το στοιχείο απόκρισης, επηρεάζοντας την στερεοδιαµόρφωση των δύο δάκτυλων ψευδαργύρου. Η αρχική µας υπόθεση ήταν ότι η σύνθεση της ένθεσης των 21 αµινοξέων είναι υπεύθυνη για την παρατηρούµενη αδυναµία της µεγάλης ισοµορφής να προσδεθεί στο DNA. Οι σηµειακές µεταλλάξεις που προκαλέσαµε στην µεγάλη ισοµορφή µεταλλάσσοντας αρχικά και τις δύο προλίνες της ένθεσης σε αλανίνες (Ρ216/224Α) και µετά κάθε µία προλίνη µεµονωµένα (Ρ216Α και Ρ224Α), έδειξαν ότι οι προλίνες στις θέσεις 216 και 224 δεν επηρεάζουν την πρόσδεση των οµοδιµερών των µεγάλων ισοµορφών, αφού και οι τρεις µεταλλαγµένες µεγάλες ισοµορφές δεν έχουν την ικανότητα να προσδένονται στο στοιχείο απόκρισης C1R. Συνεπώς οι αλλαγές αυτές δεν απαλείφουν τις συνέπειες