ΜΕΛΕΤΗ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΚΑΙ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΩΝ- ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ- ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΜΟΡΙΑΚΗ ΙΑΤΡΙΚΗ. Βιοχημεία Ι Ε-1

Transcript

1 ΜΕΛΕΤΗ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΚΑΙ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΩΝ- ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ- ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΜΟΡΙΑΚΗ ΙΑΤΡΙΚΗ Βιοχημεία Ι Ε-1

2 Η Γενετική Μηχανική έχει πολλές εφαρμογές στη Μοριακή Ιατρική για τη διάγνωση και τη θεραπευτική αγωγή Διάγνωση με εντοπισμό μεταλλάξεων Έλεγχος πατροτητας Ιατροδικαστική Παραγωγή ορμονών (ινσουλίνη, αυξητικές ορμόνες) Γονιδιακή θεραπεία Βιοχημεία Ι Ε-2

3 Η ραγδαία ανάπτυξη της Μοριακής Βιολογίας, Βιοτεχνολογίας και Βιοϊατρικής πηγάζει από την πρόοδο Στην κατανόηση του μηχανισμού αντιγραφής και μεταγραφής DNA Στην αξιοποίηση της δυνατότητας υβριδισμού Στη μελέτη των περιοριστικών ενδονουκλεασών Στη μεθοδολογία αποτύπωσης Στην αλληλούχιση DNA Στη σύνθεση ολιγονουκλεοτιδίων Στην ανάπτυξη της Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυμεράσης, PCR (Polymerase Chain Reaction) Στην τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA Στη διαθεσιμότητα υψηλής υπολογιστικής ισχύος Στην ανάπτυξη μικροσυστοιχιώνdna Βιοχημεία Ι Ε-3

4 Ροή γενετικής πληροφορίας Αντιγραφή Μεταγραφή Μετάφραση Αντιγραφή: Παρέχει 2 μόρια DNA ίδια με το αρχικό και εξασφαλίζει τη μεταβίβαση της γενετικής πλροφορίας με εξαιρετική ακρίβεια Μεταγραφή: Η αλληλουχία βάσεων του DNA καταγράφεται σαν αλληλουχία συμπληρωματικών βάσεων σε ένα μονόκλωνο μόριο mrna Μετάφραση: Τριπλέτες βάσεων του mrna κωδικοποιούν συγκεκριμένα αμινοξέα και κατευθύνουν την παραγωγή πρωτεινών με συγκεκριμένη αλληλουχία. Τα κωδικόνια αναγνωρίζονται από trna που μεταφέρουν τα αντίστοιχα αμινοξέα. Το ριβοσώματα είναι μηχανήματα πρωτεϊνοσύνθεσης. Βιοχημεία Ι Δ-4

5 Η Γενετική Μηχανική μιμείται την αντιγραφή του DNA DNA DNA Νεοσυντιθέμενη αλυσίδα DNA συγκροτείται με προϋπάρχουσα σαν εκμαγείου Η DNA πολυμεράση καθοδηγείται από το εκμαγείο και καταλύει το σχηματισμό νέου φωσφοδιεστερικού δεσμού στο 3 άκρο. Απαιτούνται: 1. Εκμαγείο (μονόκλωνο ή δίκλωνο DNA με ασυνέχεια) 2. Πρόδρομες ενώσεις datp, dgtp, dttp, dctp 3. Αλυσίδα εκκίνησης με ελεύθερο 3 -ΟΗ Η διπλή έλικα διευκολύνει την ακριβή μεταβίβαση της γενετικής πληροφορίας Βιοχημεία Ι Δ-5

6 Η αντιγραφή του DNA 3 πιθανά μοντέλα αντιγραφής Συντηρητική Ημισυντηρητική Μεικτή Βιοχημεία Ι Δ-6

7 Τo πείραμα Meselson και Stahl Tεχνική: Φυγοκέντρηση σε βαθμίδωση πυκνότητας Βιοχημεία Ι Δ-7

8 Η αντιγραφή του DNA είναι ημι-συντηρητική Βιοχημεία Ι Δ-8

9 Απορρόφηση Απορρόφηση σε 260 nm Μετουσίωση του DNA και υβριδισμός-- Η διπλή έλικα μπορεί να αποδιαταχθεί και να επαναδιαταχθεί Υποχρωμισμός: Οι βάσεις απορροφούν λιγότερο όταν αλληλεπιδρούν στη διπλή έλικα Μετουσίωση: Διαχωρισμός των δύο αλυσίδων με θέρμανση Μονόκλωνο Δίκλωνο Θερμοκρασία αποδιάταξης (Τm) λ (nm) Θερμοκρασία (⁰C) Βιοχημεία Ι Δ-9

10 Στη θερμοκρασία τήξης Τ m 50% μονόκλωνο, 50% δίκλωνο Πλούσιο σε A-T Κανονική σύσταση Πλούσιο σε G-C Βιοχημεία Ι Δ-10

11 Το φαινομενο του υβριδισμού Στα κύτταρα η αποδιάταξη διαμεσολαβείται από τις ελικάσες Μετουσίωση: Διαχωρισμός των δύο αλυσίδων με θέρμανση Επαναδιάταξη: Επανασύνδεση αλυσίδων με μείωση θερμοκρασίας, η βάση του υβριδισμού Βιοχημεία Ι Δ-11

12 Στο φαινόμενο του υβριδισμού βασίζονται σχεδόν όλες οι σύγχρονες μέθοδοι της τεχνολογίας ανασυνδυασμένου DNA Υβριδισμός: Διαδικασία με την οποία τμήμα DNA ή RNA (μεγέθους > 15bp), o ανιχνευτής, χρησιμοποιείται για τόν εντοπισμό άλλου τμήματος DNA που παρουσιάζει συμπληρωματικότητα βάσεων, το εκμαγείο Ανιχνευτής και εκμαγείο πρέπει να είναι (ή να γίνουν) μονόκλωνα για να υβριδισθούν. Βιοχημεία Ι Ε-12

13 Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες Τα μόρια DNA στα ανθρώπινα χρωμοσώματα είναι τεράστια και για να μελετηθούν πρέπει να θραυσματοποιηθούν: Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες αναγνωρίζουν συγκεκριμένες αλληλουχίες βάσεων και αποκόπτουν το DNA Παλινδρομικές αλληλουχίες MADAM I M ADAM SEX AT NOON TAXES ΝΙΨΟΝ ΑΝΟΜΗΜΑΤΑ ΜΗ ΜΟΝΑΝ ΟΨΙΝ Βιοχημεία Ι Ε-13

14 Συνεκτικά και λεία άκρα Βιοχημεία Ι Ε-14

15 Η ηλεκτροφόρηση DNA πολύτιμη αναλυτική μέθοδος O έλεγχος της καθαρότητας του DNA γίνεται με ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης (μέχρι 20kb) ή πολυακρυλαμιδίου (μέχρι 1000bp). Με την ίδια μέθοδο μπορούν να διαχωρισθούν με μεγάλη ευκρίνεια τα τμήματα που προκύπτουν από αποκοπή του DNA με περιοριστικά ένζυμα. Η χρώση γίνεται με βρωμιούχο αιθίδιο ή (για ραδιενεργό DNA) με αυτοραδιογραφία. Βιοχημεία Ι Ε-15

16 Η ηλεκτροφόρηση DNA πολύτιμη αναλυτική μέθοδος Κατά την ηλεκτροφόρηση διοχετεύεται ηλεκτρικό ρεύμα μέσω ηλεκτροδίων σε ένα μέσο (πηκτή ) στο οποίο τοποθετείται σε ένα σημείο το προς ανάλυση δείγμα. Φορτισμένα σωματίδια (κορμός DNA) κινούνται προς τα ηλεκτρόδια με ταχύτητες διαφορετικές ανάλογα με το φορτίο τους και αντιστρόφως ανάλογα με το μέγεθος τους. Βιοχημεία Ι Ε-16

17 Η Γενετική Μηχανική μιμείται την αντιγραφή του DNA DNA DNA Νεοσυντιθέμενη αλυσίδα DNA συγκροτείται με προϋπάρχουσα σαν εκμαγείου Η DNA πολυμεράση καθοδηγείται από το εκμαγείο και καταλύει το σχηματισμό νέου φωσφοδιεστερικού δεσμού στο 3 άκρο. Απαιτούνται: 1. Εκμαγείο (μονόκλωνο ή δίκλωνο DNA με ασυνέχεια) 2. Πρόδρομες ενώσεις datp, dgtp, dttp, dctp 3. Αλυσίδα εκκίνησης με ελεύθερο 3 -ΟΗ Η διπλή έλικα διευκολύνει την ακριβή μεταβίβαση της γενετικής πληροφορίας Βιοχημεία Ι Δ-17

18 Η αλληλούχηση του DNA και των γονιδιωμάτων βασίσθηκε στην ελεγχόμενη διακοπή της αντιγραφής (μέθοδο Sanger ή των δι-δεοξυ αναλόγων) Απαιτούνται: 1. Μονόκλωνο DNA προς αλληλούχηση (εκμαγείο) 2. Eκκινητής 3. DNA πολυμεράση 4. datp, dctp, dgtp, dttp 5. ddatp, ddctp, ddgtp, ddttp (διδεόξυ- ανάλογα των dνtp) Βιοχημεία Ι Ε-18

19 Ανάλογα με τη βάση τερματισμού άλλο θραύσμα (και χρώμα) Βιοχημεία Ι Ε-19

20 Συνοπτικά η μέθοδος Άγνωστη αλληλουχία: 3 ATCCAGCTA 5 Εκκινητής: 5 TAG 3 Προσθήκη datp+dgtp+dctp+dttp Διαχωρισμός σε 4 δοκ. σωλήνες Στον καθένα ddatp ή ddctp ή ddgtp ή ddttp και DNA πολυμεράση Ηλεκτροφόρηση Εμφάνιση Ανάγνωση Βιοχημεία Ι Ε-20

21 Η μέθοδος Sanger μπορεί να αυτοματοποιηθεί Σήμανση κάθε ddntp με διαφορετικό φθοριόχρωμα - 1 αντιδραση, 1 ηλεκτροφόρημα Βιοχημεία Ι Ε-21

22 Η αυτοματοποίηση της μεθόδου Sanger επέτρεψε την αλληλούχηση χρωμοσωμάτων-γενωμάτων Απαιτούνται επιπλέον χρήση αυτόματων on line ανιχνευτών φθορισμού (10000 bp/ημέρα) Ρομποτική στο χειρισμό δειγμάτων Ηλεκτροφόρηση σε τριχοειδές Αλληλούχιση του ανθρώπινου γενώματος με 1 συσκευή αυτοματοποίησης θα απαιτούσε 1000 χρόνια, άρα απαιτείται οπωσδήποτε και κατανομή εργασίας σε πολλές ομάδες που εργάζονται παράλληλα Βιοχημεία Ι Ε-22

23 Της αλληλούχησης του DΝΑ συνήθως προηγείται πέψη με περιοριστικά ένζυμα και κλωνοποίηση σε ένα φορέα, π.χ. βακτηριοφάγο Μ13. Βιοχημεία Ι Ε-23

24 Πολλαπλασιασμός DNA και κλωνοποίηση Κλώνος: Σύνολο μορίων ή κυττάρων πανομοιότυπων με το αρχικό μόριο ή κύτταρο Κλωνοποίηση γονιδίου ή τμήματος DNA είναι η δημιουργία πολλών αντιγράφων του Γιατί είναι απαραίτητη συχνά η κλωνοποίηση; Τα περισσότερα γονίδια απαντώνται σε μικρές ποσότητες στα κύτταρα-πρέπει αρα να παραχθεί μεγάλος αριθμός ταυτόσημων αντιτύπων-κλώνων για διαγνωστικούς ή ερευνητικούς σκοπούς Δύο μέθοδοι κλωνοποίησης: 1. Κλωνοποίηση DNA in vivo σε κύτταρα ξενιστή 2. Κλωνοποίηση DNA in vitro με PCR Βιοχημεία Ι Ε-24

25 Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, PCR (Polymerase Chain Reaction) Απλή και αποτελεσματική μέθοδος για την παραγωγή πολλαπλών αντιγράφων αλληλουχιών DNA και πολύτιμο εργαλείο στη Μοριακή Διαγνωστική, την Ιατροδικαστική και τη μελέτη της Μοριακής Εξέλιξης απαιτει ng DNA και οδηγεί στην παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων DNA με τις οποίες γίνεται εφικτή η εργαστηριακή μελέτη Απαιτούνται: 1. Το προς κλωνοποίηση DNA (Εκμαγείο) 2. Μεγάλη περίσσεια (10 8 ) ολιγονουκλεοτιδίων- εκκινητών με αλληλουχίες συμπληρωματικές προς τα άκρα του DNA και «μοναδικές» 3. Θερμοανθεκτική DNA πολυμεράση 4. dntp (datp, dctp, dgtp, dttp) Βιοχημεία Ι Ε-25

26 30-35 κύκλοι PCR μπορούν να οδηγήσουν στη δημιουργία (10 9 ) αντιγράφων του αρχικού DNA Η PCR βασίζεται σε επαναλαμβανόμενους κύκλους ανύψωσης και μείωσης της θερμοκρασίας 3 σταδίων: Αποδιάταξης για διαχωρισμό αλυσίδων εκμαγείου και εκκινητών με θέρμανση σε ~95 C Υβριδισμού προς σχηματισμό ετεροδιμερών εκμαγείουεκκινητή με μείωση της θερμοκρασίας (συνήθως ~3-5 C χαμηλότερα από την T m του αναμενόμενου ετεροδιμερούς) Σύνθεσης και επιμήκυνσης DNA με τη βοήθεια της πολυμεράσης Βιοχημεία Ι Ε-26

27 Στους επόμενους κύκλους σαν εκμαγεία δρουν και τα μόρια DNA που συντέθηκαν σε προηγούμενους κύκλους 2 νέα ετεροδιμερή DNAεπιμηκυμένου εκκινητή στον 1 ο κύκλο Θεωρητικά μετα από ν κύκλους 2 ν ενίσχυση πρακτικά φορές μετά 20 κύκλους, μετά 30 κύκλους Βιοχημεία Ι Ε-27

28 Γονίδιο προς ενίσχυση 5 3 CATATGAGAGACAGTGGGACCGTCTGATCGCACTGGACTTGAGGATTCTAGAGTAA GTATACTCTCTGTCACCCTGGCAGACTAGCGTCACCTGAACTCCTAAGATCTCATT 3 5 Μετά το διαχωρισμό αλυσίδων 5 3 CATATGAGAGACAGTGGGACCGTCTGATCGCACTGGACTTGAGGATTCTAGAGTAA TGAACTCCTAAGATCTCATT GTATACTCTCTGTCACCCTGGCAGACTAGCGTCACCTGAACTCCTAAGATCTCΑΤΤ CATATGAGAGACAGTGGGAC 5 3 Εκκινητης 1 5' CATATGAGAGACAGTGGGAC 3' Εκκινητης 2 5' TTACTCTAGAATCCTCAAGT 3' Βιοχημεία Ι Ε-28

29 Η σύνθεση ολιγονουκλεοτιδίων (ανιχνευτών και εκκινητών) για cdna και γονιδια γίνεται με αυτοματοποιημένες μεθόδους στερεάς φάσης και αποτελεί τη βάση για τη γενετική μηχανική Βιοχημεία Ι Ε-29

30 Η PCR χρησιμοποιείται σε πολλές εφαρμογές για την παραγωγή επαρκών ποσοτήτων DNA σαν το πρώτο στάδιο για περαιτέρω ανίχνευση/διάγνωση/μελέτη γονιδίων Ανίχνευση σημειακών μεταλλάξεων Γενετικός τύπος πολυμορφισμός σε περιοριστικές θέσεις Ανίχνευση μικροδορυφορικών επαναλήψεων Ανίχνευση ελλειμμάτων σε γονίδια που ευθύνονται για νόσημα Προσδιορισμός μήκους τρινουκλεοτιδικών επαναλήψεων υπεύθυνων για σοβαρά σύνδρομα (Fragile-X, αταξία Friedreich, Huntington s κλπ) Γενετικός έλεγχος πριν την εμφύτευση σε IVF από ένα μονο κύτταρο Έγκαιρη ανίχνευση HIV σε ασθενείς, έλεγχος δωρητών αίματος Βιοχημεία Ι Ε-30

31 Η PCR είναι πολύτιμο εργαλείο στη σύγχρονη Ιατροδικαστική, γιατί καθιστά εφικτή την ανάλυση DNA από μικροποσότητες (ίχνη αίματος ή από μια τρίχα κλπ) Μειονεκτήματα: 1. Μη εφαρμόσιμη για μεγάλα μόρια DNA (>3kb) 2. Η πιθανότητα καποιων λαθων απο την πολυμεραση που πολλαπλασιάζονται Βιοχημεία Ι Ε-31

32 Η κλωνοποίηση in vivo γίνεται σε κύτταρα ξενιστών που πολλαπλασιάζονται παρά την παρουσία ξένου DNA παράγοντας πολλαπλά αντίγραφά του. Ανασυνδυασμένο DNA: Τεχνητό μόριο DNA κατασκευασμένο από 2 τμήματα DNA που κανονικά δεν ανήκουν στο ίδιο μόριο. Το ένα τμήμα είναι το υπό κλωνοποίηση DNA και το αλλο ο φορέας κλωνοποίησης. Σαν ξενιστές συνήθως χρησιμοποιούνται συχνά κύτταρα βακτηρίων, που περιέχουν και μη χρωμοσωμικό DNA. Βιοχημεία Ι Ε-32

33 Τα πλασμίδια είναι φυσικά κυκλικά δίκλωνα μόρια dsdna αντιγράφονται πολλές φορές σε κάθε κυτταρική διαίρεση έχουν θέσεις αποκοπής από περιοριστικές ενδονουκλεάσες που σχηματίζουν κολλώδη άκρα χρησιμοποιούνται για την κατασκευή ανασυνδυασμένου DNA Βιοχημεία Ι Ε-33

34 Για την κατασκευή ανασυνδυασμένου DNA χρησιμοποιούνται περιοριστικές ενδονουκλεάσες και DNA λιγάσες

35 Τα πλασμίδια που χρησιμοποιούνται για κλωνοποίηση περιέχουν ρεπλικόνιο (θέση έναρξης της αντιγραφής) δείκτες επιλογής (γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες αντοχής σε αντιβιοτικά) Θέσεις κλωνοποίησης (θέσεις εισαγωγής του υπό κλωνοποίηση DNA που αναγνωρίζονται από περιοριστικές ενδονουκλεάσες)

36 Κλωνοποίηση σε βακτηριακά κύτταρα 1. Πέψη κυκλικού με ενδονουκλεάσες περιορισμού 2. Το υπό ενίσχυση DNA κόβεται με την ίδια ενδονουκλεάση περιορισμού 3. Η DNA λιγάση συνδέει ομοιοπολικά τμήματα του πλασμιδίου με το επιθυμητό τμήμα DNA, δημιουργώντας ανασυνδυασμένο μόριο DNA 4. Το ανασυνδυασμένο DNA εισάγεται στο βακτήριο ξενιστή με μετασχηματισμό. 5. Τα βακτήρια αναπτύσσονται παρουσία αντιβιοτικού- επιλέγονται κύτταρα με υβριδικό πλασμίδιο μεσω ανθεκτικότητας στο αντιβιοτικό 6. Τα θυγατρικά κύτταρα περιέχουν υβριδικά πλασμίδια 7. Τα βακτήρια λύονται και απομονώνεται το υβριδικό πλασμίδιο 9. Πέψη πλασμιδίων με ενδονουκλεάση Αποτέλεσμα Ενισχυμένο επιθυμητό τμήμα DNA και αρχικό πλασμίδιο Βιοχημεία Ι Ε-36

37 Η Γενετική Μηχανική μιμείται τη μεταγραφή του DNA Απαιτούνται: 1. Εκμαγείο (ds DNA ή ss DNA) 2. Πρόδρομες ενώσεις (ATP, GTP, UTP, CTP) 3. Δισθενές μεταλλικό ιόν (Mg +2 or Mn +2 ) RNA πολυμεράση Κατεύθυνση σύνθεσης το ΝΤΡ προσβάλλει το 3 -ΟΗ Το mrna δρα σαν εκμαγείο για την πρωτεινοσύνθεση Βιοχημεία Ι Δ-37

38 Η Γενετική Μηχανική αξιοποιεί εργαλεία από ιούς Στους ρετροϊούς RNA DNA Η αντίστροφη μεταγραφάση είναι το ένζυμο-κλειδί για την παραγωγή cdna (γονιδίου χωρίς ιντρόνια) με πολλές δραστικότητες Βιοχημεία Ι Δ-38

39 Ευκαρυωτικό DNA μπορεί να κλωνοποιηθεί και να εκφρασθεί σε βακτήρια από το συμπληρωματικό DNA (cdna) που παρασκευάζεται από mrna με αντίστροφη μεταγραφή Διαδικασία ιδιαίτερα σημαντική για την παραγωγή ινσουλίνης, αυξητικών ορμονών, ερυθροποιητίνης Βιοχημεία Ι Ε-39

40 Από το DNA (RNA) στην πρωτεΐνη-υπερέκφραση πρωτεϊνών Βιοχημεία Ι Ε-40

41 Εφαρμογές Γενετικής Μηχανικής στη διάγνωσηανίχνευση-θεραπεία Προηγείται PCR για την παραγωγή πολλαπλών αντιγράφων του DNA από ιχνοποσότητες Βιοχημεία Ι Ε-41

42 Εντοπισμός γενετικών αποτυπωμάτων-ιατροδικαστική, έλεγχος πατρότητας Βιοχημεία Ι Ε-42

43 Προγεννητική διάγνωση και εξέταση για κυστική ίνωση Κυστική ίνωση: οφείλεται σε μεταλλάξεις του γονιδίου CFTR. Η πιο συχνή μετάλλαξη απαλοιφή τριών βάσεων. Είναι δυνατό να γίνει διάγνωση με βάση το μέγεθος των προϊόντων PCR μετά από ενίσχυση αυτού του τμήματος DNA. Βιοχημεία Ι Ε-43

44 Αποτύπωση (Στύπωμα) κατά Southern: Συνδυάζει χρήση ενζύμων περιορισμού, ηλεκτροφόρησης και ανιχνευτών DNA για την παραγωγή, το διαχωρισμό και την ανίχνευση τμημάτων DNA ή συγκεκριμένων αλληλουχιών σε τμήματα DNA -χρησιμοποιείται ευρύτατα στη διάγνωση και την έρευνα Βιοχημεία Ι Ε-44

45 Αποτύπωση (Στύπωμα) κατά Southern 1.Τα περιοριστικά θραύσματα διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση πηκτής 2.Το δίκλωνο DNA μετατρέπεται σε μονόκλωνο DNA με έκθεση σε ΝαΟΗ 3.Η πηκτή εξουδετερώνεται και αποτυπώνεται σε φύλλο νιτροκυτταρίνης ή nylon. Το ssdna ακινητοποιείται στη νιτροκυτταρίνη ή το nylon και μπορεί να αποθηκευθεί ή να χρησιμοποιηθεί άμεσα 4. Για την ανίχνευση συγκεκριμένων αλληλουχιών στα θραύσματα (π.χ. συγκεκριμένου εξονίου ή μετάλλαξης): Το φύλλο νιτροκυτταρίνης επωάζεται με σημασμένα με ραδιοισότοπα ή φθοριοχρώματα ολιγονουκλεοτίδια-ανιχνευτές συμπληρωματικά με το υπό ανίχνευση τμήμα DNA Αυτοραδιογραφία (ή φθορισμός) υποδεικνύει τις θέσεις των επιθυμητών τμημάτων Βιοχημεία Ι Ε-45

46 Βιοχημεία Ι Ε-46

47 Γενική χρήση της Southern Όταν είναι γνωστή η μετάλλαξη που συνδέεται με το γενετικό νόσημα μοριακή διάγνωση επιτυγχάνεται με: 1. ολιγονουκλεοτίδια-ανιχνευτές ειδικά για τη φυσιολογική και μη φυσιολογική αλληλουχία και 2. υπό αυστηρές συνθήκες υβριδισμού (π.χ. υψηλή θερμοκρασία ή χαμηλή ιονική ισχύ) Σε περιπτώσεις πολλών μεταλλάξεων που οδηγούν στην ίδια ασθένεια (ετερογένεια αλληλομορφων) συνήθως ελέγχονται οι συνηθέστερες Βιοχημεία Ι Ε-47

48 Διάγνωση γενετικών συνδρόμων με Southern και ειδικούς ανιχνευτές (ASO) Αλληλιο-ειδικός ολιγονουκλεοτιδικός ανιχνευτής που ανιχνεύει το αλληλόμορφο S της αιμοσφαιρίνης (Hb) Βιοχημεία Ι Ε-48

49 Αποτύπωση κατά Southern χρησιμοποιείται για την ανίχνευση RFLPs και τη διάγνωση γενετικών νοσημάτων RFLP: Restriction fragment length polymorphism Tα περιοριστικά ένζυμα αποκόπτουν το DNA σε ειδικές αλληλουχίες αναγνώρισης. Αν τέτοια αλληλουχία μεταβληθεί από μετάλλαξη ή πολυμορφισμό τo περιοριστικo ένζυμo δεν θα αναγνωρίσει και δεν θα αποκόψει το DNA. Τα αποτυπώματα κατά Southern θα το αποκαλύψουν (π.χ. στη δρεπανοκυτταρική αναιμία Α μεταλλάσσεται σε Τ στο γονίδιο της β-globin καταστρέφοντας την αλληλουχία αναγνώρισης του περιοριστικού ενζύμου Mst II με αποτέλεσμα τη δημιουργία θραυσμάτων διαφορετικών από αυτά που δίνει το φυσιολογικό γονίδιο) Βιοχημεία Ι Ε-49

50 Εναλλακτική διάγνωση δρεπανοκυτταρικής αναιμίας με RFLP Βιοχημεία Ι Ε-50

51 Για την προγεννητική διάγνωση δρεπανοκυτταρικής αναιμίας η αποτύπωση κατά Southern πλεονεκτεί της ηλεκτροφόρησης αιμοσφαιρίνης και του αιματολογικού ελέγχου Διάφορες άλλες μη φυσιολογικές αιμοσφαιρίνες μπορεί να δωσουν εικόνα ηλεκτροφορητική παρόμοια με της ΗbS Εμβρυικά κύτταρα που δεν εκφράζουν τα γονίδια αιμοσφαιρίνης μπορούν να δωσουν το DNA που απαιτειται για Southern Βιοχημεία Ι Ε-51

52 Ιικές λοιμώξεις σε ασθενείς, αιμοδότες κλπ- Ταυτοποίηση ιικού DNA με αντίστροφη μεταγραφάση και Southern Βιοχημεία Ι Ε-52

53 Μέθοδοι αποτύπωσης στη Μοριακή Βιολογία Αποτύπωμα κατά... Southern Ανιχνευτής (Probe) Ολιγονουκλεοτίδιο DNA Εκμαγείο (Template) Northern Ολιγονουκλεοτίδιο RNA Western Αντίσωμα Πρωτεΐνη Eastern Αντίσωμα ή Ανιχνευτής μεταμεταφραστικών τροποποιήσεων Πρωτεΐνη Βιοχημεία Ι Ε-53

54 Γονιδιακή θεραπεία Στόχος η θεραπεία μιας νόσου, που οφείλεται σε μετάλλαξη ενός γονιδίου, με ενσωμάτωση στα σωματικά κύτταρα ενός ασθενούς της φυσιολογικής μορφής του κλωνοποιημένου DNA που αντιστοιχεί στο γονίδιο που ευθύνεται για τη νόσο. Μεταβάλλει μόνο τα σωματικά κύτταρα-στόχους και δε μπορεί να περάσει στην επόμενη γενεά. Συνήθως το «φυσιολογικό» γονίδιο εισάγεται μέσω ιού. Χρησιμοποιήθηκε σε νόσους όπως η ανοσοανεπάρκεια SCID-δοκιμάζεται ακόμη. Βιοχημεία Ι Ε-54

55 Τα διαγονιδιακά ζώα προκύπτουν με μικροέγχυση του κλωνοποιημένου γονιδίου στο γονιμοποιημένο ωάριο Το γονίδιο υπάρχει στη γαμετική σειρά του ζώου και μπορεί να μεταβιβαστεί από γενιά σε γενιά- π.χ. σούπερ-ποντίκι, διαγονιδιακά ζώα στων οποίων το γάλα παράγονται ανθρώπινες πρωτεΐνες (αντιθρομβίνη). Μπορεί να εισαχθεί και μη λειτουργική μορφή του γονιδίου- knockout ποντίκια, ιδιαίτερα χρήσιμα μοντέλα για τη μελέτη ανθρώπινης νόσου που οφείλεται σε απαλοιφή ή απενεργοποίηση συγκεκριμένου γονιδίου και knock-in ποντίκια Βιοχημεία Ι Ε-55

56 Ανάλυση γονιδιακής έκφρασης Οι μικροσυστοιχίες DNA περιέχουν χιλιάδες καθηλωμένες αλληλουχίες DNA-καθεμία αντιπροσωπεύει διαφορετικό γονίδιοακινητοποιημένες σε πλακίδιο (chip). Xρησιμεύουν στη μελέτη προτύπου της παραγωγής mrna (ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης) ταυτόχρονα χιλιάδων γονιδίων. mrna μετατρέπεται σε cdna και σημαίνεται με φθορίζουσα χρωστική-εκτίθεται σε ένα DNA chip γονιδίων-η ένταση φθορισμού σε κάθε θέση αντιστοιχεί στην ποσότητα του mrna στο δείγμα. Οι μικροσυστοιχίες DNA χρησιμοποιούνται για τη σύγκριση της γονιδιακής έκφρασης ανάμεσα σε δύο τύπους κυττάρων (π.χ φυσιολογικά και καρκινικά), για κατηγοριοποίηση τύπους καρκίνου κλπ. Ιδιαίτερα σημαντικές για την ανάπτυξη και την εξέλιξη της εξατομικευμένης ιατρικής. Βιοχημεία Ι Ε-56