Δοµή και ιδιότητες του DNA

Transcript

1 Δοµή και ιδιότητες του DNA Βακτηριακό χρωµόσωµα ευκαρυωτικό χρωµόσωµα και χρωµατίνη 28/02/2014 1

2 Tο βακτηριακό γονιδίωµα περιέχεται σε ένα κυκλικό DNA µήκους 1300 µm εντός του βακτηριακού κυττάρου που στην περίπτωση του E.coli έχει διαστάσεις 1Χ3 µm, συνεπώς είναι πολύ σφιχτά αναδιπλωµένο µέσα στο κύτταρο. Tο βακτηριακό χρωµόσωµα περιέχει: πολλές θηλιές από υπερελικωµένο DNA στο κέντρο του µια συµπαγή δοµή από RNA και πρωτείνες Σταδιακή πέψη του βακτηριακού χρωµοσώµατος µε DΝάση, RΝάση και θρυψίνη συνεπάγεται σε µια κεντρική ελάχιστη δοµή από 45±10 θηλιές που λέγεται σκαλωσιά (scaffold). 28/02/2014 2

3 Tο ευκαρυωτικό DNA είναι οργανωµένο σε γραµµικά χρωµοσώµατα που περιέχουν dsdna και πρωτείνες (ιστόνες) και βρίσκεται αποκλειστικά στον πυρήνα. Οι ιστόνες (histones) Η1, Η2Α, Η2Β, Η3, Η4 είναι µικρές βασικές πρωτεϊνες, θετικά φορτισµένες (υψηλό ποσοστό R, K) και δηµιουργούν ιονικούς δεσµούς µε το αρνητικά φορτισµένο DNA. Σύµπλοκο: DNA + ιστόνες = νουκλεόσωµα => χρωµατίνη 28/02/2014 3

4 Γιατί τα σπερµατοζάρια δεν έχουν ιστόνες? Οι ιστόνες είναι άψογα σχεδιασµένες για τη λειτουργία τους και ως εκ τούτου είναι πολύ συντηρηµένες µε κορωνίδα την H4. H H4 είναι 100Χ πιο συντηρηµένη από τα πλέον συντηρηµένα µόρια που είναι αιµοσφαιρίνη και κυτόχρωµα c. 28/02/2014 4

5 Εκτός των ιστονών, το πυρηνικό DNA περιέχει και άλλες, µη βασικές, πρωτεϊνες γνωστές ως µη ιστόνες (non-histone DNA binding proteins) όµως είναι σε µικρή ποσότητα. Οι πρωτείνες αυτές είναι: Πρωτείνες για αντιγραφή, µεταγραφή και επιδιόρθωση του DNA Πρωτείνες που σχετίζονται µε την µετάπτωση της χρωµατίνης από την ενεργό στην ανενεργό κατάσταση HMG (high mobility group) πρωτείνες που είναι κυρίως µεταγραφικοί παράγοντες. 28/02/2014 5

6 Η αλληλεπίδραση πρωτεϊνών µε DNA γίνεται µέσω δεσµών υδρογόνου και δεν επηρεάζει το ζευγάρωµα των βάσεων. Οι δεσµοί υδρογόνου σχηµατίζονται µεταξύ των βάσεων που εκτίθενται στη µικρή αλλά κυρίως µεγάλη αύλακα του DNA και συγκεκριµένων αµινοξέων που σχηµατίζουν χαρακτηριστικά µοτίβα (DNA binding domains) 28/02/2014 6

7 ΗTH: helix turn helix είναι ένα επίσης σηµαντικά διαδεδοµένο πρωτεϊνικό µοτίβο που αλληλεπιδρά µε την µεγάλη αύλακα του DNA σχηµατίζουν χαρακτηριστικά µοτίβα (DNA binding domains) 28/02/2014 7

8 Leucine-Zipper είναι ένα επίσης σηµαντικά διαδεδοµένο πρωτεϊνικό µοτίβο που αλληλεπιδρά µε την µεγάλη αύλακα του DNA σχηµατίζουν χαρακτηριστικά µοτίβα (DNA binding domains) 28/02/2014 8

9 Ξεδιπλωµένο ανθρώπινο DNA έχει µήκος ~2 m και χωράει στον πυρήνα που έχει διάµετρο 10-6 m, οπότε είναι σηµαντικά συµπυκνωµένο. Η βασική µονάδα δοµής του DNA στον πυρήνα είναι το νουκλεόσωµα. Το νουκλεοσώµατα σχηµατίζουν χάντρες διαµέτρου nm συνδεδεµένες µε γυµνό DNA που λέγεται συνδετικό DNA (linker DNA) συνολικού µήκους 200 bp, όπως µετρήθηκε από πειράµατα πέψης. 28/02/2014 9

10 Η χρωµατίνη που ελευθερώνεται από λυµένους πυρήνες αποτελείται από µια συµπαγώς οργανωµένη σειρά σωµατίων. 28/02/2014 Κατά την πέψη χρωµατίνης µε µικροκοκκική νουκλεάση, αποδεσµεύονται µεµονωµένα νουκλεοσώµατα. 10

11 Οι πυρήνες των νουκλεοσωµάτων (core particles) φτιάχνονται απο 146 bp αριστερόστροφα τυλιγµένες γύρω από ενα πρωτεϊνικό οκταµερές ιστονών 2Χ(Η2Α, Η2Β, Η3, Η4). Το νουκλεόσωµα αποτελείται από περίπου ίσες µάζες DNA και ιστονών (συµπεριλαµβανοµένης της H1). Το µοριακό βάρος του νουκλεοσώµατος είναι 262 kd. Η ιστόνη Η1 αλληλεπιδρά µε το συνδετικό DNA και σταθεροποιεί τα νουκλεοσώµατα το ένα κοντά στο άλλο. 28/02/

12 Σε ένα συµµετρικό µοντέλο για το νουκλεόσωµα, το τετραµερές Η32 Η42 παρέχει τον πυρήνα του σχήµατός του. Ένα µόνο διµερές Η2A H2B µπορεί να φανεί στην κάτοψη, γιατί το άλλο βρίσκεται κρυµµένο από κάτω. Οι Ν-τελικές ουρές των ιστονών είναι ευέλικτες και προεξέχουν από το νουκλεόσωµα, προβάλλοντας ανάµεσα από τις στροφές του DNA. 28/02/

13 Η κρυσταλλική δοµή του πυρηνικού οκταµερούς των ιστονών παρουσιάζεται σε ένα χωροπληρωτικό µοντέλο (space filling model). Το τετραµερές Η32 Η42 απεικονίζεται άσπρο και τα διµερή Η2A H2B µπλε. Μόνο ένα διµερές Η2A H2B είναι ορατό στην κάτοψη, διότι το άλλο είναι κρυµµένο από κάτω. Η πιθανή πορεία του DNA φαίνεται στην κάτοψη ως στενός σωλήνας (ένα τέταρτο της πραγµατικής διαµέτρου του DNA) και στην πλευρική άποψη ως δέσµη παράλληλων γραµµών µε εύρος 20 Å. 28/02/

14 Σε µοντέλλα µεταφασικών χρωµοσωµάτων οι θηλιές που σχηµατίζουν τα σωληνοειδή είναι προσκολληµένες σε ένα κεντρικό πυρήνα που ονοµάζεται ικρίωµα (σκαλωσιά) (scaffold). 28/02/

15 Το αντιγραφόµενο DNA ενσωµατώνεται αµέσως σε νουκλεoσώµατα. 28/02/

16 Η καθαρά δοµική εικόνα της χρωµατίνης µας παρέχει µόνο µια στατική περιγραφή της. Δυναµική εικόνα της χρωµατίνης µπορούµε να αποκτήσουµε έµµεσα. Δυναµική εικόνα της χρωµατίνης είναι η διευθέτηση των νουκλεοσωµάτων σε τυχαίες ή ειδικές θέσεις στην αλληλουχία του DNA. Ο όρος: νουκλεόσωµα σε φάση (phased nucleosomes) περιγράφει συγκεκριµένη διευθέτηση των νουκλεοσωµάτων στο DNA. 28/02/

17 Η οργάνωση της χρωµατίνης είναι ελαστική για να καλύψει τις δοµικές και λειτουργικές της ανάγκες. Η χρωµατίνη από φωτογραφίες ΗΜ είναι γνωστό οτι εµφανίζεται ως ευχρωµατίνη (ενεργός χρωµατίνη) και ετεροχρωµατίνη (ανενεργός χρωµατίνη) 28/02/

18 Η τροποποίηση µεθυλίωση - των κυτοσινών είναι ένας παράγοντας που επηρεάζει-ρυθµίζει την µεταγραφική ενεργότητα. Πώς: Η µεθυλίωση C σε ειδικές θέσεις εµποδίζει την πρόσδεση παραγόντων µεταγραφής (transcription factors) Tα ήδη ενεργά γονίδια δεν µεθυλιώνονται: Στα ενεργά γονίδια δουλεύουν µια σειρά από πρωτείνες. Είναι πιθανόν αυτές οι πρωτείνες να εµποδίζουν τα ένζυµα µεθυλίωσης (DNA methylases) να δράσουν. 28/02/

19 Η χρωµατίνη πακετάρεται µε τις ιστόνες σχηµατίζοντας τα νουκλεοσώµατα. Η συµπαγής δοµή της χρωµατίνης δεν επιτρέπει την ελεύθερη πρόσδεση πρωτεϊνών που σχετίζονται µε την µεταγραφική ενεργότητα και άρα τη γονιδιακή ρύθµιση. 28/02/

20 Η µηχανισµοί αποδόµησης (και όχι αποικοδόµησης) της χρωµατίνης, των νουκλεοσωµάτων, στόχο έχουν να αυξήσουν τη διαθεσιµότητα του DNA στις πρωτείνες που θα αναλάβουν την µεταγραφή και άρα τη γονιδιακή έκφραση. Μέσω συµπλόκων αναδόµησης της χρωµατίνη χρησιµοποιώντας ATP (chromatin remodeling complexes) Ενζυµική (χηµική) τροποποίηση των νουκλεοσωµάτων µέσω τροποποίησης των ιστονών µε στόχο την προγραµµατισµένη έκφραση/ αδρανοποίση γονιδίων ανταποκρινόµενη σε αναπτυξιακά και περιβαλλοντικά ερεθίσµατασήµατα. 28/02/

21 Η µηχανισµοί αποδόµησης (και οχι αποικοδόµησης) της χρωµατίνης, των νουκλεοσωµάτων: Τα συµπλόκα αναδόµησης της χρωµατίνη είναι σύµπλοκα πρωτεϊνικών υποµονάδων που χρησιµοποιούν ενέργεια (ATP) για να σπάσουν τη δοµή των νουκλεοσωµάτων ώστε να αυξηθεί η προσπελασιµότητα του DNA από µεταγραφικούς παράγοντες. Υπάρχουν πολλές οικογένειες τέτοιων συµπλόκων που η κάθε µια σχετίζεται µε οµάδες γονιδίων (άρα εξειδίκευση). 28/02/

22 Η µηχανισµοί αποδόµησης (και όχι αποικοδόµησης) της χρωµατίνης, των νουκλεοσωµάτων: Το δυναµικό µοντέλο για τη µεταγραφή της χρωµατίνης προβλέπει τη δράση παραγόντων οι οποίοι χρησιµοποιούν την ενέργεια που παράγεται από την υδρόλυση του ATP για να εκτοπίσουν τα νουκλεοσώµατα από συγκεκριµένες περιοχές του DNA. 28/02/

23 Ενζυµική (χηµική) τροποποίηση των νουκλεοσωµάτων µέσω τροποποίησης των ιστονών µε στόχο την προγραµµατισµένη έκφραση/αδρανοποίση γονιδίων ανταποκρινόµενη σε αναπτυξιακά και περιβαλλοντικά ερεθίσµατα-σήµατα. Η ακετυλίωση των ιστονών ενεργοποιεί τη χρωµατίνη Η µεθυλίωση του DNA απενεργοποιεί τη χρωµατίνη. Η µεθυλίωση των ιστονών απενεργοποιεί τη χρωµατίνη. 28/02/

24 Η ακετυλίωση των ιστονών H3 και H4 σχετίζεται µε την ενεργή ενώ η µεθυλίωση µε την ανενεργή κατάσταση της χρωµατίνης. 28/02/

25 Η ακετυλίωση λυσίνης και η φωσφορυλίωση σερίνης µειώνουν το συνολικό θετικό φορτίο µιας πρωτεΐνης. Αντίθετα, η µεθυλίωση ενισχύει την ηλεκτροθετικότητα της λυσίνης. 28/02/