Οι μικροβιακές κοινότητες των υποουλικών βιοϋμένων The subgingival biofilm microbial communities

Transcript

1 Περιοδοντολογικά Ανάλεκτα Επίσημη Έκδοση της Ελληνικής Περιοδοντολογικής Εταιρείας Official Publication of the Hellenic Society of Periodontology Analecta Periodontologica Οι μικροβιακές κοινότητες των υποουλικών βιοϋμένων The subgingival biofilm microbial communities Δήμητρα Σακελλάρη 1, Ricardo Palmier Teles 2 1 Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Εργαστήριο Περιοδοντολογίας και Βιολογίας Εμφυτευμάτων, Οδοντιατρική Σχολή, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο, Θεσσαλονίκη, Ελλάδα, 2 Διευθυντής Κλινικής και Εφαρμοστικής Έρευνας, Τμήμα Περιοδοντολογίας, Αναπληρωτής Μέλος Προσωπικού, Ινστιτούτο Forsyth, Cambridge, MA, ΗΠΑ Dimitra Sakellari 1, Ricardo Palmier Teles 2 1 Associate Professor, Department of Periodontology and Implant Biology, Aristotle University Dental School, Thessaloniki, Greece, 2 Director of Clinical and Translational Research, Department of Periodontology, Associate Staff Member, The Forsyth Institute, Cambridge, MA, USA *Στη μνήμη του δασκάλου μας Sigmund Socransky In memoriam of our teacher Sigmund Socransky Περίληψη Οι πρόσφατες τεχνολογικές εξελίξεις δημιούργησαν νέες προοπτικές στον προσδιορισμό των αιτιολογικών παραγόντων των περιοδοντικών νόσων. Η διαπίστωση ότι οι περιοδοντικές νόσοι είναι λοιμώξεις είναι καλά εδραιωμένη και επιστημονικά τεκμηριωμένη και έχει διαμορφώσει τις σύγχρονες θεραπευτικές πρακτικές. Οι κλασικές μελέτες στις δεκαετίες του 1960 και του 1970 περιέγραψαν τα στάδια σχηματισμού της οδοντικής πλάκας και τα διάφορα είδη μικροβίων που αποικίζουν σταδιακά το υποουλικό περιβάλλον. Επιπλέον, με τη συνεισφορά καλλιεργητικών τεχνικών οι μελέτες αυτές βοήθησαν στην αναγνώριση παθογενετικών ειδών που συνδέονται αιτιολογικά με την εμφάνιση και εξέλιξη της περιοδοντικής φλεγμονής. Η εισαγωγή των νεότερων εργαστηριακών τεχνικών έχει επιτρέψει την διεξοδική ανάλυση των υποουλικών οικοσυστημάτων σε μεγαλύτερους αριθμούς κλινικών δειγμάτων. Mετά τη δεκαετία του 1990, oι τεχνικές μοριακής βιολογίας έχουν προσφέρει περαιτέρω πληροφορίες για τους μικροβιακούς μηχανισμούς προσκόλλησης τόσο στα δόντια όσο και σε άλλα μικρόβια καθώς και για τους μικροβιακούς λοιμογόνους παράγοντες. Έτσι, μια σαφώς πιο λεπτομερής περιγραφή και ανάλυση της δομής και των λειτουργιών της υποουλικής μικροχλωρίδας είναι πλέον διαθέσιμες. Η σύγχρονη γνώση και τα επιστημονικά δεδομένα υποστηρίζουν την άποψη ότι τα υποουλικά μικρόβια είναι καλά οργανωμένα σε σύνθετες και ποικίλες μικροβιακές κοινότητες που λειτουργούν σαν βιοϋμένες οι οποίοι περιλαμβάνουν μη καλλιεργήσιμα ακόμη μικροβιακά είδη. Τέλος, αναφέρονται οι κλινικές και μελλοντικές επιπτώσεις των υποουλικών μικροβιακών βιοϋμένων σε σχέση με την περιοδοντική θεραπεία. Περιοδοντολογικά Ανάλεκτα 2010; 21(4):1-15 Λέξεις κλειδιά: περιοδοντική νόσος, μικροβιολογία, οδοντική πλάκα, βακτήρια, υποουλικό οικοσύστημα, βιοϋμένας Abstract Recent advances in technology have provided new insight into the etiological factors of periodontal diseases. The recognition that periodontal diseases are infections is well established and documented scientifically, and has shaped contemporary therapeutic approaches. The classical studies of the 1960s and 1970s described the stages of dental plaque formation and the various microbial species that gradually colonize the subgingival environment. In addition, by applying culture techniques, these studies assisted in the recognition of pathogenic species that are etiologically connected to the initiation and development of periodontal inflammation. The introduction of newer laboratory techniques has allowed for the in-depth analysis of subgingival ecosystems in larger numbers of clinical samples. Molecular biology techniques after the 1990s have provided further information on microbial mechanisms of adhesion to teeth and other bacteria, as well as a description of their virulence factors. Hence, a profoundly more detailed description and analysis of the structure and functions of the subgingival microbiota is now available. Current knowledge and scientific data support the concept that the subgingival microbiota is well organized into complex and diverse microbial communities functioning as biofilms, which include not-yet-cultivable microbial species. Finally, the clinical and future implications of subgingival bacterial biofilms are discussed in relation to periodontal therapy. Analecta Periodontologica 2010; 21(4):1-15 Key words: periodontal disease, microbiology, dental plaque, bacteria, subgingival ecosystem, biofilm Copyright 2009 Hellenic Society of Periodontology. All Rights Reserved.

2 2 Περιοδοντολογικά Ανάλεκτα Τόμος 21 (2010) Εξελίξεις της περιοδοντολογίας στο ξεκίνημα της νέας χιλιετηρίδας Analecta Periodontologica Volume 21 (2010) Advances in periodontics at the dawn of the new millennium Ιστορικά στοιχεία Η περιοδοντολογική μικροβιολογία αναπτύχθηκε κυρίως στη δεκαετία του 1960, στα πλαίσια των προσπαθειών για τη διερεύνηση των αιτιολογικών παραγόντων και των παθογενετικών μηχανισμών που οδηγούν στην καταστροφή των περιοδοντικών ιστών. Η ουλίτιδα και η περιοδοντίτιδα είχαν ήδη συνδεθεί από επιδημιολογικές μελέτες με τα επίπεδα των μαλακών εναποθέσεων στις οδοντικές επιφάνειες μέσα στην ουλοδοντική σχισμή που περιλαμβάνουν μεγάλους αριθμούς διαφορετικών μικροβιακών ειδών και ονομάστηκαν «μικροβιακή πλάκα» (Lovdal και συν. 1958, Ramfjord 1961, Greene 1963). Οι κλασικές μελέτες των δεκαετιών του 1960 και του 1970 με τη χρήση οπτικού και ηλεκτρονικού μικροσκοπίου περιέγραψαν τα στάδια σχηματισμού και σύνθεσης της συνήθως υπερουλικής πλάκας και έθεσαν τις βάσεις της σύγχρονης περιοδοντολογικής μικροβιολογίας (Theilade και συν. 1966, Eastcott και Stallard 1973, Listgarten 1976). Έγινε γνωστό ότι τα μικρόβια προσκολλώνται πολύ σύντομα σε καθαρές οδοντικές επιφάνειες και άλλες στερεές επιφάνειες στη στοματική κοιλότητα όπως μεταλλικές ή ακρυλικές επιφάνειες (Listgarten και συν. 1975, Theilade και συν. 1982). Ακόμη, αποδείχτηκε ότι οι κατά Gram-θετικοί κόκκοι όπως είδη του γένους Streptococcus κυριαρχούν στην πρώιμη φάση αποίκισης και ότι η χλωρίδα γίνεται με την πάροδο του χρόνου πιο πολύπλοκη σαν αποτέλεσμα τόσο του πολλαπλασιασμού όσο και της προσκόλλησης άλλων, κυρίως Gram-αρνητικών ειδών (Socransky και συν. 1977, Brecx και συν. 1981, 1983). Η διάθεση θρεπτικών ουσιών, όπως τα μεταβολικά προϊόντα των πρώιμων αποικιστών (εξωπολυσακχαρίτες που χρησιμεύουν σαν πηγές ενέργειας) και η δημιουργία ενός πυκνού στρώματος πλάκας με συγκεκριμένες φυσικοχημικές συνθήκες (αναερόβιο περιβάλλον) επιτρέπουν την εγκατάσταση των Gram-αρνητικών ειδών, που είναι πιο παθογόνα για τους περιοδοντικούς ιστούς. Η περιοδοντική φλεγμονή ενισχύει την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό αυτών των παθογόνων μικροβίων με τη διαθεσιμότητα θρεπτικών ουσιών από τον ορό, τα κατεστραμμένα κύτταρα του ξενιστή και τα αποδιοργανωμένα στοιχεία της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας. Οι κλινικοί έδειξαν ότι εάν δεν γίνει συστηματική αφαίρεση της πλάκας με τη στοματική υγιεινή ή/και την περιοδοντική θεραπεία, η καταστροφή των ιστών συνεχίζεται και επιτείνεται διαιωνίζοντας την επιβίωση των παθογόνων μικροβίων, μια διαδικασία που ονομάστηκε «ανάστροφη αλληλεπίδραση». Ιστολογικές μελέτες έχουν παρουσιάσει τη δομή της μικροβιακής πλάκας στο αρχικό αλλά και στο τελικό στάδιο ωρίμανσης, όπου διακρίνονται ποικίλες αλλά σαφώς καθορισμένες μορφές, όπως οι πυκνές άμορφες μάζες που είναι προσκολλημένες στις στερεές επιφάνειες και οι πιο σύνθετες μικροβιακές διατάξεις όπως ο σχηματισμός βούρτσας δοκιμαστικού σωλήνα (Εικόνες 1 και 2) (Listgarten 1976). Συνεπώς, οι κλασικές μελέτες είχαν ήδη αποδείξει ότι σε αντίθεση με άλλες λοιμώξεις του ανθρώπινου σώματος, οι περιοδοντικές νόσοι σχετίζονται αιτιολογικά με μικρόβια τα οποία είναι οργανωμένα σε δομημένους σχηματισμούς που οι ερευνητές άρχισαν να διερευνούν. Παρά τους σημαντικούς τεχνικούς περιορισμούς της εποχής, συγκεντρώθηκε ένας ουσιαστικός όγκος δεδομένων και πληροφοριών, που όχι μόνο τεκμηρίωσαν το ρόλο των υποουλικών μικροβιακών συναθροίσεων της ουλοδοντικής σχισμής ή του περιοδοντικού θυλάκου στην παθογένεια των περιοδοντικών νόσων Historical data Periodontal microbiology mainly evolved in the 1960s due to the emerging effort to investigate the etiological factors and pathogenetic mechanisms leading to the destruction of periodontal tissues. Gingivitis and periodontitis had already been linked, from epidemiological studies, to the levels of soft accumulations on teeth surfaces within the gingival crevice, which had been shown to contain numerous and diverse bacterial forms and were termed dental plaque (Lovdal et al. 1958, Ramfjord 1961, Greene 1963). The classical studies of the 1960s and the 1970s, using light and electron microscopy, provided a description of stages of usually supragingival plaque formation and composition and established the fundamentals of contemporary periodontal microbiology (Theilade et al. 1966, Eastcott and Stallard 1973, Listgarten 1976). It became evident that bacteria adhere very soon to professionally cleaned teeth and other solid surfaces in the oral cavity such as metal or acrylic (Listgarten et al. 1975, Theilade et al. 1982). It was also shown that Gram-positive cocci such as Streptococcus species predominate at the early phase of colonization and that the microbiota becomes more complex over time as a result of the combination of bacterial multiplication and adhesion of other mainly Gram-negative species (Socransky et al. 1977, Brecx et al. 1981, 1983). The provision of nutrients such as metabolic end products from early colonizers (extracellular polysaccharides that serve as an energy deposit) and the creation of a dense plaque layer with specific physicochemical conditions (anaerobic environment) allow for the introduction of these Gram-negative species, which are more pathogenic to periodontal tissues. Periodontal inflammation enhances the survival and multiplication of these specific bacteria by further providing nutrients from serum, damaged host cells, and fragmented extracellular matrix components. Clinicians demonstrated that, unless plaque was removed by oral hygiene and/or periodontal therapy, it could lead to further periodontal destruction, thus ensuring continuous feedback for pathogenic bacteria, a process that has been recently termed reciprocal interaction. Histological studies have demonstrated the structure of microbial plaque both at early and mature phases, where clearly diverse but well-defined forms were identified, such as dense, mainly amorphous masses attached to the solid surfaces and complex formations such as the test-tube brush configuration (Figures 1 and 2) (Listgarten 1976). Therefore, classical studies had already shown that, unlike other infections in the human body, periodontal diseases are associated with bacteria organized in structured formations, which researchers began to explore. Despite the considerable technological constraints of that era, a substantial amount of data and information was collected, establishing the etiological role of bacterial accumulation in the gingival crevice/pocket in periodontal diseases. Direct clinical implications

3 Δ. Σακελλάρη, R. P. Teles: Οι μικροβιακές κοινότητες των υποουλικών βιοϋμένων D. Sakellari, R. P. Teles: The subgingival biofilm microbial communities Α Α Β 3 Β Εικόνα 1: Ιστολογικές τομές υποουλικού βιοϋμένα όπου διακρίνονται ο πυκνά δομημένος βιοϋμένας (κίτρινα βέλη) που είναι προσκολλημένος στην οδοντική επιφάνεια (Α, Β) και ο βιοϋμένας προς το επιθήλιο του θυλάκου (πορτοκαλί βέλη) που έχει πιο χαλαρή δομή (Β). (Ευγενής παραχώρηση του Καθ. Max Listgarten) Figure 1: Histological sections depicting the densely formed biofilm (yellow arrows) attached to the tooth surface (A, B) and the biofilm closer to the epithelial lining (orange arrows) with loose structure. (Kind contribution of Prof. Max Listgarten) Εικόνα 2: Επιμήκης (Α) και εγκάρσια τομή (Β) μικροβιακών σχηματισμών «βούρτσας δοκιμαστικού σωλήνα» που αποτελούνται από ένα μακρύ νηματοειδή μικροοργανισμό που περιβάλλεται από ραβδόμορφα μικρόβια. (Ευγενής παραχώρηση του Καθ. Max Listgarten) Figure 2: Longitudinal (A) and cross sections (B) of microbial test-tube brush formations consisting of a long filamentous microorganism surrounded by microbial rods. (Kind contribution of Prof. Max Listgarten) αλλά και οδήγησε σε αλλαγές στις θεραπευτικές προσεγγίσεις. Η σημασία της σχολαστικής αφαίρεσης της πλάκας στη θεραπεία των περιοδοντικών νόσων αλλά και στη διατήρηση της περιοδοντικής υγείας, τεκμηριώθηκε και παραμένει ο θεμέλιος λίθος της περιοδοντικής θεραπείας για τον 20ο και πολύ πιθανά και για τον 21ο αιώνα. Εργώδεις μικροβιολογικές καλλιεργητικές μελέτες στην Ευρώπη και τις Ηνωμένες Πολιτείες που διερεύνησαν αυτούς τους μικροβιακούς «σχηματισμούς» οδήγησαν στην αναγνώριση μικροβιακών ειδών που σχετίζονται με την υγεία και τη νόσο, τους ενεργούς και μη ενεργούς θυλάκους αλλά και συγκεκριμένες περιοδοντικές παθήσεις όπως η νεανική (επιθετική) περιοδοντίτιδα (Newman και συν. 1976, Slots 1976, Newman και Socransky 1977, Slots 1977a, b, Darwish και συν. 1978, Tanner και συν. 1979, Djink και συν. 1988). Συσσωρευμένα στοιχεία από μικροβιολογικές μελέτες απέδειξαν την αξιοσημείωτη ποικιλομορφία αυτών των υποουλικών μικροβιακών σχηματισμών, κάνοντας τη στοματική κοιλότητα και ειδικά το υποουλικό περιβάλλον, ένα από τα πιο πολύπλοκα οικοσυστήματα του ανθρώπινου οργανισμού. Οι Moore και Moore (1994) ανέφεραν ότι ανάμεσα στα μικροβιολογικά στελέχη που αναγνωρίστηκαν σε υποουλικά δείγματα 300 ατόμων με ένα φάσμα διαφορετικών κλινικών καταστάσεων στους περιοδοντικούς ιστούς, αναγνωρίστηκαν πάνω από 500 διαφορετικά μικροβιακά είδη. Επίσης, ανέφεραν ότι περίπου 100 από αυτά τα είδη σχετίζονται ισχυρά με την περιοδοντική νόσο. Με τις προόδους στις καλλιεργητικές τεχνικές, δύσκολα για καλλιέργεια Gram-αρνητικά αναερόβια είδη όπως η Tannerella forsythia απομονώθηκαν από την ουλοδοντική σχισμή και άρχισαν να αποκαλύπτονται οι συνεργιστικές και ανταγωνιστικές τους σχέσεις με άλλα μέλη της υποουλικής χλωρίδας. Μικροβιακά είδη όπως τα Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, είδη σπειροχαιτών, Fusobacterium nucleatum, and therapeutic approaches derived from this knowledge. The importance of meticulous plaque removal in treating periodontal diseases and maintaining periodontal health was established and remained the cornerstone of periodontal therapy in the 20th century and will most likely continue to do so in the 21st century. Laborious microbiological cultural studies of these newly recognized bacterial structures from investigators in Europe and the United States led to the recognition of bacterial species in health and disease, in active and nonactive pockets, and in specific periodontal conditions such as juvenile (aggressive) periodontitis (Newman et al. 1976, Slots 1976, Newman and Socransky 1977, Slots 1977a, b, Darwish et al. 1978, Tanner et al. 1979, Djink et al. 1988). Accumulated data from microbiological studies have shown the remarkable diversity of these subgingival bacterial structures as well as the fact that the oral cavity, particularly the subgingival environment, consists of perhaps the most complex microbial ecosystem in the human organism. Moore and Moore (1994) reported that among 51,000 bacterial isolates identified in subgingival samples from 300 subjects with different states of periodontal conditions, more than 500 different microbial species were recognized. They also reported that about 100 of these species were predominantly associated with periodontal disease. With advances in culture techniques, difficult to grow Gram-negative anaerobic species such as Tannerella forsythia were identified in the gingival crevice, and their synergistic and antagonistic relationships with other members of the subgingival microbiota began to unveil. Bacterial species such as Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Spirochetes species, Fusobacterium nucleatum, Campylobacter Copyright 2009 Hellenic Society of Periodontology. All Rights Reserved.

4 4 Περιοδοντολογικά Ανάλεκτα Τόμος 21 (2010) Εξελίξεις της περιοδοντολογίας στο ξεκίνημα της νέας χιλιετηρίδας Analecta Periodontologica Volume 21 (2010) Advances in periodontics at the dawn of the new millennium Campylobacter rectus, Eikenella corrodens και Aggregatibacter actinomycetemcomitans για να αναφέρουμε ορισμένα είδη με τη σύγχρονη ονοματολογία αναγνωρίστηκαν ως πιθανά περιοπαθογόνα μικρόβια και διερευνήθηκε η σχέση τους με συγκεκριμένες μορφές περιοδοντικών νοσημάτων (Newman και συν. 1976, Slots 1976, Newman και Socransky 1977, Slots 1977a, b, Darwish και συν. 1978, Tanner και συν. 1979, Djink και συν. 1988). Μία άλλη σημαντική διαπίστωση της εποχής ήταν το γεγονός ότι η αντιμετώπιση αυτών των μικροβιακών σχηματισμών αποτελεί θεραπευτική πρόκληση, αφού μια μονοθεραπευτική προσέγγιση πιθανότατα δε θα ήταν ικανοποιητική για όλα τα εμπλεκόμενα μικροβιακά είδη. Ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι η συστηματική χορήγηση διαφόρων αντιμικροβιακών ουσιών. Η επιλογή αντιβιοτικών για την εξάλειψη παθογόνων ειδών γίνεται μετά από προσδιορισμό της ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης στο εργαστήριο. Όμως, οι τυπικές συνθήκες αυτής της δοκιμασίας δεν επιτρέπουν την καλλιέργεια των υποψήφιων περιοπαθογόνων βακτηρίων. Μετά την αναγνώριση των πιθανών περιοπαθογόνων μικροβίων και των καλλιεργητικών συνθηκών τους, μια σειρά από in vitro μελέτες προσδιόρισαν την αντιβιοτική ευαισθησία τους. Διάφορες ομάδες αντιβιοτικών, επιδεικνύουν διαφορετικές ανασταλτικές συγκεντρώσεις για ποικίλα περιοπαθογόνα μικρόβια και λόγω της ποικιλότητας της υποουλικής χλωρίδας, τα ευρέος φάσματος αντιβιοτικά όπως οι τετρακυκλίνες, προτιμήθηκαν για κλινική εφαρμογή (Walker 1996a, b). Παράλληλα, διερευνήθηκαν οι μηχανισμοί της μικροβιακής προσκόλλησης σε μια προσπάθεια τόσο της κατανόησης των βιολογικών διαδικασιών που οδηγούν στη δημιουργία αυτών των μικροβιακών υποουλικών σχηματισμών όσο και της επινόησης πιθανών θεραπευτικών παρεμβάσεων για να διακοπεί η μικροβιακή συσσώρευση στα δόντια και να διατηρηθεί η περιοδοντική υγεία. Οι ερευνητές υπέθεσαν ότι δύο μηχανισμοί μικροβιακής προσκόλλησης προκαλούν και υποστηρίζουν το σχηματισμό υποουλικής πλάκας: μη ειδικοί μηχανισμοί προσκόλλησης που βασίζονται σε φυσικοχημικές δυνάμεις και ειδικοί τρόποι προσκόλλησης που βασίζονται σε εξειδικευμένους, αλλά άγνωστους για την εποχή εκείνη, μηχανισμούς (Gibbons και Van Houte 1975). Η συμβολή των νεότερων τεχνολογιών Η εισαγωγή νεότερων τεχνολογιών επέτρεψε τη λεπτομερή διερεύνηση της δομικής σύστασης των μικροβιακών κυττάρων. Επιπλέον, επιβεβαιώθηκε ο αιτιολογικός και παθογενετικός ρόλος συγκεκριμένων μελών των υποουλικών μικροβιακών σχηματισμών και διερευνήθηκαν οι συγκεκριμένοι λοιμογόνοι παράγοντες που συνεισφέρουν στο παθογενετικό δυναμικό των μικροβίων. Έτσι, αναγνωρίστηκαν οι λιποπολυσακχαρίτες των Gram-αρνητικών μικροβίων, οι εξωτοξίνες όπως η γνωστή λευκοτοξίνη του A. actinomycetemcomitans (γνωστός παλιότερα ως Actinobacillus actinomycetemcomitans) και ένα ευρύ φάσμα πρωτεολυτικών ενζύμων (προϊόντων των Gram-αρνητικών μικροβίων) που μπορούν να αποδομήσουν την εξωκυττάρια ουσία του συνδετικού και οστίτη ιστού (Socransky και Haffajee 1991). Επιπρόσθετα, τα δομικά συστατικά των παθογόνων μικροβίων διερευνήθηκαν πλέον σε μοριακό επίπεδο (Socransky και Haffajee 1991). Συνεπώς, ο σημαντικός όγκος των επιστημονικών πληροφοριών που συγκεντρώθηκε επιβεβαίωσε τη λοιμο- rectus, Eikenella corrodens, and Aggregatibacter actinomycetemcomitans to mention some species using current terminology were recognized as putative periodontal pathogens and their relationship to specific forms of periodontal disease was explored (Newman et al. 1976, Slots 1976, Newman and Socransky 1977, Slots 1977a, b, Darwish et al. 1978, Tanner et al. 1979, Djink et al. 1988). Another significant discovery of that era was the fact that these bacterial structures would be difficult to eliminate, since a single therapeutic approach was not expected to be satisfactory for all involved microbial species. A characteristic example is the administration of different systemic antimicrobials. The selection of antibiotics against pathogenic species is traditionally made after determining the minimum inhibitory concentrations in the laboratory. However, the typical conditions used for this test do not allow the growth of suspected anaerobic periodontal pathogens. After the identification of potential periodontal pathogens and their growth conditions, a series of in vitro investigations aimed at determining their antibiotic susceptibilities. Different classes of antibiotics display different inhibitory potential for various periodontal pathogens and, because of the complexity of the subgingival microbiota, broad-spectrum antibiotics such as the tetracyclines were preferred for clinical application (Walker 1996a, b). In parallel, mechanisms of bacterial adhesion were investigated in an effort both to understand the biological processes that result in these subgingival bacterial structures and to devise possible therapeutic approaches to interrupt bacterial accumulation on teeth, preserving periodontal health. Researchers hypothesized that two forms of bacterial adhesion supported and enhanced the formation of subgingival plaque: nonspecific adhesion mechanisms based on physical and chemical forces and specific adhesion mechanisms based on highly specific but, at that time, unknown mechanisms (Gibbons and Van Houte 1975). The contribution of newer technologies The introduction of newer technologies has allowed for detailed investigations of the structural components of bacterial cells. Moreover, the etiological-pathogenetic role of specific members of the subgingival bacterial structures was verified and further insight was provided into specific virulence factors that contribute to the microbial pathogenetic potential. Lipopolysaccharides from Gram-negative bacteria, exotoxins such as the notorious leukotoxin of A. actinomycetemcomitans (formerly Actinobacillus actinomycetemcomitans), and an array of proteolytic enzymes (products of Gram-negative species) that can degrade the extracellular matrix of connective tissue and bone have been recognized (Socransky and Haffajee 1991). In addition, the structure of pathogenic bacteria has been investigated at the molecular level (Socransky and Haffajee 1991). Therefore, a considerable amount of scientific information was collected

5 Δ. Σακελλάρη, R. P. Teles: Οι μικροβιακές κοινότητες των υποουλικών βιοϋμένων 5 D. Sakellari, R. P. Teles: The subgingival biofilm microbial communities Εικόνα 3: Μικροβιακά «συμπλέγματα» των περιοδοντικών θυλάκων που αποικίζουν διαδοχικά το υποουλικό περιβάλλον. Η χρόνια περιοδοντίτιδα συσχετίζεται στενά με τα μικρόβια του ερυθρού συμπλέγματος (Τροποποιημένη από Socransky και συν.1998, αναπαραγωγή με άδεια του εκδοτικού οίκου John Wiley and Sons). Figure 3: Microbial complexes in periodontal pockets colonizing the subgingival environment. Chronic periodontitis is closely associated with members of the red complex. (Modified from Socransky et al. 1998; reproduced with permission from John Wiley and Sons). γόνο ικανότητα των πιθανών περιοπαθογόνων και παρείχε στην περιοδοντολογική κοινότητα μελλοντικούς θεραπευτικούς στόχους, χωρίς όμως να έχει διαμορφωθεί μια ολοκληρωμένη και συνολική άποψη του οικολογικού ρόλου των μικροβίων στο υποουλικό περιβάλλον. Αν και η ανάπτυξη των αναερόβιων καλλιεργητικών τεχνικών ήταν ουσιαστική για να μελετηθεί η σύνθεση της υποουλικής πλάκας και για να προσδιοριστούν οι διαφορές μεταξύ των μικροβιακών εναποθέσεων που σχετίζονται με την περιοδοντική υγεία και με διάφορα περιοδοντικά νοσήματα, οι τεχνικές αυτές έχουν αρκετά μειονεκτήματα. Οι μικροβιακές καλλιέργειες είναι γενικά δαπανηρές, τεχνικά εργώδεις, χρονοβόρες και δύσκολες λόγω της ανάγκης δημιουργίας αναεροβίων συνθηκών. Οι ερευνητές σύντομα διαπίστωσαν ότι για να διευρυνθεί η γνώση της μικροβιακής αιτιολογίας των περιοδοντικών νοσημάτων, απαιτείται εφαρμογή τεχνικών με χαμηλότερο κόστος και υψηλή διεκπεραιωτικότητα. Συνεπώς, άρχισαν να εφαρμόζουν διάφορες τεχνικές μοριακής βιολογίας που δεν απαιτούν την καλλιέργεια μικροβίων από υποουλικά δείγματα. Μια τέτοια τεχνική μοριακής βιολογίας που ονομάστηκε «υβριδισμός DNA-DNA δίκην σκακιέρας» (checkerboard DNA-DNA hybridization), επινοήθηκε στο Ινστιτούτο Forsyth από τους Socransky και συν. (1994). Η τεχνική επιτρέπει την ταυτόχρονη ανάλυση 28 δειγμάτων μικροβιακής πλάκας για την ανίχνευση μέχρι 40 υποουλικών ειδών μικροβίων σε ειδική μεμβράνη με χρήση ανιχνευτών DNA του μικροβιακού γενετικού υλικού. Το 1998, η ίδια ερευνητική ομάδα παρουσίασε σε ένα ιστορικό άρθρο τα αποτελέσματα από την ανάλυση δειγμάτων υποουλικής πλάκας από 185 ασθενείς για ανίχνευ- that verified the pathogenic potential of suspected periopathogens and provided the periodontal community with possible future therapeutic targets, but lacked perspective regarding the ecological role of microbes in the subgingival environment. Although the development of anaerobic culture techniques was essential to examine the composition of the subgingival plaque and to determine differences between bacterial deposits associated with periodontal health and different periodontal diseases, these techniques have several limitations. Microbial culture in general is expensive, labor intensive, and time-consuming, and the requirement of anaerobiosis only enhanced these issues. Researchers soon realized that in order to expand the knowledge on the microbial etiology of periodontal diseases, less expensive, highthroughput technologies would be required. Therefore, thay started to apply different molecular approaches that did not require growth of microorganisms from subgingival samples. One such molecular biology technique, named checkerboard DNA-DNA hybridization, was developed at the Forsyth Institute by Socransky et al. (1994). The assay allowed for the probing of up to 28 plaque samples for the presence of up to 40 subgingival microbial species on a single nylon membrane by using whole-genomic DNA probes. In 1998, in a benchmark paper authored by the same group, 13,261 subgingival plaque samples from 185 patients were analyzed for 40 bacterial species with this technique Copyright 2009 Hellenic Society of Periodontology. All Rights Reserved.

6 6 Περιοδοντολογικά Ανάλεκτα Τόμος 21 (2010) Εξελίξεις της περιοδοντολογίας στο ξεκίνημα της νέας χιλιετηρίδας Analecta Periodontologica Volume 21 (2010) Advances in periodontics at the dawn of the new millennium (Socransky et al. 1998). The results demonstrated that bacterial species in subgingival dental plaques were not as randomly assembled as originally thought. By applying cluster analysis and community ordination statistical models, the Forsyth team demonstrated that certain bacterial species formed clusters in the subgingival environment and tended to be present simultaneously in distinct complexes. In addition, these complexes, elegantly depicted with different colors (Figure 3), seemed to colonize the gingival crevice environment in a sequential manner. Gram-positive facultative anaerobic streptococci formed the socalled yellow complex; E. corrodens, Campylobacter concisus, A. actinomycetemcomitans serotype a, and Capnocytophaga species formed the green complex; and Veillonella parvula and Actinomyces odontolyticus formed the purple complex. These complexes encompassed pioneer species that adhere to the tooth/ root surface, and their establishment in the subgingival environment precedes colonization by Gram-negative and certain Gram-positive anaerobic bacterial species, the so-called late colonizers, which compose the orange and red complexes. The orange complex included putative periodontal pathogens such as Fusobacterium spp., Campylobacter spp., Prevotella spp., and Eubacterium nodatum. The red complex consisted of P. gingivalis, Treponema denticola, and T. forsythia and was closely associated with clinical signs of periodontal disease such as pocket depth and bleeding on probing. This large database of over 500,000 data points allowed, through mathematical modeling, additional insights into the composition of subgingival microbiota and their relationship to the clinical conditions of the area. Further, the data allowed inferences on the sequence of bacterial succession during the development of subgingival plaque. Following a completely different approach, Kolenbrander and co-workers from the National Institutes of Health in the United States demonstrated that colonization of the teeth is driven by adhesion of bacterial species to the tooth surface and coaggregations among oral bacteria, which are highly specific processes (Kolenbrander et al. 2002). The acquired pellicle is a source of known receptors (mucins, proline-rich proteins, agglutinins) for specific bacteria in the oral cavity. For instance, viridans group streptococci, which are inhabitants of the oral cavity, have been shown to possess specific adhesins that allow for their early binding to the acquired pellicle. Their ability to coaggregate and to attach to other oral bacterial genera make them ideal early colonizers and, in fact, classical early microscopy studies demonstrated that streptococci were the main members of initial dental plaque. These adhesion processes are now described at the cellular-molecular levels and offer another perspective for clinical intervention in order to prevent plaque accumulation and maturation. Other early colonizers via these specific receptor mechanisms include species of Actinomyces, Capnocytophaga, Eikenella, Prevotella, and Veillonella. Data on aggregation among different bacση 40 μικροβιακών ειδών με την τεχνική αυτή (Socransky και συν. 1998). Tα αποτελέσματα αυτής της μελέτης απέδειξαν ότι οι υποουλικοί μικροβιακοί πληθυσμοί δεν είναι τυχαία οργανωμένοι όπως πιστευόταν παλιότερα. Εφαρμόζοντας την ανάλυση ομαδοποίησης και στατιστικά μοντέλα συνολικής κατάταξης, η ομάδα του Forsyth έδειξε ότι συγκεκριμένα υποουλικά βακτήρια σχηματίζουν ομάδες στο υποουλικό περιβάλλον και τείνουν να οργανώνονται σε ευδιάκριτα «συμπλέγματα». Επιπλέον, αυτά τα μικροβιακά συμπλέγματα που παρουσιάστηκαν παραστατικά με διαφορετικά χρώματα (Εικόνα 3), φαίνεται ότι εγκαθίστανται στο περιβάλλον της ουλοδοντικής σχισμής με συγκεκριμένη χρονική αλληλουχία. Οι Gram-θετικοί δυνητικά αναερόβιοι στρεπτόκοκκοι σχηματίζουν το κίτρινο σύμπλεγμα, τα Eikenella corrodens, Campylobacter concisus, A. actinomycetemcomitans ορότυπος a και είδη του γένους Capnocytophaga, σχηματίζουν το πράσινο σύμπλεγμα, και τα Veilonella parvula and Actinomyces odontolyticus σχηματίζουν το κυανό σύμπλεγμα. Τα συμπλέγματα αυτά περιλαμβάνουν τα πρώτα μικρόβια που προσκολλώνται στην οδοντική/ριζική επιφάνεια, ενώ η εγκατάστασή τους στο υποουλικό περιβάλλον προηγείται των κατά Gram-αρνητικών και ορισμένων Gram-θετικών αναερόβιων μικροβίων που αποτελούν τους όψιμους αποικιστές και οργανώνονται στο πορτοκαλί και το ερυθρό σύμπλεγμα. Το πορτοκαλί σύμπλεγμα περιλαμβάνει πιθανά περιοδοντικά παθογόνα μικρόβια όπως είδη των γενών Fusobacterium, Campylobacter, Prevotella και το Eubacterium nodatum. Το ερυθρό σύμπλεγμα αποτελείται από τα P. gingivalis, Treponema denticola και T. forsythia και σχετίζεται ισχυρά με κλινικά σημεία της περιοδοντικής νόσου όπως το βάθος των θυλάκων και η αιμορραγία στην ανίχνευση. Η μεγάλη βάση δεδομένων με πάνω από στοιχεία, επέτρεψε μέσω μαθηματικών μοντέλων ανάλυσης την περαιτέρω διερεύνηση της σύνθεσης της υποουλικής χλωρίδας και της σχέσης της με την κλινική κατάσταση της περιοχής. Επιπλέον, τα δεδομένα συνέβαλαν στη διεξαγωγή συμπερασμάτων για τη διαδοχική μικροβιακή αποίκιση κατά τη συσσώρευση της υποουλικής πλάκας. Ακολουθώντας μια εντελώς διαφορετική προσέγγιση, οι Kolenbrander και συνεργάτες από τα Εθνικά Κέντρα Υγείας των Ηνωμένων Πολιτειών απέδειξαν ότι η αποίκιση των δοντιών καθοδηγείται από την προσκόλληση των μικροβιακών ειδών στην οδοντική επιφάνεια και τη συγκόλληση μεταξύ των μικροβίων, που είναι διαδικασίες με μεγάλη ειδικότητα (Kolenbrander και συν. 2002). Ο επίκτητος υμένας είναι πηγή γνωστών υποδοχέων (βλεννίνες, πρωτεΐνες πλούσιες σε προλίνη, συγκολλητίνες) για συγκεκριμένα μικρόβια του στόματος. Για παράδειγμα, οι πρασινίζοντες στρεπτόκοκκοι που ανήκουν στο οικοσύστημα του στόματος διαθέτουν ειδικές προσκολλητίνες που επιτρέπουν την πρώιμη προσκόλληση στον επίκτητο υμένα. Η ικανότητα συγκόλλησης και προσκόλλησης σε άλλα μικροβιακά γένη τους καθιστούν ιδανικούς πρώιμους αποικιστές και οι πρώτες κλασικές μικροσκοπικές μελέτες απέδειξαν ότι οι στρεπτόκοκκοι συνιστούν την κύρια μάζα της αρχικής πλάκας. Οι διαδικασίες προσκόλλησης μελετώνται πλέον σε κυτταρικό-μοριακό επίπεδο και παρέχουν τη δυνατότητα για κλινικές παρεμβάσεις με στόχο την πρόληψη σχηματισμού και ωρίμανσης της μικροβιακής πλάκας. Άλλοι πρώιμοι αποικιστές με συγκεκριμένους υποδοχείς περιλαμβάνουν τα γένη Actinomyces, Capnocytophaga, Eikenella, Prevotella και Veillonella. Δεδομένα για τη συγκόλ-

7 Δ. Σακελλάρη, R. P. Teles: Οι μικροβιακές κοινότητες των υποουλικών βιοϋμένων D. Sakellari, R. P. Teles: The subgingival biofilm microbial communities 7 Εικόνα 4. Διαδοχική αποίκιση της οδοντικής επιφάνειας ως αποτέλεσμα των ειδικών μηχανισμών προσκόλλησης μέσω συγκεκριμένων υποδοχέων. Η πολύπλοκη αυτή διαδικασία οδηγεί σε μεγάλη ποικιλομορφία της υποουλικής μικροχλωρίδας με τη συμμετοχή πρώιμων και όψιμων αποικιστών. Τα περιοπαθογόνα είναι συνήθως όψιμοι αποικιστές και η υποουλική τους εγκατάσταση διευκολύνεται από την παρουσία του F. nucleatum που λειτουργεί σαν γέφυρα μεταξύ των πρώιμων κυρίως μη παθογόνων και των όψιμων αποικιστών. ΠΠΠ: πρωτεΐνη πλούσια σε προλίνη. (Ευγενής παραχώρηση του Dr. Paul Kolenbrander) Figure 4. Sequence of tooth surface colonization as the result of specific adhesion mechanisms through selective receptors. This complex procedure leads to immense diversity of the subgingival microflora with the participation of early and late colonizers. Periopathogens are usually late colonizers and are facilitated by the presence of F. nucleatum, which acts like a bridge between early mainly nonpathogenic and late colonizers. PRP: proline-rich protein. (Kind contribution of Dr. Paul Kolenbrander) ληση μεταξύ διαφορετικών μικροβιακών ειδών υπέδειξαν επίσης το σημαντικό ρόλο των διαφόρων ειδών Fusobacterium στην ωρίμανση της οδοντικής πλάκας (Εικόνα 4). Ήταν ήδη γνωστό ότι αυτό το είδος μπορεί να ανιχνευτεί τόσο σε υγιείς όσο και σε νοσούσες περιοδοντικές θέσεις, αλλά η ικανότητά του να γεφυρώνει πρώιμους με όψιμους αποικιστές αναγνωρίστηκε σχετικά πρόσφατα (Bradshaw και συν. 1998). Πιο συγκεκριμένα, το F. nucleatum προσκολλάται τόσο με πρώιμους αποικιστές όπως τα Streptococcus oralis, S. gordonii, S. mitis, V. atypica και Actinomyces naeslundii όσο και με όψιμους αποικιστές όπως τα μέλη του ερυθρού συμπλέγματος P. gingivalis και T. denticola που δε διαθέτουν τους κατάλληλους υποδοχείς/συνδέτες για την άμεση μεταξύ τους προσκόλληση (Bradshaw και συν. 1998). Η αναγνώριση του ρόλου του F. nucleatum ως «γέφυρας» μεταξύ των γενικά μη παθογόνων και των παθογόνων μικροβίων, το καθιστούν πιθανό θεραπευτικό στόχο. Πραγματικά, η πιθανότητα διακοπής της αλυσίδας αποίκισης και διαδοχής με μηχανικά ή χημικά μέσα έχει διερευνηθεί και αποτελεί δελεαστική θεραπευτική επιλογή. Το μοντέλο συσσώρευσης της πλάκας που πρότεινε ο Kolenbrander, βασίστηκε σε στοιχεία από μελέτες μικροβιακής terial species also indicated the crucial role of species of Fusobacterium for dental plaque maturation (Figure 4). It was already known that this species can be found in both healthy and diseased periodontal sites, but their ability to bridge early colonizers to late colonizers in the dental plaque was recently recognized (Bradshaw et al. 1998). More specifically, F. nucleatum can bind both to early colonizers such as Streptococcus oralis, S. gordonii, S. mitis, V. atypica, and Actinomyces naeslundii and to late colonizers such as members of the red complex, P. gingivalis and T. denticola, which lack the proper receptors/ligands to adhere directly to each other (Bradshaw et al. 1998). The recognition of the role of F. nucleatum as a bridge between generally nonpathogenic and pathogenic species makes it a potential therapeutic target. Indeed, the possibility of breaking the colonization chain and succession by various mechanical or chemical means has been explored and is an attractive treatment option. The model of plaque accumulation depicted by Kolenbrander, based on data from bacterial aggrega- Copyright 2009 Hellenic Society of Periodontology. All Rights Reserved.

8 8 Περιοδοντολογικά Ανάλεκτα Τόμος 21 (2010) Εξελίξεις της περιοδοντολογίας στο ξεκίνημα της νέας χιλιετηρίδας Analecta Periodontologica Volume 21 (2010) Advances in periodontics at the dawn of the new millennium συγκόλλησης και βρίσκεται σε πλήρη συμφωνία με την άποψη της διαδοχής των υποουλικών συμπλεγμάτων που παρουσίασαν οι Socransky και συνεργάτες (Socransky και συν. 1998). Είναι αξιοσημείωτο ότι ακολουθώντας τελείως διαφορετικές προσεγγίσεις, οι δύο αυτές ερευνητικές γραμμές κατέληξαν σε παρόμοια μοντέλα. Επιπλέον, τα μοντέλα αυτά συμφωνούν με πρώιμες αναφορές που βασίστηκαν τόσο σε μικροσκοπικές παρατηρήσεις όσο και σε καλλιεργητικές τεχνικές. Συνδυάζοντας τα στοιχεία των δύο διαφορετικών προσεγγίσεων, οι ερευνητές έδειξαν ότι τα υποουλικά μικρόβια οργανώνονται με ένα πολύ πιο καλά δομημένο τρόπο από ότι αρχικά πιστευόταν. Ειδικοί μηχανισμοί καθορίζουν την προσκόλλησή τους τόσο σε επιφάνειες όσο και μεταξύ τους, σχηματίζοντας συμπλέγματα τα οποία με ένα οργανωμένο διαδοχικό χωροχρονικό τρόπο αποικίζουν το υποουλικό περιβάλλον εκφράζοντας το παθογενετικό δυναμικό τους, καθώς γίνονται όλο και πιο πολύπλοκα (Εικόνα 5). Η εισαγωγή των βιοϋμένων στην περιοδοντολογία Παράλληλα, η διαπίστωση ότι οι περισσότερες μικροβιακές λοιμώξεις στον άνθρωπο προκαλούνται από μικρόβια που είναι οργανωμένα σε βιοϋμένες, δηλαδή μικρόβια που είναι προσκολλημένα σε στερεές επιφάνειες, αλλά και μεταξύ τους με σταθερή παρουσία ροής υγρού, έφερε δραματικές αλλαγές στην αντίληψη μας για την πρόκληση νόσου από την αλληλεπίδραση ανάμεσα στις μικροβιακές κοινότητες και τον ξενιστή (Costerton 1999, Costerton και συν. 1999). Επιπλέον, έγινε σαφές ότι οι βιοϋμένες αντιπροσωπεύουν ένα μηχανισμό εξέλιξης που προσφέρει στα μικρόβια προστασία από τα αντιμικροβιακά αλλά και την άμυνα του ξενιστή. Ο όρος «οδοντικός βιοϋμένας» εμφανίστηκε στην περιοδοντολογία και εξαιρετικά ενδιαφέρουσες νέες γνώσεις επιβεβαίωσαν και ενίσχυσαν την άποψη των οργανωμένων υποουλικών μικροβιακών κοινοτήτων (Kolenbrander και συν. 2002, Socransky και Haffajee 2002). Οι ιδιαίτερες συνθήκες στην ουλοδοντική σχισμή όπου μια σταθερή επιφάνεια (δόντι) είναι προσκολλημένη σε μαλακούς ιστούς και διαβρέχεται από ένα υγρό πλούσιο σε μικρόβια (σάλιο), επιτρέπουν το σχηματισμό βιοϋμένων παρόμοια με άλλες επιφάνειες όπως οι καθετήρες, οι τεχνητές καρδιακές βαλβίδες και οι τεχνητές αρθρώσεις. Στην ουλοδοντική σχισμή συνυπάρχουν όλες οι απαραίτητες συνθήκες για το σχηματισμό βιοϋμένων: μια σταθερή επιφάνεια, η παρουσία μικροβίων και η ροή υγρού. Ουσιαστικά, οι βιοϋμένες αποτελούν οργανωμένες μικροβιακές κοινότητες όπου τα μικρόβια επιδεικνύουν ένα πλήθος ιδιοτήτων που είναι διαφορετικές από εκείνες που έχουν όταν ζουν σε ελεύθερη ή «πλανκτονική» κατάσταση (Donlan 2002, Dunne 2002). Καταρχάς, όταν προσκολλώνται σε μια επιφάνεια, τα μικρόβια εκφράζουν διαφορετικά φαινοτυπικά χαρακτηριστικά που επιτρέπουν καλύτερη αποίκιση και επέκταση (Jenkinson και Lappin-Scott 2001). Μετά από την αρχική προσκόλληση και τον πολλαπλασιασμό, τα μικρόβια επιδεικνύουν διαφορετική «συμπεριφορά» λόγω ειδικών βιοϋμενικών χαρακτηριστικών όπως η «αίσθηση μεγέθους πληθυσμού». Πιο συγκεκριμένα, μέσω της ανταλλαγής χημικών μηνυμάτων, τα μικρόβια των βιοϋμένων αντιλαμβάνονται τη γειτνίαση με ένα μεγάλο αριθμό «συγγενών» τους οργανισμών (Davies και συν.1998, Xie και συν. 2000, Donlan 2002). Επίσης, μια σειρά από φαινοτυπικά χαρακτηριστικά μεταβάλλονται στην προσπάθεια προσαρμογής στη μικροβια- tion studies, is in complete agreement with the concept of succession of microbial complexes described by Socransky and coworkers (Socransky et al. 1998). It is remarkable that, using completely disparate approaches, these two lines of investigation came up with strikingly similar models. In addition, these models also concur with early reports based on microscopy and culture techniques. By combining data from these two different approaches, researchers showed that subgingival bacteria are organized in a far more structured manner than previously thought. Specific mechanisms determine their adhesion to surfaces and to each other, resulting in complexes that, in an ordinate and sequential spatiotemporal manner, colonize the subgingival environment, expressing pathogenic potential as they become more and more complex (Figure 5). The introduction of biofilms in periodontology Meanwhile, the recognition that most human bacterial infections are caused by bacteria that have accumulated in biofilms, i.e., bacteria that have adhered to a solid surface and to each other in the presence of bulk fluid, brought dramatic changes into our understanding of how these microbial communities interact with the host to cause disease (Costerton 1999, Costerton et al. 1999). Further, it became clear that biofilms represented a mechanism of evolution that confer to bacteria special protection against antimicrobial agents and the host response. The term dental biofilm was introduced in periodontology and intriguing new knowledge confirmed and enhanced the notion of organized subgingival microbial communities (Kolenbrander και συν. 2002, Socransky & Haffajee 2002). The unique situation in the gingival crevice, where a nonshedding surface (tooth) is attached to soft tissues and bathed by a fluid heavily colonized with bacteria (saliva), allows for the formation of biofilms in a manner similar to that of biofilms on other surfaces such as catheters, artificial heart valves, and prosthetic joints. In the gingival crevice, all the necessary conditions for biofilm formation are met: a solid surface, the presence of bacteria, and fluid flow. Biofilms have been shown to be, in essence, organized microbial communities, where bacteria display an array of properties different from those that they possess when living in a free-floating or planktonic state (Donlan 2002, Dunne 2002). First, when adhered to a surface, bacteria display different phenotypic characteristics that allow for their better colonization and expansion (Jenkinson and Lappin-Scott 2001). After their initial adhesion and multiplication, bacteria have also been shown to behave differently because of biofilm-related phenomena such as quorum sensing. More specifically, through the exchange of chemical signals, bacteria grown in biofilms display the ability to perceive that a number of their kindred are in the vicinity (Davies et al. 1998, Xie et al. 2000, Donlan 2002). An array of phenotypic characteristics is also altered in their effort to behave in a microbial

9 Δ. Σακελλάρη, R. P. Teles: Οι μικροβιακές κοινότητες των υποουλικών βιοϋμένων 9 D. Sakellari, R. P. Teles: The subgingival biofilm microbial communities Α Γ/C Εικόνα 5: Σχηματική απεικόνιση βιοϋμένα με σχήμα μανιταριού και των πιθανών μηχανισμών αυξημένης αντοχής στα αντιμικροβιακά: φραγμός διάχυσης από εξωπολυσακχαρίτες (Α), παρουσία περιοχών με διαφορετική μεταβολική δραστηριότητα στο εσωτερικό του ίδιου βιοϋμένα (Β) και παρουσία ανθεκτικών μικροβιακών στελεχών (Γ). (Ευγενής παραχώρηση του Dr. Μ. Μαζίνη) Figure 5: Schematic reproduction of mushroom-shaped biofilm and possible mechanisms of increased resistance to antimicrobials: barrier from exopolysaccharites (A), presence of areas with different metabolic activities within the same biofilm (B), and presence of resistant microbial strains (C). (Kind contribution by Dr. M. Mazinis) κή κοινότητα. Καθώς o βιοϋμένας ωριμάζει, οργανώνεται ακόμη καλύτερα σαν κοινότητα και χάρη σε τεχνολογικές εξελίξεις όπως το ομοεστιακό μικροσκόπιο με laser έχουμε στη διάθεσή μας μια πολύ πιο ακριβή περιγραφή αυτών των μικροβιακών κοινοτήτων. Οι βιοϋμένες δεν είναι απλές δομές από ογκώδεις μικροβιακούς πληθυσμούς αλλά αποτελούνται από σχηματισμούς με μορφή μανιταριού ή πύργου και διαθέτουν ένα δίκτυο διαύλων νερού που λειτουργεί σαν πρωτόγονο κυκλοφορικό και αποχετευτικό σύστημα που επιτρέπει τη διάχυση θρεπτικών στοιχείων και την απομάκρυνση αποβλήτων. Ολόκληρη η μικροβιακή κοινότητα που μπορεί να αποτελείται από ένα ή περισσότερα είδη, προστατεύεται από εξωπολυσακχαρίτες (γλυκοκάλυκας) που παράγονται από τα μέλη του βιοϋμένα (Sutherland 2001). Η σύσταση και η δομή του γλυκοκάλυκα είναι επίσης ποικιλόμορφες, ανάλογα με τα μικρόβια που τον παράγουν, αλλά ο ρόλος του ως φραγμού προς το περιβάλλον είναι καλά τεκμηριωμένος (Εικόνα 5). Μέσα στους βιοϋμένες, οι μικροβιακοί πληθυσμοί συμπεριφέρονται επίσης σαν κοινότητες (O Toole και συν. 2000, Stoodley και συν. 2002). Σε πολυμικροβιακούς βιοϋμένες όπως οι στοματικοί, διαφορετικές συνθήκες ph και οξειδοαναγωγικού δυναμικού συνυπάρχουν σε στενή γειτνίαση (Vroom και συν. 1999). Οι σχέσεις συνέργειας όπως η κατανάλωση οξυγόνου από προαιρετικά αναερόβια είδη που επιτρέπει την επιβίωση των αναεροβίων, η ανταλλαγή μεταβολικών προϊόντων και θρεπτικών ουσιών και η προστασία από αντιμικροβιακή δραστηριότητα, είναι ανάμεσα στα στοιχεία που αποδεικνύουν ότι η μικροβιακή κοινότητα εναρμονίζεται με τον κοινό στόχο των μελών της να επιζήσουν και να πολλαπλασιαστούν. Χαρακτηριστικά παραδείγματα είναι η παραγωγή οργανικών οξέων από είδη Streptococcus που χρησιμοποιούνται από είδη Veillonella για πολλαπλασιασμό ή η μεταβολική συνεργασία μεταξύ των P. gingivalis και T. denticola. Αυτές οι ευεργετικές συνεργασίες αποκαλύπτονται επίσης και από μικρόβια που παράγουν β-λακταμάσες, προστατεύοντας γειτονικά είδη από πενικιλλίνες και κεφαλοσπορίνες. Επειδή οι περιοδοντικές νόσοι προσβάλλουν θέσεις που είναι εύκολα προσβάσιμες για παρατήρηση, δειγματοληψία και θερα- community. As the biofilm matures, it becomes better organized as a community; technological advances, such as confocal laser microscopy, have provided a far clearer description of these microbial communities. Biofilms are not simple structures of massive microbial populations, but are composed of well-shaped mushroom or tower-like formations with a waterchannel network that functions like a primitive circulation and sewer system, allowing for the diffusion of nutrients and excretion of waste products. The whole microbial community, which may consist of single or multiple species, is protected by exopolysaccharides (glycocalyx) produced by the members of the biofilm (Sutherland 2001). The composition and structure of the glycocalyx are also diverse, depending on the producing bacteria, but its role as a barrier to the environment has been well documented (Figure 5). Inside biofilms, microbial populations also behave like communities (O Toole et al. 2000, Stoodley et al. 2002). In multispecies biofilms such as oral biofilms, various conditions of ph and reduction potential exist in close proximity (Vroom et al. 1999). Synergistic relations such as the consumption of oxygen by facultative anaerobic species, which allows for the survival of anaerobic species; the exchange of metabolic products and nutrients; and protection from antimicrobial activity are among the elements that clearly demonstrate that the microbial community adapts itself to the members common target to survive and multiply. Characteristic examples are the production of organic acids by Streptococcus spp., which are used by Veillonella spp. for growth, or the metabolic partnership between P. gingivalis and T. denticola. These beneficial interactions are also clearly shown by beta-lactamase-producing bacteria, which protect their neighbors against penicillins and cephalosporins. Because periodontal infections affect sites readily accessible to monitoring, sampling, and treatment, Β Copyright 2009 Hellenic Society of Periodontology. All Rights Reserved.

10 10 Περιοδοντολογικά Ανάλεκτα Τόμος 21 (2010) Εξελίξεις της περιοδοντολογίας στο ξεκίνημα της νέας χιλιετηρίδας Analecta Periodontologica Volume 21 (2010) Advances in periodontics at the dawn of the new millennium πεία, η υποουλική πλάκα παρέχει ένα ιδανικό μοντέλο για την έρευνα βιοϋμένων (Wood και συν. 2000, Guggenheim και συν. 2001, Palmer και συν. 2001). Ωστόσο, εξαιτίας της ποικιλότητας αυτών των βιοϋμένων, ο καθορισμός του επακριβή ρόλου κάθε είδους στη μικροβιακή κοινότητα και η συμμετοχή τους στην υγεία ή τη νόσο αποτελεί μία πρόκληση. Τα εργαστηριακά μοντέλα των υποουλικών μικροβιακών κοινοτήτων είναι διαθέσιμα μόνο για απλοποιημένους συνδυασμούς μικροβιακών ειδών που είναι πολύ λιγότερο πολύπλοκοι από τους in vivo υποουλικούς βιοϋμένες (Pratten και συν. 1998a, b). Ωστόσο, εργαστηριακά μοντέλα όπως οι κυψέλες ροής, η συσκευή Robbins, οι συσκευές με χημειοστάτες ή διάφοροι επωαστές, οδήγησαν σε σημαντικές ανακαλύψεις σχετικές με τη συμπεριφορά των μικροβίων που αναπτύσσονται σε βιοϋμένες (Wimpenny 1999). Για παράδειγμα, η in vitro έρευνα με μοντέλα βιοϋμένων έδωσε απαντήσεις για τους λόγους επιμονής των λοιμώξεων που οφείλονται σε βιοϋμένες, παρά τη χορήγηση αντιμικροβιακών σε συγκεντρώσεις με αποτελεσματική in vitro δράση. Σε συμφωνία με την άποψη της οργανωμένης μικροβιακής κοινότητας, οι υποουλικοί βιοϋμένες επιδεικνύουν μια ιδιαίτερα αυξημένη αντοχή σε αντιμικροβιακά (Stewart και Costerton 2001). Οι παράγοντες που είναι υπεύθυνοι για την αντοχή στα αντιμικροβιακά περιλαμβάνουν την παρουσία του προστατευτικού φραγμού από εξωπολυσακχαρίτες που παρεμποδίζει τη διάχυση των αντιβιοτικών, τον τεράστιο αριθμό βακτηριακών κυττάρων στους βιοϋμένες, την ανταλλαγή γενετικού υλικού που προσφέρει αντοχή στα αντιβιοτικά και τα διαφορετικά μικροβιακά μεταβολικά στάδια μέσα στον ίδιο πυκνοκατοικημένο βιοϋμένα που τροποποιούν την αποτελεσματικότητά των αντιβιοτικών (Anwar και συν.1992, Amorena και συν. 1999, Anderl και συν. 2000, Lewis 2001). Συνεπώς, προέκυψε μια σειρά ερωτηματικών σχετικά με τους κατάλληλους τρόπους και προσεγγίσεις για την εξάλειψη ή τον καλύτερο έλεγχο των βιοϋμενικών λοιμώξεων. Στην περιοδοντολογία, η άμεση κλινική συνέπεια από τη μεγαλύτερη ανθεκτικότητα των βιοϋμενικών μικροβίων στα αντιβιοτικά, ήταν η αυξημένη έμφαση της μηχανικής θεραπείας ως πρωταρχικού μέσου αντιμετώπισης των περιοδοντικών νόσων (Herrera και συν. 2008). Η ιδέα ότι η μηχανική διατάραξη των βιοϋμένων πρέπει να προηγείται ή να συνοδεύει τη συστηματική αντιβιοτική θεραπεία για ενίσχυση της αντιμικροβιακής πρόσβασης στα εναπομείναντα μικρόβια στόχους, έγινε ένα νέο δόγμα της περιοδοντικής θεραπείας. Επιπλέον, προέκυψαν ερωτήσεις σχετικές με την αποτελεσματικότητα των αντιμικροβιακών, ειδικά των συστηματικών αντιβιοτικών. Ο καλύτερος τρόπος για τον προσδιορισμό του βαθμού προστασίας που παρέχει η δομή του βιοϋμένα στον αιτιολογικό παράγοντα μιας λοίμωξης, είναι μέσω in vivo δεδομένων από κλινικές μελέτες. Αν και η μεγαλύτερη αντοχή στα αντιμικροβιακά των υποουλικών μικροβίων που αναπτύσσονται σε βιοϋμένες σε σχέση με αυτήν των ίδιων ειδών που πολλαπλασιάζονται σε πλανκτονική μορφή είναι αδιαμφισβήτητη (Wright και συν. 1997), το ερώτημα που παραμένει είναι το πόσο αποτελεσματική και κλινικά σημαντική είναι αυτή η πρόσθετη προστασία. Τα αντιβιοτικά σχήματα που χρησιμοποιούνται συνήθως στην οδοντιατρική κλινική πράξη οδηγούν γενικά σε θετικά κλινικά αποτελέσματα όταν χρησιμοποιούνται σαν επικουρική θεραπεία συνδυαστικά με την κλασική μηχανική αντιμετώπιση και επηρεάζουν την υποουλική χλωρίδα, παρά τη δυνητική προστασία που subgingival plaque provides an ideal biofilm model for biofilm research (Wood et al. 2000, Guggenheim et al. 2001, Palmer et al. 2001). However, because of the complexity of these biofilms, defining the precise role of each bacterial species in the community and their contribution to health or disease has been a challenge. Laboratory models of subgingival microbial communities are currently available only for simplified combinations of bacterial species, far less complex than in vivo subgingival biofilms (Pratten et al. 1998a,b). Still, in vitro models such as flow cells, the Robbins device, chemostat fed devices, or different fermenters have allowed for important discoveries regarding the behavior of bacteria grown in biofilms (Wimpenny 1999). For instance, insights into the reasons for persistent biofilm infection despite administration of appropriate doses of antimicrobials with a demonstrable in vitro effect have been provided by research with in vitro biofilm models. In agreement with the concept of organized microbial communities, an exceptionally increased antibiotic resistance was demonstrated by subgingival biofilms (Stewart and Costerton 2001). The factors for antibiotic resistance include the presence of the protective exopolysaccharide barrier which limit the diffusion of antibiotics; the enormous numbers of bacterial cells within the biofilms; the interspecies exchange of genetic elements conveying resistance; and the different microbial metabolic stages within the same densely populated biofilm, which alter the effectiveness of antibiotics (Anwar et al. 1992, Amorena et al. 1999, Anderl et al. 2000, Lewis 2001). Therefore, a series of questions were raised regarding the means and approaches for eradicating or better controlling biofilm infections. In periodontology, the immediate clinical implication that emerged from this concept of a higher resistance of bacteria grown in biofilms was the increased emphasis on mechanical therapies as the primary means to treat periodontal diseases (Herrera et al. 2008). The notion that mechanical disruption of the biofilm must precede or accompany systemic antibiotic therapy to foster access of the antimicrobial(s) to the remaining target bacteria became a new dogma in periodontal therapy. In addition, questions were raised concerning the efficacy of antimicrobials, especially systemically administered antibiotics. The best way to determine the extent of protection provided by the biofilm structure to the etiological agent of an infection is through in vivo data obtained from clinical trials. Although the increased resistance to antimicrobials of subgingival species grown in biofilms, compared with that of the same species grown in a planktonic state, is irrefutable (Wright et al. 1997), the question remains as to how efficient and clinically relevant this added protection is. Antibiotic regimens commonly used in dental clinical practice have achieved positive clinical results when used as adjunctive treatments in addition to mechanical therapy and dramatically altered the subgingival microbiota despite the presumed protection conferred by the biofilm (Herrera et al. 2002, Haffajee et al. 2003). In